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[硕士论文] 张昌建
生物物理学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:核小体是真核生物体内由 DNA和组蛋白八聚体形成的染色体基本结构单位。基因调控、DNA复制和修复、细胞核内染色质的高级空间结构的形成等生物学过程都依赖于核小体在基因组中的分布与排列。而随着测序技术飞速发展导致的基因组大数据时代的到来,如何建立快速、有效的识别核小体精确定位算法成为了生物信息学新的挑战。目前,关于核小体定位理论预测的方法都存在一些缺点,例如数据存在冗余性、核小体特征提取的不全面、没有友好的免费服务界面等,这驱使我们开发了一个基于核小体序列的结构属性和长程关联信息的新的预测方法,弥补了目前关于核小体定位方法的一些缺陷。我们还将该方法扩展到了人类复制起始位点的理论预测上,同样取得了很好的效果。
  本文分别提取了核小体和复制起始位点序列的核苷酸频率特征以及包含伪核苷酸组分的物化性质特征,然后通过支持向量机和随机森林算法分别构建了核小体位点和复制起始位点的预测模型并且利用不同的分类算法作为对照综合评估了模型的性能;同时,我们开发了免费的在线预测服务软件供科研人员使用;最后利用核小体的预测模型分析了人类复制起始位点邻近区域的核小体分布情况。
  我们首先从相关的文献和数据库中得到人类核小体和复制起始位点序列的数据,通过对数据的筛选和去相似性处理后,利用伪核苷酸组分提取特征的方法分别对核小体和复制起始位点序列进行了特征提取。利用留一法交叉验证来计算模型的预测精度,结果表明核小体位点的预测模型Acc达到了87.38%,auROC达到了0.933;人类复制起始位点的预测模型Acc达到了75%,auROC达到了0.835。此外,为了更好的评估模型的性能,我们还比对了不同的机器学习算法,包括决策树、朴素贝叶斯等,结果显示,我们构建的两个预测模型在各个评价指标上都具有一定的优势。我们还开发了一个免费的在线服务软件,科研人员可以通过访问http://lin.uestc.edu.cn/server/iOri-Human.html网站对未知的序列进行预测。最后,通过研究复制起始位点的所有子序列是否为核小体序列来研究复制起始位点邻近区域的核小体分布情况。结果表明复制起始位点邻近区域形成核小体的概率低于其他区域,证实了本文构建的核小体预测模型具有一定的实用性。
[硕士论文] 梁志勇
生物物理学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:启动子作为调控元件的一部分,能够控制基因的转录。在原核生物中,启动子能够被RNA聚合酶的σ因子特异性识别。在大肠杆菌(Escherichia coli)中,σ70启动子能够控制大肠杆菌中大部分必需基因的转录起始,因而被称为“管家启动子”;而枯草杆菌中的σ43启动子作用如同大肠杆菌中的σ70一般,同样调控着枯草杆菌中大部分必需的基因转录起始。由于启动子在转录调控中的重要作用,使得从整个基因组序列中准确识别出启动子,成为进一步了解基因调控机制的重要一步。随着基因组数据的出现和计算方法与设备的发展,人们非常希望通过使用机器学习方法来识别启动子。
  由于在一些研究大肠杆菌σ70启动子和枯草杆菌σ43启动子的预测方法中,它们的预测器仅考虑了序列的短程特征信息,而并没有考虑同样很重要的长程序列顺序信息。因此,本文提出了一种新的方法——PseZNC,用来公式化启动子样本序列,在这个模型中,既考虑了序列短程特征信息,也考虑到了序列长程特征信息。短程顺序特征信息由多窗口 Z曲线通过描述碱基组分来获得,而序列的长程特征信息则由两个二核苷酸之间物理化学性质相关性来描述。我们选择支持向量机作为本文的分类算法。
  在使用5-fold交叉验证中,用该方法对大肠杆菌σ70启动子进行预测时,预测的准确率Acc为84.54%,灵敏度Sn为80.30%,特异性Sp为84.54%,AUC为0.9088;对于枯草杆菌σ43启动子的识别,预测准确率Acc为92.30%,灵敏度Sn为88.89%,特异性Sp为93.83%,AUC为0.9650。这些结果证明PseZNC是一个效果很好的预测器,且有很大的潜力应用于其他调控元件的识别中。为了方便相关研究者进一步研究大肠杆菌而不必重复本文方法,我们提供了一个用户友好、简单实用的在线服务工具 iPro70-PseZNC,该工具可通过以下网址进行免费访问使用:http://lin.uestc.edu.cn/server/iPro70-PseZNC。
[硕士论文] 刘娇
生物数学 安徽师范大学 2017(学位年度)
摘要:核小体作为真核生物染色体的基本结构,控制了转录因子与结合位点的结合通道,在基因表达、细胞周期、DNA复制,RNA剪接等基本生命过程中扮演重要角色。核小体定位作为一种重要的表观遗传因素,其在基因表达调控等多种生命过程中起着非常关键的作用。预测核小体定位有助于揭示复杂的生命现象,具有医学和生物学重要的意义。
  本文基于时间序列分析建立了核小体定位模型,对core DNA序列和linker DNA序列进行分类预测,实验结果显示,相对于ID-SVM和iNuc-PseKNC,本文算法取得了较高的预测精度,表明本文的模型适合用于预测核小体定位。然后根据占据模型得到了核小体在全基因序列上的精确定位图谱。
  首先,本文阐述了核小体定位的研究背景、研究意义及其研究现状,并介绍了一些相关的基础背景知识,如遗传物质和它们间的相互关系,以及相关的数据库资源、核小体周期性研究、LZ复杂度算法等。
  接下来,基于时间序列分析中的p阶自回归过程AR(p)模型表示DNA序列中核苷酸的相互关系,并用改进的LZ复杂度计算其中偏自相关系数,再结合核小体二联体的周期性以及DNA的物化性质建立了核小体定位预测模型。
  然后,统计分析数据集中的核苷酸的占据率。根据单核苷酸的占据率表明了本文核小体数据的有效性。二核苷酸的占据率得出了二核苷酸在core DNA序列和linker DNA序列中的偏好性,其结果说明了核小体的linker DNA序列相对于core DNA序列更具有保守性。
  最后,借助SVM实现本文定位模型的检验性分析,实验结果表明本文模型可以有效的区分H.sapiens,Celegans, D.melanogaster,S.cerevisiae四个物种核小体中的core DNA序列与linker DNA序列,能够切实提取核小体定位信息,对于实现在全基因序列上的核小体定位的预测是可行的。同时还验证了DNA的物化性质对核小体定位研究的重要性。此外,在与Kaplan等人测得的酵母14号染色体的核小体占据图谱相比较并取得良好的定位效果的基础上,确立了四个物种在全基因序列上核小体精确定位谱图,对核小体占据区和缺乏区不错的预测效果说明了本文模型可作为预测核小体定位理论研究的有效工具。并由相关性分析确定了四物种之间存在亲缘关系。
[硕士论文] 许薷方
海洋生物学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:深海是一个特殊的生态环境,这里有着永久的低温、高压和黑暗,生活在这些环境下的微生物都有着特殊的生理代谢途径以适应这种极端环境,但目前人们对这些微生物的耐压耐冷机理的了解仍然非常有限。一株革兰氏阳性放线菌Microbacterium sediminis YLB-01分离自西南印度洋(49.8405E,37.8111S)2327m深的海底沉积物,具有耐受高压和低温的特性。本文以YLB-01作为模型,试图从人工诱变和转录组表达两个层面上解答其耐压耐冷策略。
