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[博士论文] 特发叶·沃酷
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本论文试验研究由三部分组成。第一部分分析肝配蛋白A5(EphrinA5)在小鼠颗粒细胞中的生理作用和信号转导途径;第二部分探讨肝配蛋白A5的全基因组效应;第三部分分析鼠源肝配蛋白A5及其受体蛋白结构。
  实验Ⅰ:肝配蛋白A5对小鼠原代颗粒细胞凋亡和增殖的调控作用及新的信号通路
  最新研究结果表明,肝配蛋白A5除了作为神经发生因子发挥生理作用外,还在雌性小鼠繁殖过程中具有重要生物学作用,但在颗粒细胞(GC)中的生物学作用尚不清楚。GC是研究卵泡发育基因功能和调控网络的理想模型。本研究结果表明,肝配蛋白A5的表达在各年龄组小鼠GC中有差异。干扰肝配蛋白A5基因引起mRNA水平和蛋白质水平表达下调,同时抑制E游受体EphA5、Epha3、Epha8和Ephb2的mRNA表达。在体外水平,肝配蛋白A5的下调表达抑制小鼠GC细胞凋亡过程。为了揭示肝配蛋白A5在调控GC凋亡中的作用,本研究进一步分析凋亡因子mRNA和蛋白水平的表达情况,发现Bax、Tnfα、Caspase-8和Caspase-3表达下调,而Bcl-2表达上调。这些结果表明,肝配蛋白A5通过Caspase-8介导的内源性途径参与细胞凋亡。进一步敲低肝配蛋白A5的表达水平,引起Pcna表达上调,随后激活p-Akt和p-ERK途径来,促进GC增殖。此外,抑制肝配蛋白A5可增强BMH15、VEGFA和雌二醇mRNA表达水平,并且在不影响孕酮表达水平的情况下抑制GDF9表达,说明其参与卵泡血管生成和卵母细胞发育调控。综上所述,肝配蛋白A5调节雌性小鼠卵泡颗粒细胞凋亡、增殖和类固醇生成过程,因此是雌性生育障碍的潜在治疗靶标。
  实验Ⅱ:小鼠颗粒细胞肝配蛋白A5干扰后的转录组分析
  肝配蛋白A5是一种肝配蛋白-乙二醇苯醚(ephrin-Eph)信号分子,主要是神经元因子。但最近的研究表明其生理作用超过了神经发生,其在雌性生殖功能中尤其在卵泡发育中的作用日益受到关注。肝配蛋白A5与繁殖相关的研究处于初始阶段,目前尚未从转录组水平报道肝配蛋白A5在卵巢颗粒细胞中的作用。本研究研究利用肝配蛋白A5的siRNA处理小鼠颗粒细胞,然后进行转录组测序(RNA-Seq),以探索肝配蛋白A5干扰后颗粒细胞的全基因组图谱。RNA-Seq分析结果表明,在小鼠颗粒细胞中检测到16389个基因,与阴性对照相比,siRNA处理的细胞中有208个基因失调。其中,149个基因下调,59个基因上调。失调的基因主要富集在细胞外过程、钙结合和细胞粘附。此外,它们主要参与了PI3K-Akt信号转导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用、局灶性粘附和Rap1信号转导途径等过程。总体而言,干扰肝配蛋白A5改变了调节卵泡发生的十多种基因的转录水平、调控网络和生物学过程。本研究为肝配蛋白A5在神经生物学外的雌性生殖中的作用研究提供了新的线索和研究思路。
  实验Ⅲ小鼠肝配蛋白A5及其受体的结构分析
  蛋白质结构对于细胞功能至关重要,因此结构的缺陷可能导致细胞功能紊乱。肝配蛋白A5受体属于介导细胞通讯过程中最大的一类酪氨酸激酶家族。通过NCBI和蛋白质资源数据库中检索肝配蛋白A5(Efna5)、肝配蛋白A5受体3(Epha3)、肝配蛋白A5受体5(Epha5)和肝配蛋白A5受体B2(Ephb2)的氨基酸序列,评价和鉴定其蛋白质结构并预测候选蛋白的三维(3D)结构。候选蛋白预测结构存在轻微的构象变化,采用ProSA软件3D分数进一步分析预测模型的精度。Efna5、Epha3、Epha5和Ephb2的Verify3D分数分别为92.75%、94.77%、89.87%和85.96%,说明预测模型结构在可接受质量范围内。蛋白质结果无序性分析表明Efna5、Ephb3和Ephb2分别存在32.89%、25.4%和27.07%的残基紊乱。配体结合位点分析结果表明,Efna5、Epha5、Epha3和Ephb2分别存在3、5、4和2个不同的氨基酸残疾数目的配体分子。此外,预测到候选蛋白非结合区的3个结合位点。距离波动分析发现一些氨基酸残基在下降和上升的波动中均存在。应用互相关函数进一步分析发现这些候选蛋白均存在突变结构。相互作用和通路分析发现鉴定的40个蛋白中有15个蛋白不属于肝配蛋白A5受体家族。CpG岛分析结果表明,候选靶蛋白存在甲基化位点,其中Ephb2预测分数最高。计算机模拟分析靶蛋白的3D结构,为进一步结构分析提供直观信息。此外,候选蛋白一些已经证实结合位点区域为分子嵌合和新药物分子设计提供有力的证据。
[硕士论文] 张杨
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:细丝蛋白B(Filamin B,FLNB)由第3号常染色体上的基因编码,是细胞骨架蛋白,它与肌动蛋白交联形成三维细胞骨架网络并维持细胞形态,在细胞中参与多种生理生化活动,包括转录调控和细胞增殖等。近年来的研究表明,细丝蛋白A和细丝蛋白B在肿瘤发生、骨骼疾病、细胞迁移以及粘附过程中起关键作用;本实验室以前的研究表明,细丝蛋白A(FLNA)能够抑制RNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)指导的基因转录,并且通过细胞特异性的调节方式抑制RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)指导的基因转录,进而抑制细胞增殖。由于FLNB和FLNA都属于细丝蛋白家族,初级结构上具有80%的同源性,且在细胞内共定位,因此,在本课题中,我们试图了解FLNB是否也参与PolⅠ和PolⅢ基因转录过程并影响细胞的增殖和迁移功能。
  为了完成以上研究目标,首先,我们制备了FLNB shRNA慢病毒表达系统,利用制备的慢病毒表达颗粒侵染293T和HeLa细胞并筛选出FLNB shRNA稳定表达细胞系。利用RT-qPCR分析这些细胞系中PolⅠ和PolⅢ指导的基因转录,结果表明,FLNB敲低能够显著降低所检测的一部分基因的RNA表达水平;提示FLNB是PolⅠ和PolⅢ指导的基因转录所需要的。为了确定这一发现,利用293T和HeLa细胞过表达FLNB,结果表明,FLNB过表达显著增加核糖体RNA,U6snRNA以及7SL RNA表达水平。这些结果证明FLNB是维持PolⅠ和PolⅢ正常基因转录所必需的。由于FLNA敲低能促进细胞中PolⅠ和PolⅢ基因转录,因此,在FLNB敲低的基础上再次敲降FLNA是否挽救因FLNB敲低导致的基因表达抑制,利用FLNB-FLNA双敲低细胞系以及qPCR方法,数据表明,一部分受FLNB敲低抑制的基因的表达水平有不同程度的上调。这一结果提示FLNB与FLNA在调控PolⅠ和PolⅢ基因转录功能上起着相反的作用。
