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[硕士论文] 辛成德
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种血液系统恶性疾病,其特征是骨髓中浆细胞恶性增生,分泌出大量的单克隆免疫球蛋白或其片段,导致患者出现血钙增高、肾功能损害、贫血、骨病等临床表现。MM好发于老年人,主要发病人群的年龄在50-70岁之间,发病率约为1/10万,占全部恶性肿瘤的1%,居血液系统恶性肿瘤的第二位。
  MM病因至今尚不明确,遗传、环境因素、化学物质等都可能与MM的发病有关。蛋白酶体抑制剂等靶向药物在临床上的广泛运用使MM患者的预后明显改善,但只有少数患者能够长期控制骨髓瘤,治疗药物耐药的产生在其中发挥着重要作用。因此,寻找一种能够在诊断、预后判断和整个疾病过程中表征疾病进程及药物敏感性的靶标显得十分必要。
  醛酮还原酶(Aldo-keto reductases,AKR)是一种NADP(H)依赖性的氧化还原酶,参与体内醛酮类化合物清除代谢。AKR1家族主要存在与哺乳动物中,有AKR1C1、AKR1C2、AKR1C3、AKR1C4四个亚型。目前发现,AKR1家族与恶性肿瘤密切相关,能在前列腺癌、乳腺癌中引起特异性的耐药,并通过作为E3-连接酶-泛醌系统中的共激活因子,调节细胞对药物的敏感性并能影响细胞凋亡及远处转移。近来,在GCBI等数据库中检索还发现,AKR1C1主要表达于乳腺癌、肺癌、结肠癌等实体肿瘤中,在非霍奇金淋巴瘤、B细胞性淋巴瘤等血液系统肿瘤中亦见报道。
  基于以上介绍,提出以下疑问:AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞株及MM患者外周血中是否也有异常表达?异常表达的AKR1C1与MM的诊断及预后有无关联呢?它们在MM的发病机制中又起着怎样的作用?为了解决这些问题,本课题运用大量数据统计分析、实时荧光定量PCR、基因转染、流式细胞学等技术进行了以下三部分的研究:1)AKR1C1及其他亚型在多发性骨髓瘤细胞株及患者中的表达情况;2)AKR1C1与多发性骨髓瘤患者临床及预后指标相关性;3)AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞中的生物学作用。
  第一部分:AKR1C1及其他亚型在多发性骨髓瘤细胞株及患者中的表达情况
  AKR1家族作为一种肿瘤相关基因,在实体肿瘤中存在异常表达已被证实。相关研究发现AKR1家族除与前列腺癌、乳腺癌密切相关外,在其他多种肿瘤如非小细胞肺癌、胆管癌、胃癌中表达水平明显异常,并有参与到治疗药物耐药机制的产生中,但AKR1家族在血液系统肿瘤特别是多发性骨髓瘤中表达情况尚未见报导。
  本部分实验主要目的是研究AKR1C1及其他亚型:AKR1C1-AKR1C4在各种多发性骨髓瘤细胞株及部分初诊MM患者外周血中的表达情况。首先,采用荧光定量PCR技术检测多发性骨髓瘤细胞株U266、H929、8226、KM3、LP-1等五个细胞株及正常骨髓CD138+浆细胞中AKR1C1-AKR1C4的表达情况,结果发现,各种多发性骨髓瘤细胞株中AKR1C1-AKR1C4表达水平不尽相同:AKR1C1在MM细胞株H929及U266细胞中的表达水平明显升高,AKR1C2在MM细胞株U266、H929、LP-1中表达水平均升高,AKR1C3在MM细胞株H929、LP-1中表达水平升高,AKR1C4在MM细胞株H929及U266中表达水平升高;而且AKR1C1-AKR1C4均在MM细胞株H929中的表达升高最为显著。接下来,进一步检测分析AKR1C1-AKR1C4在H929细胞中的表达水平,发现在H929细胞中,AKR1C1的表达水平要明显高于AKR1C2、AKR1C3及AKR1C4,且AKR1C4的表达水平最低。其次,为明确AKR1C1及其他亚型在初诊MM患者中的表达情况,收集了21例临床初发MM患者和20例健康对照者的外周血PBMC,利用实时荧光定量PCR技术检测其AKR1C1-AKR1C4的表达水平。结果发现,与健康对照者相比,AKR1C1-AKR1C4在初发MM患者外周血PBMC中的表达量不尽相同:AKR1C1的表达水平异常升高,而AKR1C2、AKR1C3、AKR1C4则在初发MM患者外周血PBMC中未见异常表达。
  上述结果说明,AKR1C1及其他亚型在不同多发性骨髓瘤细胞株中的表达存在明显差异,而且AKR1C1在MM细胞株H929及初发MM患者外周血PBMC中均异常高表达。
  第二部分:AKR1C1与多发性骨髓瘤患者临床及预后指标相关性
  多发性骨髓瘤仍然是一种几乎无法治愈的浆细胞恶性肿瘤,新兴药物如蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、抗CD38单克隆抗体等在临床上广泛运用,MM患者的预后明显改善,但仍只有少数患者能够长期控制骨髓瘤。药物的耐药性在其中发挥着重要作用。因此,寻找一种能够在诊断、预后判断和整个疾病过程中表征疾病进程及药物敏感性的分子显得十分必要。第一部分的实验结果表明,AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞株及初发MM患者PBMC中均显著高表达,但其与多发性骨髓瘤患者病情程度、预后及临床指标间的相关性还需要进一步的探讨。
  本部分实验主要目的是探讨AKR1C1作为多发性骨髓瘤的诊断、预后判断、疗效监测新指标的可能性。首先,分别检测了AKR1C1在不同疾病阶段的MM患者外周血PBMC中的表达水平,发现,与健康对照组相比,初发组、复发组与缓解组MM患者的外周血PBMC中AKR1C1的表达水平均显著升高;而且与缓解组相比,初发组、复发组MM患者的外周血AKR1C1的表达水平有明显升高;但初发组与复发组之间,外周血AKR1C1的表达水平则无明显差异。其次,再分析检测不同预后分期的MM患者中外周血PBMC中AKR1C1的表达水平,发现ISS-Ⅰ期、ISS-Ⅱ期MM患者分别与ISS-Ⅲ期MM患者相比,外周血中AKR1C1表达水平差异明显;而且与其余两组相比,ISS-Ⅲ期MM患者的外周血AKR1C1表达水平最高;但ISS-Ⅰ期与ISS-Ⅱ期之间,外周血AKR1C1的表达水平则无明显差异。最后,又把AKR1C1在MM患者外周血PBMC中的表达水平与MM诊断、分期及预后相关的各种临床参数,包括血κ轻链、κ/λ比值、β2微球蛋白、血清白蛋白、乳酸脱氢酶、血红蛋白、血肌酐、血钙等进行大量的统计学分析。结果发现,AKR1C1在MM患者的外周血表达水平与血清κ轻链的含量呈正相关性、并与κ/λ的比值也显著正相关;还与血清β2微球蛋白含量显著正相关,也与LDH的含量呈正相关性;但是,AKR1C1在MM患者的外周血表达水平与血清白蛋白、血红蛋白、肌酐、血钙均无明显相关性。因此,上述结果提示,AKR1C1在MM中的表达水平与MM疾病的严重程度以及疾病的预后密切相关。
  第三部分:AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞中的生物学作用
  在多发性骨髓瘤患者的临床药物治疗中,部分病人会出现Bcl-2家族蛋白调控失控导致凋亡途径异常,从而出现对治疗药物的耐药。如能让MM患者骨髓瘤细胞恢复正常的凋亡机制,将能够明显提高临床药物的治疗效果。此外,调控细胞自噬也是其多发性骨髓瘤治疗的研究方向之一。通过前两部分的研究,发现AKR1C1在多发性骨髓瘤MM患者外周血PBMC中显著高表达,且异常表达的AKR1C1与MM的病情程度、预后密切相关;但其在MM的发病机制间的相关性还需要进一步的探讨。
  因此,在本部分实验中,首先通过CCK-8方法检测骨髓瘤H929细胞转染siRNA-AKR1C1后对细胞增殖的影响,发现与对照组相比,H929细胞转染siRNA-AKR1C1后细胞增殖率均明显降低;两组的细胞增殖率在12-72h间的各时间点均相差明显;且随着时间的延长,两组间差异逐渐增大,在48h时两组间差异最为明显。其次,为明确AKR1C1对目前治疗MM的主流化疗药物:硼替佐米(Bortezomib,BTZ)的药物敏感性,先研究了转染siRNA-AKR1C1并联用BTZ后对H929细胞增殖的影响。结果发现,对照组与转染siRNA-AKR1C1组的H929细胞增殖均明显受抑制;且与对照组相比,siRNA-AKR1C1组的细胞增殖受抑更为明显;在硼替佐米浓度为20ng/ml时,siRNA-AKR1C1组与对照组间的差异最为明显。然后,又采用流式细胞术检测骨髓瘤H929细胞转染siRNA-AKR1C1后对细胞凋亡的影响;发现与对照组相比,转染siRNA-AKR1C1组的细胞凋亡率明显增加,而且,加入硼替佐米后,转染siRNA-AKR1C1组的细胞凋亡率更要显著高于对照组。接下来,还探讨了骨髓瘤H929细胞转染siRNA-AKR1C1后对凋亡相关分子:Bcl-2、Caspase-3、以及自噬相关分子:p62、LC3表达的影响,结果发现,与对照组相比,转染siRNA-AKR1C1组的Bcl-2的表达减少、Caspase-3的表达则明显增加,且p62的表达明显减少、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换则明显增加。上述结果说明,在骨髓瘤H929细胞中沉默AKR1C1的基因表达后,能够明显抑制细胞增殖、增加细胞凋亡以及H929细胞对硼替佐米的药物敏感性,也能下调Bcl-2的表达、上调Caspase-3的表达,还可以诱导细胞自噬。
[博士论文] 王扬
内科学(血液病学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究第一部分应用新型基因表达谱芯片筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人存在显著差异表达的lncRNA CUST37778。采用定量PCR技术在新的独立样本中验证前期的筛选结果。第二部分观察分析lncRNA CUST37778表达水平与急性B淋巴细胞白血病临床参数及预后的相关性。第三部分阐明了lncRNA CUST37778可增强急性B淋巴细胞白血病的增殖活性和浸润能力
  第一部分 急性B淋巴细胞白血病中差异表达的lncRNA的筛选
  目的:应用新型基因表达谱芯片筛选出在急性B淋巴细胞白血病中存在显著差异表达的lncRNA。
  方法:应用新型基因表达谱芯片检测lncRNA,筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人表达存在显著差异的lncRNA。采用定量PCR技术在新的独立样本中验证前期的筛选结果。利用核质分离实验确定lncRNA CUST37778的亚细胞分布。
  结果:1.采用新型表达谱芯片检测了6对初发急性B淋巴细胞白血病患者单个核细胞和正常人单个核细胞,获得lncRNAs差异表达谱,发现lncRNA CUST37778在初发或复发急性B淋巴细胞白血病中的表达水平明显高于急性B淋巴细胞缓解组与正常对照组。
  2.扩大临床样本量,利用定量PCR对差异表达的lncRNA CUST37778进行验证,27例初发及复发急性B淋巴细胞白血病骨髓单个核样本,32例急性B淋巴细胞白血病完全缓解骨髓单个核样本及48例健康人骨髓单个核样本,检测发现lncRNA CUST37778在初发及复发样本中的表达显著高于完全缓解组及对照组。
  3.lncRNA CUST37778同时存在于急性B淋巴细胞白血病细胞的胞质和胞核,胞核中含量约占总量的60%。
  结论:应用新型基因表达谱芯片筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人显著高表达的lncRNA CUST37778,且lncRNA CUST37778同时存在于细胞胞质和胞核。
  第二部分 lncRNA CUST37778表达水平与初发及复发ALL患者临床参数相关性分析
  目的:观察分析lncRNA CUST37778表达水平与急性B淋巴细胞白血病临床参数及预后的相关性
  方法:收集自2015年8月至2016年10月在我院血液科诊疗的27例初发及复发急性B淋巴细胞白血病患者的临床资料,观察指标为基本临床特征及诊断信息即性别、年龄、初诊外周血白细胞计数、初诊骨髓原始细胞比例(%)、细胞遗传学及分子生物学异常、预后分层评估、首次诱导治疗后是否达完全缓解(CR1)、生存情况(包括复发或死亡)。利用ROC曲线分析界定lncRNA CUST37778的表达量界值,将27例初发及复发B-ALL患者分为高、低表达两组,统计分析在lncRNA CUST37778高、低表达组中所收集的B-ALL患者的临床参数是否存在统计学差异。两组间比较采用卡方检验,生存资料分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比较采用log-rank检验,生存分析采用COX比例风险模型进行单因素和多因素分析,所有多变量回归分析均列出OR或HR以及95%的置信区间用于风险评估。
  结果:1.利用ROC曲线分析界定27例初发及复发B-ALL患者中lncRNA CUST37778的表达量界值为0.2135,将27例初发及复发B-ALL患者分为高表达、低表达两组。外周血血小板计数<100×109(p=0.0370*)、骨髓原始细胞比例≥42%(p=0.0130*)在lncRNA CUST37778高表达组中的发生率显著高于lncRNA CUST37778低表达组中。而高表达组和低表达组在性别(p=0.125)、年龄(p=0.8947)、外周血白细胞计数(p=0.2059)、外周血血红蛋白水平(p=0.8857)、是否Ph染色体阳性(p=0.3261)、危险分层(p=0.4113)方面均无显著统计学差异。
  2.27例B-ALL患者接受一个疗程诱导化疗后,共14例达缓解,首次诱导缓解率为51.85%,lncRNA CUST37778高表达组与低表达组在首次诱导完全缓解率上未发现存在统计学差异(P=0.7448)。
  3.1ncRNA CUST37778高表达患者存在较差的预后趋势,与低表达组相比OS(p=0.0436)和DFS(p=0.0471)存在显著统计学差异。
  结论:利用ROC曲线分析界定27例初发及复发B-ALL患者中lncRNA CUST37778的表达量界值为0.2135,在lncRNA CUST37778高表达组中的患者更易出现较低的外周血血小板水平和较高的骨髓原始细胞比例。lncRNA CUST37778的表达水平对患者对化疗敏感性并无明显影响。lncRNA CUST37778高表达患者存在较差的预后趋势。
  第三部分 lncRNA CUST37778增强急性B淋巴细胞白血病的增殖活性和浸润能力
  目的:明确lncRNA CUST37778在B-ALL发生发展中的作用机制。
