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[硕士论文] 樊春彪
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是雌雄生殖细胞的前体细胞,小鼠PGCs(mouse PGCs,mPGCs)是由早期着床后胚胎的上胚层细胞受来自胚外信号的作用特化而成,PGCs特化后经迁移到达生殖嵴参与性腺发生。PGCs的迁移过程受多因素调控,但目前对参与调节的分子及作用机制还缺乏了解。
  本研究首先利用流式细胞法从OCT-4标记的小鼠胚胎分离获得9.5天(embryo day9.5,E9.5)和12.5天(E12.5)的mPGCs两组样品分别代表迁移阶段和迁移到达生殖嵴阶段,其中,为排除性别分化对迁移基因调控的影响,E12.5天分为雌雄两组。随后,利用hiseq4000测序平台结合PE101测序方法对获得的细胞进行单细胞表达谱测序(RNA Sequencing,RNA-seq)分析。测序结果共获得13,977个转录本,其中9,822个属于已知蛋白编码基因的转录本,1,048个属于未知的转录本。在表达谱测序结果比较中,E9.5天与雌性E12.5天(E12.5F)mPGCs有7,395个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),其中包括上调基因4,792个和下调基因2,603个(FDR≤0.001且变化倍数≥2)。E9.5天与雄性E12.5天(E12.5M)mPGCs相比,共检测到7,289个DEGs,包括4,287个上调基因和3,002个下调基因。为验证测序结果的准确性,随机挑选26个mRNA差异表达基因进行实时荧光定量分析,结果显示与RNA-seq得到的基因表达差异趋势一致,表明RNA-seq测序结果可靠。
  为阐明mPGCs迁移过程中的调控网络,通过表达基因通路(pathway)分析发现,测序所获得的DEGs中有75个通路在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库中被注释(P<0.01)。通过比较,在雌性mPGCs迁移过程中涉及56个信号通路;在雄性中,涉及56个信号通路。其中37个信号通路是雌性和雄性mPGCs迁移过程中共同拥有的,这些通路涉及细胞存活15个,细胞增殖14个,细胞粘附7个,细胞迁移5个和细胞分化3个。其中ErbBs信号通路位于上述所有类型的信号通路中。通过对ErbBs信号通路以及其上下游调控通络的分析,表明上游Ras信号通路,EGFR酪氨酸激酶抑制剂阻断信号通路和下游Focal adhesion信号通路同时发生改变。并对涉及这些通路的LRRC58和RHOA蛋白进行免疫荧光分析和8个基因进行qPCR验证,验证结果与分析结果相符。因此,表明ErbBs信号通路可能在mPGCs迁移过程中发挥作用。
  本研究通过对mPGCs迁移过程的基因表达谱解析,为进一步深入研究mPGCs的迁移机制及阐明小鼠配子发生和分化过程奠定了基础。
[硕士论文] 刘佳
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:子代基因组可以来源于父本及母本双方,或者其中一方(即孤雄或孤雌),后者的遗传方式在自然界中尤为罕见,但却为探索生物的隐性遗传特征提供了极为重要的资源。本研究主要在小鼠二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立及新型多能性干细胞系的诱导两个方面进行了探讨。
  首先,采用化学成分明确的培养液来培养小鼠二倍体孤雌囊胚,培养液成分包括:基础培养基N2B27、激活素A(ActivinA)、成纤维细胞生长因子(bFGF)以及血清替代物(KSR),这种建系方法可以高效率的获得小鼠孤雌胚胎来源的上胚层干细胞(parthenogenetic epiblast like stem cell,下文称之为Pa-AFSCs),该细胞系的形态特征及部分鉴定结果如下:
  1.克隆形态以及碱性磷酸酶染色结果显示,Pa-AFSCs与上胚层干细胞(Epiblaststem cells,EpiSCs)相似。
  2.免疫荧光染色结果显示:Pa-AFSCs表达Nanog的细胞明显少于对照组胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs),而其表达Gata6的细胞明显多于完全阴性的ESCs,H3K27me3的结果显示几乎全部Pa-AFSCs细胞皆表现为一条X染色体处于失活的状态。
  3.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)结果显示:Pa-AFSCs的Oct4,Nanog,Gata4,Gata6和Eomes的转录水平与EpiSCs相差无几,但滋胚层标志基因Elf5和细胞周期相关基因cMyc的转录水平明显高于EpiSCs。
  4.畸胎瘤及嵌合体实验结果:畸胎瘤的实验结果显示未观察到明显畸胎瘤形成。实验获得1枚6.5天嵌合原肠胚,胚胎嵌合率4.2%,嵌合部位胚外外胚层(extraembryonic ectoderm,EXE)。
  5.生长曲线结果显示,来源于ICR小鼠的Pa-AFSCs生长速度明显高于来源于129小鼠的Pa-AFSCs。
  随后,进一步将得到的Pa-AFSCs置于包含ActivinA、骨形态发生蛋白BMP4、CHIR99021、白血病抑制因子LIF(即ABCL培养体系)的培养液中进行诱导培养,得到新型小鼠多能性干细胞系,命名为:Ja-ASCs。其克隆形态以及碱性磷酸酶染色结果与对照组ESCs相比,无明显差别,可稳定传代至40代以上。免疫荧光染色结果显示:与对照组Pa-AFSCs相比,失活的X染色体重新活化。RT-qPCR实验结果显示:比较于Pa-AFSCs,Oct4,Nanog和Klf4的表达上调,Gata4和中胚层标志基因Sox17的转录下调。另外发现Cdx2的转录水平明显高于对照组Pa-AFSCs。嵌合体结果显示Ja-ASCs不具备贡献着床后胚胎的能力。
  综上所述,本实验由小鼠孤雌激活的囊胚建立了两种新型的细胞系:Pa-AFSCs和Ja-ASCs。从形态特征以及干细胞的某些特征来看,Pa-AFSCs接近于EpiSCs,而Ja-ASCs更类似于ESCs。然而Pa-AFSCs无法形成畸胎瘤,Ja-ASCs也无法贡献于着床后的嵌合体胚胎中,具体分子机制还有待进一步研究。
[博士论文] 王嘉博
畜牧学;动物遗传育种与繁殖 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:通过测序以及微芯片技术得到的全基因组基因型数据与表型数据间的关联分析,是探测人类疾病、农作物性状未知基因或通过已知群体基因型预测表型数据的方法。根据模型目的可以分为全基因组关联分析方法(GWAS)和全基因组预测方法(GP)两类分析方法。
  本研究通过对混合线性模型中随机效应分子亲缘关系矩阵的两种变形手段,发展两种全基因组预测方法:1)CBLUP通过参考群体和预测群体个体聚类压缩成组,利用组间分子亲缘关系矩阵代替个体间分子亲缘关系矩阵。通过模型似然值函数探测最佳压缩比例,进行BLUP预测;2)SBLUP通过SUPER方法对参考群体的基因型和表型进行GWAS分析,划分遗传关联区域(bin),通过模型似然值确定bin的大小和最佳的bin数量,利用筛选出来的bin创建针对性状的独特分子亲缘关系矩阵,最后在混合线性模型中进行预测。通过在模拟数据和真实数据中与GBLUP和贝叶斯LASSO方法进行对比发现,SBLUP对于简单性状(控制性状的基因数目较少)比较敏感,在这一领域具有非常大的优势,预测准确率相对于其他三种方法提高很大;CBLUP对于遗传力偏低且控制性状的基因数据比较多的性状比较敏感,在这种遗传背景下的性状具有比较大的优势,预测准确率有很好的表现。在真实数据(闽南芥、老鼠和玉米)中一共157个性状中,这两种方法只有在其中21个性状中的预测准确率没有贝叶斯LASSO高,超过比率达到了86.6%。这两种方法很好的拓展了BLUP系列方法的优势范围,从多角度解释了分子亲缘关系矩阵的构建和混合模型随机项的多元组建。在方法计算效率测试中,我们使用模拟数据扩增和真实大数据进行测试,结果展示我们的两种方法均具有较好的计算效率,计算速度比贝叶斯LASSO快,但比GBLUP要慢。结果证明在保证BLUP系列运算速度快的优势下,提高了模型预测的准确率。为人类疾病预测和动植物育种提供了高效、准确的全基因组预测新方法。