  由于PolⅠ和PolⅢ基因转录和细胞增殖密切相关,因此,我们试图确定FLNB表达水平的改变是否影响细胞增殖。通过对上述细胞株在不同时间进行细胞计数和MTT实验发现,FLNB敲低抑制细胞增殖,而FLNB过表达则促进细胞的增殖。FLNB是否调节细胞的迁移还不清楚,因此我们通过细胞划痕和Transwell实验分析FLNB表达水平的改变对上述细胞迁移能力的影响。结果表明,FLNB敲低抑制细胞迁移,而FLNB过表达促进细胞迁移。进一步对FLNA敲低细胞系及FLNB-FLNA双敲低细胞系的增殖和迁移功能的分析表明,在293T、HeLa细胞中,FLNA与FLNB在调控细胞增殖和迁移功能上起相反的作用;FLNA抑制细胞增殖和迁移,而FLNB促进细胞增殖和迁移。与FLNB敲低细胞系相比,虽然FLNB-FLNA双敲低细胞系的增殖水平表现出一定程度升高,但双敲低细胞系的迁移能力则表现出的下降趋势。这一结果显示,当同时敲低293T、HeLa细胞中的FLNB后再敲低FLNA,FLNA在细胞迁移方面起正调控作用,提示FLNA对细胞迁移的调节作用依赖于FLNB的表达。综合以上数据,本课题发现,FLNB是维持细胞PolⅠ和PolⅢ正常基因转录、细胞增殖和细胞迁移所必需的,而FLNA对细胞迁移的调节取决于FLNB是否表达。这些发现对我们进一步探索FLNB对基因转录和细胞迁移的调节机制奠定了基础。
[博士论文] 张浩
细胞生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:等离子体广泛存在于宇宙中。地球环境中也存在丰富的等离子体及现象,如雷电产生的等离子体、电离层、等离子体发射的极光等,这些环境等离子体对地球生态产生重要的影响。近年来人类的生产活动产生的等离子体日渐增多,不仅广泛用于工业(电子加工、材料、光源等)和在生产中产生(如高压长距离输电线路等),而且发展到用于农业、环境治理,且在生态环境和生物医学领域具有潜在的重要应用前景。
  大气压放电冷等离子体在室温状态下具有极高的化学活性、可在开放环境中工作,逐渐被应用于生物领域,如公共场所灭菌、空气净化、污水处理、生物育种、生物医学等领域,并成为目前等离子体在和生物、医学交叉学科的一个研究热点。在等离子体应用于生物、医学的初期研究首先从物理学层面研究不同类型的低温冷等离子体对多种微生物的杀灭效果以及对人体细胞的凋亡效应。一些研究者随后开始尝试从生物学角度探究等离子体的作用机理,并且普遍认为等离子体引起的活性氧(ROS)在等离子体诱导的多种生物学效应中起到关键作用。但关于等离子体与微生物和细胞之间的相互作用机制仍不清晰。现有研究中从分子水平探究等离子体作用机理的尝试很少,尤其是功能蛋白的结构变化、表达水平变化等方面的研究匮乏。基于目前的研究现状,本文从分子学角度初步探究等离子体与蛋白质、细菌和细胞之间的相互作用过程。一方面深入研究了冷等离子体对体外功能大分子的影响,给出可能的分子作用机制,另一方面探索等离子体对细胞内功能分子的影响,并初步从分子水平探究等离子体诱导的灭菌以及细胞凋亡的机制。
  第一部分,本文主要对低温等离子体诱导溶液中蛋白质的变性及相关机理进行了研究。本文选用乳酸脱氢酶(LDH)作为蛋白分子模型,利用介质阻挡放电等离子体,以氦+氧(0.5%)为工作气体,对乳酸脱氢酶溶液进行处理。通过检测等离子体引起的几种长寿命ROS的含量以及处理前后乳酸脱氢酶的活力和结构变化,分析了等离子体诱导乳酸脱氢酶变性的可能机理。实验结果表明一定剂量的等离子处理可以诱导体外生物功能蛋白发生部分变性,而且蛋白变性依赖于等离子体产生的ROS、尤其是长寿命ROS的作用。
  第二部分,本文探究了等离子体对膜蛋白和胞内可溶性蛋白的影响。该论文以膜蛋白YgaP和胞内蛋白Swc-7作为分子模型,通过基因重组和诱导表达技术,将模型蛋白在大肠杆菌内过度表达,并提纯等离子体处理前后的细菌内的模型蛋白,通过对模型蛋白的结构变化分析,证实了等离子体同样可以影响细菌体内生物分子的结构,且这种等离子体诱导的结构改变对放置时间存在依赖性,等离子体处理后,膜蛋白比胞内蛋白更早受到影响。另外通过分析等离子体对大肠杆菌的杀灭效率,我们推断出细菌膜蛋白的改变或损伤在等离子体诱导的灭菌过程中起主导作用。
  第三部分,本文探究了不同细胞周期阶段的HeLa和MCF-7细胞对低温等离子体的敏感差异性。结果表明等离子体可以诱导细胞形态变化、抑制增殖能力、促进凋亡,尤其S和M相的HeLa和MCF-7细胞比G1和G2相细胞更易受到等离子体的损伤;蛋白质表达水平分析结果等离子体诱导的S和M相的HeLa和MCF-7细胞凋亡受caspase家族蛋白的调控。另外,等离子体处理可以诱导不同周期阶段的HeLa和MCF-7细胞内ROS积累,而ROS清除剂NAC可以显著抑制等离子体诱导的ROS生成,并减弱等离子体的抗癌效应。
[硕士论文] 查双凤
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:整合素是脊椎动物细胞表面一类非常重要的细胞黏着分子,由α、β两个亚基构成。整合素通过与胞内骨架蛋白的相互作用介导细胞与胞外基质间的黏着。整合素不仅是细胞外基质与细胞内骨架之间的物理连接桥梁,同时是细胞信号转导中的重要组分。由整合素介导完成的一系列信号事件是细胞了解环境并作出反应的重要途径之一。Talin蛋白是重要的整合素激活因子,能够结合并激活整合素。同时作为连接细胞骨架与跨膜受体整合素的桥梁,在细胞粘附、迁移等过程中发挥着关键的调控作用。
  此研究是在实验室前期研究的基础上进行的延伸和拓展。实验室研究组在2012年解析了Talin-F2F3/R9复合物晶体结构。该结构显示,在自抑制状态下,Talin上的整合素结合位点F3与其尾部片段R9(1654-1822 a.a.)结合,此时整合素不能被活化。这一自抑制复合物结构为我们认识Talin的自抑制调控机制提供了新的视角,但是仍然无法揭示Talin自抑制状态下的全长结构。
  作为一个270 kD的蛋白,Talin除了F3和R9以外的部分在自身的活化过程中如何协同发挥作用,至今仍是未知的。此外,Talin蛋白可以通过C端最后一个α螺旋形成二聚体,而Talin蛋白到底是单体内自抑制还是二体内的两个分子互相抑制,目前不清楚。我们从体外重组表达和天然组织提取两个方面着手,以获得高质量的Talin蛋白样品。考虑到Talin蛋白整体难于结晶,我们尝试结合负染色技术和冷冻电镜三维重构的方法,获得Tlin蛋白处于自抑制状态下的整体结构。原核表达的Talin蛋白在负染电镜下观察蛋白状态不均一。我们通过结合生物交联剂和密度梯度离心的方法,蛋白状态的均一性得到了很大程度的提高,负染电镜图片质量较高,且图像衬度高,蛋白颗粒明显。但遗憾的是并未得到高质量的冷冻电镜图片。天然组织提取方面,我们采用硫酸铵沉淀法将大量粗制剂中的部分目的蛋白沉淀下来。再结合各种分离能力不同的阴离子交换柱、分子筛、疏水柱、阳离子交换柱,最终得到了较为纯净的Talin蛋白样品,负染电镜下能够看到蛋白颗粒。