  通过一种新型的诱变方法——常压室温等离子体诱变,成功获得一株高压和低温敏感性突变子—9-3E5。实验结果表明,该突变子在常温常压下生长状态与野生株相似,但在高压(30MPa)和低温(4℃)条件下均生长受限(非致死性突变)。对突变子9-3E5的基因组进行重测序,一共发现了1082个单核苷酸突变(SNP),其中有838个位于编码区;27个小片段的插入与缺失(InDel),其中有个20个突变位于编码区。对突变基因分析发现,突变子9-3E5中有4个细胞分裂相关基因发生了1个或以上的SNP突变。我们猜想细胞分裂受限是突变子9-3E5在低温或高压生长受抑制的主要原因,这也提示,YLB-01细胞分裂基因的功能与其高压和低温适应性相关。
  为了进一步解答YLB-01的耐压耐冷机理,我们分别用高通量法测定了常温常压(28℃,0.1MPa,NPNT),常温高压(28℃,30MPa,HPNT),低温常压(4℃,0.1MPa,NPLT),低温高压(4℃,30MPa,HPLT)的转录组表达水平。结果表明,YLB-01在高压和低温具有相似的应对策略。另外,高压和低温抑制了YLB-01的多个生物进程,包括细胞代谢、细胞分裂、蛋白翻译、物质转运和胞外蛋白分泌、细胞运动和DNA损伤等,这些影响是YLB-01在极端环境下生长缓慢的主要原因。此外,通过对转录组数据分析,我们发现YLB-01主要是通过以下四条策略来应对高压和低温的影响,分别是:(1)高压或低温诱导了YLB-1的菌毛组装和生物膜的形成,促进了该菌的蹭行运动、营养物质的摄取和提高其压力应对;(2)通过碱基切除修复和错配修复机制修复DNA损伤位点;(3)通过富集了多种相溶性溶质来应答的低温和高压的刺激;(4)通过转录调控因子调节细胞应对环境压力的改变。
[博士论文] 齐静
发育生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:Dishevelled(Dvl或Dsh)作为一个关键的中间信号分子介导不同Wnt信号通路的激活,它包括三个高度保守的结构域DIX、PDZ和DEP,其中DIX结构域介导经典Wnt信号,DEP结构域在非经典Wnt信号通路中起作用,而中间的PDZ结构域在两种通路中都起作用。Dvl的C末端结构从无脊椎动物到脊椎动物也高度保守,但是它在调控不同Wnt信号通路激活中的功能依然不清楚。
  本研究首先通过构建Dvl不同缺失突变体来研究C末端结构在经典和非经典Wnt信号通路中的功能。结果表明C末端结构的缺失导致Dvl在经典Wnt信号中的活性下调,特别是C末端缺失最后8个氨基酸的突变体Xdsh-CΔ8与野生型Dvl相比能明显下调经典Wnt信号的激活,且具有剂量依赖效应。而Xdsh-CΔ8与野生型Dvl相比,更容易影响斑马鱼胚胎原肠期细胞的集中延伸运动诱导PCP缺陷,增强非经典Wnt/PCP信号活性。这些结果表明Dvl蛋白C末端结构差异调节Wnt信号活性。由于本课题组之前报道了Dvl的构象变化是由其高度保守的PDZ结构域结合C末端引起,这对于信号的特异性非常重要。因此,在本研究中我们提供了进一步的证据表明Dvl的C末端与PDZ结构域的结合导致Dvl在Wnt信号通路中的自我抑制。强制结合C末端与PDZ结构域(突变体Xdsh268/735C形成闭合型构象),降低了Dvl在经典Wnt和非经典Wnt/PCP信号中的活性,而干扰C末端与PDZ结构域的相互作用(突变体Xdsh-RFP或Xdsh-GFP或Xdsh-CΔ8形成开放型构象),释放了Dvl的自我抑制,削弱了其在经典Wnt信号中与LRP6的功能互作,但增加了Dvl在Wnt/PCP信号中的特异性,这与增强的Dvl膜定位密切相关。因此,我们的结果阐明了Dvl最后C末端结构介导的自我抑制在经典Wnt/β-catenin和非经典Wnt/PCP信号通路中具有不同的调控作用。总之,本论文的研究结果强调了C末端结构在维持Dvl至合适的自我抑制状态的重要性,从而有利于其它相互作用因子共同调节信号特异性的转换。更重要的是,该结果暗示了C末端标记的Dvl融合蛋白广泛应用于研究Dvl的功能和亚细胞定位可能不能真实反映野生型Dvl的作用,因为这些蛋白不能自我抑制。
[硕士论文] 何超
遗传学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:对于真核生物,染色质是最大的单一生物大分子,是基因组的存在形式,是遗传和表观遗传的共同载体,而细胞核是染色质的储存空间。在有丝分裂间期,不同的染色质在细胞核内分别占据一个相对独立但又相对固定的空间位置即染色体领域CT(Chromatin Territory),每条染色质进一步分层级折叠成复杂而有序的三维高级结构,这些稳定的高级结构及其核内空间定位与 DNA重组与复制、基因的转录甚至翻译等密切相关。大量研究发现,很多调控因子都是依赖着染色质三维空间结构来发挥功能。
  染色体构象捕获技术3C(Chromosome Conformation Capture)是2002年出现的研究染色质折叠的核心生化技术,近年来随着3C的衍生技术如4C、5C、Hi-C、Capture-C以及考察特定蛋白介导染色质互作的 ChIA-PET等分子图谱(Mapping)以及DNA-FISH等不同类型的成像(Imaging)技术的迅速发展,人们对染色质折叠的认识不断加深。目前普遍认为:有丝分裂间期染色质的折叠包含染色质领域(chromosome territory)、拓扑结构域(TAD)、染色质环(chromatin loop)等从大到小不同层级的结构单元,作为基因组序列及其DNA和组蛋白修饰、染色质调控蛋白的结合等的最终载体和响应器(carrier&responser)或“集大成者”(moderator),基因组的复杂三维高级结构与组蛋白修饰、DNA甲基化、DNase敏感性等基因组其它组学特征以及基因的复制、转录等基因组功能特征密切相关。
  顺式调控元件 CREs(cis-regulatory elements)往往指的是与结构基因串联的特定非编码DNA序列,它们通过与转录因子等的结合而调控基因转录的精确起始和转录效率,从而参与基因表达的调控。根据序列组成等特性,可以将其分为常见的启动子、终止子、增强子、绝缘子、边界元件、基因组座位调控元件以及重复元件、核基质附着区等不同类型。其中重复元件(repeat elements)在基因组中多次重复出现,包含了大量的有着不同的结构和来源的DNA元件,在真核生物基因组中的比例可达到一半以上。根据片段长度及生物学特性,重复元件可进一步分成串联重复序列及转座元件等。由于受到测序读长、比对等技术手段的限制,人们对于重复元件在基因组中发挥的功能和机制目前还知之甚少,需要进一步发掘。核基质附着区(MARs)是一类在不同物种与组织细胞的基因组中广泛存在的、富含 AT序列且与核基质紧密结合的 DNA元件。目前认为MARs元件一方面可能作为染色质三维折叠的结构单元,对于建立和维持染色质领域发挥着作用;另一方面可能作为基因表达调控的功能性单元,通过与核基质等结合,调节基因表达。
  本研究以染色质三维结构实验数据为基础,通过多组学数据整合分析,从基因组序列特征出发,考察了多种不同顺式调控元件在染色质三维折叠中的可能作用,以及染色质三维结构对这些元件演化等潜在影响,为进一步深入了解不同元件在染色质三维高阶结构的建立、维持以及传递等过程中可能的作用奠定了基础。
  本论文的主要研究内容如下:
