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[硕士论文] 刘天琦
生物学 曲阜师范大学 2016(学位年度)
摘要:黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是中国北方农田害鼠的优势种之一,对人民的生活和健康造成了严重影响,其雄性个体具有显著的季节性繁殖特点,一年有春秋两季的繁殖高峰,产仔快,短时间内数量激增,可作为研究季节性繁殖的良好动物模型。本研究以雄性黑线仓鼠为研究对象,克隆钟基因(Bmal1、Clock)部分基因序列并采用实时荧光定量PCR技术分析其在下丘脑和睾丸的表达规律,研究结果有助于理解钟基因与季节性繁殖活动的关系,并为进一步探究黑线仓鼠季节性繁殖调控的分子机制奠定基础。
  测序共得到黑线仓鼠Bmal1 cDNA序列1754bp(KU645887),全部为CDs,编码584个氨基酸;共得到Clock cDNA序列911bp(KU645888),全部为CDS,编码303个氨基酸。Bmal1和Clock都是HLH/PAS转录因子家族成员,均为疏水性蛋白,具有多个与昼夜节律和代谢活动相关的作用位点,聚类分析表明二者在进化上具有保守性。
  从组织器官表达来看,Bmal1和Clock在黑线仓鼠的多个器官(肾脏、肝脏、脾脏、下丘脑、附睾、睾丸)中均有表达,其中在下丘脑和睾丸中表达量最高,提示其可能与繁殖调控有关。从个体发育表达来看,Bmal1和Clock在雄性黑线仓鼠的表达呈现出相似的规律,即在下丘脑和睾丸中的表达均是成年期表达量最高,说明Bmal1和Clock对雄性黑线仓鼠成体期生理状态的维持发挥重要作用,推测与二者参与调节睾酮分泌,参与雄性繁殖调控有关。从季节性表达来看,两个基因在下丘脑和睾丸的表达并不一致。雄性黑线仓鼠下丘脑中Bmal1在春季和秋季的表达显著高于夏季和冬季,即在高繁殖季的表达显著高于在低/非生殖季的表达;但是,下丘脑中Clock在冬季的表达却显著高于春季、夏季和秋季;睾丸中Bmal1在冬季的表达量显著低于其他三季,在春季、夏季、秋季的表达量没有显著差异(P<0.05)。睾丸中Clock在夏季的表达显著高于春季、秋季和冬季,在春季、秋季和冬季的表达没有显著差异(P<0.05)。下丘脑中Bmal1在四季的表达与GnRH、GPR54、Dio2等的表达趋势相似,而Clock则与RFRP的表达趋势相似;睾丸中Clock在四季的表达趋势与RFRP的表达相似,而与Kiss-1的表达趋势相反。推测年周期信号通过TSHβ/Dio2→RF-酰胺整合到生殖轴上。以上结果提示Bmal1和Clock可能是黑线仓鼠季节性繁殖复杂调控分子网络中的重要环节。
[硕士论文] 吕甲强
生物学 曲阜师范大学 2016(学位年度)
摘要:黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)俗称小腮鼠、背纹仓鼠、花背仓鼠等,是我国北方农田害鼠的优势种,分布范围广,繁殖能力强,危害性大。黑线仓鼠的繁殖活动具有季节性节律,属于季节性繁殖动物,每年春、秋季为繁殖高峰期,研究黑线仓鼠的季节性繁殖机制能够探究外在环境信息调控黑线仓鼠繁殖活动的信号通路,可以探寻从生物学角度消灭鼠害的方法。KiSS-1/GPR54系统是季节性繁殖调控体系中非常重要的一环,在黑线仓鼠中发现:KiSS-1的mRNA表达量和kisspeptin含量都存在季节性差异,都是冬季的表达最低,夏秋表达比较高;而且KiSS-1的mRNA表达量与光照长度成正比;褪黑激素对KiSS-1的表达具有抑制作用。本实验从启动子DNA甲基化入手研究KiSS-1的表达模式,以探究KiSS-1基因参与黑线仓鼠季节性繁殖调控的分子机制。
  首先我们利用黑线仓鼠的肝脏组织,通过PCR扩增、克隆测序获得KiSS-1基因启动子序列,并对此序列进行生物信息学分析,鉴定其核心启动子并预测CpG岛为检测其甲基化状态打下基础。此序列全长2012bp,GenBank登录号:KU965557,将此序列与黑线仓鼠编码序列相比对,找到翻译起始密码子,起始密码子前有序列1997bp,剩余的12bp序列为KiSS-1基因的编码序列。此序列GC含量为52.3%,高于AT含量。发现转录起始位点位于起始密码子上游500bp处,并发现启动子核心区TATA框,位于转录起始位点上游-22bp处,并且在TATA框上游发现顺式作用元件CAAT框位于转录起始位点上游-227bp处。将启动子序列以及附近编码序列导入MethPrimer预测到CpG岛,全长420bp,GC含量为58.6%,远高于AT含量,含有11个CpG位点。
  选取4个季节的雌性黑线仓鼠的下丘脑,我们每个季节选取3只雌性黑线仓鼠的下丘脑组织,提取基因组DNA,然后利用亚硫酸盐测序法检测KiSS-1基因启动子CpG岛甲基化状态,每个个体筛选10个克隆。利用biq2.0分析测序结果做出点状图,通过分析点状图可以发现:11个CpG位点中只有第2个位点是全部非甲基化状态;第5个CpG位点只有夏季是非甲基化的,其他季节是甲基化状态的。可以推测第二个位点与可能KiSS-1基因表达有关;夏季KiSS-1基因表达最高可能与第五个位点有关。根据点状图计算出四个季节的黑线仓鼠的甲基化状态分别为:81.82%,76.67%,84.85%,89.70%,单因素方差分析发现冬季的甲基化程度最高,春季和秋季的甲基化程度居中,显著低于冬季的甲基化程度,而夏季的甲基化程度最低。将其与黑线仓鼠四个季节KiSS-1的mRNA表达量进行相关性分析,结果表明黑线仓鼠KiSS-1 mRNA表达量与KiSS-1启动子甲基化状况呈中度负相关(r=-0.781,p=0.003)。即甲基化程度越高,mRNA表达量越低,可以推测启动子甲基化抑制基因表达。将KiSS-1启动子甲基化状态与四个季节的光照周期比较,发现两者的变化趋势相反,即光照时间越长,甲基化程度越低,推测光照长度与启动子甲基化程度呈负相关。而光信号会影响褪黑激素的释放,而褪黑激素也抑制KiSS-1基因的表达,所以推测光信号影响KiSS-1是通过褪黑激素影响KiSS-1启动子甲基化程度来完成的。光照时间增多会抑制褪黑激素的分泌,褪黑激素含量降低会通过一定途径导致KiSS-1启动子甲基化程度降低,会使KiSS-1基因的表达增强,促进kisspeptin合成,促进GPR54表达,GPR54会促进GnRH神经元合成和释放GnRH,进一步促进LH和FSH的释放,促进繁殖。
  综上所述,本研究通过自然季节取样和亚硫酸氢盐测序法相结合,研究了KiSS-1启动子甲基化在KiSS-1/GPR54系统中的作用,进一步揭示了KiSS-1/GPR54系统在季节性繁殖调控中所起的作用,为进一步深入的研究季节性繁殖的调控机制和生物防治鼠害提供了科学的理论依据。
[硕士论文] 季志鸿
细胞生物学 郑州大学 2016(学位年度)
摘要:目前鼠害可严重损害经济作物和传播疾病,目前最经济适用的控制技术为不育控制技术。左炔诺孕酮(L)是一种人工合成的孕激素,炔雌醚(Q)是一种人工合成的雌激素,已有很多研究证明二者对不同的鼠类可产生或强或弱的繁殖抑制效果。不育剂让动物不育的同时,也会有有毒性,过高的剂量会导致鼠类中毒致死。因此准确地估计不育剂的毒性尤为重要。CYP1A2是一种细胞色素P450(cytochrome P450,cytochromeCYPs,简称P450)分子,负责一些药物、前毒性物质和前致癌物在体内的活化,口服避孕药可以抑制其活性。布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii)主要分布在俄国外贝尔加湖地区、蒙古北部及东部、黑龙江、吉林、辽宁、河北坝上等地,其破坏草原植被,啃食农作物,传播疾病,造成严重的鼠害。
  本研究以布氏田鼠为研究对象,灌胃给药L、Q,以及二者1:1的混合物,通过石蜡切片鉴定生殖系统变化、ELISA法测生殖相关激素、荧光定量PCR测三种不育剂对CYP1A2 mRNA表达量的影响,来筛选能够指征三种不育剂毒性大小的一种P450分子,从而为鼠害防治提供依据。主要进行了以下几个方面的研究:(1)不育剂对布氏田鼠繁殖的影响(2)不育剂对布氏田鼠生殖系统的影响(3)不育剂对布氏田鼠生殖激素的调控。(4)不育剂对CYP1A2的调控作用。
  主要结果如下:
  (1)Q可以显著降低布氏田鼠的体重,而L不能,在灌胃后14d时降低最为显著。L、Q、L-Q均对布氏田鼠的繁殖起到了抑制作用,表现为怀孕率几乎为0,仅L组有一组生育,且妊娠期延长,胎仔数减少,胎仔未成形,子宫红肿,而对照组怀孕率为85.7%,平均胎仔为4.86±0.53,均显著高于给药组。
  (2)不育剂对雌鼠的子宫有明显的影响,而对卵巢影响不显著,Q可以显著降低子宫重量,L效果不显著。给药组子宫形态呈现变细、变薄、易断现象,但规律性不强。不育剂对睾丸和附睾有明显的影响,Q均可以显著降低布氏田鼠睾丸和附睾的重量,L和L-Q作用效果不显著。切片显示雄鼠睾丸、附睾内曲细精管量减少,管腔空虚,管内精子细胞数减少、凋亡,Q组最为显著,L组、L-Q组不显著。
  (3)两种不育剂对促卵泡刺激素有明显的影响,而对雌二醇、睾酮、皮质酮没有明显的影响。L-Q组的促卵泡刺激素相比对照组有所降低,L、Q和对照组相比无太大变化,双因素方差得 L是起主要作用的因素,Q效果不显著,二者也没有交互作用。也即L可以显著抑制促卵泡刺激素的表达,L和Q对雌二醇、睾酮、皮质酮的表达不起作用。
  (4)不育剂对CYP1A2有明显的影响,Q可以显著抑制CYP1A2的表达,L不能,但二者有显著的交互作用。Q组肝损伤严重,外形糜烂充水,有点状坏死区,颜色变暗,表面粗糙。切片显示肝细胞扩大,组织水肿,肝细胞着色变浅,并伴有出血的状况,肝密度变小,腔隙增多。其他两组结果不显著。
  结论:
  (1)2mg/kg的Q可以抑制布氏田鼠的体重,L和Q均可以降低怀孕率和胎仔数,L和Q均起到了让布氏田鼠不育的目的,同时又不会让老鼠致死。2mg/kg是一个合适的不育剂量。
  (2)Q可以显著抑制睾丸、附睾的发育,对子宫和卵巢无太大影响,它的不育机制是抑制睾丸和附睾内精子的生成和成熟。L对子宫、卵巢、睾丸、附睾作用均不显著。说明Q是一种雄性不育剂。
  (3)L可以显著抑制 FSH的表达,它在激素方面的不育机制是通过抑制FSH的表达来起到抑制排卵的目的。说明L是一种雌性不育剂。
  (4)Q可以显著抑制CYP1A2 mRNA的表达,L效果不显著。CYP1A2抑制表现为明显的肝损伤,Q可以通过显著抑制CYP1A2的表达从而造成肝中毒。
[硕士论文] 王菊霞
草学 兰州大学 2016(学位年度)
摘要:以高原鼠兔为研究对象,采用天敌猫、藏狗、黄鼬和同域分布鼠种高原鼢鼠的粪便作为气味源,利用室内饲养的方法,探讨在不同天敌粪便气味的影响下,高原鼠兔粪便中类固醇激素的变化情况,主要结果如下:
  1.不同天敌的粪便气味对雄性高原鼠兔粪便中的皮质酮、皮质醇和睾酮浓度均有不同程度的影响。与对照相比,猫、藏狗、黄鼬粪便气味对雄性高原鼠兔粪便中的皮质酮浓度有显著促进作用(P<0.05),而高原鼢鼠的粪便气味对鼠兔皮质酮浓度影响不显著(P>0.05),其影响强度顺序为:黄鼬>猫>藏狗>高原鼢鼠。与此类似,不同天敌粪便气味对雄性高原鼠兔粪便中的皮质醇浓度也有显著的影响(P<0.05),其影响强度变化与皮质酮浓度变化相似。而不同天敌气味对雄性高原鼠兔粪便中的睾酮含量均有显著的抑制作用(P<0.05)。
  2.不同天敌粪便气味对雌性高原鼠兔粪便中的皮质酮、皮质醇和孕酮浓度也有不同程度的影响。在猫、藏狗、黄鼬和高原鼢鼠粪便气味的影响下,雌性高原鼠兔粪便中的皮质酮、皮质醇浓度均显著升高(P<0.05),其影响程度由大到小依次为:黄鼬>猫>藏狗>高原鼢鼠(P<0.05);与之相反,受天敌粪便气味的影响,雌性高原鼠兔粪便中的孕酮含量显著下降(P<0.05),其下降顺序为:黄鼬>猫>藏狗>高原鼢鼠(P<0.05)。
  3.不同天敌气味对雌、雄高原鼠兔的体重均有显著的影响,与对照相比,在猫、藏狗、黄鼬和高原鼢鼠粪便气味的作用下,雌、雄高原鼠兔的体重均显著下降(P<0.05),雄性鼠兔在猫、藏狗、黄鼬和高原鼢鼠气味影响下体重分别减少6.37%、5.73%、7.70%和3.18%;而雌性鼠兔在猫、藏狗、黄鼬和高原鼢鼠气味影响下体重分别减少7.75%、7.71%、7.75%和3.52%。
  4.雄性高原鼠兔粪便中皮质酮的浓度分别与猫、藏狗和黄鼬气味处理时间呈显著正相关关系,与高原鼢鼠粪便气味处理时间不相关;皮质醇浓度分别与猫、藏狗、黄鼬和高原鼢鼠粪便气味的处理时间呈显著正相关关系;粪便中的睾酮浓度分别与各类粪便气味的处理时间之间均呈现显著的负相关关系。
  5.雌性高原鼠兔粪便皮质酮的含量与猫、藏狗、黄鼬和高原鼢鼠粪便气味处理时间之间呈显著的二次函数关系;皮质醇含量与猫、藏狗、黄鼬和高原鼢鼠粪便气味的处理时间之间呈显著的正相关关系;而雌性高原鼠兔粪便中孕酮浓度则与各天敌气味处理时间均表现出显著的负相关关系。
  6.雄性高原鼠兔的体重分别与猫、藏狗、黄鼬和高原鼠兔粪便气味的处理时间呈显著的二次函数关系;雌性高原鼠兔的体重与各种粪便气味的处理时间之间亦表现出同样的变化趋势。
[硕士论文] 张小刚
草学 兰州大学 2016(学位年度)
摘要:高原鼢鼠(Myospalax baileyi)是地下啮齿动物中比较常见的一种哺乳动物,主要分布在高海拔地带的地下洞道内,洞道的环境特征主要表现在黑暗、高二氧化碳、低甲烷、低一氧化碳、高氧化二氮、高湿度和低氧等方面。地下洞道内这些独特的环境因素不仅影响地下啮齿动物的行为和生活方式,而且还能够影响到它们的新陈代谢。在长期进化的过程中地下啮齿动物对地下环境形成了各种适应,主要表现在对温度、低氧高二氧化碳、能量和食物缺乏等一系列的适应性。因此,地下啮齿动物与它们生活的洞道微环境之间有着非常密切的关系,对地下啮齿动物洞道环境的研究也更为复杂。论文以青藏高原地带常年生活在海拔2800米以上的高原鼢鼠的地下洞道为研究对象,选择甘南藏族自治州合作、尕海和阿孜代表不同的海拔高度,分别在5月、7月和9月不同生长季实行调查取样,分析探讨不同海拔高度及牧草生长季对高原鼢鼠洞道内二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)、一氧化碳(CO2)、一氧化二氮(N2O)、氧气(O2)和水分含量变化的影响。研究取得以下结果:
  1.高原鼢鼠洞道内各种气体成分的含量在不同地点的变化随时间的变化而异。二氧化碳气体的含量在三个不同的地点均表现出相同的变化趋势,由牧草萌发期到牧草枯黄期呈增加趋势。一氧化碳、氧化二氮气体的变化趋势与二氧化碳气体的变化类似。甲烷含量则表现出相反的趋势:由萌发期至枯黄期呈下降趋势。洞道内氧气含量的变化在三个地点亦表现出相同的趋势:牧草萌发期和牧草枯黄期较高,而牧草生长旺盛期则相对较低。洞道内湿度的变化在合作和阿孜类似,5月最高,7月9月依次下降,而在尕海则是7月最高。
  2.在合作、尕海和阿孜三个不同的地点,有鼠洞道中不同季节的二氧化碳含量均显著高于无鼠洞道内和地面的含量,而无鼠洞道内二氧化碳含量则显著高于地面含量。同时,三地点有鼠洞道内二氧化碳的含量均随着季节的变化,由低增高,而无鼠洞道及地面二氧化碳含量则基本保持稳定。甲烷含量变化则均表现为地面含量高于有鼠洞道和无鼠洞道;一氧化碳含量的变化没有明显的规律性;氧化二氮的含量表现为有鼠洞道内>无鼠洞道>地面;氧气含量的变化三地均表现为有鼠洞道<无鼠洞道<地面,且不同季节的变化规律相似。水分含量在三地均呈现出有鼠洞道>无鼠洞道路>地面的变化趋势,而且不同生长季的变化格局基本类似。
  3.随着海拔高度的增加,各种气体成份表现出不同的变化趋势。二氧化碳含量在不同季节均随着海拔高度的增加而增加,二者间呈显著的正相关关系。甲烷含量的变化与二氧化碳类似,不同季节均与海拔高度呈显著正相关关系。一氧化碳和氧化二氮含量与海拔没有显著相关性。氧气的含量不同季节均随着海拔高度的增加而下降,二者间呈显著负相关性;水分的含量不同季节均与海拔呈正相关关系。
  4.三地高原鼢鼠洞道内二氧化碳气体的含量由牧草萌发期至牧草枯黄期均呈不断增加的趋势,二者间呈显著正相关关系。甲烷含量在三地自萌发期到枯黄期的变化均呈下降趋势,二者间呈显著负相关关系。一氧化碳和氧化亚氮含量的变化与季节之间没有显著的相关性。三地氧气含量的变化与季节间均表现出二次函数关系;水分含量在三地从萌发期到牧草枯黄期均呈不断减少的趋势,二者呈现负相关关系。
[硕士论文] 娄志凯
农业信息化 重庆师范大学 2016(学位年度)