  本研究通过对现行世界广泛应用的全基因组关联分析工具软件(GAPIT)的重新编译,建立GAPIT第三版本,并在R语言平台实现在线调用和分析。软件主要功能包括:1)整合最新GWAS算法包括一般线性模型(GLM)、混合线性模型(MLM)、压缩式混合线性模型(CMLM)、SUPER、Farm-CPU和多位点混合线性模型(MLMM),使用户可以在一款软件中同时进行多方法的分析比较;2)将主体分析软件拆分为数据逻辑准备、数据质量控制、中间介质运算、统计分析和结果输出五个部分,这样的逻辑安排使GAPIT3可以适应第三方软件调用和输入,为未来GAPIT线上分析大数据做准备;3)多种基因型和GWAS分析结果输出,在原有GAPIT基因型和表型关联分析结果输出的基础上,增加了NJtree、3D PCA和染色体显著位点区域相关性分析等输出结果,丰富了软件分析数据的角度和结果展示。本软件已经开发完毕,现在可以通过www.zzlab.net/GAPIT使用。
  本研究通过对环境与基因型互作模型的开发,设计并完成了一款具有区分加性遗传效应与互作遗传效应功能的全基因组关联分析工具软件,软件通过C语言进行编译,实现了动态内存管理、二位基因型运算、多线程并行处理分析等先进大数据处理技术,对于23G的原始数据,在3个环境下总数据达到207G的情况下,依然仅仅需要4个小时就可以运行完成。同时,通过模拟数据的设置,建立了一套基因与环境模拟方法,利用不同环境下的遗传相关对整个遗传效应中加性效应和互作效应的比例进行设定,经过测试我们发现GbyE模型在互作效应占主效的情况下具有十分优越探测能力,具有十分显著的统计学强度优势,而在加性效应占主效的情况下统计学强度和纯加性效应模型保持一致,并没有丢掉统计学强度。在真实数据中,我们利用Ames和NAM两个群体的开花期性状进行分析,并通过交叉验证和其他学者的研究结果进行富集验证,结果展示,在真实数据中GbyE模型具有较好的验证,以500K为验证区间的随机富集验证率为20%左右,而我们的GbyE达到了显著的30%,以1M位验证区间的随机富集验证率为30%左右,而我们的GbyE达到了显著的40%。本软件已经开发完毕,现在可以通过www.zzlab.net/GbyE使用。
[硕士论文] 杜应雯
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:绝大多数动植物重要性状是由少数较大效应的基因和较多效应较小的基因控制,并受环境修饰的数量性状。为在动植物育种中更好地利用和改良这些性状,需要深入解析这些性状的遗传基础。目前,关联分析是解析数量性状遗传基础的主要途径。
  随着测序技术的飞速发展,标记数p远大于样本容量n的超高维标记小样本数据已成常态。这无疑加重了关联分析的计算压力。如何在有限的样本容量下快速准确地从海量标记中筛选出与数量性状显著关联的位点成为一项重大挑战。当前广泛应用的关联分析方法是基于多基因背景和群体结构控制的单位点全基因组扫描。这些方法不能同时估计所有标记效应,只能在群体结构与多基因背景控制下单独估计每个标记效应。这些估计值可能是有偏的。为解决这一问题,本研究利用奇异值分解、SCAD和经验Bayes估计、多位点遗传模型和似然比检验,提出了一种多位点全基因组关联分析新方法,通过三个Monte Carlo模拟试验和拟南芥开花时间相关性状分析,来证实新方法的有效性。主要结果如下:
  1、新方法分为两步:1)潜在关联标记的选择。通过奇异值分解获得所有标记的效应值,效应值较大的标记为可能潜在关联标记,进一步用SCAD压缩估计选择出潜在关联标记;2)显著QTN(quantitative trait nucleotide)的鉴定。将潜在关联标记放入多位点模型中,用经验Bayes估计这些潜在关联标记效应,当效应绝对值大于10-5时用似然比检验鉴定其与性状的显著关联性。这种方法称为基于奇异值分解和SCAD估计(Singular value decomposition-SCAD screening plus empirical Bayes,S3-EB)的多位点关联分析方法。
  2、通过三个Monte Carlo计算机模拟试验来验证S3-EB的有效性。在第一个模拟试验中,从199个拟南芥品系216130个SNP的实际关联群体中随机抽取10000个SNP作为模拟关联群体的基因型。在稀有等位基因频率等于0.3的6个SNP上设置了6个模拟QTNs,其遗传率分别设为0.1、0.05、0.05、0.15、0.05和0.05。群体平均数和误差方差均设置为10。通过模拟QTN基因型值和随机误差获得199个品系的模拟表型观察值,并重复1000次。用S3-EB、mrMLM、EMMA和FarmCPU四种方法分别分析每个模拟样本数据,结果表明:1)用上述四种方法检测6个模拟QTNs的平均功效分别为74.8、67.03、46.0和41.87(%),成对t检验表明:S3-EB的统计功效显著高于另外三种方法(P-值介于0.0036与0.0063之间);2)6个模拟QTNs的平均均方误差(mean squared error,MSE)分别为0.1064、0.0934、0.5432和0.2824,成对t检验表明:S3-EB的MSE显著低于EMMA(P-值等于0.015),但与mrMLM和FarmCPU无显著差异(P-值分别等于0.3199和0.1549);3)上述四种方法的计算时间分别为0.79、4.01、68.77和5.12小时;4)四种方法的假阳性率分别为0.0489、0.0167、0.0325和0.0178(%),处于同一数量级。
  若在第一个模拟试验中分别添加多基因背景和上位性背景,以研究这些背景干扰对S3-EB的QTN检测功效和参数估计精度的影响。结果表明:这些结果与第一个模拟试验结果趋势一致。
  综上所述,新方法通过奇异值分解,将运算维度由计算数十万计SNP标记效应个数降低为计算数干计样本容量效应数,快速获得同一模型下全部标记效应值,有利于潜在关联变量选择,提高了统计功效和参数估计精度,缩短了计算时间,使假阳性率与Bonferroni矫正方法处于同一量级,验证了新方法的有效性。
  3、用上述四种方法分析了下载的199个拟南芥品系216130个SNP的开花时间相关性状FLC、FRI、FT-GH和FT-Field。结果表明:1)上述四种方法检测到与FLC显著关联标记数分别为15、21、0和6,计算时间分别为0.0083、0.0684、1.0767和0.0838小时;与FRI显著关联的标记数分别为6、8、33和5;与FT-GH显著关联的标记数分别为17、4、0和7;与FT-Field显著关联的标记数分别为17、24、0和9;2)建立数量性状表型与显著关联标记间的多元线性回归模型,FLC性状四种方法的BIC值分别为336、328.2、596.5和521.3;FRI的BIC值分别为163.5、156.7、322.3和211.6;FT-GH性状的BIC值分别为-321.2、-296.1、314.6和-465.0;FT-Field性状的BIC值分别为30.4、318.9、306.9和156.6。新方法BIC值处于最小或者次小,说明新方法是相对较优的;3)在上述关联标记±50kb范围内,上述四种方法分别检测到59、9、3和8个已报道的性状相关基因,其中39个仅被S3-EB方法检测到。这些结果也证实新方法的有效性。