  开发了Hi-C数据处理的一站式软件HBP。建立了针对特殊顺式调控元件的研究方法,开发了能够系统考察特殊顺式调控元件参与的染色质相互作用的处理软件HBP(Hi-C BED file analysis Pipeline),通过简单的操作即可实现针对不同元件的处理和分析。HBP作为一款开源、灵活、高度优化的一站式处理平台,能够有效地分析全基因组三维高级结构特点及特殊序列元件参与的染色质相互作用,大大方便了针对特定相关区域染色质折叠的系统研究。作为一个简便、高效、可靠的工具,HBP能够通过整合组蛋白修饰一级 ChIP-seq、RNA-seq等其它组学数据,针对特定区域的染色质相互作用进行大规模系统挖掘与分析,对潜在分子机制以及生物学意义等进行多方面的研究。
  基于染色质三维结构对部分重复元件进行了研究。重复元件在各类物种基因组中广泛分布且种类繁多,不同种类之间序列功能各异。本研究探索了与染色质三维结构高度相关的一些重复元件子类,发现了包括Alu等在内的重复元件广泛地参与了染色质的三维折叠。首次从染色质三维结构的空间距离层面,系统考察了相邻重复元件子类间的演化过程,发现在一维序列演化关系上相对靠近的子类,在三维空间结构上的相互作用强度相对较高,提示重复元件的进化历程可能与基因组三维高级结构的形成密切相关。
  基于染色质三维结构对核基质附着区进行了研究。核基质附着区 MARs(Matrix Associated Regions)在不同的物种间广泛存在,虽然存在AT序列相对富集等共同序列特征,却没有发现显著保守性等其它结构特征,此外其在细胞核内的功能和机制也尚无定论。本研究针对MARs元件,从相互作用频率分布、网络拓扑结构及潜在生物学功能等三方面进行了探索。发现 MARs元件与染色质三维结构高度相关,且在高强度相互作用中占据着较大的比例,提示MARs元件对染色质折叠具有重要影响。同时,拓扑结构聚类分析证实MARs元件可以分为不同类型,包括了维持染色质领域及高级空间构象等方面的结构单元部分以及调控基因表达等方面的功能单元部分,提示不同类型 MARs元件在基因组细胞核高级结构及功能上可能发挥不同的作用。
  综上所述,本课题以染色质三维结构为基础,以研究不同顺式调控元件在染色质三维结构中发挥的作用为目的,开发了特定的Hi-C数据分析处理软件HBP,建立了多组学数据的整合分析方法,并且对部分重复元件及核基质附着区与基因组三维高级结构的关系等进行了分析,发现了一些与染色质三维结构高度相关的现象,为进一步的染色质高阶构象及构成元件结构与功能等方面的研究奠定了基础。
[博士论文] 刘玉胜
遗传学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:母源mRNA降解是小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中的重要事件。然而,我们对调节哺乳动物母源mRNA降解的因子和机制的了解还太少。一般而言,mRNA去腺苷酸化是非常重要的一个分子事件,是mRNA降解的第一步也对降解起到限速的作用。负责mRNA去腺苷酸化的主要是CCR4-NOT(CCR4-NOT transcription complex)复合体。在CCR4-NOT复合体中,Cnot6/6L和Cnot7/8具有核酸酶活性,它们担负着去腺苷酸化功能。然而,CCR4-NOT复合体中并没有RNA结合蛋白,其发挥去腺苷酸化功能需要其它的RNA结合蛋白或桥接蛋白来介导。在体细胞中,BTG/TOB(B-celltranslocation gene/Transducer of ERBB2)抗增殖蛋白家族作为桥接蛋白,在介导CCR4-NOT复合体调节mRNA去腺苷酸化及随后的降解过程中发挥着重要的作用。虽然BTG/TOB蛋白家族对mRNA去腺苷酸化具有重要功能,但是已经报道的五个成员(Tob1、Tob2、Btg1、Btg2、Btg3)的基因敲除鼠都具有正常的生存能力和生育力。另外,根据已经发表的基因表达数据库,相比于这五个成员Btg4(B-cell translocation gene4)特异性高表达在小鼠卵母细胞和早期胚胎中。提示Btg4可能参与小鼠母源向合子转变过程中母源mRNA的降解。本项目利用基因敲除小鼠研究了Btg4在母源向合子转变过程中的功能和作用机制。
  实时定量RT-PCR结果显示Btg4特性高表达与卵巢和睾丸中,在卵母细胞和早期胚胎中呈现母源表达模式;有意思的BTG4蛋白主要表达在卵母细胞成熟以后到1-细胞阶段,提示其可能在母源向合子转变阶段发挥着重要功能。为研究Btg4的生理功能,本研究建立了该基因的敲除小鼠。Btg4敲除不影响小鼠的生存能力和雄鼠的生育能力,但导致雌鼠不育。Btg4缺失并不影响雌鼠的排卵和卵母细胞的成熟,但母源Btg4敲除却导致早期胚胎发育阻滞。借助于高通量转录组测序,Btg4敲除后,GⅤ期卵母细胞没有明显的差异,而MⅡ期卵母细胞和合子的转录组发生的明显差异:母源mRNA降解受到阻止,相对于野生型,上调的比例分别是46%(6401/13770)和20%(2898/14058)。同时,选择一部分有代表性的母源基因,利用qRT-PCR技术对它们的高通量测序结果进行了验证。为了进一步探索BTG4缺失后导致母源mRNA上调的原因,利用Poly(A)尾巴长度检测方法(PAT,Poly(A) tail length assay),Btg4敲除的MⅡ期卵母细胞和合子不能去腺苷酸,因而降解受到阻止。另外,通过共免疫沉淀实验得出结论,BTG4能够将CCR4-NOT复合体募集到PABPC1L(Embryonic poly(A)-binding protein)(一种特异性表达在卵母细胞中的poly A结合蛋白),从而调节母源mRNA的降解。将BTG4蛋白中的两个保守的基序(BoxA和B)删除后,影响了BTG4与CNOT7的相互作用。最后,Btg4挽救实验表明:只有全长的BTG4才能恢复BTG4缺失导致的异常表型。
  综上所述,我们的结果证实:在小鼠MZT(Maternal tozygotic transition)过程中,Btg4是母源mRNA降解的一个重要的调节子;并且BTG4是通过连接CCR4-NOT复合体与PABPC1L来发挥这一调节功能的。另外,我们的研究一方面增加了对小鼠母源向合子转变过程中分子调控机制的理解,同时相关的研究还可为人类不孕不育等发病机制提供参考。
[硕士论文] 刘萍
生物学;生物化学与分子生物学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:转录因子介导的体细胞重编程技术不仅避免了传统干细胞研究的伦理问题;同时在疾病模型、药物筛选等方面具有广阔的应用前景。系统地研究重编程过程中的分子机制不仅有助于理解细胞命运转变的内在联系,更有助于获得临床级别的诱导多能干细胞(iPSCs)用于疾病治疗。近些年的研究表明环状RNA(circRNA)的表达呈现出细胞类型特异性且参与调控大脑神经发育、肿瘤的发生发展,暗示其具有重要的生物学功能。但circRNA在体细胞重编程和多能性中的研究还未见报道。
  本论文第一部分以小鼠胚胎干细胞(mESCs)和体细胞重编程为模型探索circRNA的生物学功能。首先采用环状RNA测序的方法系统的比较circRNA在胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞(MEFs)中的表达差异;然后结合生物信息学分析和功能预测,筛选出特定的circRNA进行双向PCR测序验证;进一步针对特定的circRNA,通过siRNA敲低和过表达研究其对小鼠胚胎干细胞多能性的调控;最后在OG2MEF细胞中筛选能够调控重编程的circRNA分子。研究发现circGatad2a,circKdm2a,circMad111过表达可以稳定地促进OG2MEF细胞的重编程效率。进一步研究表明这三种环状RNAs过表达能够不同程度的促进重编程后期多能性基因(如Nanog, Pou5f1等)的表达且不依赖于自身mRNA基因的变化。