[博士论文] 杨玲娜
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:特异性的RNA-蛋白质相互作用在基因表达调控过程中扮演着重要的角色,包括转录的调控,RNA加工和运输,mRNA降解和翻译的调控等。RNA结合蛋白通常都是通过RNA结合结构域来与他们的RNA靶标发生相互作用。主要的RNA结合结构域包括双链RNA结合结构域(dsRBD),RNA识别基序(RRM),锌指(ZnF)以及核不均一核糖核酸蛋白K同源结构域(KH)等。
  KH结构域最早是在核不均一核糖核酸蛋白K中发现的。KH结构域广泛存在生物三域系统中,也是最丰富的RNA结合结构域之一。KH结构域通常都是以多重拷贝的形式存在于同一个蛋白质中,共同识别RNA靶标。这种串联识别RNA靶标的方式不仅可以提高蛋白质-核酸的结合亲和力,还可以提高识别特异性。KH结构域大约由70个氨基酸残基组成,这些氨基酸残基折叠形成三段α螺旋和一个由三个反平行的β-strand的β-sheet,并且这个β-sheet位于三段α螺旋的相对面。根据拓扑学排列的不同,KH结构域可以分为Ⅰ型和Ⅱ型两类,分别存在于真核生物蛋白质中和原核生物蛋白质中。Ⅰ型和Ⅱ型KH结构域都会形成一个疏水的裂缝,可以容纳4个非配对的核苷酸。根据文献报道知道,包含KH结构域的蛋白质行驶多种多样的细胞功能,并且蛋白质的KH结构域与RNA靶标之间的识别是其发挥调控功能的保证。
  线虫MEX-3蛋白质包含两个KH结构域,是包含KH结构域的蛋白质家族成员之一。根据文献报道,MEX-3是线虫早期胚胎正常发育和保持生殖细胞全能性所必需的。随后,在人和鼠中也发现了线虫MEX-3的同源蛋白质(MEX-3A,-3B,-3C和-3D)。哺乳动物的MEX-3蛋白质与线虫MEX-3蛋白质一样,都含有两个RNA结合的KH结构域,除此之外,他们的C端还包含一个具有E3泛素蛋白连接酶活性的RING结构域。这四个哺乳动物的MEX-3蛋白质与线虫MEX-3蛋白质一样,参与许多转录后调控。其中,MEX-3C已经被证明了与许多疾病的发生相关,包括高血压,能量代谢,免疫应答和癌症等。虽然许多研究证明了MEX-3C参与许多mRNA的翻译调控,但是MEX-3C是直接地或者间接地结合其RNA靶标并不清楚。在报道的MEX-3C调控的mRNA中,HLA-A2mRNA是目前唯一被证明了的与MEX-3C直接结合的mRNA。MEX-3C结合HLA-A2mRNA的3'非编码区,抑制该mRNA的翻译,此外,当RING结构域存在时,MEX-3C的结合还会诱导HLA-A2mRNA发生降解。然而,对于MEX-3C抑制mRNA翻译和诱发mRNA降解的分子机制,以及MEX-3C识别的RNA序列特异性并不清楚,需要进一步研究。
  在本论文工作中,我们解析了人源MEX-3C KH1-GUUUAG和KH2-CAGAGU两个复合物的晶体结构。基于结构分析,我们构建了一系列蛋白质丙氨酸突变体,通过等温量热滴定实验揭示了稳定RNA-蛋白质相互作用的关键的氨基酸残基。此外,我们还鉴定了MEX-3C KH结构域识别的RNA基序(hMRE),并且证明了HLA-A2mRNA的3'非编码区中含有该RNA基序。最后,通过荧光偏振实验,我们证明了人源MEX-3C K同源结构域可以高亲和力地结合存在于HLA-A2mRNA的3'非编码区的hMRE。
[硕士论文] 万定云
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:生物体由蛋白质、DNA、RNA等生物大分子组成,这些生物大分子在生物体各种调控通路中相辅相成,共同维持生命体的正常运转。它们主要通过DNA与RNA、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA、蛋白质与蛋白质相互作用进行生物信息的传递,最终完成生物体的一系列活动。
  其中,秀丽隐杆线虫MEX-3蛋白质的KH结构域与拟南芥PUF类蛋白质APUM5都是通过与mRNA的3'不翻译区相互作用,进而激活或抑制mRNA的翻译过程,调控整个生命进程。而斑马鱼精氨酸甲基转移酶PRMT9通过修饰某些蛋白质精氨酸的甲基化,使甲基化的蛋白质某种功能被激活或被抑制,进而影响生物体一系列下游调控过程。
  MEX-3蛋白质在秀丽隐杆线虫的P granule中被发现,具有串联的KH结构域,它通过结合RNA调控生殖细胞系全能干细胞的更新及早期胚胎发生时期细胞的分化。PUF类蛋白质存在于多种生物体中,拟南芥APUM5通过其PUF结构域结合病毒基因组从而实现自我防御的功能。而精氨酸甲基转移酶PRMT9通过甲基化剪接因子参与选择性剪接的相关调控。通过研究蛋白质与RNA、蛋白质与蛋白质作用的结构基础,能帮助我们进一步的了解生物体中各种调控过程的分子机制。
  我们主要利用大肠杆菌体外表达了秀丽隐杆线虫MEX-3 KH结构域、拟南芥APUM5 PUF结构域,昆虫细胞体内表达了精氨酸甲基转移酶PRMT9。通过NTA亲和层析柱、Hiload 16/60 Supdex 75/200、MonoS/Q等分离纯化手段获得纯度较高、状态良好的目的蛋白质。同时,我们也使用了核磁共振技术、动态光散射实验观测蛋白质状态。并采用等温滴定量热法验证了目的蛋白质与RNA的相互作用,由pull down实验验证了精氨酸甲基转移酶与SF3B2剪辑因子的相互作用。最后,通过晶体学实验筛选到拟南芥APUM5 PUF类蛋白质与烟草黄瓜花叶病毒的3 'UTR区RNA序列的晶体,但是由于晶体较小,分辨率较低,目前正在优化中。
[博士论文] 杨帆
生理学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:G蛋白偶联受体(GPCR)可以通过G蛋白及Arrestin将细胞外的刺激转变为细胞内信号。在这个过程中,G蛋白主要是通过调节细胞内第二信使的水平来发挥作用的;而Arrestin则是通过招募不同的下游蛋白,使受体发生脱敏或启动Arrestin自身的信号转导途径。最近的一些研究发现,GPCR的C末端磷酸化短肽或者是GPCR受体与Arrestin结合后都能够引起Arrestin发生较大的构象变化。在最近解析出的V2R受体磷酸化的C末端短肽(V2Rpp)与β-arrestin-1的复合物晶体结构中发现,V2Rpp的结合能够导致β-arrestin-1的N端结构域和C端结构域发生较大的旋转。通过电镜技术和氢氘交换质谱方法发现,当β2AR与β-arrestin-1结合后同样可以促使Arrestin发生较大构象变化。这些研究暗示Arrestin结构上的可塑性可能是其发挥不同功能的基础。
  然而该研究领域仍有一些重要的问题至今没有得到解决。其中,介导GPCR下游信号途径的关键因子只有20个G蛋白和4个Arrestin分子,它们是如何实现人类基因组所编码的800多个G蛋白偶联受体所具有的显著不同的功能?
