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[硕士论文] 吴亚群
特种经济动物饲养 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:用人工饲料养蚕是今后我国蚕业发展的方向,但缺乏人工饲料适应性蚕品种严重制约了该技术的生产应用。探明家蚕对人工饲料摄食性的遗传方式及分子机理,对于选育人工饲料适应性蚕品种及改良饲料配方均具有重要的理论和实践意义。为此,本研究以对人工饲料摄食性不同的家蚕品种(品系)为材料,探讨了不同蚕品种对人工饲料摄食性的遗传模式,并利用SSR标记和图位克隆技术对家蚕食性相关的基因进行了定位,采用半定量PCR技术测定了有差异的分子标记间14个预测基因在广食性品种中广04(ZG04)与低食性品种鲁七(L7)间的表达差异。主要获得如下结果:
  1.利用对人工饲料摄食性存在极显著差异的3对家蚕品种(品系)为材料,分别组配成P1、P2、F1、F2及BC1共10个世代,以人工饲料育收蚁36?h疏毛率为摄食性指标,应用联合尺度检验等方法进行摄食性遗传模式研究。结果表明:通过多代歧化选择选育的菁松A、菁松B的高食性与低食性品系对人工饲料的摄食性符合加性遗传;广食性品种ZG04对低食性品种L7为显性-加性-母性遗传模式。
  2.用ZG04和L7作为亲本组建F1代及BC1F回交群体(ZG04×L7)×L7和BC2F回交群体[(ZG04×L7)×L7]×L7,利用SSR技术对人工饲料摄食性相关基因进行定位和连锁分析,结果显示在第7连锁群上发现2个与食性连锁的SSR多态性标记S0709和S0710,遗传距离为1.1 cM。利用SSR Hunter1.3软件在S0709和S0710之间搜索潜在的SSR位点,并根据PCR扩增结果和摄食性表现型对比,结果找到5个新的多态性SSR标记,这5个标记在BC2F群体中的电泳图谱中,低食性个体与L7基因型与表现型一致。利用KAIKObase家蚕数据库中的有关信息分析S0709-S0710间的碱基序列及预测基因,结果在S0709与S0710间有14个预测基因。根据标记位点与基因位点,绘制出14个基因与7个分子标记的连锁图。遗传连锁图的遗传距离为226720 bp,Gene8与S3标记间距离最近,为241 bp。
  3.分别用ZG04与L7的蚁蚕、2龄起蚕、3龄起蚕、3龄蚕头部为材料,采用半定量PCR技术,测定在S0709-S0710之间预测出的13个基因的表达情况。结果表明,其中10个基因在ZG04与L7间的表达无显著差异,但Gene1和Gene3在ZG04的蚁蚕、2龄起蚕、3龄起蚕及3龄蚕头部中的表达水平均显著高于L7。Gene4在ZG04中不表达,但是在L7不同龄期均有表达。关于这些基因的具体功能及其与食性的关系有待进一步研究。
[硕士论文] 李二兰
特种经济动物饲养 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:吡虫啉(Imidacloprid)是新烟碱类杀虫剂,在农林害虫防治中广泛使用。本试验用吡虫啉作为代表性药剂,建立家蚕慢性中毒模型,分析了慢性吡虫啉中毒对家蚕消化酶、生长发育和食物利用的影响、微量吡虫啉在家蚕体内的代谢特征及慢性吡虫啉中毒对蚕体组织谷胱甘肽转移酶活性的影响,结果如下:
  1、家蚕吡虫啉急性中毒表现为拒食,身体扭曲呈“C”或“S”型,吐褐色的肠液,身体缩短变软等症状。3龄起蚕的96h-LC50为1.17709 mg/L;5龄起蚕的96h-LC50为1.72601 mg/L。经试验确定的慢性中毒吡虫啉药液浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 mg/L5个剂量。
  2、采用质量法研究了吡虫啉导致的家蚕慢性中毒对幼虫的生长发育及食物利用的影响。结果表明,高浓度(10-1和10-2 mg/L)的吡虫啉药液对家蚕的生长发育和食物利用有明显抑制作用,而低浓度(10-3、10-4和10-5 mg/L)的吡虫啉药液对家蚕的生长发育和食物利用则有促进作用。