  本论文第二部分基于课题组已有的发现:即敲低抑制复合物NCoR/SMRT能显著提高OSKM介导的小鼠体细胞重编程效率并促进多能性基因的表达,进一步探索NCoR/SMRT抑制复合物和重编程因子间的作用关系。并以此高效重编程系统为模型,初步研究促重编程circRNA表达的差异。研究发现,重编程因子OSKM都能和NCoR/SMRT复合物相互作用,但与c-Myc的作用最强。为此我们推测NCoR/SMRT抑制复合物主要由c-Myc招募去抑制重编程后期多能性基因的激活,从而降低体细胞重编程的效率,但敲低NCoR/SMRT介导的高效重编程系统并未影响部分促重编程circRNA的表达。
  综上所述,本论文主要研究circRNA在小鼠胚胎干细胞和体细胞重编程中的生物学功能。通过高通量的circRNA测序和系统的功能筛选发现circRNAcircGatad2a, circKdm2a-1#,circMad111可以促进体细胞重编程的效率,具体的分子机制还有待于后续研究;另一方面发现c-Myc参与招募抑制复合物NCoR/SMRT去抑制多能性基因的激活,并且敲低NCoR/SMRT介导的高效重编程系统并未影响促重编程circRNA的表达。
[博士论文] 文明
发育生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:物种之间的杂交往往导致杂种失活和杂种不育,远缘杂交导致生殖隔离的一个可能机制是杂种后代中来自不同物种的基因不相容和核质冲突。另一方面,基因组之间冲突和核质冲突是物种进化的动力。本论文基于红鲫(carassius auratus red var.)(G)和团头魴(megalobrama amblycephala)(B)远缘杂交实验中的重要结果,以红鲫为母本和团头魴为父本得到能够存活的子代,而反交后代却100%不存活。鉴于以上现象与有关理论基础,我们推断“核质冲突可能是导致反交后代致死重要原因之一”。为了验证我们的假设,本实验以团头魴早×红鲫♂(鲂鲫F1)(BG)为实验组,以红鲫♀×团头魴♂(鲫鲂F1)(GB)、红鲫自交,团头魴自交为对照组,对其四个代表性胚胎发育时期(囊胚期,原肠期,心脏跳动期,出苗期)的线粒体DNA进行了研究分析。首先我们对胚胎内的父母本线粒体DNA变化进行了研究,探究线粒体的变化与胚胎致死的相关性,另外我们还利用显微注射线粒体技术,探究外源线粒体对胚胎发育的影响及其在胚胎发育过程中的变化。在转录组水平,我们对四个物种的四个时期的胚胎进行了转录组测序比较分析,对鲂鲫致死的可能基因进行了进一步的研究。通过对红鲫和团头魴杂交系统的分析,我们发现了父本线粒体在鲤科杂交鱼中的行为,同时也说明了核质冲突在鲂鲫致死的相关关系。本论文获得的具体研究结果如下:
  1.基于对父母本线粒体变化在实验组(鲂鲫)与对照组(红鲫、团头魴和鲫鲂)的研究。我们设计了针对红鲫和团头魴线粒体基因cytb特异的引物,对父母本线粒体DNA在胚胎发育中的变化进行了系统检测。结果发现在两个杂交物种的胚胎中,父本mtDNA在鲤科鱼的胚胎发育过程中消除滞后并且所有线粒体基因表达沉默。父本mtDNA在受精卵时期存在,但是在鲫鲂F1成鱼组织中和幼苗中均没有发现父本线粒体DNA,这就意味着父本mtDNA的传递和消除是为了确保严格的线粒体的母本遗传。令人惊讶的是,父本mtDNA在胚胎发育过程中一直到心脏跳动期都是可以被检测到的,直到出苗时期才消失,这也暗示着它的滞后消失导致早期胚胎发育的胚胎异质性。更重要的是,在整个胚胎发育过程中,我们并没发现任何线粒体基因的表达,说明父本线粒体基因在整个胚胎发育过程中都是表达沉默的,从而排除胚胎在发育过程中线粒体异质对胚胎发育的影响。因此,在理科杂交鱼中,父本线粒体滞后消除并且表达沉默。清楚的是,线粒体基因的表达沉默揭示出一种新的线粒体母性遗传机制,同时也意味着可能可以通过线粒体转植和替换来达到治疗线粒体相关疾病。
  2.在大部分真核生物中,线粒体和线粒体DNA总是严格母系遗传,而精子mtDNA通常在受精过程中进入卵子,但是在受精后很快被消除。有报道称显微注射精子和肝脏小鼠mtDNA到胚胎中,线粒体一直存在直到出生后。同时鲤科杂交鱼中精子线粒体在胚胎发育过程中滞后消除并且转录沉默。本论文我们利用来自红鲫和斑马鱼的肝脏、心脏和精子的线粒体互相注射到对方的1细胞的受精卵中,然后再对显微注射的四个时期(囊胚期、原肠期、心脏跳动期和出苗期)的胚胎中线粒体的mtDNA和mtRNA进行检测。不同于杂交鱼中通过受精传递到胚胎中精子线粒体DNA,他们在心脏跳动期后消失并且在整个胚胎发育过程中表达沉默。这些通过显微注射到胚胎中外源线粒体,在胚胎发育的整个过程中不仅一直存在而且也持续表达。更令人惊奇的是,显微注射的线粒体的斑马鱼胚胎发育正常,这也就说明线粒体异质并不影响胚胎的形成和发育。因此,外源线粒体的持续存在以及表达是依赖于线粒体的传递方式而不是线粒体的来源,这也暗示着胚胎中存在着负责清除并沉默受精来源的精子线粒体DNA,而不能清除通过显微注射进入胚胎的线粒体,这些发现为关于胚胎中mtDNA命运及其在正常和疾病中异质性机制提供了新的解释。
  3.不同物种之间的杂交往往存在不同程度的核质不相容,而导致其后代不育、不能存活以及表型上的不正常。近年来科研工作者也在核质不相容的方面开展了许多的相关研究,然而直接的实验相关的证据还是很少。红鲫(2n=100)和团头魴(2n=48)同属于鲤科,但分别隶属于鲤亚科鲌亚科。本实验将团头魴和红鲫进行人工远缘杂交,发现反交后代BG严重畸形并且致死,而正交交后代GB成活。考虑到正交能存活后代GB的母本基因组远大于父本,而线粒体为严格意义上的母系遗传,所以核基因组与线粒体基因组之间的冲突相对较少。然而反交后代致死且反交后代中母本核基因组远小于父本核基因组,所以我大胆猜想正交后代严重畸形且致死的重要原因之一可能是远大于母本的父本核基因组与母源性细胞质基因组之间不相容。为了验证我们的猜想,我们提取红鲫的精子线粒体注射到BG的1-2细胞胚胎中,结果发现显微注射的父源性线粒体虽然没能改变BG因内脏裸露而致死命运,但却在很大程度上缓解了胚胎的畸形程度,有部分鱼苗甚至可以正常游动。因此,我们推测核质冲突在导致BG畸形和能量供给方面有重要影响,而其最终致死是由于核质冲突与核-核冲突共同作用的结果。
  4.综合上述研究结果,我们认为尽管父本线粒体在杂种胚胎中滞后消除却一直表达静止,从而防止了父本线粒体基因在胚胎发育过程中的作用,同时实验也说明父本线粒体在胚胎中的滞留与鲂鲫致死没有直接关系。另外显微注射线粒体到BG受精卵中,试图通过注射线粒体来改变其致死的结局,然而结果却显示注射了线粒体的胚胎能够增强胚胎的活性及其存活时间,但是却不能改变其致死的结局。这些结果表明我们没能从线粒体角度探究其与杂交胚胎致死的直接相关关系,因此,为了进一步探究杂交胚胎致死与核质冲突相关关系,我们利用高通量测序的优势,我们对实验中的四个物种的四个具有代表性的胚胎进行了转录组测序。通过对整体基因表达水平的考察,以及将BG各胚胎时期与其他三个物种同一时期的胚胎基因表达水平进行比较分析,获得了许多差异表达基因。同时我们利用红鲫和团头魴的unigenes构建了一个模拟杂交转录组参考序列,再对杂交鱼中的个胚胎时期的父母本基因表达差异分析,从而获得了父母本基因在杂交胚胎中的差异表达谱。这些早期转录本分析为我们从转录组角度探索双亲表达的核基因与母源性的线粒体基因的不相容关系,以及这种核质冲突与鲂鲫F1致死的相关关系打下了重要的基础。