摘要:鸟类危害是指鸟类的觅食行为对农作物产生的危害,鸟类对经济作物的食用导致农民利益受损,严重的导致粮食供应受到影响。尤其是近些年来我国加强了对环境和鸟类生物的保护,野生鸟类越来越多,对农作物产生的危害也越来越大。目前经分析各种驱鸟方法发现超声波驱鸟的效果好,但是需要长时间发声需要耗费大量电力从而造成资源浪费。如果可以通过监测装置检测到鸟类的踪迹,并以此为信号启停超声波驱鸟器,则可以大大降低这种浪费。目前国内外的鸟类检测手段主要包括热成像法、雷达法,图像处理等一系列的方法。前两种检测方法的性价比太低,往往需要昂贵的设备,对于农民阶层很难承受。相比之下,图像处理法则相对廉价,通过摄像头将图像信息传递给微型处理器进行处理即可。这对于连年受鸟害侵袭,不堪其扰的农民来说,性价比较高,也容易推广。图像处理技术中鸟类特征提取以及跟踪作为该驱鸟系统的关键技术。
  首先,本文通过机器学习的方法对ImageNET上的33623个样本进行筛选和数据分析,得到正面鸟类样本31495个,负面鸟类样本1064个。然后,对于原始图像进行小图的扣取,人工分类小图哪些是由鸟类信息的,通过HOG特征提取出这些数据的特征向量,并对其进行窗宽加权,利用机器学习的方法对数据样本进行训练,根据训练的结果得到相对于随机分类更好的局部分类器。将多个局部分类器组合成最终分类器。
  其次,图像转换为信号输入到处理器,处理器通过函数变换对图像信号预处理,比如高斯函数可以消除信号噪点,平滑图像;拉普拉斯可以在平滑的基础上适当锐化图像,增强原有的细节)。然后对于输入图像进行小图划分(20×20),对小图同样进行HOG特征处理和窗宽加权。再次,利用鸟类模型训练过程中训练出的特征模型进行识别,通过MeanShift算法对于鸟类视频进行跟踪。
  然后,以4个常规的MP4格式视频文件作为实验对象,在VS2010环境下进行跟踪目标测试。对于实验的各个视频均能追踪到目标,证明该算法的可行性。
  最后,根据前面的研究,进行一系列的系统分析,来设计前端的系统以及后台管理系统,最终得到智能驱鸟系统的系统设计方案。
[硕士论文] 李莉
园艺 宁夏大学 2016(学位年度)
摘要:在宁夏河东生态园艺试验中心,选择栽植有苹果,桃,李,杏,梨的混栽果树种植区1.67hm2,针对当地果园害鸟种类及危害特点调查,明确其转移危害特点;并且选择2m×3m,3m×4m,3m×5m不同株行距的混栽果园1hm2,调查不同栽植密度对鸟雀啄食果实的影响;选择相同栽植密度的混栽果园0.2hm2,供试品种为富士,分别进行不套袋、套不同果袋3个处理,调查果实套袋对鸟雀啄食果实的影响,分析不同果园管理方式对鸟雀啄食果实的影响。最后,在目前四种常用鸟雀驱避技术方法上加以研究,并且开展遥控无人机驱赶的探索性试验,从防治效果、技术投入成本、挽回损失收益等综合对比,筛选出适宜该区最优的鸟雀驱避技术,并加以推广。具体研究结果如下:
  1.果园内主要危害鸟类有麻雀(Passer montanus)、喜鹊(Pica pica)、乌鸦(Corvus coeone)、斑鸠(Streptopelia turtur)等。不同鸟类活动规律不同,麻雀的活动早晨多于傍晚,喜鹊的活动傍晚多于早晨,乌鸦觅食行为主要集中在中午,斑鸠主要在早晨和下午两个时间段内觅食。栽植区内早熟品种受鸟雀危害较为严重,随着其它品种果实相继成熟,鸟雀便转移危害。
  2.果园内不同管理方式对鸟雀啄食果实影响不同,果树栽植密度越大,鸟雀危害果实程度越严重;果实不套袋较套袋果受鸟雀危害严重,并且套双层内黑蜡纸袋果实比套双层内红蜡纸袋果实受鸟雀危害严重。
  3.在相同品种条件下,4种鸟雀驱避技术防鸟害的防效程度以有色防鸟网阻隔技术效果最好,持效性最长,稳定性最好,以早熟品种为例,有色防鸟网技术下果实受啄率降低程度最大,为97.36%,生物驱避剂次之,果实受啄率降低程度为88.46%;然后是超声波驱鸟器,果实受啄率降低程度为42.07%;驱避效果最差、持效性最短、稳定性最差的是风力驱鸟器,果实受啄率降低程度为39.90%。
  4.早熟品种、中熟品种、晚熟品种依次受害,并且受害程度依次降低。
  5.遥控无人机驱避技术防治效果仅次于防鸟网驱避技术,在试验区域内防治鸟害效果较好。
[硕士论文] 王婷
生物学 曲阜师范大学 2016(学位年度)
摘要:动物的繁殖活动是由众多因子通过错综复杂的神经内分泌系统调节下丘脑-垂体-性腺轴活动的一个极其复杂的过程。动物为了获得最大的繁殖成功率,只在特定的季节进行繁殖活动,这种现象称为季节性繁殖。季节繁殖是影响动物种群数量波动的主要原因之一,Tac3/Tacr3在调节动物季节性繁殖活动中发挥着重要作用。Tac3编码神经激肽B(NKB),NKB是一种含有特定的十个氨基酸的多肽;Tacr3编码NK3R,NK3R是NKB的天然受体,属于视紫红质七次跨膜G蛋白偶联受体家族。黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是典型的季节性繁殖动物,具有春、秋两个繁殖高峰期,是研究动物季节性繁殖机制的理想模型。本研究以黑线仓鼠为材料,采用分子生物学方法和技术,检测Tac3/Tacr3在黑线仓鼠的不同组织、不同发育阶段及不同季节的差异表达,揭示Tac3/Tacr3系统参与动物季节性繁殖活动的调控机理,旨在从分子水平上探究黑线仓鼠种群数量的季节性爆发机制。
  首先,以黑线仓鼠下丘脑为材料,采用普通PCR扩增的方法得到黑线仓鼠Tac3 cDNA序列396bp(GenBank登录号:KU519331),包括完整的编码区序列360bp;获得Tacr3 cDNA序列1256bp(GenBank登录号:KU519332),包括编码区序列1244bp。对其进行生物信息学分析,建构系统发育树。
  Tac3编码119个氨基酸残基,前21个为信号肽区域,C末端含有一个高度保守的结构功能域,即特征性十肽-Asp-Met-His-Asp-Phe-Phe-Val-Gly-Leu-Met,是速激肽家族的典型特征。速激肽保守的羧基末端,是速激肽作用于受体的基本结构,这种进化过程中的高度保守性说明这一类肽在生命活动中有着不可替代的重要作用。Tacr3编码区长1244bp,编码414个氨基酸残基,对二级结构进行分析表明整体疏水性较强。SMART对所得氨基酸序列进行相关结构分析,发现该序列存在7个明显的高疏水区域,而这七个高疏水区组成七个完整的α螺旋结构域,属于典型的G蛋白偶联受体家族视紫红质亚家族。使用MEGA5.0软件对黑线仓鼠的Tac3/Tacr3核苷酸序列与中国仓鼠、金黄仓鼠、牛、人等多个物种的相应核苷酸序列进行比对,构建了系统发育树,所得结果与传统物种分类结果相一致。
  其次,采用实时荧光定量PCR技术检测Tac3和Tacr3在黑线仓鼠不同组织器官、不同发育阶段、不同季节中的相对表达量,采用酶联免疫反应检测了不同发育阶段、不同季节黑线仓鼠血清中NKB/NK3R(Tac3/Tacr3表达蛋白)的浓度,探究该系统对繁殖活动的调控模式。
  通过检测Tac3和Tacr3在组织器官间的差异表达,发现Tac3和Tacr3在黑线仓鼠下丘脑中表达量远远高于在肝、肾、脾等其他器官组织中的表达量(P<0.01),而且血清中蛋白含量在不同发育阶段差异并不显著(P>0.05),表明Tac3/Tacr3系统主要在中枢神经系统中发挥调控作用,下丘脑是Tac3/Tacr3系统作用的关键部位。
  通过检测Tac3和Tacr3在不同发育阶段的差异表达,发现Tac3和Tacr3在雌性黑线仓鼠幼体时期表达量最高(P<0.05),在雄性黑线仓鼠亚成体时期表达量最高(P<0.05),推测该系统参与调控黑线仓鼠生殖活动的启动,而且时间上存在着雌雄异型,主要体现在发育时期变化上。
  季节性差异表达检测结果表明,发现黑线仓鼠下丘脑中,Tac3在春秋季节的表达量显著高于夏冬季节(P<0.05),与GnRH的季节表达模式相一致,也与黑线仓鼠季节性繁殖规律相一致,推测Tac3的表达能促进GnRH的分泌,对黑线仓鼠的繁殖调控起到促进作用。雌性黑线仓鼠下丘脑中,受体基因Tacr3在夏秋季的表达量高于春冬季节(P<0.05),而雄性个体在春秋季节的表达量高于夏冬季节(P<0.05),这与GPR54(KiSS1受体)基因的表达结果大致相同,推测黑线仓鼠中Tac3/Tacr3系统与KiSS1/GPR54系统有着密不可分的联系。Tacr3在雌性黑线仓鼠的下丘脑中夏季表达水平最高(P<0.05),推断此现象可能与光照时长有关,Tacr3的表达能够显著的受到光照长度的正向调控。但是在卵巢中夏季的表达水平并不是最高,中枢和外周表现不一致,可能是由于复杂的生理调控机理造成的。