  为了便于推广应用该方法,在R环境下,基于附加包shiny,研制了S3-EB方法的应用程序,嵌入多位点关联分析软件包mrMLM,可在Windows、Mac和Linux系统下运行操作。
[硕士论文] 王志丹
计算机技术 北京交通大学 2018(学位年度)
摘要:目前,人们通过探究不同的细胞谱系来深入地研究细胞重编程的机制原理。本文研究的细胞谱系为小分子诱导成纤维细胞分化为多功能干细胞。该谱系的细胞在培养过程中,细胞形态和位移变化较大,相应地识别单个细胞,预测细胞能否成功分化有较大难度,目前尚未有人以高准确率的方法实现该谱系细胞的预测。本文提出了一种全新的细胞谱系预测的方法:采用实时成像的方式,拍摄细胞分化的全过程,通过深度学习方法学习出不同细胞的形态差异,从而对细胞能否成功分化进行预测。该方法相比于传统的人工判别,准确率较高。本文的主要工作分为如下三个方面:
  (1)细胞谱系图像的识别和切割。本文使用优化后的边缘检测算法对图像中的单个细胞对象进行边缘识别,利用识别出的边缘坐标自动地将单个细胞切割成细胞图像块。
  (2)细胞谱系图像的异常检测和差异性特征提取。本文提出了在细胞图像分类任务中,首先对原始数据进行异常检测,根据异常检测的结果有针对性地采用数据处理和数据增强方法。同时,本文利用反卷积网络可视化和特征筛选的方法找出不同种群细胞之间的5个差异性特征,分别为DNA强度、纹理熵、纹理相关性、DNA质量上四分值和图像对比度。这有利于生物科学家在细胞培养实验中更好地区分不同种群细胞。
  (3)基于深度学习的细胞谱系图像预测。本文在AlexNet卷积神经网络上加入Batch Normalization层,形成AlexNet-BN。相比于原始的AlexNet网络,它降低了图像像素特征之间绝对差异对结果的影响,强化了像素特征之间的相对差异,因此更适合本文的细胞谱系图像分类任务。同时,针对阴性细胞数据量较少,不足以支持卷积神经网络训练的问题。本文将ImageNet数据库上学出的深度网络迁移过来,并在此基础上进一步优化,使其自适应源域和目标域之间的差异。实验结果表明,该方法在少量的细胞图像训练集上便取得了较好的分类效果。同时,在公共的眼底疾病数据集和肺炎X光图像数据集上也具有较好的分类性能。
[硕士论文] 骆孟
作物遗传育种 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:全基因组关联研究(GWASs)已被成功鉴定了与人类、动物和植物复杂性状相关联的数以千计的遗传变异。少数的GWAS结果则能够完全确定影响复杂性状的所有遗传因素,而这些遗传因素是由多种遗传和环境因素相结合引起的。但使用当前的分析技术大都存在遗传力丢失(missing heritability)即解释能力低下的窘境。通常,GWAS方法依赖混合模型进行群体结构校正,以避免性状与遗传标记之间的虚假关联。而多数单位点分析难于应对复杂性状多基因共同协同作用(包括上位性)的本质。因此,进一步研究基因相互作用可能有助于检测到不能从单变量方法检测到的遗传变异。提出和开发能够同时检测加性效应及上位性效应模型的新方法很有必要。然而除了发现与性状相关的遗传变异位点外,人们越来越感兴趣的是从植物育种、动物育种和人群的个体基因型数据中预测复杂性状的表型。这些预测是基于SNPs的选择,并估计他们在样本中的效应大小,然后在具有已知表型的独立样本中进行验证并且最终应用于未知表型的样本。本研究提出了一种新的统计分析方法—重复筛选法(Iterative screen regression,ISR)。它首先建立新的模型选择标准RIC(回归信息标准),然后用特殊的变量筛选过程,使RIC最优化从而实现遗传效应解析的最优化。主要将其运用在检测上位性和加性效应的全基因组关联分析(GWAS)和基因组选择(GS),研究内容包括以下三部分:
  (1)所有常见的全基因组关联(GWA)方法都依赖于群体结构校正,以避免错误的基因型与表型的相关联。然而,群体结构校正是一种严厉的惩罚措施,这也阻碍了对真实关联的鉴定。使用重复筛选法(ISR),可实现同时将多个标记加到模型中,能够适当地矫正了GWAS中个体间的群体结构和潜在的亲缘关系。模拟实验的结果表明,重复筛选法(ISR)在统计功效(敏感度)与假发现率(FDR)和特异度优于现有的多位点线性(混合)模型和单位点线性(混合)模型,并且估计线性效应具有更高精度。还通过将其应用于水稻,远缘杂种小鼠和拟南芥数据来展示它的实用性。结果表明它可以多定位到了其他方法无法检测到的新关联位点。我们的ISR方法为多位点GWAS提供了一种新的选择,它不仅计算速度快,而且也可以有效地分析大型数据集(n>100000)。
  (2)基因与基因的相互作用,也称为上位性,其调控着不同物种的许多复杂性状。随着低成本基因分型的可用性,现在可以在全基因组范围内研究上位性。然而,鉴定全基因组上位性是一种超饱和多元回归问题,难度较大、效果不佳。ISR方法则可以适用于此类问题的复杂性状的遗传效应解析。通过两套真实基因型模拟表型数据(人类与水稻),另外还选择了植物中最常用的群体IMF2(水稻)、MAGIC(大麦),用ISR方法来进行解析相关复杂性状的遗传效应。模拟表明,就检测功效和一类型错误而言,该方法显著优于常用的穷举搜索方法(PLINK)。在水稻RIL群体中,QTL全模型包括1619个标记的加性和显性以及所有的成对互作,总共超过500万个效应项。QTL关联分析在两年内分别确定了42、45、38和48个与四种性状,即单株穗数,每穗粒数,粒重和单株产量显著关联的QTLs。大多数鉴定的QTL都是二基因的相互作用。在大麦MAGIC群体中,全模型包括3413个标记包含互作效应在内所有效应项超过500多万。QTL关联作图鉴定了与大麦开花期(FT)性状显著关联的21个QTLs。还观察到,检测结果(关联的主效和上位性效应的基因组区域)与已报道的与水稻和大麦及其密切相关物种的复杂性状的已知候选基因是一致的。研究结果表明,ISR是一种用于检测多位点模型中的位点间相互作用的有效方法。
  (3)尽管全基因组关联研究已经鉴定出与各种复杂性状和疾病相关的遗传标记,大多数预测表型的能力任有限,这些关联的基因位点只是解释了表型变异的一小部分。利用基因型数据对复杂性状进行准确的遗传预测可以促进动物和植物育种计划中的基因组选择。由于大多数复杂性状具有多基因结构,因此准确的基因组预测通常需要通过多基因方法一起模拟所有遗传变异。在此,同样还运用ISR方法来进行基因组模拟及表型预测。并应用ISR对牛、水稻、小麦和小鼠四种物种在内的12个性状全基因组预测。研究结果表明,ISR方法预测力比几种常用的多基因预测方法高(如,rrBLUP、BSLMM和BayesC等)及稳定。
[硕士论文] 肖慧
野生动植物保护与利用 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:SOX9基因属于SOX基因家族,与哺乳动物胚胎发育、性别决定、人类遗传综合征和恶性肿瘤的发生有密切关系。MicroRNA PC-5P-1090(PC-1090)是在鹿茸生长点茸皮中新发现的小分子RNA。为了验证SOX9基因是否是PC-1090的直接作用靶基因,本研究构建含有SOX93'UTR的野生型重组质粒(pMIR-Report-SOX9-3'UTR-WT)和突变型重组质粒(pMIR-Report-SOX9-3'UTR-MUT);将pMIR-Report-SOX9-3'UTR-WT、pMIR-Report-SOX9-3'UTR-MUT分别与1090mimics和control mimics共转染293T细胞,Western blot检测转染后293T细胞中荧光素酶基因的表达量;分别以1090mimics与control mimics转染Huh-7细胞(表达内源性的SOX9),Western blot检测转染后Huh-7细胞中SOX9蛋白表达的变化。