[硕士论文] 王纬韬
生物信息 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:随着测序技术的发展,高通量测序的精准度不断提高,成本逐年下降,相关的应用亦越来越广,本文以高通量测序技术为基础,利用测序数据,提出鉴定家系遗传病的候选基因的方法。在实际操作上需面临流程参数设定,显隐性假设,以及候选基因是抑制子或激活子的假设等问题。对研究者而言如何选择更优的参数,针对各种遗传假设快速合理地得到分析结果,是充满挑战性的。为了更好地解决这一问题,基于二代测序技术的基因识别软件GIPS应运而生,他为研究者提供了四种指导性参数,并成功地应用于水稻测序数据上。
  本文统筹考虑了家系遗传病中各种可能出现的情况,在第一代GIPS的基础上增加了新的家系过滤算法,ANNOVAR注释软件接口,曼哈顿图谱绘制功能,以及底层的背景突变率算法的重定义和公式改进。进一步增加该软件的实用性,可扩展性,生物学可靠性以及精准度。并为提高运行效率,推出了快速获得候选基因列表的新命令。针对第二代GIPS软件的优化。首先,讨论了在家系遗传病中可能存在的各种情况,如待研究病症的显隐性,候选基因是抑制子或是激活子。并根据每种情况,利用不同SNP在基因座上的基因型,进行家系筛选。为了使得用户更直观地了解基因组上所有基因与表型的相关程度,绘制出基因组上每一个基因与表型相关联的显著性的曼哈顿图谱。亦可更直观的反应出通过阈值筛选的候选基因数目。通过改进背景突变率的算法,我们得到更为精确的评估标准,文中亦对前后两种背景突变率作了详细的比较,为了更多的从生物学角度改进该算法,我们还可以综合不同类型的打分软件,从不同角度(例如序列保守程度,理化性质等),指导SNP的筛选。
[博士论文] 徐锦根
细胞生物学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:Wnt信号通路在胚胎发育以及成体组织更新等许多生理过程中发挥重要的作用。当Wnt信号通路在生殖细胞阶段发生突变时会导致遗传病的发生,而在体细胞中发生突变时则会导致肠癌以及其他相关疾病。R-spondin蛋白(简称RSPOs)是一组能够和Wnt蛋白一起协同刺激Wnt/β-catenin信号通路从而在发育以及组织更新等生理过程中发挥重要作用的糖蛋白。最近,孤儿受体LGR4以及它的同源蛋白被证实能够作为R-spondin蛋白的受体从而介导R-spondin对Wnt信号通路的激活。LGR4-6属于B型LGR受体,其特征除了经典的七次跨膜区域外,还包括细胞外和R-spondin蛋白结合的包含leucine-rich repeat(LRR)重复序列的结构域。尽管R-spondin和LGR蛋白具有非常重要生理功能,但是LGRs识别R-spondins的分子机理却依然没有得到很好的解释。在我们的这项研究中,我们采用了leucine-richrepeat杂交技术获得了活性良好、性质均一的LGR415以及LGR49重组蛋白,并且成功地解析了单个LGR415以及LGR49/RSPO1复合物的晶体结构。结构表明LGR4胞外结构域呈扭曲的马蹄状结构,而RSPO1的CRD结构域以一种平坦的β样构象结合在LGR4的内表面,它们之间存在许多的亲水以及疏水作用。我们还注意到LGR4上和RSPO1作用的氨基酸在LGR4/5/6上都是保守的,推测LGR4/5/6应该以相同的界面结合R-spondin蛋白。综合先前其它小组解析的LGR5结构我们推测LGR4/5/6都是仅采用单独的内表面来结合R-spondins,表明B型LGR受体结合配体的模式是单位点结合,这和A型LGR受体(LGR1/2/3)的两步识别步骤以及C型LGR受体(LGR7/8)的多界面结合模式是有显著区别的。总之,我们的工作以及先前别人解析的结构很好地解释了LGR受体超家族识别配体多样性的机制。
[硕士论文] 朱永强
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本文对呼和浩特地区汉族和蒙古族人群19个短串联重复序列基因座(D2S1338、D3S1358、CSF1P0、D5S818、Penta D、Penta E、D6S1043、D7S820、TH01、D8S1179、D12S391、TPOX、D13S317、D16S539、vWA、D18S51、D19S433、D21S11、FGA)的群体遗传多态性进行了调查。通过调查,为呼和浩特地区汉族和蒙古族人群法医学个人识别、群体遗传学以及亲权鉴定研究提供基础参考数据。
  采用Chelex-100法对所收集的呼和浩特地区汉族、蒙古族群体样本进行DNA提取,并使用基点认知技术(北京)有限公司所生产的GoldeneyeTM身份检定系统20A扩增试剂盒进行扩增及检测。结果呼和浩特地区汉族群体在19个STR基因座共检出238个等位基因和914种基因型,除D8S1179(P<0.05)外,其余18个STR基因座分布均符合Hardy—Weinberg平衡定律(P>0.05);呼和浩特地区蒙古族群体在19个STR基因座共检出217个等位基因和763种基因型,其19个STR基因座分布均符合Hardy—Weinberg平衡定律(P>0.05)。所调查的呼和浩特地区汉族、蒙古族人群19个STR基因座均具有较好识别能力。
  通过群体差异性检验,呼和浩特地区汉族与蒙古族群体19个STR基因座的等位基因频率无显著性差异(P>0.05)。
  通过人群聚类分析,本次调查研究的呼和浩特地区汉族和蒙古族两个群体最多来自于两个祖先群体。
  通过群体基因型结构分析,本次调查研究所采用的GoldenEye20A荧光标记复合扩增系统19个基因座,针对呼和浩特地区汉族、蒙古族群体检验,检出等位基因数量最多的基因座均依次为Penta E,D18S51,D6S1043,检出杂合度最低的基因座均为TPOX与TH01。
[硕士论文] 徐晓飞
药学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:Long interspersed nuclear elements(LINE-1 or L1)目前存在于人类基因组中最活跃的一种逆转座子,也是许多动物基因组中最成功的逆转座子。通过统计分析发现,人类基因组中大约存在百分之十七点五的序列由L1或其突变过后的部分序列构成,超过6700个L1元件的拷贝分布在人类基因组的各条染色体中。尽管拷贝数量大,但大部分L1元件在和完整的L1序列对比之后发现存在各种各样的突变和序列截断,这些不完整的L1序列往往缺失了转座过程所需的某些特定功能,直接导致这些突变体并不能独自的完成整个L1的转座过程。不过近年来不断有L1相关细胞培养实验表明可能存在一些具有活性的L1元件存在于人类基因组中,其中有一些还被证明具有很高的转座活性。在这些实验中,有的研究者克隆了人类基因组中一批具有高度完整性和可能具有活性的L1序列,并通过细胞实验观察这些挑选出来序列的转座率。和已知具有很高活性的L1转座子相比较,最终发现人类基因组中部分L1序列确实具有转座活性,并以此推测人类基因组序列中大约存在80~100条仍具有转座活性的L1序列。众所周知,L1作为一种仍能独自完成转座过程的转座子,其转座的现象严重的影响人类基因组的稳定性,且L1转座的发生往往会导致相应的疾病。由此可见,有活性L1序列的注释应该引起我们的高度关注。通过突变L1序列的某些位点来分析L1序列活性,是目前唯一的验证方法,这种方法也发现了很多突变位点会导致L1序列的失去或减弱转座活性。尽管如此,这种突变实验方法无形中增加了研究L1序列活性的门槛,让很多生物信息学研究者望而却步。因此,现在迫切的需要一种能够可靠的和易操作的方法来分析L1序列的活性。