  综上所述,本研究探究了Tac3和Tacr3在黑线仓鼠的不同组织器官、不同发育阶段及不同季节的差异表达模式,从分子水平探究了黑线仓鼠内分泌神经肽系统参与季节性繁殖的调控机制,为种群数量波动与暴发的遗传机制以及鼠害治理提供理论依据。
[硕士论文] 徐洋洋
生物学 曲阜师范大学 2015(学位年度)
摘要:在一些动物中,其生殖活动表现出明显的季节性节律,生殖行为常常在特定的季节发生,即季节性繁殖,黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是典型的季节性繁殖动物,同时也是我国北方地区对农田作物危害程度极大的物种之一。GDF9和 BMP15是 TGFβ超家族中的重要成员,参与调控卵泡生长、分化等生理过程,调控雌性哺乳动物繁殖。本研究运用RT-PCR和FQ-PCR技术探寻GDF9和BMP15在黑线仓鼠中的表达规律,探讨光周期对黑线仓鼠卵巢功能的影响,为掌握黑线仓鼠的繁殖机制提供理论基础,同时为哺乳动物繁殖的环境条件控制及鼠害防治策略的制定提供科学理论依据。
  本研究克隆得到黑线仓鼠GDF9cDNA序列1364bp(KM272986),含完整CDS1329bp;BMP15cDNA序列1253bp(KM369986),含完整CDS1179bp。对GDF9和BMP15序列进行生物信息学分析,二者在理化性质,二级结构、三级结构以及进化聚类等方面显示出较高的相似度,在进化上均相对保守;对预测出的氨基酸序列分析,二者均含典型TGFβ结构域和6个Cys,而TGFβ家族大多数成员多为7个,这提示GDF9与BMP15可能以非共价键连接,使之以同源或异源二聚体行使功能。
  不同发育阶段以及不同组织定量结果显示GDF9、BMP15在黑线仓鼠多个组织(肝脏、子宫、肾脏、脾脏、下丘脑、卵巢)中均有表达,卵巢中表达丰度相对较高,说明该基因对黑线仓鼠雌性生殖功能的调节可能具有重要作用;GDF9、BMP15不同发育时期的表达水平也有差异,卵巢中二者的表达都在成体发情期中最高,下丘脑中都在亚成体中最高,此差异表明GDF9、BMP15的表达都存在发育阶段特异性,且不同发育阶段基因主要作用的靶器官可能不同。
  GDF9、BMP15在黑线仓鼠卵巢组织中高繁殖季节的表达水平显著高于其他季节(P<0.05),进一步证明GDF9、BMP15在卵泡发育中发挥重要作用。研究不同光周期下黑线仓鼠的体重、脏器系数、性腺激素含量等变化,表明短光照对黑线仓鼠繁殖有抑制效应,长光照在一定程度上有促进效应;GDF9、BMP15在不同光周期条件下表达水平的差异响应了光周期的变化,短光照组GDF9、BMP15 mRNA水平均显著高于长光照组(P<0.05),表明GDF9、BMP15的表达水平可能受到光周期的调节,GDF9、BMP15的具体作用机制可能是在短光照诱导的卵巢退化过程中发挥抗凋亡作用,通过抑制颗粒细胞凋亡促进卵泡存活,从而减少卵泡闭锁;对短光照处理4周的仓鼠再进行4周长光照(PT组),GDF9、BMP15 mRNA水平显著低于短光照组(P<0.05),表明长光照在一定程度上能缓解并恢复短光照对繁殖产生的抑制,但是 PT组与长光照组相比,PT组BMP15的表达水平显著高于长光照组(P<0.05),GDF9的表达水平与长光照组无显著差异,暗示GDF9和BMP15可能在光刺激卵巢功能恢复的过程中发挥不同的调节作用。
[博士论文] 张义锋
有机化学 郑州大学 2014(学位年度)
摘要:食物贮藏行为是鼠类的基本行为之一,一直以来都受到学者们的关注,研究的方向主要集中于:鼠类对林木种子的扩散和处理及对种子命运的影响;贮藏者之间的关系;贮存者与天敌之间的关系;蛀果昆虫对种子的影响、林木种子特征对鼠类食物贮藏行为的影响等方面,重点关注鼠类如何作用于植物,而对于植物对种子捕食者的反作用研究较少。本文从鼠类和昆虫的取食行为及栓皮栎(Quercusvariabilis)种子的特征入手,研究了鼠类如何取食和扩散种子、蛀果昆虫如何取食栓皮栎种子、栓皮栎种子如何应对鼠类和昆虫的捕食,以及鼠类-栓皮栎种子-昆虫之间的互作关系等。本研究于2007-2013年在太行山愚公地区进行,主要研究内容和结果如下:
  (1)基于长期的调查结果,阐明了鼠类对栓皮栎种子的扩散方式受到年际和生境的显著影响。扩散距离年际间差异显著、生境间差异极显著;
  (2)阐明了当地的6种鼠类在林木种子扩散中的作用和地位,发现只有大仓鼠(Cricetulustriton)仅集中贮藏种子,是纯粹的种子消费者,而岩松鼠(Sciurotamiasdavidianus)、花鼠(Eutamiassibiricus)、社鼠(Niviventerconfucianus)、大林姬鼠(Apodemuspeninsulae)、黑线姬鼠(A.agrarius)等5种鼠均表现出分散贮藏行为,有利于种子的扩散;首次证实社鼠在本地区对栓皮栎种子以分散贮藏为主;
  (3)描述了鼠类对栓皮栎种子的取食特征,共分为5种类型,揭示了鼠类有不完全取食种子且将种子残余物分散贮藏的行为,有30%-40%的种子被部分取食但胚被保留;首次发现了小型鼠类对栓皮栎种子的剥皮后贮藏行为,全面阐述了鼠类对发芽种子的切根后贮藏行为;通过围栏实验发现,岩松鼠、大仓鼠、社鼠、大林姬鼠和黑线姬鼠均有部分取食种子的行为,但只有社鼠和大林姬鼠有分散贮藏种子残余物的行为,大仓鼠和社鼠有剥皮行为,岩松鼠、大仓鼠、社鼠、大林姬鼠和黑线姬鼠均表现出切根行为;
  (4)首次全面描述了昆虫对栓皮栎种子的取食特征,可将其分为5种取食类型;84.27%的种子被昆虫部分取食,且倾向于从远离胚的位置取食;大部分虫蛀种子(63.30%)的胚保持完好,仍具有发芽和建苗的能力;
  (5)证明了在发育的不同阶段,栓皮栎种子采用不同的策略以逃避鼠类的捕食,包括种子产量波动、快速发芽、残余物发芽、种子被切根后二次发芽和种子被取食后根部重新发芽建苗等5种策略;证明了栓皮栎种子可以通过种子产量波动、能量过剩和寄生昆虫被鼠类取食等3种途径应对昆虫的取食。
  总之,通过本研究,较为全面系统地阐述了鼠类和昆虫对种子的取食特征和植物应对鼠类和昆虫捕食的途径,最后探讨了种子-鼠类-昆虫之间的相互关系及协同进化。发现种子在为鼠类提供能量促进其扩散种子的同时,又进化形成或借助一些途径减少捕食者的过度取食,以增加自身生存的机会;鼠类在取食种子的同时,又能对种子的扩散产生一定的积极作用;鼠类对昆虫的取食和控制即增加了自身食物资源的供应,又避免了昆虫的过度繁殖。种子、鼠类和昆虫三者之间最终达到一种互为有利并相互制约的平衡。
[硕士论文] 耿晓翠
动物学 曲阜师范大学 2014(学位年度)
摘要:季节性繁殖是黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)对温带生态因子季节变化的适应机制之一,也是造成其种群数量波动的重要因素。研究阐明黑线仓鼠繁殖调控的分子机制有利于制定科学高效的综合措施预防和控制鼠害,具有重要的现实意义。
  哈氏腺(Harderian gland,HG)亦称瞬膜深部第三眼睑腺,广泛分布在眼眶内侧。在形态上,哈氏腺存在明显的物种差异,不同发育时期其形态也有所差异,有些物种还具有明显的性别二态性特征。在功能上,哈氏腺被认为是目前未能彻底证实功能的,广泛分布在脊椎动物体内的最后的大型结构。其功能除了分泌粘液,润滑眼球外,还可能涉及免疫、感光保护器以及体温调节等。已有研究证实哈氏腺具有感光作用,且其生理活动受神经-体液的双重调控。HG与松果体在功能、产物成分上有较多相似之处,例如在二者中都检出了褪黑素及其受体、生长抑素。HG可能作为松果体的“候补”结构,参与视网膜-松果体轴的组成,因此可能是调控季节性繁殖的重要靶器官。
  生长抑素(somatostatin, SS)能够影响催乳素(PRL)、促性腺激素(LH、FSH)等的分泌,同时 SS能够通过抑制下丘脑GnRH的释放,间接影响子宫生理功能。因此, SS可能与GnRH共同参与了动物的生殖功能调控。然而,黑线仓鼠哈氏腺内是否有SS的表达,其表达模式是否与GnRH有关,都尚未见报道。
  鉴于HG结构复杂,且功能及其调控机制不清,在本实验室前期研究克隆黑线仓鼠GnRH部分序列的基础上,初步探究了黑线仓鼠 HG形态组织结构特征,通过RT-PCR克隆哈氏腺SS基因序列,并利用实时荧光定量PCR方法探究HG中SS与GnRH的基因表达模式。