  结果显示:经测序证实荧光素酶报告载体pMIR-Report-SOX9-3'UTR-WT和pMIR-Report-SOX9-3'UTR-MUT构建成功;Western blot结果显示,共转染PC-1090mimics与SOX93'UTR野生型重组质粒的293T细胞组,荧光素酶的表达量明显下降,而其他对照组荧光素酶的表达量无显著变化;与转染control mimics的Huh-7细胞组相比,转染1090mimics的Huh-7细胞中SOX9蛋白的表达显著降低。
  结论为PC-1090具有生物学功能,且和SOX93'UTR上的位点特异性结合,靶向负调控SOX9基因的表达。
[硕士论文] 徐娇
生物学;遗传学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)作为模式生物在研究先天免疫机制方面起到了重要作用,而Toll通路是果蝇中最重要的先天免疫通路之一,能够通过一系列信号传导抵抗革兰氏阳性菌的入侵。最近的许多研究表明,microRNA(miRNA)在果蝇免疫信号传递过程中发挥着重要的调控作用。miRNA是一类广泛存在于动植物基因组中长约21-24nt的小非编码RNA,通过结合靶基因mRNA的特定位点,抑制mRNA的翻译或诱导mRNA的降解,介导多种重要生理活动与过程,在转录后水平调控基因的表达。在本实验室前期的工作中,通过高通量测序的筛选,发现miR-964在果蝇受革兰氏阳性菌刺激后发生了显著的下调,据此猜测miR-964可能作为果蝇Toll免疫响应中的重要调控因子。因此,本论文采用实验生物学和生物信息学有机结合的方法,通过体内、体外实验证明果蝇miR-964能够直接靶向抗菌肽基因Drosomycin(Drs)来调控Toll信号通路。本论文所取得的主要实验研究结果如下:
  1.利用革兰氏阳性菌粪肠球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis)分别感染miR-964高表达果蝇、野生型果蝇(w1118)和miR-964基因敲除果蝇,通过生存率分析实验发现miR-964高表达果蝇的生存率显著低于野生型果蝇和miR-964基因敲除果蝇的生存率。
  2.通过实时荧光定量(qRT-PCR)实验检测野生型果蝇(w1118)在感染革兰氏阳性菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus,M.luteus)后miR-964基因的表达,并发现感染后24h、48h和72h均有显著上升;而miR-964高表达果蝇在感染M.luteus24h后Drs表达量显著下降,miR-964敲除果蝇在感染M.luteus12h和24h后Drs表达量显著上升。通过构建miR-964表达回复果蝇,并经qRT-PCR和GFP绿色荧光蛋白检测发现抗菌肽基因Drs的表达量得到了回复。实验证明,果蝇miR-964能够响应革兰氏阳性菌的刺激,并影响Toll通路下游抗菌肽Drs的表达。
  3.为了进一步研究果蝇miR-964影响Toll通路的分子机制,利用TargetScan、miRanda和PITA软件对miR-964的靶基因进行了预测并取交集,获取了两个可能受miR-964调控的Toll信号通路中的相关基因—Spz和Drs。
  4.通过双荧光素酶报告基因系统对miR-964靶基因进行体外验证,证明Drs是miR-964的直接靶基因。
  5.在果蝇体内利用qRT-PCR和Western Blotting的方法再次验证了miR-964和Drs基因的靶标关系,进一步证实miR-964是直接靶向抗菌肽基因Drs的。
  本研究揭示miR-964能通过直接靶向基因Drs的3'UTR调控抗菌肽Drs的表达来对Toll信号通路进行负反馈调节,从而影响果蝇先天性免疫的作用机制,为研究miRNA在先天免疫中的功能提供了新的证据和重要的参考。
[硕士论文] 任碧玉
生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:Sonic Hedgehog(Shh)信号在调控神经管腹侧神经元的分化中起着关键作用。RNF220编码一个泛素连接酶,在中后脑与脊髓的腹侧区域表达,通过调控Shh信号通路转录因子Gli的活性参与腹侧神经管的图式形成。RNF220在腹侧神经管特异表达的转录调控机制,特别是其自身的表达是否受到Shh信号的调控尚不清楚。本论文解析了RNF220基因的潜在增强子元件,并以鸡胚为模型,通过报告基因系统,验证了其中一个超级保守元件M280在神经管中具有转录激活活性,还发现在鸡胚神经管中激活Shh信号活性会激活RNF220的异位表达。作为一个泛素连接酶,RNF220自身的蛋白稳定性是否受到泛素化修饰的影响及其调控机制也是一个重要问题。本文发现,RNF220是泛素连接酶Smurf1/2的靶蛋白,Smurf可结合RNF220并诱导其泛素化与降解。论文还发现锌指蛋白ZC4H2可抑制Smurf对RNF220的泛素化而提高其稳定性。本文初步揭示了RNF220基因的转录水平和蛋白翻译后修饰水平的调控机制。
[硕士论文] 高辉
内科学(心血管) 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:高脂血症作为传统的冠心病的危险因素,具有可调节及遗传的特性。国外全基因组关联研究证实在欧裔人群中VLDLR rs3780181SNP与血TC和LDL-C水平具有一定相关性。但是不同种族基因变异的效应强度具有一定的差别,国外的研究结果需要在不同种族中进行重复验证,故研究中国人群VLDLR rs3780181SNP与血脂紊乱等其他代谢性疾病的关系意义重大。京族是中国唯一的从事海洋渔业的少数民族,京族人群饮食习惯、社会习俗以及遗传背景与内陆民族及当地汉族可能有不同之处,是进行群体遗传学研究的理想群体。因此本文的研究目的是探讨广西京族人群和当地汉族人群VLDLR rs3780181SNP和环境因素与血脂水平的关系。
  方法:采用分层抽样的方法,随机选取广西东兴市江平镇京族和汉族人群各707人作为研究对象,其中包括276名汉族男性(占汉族总受试者人数的39.0%)、431名汉族女性(占汉族总受试者人数的61.0%)以及278名京族男性(占京族总受试者人数的39.3%)、429名京族女性(占京族总受试者人数的60.7%)。采取血液标本分别用于测定血脂水平和血DNA提取。利用PCR-RFLP联合PCR产物基因测序验证的技术路线方法对VLDLR rs3780181SNP进行基因分型。利用spss17.0软件进行后续的数据分析基因型与血脂水平的关系。
  结果:(1)京族组体重、身高、腰围、体重指数、血糖水平高于汉族,京族人群的ApoA1/ApoB比值、TC、TG、饮酒比率低于当地汉族。(2)京族人群的VLDLR rs3780181SNP最小G等位基因频率低于汉族人群(8.3%vs10.5%,P<0.05),在京族人群中,男女性别间rs3780181SNPAA、AG、GG各基因型的分布比较差异有统计学意义。(3)通过协方差分析不同VLDLR rs3780181SNP基因型与血脂水平的关系,我们研究发现AG/GG基因型京族人比AA基因型京族人血TC水平低,AG/GG基因型的汉族人比AA基因型汉族人血LDL-C水平低。当按性别亚层进一步分析时发现,以上这种差异分别只存在于各自的女性亚组人群中,不表现在男性人群中。另外我们发现只有汉族女性的AG/GG基因型者血ApoB水平比AA基因型低(均P<0.05)。(4)多重线性回归分析结果显示两民族合并人群的血清LDL-C和TC水平、汉族组的血清LDL-C水平和京族组的血清TC水平与VLDLR rs3780181SNP基因型呈显著相关(均P<0.05)。当两民族人群进一步按性别分层分析发现仅京族女性组的血清TC、汉族女性组的血清LDL-C、ApoB水平与VLDLR rs3780181SNP基因型呈显著相关(P<0.05);(5)两民族人群及不同性别亚组的血脂相关指标也不同程度的与多种环境因素和其他因素相关,如性别、年龄、体重指数、吸烟、饮酒、血压、脉压、血糖、腰围等。
