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[成果]
1400520993
北京
Q53
应用技术
自然科学研究与试验发展
公布年份:2013
成果简介:葡萄糖苷酶可以降解短链的寡糖(2-6单糖聚合物),近年来beta葡萄糖苷酶在木薯解毒,果汁脱苦等食品加工过程得到广泛商业应用。低温葡萄糖苷酶在低温水处理、冷洗行业等有极其重要的作用。尤其是低温食品加工行业低温beta葡萄糖苷酶可防止食品酸败及营养剂风味遭到高温破坏。该课题从南极微球菌Micrococcusantarcticus的基因文库中克隆了首个嗜冷葡萄糖苷酶—BglU。序列分析显示bglU全长1419bp,编码472氨基酸。序列比对显示BglU属于GH1家族。重组6His-BglU呈现明显的温度不稳定性:30oC的Tm1/2仅30分钟。BglU的最适酶反应温度为25oC、最适酶反应pH为6.5。BglU的最适低物为纤维二糖和p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG).最适条件下,以pNPG做底物,Km和kcat分别为7mmol/L和7.85×103/s.该课题同时解析了BglU蛋白结构,从蛋白结构上(特殊氨基酸及二级结构的使用)解释其冷适应机理。低温条件下(4oC),该课题成功获得BglU的晶体,并在2.2的分辨率下解析了该蛋白结构。和其他来自GH1家族的同源蛋白类似,BglU结构为典型的TIMbarrel折叠。一个大而深的底物结合口袋位于BglU的表面,其中深约20体积约18583。通过序列及结构比对,His299在其他蛋白中是高度保守的Try,突变子H299Y的酶活、最适反应温度及温度稳定性都明显增加;这说明His299是该蛋白高低温活性,低最适反应温度和温度敏感主要原因。突变子G261R和Q448P与野生酶BglU相比,增加了最适反应温度,但是低温酶活却有所减少最大酶活没有变化。突变子A368P,T383P,和A389E的最适反应温度,温度稳定性及低温酶活均小幅增加。突变子K163P,N228P,和H301A的酶活显著减少。综上,His299在酶反应中负责传递质子,是嗜低温酶BglU冷适应的主要原因。脯氨酸,精氨酸和谷氨酸的低含量是其冷适应的另外一个原因。这些研究结果有助于基于结构信息的低温酶分子改造,为设计适合各种不同温度工业过的低温酶程提供了结构基础。