  在本文的研究中,利用基因密码子扩展技术和19F-NMR方法研究了Arrestin与GPCR的C末端磷酸化短肽的相互作用,提出了Arrestin对GPCR的磷酸化编码的识别机制。首先,应用基因密码子扩展技术,把非天然氨基酸F2Y插入到Arrestin的七个特异结构位置和潜在的磷酸基团结合区域。19F-NMR位移变化和体外体内实验证明Arrestin能够通过其特有的、包括至少10个潜在的磷酸根结合位点的磷酸根结合凹槽来识别受体的磷酸化编码。研究发现不同的磷酸化编码模式能够产生不同的构像变化,从而引起不同的生物学效应。GRK2磷酸化的β2AR的C末端短肽可以和Arrestin上的磷酸根结合位点1-4-6-7结合,导致其发生构象变化,这种构象变化可以特异的招募网格蛋白Clathin,进而介导受体发生内吞。GRK6磷酸化的β2AR的C末端短肽可以和Arrestin上的1-5磷酸根结合位点发生相互作用,导致其发生构象变化,而这种构象可以特异招募下游的SRC蛋白。Arrestin通过其磷酸化结合位点来识别受体不同的磷酸化花样,引起自身的构象变化,并且将这种构象变化转换成不同的细胞功能。
  因此,提出了受体磷酸化编码的笛子模型:受体的磷酸化编码花样可以通过与Arrestin的10个磷酸化位点特异性的结合,就像手指按在笛子的孔上,不同的磷酸化组合可以带来不同的手指组合,从而形成特异的音符,并引起Arrestin的特异性构型变化。考虑到10个磷酸化位点的组合可以带来超过1000种变化(210-1=1023),这样受体C末端不同的磷酸化花样就可以引起超过1000种Arrestin的特异性构型,从而可以行使超过1000种功能。
[硕士论文] 洪海燕
计算机技术 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质是组成生物体的一切细胞、组织的重要成分,是生命的物质基础。蛋白质参与了机体的所有重要组成部分。一般来说,将蛋白质经过基因剔除式突变并将其移除后造成了生物体的功能丧失,并使生物体致病甚至无法生存,该蛋白质即为关键蛋白质。由于生物体的存活和后代的繁衍都离不开关键蛋白质,因此生命科学中一项重要的研究内容就是识别关键蛋白质。本文在蛋白质相互作用(PPI)网络拓扑结构的基础上,将融合多源生物信息来预测关键蛋白质,主要内容包括以下三个方面:
  (1)提出了基于改进的PageRank算法EPP(Essential Proteins Predict)识别关键蛋白质。该算法将PPI网络看成是一个不确定的、顶点带有属性的网络,然后在该网络中将重要性排名在前P%的顶点作为关键蛋白质。该方法首先需要计算顶点(即蛋白质)间的相似度,对于相似度的计算,我们综合考虑了蛋白质的可信度及语义相似度信息;其次,对于PPI网络中的每一个顶点我们还考虑了顶点的邻居信息,即计算它的邻域相似度;最后利用上述提出的可信度及语义相似度来计算顶点的重要性。本文提出的算法综合考虑了PPI网络的拓扑信息和蛋白质的生物信息,因此具有复杂度低、识别准确率高的优点。我们利用标准数据集进行测试,实验结果表明,所提出的算法能更准确地识别出更多的关键蛋白质。
  (2)提出了基于改进的PSO算法EPPSO(Essential Protein PSO)识别关键蛋白质。在该算法中,我们提出了衡量top-p关键蛋白质的整体性指标,而不是评估蛋白质关键性的单个指标。EPPSO算法采用选取候选解的方法,每一个候选解含有P个蛋白质,我们整体度量这P个蛋白质的关键性即可。对于整体关键性,我们采用这些蛋白质与其他蛋白质间的联系的紧密度来衡量,即为算法中提出的适应度函数。然后根据粒子群的算法思想,通过跟踪全局最优值及个体最优值来更新该函数。为了评估算法的性能,我们在酵母数据集等标准数据集上运行该算法,实验结果表明与其他经典算法相比,本文算法识别准确率明显优于其他方法。此外,由于本文算法只需识别出P个关键蛋白质即可,而不必根据某种指标逐个计算每个蛋白质的关键性,因此具有较低的计算量。
  (3)在以上工作的基础上,本文设计了一个基于WEB的在线关键蛋白质识别系统。该系统可以把预测的结果通过图形化的方式体现在系统上,方便高效。经测试该系统运行稳定,界面美观,具有良好的经济价值和社会价值。
[硕士论文] 邱留洋
生物物理学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:多肽在人体代谢的各个过程都承担了重要作用,其中包括细胞增殖、细胞分化、消化代谢、免疫防御、肿瘤病变等。在1953年,美国生化学家第一次人工合成了催产素这一多肽,标志着多肽可以为人们所利用。在经历了长期发展之后,现在在全球范围内上市的多肽药物已经超过了80种,并且还有很多多肽药物处于正在研究的阶段。与其它药物相比,多肽类药物具有一些独特的优势:药效好,特异性高,通常在人体内不会产生累积,很少和其他药物发生交叉作用。
  多肽药物虽然具有上述的这些优势,不过同其它的药物对比,多肽药物同样存在着缺点:多肽的稳定性较低,常常被肽酶分解为氨基酸,这导致多肽的半衰期很短,为了保证药效需要重复为患者给药,很不方便。为解决这一问题,学者们探索了很多新方法,蛋白融合技术是目前延长蛋白和多肽类药物半衰期的有效手段之一。Fc融合则是目前研究最多、进展最快的蛋白融合技术,它通常是将IgG蛋白的Fc段同筛选出的多肽融合在一起。这样的多肽(Peptide)-抗体(Antibody)融合蛋白被称为“肽体”(Peptibody)。
  研究者发现:在罗米司亭(romiplostim)这一药物中,Fc段和多肽通过不同的方式连接所得到的活性差别极大。通过Fc的C端和多肽连接的活性相比于通过Fc的N端同多肽连接要高出10倍以上。但对多肽与抗体连接方式与药效间的关系和相应的机制还尚不清楚,对其的研究也更多集中在实验方面,理论上的探索寥寥无几。
  本学位论文拟从结构生物信息学角度出发,利用ITASSER在线服务预测蛋白结构以及 ZDOCK对接蛋白从而构建相关的模型,预测分析出不同连接方式的肽体同受体的结合情况。然后通过 AMBER等分子动力学模拟软件计算结合自由能以及能量分解的方法研究不同结合方式的肽体同受体的相互作用,从理论上尝试解释不同肽体药物连接方式不同所致的活性不同提供理论支持。也为以后设计肽体药物给出理论上的预测。
[硕士论文] 周雨
生物化学与分子生物学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:重组人干扰素是一类常见的蛋白质药物,它在抗病毒、抗肿瘤方面都发挥了一定的作用。由于这类蛋白质药物进入体内后容易被肾脏清除或易被蛋白酶降解,半衰期短,因此需要对这类蛋白质进行修饰。虽然聚乙二醇修饰、包裹蛋白质药物后可以提高药物的稳定性,但该方法存在诸多缺陷,包括修饰位点不可控、高免疫原性和以及毒性等,因此寻找更合适的替代性高分子材料与修饰方法迫在眉睫。