  方法:利用Real-time PCR方法检测B-ALL和Nalm-6细胞中lncRNA CUST37778的表达水平。筛选出干扰效率最佳的siRNA,应用其对于lncRNA CUST37778在B-ALL和Nalm-6细胞中的表达水平进行干扰,Real-time PCR鉴定干扰效率;干扰B-ALL和Nalm-6细胞后,CCK-8检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,Q-PCR和Western blot检测细胞凋亡与细胞增殖关键因子Bcl-2、Bax、PCNA、P21、P27的表达水平;Western blot检测MAPK通路关键因子ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、P38、p-P38的表达和PI3K-AKT信号通路关键分子AKT、p-AKT、NF-kB、p-NF-kB、STAT3、p-STAT3、β-catenin和Notch1的表达。构建过表达lncRNA CUST37778的稳转Nalm-6细胞,Real-time PCR验证过表达效率,对上述干扰实验所得结果应用受影响的关键分子的相应抑制剂进行进一步验证。
  结果:1.利用Real-time PCR方法确认lncRNA CUST37778在BALL-1细胞、Nalm-6细胞中高表达,与非B-ALL细胞系K562细胞、Molt4细胞存在显著统计学差异。
  2.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可促进B-ALL肿瘤细胞凋亡,抑制B-ALL肿瘤细胞增殖,使得G1期延长、G2期缩短。
  3.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可促进促凋亡因子Bax、P21和P27的表达,抑制癌基因Bcl-2和核蛋白PCNA的表达,从而促进B-ALL肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖。
  4.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可显著抑制MAPK通路关键因子ERK1/2磷酸化水平,故选择ERK1/2抑制剂PD98059进行进一步挽救实验。
  5.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可显著抑制PI3K-AKT信号通路p-AKT和p-NF-kB的表达,故选择AKT抑制剂LY294002进行进一步挽救实验。
  6.过表达lncRNA CUST37778可促进细胞增殖和缩短G1期,抑制细胞凋亡,ERK1/2抑制剂PD98059和AKT抑制剂LY294002可以阻断lncRNA过表达的作用。
  7.过表达lncRNA CUST37778可促进p-ERK1/2激活,ERK1/2抑制剂PD98059可以阻断此作用;还可促进p-AKT激活,AKT抑制剂LY294002可以阻断此作用。
  8.过表达lncRNA CUST37778可促进裸鼠皮下肿瘤生长,干扰其则可抑制皮下肿瘤生长。
  9.lncRNA CUST37778过表达接种组和Nalm-6空载接种组的裸鼠肝脏存在Nalm-6细胞来源的白血病浸润灶。
  结论:lncRNA CUST37778在BALL-1细胞、Nalm-6细胞中高表达,干扰lncRNA CUST37778的表达水平可抑制B-ALL细胞增殖活性,促进细胞凋亡,使G1期延长、G2期缩短,促进促凋亡因子Bax、P21和P27的表达,抑制癌基因Bcl-2和核蛋白PCNA表达,并可显著抑制PI3K-AKT信号通路中p-AKT和p-NF-kB的表达水平、抑制MAPK信号通路中p-ERK1/2的表达水平。过表达lncRNA CUST37778促进细胞增殖和缩短G1期,抑制细胞凋亡,促进Bcl-2和PCNA表达,并促进p-ERK1/2和p-AKT激活,ERK1/2抑制剂PD98059和AKT抑制剂LY294002可以阻断lncRNA过表达的作用。体内实验证实lncRNA CUST37778可促进裸鼠皮下肿瘤生长及浸润能力。
[硕士论文] 刘斌
内科学(血液内科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是临床最常见的一种非霍奇金淋巴瘤,其发病与多种病原学及生物化学等因素相关,其具有发展迅速、侵袭性较高的特点。EBV(Epstein-Barr virus,EBV)是一种双链DNA病毒,已经有研究证实,EBV与许多肿瘤发病相关。而近年来EBV在DLBCL发病中的作用得到了越来越多的关注。在2016年NCCN非霍奇金淋巴瘤指南中,已将EBV+DLBCL单独列为弥漫大B细胞淋巴瘤中的一种亚型。针对EBV+DLBCL的相关临床调查报道提示,EBV感染和DLBCL起病具有一定相关性,而且这种亚型的DLBCL对于常规一线治疗疗效不佳,预后相对较差。而目前还鲜有针对EBV+DLBCL发病的机制性的研究报道。本文通过回顾性研究,统计EBV+DLBCL患者的临床信息,从而分析得出EBV+DLBCL独特的临床特征。并分析其相关基因及蛋白表达水平的变化,试图找出EBV+DLBCL的发病机制,为后续探寻更有效的治疗方法打下基础。本研究共分2部分,第一部分收集初发DLBCL患者的病理标本,检测EBV在DLBCL中的表达情况。结合临床资料,分析EBV的表达情况对DLBCL预后的影响。第二部分对结合EBER表达情况,对DLBCL标本进行基因突变分析及P53蛋白测定,分析EBV+DLBCL可能的致病机制。
  第一部分 弥漫大B细胞淋巴瘤中EBV表达情况及相关生存预后分析
  目的:明确DLBCL患者中EBV的表达情况,分析得出EBV+DLBCL生存预后情况。
  方法:收集本中心346例初发DLBCL患者的肿瘤病理标本,采用EBER原位杂交方法检测EBV表达情况。结合临床及病理资料,分析EBV和部分关键临床因素的相关性及EBV对DLBCL预后的影响。
  结果:在346例DLBCL患者中,EBV表达阳性共36例(10.4%)。相关性分析提示EBV阳性表达和患者性别、年龄、Hans分型、“双表达”、ECOG体力评分、Ann Arbor分期、IPI、B症状、LDH、β2微球蛋白、骨髓侵犯均无明显相关性。生存分析提示,EBV是DLBCL患者预后不良的一项独立危险因素。
  结论:EBV在DLBCL中的阳性表达率为10.4%,EBV是影响DLBCL患者预后的一项独立危险因素。
  第二部分 EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤中P53蛋白表达情况分析及TP53基因突变分析
  目的:检测EBV阳性DLBCL肿瘤标本中P53蛋白表达及TP53基因突变,了解EBV阳性DLBCL发病可能的分子学机制。
  方法:选取36例EBV+DLBCL及36例EBV-DLBCL标本,采用免疫组化的方法检测肿瘤组织内P53蛋白表达,了解P53蛋白在EBV+DLBCL中的表达情况;采用Sanger基因测序法,明确TP53基因在EBV+DLBCL中的突变情况。分析EBV在DLBCL疾病中对P53表达的影响,探寻发病可能的分子机制,为进一步精准治疗提供依据。
  结果:1.P53蛋白表达情况:72例患者中P53蛋白阳性表达为24例(33.3%)。其中,EBV阳性组为16例(44.4%),EBV阴性组8例(22.2%)。EBV阳性组P53蛋白阳性率明显高于EBV阴性组(44.4 vs.22.2%,P=0.046)。2.TP53基因突变情况:选取经免疫组化提示P53蛋白阳性的24例DLBCL患者肿瘤标本,在16例EBV+DLBCL患者中,发生TP53基因突变的共3例(18.8%)。
  结论: P53蛋白表达方面,EBV+DLBCL中P53阳性率为44.4%。而在P53蛋白表达阳性的16例EBV+DLBCL中,TP53基因的突变率仅为18.8%。根据P53蛋白在EBV+DLBCL中的高表达可以推断P53通路的异常激活是导致EBV+DLBCL发病的原因之一。而TP53突变率较低,证实EBV+DLBCL中P53通路的异常可能与TP53并无明显相关性,可能是由其它因素导致。而EBV+DLBCL组中P53的阳性率明显高于EBV-DLBCL组,因此可以推测,EBV感染很可能和P53表达密切相关。由EBV引起的P53通路异常可能是EBV阳性DLBCL一项重要发病机制。
[硕士论文] 傅郁华
内科学(血液病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景与目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系统发病率第二的恶性肿瘤,约占所有血液系统恶性肿瘤的10%,其疾病本质为骨髓中浆细胞恶性增生产生大量单克隆免疫球蛋白或其片段(M蛋白),并导致相关器官或组织损伤,至今仍无有效方法治愈。在传统化疗方案治疗下,MM患者中位生存期不足3年。近年来,随着以硼替佐米为代表的各种新药以及自体造血干细胞移植(autologous stem cell transplantation,ASCT)的应用,MM患者的总生存期及生存质量得到了明显的改善,中位总生存期延长至5-7年。由于患者在疾病发展及预后方面存在明显的异质性,生存期从数月至十余年不等,因此进行准确的预后分层并行合适的个体化治疗是MM患者获得成功诊治的关键。2015年国际骨髓瘤工作组(International Myeloma Working Group,IMWG)在国际分期系统(International Staging System,ISS)的基础上制定了纳入遗传学高危因素以及乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)水平的修订版国际分期系幺充(Revised International Staging System,RISS),以期能更好的实现MM患者的预后分层。本研究对我院初发的259例MM患者进行临床特征及疗效、预后分析,目的在于分析RISS分期系统对MM患者预后及治疗的影响,并与传统Durie-Salmon(DS)分期系统及ISS分期系统进行相关预后分析比较,同时分析硼替佐米的应用对各分期系统预后的影响,旨在更好的认识多发性骨髓瘤的临床特征,同时验证RISS分期系统在预后分层及指导治疗意义上优于传统分期,值得在临床MM诊治过程中推广使用。
  资料与方法:回顾性分析259例我院收治MM患者的病例资料,分别用年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、血清白蛋白、血清球蛋白、β2-微球蛋白、乳酸脱氢酶、血肌酐、血清钙、尿酸、FISH检测结果(1q21基因、RB1基因、P53基因、D13S319基因)、免疫表型(CD56、CD20、CD19)、新药硼替佐米的应用、自体造血干细胞移植的应用、硼替佐米的注射方式、缓解深度、分期等影响因素对MM患者无进展生存期(progression free survival,PFS)及总生存期(overall survival,OS)进行单因素及多因素分析,并分析各影响因素对硼替佐米疗效的影响;分别用DS分期系统、ISS分期系统及RISS分期系统对MM患者进行生存及预后分析,同时分析新药硼替佐米的应用对DS分期、ISS分期、RISS分期预后的影响。
  结果:1.259例MM患者的收治年份以2010-2016年间为主,占84.1%;中位发病年龄58(34-87)岁,其中男性患者147例,女性患者112例,男女比例为1.31∶1,发病年龄以41-70岁区间为主,占86.1%;免疫分型以IgG型为主,占59.1%;中位随访45(4-188)个月,失访率为15.1%,总体MM患者中位PFS45个月,中位OS67个月;初诊实验室指标显示:大部分MM患者起病时伴有贫血、低蛋白血症、球蛋白及β2-微球蛋白水平升高;FISH检测提示有87.4%的MM患者检出异常,其中1q21基因扩增检出率为56.9%(58/102),RB1基因缺失检出率为44.1%(45/102),P53基因缺失检出率为17.5%(18/103),D13S319基因缺失检出率为42.7%(44/103),IGH基因重排检出率为38.8%(40/103)。2.单因素分析显示,性别(P=0.006)、32-微球蛋白(P=0.005)、尿酸(P=0.021)、是否行自体造血干细胞移植(P=0.025)、ISS分期(P=0.033)、RISS分期(P=0.022)与MM患者PFS显著相关,多因素分析显示性别(P=0.023)是影响MM患者PFS的独立预后因素;而年龄(P=0.038)、β2-微球蛋白(P=0.01)、ISS分期(P=0.028)、RISS分期(P=0.001)、缓解深度(P=0.001)与MM患者OS显著相关,多因素分析显示缓解深度(P=0.021)是影响MM患者OS的独立预后因素。3.259例患者中可行DS分期MM患者239例,DS分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分别占4.2%、16.7%、79.1%,分期以DS分期Ⅲ期为主;中位PFS分别为68、41、44个月(P=0.496),中位OS分别为99、64、67个月(P=0.478),5年PFS率分别为60%、38.1%、31.3%(P=0.208),5年OS率分别为60%、60.9%、53%(P=0.533)。可行ISS分期MM患者236例,ISS分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分别占17.4%、41.1%、41.5%;中位PFS分别为53、48、38个月(P=0.033),中位OS分别为68、92、57个月(P=0.028),5年PFS率分别为36.8%、40%、25.6%(P=0.291),5年OS率分别为60%、63.9%、42.1%(P=0.119)。可行RISS分期MM患者173例,RISS分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分别占9.2%、81.6%、9.2%,以RISS分期Ⅱ期为主;中位PFS分别为68、47、16个月(P=0.022),中位OS分别为随访未达到、72、25个月(P=0.001),5年PFS率分别为55.6%、34.7%、11.1%(P=0.049),5年OS率分别为80%、59.2%、22.2%(P=0.012)。ISS分期Ⅲ期MM患者共98例,可进行RISS分期者52例,分期为ISS分期Ⅲ期、RISS分期Ⅲ期MM患者16例,分期为ISS分期Ⅲ期、RISS分期Ⅱ期MM患者36例,两组中位PFS分别为16个月与41个月(P=0.091),中位OS分别为25个月与64个月(P=0.042)。4.硼替佐米疗效分析显示,新药硼替佐米组疗效显著高于传统化疗组(P<0.0001),BADT化疗方案组CR率、ORR优于BAD与BDT组,且明显优于BD组(P=0.001);其中血红蛋白值(P=0.022)、血小板计数(P=0.007)与P53基因(P=0.002)显著影响硼替佐米疗效。5.RISS分期Ⅲ期患者预后差,应用新药硼替佐米可获益,新药组与传统化疗组中位OS分别为30个月与14个月(P=0.014)。
  结论:1.MM好发于中老年人,男性发病率略高于女性,免疫分型以IgG型为主,起病时多伴有贫血、低蛋白血症、球蛋白和β2-微球蛋白水平升高以及染色体异常;2.性别和缓解深度分别是影响MM患者PFS和OS的独立预后因素;3.RISS分期系统在预后分层意义上优于传统DS分期系统和ISS分期系统,且可进一步筛选出ISS分期Ⅲ期患者中高危MM患者;4.硼替佐米可使MM患者疗效显著提高,血红蛋白值、血小板计数与P53基因可影响硼替佐米疗效;5.RISS分期Ⅲ期患者预后差,中位总生存期为25个月,新药硼替佐米可改善其不良预后。
[博士论文] 李鑫雨