  本文引入了一种基于支持向量机(SVM)、结合特征化的DNA序列的策略,旨在构造一个数学模型来深入的分析未知L1序列的活性。不同于其他方法,这里以核酸的种类、基团类型和氢键类型作为分类依据,用三条特征序列来唯一标识一条L1序列。蛋白质序列的描述符生成方法global protein sequence descriptors同样也被引入到这里,使用特征序列的组成、转换和分布来产生相应特征向量。最终本文会用一个13维度的特征向量来描述一条特征序列,一个39维度的特征向量代表一条L1序列的分子描述符。通过查阅文献,这里共收集到168条已知活性的L1序列,这些序列都将被用作SVM模型的训练数据。最后建立的SVM模型通过独立验证的检验,并得出了不错的验证结果。利用生成的最终模型去扫描人类基因组序列,共发现81条L1序列可能具有活性。
[硕士论文] 李晨迪
光学 沈阳师范大学 2017(学位年度)
摘要:光学成像与图像处理结合是认识生物结构空间构象的重要技术手段。而生物结构的空间构象对认识其生理功能,发育机制有主要意义。基于免疫荧光方法,本文采用双光子荧光显微成像技术,原位且立体地获取生物样品图像。进一步,本文通过图像三维分割、三维重构及数字化建模,量化表征生物结构的构象信息。采用该方法,本文研究了卵母细胞纺锤体和染色体的空间构象。染色体的空间构象与染色体的密度,基因转录活跃程度,以及细胞核的功能有重要关联。纺锤体的空间构象与染色体的排列与分离以及细胞分裂有关,其完整性对细胞能否正常繁殖有重要作用。卵母细胞中纺锤体和染色体的构象研究对评估卵母细胞质量,分析生殖发育问题有重要意义(如出生缺陷问题)。基于体外培养技术,本文首先研究了氨甲喋呤对卵母细胞纺锤体和染色体的影响。氨甲喋呤是一种抗叶酸代谢类药物,具有抑制细胞增殖的功能,广泛用于临床医治恶性肿瘤、类风湿性关节炎及异位妊娠等疾病。许多研究证明,氨甲喋呤对快速分裂的体细胞很强的副作用。然而,其对女性生殖细胞的影响尚不明确。本文研究发现与对照组(84%)相比,生发泡破裂比率在氨甲喋呤组下降至73%(p<0.05)。氨甲喋呤组的第一极体排出率(53%)也明显低于对照组(63%;p<0.05)。氨甲喋呤组染色体异常排布比率和纺锤体形态异常比率分别为60%和49%,均明显高于对照组情况(24%,17%;p<0.05)。以上结果提示氨甲喋呤可影响卵母细胞的成熟质量。随后,本文又研究了激素超排对卵母细胞质量的影响。激素超数排卵作为一种非自然排卵方式,在临床辅助生殖及基础科学研究中应用广泛。但此种排卵方式对卵母细胞成熟质量的影响仍不明确。我们研究发现,激素超排造成染色体空间排布异常,但不影响染色体的体积、表面积等几何构型。此结果可能提示激素超排干扰了染色体的运动与迁移功能。本论文建立了一套数字化表征纺锤体和染色体空间构象的方法,研究结果对认识生殖发育问题有重要意义。
[博士论文] 周琳莉
细胞生物学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:姐妹染色单体粘连(cohesion)由多亚基的黏连蛋白复合体(cohesin)所介导,并受到精确的调控以阻止染色体的错误分离。在有丝分裂前期和前中期,染色体臂上大量的cohesin被拮抗蛋白Wap1所去除,而着丝粒区的cohesin却仍然保留着以保证有丝分裂中期染色体正确整列。但是目前着丝粒区的cohesin是如何被保护而免受Wap1拮抗的分子机制还不甚清楚。
  文中我们用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术构建了Haspin-KO细胞系。活细胞实验显示这些Haspin-KO细胞中有丝分裂进程变慢。研究发现Haspin-KO细胞中着丝粒区染色体粘连减弱,姐妹染色单体提前分离。细胞内和体外实验证实有丝分裂期蛋白激酶Haspin通过非激酶结构域氨基端保守的YGA/R基序(YGA/R motif)与cohesin调节亚基Pds5B结合。Haspin-Pds5B相互作用抑制Wap1与Pds5B结合。破坏细胞中内源或者外源Haspin与Pds5B的结合都会导致着丝粒区姐妹染色单体粘连减弱,以及姐妹染色单体提前分离。相反,把含有能与Pds5B结合的Haspin氨基端50个氨基酸定点带到有丝分裂期染色体着丝粒区或者在细胞中敲低Wap1都能恢复Haspin-Pds5B结合破坏的细胞中着丝粒区染色体粘连缺陷。在细胞中过量表达野生型Haspin抑制Wap1活性,染色体臂保留着大量cohesin,染色体臂闭合。而且,在过量表达野生型Haspin的细胞中即使敲低cohesion保护蛋白Sgo1也不会导致姐妹染色单体的提前分离。最后我们得出结论,Haspin通过与Pds5B结合竞争性地抑制Wap1的活性,从而保护着丝粒区姐妹染色单体粘连。
  有丝分裂是生物繁殖和生长发育的基础,本项研究详细阐述了Haspin保护有丝分裂期着丝粒区姐妹染色单体粘连的分子机制,为进一步理解有丝分裂的调控机制提供了重要理论基础。
[硕士论文] 宋雨霏
生物化学与分子生物学 聊城大学 2017(学位年度)
摘要:牛BBOX1基因定位在牛的15号染色体上,牛15号染色上存在与肉质和胴体性状相关的QTL。通过3’RACE的方法克隆了牛BBOX1基因的选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)的变异体;采用RT-PCR的方法分析了BBOX1基因在牛不同组织中的表达谱;利用PCR-SSCP、PCR-RFLP和测序的方法检测了BBOX1基因3'UTR在研究群体中的多态性,并分析了检测到的基因多态性与牛肉质和胴体性状的相关性。
  本研究主要内容包括:⑴发现了牛BBOX1基因的三个不同的APA变异体,它们的3'UTR长度分别为229bp,664bp和678bp,它们的GenBank登录号分别为:KX431577,KX431578和KX431579。⑵用半定量RT-PCR的方法分析了牛BBOX1基因在不同组织中的表达情况,结果显示BBOX1基因在所选择的组织中都是表达的,其中瘤胃、肝脏和肾脏中的相对表达量较高。⑶在草原红牛群体中,采用PCR-SSCP和测序的方法对BBOX1基因3'UTR进了多态性检测。共检测到4个多态性座位,其中3个为单核苷酸多态性,1个为插入或缺失突变。而且SNP c.650T>C定位在远端poly(A)加尾信号中,使加尾信号序列“AAUAAA”突变成“AACAAA”。在草原红牛群体中,通过PCR-RFLP的方法对4个多态性座位进行基因分型。统计分析了各个多态性座位在群体中的基因频率、基因型频率、多态信息含量、有效等位基因数和期望杂合度等群体遗传学参数。⑷采用一般线性模型进行了BBOX1基因多态性与草原红牛肉质和胴体性状的关联分析。结果显示:多态性座位BBOX1-BbvI(c.512_513insTGC)对肌纤维直径、剪切力、净肉重和胴体重有显著影响;多态性座位BBOX1-HincII(c.650T>C)也只对肌纤维直径、剪切力、净肉重和胴体重有显著影响。
[硕士论文] 李斯慧