  本文选择了生物相容性好、免疫原性低的聚多肽作为偶联对象,其主链的可降解性、侧链的修饰便利性和端基的选择反应活性使其成为具有位点特异性的完美的用于蛋白质修饰的高分子材料。本论文中我们主要采用自然连接法、转肽酶介导的连接反应合成了不同长度、不同拓扑结构的干扰素-聚多肽偶联物。在通过质谱、western-blotting等方法对合成的产物进行鉴定后,我们借助荧光光谱、圆二色谱谱检测了偶联物的稳定性、通过Elisa方法研究了药物代谢动力学、组织分布等信息;此外,还检测了偶联物在体外和体内的毒性、抗肿瘤活性、抗病毒活性、以及免疫原性,结果发现,(1)在体外成功合成的线型和环形偶联物的水合粒径明显增大,热稳定性和酶耐受性都有极大提高;(2)偶联物在体外维持了一定水平的抗肿瘤活性及抗病毒活性,且偶联物并未表现出比野生型更强的免疫原性;(3)由于血液循环时间的增加和生物组织分布等各方面原因,偶联物在体内表现出比较良好的抗肿瘤活性。相关结果为后续系统开发干扰素-聚多肽偶联物奠定了基础。
[硕士论文] 田聪慧
生物化学与分子生物学 聊城大学 2017(学位年度)
摘要:科学研究中构建稳定表达细胞株,抗体工程和细胞工程领域筛选种子细胞经常需要两个或以上的基因稳定共表达。通常通过两个载体共转染的筛选方法来实现,然而实践中常面对许多问题。因此,有必要开发单个载体实现多基因共同表达。MDCK细胞作为流感病毒疫苗生产的重要细胞系之一,广泛应用于多种病毒的扩增与纯化。但是MDCK细胞贴壁依赖性强,需要表面粘附来进行增殖。因此实现MDCK细胞于悬浮培养中增殖,将简化病毒生产过程,并极大地促进流感病毒的生产规模。
  本文对多基因共稳定表达筛选载体与siat7e稳转MDCK细胞株的构建进行了研究。本研究分为两个部分:
  第一部分:IRES序列的多基因共稳定表达筛选载体构建。
  目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。
  方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,连接到骨架载体,构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。
  结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和Hela两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100%。基因组和转录水平PCR及蛋白免疫印迹实验表明DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组并且两种蛋白表达水平较为一致。
  结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达,并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白相互作用以及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。
  第二部分:siat7e基因稳定表达的MDCK细胞株的构建。
  目的:构建表达siat7e的MDCK细胞株,用以解决MDCK细胞的悬浮培养问题。
  方法:利用PCR技术,从MDCK细胞基因组中扩增出全长1011 bp的siat7e基因,并将该基因分别克隆到pBflag、pLV-MCS-Puro和pSF-EGFP表达载体中,三种真核表达载体转染MDCK细胞后,筛选siat7e基因稳定表达的MDCK细胞株,以期实现MDCK细胞适应无血清悬浮培养。
  结果:成功构建了pBflag-siat7e、pLV-siat7e-Puro、pSF-EGFP-siat7e三种表达质粒。pBflag-siat7e重组质粒转染MDCK细胞,抗性筛选获得四个克隆,蛋白质印记和基因组PCR未见siat7e目的条带,推测可能未筛选到siat7e阳性克隆,且细胞未见明显表型。pLV-siat7e-Puro重组质粒转染MDCK细胞,抗性筛选获得MDCK耐药细胞池。基因组和转录水平PCR都证明目的基因siat7e稳定整合到MDCK细胞基因组。同样细胞未见明显表型,降低血清或者无血清培养基培养耐药性MDCK细胞,未获得适应悬浮培养的MDCK细胞系。利用pSF-EGFP-siat7e重组载体,融合表达EGFP和siat7e蛋白,荧光定位siat7e蛋白。荧光倒置显微镜下观察EGFP荧光蛋白表达情况,验证siat7e基因成功转染至MDCK细胞。基因组和转录水平PCR验证,证明siat7e基因稳定整合到MDCK细胞基因组。蛋白荧光定位验证siat7e表达的唾液酸转移酶蛋白定位在内质网上。
  结论:成功构建了三种表达质粒,并成功筛选获得两种稳定表达siat7e基因的MDCK耐药细胞池,且成功验证唾液酸转移酶蛋白定位,但细胞未见明显表型。接下来,将进一步研究重组质粒转化后MDCK细胞适应悬浮培养的特性。
[硕士论文] 梁敏
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:轴周蛋白(Periaxin)是成髓鞘的施万细胞和晶状体纤维细胞中特异且大量表达的一种细胞骨架相关蛋白。Periaxin参与髓鞘中PDG复合物的形成,是Cajal条带存在的分子基础,一旦L-periaxin突变或缺失会引起过度髓鞘化或脱髓鞘现象。Periaxin的定位在髓鞘的形成过程中是不断变化的,从最初的细胞核到最后的远离轴突的质膜处。Periaxin可以编码含有PDZ结构域的两种蛋白亚型,分别为L-periaxin和S-periaxin。PDZ结构域在Periaxin定位和PDG复合物形成中具有重要作用,但与其结合的配体却未见报道。EphrinB2是受体酪氨酸激酶家族的一个成员。EphrinB2配体可以和其对应的受体EphB2之间形成双向信号,这种信号可以直接指导轴突的生长、细胞的聚集和迁移、髓鞘的形成。EphrinB2配体包括胞外区,跨膜区和胞内区,在C端包含有PDZ结合基序。通过结合PDZ协调组织细胞膜上的蛋白复合物。
  本文对L-periaxin与EphrinB2间的相互作用进行了分析。首先,免疫荧光共定位实验结果表明了L-periaxin与EphrinB2在细胞质和细胞膜上有共定位现象。之后对L-periaxin与EphrinB2之间的相互作用进一步验证,结果显示L-periaxin与EphrinB2之间存在相互作用。为了确定EphrinB2与L-periaxin的互作的具体区域,对L-periaxin的四个不同的结构域分别利用双分子荧光互补实验、海肾荧光素酶互补实验及免疫共沉淀实验去分析与EphrinB2间的相互作用,结果表明L-periaxin的 PDZ结构域与 EphrinB2之间存在着相互作用。将EphrinB2的PDZ结合基序去掉之后,这种相互作用消失。S-periaxin与L-periaxin有着同样的PDZ结构域,通过双分子荧光互补实验(BiFC)、海肾荧光素酶互补实验、免疫共沉淀实验、GST Pull-down实验的检测,也证实S-periaxin的PDZ结构域与EphrinB2的相互作用。