  结论:广西京族与当地汉族人群间VLDLR rs3780181SNP与血脂水平的关系存在差异,两组人群不同性别中该位点与血脂水平的关系也有差异。提示广西京族与汉族人群中VLDLR rs3780181SNP与血脂水平的关系可能存在种族和/或性别特异性。
[硕士论文] 郝伟琪
法医学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:单核苷酸多态性(SNP,Single nucleotide polymorphism)是人类基因组中含量最丰富的DNA序列多态性,指的是在基因组中由单个核苷酸的变异(转换或颠换;插入或缺失)所引起的DNA序列多态性,被认为是继STR后的第三代遗传标记。随着全基因组计划的完成,越来越的SNP位点被发现,同时人们发现某些SNP位点具有人群特异性,这些位点在不同人群之间基因频率差异非常大(AIMs,Ancestry informative markers),使用这样一组祖先信息位点进行人群区分和个体祖先信息的推断逐渐被人们熟知和运用。筛选和检测人群间基因频率差异大的多态性位点即祖先信息位点(AIMs)可以进行人群的遗传结构分析和个体的种族推断。本研究旨在建立一种针对五大洲际人群的SNP种族推断体系,并建立相应的参考数据库,从而实现对相应人群的遗传结构的研究,在法医学中使法医DNA技术从“STR被动比对”向“SNP主动查找”拓展,为反恐维稳、公共安全提供新型科技手段。
  方法:通过文献调研,筛选针对五大洲际人群的28个祖先信息位点(AIMs),均为二等位基因,基于较为普及的毛细管电泳仪和SNaPshot检测分型技术构建单管复合扩增检测体系,并对本实验室所收集的来自五大洲际21个人群的998份样本进行28个SNP位点基因分型的检测。采用GeneMapper进行电泳图谱的分型分析,利用相关统计方法对该体系所检测的样本分型和从网上数据库所下载的数据共3090份样本进行合并分析来探究该体系的区分能力,并利用参考数据库(不包含有测试人群)对来自12个人群的663份个体来评估该体系的个体祖先推断能力。
  结果:STRUCTURE聚类分析、群体主成分分析以及系统树显示28个祖先信息位点能够能把所收集的人群分为六部分,其对南亚人群和欧亚混合人群也具有很好的区分能力。针对个体祖先来源推断中,根据663个测试个体的人群匹配概率(AMP,Assignment Match Probability)显示,该体系对于五个洲际祖先来源的个体的推断准确性达到100%,对于南亚及中亚人群的推断准确率在90%以上。
  结论:该体系能够准确对五大洲际人群及混合人群(南亚及中亚)进行区分。相对于利用STR对未知DNA样本来源点对点的被动比对,该体系利用SNP对未知个体的祖先来源的推断的主动查找为法医学案件的侦破和家系排查等提供了新的思路、方法和依据。
[硕士论文] 王亚芳
物理学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:每个基因组序列k-mer频谱是确定的,不同基因组序列的k-mer频谱各不相同.研究k-mer频谱的内在使用规律可以帮助我们更好的理解基因组序列结构、各类k-mer在功能序列上的分布特征以及所反映的生物学功能.前期工作研究了不同物种基因组序列8-mer频谱的分布规律.除了极个别物种外,发现8-mer频谱存在独立选择定律,即三种CG类(0CG、1CG和2CG)8-mers是各自独立进化的,任何DNA序列均是由这三种CG类模体组合而成的.基于独立选择定律,本文以人类、斑马鱼、拟南芥、水稻、蚊子和蜜蜂这六个物种基因的转录起始位点、转录终止位点、翻译起始位点、翻译终止位点、内含子与外显子结合处以及外显子与内含子结合处这六个功能位点区域的序列为目标序列,分析各个功能位点区域上三种CG类8-mer频谱的分布和8-mer相对频率的位置分布,以及三种CG类8-mer中x-mer(x=3,4)的使用差异,探讨CG类模体在基因不同功能位点区域上的分布规律与物种进化之间的关系.
  首先,给出了三种CG类8-mer在六个功能位点区域上的8-mer频谱,发现人类、斑马鱼、拟南芥和水稻的三种CG类8-mer频谱仍然遵守独立选择定律,蚊子和蜜蜂三种CG类8-mer频谱不遵守独立选择定律.其次,计算了六个功能位点区域上三种CG类8-mer频谱分布的最概然频次与随机中心频次的相对距离.发现人类、斑马鱼、拟南芥和水稻中的三种CG类8-mer频谱的相对位置出现进化分离现象(RD0>RD1>RD2),且分离程度与物种进化呈正相关关系.也就是说,随着物种进化水平的提高,三种CG类8-mer频谱分布之间的距离在逐渐变大.蚊子的三种CG类8-mer频谱位置的进化分离与前四个物种正好相反(RD0<RD1<RD2),蜜蜂的三种CG类8-mer频谱位置没有明显的分离现象.最后,计算了六个功能位点区域上三种CG类8-mer频谱分布的相对标准差RS.发现人类、斑马鱼、拟南芥和蜜蜂中的三种CG类8-mer频谱的相对标准差有明显的规律,即RS0<RS1<RS2,与全基因组一致.也就是说,1CG和2CG类8-mer使用频率的保守性明显高于0CG类8-mer.水稻和蚊子0CG和1CG模体的保守性关系仍有RS0<RS1.但水稻在六个功能位点区域上2CG模体的保守性低于1CG模体.蚊子的三种CG类模体的保守性没有明显差异.
  探讨了三种CG类8-mer在基因六个不同功能位点区域上的分布.结果显示,三种CG类8-mer的分布在基因六个不同功能位点区域上均不相同,且呈现各自的分布特点.脊椎动物的分布相近,植物间的分布相近,蚊子和蜜蜂的分布更具多样性.转录起始位点的分布和翻译起始位点的分布有一定的相似性,转录终止位点的分布与翻译终止位点的分布相近,两个起始位点和两个终止位点的分布具有对称性质.外显子与内含子结合处和内含子与外显子结合处的分布是对称的.人类、斑马鱼、拟南芥和水稻三种CG类8-mer在基因两个起始和两个终止位点区域的分布随着物种的进化呈现出规律的变化.但六个物种在外显子和内含子结合区域呈现出相似的分布形式.蚊子和蜜蜂在两个起始和两个终止位点区域的分布与前四个物种的分布明显不同.
  采用三种CG类8-mer中x-mer(x=3,4)的相对使用频率来表征CG类8-mer的信息得到新对称相对熵,计算了新对称相对熵在六个物种基因不同功能位点区域上的分布.结果显示,人类、斑马鱼、拟南芥和水稻的2CG类新对称相对熵的偏离程度最大,1CG次之,0CG的几乎没有偏离.表明1CG和2CG类8-mer信息是组成功能位点区域的主要信号模体,0CG模体构成了区域的背景.蚊子和蜜蜂较特殊,在六个功能位点区域上的分布都表现出了明显偏好性,且分布形状与前四个物种都不相同.蜜蜂的偏离程度最大,蚊子的偏离程度最小.
  总之,人类、斑马鱼、拟南芥和水稻基因各个位点区域的序列构成遵守独立选择定律,六个功能位点上三种CG类8-mer分布各不相同,且分布形式与物种进化紧密相关.显示了含CG类模体是组成各类功能序列的核心模体,它们在功能位点区域的含量和分布差异决定了不同区域的功能差异.蜜蜂和蚊子不遵守独立选择规律,三种CG类8-mer在功能位点区域上有自己的特殊分布规律.独立选择定律为我们研究序列的结构提供了全新的思路,对于探讨序列与功能的关系具有重要的理论意义.