内科学(血液病) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:套细胞淋巴瘤(MCL)来源于淋巴结滤泡外套B细胞异常增殖,以染色体t(11;14)(q13; q32)易位导致细胞周期蛋白cyclin D1的过表达为特征,多见于老年男性,发展迅速,属侵袭性淋巴瘤,传统化疗后复发率高,预后不佳,中位生存期仅为3-5年;因此积极探索疾病发病机制,寻找特异性肿瘤标志物和有效靶向治疗成为最具潜力的突破方向。
  Krüppel样因子(Krüppel-like factor, KLF)是一类在人类组织中广泛表达的含锌指结构的转录因子。KLF家族蛋白在许多不同的生理活动如细胞增殖、生长、分化和正常组织稳态的维持中发挥重要作用。KLF4基因包含3个结构域:DNA结合结构域、转录调节结构域和核定位序列。其中高度保守的DNA结合结构域位于羧基端,一般用来调节DNA结合的特异性;转录调节结构域位于氨基端,发挥转录激活或抑制作用。KLF4在不同的肿瘤组织中可以通过与不同的靶基因作用,发挥促癌或者抑癌两种完全相反的功能。KLF4在乳腺导管癌和口腔鳞癌中表达上调,被认为是癌基因;而在胃肠道肿瘤如食管鳞癌、胃癌、结肠直肠癌,肺癌、膀胱癌、前列腺癌中表达减低发挥抑癌作用。在血液病研究中发现,KLF4在弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤和cHL中发挥抑癌基因的作用且常发生因基因启动子甲基化导致的沉默。而KLF4在MCL中的表达水平及作用尚未有明确报道。
  Wnt信号通路在B细胞的正常分化增殖中高度保守且具有重要意义,近期研究表明Wnt/β-catenin通路在MCL中都处于异常活化状态,并与肿瘤的发生进展密切相关。正常状态下,β-catenin由GSK-3β等组成的复合物磷酸化降解并在细胞中保持低水平表达。细胞受到异常刺激时,GSK-3β组成的复合物活性受抑制,大量非磷酸化β-catenin在细胞质中积聚并转入细胞核中,β-catenin在细胞核中与TCF形成复合体使得下游如c-myc,cyclin D1,MMP7等与细胞增殖、侵袭相关基因异常激活,从而参与促进肿瘤的发生发展。有文献报道KLF4在胃肠道肿瘤中可通过抑制Wnt/β-catenin通路发挥抗肿瘤作用;在多能干细胞研究中KLF4与β-catenin协同诱导端粒酶催化亚单位的表达,从而参与细胞生长的调控。
  砷剂早在古希腊和古代中国时期就被当做药物和毒药使用。三氧化二砷(ATO)联合口服维甲酸(ATRA)已经成为初治非高危型APL的标准治疗方案。ATO也开始在其他恶性血液病领域有进一步的研究观察。然而,在MCL中ATO的相关研究报道甚少。
  DNA甲基化是目前肿瘤研究中的热点之一,大量研究表明肿瘤发生发展中存在抑癌基因甲基化水平和模式的调控紊乱。由于DNA甲基化为可逆性调控,因此可以作为肿瘤靶向治疗的重要研究调控方向。在胃肠道肿瘤及部分淋巴瘤中均有发现KLF4启动子区域因甲基化而导致的基因沉默,提示KLF4启动子甲基化可能与肿瘤发生进展密切相关。
  本研究应用细胞生物学、分子生物学、免疫学及慢病毒转染介导基因过表达等技术,探讨了KLF4与ATO通过调控Wnt信号通路在MCL疾病发生发展中的调控作用及机制,为寻求新的分子标志物和靶向治疗提供分子生物学依据。
  第一部分:KLF4在套细胞淋巴瘤中调控机制研究
  目的:
  KLF4为锌指蛋白类核转录因子,是多能干细胞(iPS)的诱导因子之一,可在不同肿瘤中与不同的靶基因相互作用发挥抑癌或促癌作用。KLF4随B细胞成熟度增高而表达升高,在多种血液肿瘤中发现表达减低、缺失。有研究表明KLF4在血液恶性疾病中的作用仍存在争议。套细胞淋巴瘤来源于淋巴结滤泡外套B细胞异常增殖,发展迅速,属侵袭性淋巴瘤,预后不佳,因此积极探索疾病发病机制,寻找肿瘤标志物和有效靶向治疗成为最具潜力的突破方向。本研究旨在探讨KLF4在套细胞淋巴瘤中表达及其影响因素,及对Wnt信号通路的调控和机制。
  方法:
  1.细胞培养和切片组织标本收集;
  2.RNA提取、逆转录和实时定量PCR;
  3.免疫组织化学染色;
  4.蛋白提取和western blot分析;
  5.慢病毒载体转染介导MCL细胞株KLF4过表达;
  6.流式细胞仪检测细胞凋亡,CCK8法检测细胞增殖;;
  7.免疫沉淀(IP)法检测KLF4与β-catenin结合情况;
  8.统计学分析。
  结果:
  1.通过实时定量PCR、western blot结果分析,与健康志愿者相比较,套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1,Mino,SP53)中KLF4 mRNA、蛋白表达均明显减低。免疫组化分析显示套细胞淋巴瘤患者淋巴瘤组织石蜡标本中KLF4表达水平均减低,且其表达水平与套细胞淋巴瘤患者分期密切相关(P<0.05)。
  2.通过western blot结果分析,套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1,Mino,SP53中β-catenin、c-myc、cyclin D1的蛋白表达与健康志愿者相比明显升高。免疫组化结果分析套细胞淋巴瘤患者淋巴瘤组织标本中KLF4表达水平与β-catenin表达水平相关(P<0.05)。
  3.流式细胞仪检测分析显示,慢病毒介导过表达KLF4的Jeko-1细胞凋亡增加,CCK8法检测KLF4过表达Jeko-1细胞增殖受抑制,上述细胞株中β-catenin、c-myc表达下调,IP结果表明KLF4与β-catenin发生了蛋白结合。
  4.通过western blot、免疫组化结果分析,套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1,Mino,SP53)以及套细胞淋巴瘤患者淋巴瘤组织石蜡标本中DNMT-1表达水平与正常对照标本相比均增高。去甲基化药物5-azaC处理Jeko-1,Mino细胞后,去甲基化转移酶-1(DNMT-1)表达受抑制,而KLF4表达水平升高,Wnt/β-catenin通路分子表达受抑制。
  结论:
  本研究表明KLF4在套细胞淋巴瘤中的表达水平与患者疾病分期密切相关,KLF4过表达可抑制β-catenin及其下游分子cyclinD1,c-myc的表达,通过免疫沉淀的研究证明KLF4表达增高后与β-catenin结合,使其不能进一步激活下游通路,是其发挥抑癌作用的机制之一。DNMT-1在套细胞淋巴瘤组织及细胞株内高表达,去甲基化药物可促使KLF4恢复表达,且抑制Wnt通路相关分子,说明KLF4基因在套细胞淋巴瘤中可能因基因甲基化沉默。KLF4的表达水平、原因分析及作用机制研究对探索套细胞淋巴瘤的致病机制有重要意义。
  第二部分:亚砷酸在套细胞淋巴瘤中通过调控Wnt/β-catenin通路和DNMT-1发挥抗肿瘤作用的机制研究
  目的:
  亚砷酸(ATO)已成为治疗急性早幼粒白血病标准方案药物之一,并在其它恶性血液病领域也有进一步的探讨研究。套细胞淋巴瘤是淋巴结滤泡外套B细胞异常增殖起源的非霍奇金淋巴瘤,病情进展迅速,属侵袭性淋巴瘤,预后不佳,因此积极探索疾病发病机制,寻找有效的抗肿瘤药物成为重点研究方向。本研究旨在评估ATO在套细胞淋巴瘤中的抗肿瘤作用及并进一步研究ATO相关作用的分子生物学机制。
  方法:
  1.细胞培养和切片组织标本收集;
  2.免疫组织化学染色;
  3.蛋白提取和western blot分析;
  4.RNA提取、逆转录和实时定量PCR;
  5.ATO、5-azaC、LiCl按照所需药物浓度处理培养细胞;
  6.流式细胞仪检测细胞凋亡;
  7.统计学分析。
  结果:
  1.CCK8检测及流式分析结果显示ATO对套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1,Mino有显著的抑制增殖和促进凋亡作用,效果随药物浓度升高更显著。
  2.通过western blot、免疫组化结果分析,套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1,Mino,SP53、Grant519)中β-catenin、c-myc、DNMT-1的蛋白表达与健康志愿者相比较均明显上调(P<0.05)。生存分析显示DNMT-1阳性表达的套细胞淋巴瘤患者在39个月前的生存率明显低于阴性患者。
  3.不同浓度ATO处理套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1,Mino,SP53)后,western blot及实时定量PCR分析显示ATO可抑制细胞中DNMT-1和Wnt通路中β-catenin、及下游分子c-myc、cyclin D1、MMP7的表达,且抑制作用有剂量依赖性。
  4.Western blot结果分析显示ATO可以抑制由套细胞淋巴瘤细胞株细胞中LiCl刺激引起的β-catenin升高,并与5-azaC对DNMT-1的抑制有协同作用。
  结论:
  本研究表明ATO在套细胞淋巴瘤中发挥肿瘤抑制作用,对DNMT-1、Wnt/β-catenin通路有抑制剂量依赖性的抑制作用。ATO可拮抗LiCl对Wnt/β-catenin通路的激活作用,并可协同去甲基化药物5-azaC抑制DNMT-1的表达。以上结果表明ATO在套细胞淋巴瘤中治疗研究中有潜在研究意义及治疗前景。
[硕士论文] 赵新颖
内科学(血液学) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一种异质性肿瘤,是国内最常见的恶性淋巴瘤类型。美罗华联合CHOP的化疗方案显著地提高了患者生存,但仍有30-40%的DLBCL病人会发生难治或复发。导致DLBCL病人难治或复发的原因包括:年龄大于60岁、肿瘤分期为Ⅲ期和Ⅳ期、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase level,LDH)升高、巨块、不良分子标记等。而近年来越来越多关于影响患者预后和指导治疗的分子标记物的临床调查研究表明乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染与DLBCL的发生、化疗疗效和预后明显相关,然而HBV感染影响患者预后的具体机制研究甚少。
  研究目的:
  探究HBV感染对DLBCL患者预后的影响及分子机制,阐明HBV的功能片段HBX对DLBCL细胞的化疗药物敏感性的影响,寻找可能改善合并HBV感染的DLBCL患者预后的分子作用靶点。
  研究方法:
  (1)临床资料统计:本研究收集上海长海医院2004年1月至2014年7月合并HBV感染和无HBV感染的DLBCL患者临床病例资料,运用卡方检验、非参数检验比较两组患者临床资料特征,运用Kaplan-Meier法和Log-Rank检验分析和比较不同组患者的总生存(overall survival,OS)、无进展生存(progression free survival,PFS)情况。
  (2)实验方法:构建慢病毒载体(HBX过表达载体、CHK2干扰载体、CHK2(WT)过表达载体和CHK2(T68A)过表达载体)感染细胞,对细胞的相应基因进行过表达或者干扰;运用细胞计数方法检测细胞的增殖水平,Propidium iodide(PI)染色流式检测细胞周期分布,Annexin-Ⅴ/PI双染法流式检测细胞凋亡比例;荧光定量PCR和蛋白质印迹分别检测细胞样品中相关基因mRNA和蛋白水平变化;皮下成瘤实验构建NOD-SCID免疫缺陷鼠移植瘤模型,观察HBX在体内对肿瘤耐药的影响,免疫组化检测患者标本和动物肿瘤组织样本中的蛋白水平。
  研究结果:
  (1)合并HBV感染较无HBV感染的DLBCL患者总生存期和无进展生存期短、化疗效果差,尤其是生发中心(germinal center B-cell-like,GCB)型,且HBV感染引起的肝功能损害对患者生存无明显影响,HBV感染可作为影响DLBCL患者OS的重要预后因素。
  (2)DLBCL细胞系(SUDHL-4和DB)中过表达HBV的一个重要的功能片段HBX显示HBX对DLBCL细胞的增殖、周期、凋亡无明显影响;进一步研究显示过表达HBX减弱了S期阻滞药物甲氨喋呤(methotrexate,MTX)及阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)对DLBCL细胞的增殖抑制作用,但对表柔比星(epirubicin,EPI)和长春地辛(vindesine,VDS)的细胞增殖抑制无明显减弱作用。细胞周期分析同样显示过表达HBX减弱了MTX和Ara-C对DLBCL细胞的S期阻滞作用,提示HBX能特异性减弱S期阻滞的化疗药物对淋巴瘤细胞的增殖抑制作用。
  (3)DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)信号通路与肿瘤耐药相关,通过检测DDR中两条关键信号通路ATM/CHK2和ATR/CHK1,发现HBX过表达能够明显减弱化疗药物作用下CHK2的磷酸化水平,但对P-CHK1无明显影响。我们的结果还显示与P-CHK2的趋势一致,HBX过表达抑制了MTX作用中P-CHK2的下游基因P21和P53的表达,提示HBX能特异性抑制CHK2信号通路。
  (4)为进一步探究CHK2在DLBCL耐药中的作用,用shRNA干扰SUDHL-4细胞系中CHK2的表达水平发现降低CHK2的表达同样能够显著减弱MTX对淋巴瘤细胞的增殖抑制作用和S期阻滞作用,与过表达HBX的作用一致。同时在HBX过表达的DLBCL细胞中过表达野生型CHK2能挽回HBX引起的化疗耐药,而过表达非磷酸化的CHK2突变体则不能挽回HBX引起的化疗耐药,表明HBX通过抑制CHK2的磷酸化增强对S期阻滞药物的耐药作用。
  (5)通过皮下成瘤建立NOD-SCID鼠移植瘤模型,体内实验也同样发现HBX过表达对DLBCL肿瘤的体积和重量无明显影响,但能够减弱MTX的肿瘤抑制作用。免疫组化结果同样表明HBX能够特异性抑制MTX作用下的P-CHK2的水平,但对ATM、CHK2、P-CHK1和CHK1的水平无明显作用。
  研究结论:
  HBV感染与DLBCL患者化疗耐药和预后差有关,是其独立的预后因素。HBV病毒的功能片段HBX通过特异性抑制DNA损伤应答分子CHK2的磷酸化,从而降低DLBCL细胞对于S期阻滞药物的敏感性,这可能是HBV感染导致DLBCL患者化疗疗效和预后差的分子机制之一。因此CHK2抑制剂不能改善DLBCL患者的耐药。
[硕士论文] 岳文勤
内科学(血液病) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是骨髓造血干/祖细胞不同成熟阶段分化受阻,进而阻碍正常造血的一种高度异质性血液肿瘤。其标准诱导化疗方案已经近50年未曾改变过,目前仍是一种预后较差的急性白血病类型,5年生存率仅20%左右,多数AML患者化疗耐药或最终复发。大量研究发现CD123广泛高表达在AML干/祖细胞(leukaemia stem cells,LSCs)表面,而低表达或不表达在正常造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs)中,且已证实CD123高表达与AML不良预后有关,因此,CD123已成为AML嵌合抗原受体(chimericantigen receptors,CARs)T细胞免疫治疗新的理想靶点。