  形态学观察和测量表明:黑线仓鼠HG为浅粉色,呈扁哑铃型,两眼球相对的一侧较小,外侧较大;长度与重量随年龄而变化,不同季节条件下,长度、重量也有差异。石蜡切片、HE染色的组织学研究表明:黑线仓鼠HG为复管泡腺,镜下明显看到腺体外有一层结缔组织被膜,被膜延伸将腺体分为许多小叶。每一小叶含较多腺泡,腺泡由圆柱形或锥体形上皮细胞围成大小不一的孔腔;导管深入实质部分,有的腺腔内填充有内容物。形态及组织学的研究结果提示哈氏腺功能的活跃性和复杂性。
  采用RT-PCR方法克隆测序得到HGSS cDNA序列489bp,注册于Genbank,登录号为:KF318861。该序列包括完整编码区序列351bp,编码116个氨基酸。14个氨基酸残基构成SS-14肽,其中Phe6,7,11、Trp8形成疏水区,影响分子构象活性,其他氨基酸维持该肽环形结构。利用该基因序列进行系统进化分析,结果显示:黑线仓鼠与大、小鼠的亲源关系最近,与原鸡、非洲爪蟾、斑马鱼等亲缘关系最远,这与传统分类结果一致,说明该基因结构相对保守。
  应用实时荧光定量PCR技术,检测不同发育时期(亚成年期、成年发情期、老年期)、不同季节(春、夏、秋、冬)黑线仓鼠哈氏腺中SS、GnRH的相对表达情况。结果发现SS、GnRH在不同发育时期HG中的相对表达模式,呈现出老年期<成年期<亚成年期的规律,雌雄皆然。GnRH在不同发育时期的相对表达模式与在下丘脑中的研究结果也相一致,说明可能与黑线仓鼠的繁殖调控有一定联系。不同季节发情期黑线仓鼠HG中SS与GnRH的相对表达,结果显示SS与GnRH春秋季的表达量低于夏冬两季。由于春秋季是黑线仓鼠的繁殖高峰季,提示SS、GnRH可能与黑线仓鼠的季节性繁殖调控有关。
  以上研究结果为后续研究SS、GnRH在黑线仓鼠中的功能与分子调控机制奠定基础,为探究黑线仓鼠HG的功能提供了实验证据,也为农田鼠害科学防治措施的提出补充科学依据。
[硕士论文] 林佩佩
生物化学与分子生物学 曲阜师范大学 2014(学位年度)
摘要:黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是我国北方农田的优势害鼠之一,以其分布广,繁殖力强,种群数量大,给人们的农业生产和日常生活带来严重危害。受温度、光照、食物等多种因素的影响,黑线仓鼠的繁殖行为存在季节性,每年的春季和秋季是其种群数量增长的高峰期。雌激素是主要的性激素,通过与其受体的结合调控动物的繁殖,但具体调控的分子机制尚不清楚。雌激素受体(Etrogen receptor,ESR)是核受体超家族的一员,分为两个亚型ESRα和ESRβ。ESRs不仅参与动物下丘脑-垂体-性腺轴的繁殖活动调控,而且参与和繁殖密切相关的脂肪代谢、血糖代谢、摄食等能量代谢及机体的应激反应。本研究通过检测黑线仓鼠体内ESRα和ESRβ在不同季节、不同器官中的差异表达,为研究ESRα和ESRβ的生物功能及其分子调控机制奠定基础,为研究黑线仓鼠的季节性繁殖调控机制提供科学依据,为鼠害的防治提供理论依据。
  首先,用RT-PCR方法克隆黑线仓鼠ESRα和ESRβ的cDNA序列,研究得到黑线仓鼠ESRα序列1017 bp,全部为编码区,Genbank登陆号:KC345615;ESRβ的cDNA序列896 bp,全部为编码区,Genbank登录号:KF267446。运用生物软件分别对二者的序列结构分析,发现ESRα存在14个磷酸化位点,ESRβ存在13个磷酸化位点,在二者的A/B功能区磷酸化位点存在差异,ESRα具有4个连续的丝氨酸磷酸化位点,而ESRβ则不具有这一结构,推测这跟两种受体在机体内的生理功能不同有关。二级结构预测发现ESRα和ESRβ都含有较多的α螺旋和Turn转角Coil卷曲螺旋,都具有较强的亲水性。构建ESRα和ESRβ的分子系统进化树结果显示二者都是与同是啮齿类的大鼠、小鼠最先聚为一类,其次是与灵长类的人和狒狒以及偶蹄目的绵羊、牛和野猪聚为一类,最后与原鸡和三文鱼聚类,二者的分子系统进化树结果与传统的分类结果相一致,显示ESRα和ESRβ功能的重要性和进化的相对保守性。
  其次,本研究采用实时荧光定量方法检测ESRα和ESRβ在黑线仓鼠不同组织的表达差异。结果显示:ESRα在子宫、卵巢、肾上腺、下丘脑、附睾的相对表达量高,ESRβ在卵巢、子宫、下丘脑、大脑、睾丸中相对表达量较高,二者在脾脏中的相对表达量都较低。对两种雌激素受体在同一组织的相对表达量分析发现,在雌性黑线仓鼠体内ESRα在下丘脑、肾上腺和子宫的相对表达量极显著高于ESRβ(P<0.01),ESRβ只在卵巢的表达量高于ESRα,二者差异不显著。在雄性黑线仓鼠体内,对比两种受体在同一组织的相对表达量,ESRβ在睾丸中的表达量显著高于ESRα(P<0.05);在附睾、肾上腺、肾脏中ESRα的表达量高于ESRβ,在肾脏中二者的相对表达量存在极显著差异(P<0.01);在下丘脑和大脑中,二者的差异不显著。
  最后,用实时荧光定量PCR的方法检测ESRα和ESRβ在不同季节黑线仓鼠体内不同组织的差异表达。结果显示:在雌性下丘脑中,ESRα的表达量有冬季>夏季>春季>秋季,冬季表达量与其他三个季节存在极显著差异(P<0.01);ES Rβ的表达量有冬季>夏季>秋季>春季,冬季表达量与春季和秋季的表达量有极显著差异(P<0.01);不同季节的雌性下丘脑中,ESRα的相对表达量都高于ESRβ的表达量,冬季二者的表达有极显著差异(P<0.01)。在雄性下丘脑中,ESRα的相对表达有秋季>冬季>夏季>春季,ESRβ的相对表达没有季节性差异;不同季节的雄性下丘脑中,ESRβ的相对表达量都高于ESRα的表达量。在卵巢中,ESRα的相对表达量有春季>夏季>秋季>冬季,冬季与春季的相对表达量有显著差异(P<0.05);ESRβ在卵巢中的相对表达量有冬季>秋季>春季>夏季,冬季和秋季的相对表量有极显著差异(P<0.01);不同季节的卵巢中,ESRβ的相对表达量都高于ESRα的表达量,二者的相对表达在春季存在极显著差异(P<0.01),在夏季和秋季有显著差异(P<0.05)。在睾丸中,ESRα的相对表达量有冬季>夏季>春季>秋季,冬季的相对表达量与春季和秋季的相对表达量有极显著差异(P<0.01),与夏季的相对表达量有显著差异(P<0.05);ESRβ在睾丸中的相对表达量有冬季>春季>夏季>秋季,冬季的相对表达量与其他三个季节有极显著差异(P<0.01);在不同季节的睾丸中,ESRβ的相对表达量都高于ESRα,二者的相对表达在冬季有极显著差异(P<0.01)。因此推测:ESRα主要参与了雌激素参与的对黑线仓鼠季节性繁殖的负反馈调节,在生殖器官卵巢和睾丸中,ESRα和ESRβ协同参与黑线仓鼠的繁殖。
[硕士论文] 赵磊
动物学 曲阜师范大学 2014(学位年度)
摘要:我国农田鼠害问题严重,给农业生产造成了极大困扰;并且害鼠能传播疾病,对人类生存也是一个严重威胁。因此鼠害治理工作的开展显得尤为必要,其成功防治将具有重要且深远的意义。黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是我国农田的主要鼠种,繁殖力强且危害严重,并具有季节性暴发的特点。本研究旨在通过检测黑线仓鼠繁殖候选基因RFRP-3在中枢组织及外周组织的表达模式,期望揭示黑线仓鼠繁殖的内在分子调控机制,为进一步深入阐明黑线仓鼠种群动态年际波动机理提供理论依据。
  研究选取黑线仓鼠为实验材料,采用RT-PCR技术克隆了繁殖相关基因RFRP cDNA序列;利用实时荧光定量PCR技术检测了RFRP mRNA在黑线仓鼠成体不同组织的表达情况;并在此基础上对两个重要的通路节点基因RFRP和GnR H在不同发育时期、不同发情时期及不同季节繁殖轴组织中的表达水平进行了研究,获得如下结果:
  1、克隆获得黑线仓鼠RFRP基因cDNA共643 bp,包括570 bp的ORF,共编码SPAPANKVPHSAANLPLRF-NH2(黑线仓鼠RFRP-1)和TLSRVPSLPQRF-NH2(黑线仓鼠RF RP-3)两种RF酰胺相关肽(RFRPs)序列。RFRP基因序列生物信息学分析显示,RFRP是一种跨膜蛋白,且其结构在进化过程中相对保守,预示了RFRP具有保守且重要的生物学功能。