  3、采用质量法和统计学方法研究了慢性吡虫啉中毒对家蚕经济性状的影响。结果表明,吡虫啉对家蚕幼虫的死亡情况、化蛹率、茧层量、茧层率及死笼率有显著影响,且吡虫啉添食剂量越高,对家蚕的毒害作用越明显。各药液组对熟蚕体质量、全茧量、蛹体重作用有所不同,低浓度吡虫啉对其起促进作用,而高浓度对其起抑制作用。
  4、采用酶活力测定法测定吡虫啉对5龄幼虫中肠中3种消化酶(淀粉酶、蔗糖酶、海藻糖酶)活性的影响。结果表明,低浓度吡虫啉药液对5龄幼虫中肠淀粉酶和海藻糖酶的活性起促进作用,而添食高浓度吡虫啉药液在幼虫5龄1~5d时对两种酶的活性起抑制作用,随着幼虫的生长发育,酶活性逐渐恢复正常并高于对照。吡虫啉药液对蔗糖酶活性具有抑制作用,且添食药液浓度越大,抑制作用越明显。
  5、采用高效液相色谱法测定了不同时间段5龄幼虫中肠、血液、脂肪体和丝腺中吡虫啉含量。结果表明,吡虫啉到达家蚕各组织的顺序依次为:中肠→血液→脂肪体→丝腺,且中肠和丝腺对吡虫啉农药有累积的作用。
  6、采用酶活力测定法测定了吡虫啉对家蚕各组织谷胱甘肽转移酶活性的影响。结果表明,吡虫啉药液对家蚕幼虫不同组织中GSTs酶活性的影响有差异,对血液、脂肪体中GSTs活性先呈短暂的抑制而后诱导;对中肠中GSTs活性起抑制作用;对丝腺中GSTs活性的影响不显著。
[硕士论文] 臧允亮
特种经济动物饲养 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:辛硫磷(phoxim)是目前国内应用最为广泛的有机磷农药,因其具有降解容易、作用广泛、杀虫高效和毒性较低等优点,而受到农林害虫防治部门的青睐。家蚕是鳞翅目的经典模式生物,是世界范围内的重要经济昆虫,在我国有着悠久的养殖历史和广泛的养殖区域。长期的人工选育使现行家蚕品种在获得高产丝量的同时,对农药的抗性反而降低,致使家蚕幼虫对多种农药都十分敏感。由于家蚕与农林害虫处于同一生态系统之中,农林生产中辛硫磷农药的不当使用,往往存在不同程度的环境污染风险。特别是亚致死剂量的辛硫磷微量污染,就能使家蚕发生中毒,而使蚕桑生产遭受重大经济损失,严重影响桑蚕产业的发展。
  本研究选取家蚕一代杂交种菁松×皓月为实验材料,对5龄起蚕进行氮乙酰半胱氨酸(NAC)添食处理,NAC浓度为200μg·mL-1,24h之后添食辛硫磷,辛硫磷浓度为0.5倍半致死浓度(亦称亚致死浓度,4μg·mL-1)。同时,对5龄起蚕进行亚致死浓度辛硫磷添食处理,24h后添食200μg·mL-1的 NAC。调查实验家蚕幼虫的死亡率、龄期经过、体质量和体质量增长率等生长发育指标,全茧量、茧层量、茧层率和上茧率等经济性状指标;检测家蚕体内还原型谷胱甘肽(GSH)含量、总碳水化合物和蛋白质含量等生理生化指标,及超氧化物歧化酶(SOD)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、酚氧化酶(POD)等相关解毒酶的活性变化和乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性变化。利用高效液相色谱法(HPLC)检测NAC对亚致死浓度辛硫磷中毒家蚕幼虫体内辛硫磷代谢的影响,并测定NAC溶液的稳定性,探究NAC对家蚕辛硫磷中毒的预防和解毒效果,以期为探索新的家蚕微量有机磷中毒解毒途径提供参考。
  根据本研究,初步得出以下结论:
  (1)NAC能够显著缓解亚致死浓度辛硫磷所引发的5龄家蚕幼虫有机磷农药中毒症状,中毒家蚕的四处乱爬、摆头、吐液、痉挛、脱肛等症状明显减轻。NAC可有效提高亚致死浓度辛硫磷中毒5龄家蚕幼虫的体质量,其体质量的均值达2.028g,显著高于辛硫磷毒对组的1.849g(p<0.05),且与对照组无异。 NAC添食预处理后,亚致死浓度辛硫磷中毒家蚕幼虫的体质量增长趋于正常水平,盛食期和熟蚕的体质量增长率均与对照组无显著差异;辛硫磷中毒家蚕幼虫的存活率由81%±5%提高到了98%±5%,达到显著水平;亚致死浓度的辛硫磷中毒后,家蚕幼虫的龄期经过延长了25h,而 NAC添食预处理组辛硫磷中毒家蚕的龄期经过则与对照组无异。