  本研究第一部分我们回顾性分析了CD123在初诊AML(非APL)患者中的表达分布及与生存预后的关系,探讨表达CD123的AML患者是否更易诱导化疗失败及伴有更差的生存预后,从而为靶向CD123的CART细胞免疫治疗AML提供理论基础。本研究第二部分则是通过构建靶向CD123的CAR慢病毒载体,制备具有高转染效率的CART123细胞,体外试验验证CART123对CD123+AML原代细胞的细胞毒性作用,明确CART123细胞的有效性,为临床难治复发CD123+AML患者提供新的治疗选择。
  第一部分 CD123在急性髓系白血病细胞中的表达及预后价值研究
  研究目的:回顾性分析CD123在137例初诊AML患者中的表达分布及与患者生存预后的关系。
  研究方法:回顾性分析2012年1月至2015年12月我院血液科收治的137例初诊AML(M3除外)患者CD123表达情况,收集患者基本临床资料,包括年龄、性别、初诊白细胞计数、初诊骨髓原始细胞比例、细胞遗传学及分子生物学异常、是否移植、是否达CR1以及CD123表达。初诊时多参数流式细胞术检测CD123表达占骨髓白血病细胞群≥20%定义为阳性。使用SPSS21软件进行数据统计分析,所有计数资料采用“频数”(%)表示,计量资料采用“中位数”表示,两组间比较采用卡方检验、Mann-Whitney U检验或Fisher确切概率法,生存资料分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比较采用log-rank检验,完全缓解率(CR1)采用非条件Logistic回归分析,生存分析采用COX比例风险模型进行单因素和多因素分析,所有多变量回归分析均列出OR或HR以及95%的置信区间用于风险评估,所有检验均为双侧检验,统计检验结果P<0.05为差异具有统计学意义。
  研究结果:1、137例初诊AML患者中,男性70例(51.2%),女性67例(48.9%),中位年龄46岁(13-72岁),其中CD123+组84例(61.3%),CD123-组53例(38.9%),按FAB/WHO分型M1-M6中CD123表达率分别为60.0%(3/5)、48.5%(16/33)、70.8%(34/48)、68.4%(26/38)、50.0%(4/8),未分类者20.0%(1/5);其中M1、M4、M5的CD123表达阳性率相对较高,M2、M6表达稍偏低,M4与M2比较有明显统计学差异(P=0.042)。所有病例根据细胞遗传学及分子学异常进行危险分组,分别为预后良好组(28例)、预后中等组(74例)和预后不良组(35例),结果显示三组CD123表达无明显统计学差异;
  2、分析患者临床参数及常见突变基因与CD123表达的相关性,结果发现初诊高白细胞计数(P=0.001)、CR1(P=0.027)与CD123表达明显相关,其余临床指标均与CD123表达无明显相关性;
  3、疗效分析显示,137例AML患者总CR1率为62.0%(85/137),CD123+组与CD123-组CR1率分别为54.8%(46/84)、73.6%(39/53),差异有明显统计学意义(P=0.027); Logistic回归模型分析显示,初诊骨髓原始细胞比例(P=0.021)及CD123表达(P=0.024)是AML患者CR1的独立危险因素;至随访终点,完全缓解患者共有52例复发,总复发率46.8%(52/111),CD123+组与CD123-组分别为50.8%(32/63)、41.7%(20/48),两组复发率比较无明显统计学差异(P=0.340);
  4、生存分析显示,CD123+组和CD123-组相比有明显更短的OS(P=0.015),但两组DFS比较无明显统计学差异(P=0.086);多因素分析显示CD123表达是影响AML患者OS的独立不良预后因素。将所有患者进行危险分层后,发现预后中等组中CD123+组和CD123-组比较OS(P=0.035)及DFS(P=0.029)均明显降低。进一步将患者按年龄分组后,发现年龄≤50岁组CD123表达是患者预后的独立危险因素,两组OS(P=0.003)和DFS(P=0.006)比较有明显统计学差异。
  研究结论:1、CD123在初诊AML患者中广泛高表达,其中M4型CD123表达百分比最高。初诊高白细胞计数与CD123表达呈正相关;2、CD123表达是影响AML患者CR1的独立危险因素,可用来评估患者治疗疗效;3、CD123表达患者有更差的OS,但对患者的DFS并无明显影响;4、将全部患者按危险分层及年龄分组后,发现在预后中等组及年龄≤50岁组中CD123表达能更好地预测患者生存预后。
  第二部分 靶向CD123的嵌合抗原受体T细胞体外抗白血病作用研究
  研究目的:构建靶向CD123的CAR慢病毒载体,制备具有高转染效率的CART123细胞,体外试验验证CART123对CD123+AML原代细胞的细胞毒性作用,明确CART123的有效性,为临床治疗CD123+难治复发AML患者提供试验基础。
  研究方法:采用Ficoll密度梯度离心法分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC),CD3/CD28+IL-2激活2-3天,转染以4-IBB作为共刺激分子的CD123-CAR慢病毒,体外扩增8天后,qPCR检测转染效率、流式细胞术检测(FACS)细胞表型,流式CountBright磁珠绝对计数法验证CART123体外靶向杀伤能力,流式细胞术检测效靶细胞共培养后CD107α释放及细胞因子分泌情况。
  研究结果:1、成功构建CD123T28z和CD123TBBz两种结构的CD123 CAR慢病毒载体,CD123TBBz能有效转染激活的健康供者T淋巴细胞细胞,获得高转染效率及合适CD4/CD8细胞亚群比例的CART123细胞;2、CART123与CD123+AML原代细胞体外共培养后表现出显著的CD107α释放和细胞因子分泌,并且能有效发挥杀伤靶细胞的能力。
  研究结论:体外验证了我们的CART123细胞具有高转染效率、高扩增倍数以及显著的靶向杀伤CD123+AML原代细胞的能力。这些研究结果提示CART123可能是复发难治CD123+AML患者新的细胞免疫治疗方法。
[硕士论文] 钱昱
眼科学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:一、研究背景及目的:
  黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma)简称MALT淋巴瘤,占所有B细胞淋巴瘤的7%~8%,可见于胃肠道、肺、甲状腺、口腔及眼附属器等部位。眼部的MALT淋巴瘤是中老年人中最常见的眼眶恶性淋巴瘤。在我国的眼附属器淋巴瘤(ocular adnexal lymphoma,OAL)中,MALT淋巴瘤占80%以上。眼附属器MALT淋巴瘤可出现在眼睑、泪腺、结膜等部位。近年来,随着肿瘤检测技术的发展、人们居住环境和生活习惯的改变,眼附属器MALT淋巴瘤的发病率不断上升,但该病的发病机制一直不是十分清楚。因此,针对眼附属器MALT淋巴瘤的发病机制的研究对临床上诊断、治疗以及判断预后有至关重要的作用。
  微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一种长约18~25nt的非编码小片段RNA,广泛存在于植物和动物中。近些年来,针对miRNAs在肿瘤中调控基因表达的相关研究已成为医学界中热门的研究方向。miRNAs通过剪切或转录抑制等方式调控靶向mRNA来参与细胞增殖、分化、凋亡和胚胎发育等一系列重要生命过程。miR-150是由22个核苷酸组成的非编码小分子RNA,定位于人类染色体19q13.33,它对B细胞和T细胞的成熟、胚胎发育以及干细胞分化等发挥重要作用。
  通过targetscan程序并结合MALT淋巴瘤表达谱特征,我们选定miR-150靶向抑癌基因cbl-b作为本次试验的研究对象。由此推测miR-150与cbl-b存在着调控关系,并在结膜MALT淋巴瘤的发生发展中发挥着重要的作用。
  研究目的:本实验旨在检测miR-150与cbl-b在结膜MALT淋巴瘤组织中的表达情况,并对miR-150的细胞功能学进行相关研究,为miR-150在结膜MALT淋巴瘤中的作用提出一些初步的猜想。
  二、研究方法、结果:
  (一)结膜MALT淋巴瘤标本miR-150和cbl-b表达水平的检测
  本研究共收集了第二军医大学长征医院眼科于2016年7月至2016年10月收治的共3例(3眼)的结膜MALT淋巴瘤,患者均为汉族男性,年龄分别为68岁、71岁,均为EI期淋巴瘤。所有患者均已排除除结膜MALT淋巴瘤外的其它疾病。所有病例都经手术治疗,术后经我院病理科确诊为MALT淋巴瘤,实验用肿瘤和对照组织均为在手术时切取的新鲜标本。我们采用实时定量荧光PCR方法检测肿瘤组织和癌旁组织的miR-150和cbl-b表达水平。
  结果提示:相对于对照组织,肿瘤组织中miR-150表达水平明显升高,cbl-b表达水平明显下调。
  (二)B细胞淋巴瘤细胞(RPMI8226)的培养和miR-150inhibitor转染效率测定
  RPMI8226细胞作为一种常用的人源B淋巴瘤细胞系,我们选取它作为本实验的研究对象,并使用miR-150抑制剂对其进行转染,观察并记录转染情况。
  结果提示:DMRIE-C1.5μL,miR-150抑制剂2μL,无血清转染组效果最好。
  (三)抑制miR-150对RPMI8226细胞增殖、迁移与侵袭、凋亡的影响
  本实验环节,我们应用miR-150抑制剂转染成功的RPMI8226细胞株模型,研究miR-150对RPMI8226细胞功能学的影响。我们把RPMI8226细胞分别转染阴性对照组和miR-150抑制剂组,分别进行CCK8增殖实验、流式细胞技术检测和Transwell实验。
  结果提示:(1)转染120h后,与阴性对照组相比,miR-150抑制剂组可以显著抑制RPMI8226细胞的增殖,P<0.001;(2)与正常组和阴性对照组相比,miR-150抑制剂组的细胞凋亡显著增加(P<0.001);(3)与阴性对照组相比,miR-150抑制剂组中RPMI8226细胞的迁移与侵袭均出现抑制(P<0.05)。
  三、研究结论:
  通过以上实验,我们得出结论:miR-150在结膜MALT淋巴瘤组织中的表达显著上调,其抑癌靶基因cbl-b在结膜MALT淋巴瘤组织中的表达明显下调;进一步体外细胞实验提示:抑制miR-150的表达可对B细胞淋巴瘤细胞(RPMI8226)相关生物学功能及特性产生抑制作用,这说明miR-150在结膜MALT淋巴瘤的发生发展中可能发挥重要作用,其抑癌靶基因cbl-b也有望成为结膜MALT淋巴瘤的一种新的靶向分子。
[博士论文] 陈晨
内科学(血液病) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分 AML患者骨髓微环境中交感神经病变及Th相关分子异常的作用及机制研究
  目的:
  本研究拟通过对比检测AML患者和正常对照组骨髓组织中神经相关分子的表达水平变化来探究AML患者的骨髓微环境中是否存在骨髓神经组织病变;分析神经相关分子表达水平与患者临床特征和预后的相关性;检测辅助性T细胞(Thelper,Th)相关分子的表达变化,初步探讨骨髓神经病变在AML中的作用机制。
  方法:
  1.实验分组:AML组为新诊断AML患者100例,对照组为肿瘤学及炎症免疫学方面无异常的缺铁性贫血患者55例。
  2.治疗和随访:AML(非M3型)采用标准DA或IA方案诱导治疗,获得完全缓解后,以蒽环类药物联合标准剂量阿糖胞苷或大剂量阿糖胞苷序贯强化治疗。APL(M3型)的治疗则先应用全反式维甲酸±联合化疗进行诱导缓解,完全缓解后继续以蒽环类药物联合标准剂量阿糖胞苷或亚砷酸巩固化疗。电话随访并结合住院或门诊病历随访患者总生存期(OS),即确诊之日至死亡或末次随访的时间,随访截止日期为2015年10月31日,中位随访时间为15.5个月(2.0月~34.0月)。
  3.骨髓神经组织相关因子的检测:应用免疫组织化学技术和定量RT-PCR技术,检测AML患者和对照组骨髓组织中nestin、GFAP、TH和S100B在蛋白和基因水平的表达情况,通过对两组表达率和表达强度进行统计,分析AML患者骨髓神经相关分子表达的变化;将神经相关分子的表达水平与AML患者临床病理特征和预后进行相关性分析,探讨神经病变与AML患者预后的关系;应用ELISA方法,检测AML患者和对照组骨髓上清中神经多肽Y(NPY)和去甲肾上腺素(NE)的分泌情况。
  4.辅助性T细胞相关分子的检测:应用免疫组织化学技术和定量RT-PCR技术,检测AML患者和对照组骨髓组织中Th细胞相关的IL-17和Foxp3在蛋白和基因水平的表达情况;将神经相关性分子和Th细胞相关分子的表达水平进行相关性分析,探讨两者之间的关系。
  结果:
  1.AML患者骨髓组织神经相关分子的蛋白水平表达下降
  1.1 我们共收集60例AML患者和35例正常对照骨髓活检标本。采用免疫组织化学染色法(IHC)检测神经相关分子标志物nestin、TH、S100B和GFAP的蛋白表达水平。以染色指数(SI)4分为界,≥4分为高表达,<4分为低表达。
  1.2 AML患者骨髓组织中nestin和TH的高表达率显著低于对照组,而S100B的高表达率在AML患者和对照组之间并无统计学差异。至于GFAP,我们发现在AML组无阳性表达,对照组有2例阳性表达(2/20)。
  1.3 研究了神经相关分子在骨髓组织的高表达率后,我们又进一步分析了他们的表达水平。AML患者nestin和TH的表达水平较对照组明显降低,S100B蛋白表达水平在AML患者和对照组之间无统计学差异。
  2.AML患者骨髓神经相关分子的mRNA表达水平下降
  2.1 我们共收集了40例AML患者和20例正常对照的骨髓及上清标本,定量RT-PCR方法检测nestin、TH、S100B和GFAP的mRNA表达水平。
  2.2 我们发现,与免疫组化的结果相一致,AML患者骨髓中nestin和TH的mRNA表达水平明显低于对照组。GFAP在AML组和对照组的mRNA水平均很低,但差异仍有统计学意义。S100B在AML组的mRNA水平比较稍有下降,但并无统计学意义。
  3.AML患者骨髓交感神经递质的分泌减少
  我们采用ELISA方法检测了40例AML患者和20例正常对照的骨髓上清中神经递质NPY和NE的浓度,发现AML患者骨髓上清中NPY和NE浓度明显低于对照组。
  4.AML患者骨髓组织中Th细胞相关分子的表达异常
  4.1 IHC检测Th细胞相关分子Foxp3和IL-17的蛋白水平表达
  为了探讨骨髓微环境中的免疫状态,我们采用IHC技术检测了40例AML患者和20例正常对照的骨髓活检组织中Foxp3和IL-17的表达。AML患者骨髓组织中Foxp3的高表达率高于对照组,但是无统计学差异。至于IL-17,我们发现在AML和对照组均呈高表达。尽管Foxp3在AML组的SI高于对照组的SI,但差异无统计学意义。IL-17的SI在AML组和对照组无统计学差异。我们又进一步在AML患者和对照组进行了Foxp3/IL-17的分析,但差异无统计学意义。
  4.2 实时定量RT-PCR检测Th细胞相关分子Foxp3和IL-17 mRNA的表达水平