  2、RFRP mRN A在黑线仓鼠表达较为广泛,下丘脑、子宫、卵巢、睾丸组织中均有RFRP mRNA表达,提示RFRP-3功能的多样性,且RFRP mRNA在下丘脑的表达量极显著高于其他组织(P<0.05),提示RFRP-3的作用可能主要通过脑内机制实现。
  3、黑线仓鼠不同发育时期、不同发情时期RFRP mRNA的表达量存在显著差异,呈现出以中枢组织(下丘脑)表达为主、外周组织(卵巢、子宫、睾丸)表达为辅的特点。与雌性老体相比,雌性成体下丘脑中RFRP mRNA的表达量显著降低(P<0.05);与雄性亚成体和老体相比,雄性成体下丘脑中RFRP mRNA的表达量显著增加(P<0.05)。结果表明RFRP mRNA在雌性黑线仓鼠的表达与RFRP-3抑制生殖的功能相一致,RFRP mRNA在雄性个体的表达与RFRP-3抑制生殖的功能不完全一致。同时RFRP mRNA在雌性成体发情期的表达量显著低于成体其他发情时期(P<0.05),这一结果也进一步表明了RFRP-3可能抑制雌性黑线仓鼠的生殖。
  4、四季黑线仓鼠下丘脑中RFRP mRNA的表达量显著高于外周性腺组织(P<0.05)。与春季、秋季和冬季的雌性个体相比,夏季雌性个体下丘脑中RFRP mRNA的表达量显著增加(P<0.05);与春季、夏季和秋季的雄性个体相比,冬季雄性个体下丘脑中RFRP mRNA的表达量显著增加(P<0.05)。结果提示在不同季节RFRP mRNA的表达可能受到光周期的影响,并且光周期对RFRP-3的调控机制可能存在性别差异。同时,研究发现血清中MT与RF RP-3浓度的变化表现出了一致性,表明RF RP-3的合成分泌可能依赖于体内光信号MT的释放,并且RFRP-3可能受到MT的直接调节。雌性夏季下丘脑中RFRP mRNA的表达量高于秋季(P<0.05),雌性夏季下丘脑中GnRH mRNA的表达量低于秋季(P<0.05);雄性冬季下丘脑中RFRP mRNA的表达量高于春季(P<0.05),雄性冬季下丘脑中GnRH mRNA的表达量低于春季(P<0.05)。结果表明RFRP mRNA在黑线仓鼠的表达与RFRP-3抑制黑线仓鼠季节性繁殖的功能相一致,这暗示了黑线仓鼠季节性繁殖可能存在“光周期-MT-RFRP-3-GnRH”调控通路。
[硕士论文] 李申宁
动物学 曲阜师范大学 2014(学位年度)
摘要:我国为传统的农业大国,农作物种类多,且分布广。农作物所遭受到的生物灾害复杂多样,危害严重,如鼠害的发生已对农牧业发展以及人类生活健康造成了严重威胁。因此,要想从根源上治理鼠害,需使用有效的分子生物学或生态平衡等措施,更便捷、更具有针对性的防治鼠害。黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是我国华北地区典型的害鼠之一,其繁殖方式具有伴随季节周期性转变的特点,实验以黑线仓鼠为研究对象,既是研究哺乳动物季节性繁殖的良好材料,又为治理鼠害提供理论依据。本研究以分子生物学方法和技术,研究与繁殖相关的中枢调控基因KiSS-1及其受体GPR54的表达模式,以揭示KiSS-1/GPR54调控通路在连接光照等季节性因素和繁殖机制中所起到的主要作用。
  首先,采用RT-PCR方法克隆黑线仓鼠GPR54基因全部cDNA序列,进行生物信息学分析,对与其配体KiSS-1的相互作用方式进行探究,以便通过两者的结合作用模式了解KiSS-1/GPR54调控通路的功能位点。克隆获得黑线仓鼠GPR54基因序列1102bp,其中包括全部编码区序列939bp(GenBank登录号:KF006323)。对GPR54基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析可知,翻译共获得213个氨基酸,对二级结构进行分析表明整体疏水性较强。将所获得的GPR54氨基酸序列与小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、人(Homo sapiens)等相应序列相比对,发现存在240bp左右的片段缺失,使用PredictProtein工具预测跨膜结构,仅能预测出黑线仓鼠GPR54氨基酸序列的6次跨膜结构,不具有典型的G蛋白偶联受体7次跨膜,推测可能是由于缺失片段造成了跨膜区域的中断,并与其配体KiSS-1的特异性识别位点结合有关。使用MEGA5.0软件对所获得的GPR54 mRNA序列构建了系统进化树,所获结果与传统分类学结果一致。
  其次,检测外源褪黑激素对黑线仓鼠中枢神经和外周性腺KiSS-1/GPR54系统以及GnRH的表达模式,验证KiSS-1/GPR54系统在生殖活动中起到的作用。本研究采用外源褪黑激素注射(15天)的方式,且注射期间对黑线仓鼠的体重进行跟踪监测。雌雄处理组的体重在进行褪黑激素注射后分别于第9日和第12日开始显著低于对照组。处死后对脏器系数进行检测,对照组与处理组黑线仓鼠的副性器官(子宫、附睾)具有显著差异(p<0.05),而性腺系数差异不显著(p>0.05)。随后通过实时荧光定量PCR方法,对黑线仓鼠的中枢神经系统和外周性腺KiSS-1、GPR54 mRN A的表达差异进行了检测。结果显示:处理组下丘脑中KiSS-1基因表达量显著低于对照组(p<0.05),雌雄黑线仓鼠的性腺KiSS-1及其受体GPR54表达量也具有显著性差异(p<0.05),提示褪黑激素可能通过对KiSS-1/GPR54系统的抑制从而进一步抑制黑线仓鼠的繁殖活性,此系统可能是介导光照和黑线仓鼠繁殖的重要调控通路。对下丘脑GnRH的表达模式进行检测表明,对照组与处理组的GnRH的表达量也存在显著差异(p<0.05),且均于下丘脑KiSS-1 mRNA表达趋势相一致。推测,KiSS-1、GPR54以及GnRH都是作用于下丘脑-垂体-性腺轴进而调控繁殖活性的重要因子。
  最后,对自然季节黑线仓鼠KiSS-1、GPR54基因的表达量进行检测,并使用激素含量检测和实时荧光定量两种方式,验证了黑线仓鼠KiSS-1/GPR54系统对繁殖活动的季节性调控及生殖发育的作用。其中,对血清中褪黑激素和Kisspeptin的含量进行分析,发现光周期作为调节因子发挥了重要作用。对中枢神经下丘脑KiSS-1基因的表达量检测发现雌雄黑线仓鼠均为夏季表达量最高,GPR54的表达则有性别差异,雌性为冬季显著低于其他三个季节(p<0.05),雄性则表现为夏季显著性低表达(p<0.05)。对外周性腺检测发现,卵巢KiSS-1和GPR54表达量均呈现出春季显著高表达(p<0.05),睾丸中则呈现了不同的表达模式,即春、秋季节KiSS-1表达量显著高于夏、冬季(p<0.05),而GPR54的表达量为春、秋季低于夏、冬季,表现一种对其配体KiSS-1代偿性的增加。综合推断,下丘脑的表达模式可能更趋向于受到外界环境因子调控,性腺的表达则更多的与黑线仓鼠的繁殖活动的季节循环周期相一致,而雌雄性腺KiSS-1 mRNA所呈现的不同的表达模式,推测是由于下丘脑不同核区对性激素的正负反馈机制存在性别差异,使中枢神经系统发出的不同信号对机体的繁殖调控产生了雌雄表达模式差异。
  综上所述,本研究通过自然季节取样和褪黑激素处理两种方法证实了KiSS-1/GPR54系统在介导季节性繁殖中至关重要的作用,特别是褪黑激素介导光周期对黑线仓鼠的下丘脑-垂体-性腺轴繁殖活性的调控。更深入的从分子水平验证了黑线仓鼠的季节性繁殖机制,从基因水平为更好的防治鼠害提供理论依据。
[硕士论文] 张振宇
基础数学 中北大学 2013(学位年度)
摘要:我国是一个害鼠频繁发生的国家,针对农牧业鼠害的严重性,我国自1986年起将鼠害的治理研究纳入国家“七五”攻关计划,以后又纳入“八五”、“九五”科技攻关计划.通过近十余年来的攻关研究,我国农牧业鼠害研究工作取得很大成绩.为了挖掘有效的防控措施,本文做了以下研究:
  1.文章第二章考虑了竞争性繁殖干扰,建立了免疫不育控制的模型,通过对不同的性别结构进行了比较,来研究不育控制下有性别结构的种群动态.在理论上分析了不育控制的可能作用,以期所得到的结论能为实施不育控制提供理论依据.在采用不育技术控制有害动物时,通常将实际参与繁殖的雌雄个体的比例称为竞争性繁殖干扰系数,它与种群的婚配制度及交配行为有密切的关系.本文假设,害鼠的婚配制度是一夫N妻,竞争性繁殖干扰系数为MM+m,假设密度制约只作用于出生率,建立了对雌、雄个体分别进行免疫不育控制的模型.