[硕士论文] 王岳
生物物理学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:CGI(CpG Island,CpG岛)在基因的表达调控中扮演者重要的角色,在小鼠基因组中几乎所有的管家基因和40%的组织特异性基因的启动子区都存在CGI。在本文中我们探索了k-mer(k-polymers,k聚体)与CGI之间的相关性,并通过这种相关性建立了一个分类模型,最后将分类模型应用于小鼠全基因组中用于鉴别CGI序列。
  k-mer是长度为k的核苷酸多聚体,k的选择对计算量有着重要的影响。为了选择一个合适的k值,我们在小鼠基因组中统计了不同长度k-mer的频次分布。我们发现,小鼠k-mer的分布开始在k大于6时呈现出三个峰,但当k大于11以后三峰分布现象开始逐步减弱。根据k-mer的分布图谱,我们认为k-mer的长度在8和9之间是比较合理的。之后我们将8/9-mer按照其中所含的某一二核苷数目的不同将其分为三个子集,分别是1XY、2XY、3XY。我们发现只有在CG二核苷分类下小鼠基因组8/9-mer频次分布所呈现的三个峰是可以被独立分开,基于此我们认为含有CG二核苷数目相同的8/9-mer在生物学功能上应该会有一定的相似性。
  为了探求含有CG二核苷数目相同的k-mer的生物学功能,我们定义了一个参数Ktri,这一参数可以表征序列对某一k-mer子集的偏好性。通过这种方法我们发现,CGI序列在8/9-mer中更加的偏好2CG模体,即2CG模体是构成CGI序列的核心模体。
  最后我们应用机器学习的方法,以不同子集计算的Ktri为序列的特征,建立了一个可以鉴别CGI的分类模型,并将模型应用与小鼠基因组中。我们在小鼠基因组中共鉴别出的CGI序列为52761条,是数据库中给出的16009条的3.3倍。在我们寻找到的片段中,包含了数据库中的15945条CGI序列,占数据库中总CGI的99.6%。
[硕士论文] 高程杰
细胞生物学 郑州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:红系发育是造血干细胞经增值、分化最终生成成熟红细胞的过程,受到转录因子的协同调控。红系发育过程可分为三个阶段:早期红细胞生成、终末分化、网织红细胞的成熟。红系发育过程不仅有细胞体积逐渐较小、染色质凝集及血红蛋白增多等细胞形态变化,且各基因的表达水平也随之变化。转录因子及其调控基因存在复杂的相互作用,也存在阶段变化的特征。为了研究红系发育中系统的转录调控,深入理解红系发育早期和终末阶段的差异,本课题基于RNA-seq数据构建红系发育过程的基因共表达网络,并通过网络模块探索红系发育早期和终末阶段的调控网络及关键基因差异,加深对红系发育调控机制的理解。
  方法:基于本课题组脐带血和外周血体外分化、发育的各阶段RNA-seq测序数据,使用FastQC、tophat、cuffquant、cuffdiff、cummeRbund转录组数据处理流程,得到各阶段基因表达数据及差异基因;对基因表达数据进行过滤后通过WGCNAR软件包构建基因共表达网络,并使用pajek软件计算度、k-核、介数、紧密度等网络结构参数,分别对网络及各模块进行分析,比较早期模块与终末模块的调控差异。
  结果:WGCNA构建得到的基因共表达网络,进行网络分析,得到红系发育共表达网络的核心基因,其中30%左右已在文献中得到验证。共表达网络模块分析得到了4个阶段特异模块;1个早期祖细胞模块和3个终末阶段晚期模块。早期祖细胞模块中核心基因包括PTPN6、ETS2等已知红系相关基因,参与细胞增值、分化和凋亡相关通路,与早期祖细胞的增值、分化相关。两个终末阶段晚期模块由不同基因组成但具相似的功能,调控自噬、蛋白质修饰、泛素化介导的生物学过程等,与红细胞的成熟及细胞骨架的重排有关,已知红系相关基因如ULK1、AKT2、EIF4EBP2和FOXO3。终末阶段晚期模块3中核心基因包括TAL1、NFE2等已知红系关键基因,参与调控染色质组成、去磷酸化等过程,与晚期胞内染色质变化及红系发育过程的顺利进行有关。
  结论:红系发育基因共表达网络及其网络分析结果表明早期祖细胞模块核心基因集中在祖细胞增值和分化,终末晚期模块集中在自噬、染色质凝集、细胞骨架重排等与脱核相关的功能等,与已知红系发育表型及功能一致。这不仅能加深对红系发育早期祖细胞增值和终末脱核中已知关键基因调控通路的理解,也可以预测新关键基因,为体外产生功能红细胞提供帮助。
[硕士论文] 蒋洋洋
生物医学工程 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  小鼠作为一种在医学研究中被广泛使用到的模型生物,在生命科学和生物医药相关领域的研究中发挥着重要的作用。大量生物医学研究者用小鼠建立人类疾病的模型,尤其是许多肿瘤模型,利用小鼠研究人类疾病发病机制、发现治疗药物、评估药效与副作用。但是,在许多情况下人类疾病的小鼠模型展示出与人类疾病不同的特性,包括对药物的不同反应。据报道,根据小鼠模型开发的肿瘤治疗药物仅有约5%在人类具有安全而肯定的疗效。因此,正确构造和合理解释人类疾病的小鼠模型是一个重要问题。
  最近的基因组研究揭示不仅在人类与小鼠而且在所有哺乳动物中都存在大量长链非编码RNA(简称lncRNA)基因,并揭示基因组修饰对基因表达具有重要的调控作用。研究已揭示基因组修饰的一般机制,即DNA和组蛋白修饰酶由lncRNA携带到特定基因组位点。这些新发现促使研究者从表观遗传学角度研究基因表达的种系差异。由于表观基因组修饰由大量lncRNA介导,两个亟待解答的问题是:(1)在人类和小鼠的lncRNA中有多少属于保守的直系同源物,另外又有多少lncRNA具有物种特异性?(2)是否保守的直系同源lncRNA如同保守的蛋白质编码基因那样也具有保守的功能?这两个问题对于当前对lncRNA的研究现状来说是极具研究意义和价值的。
  方法:
  首先,根据GENCODE项目首批鉴定的13562个人类lncRNA,从本课题组前期建立的同源数据库——LongMan数据库中搜索每个lncRNA在小鼠基因组同源区域的同源序列。然后人类lncRNA在小鼠的同源序列和GENCODE项目首批鉴定的10481个小鼠lncRNA经过较严格的判定条件,确定人类与小鼠的直系同源lncRNA基因。第二,使用本课题组前期开发的生物信息学工具——LongTarget预测部分人类与小鼠直系同源lncRNA在其局部基因组区域的DNA结合域与结合位点。第三,使用MEGA7计算由LongTarget预测出的同源lncRNA在其局部基因组区域的DNA结合域的遗传距离。最后在同源lncRNA在基因组局部区域的DNA结合位点分布中,通过GO分析和DAVID功能注释工具对部分同源lncRNA启动子区的靶蛋白质编码基因进行功能分析。
  结果:
  根据较严格的判定条件,仅有54个lncRNA基因在人类和小鼠是直系同源基因。其次,即便是这些直系同源lncRNA在人类与小鼠基因组也有许多种系特异性的DNA结合位点并且保守的直系同源lncRNA也存在不同的DNA结合域。第三,若干靶基因的功能注释提示种系特异性的表观基因组修饰可能对人类和小鼠的表型差异有重要影响。
  结论:
  人类与小鼠仅有极少量直系同源lncRNA,且这些lncRNA有种系特异性的DNA结合位点,提示人类和小鼠蛋白质编码基因接受非常不同的表观遗传学调控,并在很大程度解释了为何许多人类疾病的小鼠模型不能准确模拟人类疾病。