  我们应用实时定量RT-PCR方法检测了40例AML患者和20例正常对照的Foxp3和IL-17的mRNA表达水平。虽然Foxp3的mRNA表达水平在AML患者较对照组是升高的,然而两者之间无统计学差异,这个结果与IHC数据一致。而IL-17,结果显示与对照组相比AML患者mRNA表达水平显著降低。我们也分析了AML患者和对照组Foxp3/IL-17,与对照组相比,Foxp3/IL-17的比例在AML组显著增加,差异有统计学意义。
  5.AML患者骨髓神经相关分子与Th细胞相关分子之间的相关性
  为了探讨神经相关分子与Th细胞相关分子之间的关系,我们统计了40例AML患者nestin、TH、S100B和GFAP的mRNA表达水平以及Foxp3和IL-17的mRNA表达水平,分析这些因子表达的相关性。结果显示,在AML患者的骨髓中,nestin与TH和IL-17呈正相关,TH与IL-17之间亦呈正相关。重要的是,我们发现nestin及TH与Foxp3/IL-17呈显著负相关。
  6.AML患者骨髓神经相关分子与Th细胞相关分子与临床特征的相关性
  我们将60例AML患者骨髓活检组织中nestin、TH、S100B和Foxp3的表达水平与性别、年龄、FAB亚型和染色体核型分组等临床特征进行了相关性研究,结果显示这些分子的表达与AML的临床特征并无显著相关性。
  7.AML患者神经相关分子和Th细胞相关分子表达与临床预后的相关性
  为研究骨髓神经相关分子和Th细胞相关分子与AML患者预后的相关性,我们随后随访了60例AML患者,中位OS为15.5个月(范围,2-34个月)。AML患者的Kaplan-Meier生存曲线显示高表达nestin和高表达S100B的AML患者有更长的生存期。Cox比例风险回归分析发现年龄、性别、TH和IL-17的表达对生存率没有影响,而nestin和S100B可能是独立预后因素。
  结论:
  1.AML患者的骨髓微环境存在交感神经病变,而且与AML患者的预后相关。
  2.AML患者的骨髓交感神经病变可能会引起神经递质浓度降低,导致Th细胞免疫功能失衡。
  第二部分 AML患者骨髓间充质干细胞诱导分化为类神经细胞的研究
  目的:
  探讨AML患者BM-MSCs的生物学特征和向神经细胞分化能力的变化,通过与对照组的比较研究,探讨BM-MSCs在AML发生发展中的作用。
  方法:
  1.分组:AML患者组为新诊断AML患者30例,对照组为肿瘤学及炎症免疫学方面无异常的缺铁性贫血患者18例。
  2.分离和培养BM-MSCs:通过Ficoll密度梯度离心和贴壁培养的方法,获取AML患者和对照组骨髓组织中的贴壁细胞。通过CCK8细胞增殖实验检测两组细胞的增殖能力。
  3.BM-MSCs的鉴定:根据干细胞鉴定标准来鉴定获得贴壁细胞,显微镜下观察细胞形态;应用流式细胞技术检测细胞的表面抗原表达;通过干细胞的成脂分化实验,鉴定贴壁细胞的分化能力;
  4.BM-MSCs分化为类神经细胞的诱导方案的筛选:利用三种诱导方案(BME+BHA,IBMX,EGF+bFGF)将BM-MSCs诱导分化为类神经细胞,检测其诱导效率,筛选相对高效的诱导方案;
  5.应用筛选好的诱导方案,诱导AML组和对照组的BM-MSCs分化为类神经细胞,通过镜下计数类神经细胞的数目,比较两组细胞的诱导率;应用免疫荧光技术检测诱导后细胞的神经相关分子的表达。
  结果:
  1.从AML患者的骨髓组织中成功获取BM-MSCs:培养早期AML来源的BM-MSCs的增殖能力强于对照组,传代培养后,差异渐不明显。两组细胞形态无明显差异。
  2.IBMX诱导方案效率最高:通过比较BME+BHA,IBMX,EGF+bFGF的诱导效率,发现以IBMX为诱导剂的诱导方案,诱导时间短,诱导率较高(P=0.039),后续实验选择IBMX方案进行诱导。
  3.AML患者来源的BM-MSCs可以诱导分化为类神经细胞:AML患者来源的BM-MSCs和对照组的细胞类似,经IBMX诱导分化后,均有部分细胞分化为类神经细胞;免疫荧光检测神经相关分子的表达,发现两组细胞都有nestin表达下降,tubulin和GFAP表达升高;但是AML患者的BM-MSCs向神经细胞的诱导分化率降低(P=0.001)。
  结论:
  1.AML患者的骨髓组织中可以成功获取BM-MSCs。
  2.AML患者来源的BM-MSCs与对照组相比,没有形态和增殖能力的变化。
  3.AML患者来源的BM-MSCs向神经细胞分化的能力降低。
[博士论文] 李胜利
内科学(血液病) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是浆细胞的恶性肿瘤,以浆细胞在骨髓中克隆性增殖导致骨骼损害,贫血,肾功能衰竭和免疫功能抑制为特征。MM是发病率位居第二的血液系统恶性肿瘤,中位发病年龄68岁。随着中国老龄化社会的进程,MM的发病率将会进一步提升。虽然针对骨髓微环境的新药如雷利度胺和硼替佐米显著改善了骨髓瘤治疗效果。但是,MM仍不能治愈,多数患者最终因出现复发或耐药而不治身亡。因此,亟待探索骨髓瘤的发病机制特别是关于骨髓微环境在骨髓瘤发生中的作用,为寻找新的治疗靶点提供理论依据。
  既往的研究发现骨髓瘤的发病不但与浆细胞的遗传学改变有关,骨髓微环境在其发生和耐药等方面也起到关键作用。骨髓间充质干细胞(bone marrow derivedmesenchymal stem cells,BMMSCs)是骨髓微环境的重要细胞成分,具有分化为脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞的能力。BMMSCs在MM病理生理中的作用是目前的一个研究热点。BMMSCs不但在骨髓瘤的耐药,生长和生存中发挥重要的作用,其功能紊乱还与骨髓瘤骨病密切相关。以往的研究发现骨髓瘤来源的BMMSCs(MM-BMMSCs)和正常供者来源的BMMSCs在功能和基因表达等方面存在明显的不同。例如,MM-BMMSCs支持骨髓瘤细胞增殖的能力增强,而其向成骨细胞分化和抑制T淋巴细胞的能力减弱;其在基因表达谱方面发生了改变,这些异常变化可能参与MM的发生发展。
  端粒是重复序列组成的DNA片段和相关蛋白质构成的染色体的末端,对染色体起到保护作用。端粒的缩短与老化和肿瘤相关。有报道提示端粒的损伤影响间充质干细胞的功能和基因表达。然而,MM-BMMSCs端粒长度的特点,端粒长度是否影响其基因表达,目前还未有研究见于报道。此外,对于MM-BMMSCs的生物学变化与骨髓瘤患者临床特征间的关系的研究也鲜有报道。由于研究人群,BMMSCs提取和培养体系等不同,既往关于MM-BMMSCs生物特征如成骨分化能力,衰老,免疫调节及基因表达等方面的论述中仍存在分歧。因此,有必要进一步研究MM-BMMSCs的生物学特征,为多发性骨髓瘤的发病机制提供理论依据,为其治疗提供新思路。
  本实验采用贴壁培养的方法获取骨髓瘤和对照组BMMSCs,通过细胞免疫表型和诱导分化鉴定间充质干细胞。比较两种细胞在免疫表型,基因表达,细胞周期和端粒长度方面的差异。研究骨髓瘤细胞条件培养液(MCCM)对MM-BMMSCs的生物学特征的调控作用。并分析MM-BMMSCs基因表达和端粒长度与患者临床特征间的关系。
  方法:
  骨髓间充质干细胞的培养和鉴定
  髂骨穿刺的方法抽取MM患者和对照组骨髓液,采用贴壁培养的方法获得原代间充质干细胞。通过免疫表型,细胞成骨分化培养和形态鉴定BMMSCs。比较MM和对照组BMMSCs形态特征和增殖能力。
  细胞周期
  采用流式细胞术的方法检测MM患者和对照组第四代BMMSCs的细胞周期。
  基因表达
  Real-time PCR方法测量白介素-6(Interleukin-6,IL-6),巨噬细胞炎性蛋白-1α(Macrophage inflammatory protein-1 alpha,MIP-1α),吲哚胺2,3-二氧化酶(Indoleamine2,3-dioxygenase,IDO),Dickkopf-1(DKK1),核因子kB受体活化因子配基(Receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL),转化生长因子-β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)和白介素-10(Interleukin-10,IL-10)基因在MM患者和对照组第四代BMMSCs中的表达。
  端粒长度
  Real-time PCR的方法检测12例MM患者和8例对照BMMSCs的端粒长度。选择3对年龄相仿的骨髓瘤患者和对照组BMMSCs,应用Flow-Fish方法测量BMMSCs端粒的长度。
  MCCM对MM-BMMSCs基因表达和细胞周期的影响
  选取3例MM-BMMSCs,Real-time PCR方法测量MCCM作用前后IL-6,MIP-1α和IDO基因的表达情况。流式细胞仪分析MCCM作用前后细胞周期的变化。
  结果:
  原代MM-BMMSCs生长缓慢,形态无明显异常。传代后的骨髓瘤和对照组BMMSCs相比,在形态和增殖速度上未见差异。流式细胞分析表明MM-BMMSCs和对照间充质干细胞一样,表达CD73,CD90和CD105,不表达CD34,CD45和HLA-G。两者在成骨诱导培养液中,均具有向成骨细胞分化的能力。
  细胞周期分析发现骨髓瘤组与MM-BMMSCs相比更多处于G0/G1期,而对照组BMMSCs更多处于S期和G2/M期。
  与对照组BMMSCs相比,Real-time PCR发现MM-BMMSCs高表达IL-6和MIP-1α,低表达IDO。两者在DKK1,RANKL,TGF-β和IL-10的表达上未见明显差异。
  Real-time PCR方法发现MM-BMMSCs的端粒长度(0.98±0.11)较对照组端粒长度(0.65±0.07,P=0.03)明显延长。在年龄相仿的三组BMMSCs中,Flow-Fish同样验证了MM-BMMSCs比对照组BMMSCs具有更长的端粒长度。Real-time PCR未检测到hTERT在两者BMMSCs中的表达。
  在MCCM作用24小时后,MM-BMMSCs表达IL-6和MIP-1α增加,但是表达IDO明显减少。MCCM作用24小时后,处于G0/G1期的MM-BMMSCs增加,而位于S期的细胞明显减少。
  相关性分析发现,MM-BMMSCs的端粒长度与其表达的IL-6和MIP-1α成正相关。
  MM-BMMSCs表达基因IL-6和MIP-1α的水平与患者临床指标如性别,骨损,疾病分期,β2微球蛋白,骨髓中浆细胞比例和肌酐无相关性。虽然MM-BMMSCs端粒长度与疾病分期,β2微球蛋白,骨髓中浆细胞比例和肌酐无相关性,但是发生骨损的MM-BMMSCs比未发生骨损的MM-BMMSCs的端粒明显缩短。
  结论:
  MM-BMMSCs与对照组相比具有相似的生长特征和免疫表型。MM-BMMSCs更多位于G0/G1期,其端粒长度较对照增加,且高表达IL-6和MIP-1α基因,低表达IDO基因。MCCM进一步诱导MM-BMMSCs处于G0/G1期,促进其表达IL-6和MIP-1α升高,而表达IDO降低,提示骨髓瘤细胞可能通过旁分泌的途径影响间充质干细胞的功能。相关性分析发现,MM-BMMSCs端粒长度与其表达的IL-6和MIP-1α呈正相关。MM-BMMSCs表达的IL-6和MIP-1α与患者临床指标无相关性,但是其端粒长度在发生骨损的MM-BMMSCs中较未发生骨损的MM-BMMSCs中明显缩短。我们的结果提示MM-BMMSCs可能参与了MM的病理生理过程和骨髓瘤骨病的发生。
[硕士论文] 韩康康
内科学(呼吸内科) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨以多浆膜腔积液、Warburg效应为临床表现的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的临床诊断与治疗。
  方法:回顾性分析以多浆膜腔积液、Warburg效应为主要临床表现患者1例,男,51岁,因腹痛、腹胀1个月,右侧胸痛7d入院,行CT、PET-CT、内科胸腔镜检查。通过系统检索中国知网和Pubmed等中英文数据库,纳入2010至2016年有关大B细胞淋巴瘤、large B-cell lymphoma、低血糖、高乳酸、肿瘤、hypoglycemia、lactic acidosis、tumor等关键词的文献,并进行文献复习。
  结果:CT检查示胸腔、腹腔积液,超声心动图示少量心包积液;PET-CT示双侧胸膜、腹膜葡聚糖高摄取率;入院后多次血糖检测低于正常,最低至1.17mmol/L,血乳酸异常升高;胸水LDH5158U/L,CA-1253251U/mL;胸水细胞学检查见原幼淋巴样细胞;胸腔镜活检病理确诊DLBCL。随之给予化疗3周期,症状缓解。检索文献605篇,共报道3981例DLBCL,累及1处及以上浆膜腔者108例(2.71%),多浆膜腔累及者30例(0.75%);低血糖、高乳酸血症个案报道15例,均为国外文献报道,15例病例中非霍奇金淋巴瘤13例,其中DLBCL4例,Burkitt淋巴瘤3例,T细胞淋巴瘤2例,另有4例未提及淋巴瘤具体分型。
  结论:以多浆膜腔积液、Warburg效应为临床表现的DLBCL较少见,胸腔镜检查对多浆膜腔积液疾病的诊断及其鉴别诊断颇具优势。
[博士论文] 赵霞
内科学(血液病) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  淋巴瘤是源于淋巴造血系统的恶性肿瘤。随着诊疗手段的不断发展,患者的生存期和生活质量得到了很大改善,仍有很大一部分淋巴瘤患者会出现复发或耐药,甚至导致死亡。淋巴瘤属于免疫系统肿瘤,其发生是多因素、多环节、多基因相互作用的结果,它与遗传、免疫微环境的异常、抑癌基因的失活、细胞凋亡和细胞异常增殖等有关。最近研究显示,肿瘤细胞在发生发展或被化疗药物杀伤时,均可产生炎症小体。炎症小体是参与机体免疫的重要组成部分,NLRP3炎症小体是目前研究得最清楚的炎症小体,在肿瘤的发生发展和化疗耐药中占据重要地位。
  研究目的:
  研究淋巴瘤患者NLRP3炎症小体相关基因的多态性和表达,并评估其临床意义,利用淋巴瘤细胞系进行功能试验进一步探索其功能并阐明其在淋巴瘤中的作用机制。
  研究方法:
  1、淋巴瘤患者NLRP3相关基因SNPs检测:选取390例淋巴瘤患者和385例健康对照者为研究对象,刮取淋巴瘤患者骨髓涂片,抽取健康对照者EDTA抗凝全血,然后应用DNA样本提取试剂盒提取DNA,PCR(探针法)检测IL-18(rs1946518)、IL-1β(rs16944)、CARD8(rs2043211)、NFκB94ins/del(rs28362491)各基因分型。
  2、淋巴瘤患者及正常对照的NLRP3相关基因的表达:选取68例淋巴瘤患者(46例新诊断的患者和22例缓解患者)和40例健康对照提取外周血mRNA,反转录成cDNA,设计引物,应用RT-PCR方法检测淋巴瘤患者和正常对照者的外周血单个核细胞中IL-18、IL-1β、caspase-1、NLRP3、ASC、NFκB基因mRNA水平的表达。应用ELISA方法检测淋巴瘤患者和健康对照外周血清中IL-18、IL-1β的水平。免疫组织化学方法检测淋巴瘤患者淋巴瘤组织病理切片及正常淋巴结组织切片中NLRP3相关基因IL-18、NLRP3、ASC的表达。
  3、在淋巴瘤细胞系Pfeiffe中加入LPS+ATP处理后,应用Western blot法检测ASC及NFκB蛋白的表达水平,以GAPDH作内参。