  2.第三章研究害鼠不育控制中不育疫苗病毒对害鼠作用过程中,考虑害鼠食草后到转化为能量用于繁殖后代所需要的时间(即害鼠的妊娠期),加入时滞更能切合实际的反映生物间的交互作用.假设,害鼠食草后到转化为能量用于繁殖后代所需要的时间(即害鼠的妊娠期)忽略不计,建立以下具有时滞的传染病捕食被捕食模型.
  3.用数学模型描述斑块环境下种群的扩散问题是数学生态学中最有趣的问题之一,事实上,在生态环境中扩散经常发生,也就是说,种群能在不同的斑块之间扩散.考虑到害鼠存在扩散现象,本文建立了反应扩散动力学模型来研究害鼠的迁移如何导致并影响害鼠的空间传播.对于反应扩散模型,本文讨论了正平衡点的稳定性.通过研究得出结论:对于反应扩散模型,正平衡点仍然稳定,即不会出现空间斑图:害鼠的移动不但导致了行波解的出现,还引起害鼠空间上的扩散,为防止鼠害的扩散政府应加强对鼠害的监管,如果要消除鼠害,还需要免疫等其它的防控措施.
[硕士论文] 石佳
生物化学与分子生物学 扬州大学 2013(学位年度)
摘要:6-甲氧基-2-苯噁唑啉酮(6-MBOA)是植物中的一种次生代谢物,在禾本科植物的幼嫩部位中含量较高,被认为可以促进植食性哺乳动物的繁殖。为进一步阐明动植物间的协同进化,本研究运用组织学、生理学和生物化学的相关研究方法,在室内条件下以室内养殖的布氏田鼠为研究对象,通过腹腔注射不同剂量6-MBOA,确定6-MBOA对布氏田鼠幼年性成熟及成年繁殖的影响,验证6-MBOA能促进布氏田鼠繁殖的假说,为探讨布氏田鼠的繁殖策略提供理论依据。研究结果如下:
  1)21天日龄幼年布氏田鼠连续注射6-MBOA30天后,雄性田鼠高剂量组体重显著高于对照组,低剂量组血清睾酮激素水平显著高于对照组,但性腺指数及睾丸下降率在不同处理组间没有显著差异。而雌性布氏田鼠中剂量组阴门开放时间显著早于对照组;低剂量组血清雌激素水平显著高于对照组和高剂量组。不同处理对雌鼠体重及其它他性腺指数均没有显著影响。
  2)成年布氏田鼠短期连续注射6-MBOA后,雄性田鼠低剂量组和中剂量组血清睾酮水平显著高于对照组和高剂量组,中剂量组免疫球蛋白G水平显著高于对照组和低剂量组,但各剂量组褪黑素水平均显著降低;雌性田鼠低剂量组血清雌激素水平显著高于对照组和高剂量组,中剂量组也显著高于高剂量组。
  3)成年布氏田鼠长期注射6-MBOA后,不同处理组在体重方面没有显著差异;但雄性田鼠睾丸指数在中剂量组和高剂量组显著低于对照组,储精囊指数在高剂量组显著低于其它3组;血清睾酮激素水平在低剂量组、中剂量组和高剂量组均显著低于对照组;对照组生精上皮的厚度显著大于低剂量组、中剂量组和高剂量组,低剂量和中剂量组显著大于高剂量组。雌性田鼠子宫系数在低剂量组和中剂量显著高于高剂量组,卵巢系数在高剂量组显著低于对照组和中剂量组;而FSH则在中剂量组显著高于高剂量和低剂量组。
  以上结果表明,6-MBOA能提高幼年布氏田鼠的性激素水平并能缩短雌鼠阴门开放的时间,显示6-MBOA对布氏田鼠幼鼠性成熟有促进作用。在短期作用条件下,6-MBOA能提高性激素水平,降低褪黑素水平,促进布氏田鼠的繁殖,同时存在剂量效应。在长期作用条件下,6-MBOA降低了雄鼠的生精上皮厚度和睾酮含量,降低雌鼠卵巢的重量,对成年鼠的繁殖表现出一定的抑制性。总的说来,6-MBOA对布氏田鼠的繁殖有一定的促进作用,研究部分验证了6-MBOA能促进布氏田鼠繁殖的假说。
[硕士论文] 连欣欣
应用数学 中北大学 2013(学位年度)
摘要:害鼠不但对农牧业、工业造成巨大的损失,还把疾病传播给人畜,给人们带来巨大的经济损失。所以人们采用各种方法来控制害鼠种群的数量,其中不育控制是一种新的方法。目前大量的不育控制模型只涉及单个种群的控制,但事实上,自然界的种群并非单独存在,在考虑控制某单个种群数量的同时,必须同时去考虑其竞争种群数量和捕食种群数量对它的影响。因此我们有必要在研究某个只考虑竞争种群规律的同时,考虑种群之间的相互作用,也就是我们在研究利用不育技术控制害鼠的规模的同时也考虑竞争者,以及捕食者对害鼠的作用,这样我们的模型更加符合实际,也能够有更强的指导意义。
  本文根据害鼠的特性建立了出生和死亡都有密度制约的不育控制下的竞争模型、两类出生带有密度制约的不育控制下的害鼠模型、人为投放天敌和不育控制共同作用下的害鼠模型,三类动力学模型,并对其进行了深入研究。
  第二章中,讨论了一类种群出生和死亡都具有密度制约的不育控制下的竞争模型,得到了系统平衡点的存在条件,证明了平衡点的局部渐近稳定性和全局稳定性,最后给出了全局稳定的数值模拟.
  第三章中,建立了两类出生带有密度制约的不育控制下的害鼠模型,利用Hurwitz判据,证明了平衡点的局部渐近稳定性,对全局稳定性进行了数值模拟,讨论了主要参数对种群动态变化的影响.
  第四章中,假定不同性别害鼠不育率不同,建立了两种控制–间隔固定时间投放天敌和连续不育控制下的害鼠种群动态模型,获得了害鼠灭绝周期解存在、全局渐近稳定以及种群一致持续生存的条件.所获结果对害鼠防治控制有重要的指导意义.