  实验室前期研究揭示L-periaxin可以通过其分子内NLS2,3结构域与酸性结构域的相互作用形成首尾自环结构,而DRP2与L-periaxin的NLS2,3的结合会减弱L-periaxin的分子内的首尾相互作用。本文通过DRP2的干扰实验,体外NLS3多肽孵育施万细胞,结合双分子荧光互补实验,揭示DRP2及NLS3合成多肽片段可以竞争性结合L-periaxin的NLS结构域,从而破坏L-periaxin之间的分子内的相互作用,免疫荧光定位揭示L-periaxin的分子由闭环到开环的状态改变,引起L-periaxin细胞膜定位数量的增加。
  最后,为了检测L-periaxin是否影响RSC96细胞的增殖,利用MTT法及流式细胞术对敲除L-periaxin及过表达L-periaxin后对RSC96细胞的增殖的影响进行了研究。结果显示敲除了L-periaxin基因的细胞增殖速度减慢,G1期细胞的比例比正常细胞增加了18.16%, S期减少了20.62%。说明了L-periaxin会促进RSC96细胞的增殖。
[硕士论文] 杨彦
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:PPR蛋白是一类能特异识别并结合RNA的蛋白,在真核生物RNA的多种代谢途径中起着非常重要的作用。它广泛分布在高等植物中,主要定位于叶绿体和线粒体。通常情况下,PPR蛋白含有2-30个串联重复单元,每个重复单元含有35个氨基酸,其识别RNA的方式是模块化的,即一个重复单元识别一个RNA碱基,这种模块化的识别特点赋予PPR蛋白可被人工设计并用于RNA操作的潜力。已有的生物信息学分析和结构生物学研究表明,每个重复单元的第5位、35位氨基酸在RNA特异识别过程中起着至关重要的作用,被称为氨基酸组合识别密码(code)。理论上,这种氨基酸组合识别密码理论上有400种,目前,只有少部分code通过生化和结构的研究方法被解析,而大多数的code与RNA碱基之间的对应关系及具体的识别机制还不是很清楚,这对于PPR蛋白功能研究及其进一步应用十分不利,因此亟需破解PPR蛋白的不同氨基酸组合与所识别的RNA碱基之间的对应关系。这需要大量不同code的PPR蛋白,合成这样的具有串联重复序列的PPR基因耗时长且成本高昂。
  本研究致力于开发一种高效、快速、经济的组装方法用于构建具有不同code的人工设计PPR(designer PPR,dPPR)序列。本研究基于TypeⅡs限制性内切酶的序列识别特点和Golden Gate cloning的基本原理进行设计改造,分三步构建全长dPPR序列。以构建10 repeats(10R)为例,第一步通过“限制性酶切-连接”一步法构建3 repeats(3R)初级元件,第二步将3R元件通过“限制性酶切-连接”一步法构建9 repeats(9R)二级元件,第三步将9R元件克隆构建在改造的表达接收载体上,表达接收载体上含有1个“repeat”,最终拼接成完整的具有10个重复单元的dPPR序列。
  本研究成功利用组装的序列表达出目标蛋白,并利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、电泳迁移率实验的方法验证了数种密码与RNA碱基之间的对应关系。
  综上所述,本研究首次开发了一套快速高效的方法用于组装能识别特定碱基的dPPR序列,成功进行了蛋白表达和纯化,并验证了表达蛋白的活性。该方法的运用可极大地提高对PPR蛋白功能的研究效率,为PPR蛋白作为潜在的基因操作工具打下了坚实的基础。
[硕士论文] 刘黎明
控制科学与工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:单克隆抗体(mAbs)药物凭借其高度均一性、超高靶向性以及极强特异性等诸多优点已经在国内外生物医药市场所占份额越来越大。作为单克隆抗体制备过程中的关键环节,N-连接型糖基化反应对聚糖的产生具有至关重要的作用。N-连接型糖基化反应主要在高尔基体内完成蛋白质的后翻译过程,在很大程度上影响单克隆抗体药物的免疫特异性。但是由于目前理论论证困难,反应机理复杂、技术手段欠缺等原因,实现聚糖生产的在线控制仍然面临巨大的挑战。本文从聚糖生成控制策略的指导实施以及聚糖品质质量设计的角度,对N-连接型糖基化过程的研究主要完成了以下工作。
  首先基于数据驱动理论,采用多元统计回归技术偏最小二乘法(PLS)从统计学的角度对N-连接型糖基化过程产物聚糖和特殊糖型的分布进行了能控性分析。通过N-连接型糖基化网络模型和试验设计方法(DOE)获取了输入和输出数据,建立了PLS正向模型,构建了输入变量与输出糖型之间的映射关系。随后对获取的过程增益矩阵K进行了奇异值分解,通过奇异值大小从理论上定性讨论了不同输入糖基化转移酶和核糖供体浓度对多种聚糖及特殊糖型产物分布的影响情况。从仿真结果来看,详细表明了不同输出糖型的受控程度。
  其次针对N-连接型糖基化过程终产物期望聚糖质量的定量分析问题,给出了一种操纵变量空间设计方法。该方法采用多元投影技术偏最小二乘(PLS)的逆模型来进行期望聚糖品质对应的操作变量空间设计,并取得了良好预测效果。该方法利用获取的输入和输出数据矩阵建立了PLS逆向模型,对于每一种期望的输出聚糖质量,反求出其对应的不同输入变量。同时在考虑了系统预测不确定性的情况下,将每种聚糖对应的输入变量进行了置信区间范围内的扩展,使其更加合理。该方法的有效实施,能够为以后聚糖的在线控制生产和品质的提高提供一定的指导基础。
[博士论文] 鲍洪宇
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:本论文的第一章介绍了我们关于含有两个GTP酶激活蛋白质结构域的人源蛋白质ARAP3选择性识别RhoA的结构与功能研究。ARAP3是一个多结构域的蛋白质,它含有1个ArfGAP结构域、1个RhoGAP结构域、1个SAM结构域、5个PH结构域、以及1个RA结构域。ARAP3的特点是同时拥有两个具有活性的GTP酶激活蛋白质结构域,其中ArfGAP可以选择性地识别并加速Arf6-GTP水解为Arf6-GDP,RhoGAP可以选择性地识别并加速RhoA-GTP水解为RhoA-GDP。PtdIns(3,4,5)P3与ARAP3的结合可以提高ArfGAP的活性,Rap1-GTP与ARAP3的结合可以提高RhoGAP的活性。ARAP3很多生物学功能都与它的RhoGAP结构域的活性有关,如参与板状伪足的形成、参与血管生成、抑制硬胃癌细胞的腹膜扩散、调节中性粒细胞的趋化性和粘附相关过程、以及参与神经突生长等。为了更清晰的了解ARAP3是如何特异性识别RhoA,我们解析了ARAP3的RhoGAP结构域与RhoA· GDP· AlF4-在反应过渡态的复合物晶体结构。ARAP3的RhoGAP结构域由9个长的α螺旋和2个短的α螺旋反向平行折叠组成。我们对复合物结构提供的作用界面上的氨基酸进行突变,并通过细胞外ITC实验以及酶动力学实验研究了这些氨基酸对RhoGAP结构域识别RhoA以及加速RhoA-GTP水解能力的影响。我们发现对ARAP3的氨基酸的Arg-942、Arg-949、Arg-982或Arg-985的单点突变都可以显著的降低ARAP3-RhoGAP结构域与RhoA-GTP的结合能力以及GAP活性。我们还发现ARAP3是通过RhoA的α3螺旋中的氨基酸Asp-90和Glu-97来选择RhoA作为特异性作用底物的。
