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[成果]
0602150017
北京
R51
应用技术
[医学研究与试验发展, 生物、生化制品的制造]
公布年份:2006
成果简介:1994年10月-2003年10月,由中国药品生物制品检定所利用1996年卫生部科技贷款和自筹资金,应用中国自行分离、减毒的狂犬病毒株,适应于Vero细胞。该毒种在Vero细胞中增殖快,病毒滴度可达到10<'8>/ml以上,产量高,且免疫原性非常优良。该毒种已获国家食品药品监督管理局正式批准、并于2005年被世界卫生组织(WHO)的正式出版的文件确认为人用疫苗的毒种。一、方法:(一)病毒繁殖力。二倍体细胞适应株(CTN-1)毒种在Vero细胞中传至第一代即可达到7.0 Log LD<,50>/ml,第5代以后可达8.0 Log LD<,50>/ml以上,显示了对Vero细胞的良好适应性,达到了WHO认为生产疫苗可不浓缩的滴度水平。在Vero细胞中吸附时间很短,吸附率很高且繁殖速度快,16小时即可复制一代,为Vero细胞生产疫苗时,毒种用量小,收获率高打下了基础。在生产单位的实践证明,CTN-1-Ⅴ感染Vero细胞,可连续收获6次以上。(二)免疫原性。CTN-1制备的Vero细胞犬口服活疫苗血清中和抗体1:110,(2.59IU/ml),抗体阳转率100%。CTN-1-Vero细胞适应株制备的Vero细胞灭活疫苗(原液)NIH法测定效价为3.0IU/2ml以上。(三)安全、有效性。该病毒经小鼠脑内、人胚肺二倍体细胞连续传代,使小鼠发病潜伏期从14天缩短为3-6天,皮下致病力降低,在细胞内复制的滴度增高。接种病毒的鼠脑病理切片显示鼠脑皮层和海马回神经细胞广泛坏死,并有筛孔状软化灶,但均未能找到包函体,证明病毒仅在脑组织中复制而神经毒力降低。将其制备成减毒肌注犬用活疫苗,共接种22290头犬,无一例因疫苗株发病且保护率为64.0%。孕犬口服疫苗后,所产仔犬在观察的6个月期内未发现垂直感染。乳犬口服10个剂量的活疫苗,并分别在5、10、20天和3个月取脑组织及唾液腺病毒分离均阴性。小鼠接种未发现逆转现象,返祖试验阴性。证明该毒株已充分减毒,显示安全有效。(四)生产用毒种国家标准检定。1、特异免疫血清中和后做纯毒试验,未发现外源病毒污染。2、特异免疫血清中和后作免疫原性,中和指数达5.23 Log。3、CTN-1株糖蛋白核苷酸序列与国内外狂犬病毒aG、C GX89-1、CVS、SAD19、ERA、Vnukovo和PM等毒株的同源性高度一致。4、家兔肌肉和脑内、豚鼠肌肉注射不致病。5、街毒攻击试验保护率为90%。二、创新点:(一)该毒种由中国自行分离、适应、驯化、减毒和建立,具有自主知识产权。(二)已完全适应到Vero细胞,生产时可直接使用细胞培养毒种,简单而且安全性更有保证。(三)具有病毒滴度高、免疫原性好、生产疫苗时的病毒原液的浓缩倍数少、生产成本低。(四)该毒株经用野毒株(街毒)攻击保护实验,证明小鼠的保护力高。(五)该毒种利用生物学、免疫学、免疫化学、分子生物学、基因测序及动物流行病学以及疫苗人群临床研究等方法进行了验证。三、推广应用:CTN-1-Ⅴ狂犬病疫苗生产用毒种,经前期实验室适应到Vero细胞后,多次制备实验性疫苗验证,并经全面检定,该毒株符合国家和WHO相关人用疫苗生产毒株的特性要求和质量标准。与武汉、长春、兰州生物制品研究所、沈阳安迪生物高科技公司、辽宁生物技术公司应用于产业化。经后期上述企业将CTN-1-Ⅴ毒种应用于Vero细胞的转瓶和生物反应器微栽体培养,该毒种均能得到高滴度病毒量收获液。收获原液经适当浓缩即可达到制备纯化疫苗的要求。上述各企业均于1999年前后获得国家食品药品监督管理局的临床研究批件。经临床严格考核,证明CTN-1-Ⅴ株毒种生产的疫苗安全、有效。于2001年获得新药证书。现已投入规模化生产,2004年,总产量能达到100-150万人份,年产值8000万元-12000万元,将可使100-150万被动物侵袭的人群得到有效的治疗和保护。同时几家企业能提供400-500人的就业岗位。发表论文8篇。在2005年WHO出版的《Recommendations For Inactivated Rabies Vaccine For Human Use Produced in Cell Substrates and Embryonated Eggs》的正式文件与其他4株国外疫苗生产用毒种确认为人用疫苗生产用毒种。