  4、设置地塞米松浓度梯度,观察NLRP3炎症小体活化对Pfeiffer细胞药物敏感性影响。实验分组设计为对照组、LPS+ATP组、DEX组、DEX+LPS+ATP组,收集各组细胞和上清液进行相关指标检测。应用ELISA方法测定各组细胞培养上清液中IL-18和IL-1β的浓度,应用RT-PCR方法检测各组细胞IL-18、IL-1β、caspase-1、NLRP3、c-myc、TP53、bcl-2、bax基因mRNA水平的表达。
  5、在Pfeiffer培养体系中加入IL-18和抗IL-18培养48h。实验分组设计为对照组、DEX组、IL-18+DEX组、抗IL-18+DEX组,收集各组细胞进行相关指标检测。应用RT-PCR方法检测各组细胞c-myc、TP53、bcl-2、bax基因mRNA水平的表达。
  6、CCK8方法检测各组细胞增殖情况,并进行药敏分析;根据细胞周期试剂盒说明应用流式细胞术进行细胞周期分析;使用Annexin V/PI凋亡检测试剂盒流式细胞术分析各组细胞凋亡情况。
  7、统计学分析:将连续变量和分类变量用方差分析或非参数Kruskal-Wallis检验进行比较。标准卡方检验用于测试Hardy-Weinberg平衡的基因型频率。通过计算优势比(OR)和相应的95%置信区间(CI)来评估基因型与疾病风险之间的关联。使用Mann-Whitney U检验进行RT-PCR和ELISA检测的各组结果之间的比较。Kaplan-Meier曲线用于描述存活。进行细胞实验三次,定量数据表示为平均值±标准差,使用非配对t检验进行统计学分析。P<0.05被认为具有统计学意义。
  研究结果:
  一、NLRP3炎症小体相关基因SNPs与淋巴瘤的易感性及预后的相关性研究
  1、炎症小体NLRP3相关基因多态性与淋巴瘤的易感性:淋巴瘤患者IL-18(rs1946518)和NFκ394ins/del(rs28362491)基因型分布与正常对照具有显著性差异。
  2、L-18(rs1946518)和NFκB94ins/del(rs28362491)的等位基因与淋巴瘤的易感性:携带IL-18(rs1946518)等位基因“G”和NFκB94ins/del(rs28362491)等位基因“ins”者淋巴瘤患病风险均显著增加。
  3、NLRP3炎症小体基因多态性与淋巴瘤患者临床指标相关性:IL-18(rs1946518)基因型与LDH水平相关,CARD8(rs2043211)基因型与性别、B症状和结外浸润部位相关,NFκB94ins/del(rs28362491)与LDH水平、分型和骨髓浸润相关。
  4、IL-18(rs1946518)和NFκB94ins/del(rs28362491)与B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)易感性:IL-18(rs1946518)与T-NHL和B-NHL易感性均具有显著相关性。而NFκ394ins/del(rs28362491)仅与B-NHL的易感性显著相关。携带IL-18等位基因“G”者,T-NHL和B-NHL患病风险均显著增加。携带NF-kB等位基因“ins”者,B-NHL患病风险显著增加。
  5、CARD8(rs2043211)的AA基因型及LDH水平较高的淋巴瘤患者具有较短的生存期。
  二、NLRP3炎症小体相关基因在淋巴瘤患者中的表达及相关功能研究
  1、NLRP3炎症小体相关基因表达:NLRP3相关基因IL-18、IL-1β、caspase-1、NLRP3和NFκ3的mRNA表达在淋巴瘤患者中均明显高于正常人,但治疗后缓解淋巴瘤患者中只有IL-18mRNA表达明显低于新诊断淋巴瘤患者,其它基因表达未见显著性差异。IL-18(rs1946518)、NFκB94ins/del(rs28362491)、IL-1β(rs16944)基因不同基因型间mRNA表达均无显著性差异。
  2、淋巴瘤患者外周血血清IL-18以及IL-1β水平:新诊断的淋巴瘤患者的血清IL-18水平显著高于对照组,化疗缓解后较化疗前显著降低。而新诊断的淋巴瘤患者血清IL-1β水平显著高于对照组,但化疗缓解后与化疗前相比没有显著变化,IL-18(rs1946518)GT基因型患者的血清IL-18水平显著高于GG基因型。
  3、淋巴瘤病理组织中NLRP3相关基因表达:淋巴瘤患者ASC和NLRP3表达明显高于正常对照,IL-18表达略高于正常对照。
  4、NLRP3炎症小体活化验证:用LPS刺激6h,ATP作用1h后,Pfeiffer细胞ASC和NFκB的蛋白表达水平升高,NLRP3相关基因IL-18、caspase-1、IL-1β、NLRP3的mRNA表达均升高,培养上清液中IL-18和IL-1β水平显著升高,均提示NLRP3炎症小体被活化。
  5、NLRP3炎症小体的活化增强了Pfeiffer细胞对地塞米松的耐药性:LPS+ATP处理细胞后,地塞米松对Pfeiffer细胞的抑制率下降,显著提高了地塞米松的IC50值。
  6、NLRP3炎症小体减弱地塞米松对细胞增殖的抑制作用:地塞米松可抑制pfeiffer细胞增殖,NLRP3炎症小体的活化促进细胞周期从G1进入S期,通过上调c-myc mRNA表达,减弱了地塞米松对细胞周期的影响,从而促进细胞增殖。
  7、NLRP3炎症小体抑制地塞米松诱导的细胞凋亡作用:地塞米松可诱导pfeiffer细胞凋亡,NLRP3炎症小体的活化通过上调bcl-2和下调Bax从而抑制细胞凋亡,减弱地塞米松的促凋亡作用。
  8、重组人IL-18(rhIL-18)调节NLRP3炎症小体对Pfeiffer细胞的生物学作用:加入rhIL-18后c-myc mRNA和bcl-2mRNA表达显著增加,而TP53mRNA和bax mRNA表达显著降低,从而促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,抑制地塞米松的抗肿瘤作用,而加入抗IL-18后作用相反。
  研究结论:
  1、IL-18(rs1946518)和NFκB94ins/del(rs28362491)基因多态性是影响淋巴瘤易感性的相关因素,CARD8(rs2043211)基因多态性对淋巴瘤的生存期有较大影响。
  2、淋巴瘤患者NLRP3相关基因表达高于正常人,NLRP3炎症小体通过其下游基因尤其是IL-18的作用,促进淋巴瘤细胞增殖,抑制淋巴瘤细胞凋亡,减弱地塞米松的抗肿瘤作用。
  3、IL-18可活化NLRP3,促进淋巴瘤细胞增殖,抑制淋巴瘤细胞凋亡,减弱地塞米松的抗肿瘤作用。抗IL-18作用与之相反。
  4、NLRP3炎症小体可能通过其效应分子IL-18促进淋巴瘤的发生发展。
[博士论文] 杨翔宇
临床医学;影像医学与核医学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要分为以下几个部分:
  第一部分:淋巴特异性探针(Cy5.5-HA)的构建及对对前哨淋巴结成像
  目的:本实验旨在开发Cy5.5-HA作为淋巴特异性成像剂,并评价其用于前哨淋巴结成像效果及可能的机制,为术中前哨淋巴结活检提供精准实时的术中指导
  方法:将透明质酸(Hyaluronica acid,HA)与近红外荧光分子Cy5.5结合,合成Cy5.5-HA作为淋巴特异性成像剂。使用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫荧光染色评估Cy5.5-HA对淋巴系统的亲和性。分别将分子量5K、10K、20K HA合成的Cy5.5-HA于小鼠足底注入,每10分钟行近红外荧光成像至3小时,观察其在淋巴系统内的迁移和前哨淋巴结的停留时间,筛选出最佳分子量。分别将相同分子量(10K)的Cy5.5-HA和Cy5.5-PEG于小鼠足底注入后,每10分钟行近红外荧光成像至2小时,比较两种探针在淋巴系统内的迁移和前哨淋巴结的停留时间。松节油诱导形成小鼠后腿局部炎症模型第5天,分别于炎症侧和对侧注入等量Cy5.5-HA,每10分钟行近红外荧光成像至2小时,对比两侧成像差别。
  结果:通过ELISA和免疫荧光染色表明,Cy5.5-HA能够结合到淋巴系统内标志物LYVE-1。在小鼠模型中,HA最适的成像分子量是10 KDa,前哨淋巴结成像的时间窗是60分钟到180分钟。与对照10K Cy5.5-PEG在体内成像相比,具有更好的前哨淋巴结停留,表明Cy5.5-HA在前哨淋巴结内的积聚,是与其特异性结合相关,而不是单纯的与分子量大小相关。
  结论: Cy5.5-HA是一种有效的淋巴显像剂,能够在淋巴系统内特异性结合,积聚于前哨淋巴结。10K Cy5.5-HA在小鼠体内表现适宜的成像时间。
  第二部分:肿瘤特异性探针(IRDye800-mAb)构建及对肿瘤组织成像
  目的:本实验旨在构建肿瘤抗体探针,评估探针成像肿瘤的敏感性,以用于术中鉴别淋巴结转移,部分的替代术中淋巴结病理检查。
  方法:将近红外染料IRDye800与与抗表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor,EGFR)抗体西妥昔单抗(Cetuximab)和抗人类表皮生长因子受体2(humanepidermal growth factor receptor2,HER2)抗体曲妥单抗(trastuzumab)结合,合成IRDye800-Cetuximab和IRDye800-Trastuzumab两种探针。在BALB/c裸鼠裸鼠肩部建立UM-SCC-22B皮下瘤模型后,静脉注射IRDye800-Cetuximab(1 nmol)后0、1、4、8、16、24、48、96行近红外荧光成像,观察肿瘤可成像最佳时间。将UM-SCC-22B细胞使用IRDye800-Cetuximab(5 umol/L,24小时)孵育后,分不同数量(1K,3K和10K)注入到BALB/c裸鼠皮下,立即行近红外荧光观察,确定最小可识别细胞数。将不同数量(1K,3K和10K)UM-SCC-22B,注射到BALB/c裸鼠皮下,24小时后静脉注射IRDye800-Cetuximab(1 nmol),24小时后行近红外荧光成像,观察可成像最小细胞数。
  结果:我们构建了肿瘤抗体近红外探针(IRDye800-Cetuximab和IRDye800-Trastuzumab)。静脉注射IRdye800-Cetuximab成像皮下瘤模型,在静脉注入探针后4小时即可显现肿瘤组织,并在24小时到96小时维持在较高的平台期。为验证抗体探针的敏感性,我们通过皮下瘤模型成像,测定出IRdye800-Cetuximab检测UM-SCC-22B细胞的敏感性在1000个细胞级别,直径为微米级大小,敏感性较高。
  结论:我们可以认定肿瘤标志抗体探针具有较高的敏感性和较长的成像时间,因此具有用于术中成像转移淋巴结的潜力。
  第三部分:双探针共同应用对于前哨淋巴结转移成像
  目的:本实验旨在结合淋巴显像剂和肿瘤靶向剂,构建一种术中定位前哨淋巴结并能同时区分前哨淋巴结内是否有肿瘤转移的成像方法,以提供精准实时的术中指导。
  方法:将Cy5.5-HA和IRDye800-Cetuximab溶液同时置于近红外荧光成像,区分两种光谱。将带有Fluc+荧光素酶基因的UM-SCC-22B细胞和SKOV-3细胞,经小鼠足底注射,分别建立头颈癌和卵巢癌前哨淋巴结转移模型,每周行生物活体发光成像观察肿瘤生长和淋巴结转移情况。头颈癌淋巴结转移模型建立后6周后,静脉注射IRDye800-Cetuximab(0.5 nmol,100 uL)探针,肿瘤原位注射Cy5.5-HA(0.2 nmol,10 uL),对腘窝淋巴结成像,并行病理切片验证。卵巢癌淋巴结转移模型建立后7周后,静脉注射IRDye800-Trastuzumab(0.5 nmol,100 uL)探针,肿瘤原位注射Cy5.5-HA(0.2 nmol,10 uL),对腘窝淋巴结成像,并行病理切片验证。
  结果:近红外成像设备良好的区分了Cy5.5-HA和IRDye800-Cetuximab两种溶液光谱。经过一系列应用IRDye800标记的抗体和Cy5.5标记的HA对肿瘤转移模型小鼠成像,成功的区分出未转移淋巴结、部分转移淋巴结和肿瘤组织完全占据的淋巴结等三种转移状态的前哨淋巴结,并得到病理结果证实。
  结论:综合应用肿瘤靶向剂和淋巴显像剂两种探针成功地成像了前哨淋巴结,双探针荧光成像不仅定位了前哨淋巴结,也评估了前哨淋巴结转移情况。这种成像策具有提供准确且实时的术中成像导航的潜力。
[硕士论文] 李璐璐
免疫学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM),是一种恶性肿瘤,其特点是:骨髓内的浆细胞会出现异常增生的情况,属于成熟B细胞肿瘤。到目前为止,治愈率仍旧较低。MM患者会出现单克隆浆细胞的增生,同时还会产生单克隆免疫球蛋白,而骨髓中过度增生的单克隆浆细胞侵犯骨髓,又会引起如:贫血、高钙血症、骨痛或骨折、肾功能不全等症状。近年来的一些研究表明,多发性骨髓瘤的发生可能是与某些癌基因的激活,某些细胞因子的升高,以及黏附分子的异常表达相互关联。
  目的:
  本实验通过流式细胞术、酶联免疫吸附试验两种方法,检测多发性骨髓瘤患者与正常人骨髓、外周血中的黏附分子VCAM-1(CD106)、VLA-4(CD49d),以及相关细胞因子的表达水平,分析其表达差异及相关性;并进一步探讨其在多发性骨髓瘤的ISS不同分期中表达的差异及相关性,旨在深入研究多发性骨髓瘤的发病机制,从而为多发性骨髓瘤的诊断与治疗提供有力的实验数据支持。
  方法:
  1、流式细胞术(flow cytometry,FCM)
  研究对象主要来源于2013年10月-2017年4月到郑州市中心医院就诊的多发性骨髓瘤患者37例,均经临床诊断为多发性骨髓瘤,且符合国际卫生组织(WHO)诊断多发性骨髓瘤的标准(2001年)。并在郑州市中心医院找出21例非血液病患者作为正常对照组,分别取骨髓标本。用流式细胞仪检测实验组与对照组VCAM-1(CD106)、VLA-4(CD49d)、CD38以及CD138抗原的表达情况,分析不同抗原在多发性骨髓瘤ISS不同分期中的的表达特点,进一步分析其相关性及临床意义。
  2、运用酶联免疫吸附试验(ELISA)
  ELISA法研究对象来源于流式细胞术实验组(37例多发性骨髓瘤患者),为同一批患者,正常对照组来源于到郑州市中心医院健康体检的20例成人,分别取血清标本。用ELISA法检测实验组与对照组血清中VCAM-1、IL-2、IL-6、TNF-α的浓度水平,分析其在多发性骨髓瘤ISS不同分期中的的表达特点,进一步分析其相关性及临床意义。
  结果:
  1、流式细胞术
  CD38、CD138、VLA-4三种抗原在实验组与对照组中的阳性率无显著统计学差异(P>0.05);VACM-1抗原,实验组与对照组的阳性率比较,有显著的统计学差异(P<0.05)。
  CD38、CD138、VLA-4三种抗原在实验组与对照组中的抗原表达率无显著统计学差异(P>0.05);VACM-1抗原,实验组与对照组的抗原表达率比较,有显著统计学差异(P<0.01)。
  CD38、CD138两种抗原,初诊组,缓解组,未缓解组之间两两比较,均无显著统计学差异(P>0.05)。VLA-4抗原与VCAM-1抗原,初诊组与缓解组比较,缓解组与未缓解组比较,均有显著统计学差异(P<0.05),而初诊组与未缓解组比较,无显著统计学差异(P>0.05)。