  本论文的第二章介绍了我们关于拟南芥中的PUF蛋白质APUM23特异性识别18S核糖体RNA中11个核苷酸的5'-GGAAUUGACGG-3'序列的结构与功能研究。多年来PUF蛋白质得到了广泛的结构与功能研究,但是我们对植物中的PUF蛋白质仍然知之甚少。大部分的PUF蛋白质都存在于细胞质中,它们通过结合信使RNA的3'非翻译区来调控信使RNA的翻译及定位。APUM23是少数的存在于核仁中的PUF蛋白质,它参与调节前核糖体RNA的加工过程,然而其中的分子机制目前尚不清楚。我们解析了APUM23和目的RNA的复合物晶体结构,这是第一个解析出的植物中的PUF蛋白质结构,APUM23是由10个Puf repeat串联结构域折叠成的C型结构,APUM23有一段插入序列并在C型结构内侧折叠成α螺旋。这段插入序列参与RNA的识别。最后,我们还解析了不含插入氨基酸序列的APUM23的突变体和RNA5'-GGAAUUGACGG-3'的复合物晶体结构。这个复合物结构显示,G0的碱基不再与APUM23的第十个Puf repeat结构域结合,而是经过大角度的翻转和A+3的碱基形成堆积相互作用稳定A+3碱基的构象。插入氨基酸序列的存在会通过空间位阻限制G0碱基的翻转,因此APUM23的插入氨基酸序列既识别RNA的碱基,又可以稳定RNA的构象。这项工作揭示了APUM23特异性识别18S核糖体RNA的结构基础。
[硕士论文] 张成晨
生物化学与分子生物学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:目前,临床治疗癌症的主要方式是放疗,化疗和手术切除等。在临床实践中化疗遇到了以下瓶颈,以广谱抗肿瘤药阿霉素(Doxorubicin, Dox)为例,这种小分子药物注射后在血液循环过程中可以穿透血管壁,自由扩散进入非肿瘤区域的正常组织,因而也会对正常组织产生毒性的作用。化疗的另一瓶颈是长时间使用药物而产生的多药耐药性。目前研究普遍认为细胞膜表面高表达的三磷酸腺苷结合盒转运体(ATP binding cassette transporter, ABC)是细胞产生耐药性的主要原因,其中 P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的作用最为主要。当药物进入细胞后,P-糖蛋白在 ATP供能的情况下会将药物泵出细胞膜,使细胞内的药物量减少,从而不足以产生对细胞的杀伤作用,因而产生多药耐药性。基于此,在本课题的研究中,我们采用嵌段共聚物聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)为载药的骨架材料,制备了一种生物相容性好的聚合物纳米胶束,携带化疗药物阿霉素与 P-糖蛋白抑制剂依克立达(Elacridar, Ela),通过在纳米胶束表面修饰叶酸受体靶向的叶酸分子和荧光成像功能的 Cy7荧光分子,成功构筑了一种兼具协同治疗与荧光成像的多功能化靶向纳米胶束(FA/Cy7-MCs(Dox/Ela)),可用于成像引导的肿瘤治疗。
  本论文研究结果表明,共载 Dox与 Ela并修饰 FA与 Cy7的FA/Cy7-MCs(Dox/Ela)纳米胶束在体内外均有很好的抗耐药肿瘤作用,并能实现对肿瘤部位和药物分布的实时监控,有望成为一种应用于临床的多功能聚合物纳米复合药物,实现对耐药肿瘤的高效诊断和治疗。
[硕士论文] 岳艺
药学 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:酶的级联反应往往需要多种酶以不同比例协同作用,但是目前多酶共固定的研究较少,控制多酶固定顺序及比例的研究更为少见。本文旨在开发一种体外比例可控且定序固定多酶的方法。
  本文选择核壳式纳米磁球作为固定载体,一种是Fe3O4/PVIM-Ni2+,其表面的镍离子可以和His标签特异性结合;一种是Fe3O4-Au,其表面的金粒子可以和硫醇共价结合。我们设计了两类支架蛋白:Ⅰ类支架蛋白含有His标签、硫醇基和olpB黏合域(1~7个不等),一方面可与纳米磁性微球结合,另一方面根据黏合域和相应锚定域(docCipA)之间的特异性结合作用可固定融合了锚定域的蛋白(本文选用绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白DsRed为模型来进行研究)。Ⅰ类支架蛋白的单酶多层固定表明:荧光蛋白的负载量随着支架蛋白上结合位点的增多先增加后减少,当结合位点为四个时达到最大值(0.937μmol/g)。
  Ⅱ类支架蛋白具有His标签和两种黏合域A和C,分别和锚定域docA、docC结合,设计不同数量和位置的A和C得到多个支架蛋白,对两种融合了锚定域的荧光蛋白共固定后发现,固定不同荧光蛋白的摩尔计量比和相应黏合域的数量比基本一致。支架蛋白上黏合域的个数越多,蛋白越难表达,综合考虑本文选用具有三个结合位点的支架蛋白ACA和CAC进行定序可控固定双荧光蛋白的研究,按不同比例混合以上两种支架蛋白,定序固定的双荧光蛋白摩尔计量比从1∶3渐变到7∶4,最大负载量可达0.831μmol/g。
[硕士论文] 闫静
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:在真核生物蛋白质翻译终止过程中,当三个终止密码子UAA、UAG和UGA中的一个到达核糖体A位点时,被第一类肽链释放因子eRF1识别,翻译过程终止,在第二类肽链释放因子eRF3的协同下完成新生肽链释放。在翻译终止过程中,第一类肽链释放因子eRF1利用其N端结构域识别终止密码子。eRF1的N结构域中的GTS、NIKS和Y×C×××F模体对于终止密码子的识别发挥重要作用。但至目前为止,eRF1识别终止密码子的机制,尤其是对于终止密码子的选择性识别机制仍不清楚。
  在本实验中,首先构建了四膜虫(Tetrahymena thermophilia)eRF1的N结构域与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) eRF1的M和C结构域组成的杂合eRF1(Tt/Sc eRF1,Tt/Sp eRF1)。利用双荧光素酶报告体系检测结果证实,两种杂合的eRF1在细胞中识别终止密码子的活性具有显著差异。Tt/Sc eRF1识别终止密码子UGA,而不识别UAA和UAG终止密码子,与四膜虫eRF1一致,表现出了密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是1.98%、3.83%、11.04%);而Tt/Sp eRF1可以识别三个终止密码子,无密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是2.81%、2.01%、1.88%)。由此说明四膜虫eRF1的N结构域不是决定其识别特异性的唯一因子,在eRF1的M和C结构域中可能存在决定eRF1识别性质的元件或细胞中其它因子可能通过M和C结构域参与eRF1识别终止密码子的过程。