细胞生物学 中国医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:DNA聚合酶γ是迄今为止哺乳动物中唯一一种线粒体DNA聚合酶,对维持线粒体DNA的完整性及线粒体功能的稳定性起到至关重要的作用。衰老是生物界的普遍规律,是不可抗拒的随时间的增长而发生的自然衰退现象。目前社会老龄化日渐明显,与衰老相关性疾病趋于高发,是亟待解决的医学问题和社会问题。衰老机制的主要学说有端粒缩短说、自由基说、DNA损伤说等等。线粒体功能和mtDNA损伤对衰老过程的影响一直是50多年来的热门话题。Polg的功能缺失可导致线粒体基因组的不稳定,进而导致线粒体功能异常。Polg缺失的小鼠主要表现出年龄依赖性的线粒体DNA突变积累和早衰表象。Chk2(细胞周期检验点激酶2,checkpoint kinases2)是哺乳动物中的细胞周期调控蛋白,是DNA损伤修复通路(DDR)中的重要参与因子。发生DNA损伤后,细胞可通过不同途径激活Chk2,作用于下游靶蛋白,最终激活监测点机制,进而使细胞周期发生阻滞。本课题通过Chk2敲除小鼠与Polg敲除小鼠杂交,得到Polg/Chk2双基因敲除小鼠,使之与Polg纯合敲除小鼠比较,试分析Chk2缺失能否挽救Polg敲除导致的器官早衰现象。以皮肤为切入点,探索Chk2缺失是以何种方式来部分挽救Polg敲除带来的皮肤衰老的现象。同时分析Chk2缺失能否改善Polg敲除导致的心脏扩张状况。为深入研究线粒体功能与干细胞,细胞周期与衰老提供前期基础。
  方法:饲养培育Chk2敲除小鼠与Polg敲除小鼠,杂交得到WT小鼠(Chk2+/+Polg+/+)、Chk2敲除小鼠(Chk2-/-Polg+/+)、Polg敲除小鼠(Chk2+/+Polg-/-)、Chk2与Polg双基因敲除小鼠(Chk2-/-Polg-/-)四种基因型小鼠,取皮肤组织固定,石蜡包埋。绘制生存曲线统计分析Chk2敲除能否延长Polg敲除导致的寿命缩短。通过HE染色对比Polg敲除小鼠(Chk2+/+Polg-/-)、Chk2与Polg双基因敲除小鼠(Chk2-/-Polg-/-)的皮肤厚度与毛囊数量。对皮肤组织进行免疫组化实验分析毛囊细胞的Ki67和PCNA的阳性细胞比率,探究Chk2敲除能否改善Polg敲除导致的毛囊细胞增殖活性下降情况。通过TUNEL染色探究Polg敲除导致的皮肤毛囊细胞凋亡增多的情况能否通过Chk2敲除而有所改善。统计分析10月龄Chk2与Polg双基因敲除小鼠与Polg敲除小鼠心脏的高度和重量变化。
  结果:利用免疫组化技术,我们发现Polg敲除小鼠皮肤的Chk2磷酸化水平有所增高。统计学分析,Chk2的缺失可相对延长Polg缺失导致的小鼠寿命缩短。HE结果显示,同时敲除Chk2对Polg缺失导致的皮肤结构改变有部分的挽救作用。免疫组化结果显示,较Polg缺失小鼠的毛囊而言,Chk2敲除可改善Polg敲除导致的毛囊细胞增殖活性降低的情况。Chk2与Polg同时缺失的小鼠毛囊干细胞增殖活性高于Polg缺失的小鼠。TUNEL结果显示,与Polg缺失小鼠的毛囊相比,Chk2同时缺失时可减轻毛囊细胞的凋亡情况。Chk2同时缺失时可部分改善Polg小鼠心脏扩张的情况。
  结论:Chk2敲除可部分挽救由Polg敲除导致的器官早衰现象。
[硕士论文] 罗莹
细胞生物学 中国医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:DNA是生命个体重要的遗传物质,时刻受到体内外有害因素的威胁引起不同程度的DNA损伤,常见的DNA损伤类型包含碱基缺失、碱基对错配、DNA单链断裂(SSB)和DNA双链断裂(DSB)。生物个体在进化过程中为了应对DNA损伤形成了一套复杂而高效的DNA损伤修复(DNA Damage Response,DDR)机制[1],通过细胞周期阻滞,为修复损伤的DNA赢得充足的时间,保证了遗传信息的正确传递,进而维持基因组的稳定;而DNA损伤严重超出自身修复能力时,细胞将启动自噬、衰老等程序,甚至诱导细胞凋亡,从而限制基因组的不稳定[4]。在人类的多种疾病中已证实存在DDR缺陷,如神经退行性疾病、免疫缺陷、代谢综合征以及癌症等[2-4]。综上,DNA损伤和修复的复杂机制决定细胞的最终命运。
  细胞周期检验点激酶2(Cell cycle checkpoint kinase2,Chk2)是DNA损伤修复应答反应的关键分子,未发生DNA损伤时,Chk2以非活性的单体形式存在于细胞核中[5];细胞受到基因毒性作用发生DNA损伤时,Chk2被ATM、DNA-PKcs等激活,磷酸化Cdc25C、P53和BRCA1等关键的作用底物,进而调控细胞周期阻滞、DNA修复和细胞凋亡[6]等生物学事件。除了参与DNA损伤修复反应,Chk2在有丝分裂进程和染色体稳定性的维持中起着重要作用。
  SAMHD1(Sterile alpha motif and HD-domain containing protein1)最初发现于人树突状细胞的cDNA文库,包含SAM结构域和HD结构域。SAM结构域具有蛋白与蛋白或蛋白与核酸之间的相互作用,调节转录和参与信号转导等功能;HD结构域是由组氨酸和天冬氨酸组成,主要发挥磷酸水解酶的活性。SAMHD1作为哺乳动物体内的三磷酸水解酶(dNTPase),可以将细胞内的dNTP水解为核苷酸和三磷酸,该水解酶活性受其蛋白质磷酸化修饰水平的调控,SAMHD1蛋白磷酸化水平越高,其dNTP水解酶活性越低。以往研究显示,细胞周期蛋白(Cyclin A2)及细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK1)可以在苏氨酸(Thr)592位点磷酸化SAMHD1,从而降低其dNTP水解酶活性,引起细胞内dNTP含量升高,有利于病毒复制[7-9]。在巨噬细胞、树突状细胞及静息期的CD4+T细胞(G0/G1期)中,SAMHD1显著降低细胞内的dNTP水平,使人免疫缺陷病毒(HIV-1)的复制及感染受限,因而被看做是抗逆转录病毒的天然免疫蛋白[10,11]。研究发现,SAMHD1突变与人类自身免疫疾病AGS综合征(Aicardi-Goutieres syndrome)密切相关[12,13],在患者的成纤维细胞中已检测到dNTP水平增加与慢性DNA损伤[14],研究报道腺病毒、单纯疱疹病毒感染机体过程中伴随DNA损伤[15],揭示了病毒感染与宿主细胞DNA损伤和修复途径之间存在复杂的关系,提示我们SAMHD1可能参与DNA损伤修复反应。
  目前已报道SAMHD1作为一种新型的病毒抑制因子,能强有力的对抗HIV-1等逆转录病毒感染;关于SAMHD1限制HSV-1等DNA病毒感染的研究较少;在病毒感染与复制的不同阶段,SAMHD1调节宿主细胞内DNA损伤与修复反应的具体机制尚不清楚。因而,本研究旨在探讨天然免疫蛋白SAMHD1是否参与DNA损伤修复过程;解析SAMHD1参与调控DNA损伤修复反应的分子机制;阐明SAMHD1作为DNA损伤修复反应经典通路中Chk2的底物,其磷酸化修饰水平对维系基因组稳定性的影响。