[硕士论文] 吉杰
临床检验诊断学 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1.采用McSNP法对位于人FOXO3A非编码区SNP位点分型。
  2.制作FOXO3A及GAPDH内参基因的质粒标准品,构建可长期、间断性地对大量临床来源样本进行FOXO3A基因表达的定量检测体系。
  3.分析SNP型对FOXO3A基因表达水平的影响。
  方法:
  1.分离14位健康献血者的单个核细胞(PBMC),从中提取基因组DNA及总RNA。
  2.McSNP分型方法的建立。首先设计包含SNP位点的特异性PCR扩增引物,应用该引物进行PCR反应,然后用限制性内切酶切割PCR产物,最后应用熔解曲线方法分析酶切产物,确定SNP型。应用PCR-限制性核酸多态性分析(PCR-RFLP)及PCR产物测序法对分型结果进行验证。
  3.FOXO3A基因表达定量体系的建立。采用TA克隆的方法构建pGMT-FOXO3A、pGMT-GAPDH重组质粒,获得定量标准品,使用该标准品制作定量标准曲线。设计用于FOXO3A基因表达定量的特异性扩增引物,对标准品进行多次重复定量检测,计算定量结果的精密度与偏倚,评价定量体系的可检测范围。
  4.对10份来源于健康献血者的DNA及RNA样本进行rs4946936分型和FOXO3A基因表达定量。应用统计学软件SPSS做独立样本T检验,比较组间的基因表达水平差异。
  结果:
  1.14位献血者rs4946936的McSNP分型结果及5位献血者rs2802288的McSNP分型结果均与RFLP分型法所得结果一致,PCR产物测序也验证了上述分型结果的准确性。McSNP分型法中rs4946936为TT型样本的熔解曲线显示为Tm值为77.25℃的单峰,TC型显示为Tm值为77.25℃和71.75℃的双峰,CC型显示为Tm值为71.25℃单峰。
  2.TA克隆蓝白斑筛选实验显示质粒连接、转化成功,对阳性克隆采用PCR法鉴定,显示质粒中含有目的片段。将质粒作为标准品梯度稀释制作定量标准曲线,扩增效率在0.9-1.1之间,相关系数>98%,FOXO3A定量结果显示样本基因表达水平在1.56×106-1.56×103copies/μl(Ct值20~30)范围内精密度变异系数小于5%,偏倚小于7.5%。
  3.10位献血者rs4946936McSNP分型结果显示6个样本为CC型,3个样本为TC型,1个样本为TT型。rs4946936T突变型组(TT和TC型)与CC型组相比,FOXO3A基因表达水平未见统计学差异,p>0.05。
  结论:
  1.成功建立了基于熔解曲线分析的McSNP分型方法。
  2.构建了可长期对间断来源样本的FOXO3A基因表达量进行比较的检测体系。
  3.对10份献血者的基因表达水平分析,未见不同rs4946936型别个体间FOXO3A基因表达水平具有明显差异。
[硕士论文] 周涛
生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:基因组岛是由水平转移基因与移动元件等构成的基因簇,可以通过转导、结合、转化等方式进入细菌中。基因组岛具有独特的组分和功能特点,常常携带一些与微生物进化和环境适应性相关的功能基因,如致病性和抗生素耐药性基因。因此,基因组岛的识别分析已经成为微生物功能基因组研究中的一项重要研究课题之一。本文重点围绕基因组岛的识别与分析,构建了基因组岛的数据库,搭建了基因组岛的在线识别与分析平台。其主要内容安排如下:
  1.整理了基因组岛的相关数据。重点介绍了现有的基因组岛数据库和现有的识别算法;系统地整理了基因组数据,利用基因组岛识别方法,获得了现有基因组的预测结果,按照从UniProt数据库中获取基因注释的流程,整理了预测基因组岛中的基因注释数据。
  2.构建了基因组岛的数据库。根据基因组岛的数据类型,分析了内容之间的关联,利用关系型数据库设计了基因组岛数据的存储模型;由于基因组岛数据的特殊性,利用冗余备份和水平分解的方法,优化了数据库的访问效率;针对数据库的扩展性问题,本文提出了相应的解决方案。
  3.搭建了基因组岛的识别与分析平台。根据基因组岛的展示内容,采用了分层展示策略,设计了基因组岛数据的展示方案;比较了几种常用的基因组岛可视化的图形格式,选取了SVG作为展示图形的格式生成图形,实现了基因组岛数据的可视化,从而克服了由位图难于实现而引起的交互问题;根据现有的基因组岛识别方法的特点,系统整合了识别算法,搭建了基因组岛的识别平台;针对科研人员的需求,本文对基因组岛数据库以及识别分析平台进行了Web发布,实现了基因组岛数据的在线浏览、在线识别和在线分析。
[博士论文] 梁燕
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:基因组稳定性对于维持正常细胞周期至关重要,能够确保每次细胞分裂后,其两个子细胞得到完整无突变的一套基因组,保证遗传的稳定性。dnaM(原ybfE在此依据其功能被命名为dnaM)基因及其产物的功能尚不清楚,本文发现缺失dnaM基因并不导致细胞死亡,说明该基因是非必须基因。当敲除dnaM基因或过表达DnaM蛋白会导致细胞染色体复制异常,即染色体复制起始非同步和染色体复制不完整。的确,dnaM缺失会提高细胞自发突变率和SOS基因uvrB表达,且对UV敏感,UV照射也会提升dnaM基因表达,这些结果说明dnaM基因产物(DnaM)参与维持基因组稳定性。利用荧光显微镜观察DnaM的亚细胞定位发现,在快速生长的细胞中DnaM与染色体共定位;进一步分析发现DnaM在染色体复制阶段(细胞周期C期)与染色体共定位。纯化的DnaM-His蛋白质能够降解线性双链DNA、线性单链DNA,还改变质粒DNA的超螺旋状态,结果说明DnaM具有外切酶活性并可能具有拓扑酶活性。利用DnaM消化3'biotin标记的DNA发现,DnaM从3'端消化DNA,具有3'→5'外切酶活性。进一步实验显示DnaM切割闭合双链DNA中一条链而松弛处于超螺旋状态的质粒DNA。为了确定DnaM的功能位点,分析其氨基酸序列后对19个碱性氨基酸位点分别进行了突变,而后通过流式细胞仪检测不同突变蛋白对细胞染色体复制的影响。结果发现:DnaMK38I、DnaMKK51E、DnaMR52G、DnaMK56E和DnaMa76G五个突变蛋白的功能有明显改变,不再影响染色体复制,说明这些位点的氨基酸对DnaM的功能至关重要;而DnaMR92G突变蛋白的功能有所增强。有趣的是,DnaMK51E不再与染色体共定位,DnaMR92G仍与染色体共定位,说明DnaM是通过与染色体共定位来发挥作用的。经过纯化DnaMK51E和DnaMR92G突变蛋白,并与质粒DNA孵育发现,DnaMK51E和DnaMR92G突变蛋白对降解DNA的能力均有不同程度下降,但提升其松弛超螺旋DNA的活性,说明这两个氨基酸位点对于保持DnaM功能完整性是必要的。为了探究DnaM是如何定位于染色体并发挥作用,通过细菌双杂交检测了DnaM与DNA解旋酶DnaB、滑动夹子DnaN(sliding clamp)及DNA聚合酶Ⅲ的一个亚基DnaX的相互作用,结果发现DnaM与DnaN有相互作用,说明DnaM通过与DnaN的相互作用来与正在复制的染色体共定位。