为解释这一现象,我们将Sp eRF1的C端小结构域中氨基酸进行突变,选择了其中的第357、361、364和367位的氨基酸突变为酿酒酵母eRF1相应的位点,得到一系列的突变体(Tt/Sp eRF1 A364Q、Tt/Sp eRF1 D361A/A364Q、 Tt/Sp eRF1 L357A/D361A/A364Q、 Tt/Sp eRF1 L357A/D361A/A364Q/E367D)。同样也将裂殖酵母eRF1的364、367和371位氨基酸引入酿酒酵母eRF1,得到突变体Tt/Sc eRF1 Q364A、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E/E371S。结果显示,所有的突变体对UGA的识别效率没有明显的变化,但是Tt/Sp eRF1的突变体对UAG和UAA的通读效率显著提高,说明其对这两个密码子的识别效率降低。而Tt/Sc eRF1的突变体,对终止密码子识别活性的影响不显著,其对UAG的识别活性稍有提高,通读效率从5.77%降至2.98%,以上结果表明C端小结构域影响到eRF1对UAG和UAA密码子的识别活性。为了进一步分析小结构域对识别活性的影响,通过对小结构域的蛋白结构分析发现在其结构域中存在关键的、多变的Loop(357~367aa)结构,因此我们将裂殖酵母和四膜虫eRF1小结构域中的Loop结构引入到杂合的Tt/Sc eRF1中。分析结果显示,引入两种不同Loop结构到Tt/Sc eRF1嵌合体中,均可识别三个终止密码子,说明Loop结构显著的影响终止密码子的识别活性。由此表明,四膜虫eRF1的N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,也说明eRF1的C端结构域参与了终止密码子的识别过程。
  从以上实验结果推测,是否酿酒酵母第二类肽链释放因子与两种酵母的嵌合体eRF1相互作用的效率不同,导致两个嵌合体识别终止密码子的效率和功能发生了改变。因此,在本实验中,将克隆得到的四膜虫eRF1嵌合体和裂殖酵母Sp eRF1以及酿酒酵母两类肽链释放因子Sc eRF1和Sc eRF3的基因,分别连接到酵母表达载体pGADT7和pGBKT7中,得到的重组质粒共转化到酵母菌株AH109。酵母双杂交结果证实四膜虫eRF1嵌合体(Tt/Sc eRF1/Tt/Sp eRF1)、功能Sp eRF1、Sc eRF1和Sc eRF3均存在相互作用关系,说明无论在何种细胞中,蛋白质翻译终止过程都需要两类肽链释放因子的协同作用来完成。排除了酿酒酵母细胞中嵌合体eRF1识别终止密码子的性质和活性的差异是由于Sc eRF3与嵌合体eRF1相互作用的效率不同而引起的。
  为了进一步验证N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,我们通过双荧光分子互补实验(BiFC)证实eRF1功能的主要调控因素是其N端结构域与C端结构域在分子内发生的相互作用引起的。通过克隆得到四膜虫eRF1的N结构域,C结构域、酿酒酵母eRF1的C结构域和裂殖酵母eRF1的C结构域及其突变体(Sp-C A364Q、Sp-C D364A/A364Q、Sp-C L357A/D364A/A364Q)的基因,分别连接到表达载体pQE-30和pET-28a中。结果表明四膜虫eRF1的N结构域与不同的C结构域以及突变体在体内都可发生相互作用,说明C端结构域通过与N端结构域的分子内相互作用,影响终止密码子的识别活性;也进一步证实了C端结构域参与了密码子的识别过程。
  综合以上结果表明,四膜虫eRF1的N端结构域不是其识别终止密码子的唯一因子,C端结构域在一定程度上影响并决定了eRF1对终止密码子是别的特异性。本研究结果,旨在为揭示肽链释放因子识别终止密码子的分子机制提供数据支持。
[硕士论文] 张刚
计算机技术 北京交通大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质功能模块是通过相互作用或一起执行某个特定的分子功能的蛋白质组,对其探究有助于了解细胞进程,生命活动和疾病机理。识别蛋白质功能模块是蛋白质组学领域中一个非常热门的研究方向,通过计算方法进行蛋白质模块识别既可以节省大量的时间和资源,还能给出潜在的功能模块。
  目前基于计算方法的蛋白质功能模块检测方法可以分为两类:有监督的和无监督的检测方法。大多数的无监督方法认为蛋白质功能模块存在于PPI网络图中比较密集的区域。有监督的方法则通过参考数据集的信息特征训练分类模型来指导功能模块的识别,但是特征提取的不充分和PPI数据的噪声都会导致分类模型不准确。本文首先提出了一个基于逻辑回归分类模型和局部结构信息的打分函数。训练分类模型时,通过选取24个特征来提高分类模型的准确度。将分类模型和局部结构信息结合以降低PPI数据噪声所带来的负面影响。最后,基于该打分函数设计了新的功能模块检测算法。
  在四个大规模酵母数据集上与经典的无监督检测方法进行了对比实验,实验结果表明本文提出的算法在MMR值得分上高于其它算法,综合得分大多数情况下也高于其他算法。还在五个酵母数据集上与经典的有监督检测方法进行了对比实验,实验结果表明本文提出的算法得分仅次于ClusterEPs算法。最后,GO分析的结果表明本文提出的算法可以预测到潜在的蛋白质功能模块。
[硕士论文] 刘锦
药学 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质广泛存在于体液中,可作为象征人体健康的标准,用作诊断的生物标记物。将被测蛋白质的对应识别分子引入检测体系,可作为响应机制的触发点。本文引入蛋白质诱导纳米粒子亲疏水性变化机制作为分子识别,疏水片段硼酸基团与ARS络合反应为信号导出,构建蛋白质检测机制。
  1.本文用点击化学反应合成末端具有生物素的大分子链转移试剂,通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT聚合)调节投料比例,得到聚苯硼酸丙烯酰胺(PAAPBA)为疏水片段的三种不同嵌段比例的两亲性聚合物(Biotin-PEG-block-PAAPBA)。通过疏水相互作用,两亲性聚合物自组装形成100~300nm的纳米粒子,利用被识别蛋白质与纳米粒子外壳的识别分子结合,从而产生粒子整体亲疏水性平衡变化,粒子松散而使苯硼酸部分裸露,进而与ARS形成荧光生色团,作为检测信号导出方式,利用此纳米粒子检测模型蛋白链霉亲和素,检测限(LOD)可达32.50ng·mL-1。
  2.基于上述方案已实现的定量检测,本文进一步优化检测体系,建立可视化定性检测新机制。两亲性嵌段聚合物(B iotin-P EG-b lock-PAAPBA)与ARS先配位反应后,自组装可以形成黄色纳米粒子。在蛋白质影响粒子亲疏水性平衡的同时,引入环糊精分子作为外加刺激,并与疏水内核的硼酸-ARS络合物反应,竞争置换出游离的紫色ARS,促进粒子进一步瓦解,实现溶液颜色由黄到紫的转变。根据加入蛋白质的纳米粒子溶液与无蛋白质纳米粒子溶液的荧光发射信号差值作蛋白检测标准曲线,同时实现蛋白质的可视化定性和荧光定量检测,达到的检测限为5.85ng·mL-1,检测线性范围6.50ng·mL-1~1.95μg·mL-1。
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