[硕士论文] 王硕
动物学 曲阜师范大学 2013(学位年度)
摘要:黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是我国主要的农田害鼠之一,黑线仓鼠种群具有较高的繁殖力和明显的繁殖节律,这是内因(基因调控)和外因(环境因子)共同作用的结果。因此,开展黑线仓鼠种群繁殖机制和繁殖节律的研究就显得尤为重要。本研究从黑线仓鼠繁殖的关键基因入手,结合其生存环境中的关键环境因子,以分子生物学方法为主,辅以生态学、生理学和行为学等手段,揭示害鼠种群繁殖节律和波动机制,为鼠害的综合防治提供新思路。
  本研究包括以下三个主要的实验研究:
  实验研究一:采用RT-PCR的方法克隆黑线仓鼠促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)部分cDNA序列。GnRH是与繁殖相关的关键基因,在体内分布广泛、功能多样、调控系统复杂,但普遍认为其核心作用的通过下丘脑-垂体-性腺轴调控动物的生殖。本研究共得到黑线仓鼠GnRH cDNA序列355bp,包括291bp的编码区全序列,GeneBank登录号为KC608826。采用分子生物学软件对其核苷酸序列、蛋白序列进行分析,预测并分析其蛋白的二级结构和三级结构。本研究所得结果同时也为后续实验奠定了基础。
  实验研究二:对GnRH的差异表达和功能多样性展开研究。首先采用荧光定量PCR的方法比较GnRH在雌雄黑线仓鼠亚成年期、成年期(♂)、成年发情间期(♀)、成年发情期(♀)以及老年期四个阶段的中枢(下丘脑)和外周器官(性腺)中的相对表达量。结果发现GnRH的表达在不同组织间、不同性别间、不同生长阶段以及不同发情周期中均有明显差异,体现了GnRH在黑线仓鼠生殖调控中的功能多样性和调控的复杂性;然后通过对黑线仓鼠胃肠道GnRH表达的研究,证实了GnRH在黑线仓鼠胃肠道确有微量表达,且表达量存在差异,为GnRH功能多样性研究提供了补充。本研究结果同时也为后续实验提供了理论依据。
  实验研究三:在收集并统计山东省近20年气象资料基础上,从影响黑线仓鼠生殖生长的关键环境因子入手,给黑线仓鼠设置不同的环境温度,然后综合分析、讨论黑线仓鼠在不同温度下体重、摄食量、静止代谢率、开场行为和三种关键基因(GnRH、GH、OB)的表达变化。结果表明:黑线仓鼠在不同温度下,生理、行为和基因表达会发生相应变化,以适应环境和度过不利环境。
  通过以上三方面的相关实验,为研究GnRH在黑线仓鼠中的功能与分子调控机制奠定了基础,为探究黑线仓鼠种群繁殖动态的调控机制提供了理论保障,为农田鼠害的综合防治提供了科学依据。
  
[硕士论文] 张琪
动物学 曲阜师范大学 2013(学位年度)
摘要:啮齿动物特别是鼠类密度过高时,会对人类的生产和生活造成极大危害,我国每年因鼠害造成的经济损失令人触目惊心。黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)作为我国华北地区农业害鼠的优势种之一,其繁殖力极强,种群数量大,并有储食习性,常对农业生产造成很大危害,并参与一些流行病的传播,故应予以加强防控。深入研究黑线仓鼠种群的暴发机理、种群动态特征以及高繁殖机制,对于制定合理高效的农业害鼠综合治理措施具有十分重要的意义。
  促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin Releasing Hormone,CRH)是一种下丘脑促垂体激素,不仅具有调节垂体-肾上腺轴活动、控制机体应激(如攻击行为)等功能,而且近年来的研究证实 CRH尚参与生殖功能的调控。CRH通过与其两种主要的受体(Corticotropin Releasing Hormone Recepter1,CRHR1;Corticotropin Releasing Hormone Recepter2,CRHR2)结合,影响、调节动物的生理活动和行为。
  本研究以捕获于沂南县蒲汪镇农田的黑线仓鼠为研究对象,用RT-PCR方法分别克隆CRH及其两种主要受体的cDNA序列。其中, CRH部分cDNA序列1112bp,包括全部编码区(564bp),GenBank登录号:JQ416143;CRHR1的cDNA序列703bp,为部分编码区,GenBank登录号:JX535234;CRHR2的cDNA序列141bp。采用生物学软件对其序列和结构进行预测分析,发现CRH存在可能的磷酸化位点和信号肽序列;两种受体存在7个跨膜结构域,4个胞内结构域,4个胞外结构域,属于G蛋白偶联受体家族。利用SWISS-MODEL蛋白质同源模建服务器对三者氨基酸序列进行预测,分别得到了其145~185位、2~92和57~123位氨基酸的三级结构,其中得到了CRH的41个氨基酸组成。使用MEGA4.0对CRH、CRHR1及CRHR2进行系统进化和聚类分析,结果与物种亲缘关系的远近一致。
  随后,本研究采用实时荧光定量PCR的方法,分别检测雌、雄黑线仓鼠亚成年期、成年发情期和老年期三个发育时期的下丘脑、肾上腺和生殖器官中CRH、CRHR1及CRHR2的相对表达量。检测结果发现,下丘脑CRH的表达量在不同发育时期相差不大;雌雄黑线仓鼠生殖器官中CRH的表达量在成年发情期均较多,亚成年期和老年期相对较少,表明CRH与黑线仓鼠发情行为有一定的联系。CRHR1在雌性黑线仓鼠生殖器官中的表达规律与CRH的表达比较一致,而与CRHR2表达规律相反,这与之前的研究结果(CRH与CRHR1的亲和力高于与CRHR2的亲和力,CRH主要是通过CRHR1起作用)相吻合。
  同时,本研究在实验室条件下,观察记录雄性黑线仓鼠相遇的攻击行为,对其行为学参数分别进行统计分析;采用实时荧光定量PCR方法,检测黑线仓鼠下丘脑内CRH mRNA的表达量进行相对定量,以探究雄性黑线仓鼠攻击行为与 CRH表达量之间的相关性。结果表明:作为典型的独居物种,雄性黑线仓鼠同性之间攻击性较强。从属组和优势组间的恐吓频次、直立防御频次、社会行为频次、恐吓累积时间、回避累积时间差异显著(P<0.05),冲击频次、追逐频次、逃跑频次、回避频次和冲击累积时间、追逐累积时间、逃跑累积时间、直立防御累积时间差异极显著(P<0.01),而非社会行为频次、社会行为累积时间、非社会行为累积时间差异不显著。相关性分析结果显示,雄性黑线仓鼠下丘脑的表达量与冲击行为存在极显著负相关,与恐吓行为存在不显著负相关,与追逐行为存在低度负相关,与逃跑行为、直立防御行为存在极显著正相关,与回避行为存在不显著正相关,与社会行为、非社会行为存在不显著负相关。上述研究结果表明,CRH与黑线仓鼠的应激反应和攻击能力密切相关,高水平的CRH可能会抑制其攻击能力,相反,较低水平的CRH则能够增强攻击能力。因此,结合分子生物学和行为学来研究雄性黑线仓鼠攻击行为对优势-从属关系的形成,可为研究黑线仓鼠的社会行为和社群结构提供一定的理论依据。
  
[硕士论文] 徐晓飞
动物学 曲阜师范大学 2013(学位年度)
摘要:黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是我国北方农田害鼠的优势种之一,控制黑线仓鼠种群数量迫在眉睫。影响鼠类种群数量的众多因素中,食物是一个重要的调节因子,而且黑线仓鼠主要以作物种子为食,因此食物对其种群数量的调节作用更为重要。食物不足会导致黑线仓鼠的生理生化特征产生一系列的变化。Ghrein(胃饥饿素)基因是联系动物的生长、生殖、能量代谢等功能的特殊基因,而GH(生长素)、GnRH(促性腺激素释放激素)、OB(瘦素)等基因是在动物生长、生殖、能量代谢方面的主要调节基因。本研究以Ghrelin为主要基因,旨在探究Ghrelin的生物学功能及限食情况下黑线仓鼠行为、生理等变化以及相关基因的表达量的变化,为研究Ghrelin的功能及分子调控机制奠定基础;为解释Ghrelin与GH、GnRH、OB的关系提供证据;为研究限食对黑线仓鼠生理生化状态的影响及黑线仓鼠的种群调节机制提供科学依据,有助于对鼠类种群调节机制的研究,为鼠害防治创造新思路。
  首先,本研究以黑线仓鼠为材料,采用RT-PCR的方法克隆Ghrelin cDNA序列。本研究得到黑线仓鼠Ghrelin序列361bp,Genbank登录号:KC633618。用生物学软件对其跨膜螺旋,信号肽、二级结构、疏水性等进行预测,并构建系统进化树。研究结果表明:在第4-24个氨基酸之间可能存在1个跨膜螺旋,其N端的前23个氨基酸为信号肽,信号肽的基本结构包含一个α螺旋,由此可见二者结果基本吻合。对二级结构的预测发现,二级结构中Alpha螺旋较多,亲水性较强。系统进化树结果显示黑线仓鼠与仓鼠科的金仓鼠(Mesocricetus)亲缘关系最近;与小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、长爪沙鼠(Meriones unguiculatus)等其它啮齿类次之;啮齿类中与长爪沙鼠亲缘关系较远;与牛(Bos Taurus)、羊(Ovis aries)等偶蹄目亲缘关系最远。本实验初步了解Ghrelin的结构与功能,并为后续试验的引物筛选奠定基础。
  其次,用实时荧光定量PCR的方法比较Ghrelin在黑线仓鼠不同发育时期和不同组织内的表达差异,研究发现:在雌性(雄性)黑线仓鼠的下丘脑和卵巢(睾丸)内,均呈现亚成年期和老年期表达量高于成年期的特点,且对于雌性个体发情间期表达量高于发情期。这与之前的研究结果相一致,与Ghrelin在下丘脑水平抑制生殖和抑制黄体生成素和睾酮等激素分泌的功能相适应。不同时期的雌性(雄性)黑线仓鼠,均是卵巢(睾丸)内Ghrelin的表达量高于下丘脑内。Ghrelin在下丘脑中表达是在中枢水平来实现对机体的调控,在睾丸和卵巢中表达是直接发挥其对生殖系统的调节作用。并推测Ghrelin对黑线仓鼠的生殖器官的影响较大。本实验体现了Ghrelin功能的多样性及作用方式的复杂性,并为下一步实验选材提供依据。
  最后,从体重相近的成年雄性黑线仓鼠中随机选取21只,随机分为对照组、限食组和禁食组3组。对照组正常饲养;限食组给食日食量的70%,水正常,饲养15天;禁食组禁食不禁水饲养36h。检测限食状态下黑线仓鼠体重、代谢率、开场行为、血清中激素含量及下丘脑内基因表达量的变化。结果显示:限食后黑线仓鼠的体重降低,探究行为被抑制,对环境的认知能减弱,这些反应不利于其生存;但是,Ghrelin、GH激素水平及基因表达量升高和GnRH、OB激素水平及基因表达量降低,改变了黑线仓鼠的能量代谢和分配,将能量主要用于满足自身生存的基本需求,抑制生殖系统的功能,有利于黑线仓鼠在饥饿状态下的生存。血清中Ghrelin的量与GH的量呈极显著正相关,与瘦素的量呈显著负相关。Ghrelin表达量与GH的表达量呈极显著正相关;与GnRH和OB的表达量呈显著负相关。因此推测Ghrelin能促进GH的分泌,抑制GnRH、OB的分泌。
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