  综上所述,DnaM在复制阶段定位于染色体并利用其3'外切酶和可能的拓扑酶活性来纠正复制错误和减轻拓扑压力,是确保基因组稳定性的辅助机制。染色体复制过程中,由DNA解旋酶在复制叉前解开双链DNA,所形成的复制叉前超螺旋DNA由拓扑酶松弛,以此缓解解旋酶引入的拓扑压力。DnaN形成二聚体的滑行夹子,使DNA聚合酶Ⅲ锚定在DNA模版上,确保染色体复制的连续性,复制结束后滑行夹子释放DNA聚合酶Ⅲ,并脱离DNA模版。因此,DnaM在复制过程中,通过与DnaN的相互作用也定位于复制叉,并从3'末端把新合成的错误脱氧核苷酸切下来,帮助DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性以保证复制正确性;同时,DnaM可能具有的拓扑酶活性辅助拓扑酶松弛超螺旋DNA,确保复制叉的顺利前行。
[博士论文] 魏青
发育生物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:体外培养的胚胎干细胞具有无限增殖、自我更新和多能性的特点。这些特点不仅为干细胞体外发育和分化提供了研究模型,也为再生医学和损伤性疾病治疗提供了希望。然而,体外培养的胚胎干细胞很容易受到各种环境因素影响,从而丧失自我更新的能力,这严重影响了胚胎干细胞的临床应用。SC1作为一种RasGAP和Erk1/2蛋白的双重抑制剂,已被证实在小鼠胚胎干细胞的自我更新中发挥重要作用。在无LIF、血清和饲养层的条件下,加入SC1能够有效的维持胚胎干细胞的自我更新。自SC1发现以来,虽然已有一些研究报道了SC1的功能,但其发挥作用的深层分子机理仍未见报道。为此,本研究采用基因表达谱芯片、小RNA深度测序、免疫染色、Western blot等方法,全面检测了SC1处理后小鼠胚胎干细胞等的基因和蛋白表达影响,并深入探究了SC1维持胚胎干细胞自我更新的分子机理。主要研究结果如下:
  1. SC1处理(6h)可以显著提高小鼠胚胎干细胞和F9细胞中多能性因子的表达水平。AP染色实验发现SC1处理可以显著提高小鼠胚胎干细胞和F9细胞的碱性磷酸酶活性。说明SC1在维持小鼠干细胞多能性上发挥重要作用。
  2. SC1拮抗维甲酸(Retinoic acid, RA)诱导的细胞分化。RA可以诱导胚胎干细胞和F9细胞的分化,显著下调多能性基因Nanog,Oct4,Sox2和Klf4的表达。在RA诱导F9细胞分化过程中添加SC1,能够显著改变F9细胞的形态,形成“克隆样生长”。这暗示SC1可以抑制RA诱导的F9细胞分化。
  3. SC1拮抗RA诱导分化的分子机理。与单独添加RA相比,在F9xibaozhong同时添加SC1和RA6 h后,多能性因子Nanog,Oct4和Klf4的表达显著上调;同时添加SC1和RA24h后,Klf4的表达继续显著增加,而Nanog和Oct4的表达则无显著变化。此外,通过Western blot检测发现,同时添加SC1和RA时可显著抑制Erk1/2蛋白的磷酸化,并且随着添加SC1作用时间和浓度的增加,Erk1/2蛋白磷酸化的抑制效果愈加显著。由此可见,SC1是通过增加Klf4的表达和抑制Erk1/2蛋白的磷酸化,进而抑制RA诱导F9细胞的分化。
  SC1抑制RA诱导分化过程中影响F9细胞整体甲基化水平。免疫荧光染色结果显示,单独添加SC1和同时添加SC1和RA均可以显著下调F9细胞的整体DNA甲基化水平。单独添加SC1不影响F9细胞整体DNA羟甲基化水平,但同时添加SC1和RA可显著上调细胞整体DNA羟甲基化水平。在RA诱导分化的F9细胞中,添加SC1引起的DNA甲基化水平的变化,可能也是其能够拮抗RA诱导分化的原因之一。
  4.利用全基因组表达谱芯片分析了SC1处理(6h)对小鼠J1胚胎干细胞基因表达的影响。与加入等体积DMSO的J1胚胎干细胞相比,SC1处理显著上调248个基因表达,显著下调212个基因的表达(FC≥2,P≤0.01)。KEGG通路分析显示这些差异表达基因主要富集在PI3K-Akt通路,Ras信号通路,干细胞多能性调节信号通路以及细胞粘附等代谢通路。
  5.利用小RNA深度测序分析了SC1处理(6h)对小鼠J1胚胎干细胞中miRNAs表达的影响。结果显示SC1处理能显著上调14个miRNAs,显著下调176个miRNAs的表达(FC≥1.5,P≤0.05)。在J1细胞中过表达显著上调表达的miR124-3p,可以显著促进Nanog蛋白的表达,下调Erk1和抑制Erk1/2蛋白的磷酸化。通路报告实验发现miR124-3p能显著抑制MEK/ERK通路。进一步的qPCR、Western blot和双荧光素酶报告实验证实了miR124-3p可通过靶向Grb2,Sos2和Egr1来高效抑制MEK/ERK通路。因此,SC1可以通过上调miR124-3p的表达来协助其有效抑制MEK/ERK通路。
  6.研究分析SC1处理对细胞形态的影响。促进细胞聚集有利于胚胎干细胞维持自我更新,SC1能显著促进细胞形成克隆样结构。糖原染色实验发现SC1处理糖蛋白总量显著增加,这暗示SC1能促进细胞粘附分子表达量增加。qPCR和Western blot检测证明, SC1处理可显著上调F9细胞中细胞粘附分子E-cadherin和Alcam的表达。然而单独过表达粘附分子Alcam并不能显著改变细胞形态。此外,蛋白合成抑制实验证明SC1主要是通过提高细胞粘附分子的表达来促进细胞形成克隆样结构。
  综上所述,SC1能通过有效抑制分化相关的MEK/ERK通路,以及增强细胞之间粘附来维持干细胞自我更新的能力。
[硕士论文] 叶露
软件工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:随着高通量测序技术的快速发展,出现了很多应用高通量测序数据的结构变异检测方法。由于高通量测序本身的局限性,例如片段较短、测序误差偏大等因素,常规的检测方法存在较大的局限性,检测精度和敏感度不够。针对这个问题,本文主要针对插入变异,提出了一种基于序列拼接的基因组插入变异集成检测方法,取名为ISALins。本文的主要内容如下:
  (1)设计基因组插入变异检测流程,分析了检测流程用到的实验数据。鉴于千人基因组发布的插入变异数量太少,本文通过编程实现生成实验要用到的插入变异标准集。为了全面验证实验的检测效果,根据实验需求准备了NA12878个体真实测序数据和变异基准数据,仿真数据和真实数据为本课题奠定了数据基础。
  (2)分析了插入变异的片段特征,提出了一个聚簇支持插入变异片段的聚簇算法,保证了后续序列拼接和变异检测的有效性。同时提出一种解决基于De Brujin图序列拼接算法中重复序列的有效策略。
  (3)提出了一种基于序列拼接的插入变异集成检测策略,在仿真数据和真实数据上分别进行了实验。该策略的实施分为四个阶段:第一阶段,为了在保证检测敏感度的情况下,提高长插入变异的检测精度,通过融合多个工具的检测结果得到一个初始插入变异可疑断点集合;第二阶段,通过在每个可疑断点附近聚簇OEA片段,并进行软切片段(soft-clipped read)分析来得到高质量软切片段;第三阶段,利用基于De Brujin图的方法来进行局部拼接,通过使动态k-mer和k-mer频率分析策略来消除基因组重复序列造成的错误拼接问题。第四阶段,通过将重叠群片段contigs使用比对工具bwa和blat和参考基因比对后进行插入变异检测。实验结果表明,相对于传统的插入变异检测方法,本文所提出的策略对高覆盖度和低覆盖度测序数据的变异检测效果良好,在一定程度上提高了结构变异检测精度。
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