  CD38、CD138两种抗原,Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期,三组之间两两比较,无显著统计学差异(P>0.05)。VLA-4抗原与VACM-1抗原,Ⅰ期与Ⅱ期比较,Ⅰ期与Ⅲ期比较,均有显著统计学差异(P<0.05),而Ⅱ期与Ⅲ期比较,无显著差异(P>0.05)。
  2、酶联免疫吸附试验(ELISA)
  实验组血清VCAM-1的浓度明显高于正常对照组,有显著的统计学差异(P<0.01)。VCAM-1在实验组ISS不同分期中的浓度比较,Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期三组之间两两比较,均有显著的统计学差异(P<0.01)。
  实验组血清IL-2的浓度与正常对照组相比较,无显著统计学差异(P>0.05)。血清IL-2在实验组ISS不同分期中的浓度比较,Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期三组之间两两比较,均无显著的统计学差异(P>0.05)。
  实验组血清IL-6的浓度明显高于正常对照组,有显著的统计学差异(P<0.01)。血清IL-6在实验组ISS不同分期中的浓度比较,Ⅰ期与Ⅱ期相比较,有显著的统计学差异(P<0.05);Ⅰ期与Ⅲ期相比,有显著的统计学差异(P<0.01);Ⅱ期与Ⅲ期相比较,有显著的统计学差异(P<0.05)。
  实验组血清TNF-α的浓度明显高于正常对照组,有显著的统计学差异(P<0.01)。TNF-α在实验组ISS不同分期中的浓度比较,Ⅰ期与Ⅱ期相比较,有显著的统计学差异(P<0.05);Ⅰ期与Ⅲ期相比,有显著的统计学差异(P<0.01);Ⅱ期与Ⅲ期相比较,有显著的统计学差异(P<0.05)。
  结论:
  多发性骨髓瘤患者存在黏附分子VCAM-1、VLA-4和细胞因子IL-6、TNF-α的表达异常,且与ISS分期有关。研究这些黏附分子和细胞因子在多发性骨髓瘤患者体内的表达对于阐明多发性骨髓瘤的发病机制,指导临床诊断和治疗具有重要的意义。
[博士论文] 牛松涛
肿瘤学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(Extranodal NK/T-cell lymphoma,nasal type)属于非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一种少见类型,约占NHL的2%-10%,其在西方人群中非常罕见,但在亚洲、墨西哥和南美洲人群中较为普遍。NK/T细胞淋巴瘤是一个独特的临床病理实体,其发病率居T细胞淋巴瘤的首位,具有侵袭性强、预后不佳的特点,其具体病因和最佳治疗方案到目前为止还尚未搞清楚。所以,进一步研究NK/T细胞淋巴瘤的病因和分子机制有助于评估NKTCL的早期诊断、治疗和预后,也为探索新的治疗靶点提供重要的理论依据。
  Lumican(LUM)位于人类染色体12q21.3-q22上,其产物基膜聚糖是一种富含亮氨酸的伴有硫酸角质素侧链的原型蛋白多糖,是角质层、皮肤和肌肉结缔组织的主要组成部分。LUM在皮肤、血管、肺、乳腺、胰腺、结直肠、关节软骨等组织中广泛表达。LUM是细胞外基质中的重要组成成分,LUM突变或表达异常或者与整合素相互作用均可以间接地影响肿瘤的转移侵袭,也可以通过参与上皮细胞管样结构的形成调节肿瘤血管的形成,从而影响肿瘤的增殖。有很多研究已证实LUM在消化道肿瘤、呼吸道肿瘤以及泌尿生殖道肿瘤等多种恶性肿瘤中表达异常,其发生突变或者表达异常对肿瘤的发生、发展和转移均可造成一定的影响。LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的研究还未见有报道,LUM对NK/T细胞淋巴瘤的发生、发展等生物学作用以及分子机制都有待深入研究。
  本研究首先通过免疫组化法检测了LUM在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤以及反应性增生淋巴结中的表达情况,并分析了LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的阳性表达与临床病理参数、临床疗效的关系;体外研究,我们利用慢病毒载体构建了LUM过表达载体,经病毒包装并感染NK/T细胞淋巴瘤YTS细胞,得到了稳定过表达YTS-LUM细胞系,并通过细胞生物学和分子生物学方法检测了LUM过表达对NK/T细胞淋巴瘤细胞YTS细胞克隆形成、凋亡、细胞周期、侵袭以及化疗药物敏感性等生物学特性的影响,同时利用Western blot检测了LUM过表达对增殖和凋亡相关蛋白以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响。最后拟体内研究,我们通过构建肿瘤动物模型,进一步研究了LUM过表达对动物体内NK/T细胞淋巴瘤生长的影响。本研究旨在探索LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的生物学功能和分子机制,为NK/T细胞淋巴瘤的临床治疗提供了重要的候选分子标记和靶基因。
  目的:
  1.检测LUM在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤以及反应性增生淋巴结组织表达情况,分析其与临床病理参数、疗效之间的关系。
  2.研究LUM对于NK/T细胞淋巴瘤细胞克隆形成、凋亡、细胞周期、化疗药物敏感性等相关作用,以及对增殖和凋亡相关蛋白以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路的影响。
  3.进一步研究LUM对小鼠移植瘤生长、增殖和凋亡相关蛋白表达以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路的影响。
  内容:
  第一部分:LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的表达研究
  方法:
  1.利用免疫组化方法检测LUM、PCNA在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤及反应性增生淋巴结中的表达差异。
  2.分析在NK/T细胞淋巴瘤中LUM阳性表达率与临床病理参数的关系。
  3.分析在NK/T细胞淋巴瘤中LUM阳性表达率与治疗疗效之间的关系。
  结果:
  1.免疫组化结果显示LUM在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤组织中阳性表达率(25%)显著低于反应性增生淋巴结(79.2%),P<0.001。
  2.NK/T细胞淋巴瘤中LUM阳性表达率与患者年龄、性别、发生部位、临床分期、乳酸脱氢酶(LDH)水平均无明显关系(P>0.05)。LUM在PCNA弱表达的患者肿瘤组织中的阳性表达率明显高于PCNA强表达的患者肿瘤组织,即LUM可能与PCNA指数有密切的关系,P<0.05。
  3.NK/T细胞淋巴瘤中LUM的表达阳性率在有效组(CR+PR)(48.1%)明显高于无效组(SD+PD)(15.6%),P<0.05。
  第二部分:LUM对YTS细胞生物功能的影响及其分子机制研究
  方法:
  1.将LUM基因与慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro结合,构建慢病毒过表达载体plenti-LUM,并送公司测序。然后将病毒包装之后感染YTS淋巴瘤细胞,之后进行嘌呤霉素筛选稳定过表达LUM的LUM-YTS细胞。
  2.用Western blot检测LUM、增殖和凋亡以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白的表达量。
  3.细胞克隆形成实验检测LUM过表达对YTS淋巴瘤细胞克隆形成能力的影响。
  4.利用CCK-8实验检测LUM过表达对YTS细胞增殖能力的影响
  5.流式细胞仪检测LUM过表达对YTS细胞周期、细胞凋亡的影响。
  6.利用Transwell方法检测LUM过表达对YTS细胞侵袭能力的影响。
  7.CCK-8实验检测LUM过表达对YTS细胞阿霉素敏感性的影响。
  结果:
  1.pLenti-LUM慢病毒过表达载体菌落PCR和基因测序结果显示,其分子大小及序列与NCBI中的参考序列一致。表明LUM过表达慢病毒载体质粒pLenti-LUM构建成功。
  2.细胞克隆形成实验和CCK-8实验检测发现LUM过表达显著抑制YTS淋巴瘤细胞克隆形成和增殖能力。
  3.流式细胞仪检测发现LUM过表达可以明显促进YTS淋巴瘤细胞的凋亡,使细胞G1期阻滞。
  4.Transwell检测发现LUM过表达可以明显抑制YTS淋巴瘤细胞的侵袭。
  5.Western blot检测发现LUM过表达能促进促凋亡相关蛋白p53,Bax,caspase-3的表达,抑制抑凋亡因子Bcl-2和增殖相关蛋白CCND1、myc的表达。LUM过表达明显抑制淋巴瘤细胞中NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白NF-κB p65、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3的表达。
  6.LUM过表达能够明显增强YTS细胞对化疗药物ADM的敏感性。
  第三部分:LUM过表达对动物体内NK/T细胞淋巴瘤生长的影响研究
  方法:
  1.在BABL/nude雌性小鼠(裸鼠)右前肢皮下接种外源肿瘤细胞YTS、YTS-Con和YTS-LUM,构建淋巴瘤动物模型。接种后开始每隔三天测量小鼠移植瘤体积,32天后将移植瘤剥出称重。
  2.利用Western blot法检测各组小鼠移植瘤中LUM表达情况。
  3.用Western blot检测各组肿瘤组织中增殖和凋亡相关蛋白、NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白的表达。
  结果:
  1.对各组YTS荷瘤小鼠的肿瘤重量和体积检测发现,LUM过表达显著抑制肿瘤的生长。
  2.利用Western blot检测发现,与对照组相比,YTS-LUM组肿瘤组织中LUM蛋白表达显著增加。
  3.Western blot检测发现,与对照组相比,YTS-LUM组小鼠肿瘤组织中,促凋亡相关蛋白p53,Bax,caspase-3的表达量明显上升,而抑凋亡因子Bcl-2和增殖相关蛋白CCND1、myc的表达量却明显下降。
  4.与对照组相比,YTS-LUM组移植瘤组织中NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白NF-κB p65、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达量明显降低。
  结论:
  1.LUM在NK/T细胞淋巴瘤中表达量明显降低,且其表达与患者年龄、性别、发生部位、临床分期、乳酸脱氢酶(LDH)水平均无明显关系,与治疗疗效和PCNA指数有密切关系。
  2.细胞实验表明,LUM过表达可能通过调控NF-κB和JAK/STAT3信号通路,从而抑制淋巴瘤细胞增殖、克隆形成、侵袭,阻滞细胞G1期、促进细胞凋亡、增强细胞对化疗药物阿霉素的敏感性。
  3.动物体内实验进一步表明,LUM过表达可能通过调控NF-κB和JAK/STAT3信号通路,从而抑制小鼠移植瘤的生长。
[博士论文] 王琰
内科学(血液内科) 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:背景及目的:
  急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是在生物学上和临床上高度异质性疾病,中国AML发病率排名世界前列,在AML年轻患者中中国有较高的死亡率。AML的发病机制尚不完全清楚,阻碍了探索AML的新治疗方法的发展。微小RNA是一种新的短的非编码RNA分子。主要通过miRNA与靶mRNA的3'非编码端(3'-UTR)互补结合的方式进行,以阻碍靶mRNA的翻译或导致靶mRNA降解。因此,miRNAs被认为可能是基因表达的天然调节因子。最新的研究已经证明miRNAs是癌症诊断的潜在的和有希望的工具。一些研究表明microRNA-125b与白血病关系密切。本研究通过在急性髓细胞白血病细胞株Kg1a细胞和HL60细胞中转染microRNA-125b类似物,探讨microRNA-125b在AML中的生物学影响以及可能参与调控的信号通路和分子机制,并为AML治疗提供可能的新的治疗靶点。
  方法:
  1、人工合成microRNA-125b类似物及阴性对照,不同浓度分别转染人急性髓细胞白血病细胞株Kg1a细胞和HL60细胞,使其在急性髓细胞白血病细胞株中异常高表达。
  2、采用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)检测细胞增殖情况,细胞的侵袭能力应用Matrigel侵袭实验方法检测,应用流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡,采用Annexin v-FITC/PI法。
  3、蛋白印迹法(Western blot)检测过表达microRNA-125b对TNFα诱导NF-κB信号通路激活相关蛋白:IκB-α蛋白、磷酸化IκB-α蛋白以及胞浆、细胞核内核转录因子p65蛋白表达量变化。
  4、蛋白印迹法(Western blot)检测microRNA-125b过表达状态下细胞周期蛋白cyclinB、cdc-2、mdm-2及抗细胞凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白p53、Bax表达量的变化。
  5、所有实验至少重复三次,所有实验结果应用统计学处理以均数±标准差((x)±s)表示,实验数据应用SPSS10.0统计软件处理,分析两组间数据采用学生t检验法,分析三组及以上组间数据采用单因素方差分析(ANOVA),P值<0.05被认为有统计学意义。
  结果:
  1、转染microRNA-125b类似物后Kg1a细胞和HL60细胞内的microRNA-125b表达水平的改变。qRT-PCR检测结果显示,转染50nM、100nM microRNA-125b类似物及阴性对照48小时后,转染组细胞内microRNA-125b增高明显,较阴性对照组和空白组差异有统计学意义(P<0.001),阴性对照组与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。
  2、转染microRNA-125b类似物对Kg1a细胞和HL60细胞的增殖抑制作用。MTT法检测结果显示:转染microRNA-125b类似物(50nM、100nM)及阴性对照6小时,洗脱转染液,给予新鲜培养液继续孵育细胞48小时后,观察对细胞增殖抑制作用。结果显示,转染组较空白组、阴性对照组细胞增殖明显受到抑制差异,有统计学意义(P<0.01),阴性对照组与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。并且随着转染浓度增大,对细胞增殖抑制作用更明显。