  方法:1.利用Ⅰ型人疱疹病毒(HSV-1)感染人结直肠癌细胞(HCT116)实验,研究SAMHD1对DNA病毒感染的限制作用。2.培养人结直肠癌(HCT116)细胞和小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞,通过Western Blot技术检测应激条件下DNA损伤修复反应标志性蛋白表达及SAMHD1蛋白磷酸化水平变化。3.通过慢病毒包装建立稳定沉默SAMHD1的细胞株、过表达SAMHD1的细胞株,检测正常培养及应激条件下DNA损伤修复反应标志性蛋白的改变,观察SAMHD1表达水平对DNA损伤修复过程的影响。4.运用免疫共沉淀方法,检测正常培养及应激条件下Chk2与SAMHD1的结合情况和SAMHD1磷酸化水平的改变,进一步了解内源性Chk2与SAMHD1的相互作用。5.利用核浆分离实验和激光共聚焦技术检测SAMHD1细胞定位并观察SAMHD1与Chk2在细胞中分布情况。6.在沉默Chk2与过表达Chk2的人结直肠癌细胞、缺失Chk2与正常对照的乳腺癌细胞中,检测正常培养及应激刺激下DNA损伤修复反应标志性蛋白的改变。探究Chk2调控SAMHD1磷酸化水平对DNA损伤修复反应的影响。
  结果:1.在HSV-1感染过程中,SAMHD1发挥了抗病毒感染的功能。2.SAMHD1参与了细胞在应激条件下诱导的DNA损伤修复应答反应的发生,并且伴随SAMHD1磷酸化水平的升高。3.在DNA损伤刺激条件下,沉默SAMHD1抑制了细胞内dNTP水解功能,有利于DNA复制,促进了DNA损伤修复反应。4.Chk2在应激条件下与SAMHD1在细胞内结合,这种结合作用随刺激时间逐渐增强并伴随SAMHD1磷酸化水平增加。5.SAMHD1主要分布在细胞核内,并且在应激刺激下与Chk2共定位于细胞核。6.Chk2在DNA损伤刺激条件下通过调控SAMHD1的磷酸化水平促进了DNA损伤修复反应的发生。
  结论:本研究扩展了SAMHD1的抗病毒功能;首次提出天然免疫蛋白SAMHD1参与DNA损伤修复反应;揭示Chk2磷酸化修饰SAMHD1调控DNA损伤修复反应及对维系基因组的稳定性的影响。
[硕士论文] 葛英花
生物学 浙江理工大学 2016(学位年度)
摘要:TBC1D15(TBC domain family,member15)蛋白在物种间具有一个高度保守的TBC域(TBC domain),且影响其活性的关键精氨酸残基位点也高度保守。已有研究表明在小鼠及人中的TBC1D15与其他含有TBC domain的蛋白家族成员相似,都具有Rab-GAP活性,但鲨鱼中的TBC1D15研究较少,更未见对TBC1D15的Rab-GAP特异性的演变过程及关键氨基酸的改变对其Rab-GAP活性影响的相关研究。
  本研究选择了鲨鱼(Shark),猪(Sus),鼠(Mus),人(Homo)几种不同物种的TBC1D15基因进行原核表达及其重组产物纯化,结果发现TBC1D15全长蛋白表达量低,尤其是鲨鱼中的TBC1D15容易断裂,得不到稳定的全长蛋白。将这四种物种的TBC1D15蛋白序列截短,得到不同物种的GAP(GTPase activating protein)蛋白截短序列,即决定TBC1D15蛋白Rab-GAP活性的关键序列。利用序列比对软件对Shark,Sus,Mus,Homo的TBC1D15-GAP氨基酸序列进行比对,分析其序列保守性。结果发现有五个位点的精氨酸残基在物种Sus,Mus,Homo中均高度保守,但在Shark-TBC1D15-GAP中这五个位点分别由G28、K45、K119、K122、K221氨基酸残基替代。将Shark-TBC1D15-GAP中的五个不同氨基酸残基全部突变为精氨酸残基,并将其他物种GAP中的该位点的精氨酸残基全部突变为对应鲨鱼中的G28、K45、K119、K122、K221氨基酸残基,通过研究不同物种TBC1D15-GAP突变前后Rab-GAP特异性的规律变化,分析这些氨基酸位点与TBC1D15进化是否存在关联。
  对四种物种的TBC1D15全长及GAP氨基酸序列进行进化树分析发现,无论对于全长还是对GAP,物种Mus和Homo的亲缘关系较近,Shark与Sus以及Sus和Homo相互之间的亲缘关系较远。故选择相互间亲缘关系较远的Shark,Sus,Homo三个代表性物种的TBC1D15-GAP进行氨基酸突变及Rab-GAP特异性分析。
  将Shark/Sus/Homo-TBC1B15-GAP及其突变体基因构建至pETduet-his-sumo载体上并原核表达纯化。同时表达纯化不同的底物Rab(Rab4/5/7/11)蛋白并浓缩,分别与Shark/Sus/Homo-TBC1B15-GAP及其突变体蛋白反应。首先进行了动力学实验,比较不同GAP蛋白催化Rab4/5/7/11蛋白水解GTP的速率,分析不同物种TBC1D15-GAP的Rab-GAP活性差异。结果发现,不同物种的TBC1D15-GAP在特定氨基酸位点突变之后,Rab-GAP活性有一定的变化。Shark-TBC1D15-GAP在将五个氨基酸位点G28、K45、K119、K122、K221同时突变为精氨酸残基之后,与野生型Sus-TBC1D15-GA的Rab-GAP活性情况相似。且Homo-TBC1D15-GAP在将五个精氨酸同时突变为对应于Shark-TBC1D15-GAP中的氨基酸残基后也与野生型Sus-TBC1D15-GAP活性情况相似。以上结果初步表明这些特定氨基酸位点对TBC1D15的Rab-GAP活性具有一定的影响。
  进一步对六种GAP蛋白进行了Rab-GAP特异性分析,通过求水解过程中的kcat/Km,比较催化效率来判断所突变氨基酸位点对不同物种GAP蛋白的活性影响。结果发现,物种Sus和Homo的野生型GAP均对Rab11表现出最大的底物偏爱性,且对Rab11/5/4/7的催化效率依次由高到低,而Shark-TBC1D15-GAP野生型对Rab5具有较大的底物偏爱性,将氨基酸残基G28、K45、K119、K122、K221都突变为精氨酸残基后,也对Rab11有最大的底物偏爱性,与野生型Sus-TBC1D15-GAP,Homo-TBC1D15-GAP活性情况类似。进一步表明这些氨基酸残基可能与TBC1D15的物种进化有关。
  本课题通过对不同物种TBC1D15-GAP及其突变体蛋白进行Rab-GAP动力学分析及特异性分析,初步验证了TBC1D15保守域中的五个特定氨基酸残基可能是TBC1D15进化过程中的关键氨基酸残基。随着物种的不断进化,TBC1D15-GAP的底物专一性逐渐偏向Rab11,推测可能与物种进化中对环境适应能力不断提高有关。
[硕士论文] 郭鹏飞
数学 浙江理工大学 2016(学位年度)
摘要:癌症干细胞假说认为癌症干细胞是癌症异常增殖、侵袭、转移、耐药以及复发等的根源。本文基于这个假说,分析四种癌症的基因和miRNAs混合表达数据,挖掘与癌症干细胞相关的关键调控基因。
  首先本研究利用分类算法将746个乳腺癌样本中的18409个基因和1035个miRNAs划分到不同的共表达模块中;并与胚胎干细胞和间充质干细胞的相关数据库做富集度分析,得到两个大小分别为2019和859且与上述两类干细胞相关的基因集。另外对胶质母细胞瘤、低等级的脑胶质瘤和肺癌的混合表达数据重复上述过程,最终得到178个与胚胎干细胞相关的基因和7个与间充质干细胞相关的基因。
  其次通过比对这两个基因集在GSE29625和GSE28974数据中的表达方式,进一步验证了两个基因集与两类干细胞的相关性。另外发现由178个基因组成的与胚胎干细胞相关的基因集参与由转录因子E2F介导的转录过程。
  最后通过构建这两个基因集的调控网络,在乳腺癌中筛选出两个胚胎干细胞的特异性关键基因TPX2和MCM10,以及间充质干细胞的特异基因COL5A2。并通过查看178个与胚胎干细胞相关的重复基因在四种癌症调控网络中的顶点出度,筛选出两个关键调控基因BUB1B和NCAPH。这些基因可以作为治疗乳腺癌的潜在的标靶基因。
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