  3、转染microRNA-125b类似物对Kg1a细胞和HL60细胞的侵袭能力的影响。Matrigel侵袭实验结果显示:转染组与阴性对照组和空白对照组细胞迁移率明显下降(P<0.05),阴性对照组与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。
  4、转染microRNA-125b类似物对Kg1a细胞和HL60细胞的细胞周期及细胞凋亡的影响。流式细胞仪检测结果显示:转染组处在G2/M期细胞的比例和凋亡细胞比例较空白组及阴性对照组明显提高,差异有统计学意义(P<0.05),且50nM转染组与100nM转染组间差异有统计学意义(P<0.05)。
  5、在Kg1a细胞和HL60细胞中转染microRNA-125b类似物对TNFα诱导的NF-κB信号通路激活的影响:Western blot结果证实,应用TNFα处理细胞后p-IκB-α增加,IκB-α减少,核内p65增加,胞浆p65减少。在应用TNFα处理细胞细胞之前转染microRNA-125b类似物(50nM、100nM)及阴性对照,转染组较阴性对照组和单纯TNFα处理组,p-IκB-α减少,IκB-α增多,核内p65减少,胞浆中p65增加,差异有统计学意义(P<0.05),且50nM转染组较100nM转染组,差异有统计学意义(P<0.05)。
  6、在HL60细胞中转染microRNA-125b类似物对NF-κB信号通路调节的下游的与细胞周期及细胞凋亡相关基因表达的影响:Westem blot结果显示,受NF-κB信号通路调控的细胞周期G2/M期相关蛋白cyclinB、cdc-2、mdm-2表达量下降,促凋亡基因Bax、p53表达量增加,抑制凋亡基因Bcl-2表达量减少,转染组与阴性对照组和空白组比较有差异,并有统计学意义(P<0.05),阴性对照组与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。
  结论:
  1、体外实验证实miR-125b可以抑制急性髓细胞白血病细胞的增殖和侵袭及迁移能力,发生G2/M期阻滞,促进急性髓细胞白血病细胞的凋亡。
  2、miR-125b能够有效抑制急性髓细胞白血病Kg1a和HL60细胞增殖,促进凋亡是通过抑制NF-κB信号通路。
  3、我们的研究为miR-125b在急性髓细胞白血病生物治疗靶点提供了依据。
[硕士论文] 郑帅奎
免疫学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)是成人最常见的急性白血病,是致命的血液系统肿瘤。随着癌变造血祖细胞的无限增殖、比例变大,正常的造血功能明显不足,且临床表现多样。尽管在药物化疗方面取得了巨大进展,AML患者的复发率还是居高不下,总体5年生存率仍然很差,约为30%-40%。白血病细胞发生化疗耐药是治疗效果不理想,导致不良结局的主要原因。因此,AML患者的治疗需要替代疗法,需要寻找新的治疗靶位。
  microRNA(miRNA)是一类在物种间高度保守的非编码短链RNA,大小约为19-25个核苷酸。miRNA可以作用于靶基因mRNA的3'UTR非翻译区,在转录后水平负向调控基因的表达,导致mRNA的降解或者抑制其翻译。研究表明,很多miRNA在AML患者体内表达异常,并参与了AML的发病和疾病进展。本研究的目的是了解miR-495在AML患者体内的表达情况,及其对人类白血病细胞系HL-60细胞增殖和凋亡的影响。
  方法:
  1.从2015年3月到2016年4月期间在河南省人民医院收集了22例血液科AML患者的骨髓细胞标本作为病例组,收集妇产科22例健康足月婴儿顺产时的脐血标本作为对照组,分离单个核细胞后,于-80℃条件下储存。
  2.对病例组和对照组标本进行qRT-PCR检测,观察miR-495和Bmi-1mRNA的表达情况,并用SPSS21.0对病例组miR-495和Bmi-1mRNA的表达水平进行Pearson相关性分析。
  3.合成miR-495mimic和miR-495scramble,用脂质体转染方法将二者分别转染进入人类白血病细胞系HL-60细胞中。转然后细胞分为三组:miR-495组,转染miR-495mimic;NC组,转染miR-495scramble;Blank组,仅加入脂质体。
  4.用CCK-8方法对三组细胞进行增殖影响检测,观察在HL-60细胞中上调miR-495的表达对其增殖的影响。
  5.用流式细胞术对三组细胞进行凋亡检测,观察上调miR-495的表达对HL-60细胞凋亡率的影响。
  6.用Targetscan和MicroCosm生物信息学网站对miR-495的靶基因进行分析预测。
  7.构建包含Bmi-13'UTR区的野生型与突变型的双报告基因重组载体,将其与miR-495mimic或miR-495scramble共转染入人类白血病细胞系HL-60细胞中,对荧光素酶的活性进行检测。
  8.合成si-Bmi-1和si-NC,用脂质体转染方法将其转染入HL-60细胞中,将转染si-Bmi-1的细胞作为si-Bmi-1组;将转染si-NC的细胞作为si-NC组。
  9.分别用qRT-PCR和Western blot对Blank组,miR-495组,NC组,si-Bmi-1组和si-NC组进行Bmi-1mRNA和其蛋白相对表达量的检测。
  10.用CCK-8和流式细胞术方法分别对5组细胞进行细胞增殖情况和凋亡率的检测,探究miR-495对Bmi-1表达调控的作用。
  结果:
  1.AML患者骨髓细胞中miR-495的表达水平明显低于对照组脐血标本(P<0.05),病例组Bmi-1mRNA的表达水平明显高于对照组脐血标本(P<0.05),并且病例组miR-495的表达水平与Bmi-1mRNA的表达水平呈显著负相关,相关系数为r=-0.746(t=-5.01,P<0.01)。
  2.CCK-8方法实验结果显示,miR-495组HL-60细胞在24h、48h、72h、96h的450nm吸光度值显著低于Blank组和NC组(P<0.05)。
  3.流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,与Blank组和NC组相比,miR-495组HL-60细胞的凋亡率增高,且差异有统计学意义(P<0.05)。
  4.双荧光素酶报告实验结果表明,Bmi-1是miR-495作用的靶标。
  5.转染si-Bmi-1后的CCK-8实验结果表明,si-Bmi-1组细胞在24h、48h、72h、96h处的450nm吸光度值均低于Blank组、NC组和si-NC组,且差异具有显著性(P<0.05),而和miR-495组没有显著差异(P>0.05)。
  6.转染si-Bmi-1后的流式细胞术结果显示,si-Bmi-1组HL-60细胞的凋亡率显著高于Blank组、NC组和si-NC组(P<0.05),其与miR-495组的凋亡率没有显著差异(P>0.05)。
  结论:
  1.急性髓系白血病患者骨髓细胞中miR-495的表达水平异常下降,Bmi-1的表达水平异常升高。
  2.在人类白血病细胞系HL-60细胞中异常表达升高的miR-495通过靶向作用于Bmi-1负向调控Bmi-1的表达,从而抑制白血病细胞的生长,并促进白血病细胞的凋亡。
[硕士论文] 韩琳琳
生理学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:[目的]
  淋巴瘤在我国是比较常见的恶性肿瘤之一,近几年来它的发病率呈上升趋势,尽管临床经过一系列的治疗可以获得一定的成效,但依然存在难治和复发的病例。淋巴瘤的预后不良,所以分子靶向治疗的研究极其重要。超保守RNA是一种新的长链非编码RNA,近几年来许多人研究证明超保守RNA在多种肿瘤的发生、转移、侵袭以及预后有着相当密切的关系。本课题主要研究uc.133在小鼠和人的B细胞淋巴瘤与其正常相关组织中的表达情况,并研究uc.133在B细胞淋巴瘤发生发展中的作用及机制。
  [方法]
  1.采取4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen,4-OHT)分别激活p530min、10min、15min、30min的小鼠的肿瘤组织,分别用qRT-PCR验证前期基因芯片筛选出的4个UCRs的表达水平。并对其在小鼠B细胞淋巴瘤与小鼠正常骨髓B细胞中的表达情况进行比较,筛选差异性表达比较明显的UCR。
  2.构建差异性表达比较明显的uc.133的逆转录病毒表达质粒及MSCV空载体表达质粒,然后分别感染小鼠B细胞淋巴瘤38B9细胞株,人B细胞淋巴瘤Romas细胞株,嘌呤霉素筛选后使细胞感染率达90%以上,使uc.133在小鼠和人的B细胞淋巴瘤细胞株中过表达。
  3.体外检测38B9细胞与Romas细胞过表达uc.133后的增殖及凋亡情况;体内将过表达uc.133的细胞注射至BALB/c小鼠和裸鼠皮下,观察肿瘤的生长情况,一般两周左右取出小鼠肿瘤组织做Western Blot检测uc.133基因序列所在的宿主基因RSRC1蛋白的表达及病理实验。
  [结果]
  1.qRT-PCR检测显示uc.133、uc.268、uc.316A、uc.95在p53激活0min、10min、15min、30min后的表达水平上调,而其在小鼠B细胞淋巴瘤与小鼠正常骨髓B细胞中的比较,表达具有差异性(p<0.05),其中uc.133下调最明显;
  2.将差异性最明显的uc.133质粒及MSCV空载体转染293T细胞包装得到病毒,然后病毒分别感染38B9细胞和Romas细胞,嘌呤霉素筛选后使细胞感染率达96%。
  3.体外检测38B9细胞和Romas细胞过表达uc.133后与对照组比较,细胞增殖缓慢,凋亡增多。体内检测到38B9细胞过表达uc.133后肿瘤组织与对照组比较明显变小,而Romas细胞过表达uc.133后未形成肿瘤。Western Blot检测到38B9细胞与Romas细胞过表达uc.133后RSRC1的表达减少。
  [结论]
  uc.133在小鼠B细胞淋巴瘤发生发展中起着抑癌作用。
[硕士论文] 许月
内科学(血液学) 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  慢性粒细胞白血病(CML)是一种免疫参与的恶性肿瘤克隆性疾病,调节T细胞(Treg细胞)作为一种负性调控免疫的细胞,在慢性粒细胞白血病患者不同病程时体内的表达不同,而其中CD4+CD25+调节T细胞在肿瘤性疾病中发挥重要的作用,研究CD4+CD25+调节T细胞在CML中的表达,可以帮助我们从免疫角度为增加CML治疗疗效提供有效的临床治疗方案。
  方法:
  收集2016年7月至2017年2月就诊于苏北人民医院的45例CML患者以及10例健康人的外周血,利用流式细胞技术,分析健康人与CML患者以及CML患者不同病程时外周血中CD4+CD25+调节T细胞所占淋巴细胞的比例,比较CD4+CD25+Treg细胞的表达水平的差异以及其所代表的临床意义。
  结果:
  1.CD4+CD25+调节T细胞占淋巴细胞比例与CML外周血中的BCR-ABL融合基因拷贝数存在正性相关关系(r=0.300998,P<0.05)。
  2.与正常对照组相比,初诊的CML患者外周血中CD4+CD25+ Treg细胞数量占淋巴细胞比例明显增高,两组存在统计学差异(P<0.05),而经过治疗后复查的CML患者较初诊患者外周血中的CD4+CD25+Treg细胞明显下降,两组存在统计学差异(P<0.05),且治疗后达到主要分子学缓解(MMR)较未达到MMR的患者下降更为明显,两组存在统计学差异(P<0.05)。
  3.在不同分期中,急变期(AP)患者外周血中的CD4+CD25+Treg细胞明显高于慢性期(CP)及加速期(BP)患者,存在统计学差异(P<0.05),但是慢性期和加速期患者外周血中CD4+CD25+ Treg细胞占淋巴细胞比例无明显差别,两组无统计学差异(P>0.05)。
  4.初诊时根据SOKAL评分进行危险分层,低危组与中危组患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞数量无明显统计学差异(P>0.05),低危组、中危组均明显低于高危组外周血中的CD4+CD25+Treg细胞,存在统计学差异(P<0.05)。
  结论:
  CML患者外周血中的CD4+CD25+Treg频率与患者残留病灶及分期、危险分级存在正性相关性,提示CD4+CD25+Treg细胞参与CML患者体内的肿瘤免疫抑制,清除CML患者外周血中的Treg细胞可能可以协助从免疫角度增加CML疗效。
[硕士论文] 徐佩
内科学(血液病学) 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  课题通过建立淋巴瘤Balb/C小鼠模型,观察荷瘤模型鼠外周血炎症因子、凝血指标、血小板活化指标和免疫指标的水平变化,及瘤体组织中肿瘤相关巨噬细胞的表达,研究肿瘤免疫炎性微环境与高凝状态的关系,并初步探讨中药南蛇藤素干预淋巴瘤的治疗机制。
  方法:
  1、本课题选用具有正常免疫功能的Balb/C小鼠,建立B细胞淋巴瘤荷瘤模型。将25只6-8周龄的Balb/C小鼠随机分为对照组(n=5)、荷瘤干预组(n=10)及荷瘤未干预组(n=10)。荷瘤组皮下注射浓度为2×106/0.2 mL的38B9细胞,对照组予0.2 mL PBS缓冲液皮下注射;荷瘤第14 d时进行MRI和B超等影像学检查,确认小鼠肿瘤形成;荷瘤干预组予以南蛇藤素灌胃干预10d,观察小鼠若处在濒死状态,及时处死小鼠,取肿瘤组织行HE及免疫组化染色。2、分别于荷瘤1d、14 d、21 d经小鼠眼球内眦静脉取血,采用ELISA法检测血浆中CRP、TNF-α、IL-6、IL-10、TF、vWF等水平。3、采用流式细胞术检测小鼠外周血调节性T细胞及B细胞数量以及P选择素、GPⅡ bⅢa等血小板活化指标的表达水平。4、采用免疫组化法检测CSF-1R和CD68在荷瘤小鼠瘤组织中的表达。
  结果:
  1、荷瘤后14 d Balb/C小鼠皮下瘤块形成,成瘤率100%,病理特征为淋巴瘤细胞弥漫分布,且瘤块大量表达CD19。
  2、采用38B9淋巴瘤细胞成功荷瘤Balb/C小鼠,与荷瘤前相比,荷瘤组小鼠外周血CRP、TNF-α、IL-6水平均上升(P<0.05),而IL-10水平降低(P<0.05);荷瘤组小鼠血浆TF、vWF水平上升(P<0.05);淋巴瘤荷瘤小鼠CRP、TNF-α、IL-6分别与TF、vWF水平呈正相关,IL-10与TF、vWF水平呈负相关。
  3、南蛇藤素干预后,小鼠肿瘤生长缓慢,平均生存期明显延长(P<0.05),且瘤重和瘤体积明显小于未干预组(P<0.05);干预组小鼠外周血CRP、TNF-α、IL-6等促炎因子水平下降,而IL-10等抑炎因子水平上升(P<0.05);血浆TF水平下降(P<0.05),vWF有下降趋势;CD41/CD62p明显降低(P<0.05),而CD41/CD61无明显变化;干预组小鼠瘤组织CSF-1R、CD68表达阳性率明显下降(P<0.05)。
  结论:
  1、Balb/C小鼠B细胞淋巴瘤动物模型成功建立。
  2、淋巴瘤中炎性因子与肿瘤高凝状态密切相关。
  3、南蛇藤素可通过降低炎性因子分泌、改善免疫炎性微环境、控制高凝状态等途径有效干预肿瘤进程。
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