  (2)NAC能有效减轻5龄家蚕亚致死浓度辛硫磷中毒对相关经济性状的不利影响。辛硫磷中毒后,NAC添食预处理组家蚕幼虫的全茧量、茧层量、茧层率和上茧率都显著高于辛硫磷毒对组的1.363g、0.250g、18.420%和78.933%(p<0.05),分别达到了1.763g、0.363g、20.587%和87.267%,且其茧层率与空白对照组无显著差异。
  (3)NAC能有效缓解半致死浓度辛硫磷中毒所引发的生理生化指标的变化。蛋白质浓度降低的趋势得到抑制,辛硫磷处理72h后,预添食NAC的辛硫磷中毒家蚕幼虫的蛋白质浓度已与对照组无异;碳水化合物的消耗显著减少,辛硫磷处理48h后,预添食NAC的辛硫磷中毒家蚕幼虫的碳水化合物含量已与对照组无异,而辛硫磷毒对组家蚕幼虫的碳水化合物含量一直显著低于对照组(p<0.05);NAC可以参与家蚕体内谷胱甘肽的代谢,补充因辛硫磷中毒而消耗的GSH。同时,NAC能使SOD活性的激发时间显著缩短,辛硫磷处理24h后,NAC预添食组的SOD活性显著高于对照组(p<0.05),48h已与对照组无异,而辛硫磷毒对组的SOD活性,在辛硫磷处理48后才显著激活,且一直维持在较高的水平;NAC预处理组的CarE的活力可达毒对组的1.6倍以上,同时, POD活性的抑制得到显著缓解,辛硫磷处理96h后已与对照组无异;NAC能激发GSTs的活性,即使在没有辛硫磷处理时。NAC能有效缓解辛硫磷所造成的 AChE酶活性受抑制的现象,辛硫磷处理后NAC添食组的酶活一直显著高于毒对组(p<0.05)。
  (4)NAC能够促进辛硫磷在家蚕体内的代谢与外排。试验表明,辛硫磷在家蚕体内按照中肠—血淋巴—脂肪体—马氏管—排除体外的路径进行代谢。NAC预处理能显著缩短整个代谢环节所需要的时间,NAC预添食组辛硫磷在中肠、血淋巴、脂肪体和马氏管达到峰值的时间分别为0.5h、2h、4h和4h,显著低于辛硫磷毒对组的0.5h、4h、4h和8h(p<0.05),代谢时间的缩短能减少辛硫磷对家蚕幼虫的作用时间,从而有效减轻了家蚕的中毒反应。
  (5)在200μg·mL-1NAC溶液中加入5μg·mL-1纳米 TiO2,其混合液具有更高的稳定性。混合液在配制6个月和12个月时的有效NAC含量分别为87.786%和15.048%,显著高于单纯NAC溶液的30.643%和5.762%。NAC稳定性的提高,为其生产应用奠定了基础。
[硕士论文] 章娜
生物化学与分子生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:细胞凋亡在生物体的生命活动中扮演着重要角色,其过程受到众多基因调控。其中,API5(Apoptosis inhibitor-5)是一种新发现的细胞凋亡抑制因子,能有效阻断细胞凋亡进程,但其结构与已知的细胞凋亡抑制蛋白(IAPs)并不相同。目前有关API5的研究主要集中在人类癌症相关等方面,因其高水平表达可促进癌细胞发生而倍受关注。通过基因序列的比对分析,在家蚕(Bombyx mori)基因组中发现存在该蛋白的同源基因BmAPI5(GenBank编号:XM004927989),但其在家蚕体内的功能与作用至今尚未见有报道。
  本研究主要内容包括:⑴克隆获得家蚕BmAPI5基因全长cDNA序列,其开放阅读框长1,671 bp,编码557个氨基酸残基,蛋白分子量63.13 kD,等电点6.09。BmAPI5蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,具有LxxLL基序和亮氨酸拉链等特征结构域。家蚕BmAPI5与黑腹果蝇和人类同源基因Aac11的氨基酸序列相似性分别为46%和47%。将家蚕BmAPI5开放阅读框序列克隆至原核表达载体pET-32a中,经大肠杆菌(Escherichia coli)诱导表达获得重组BmAPI5蛋白,并制备其兔多克隆抗体。⑵分别采用实时荧光定量PCR技术和Western杂交技术分析家蚕BmAPI5基因在不同发育时期、不同组织以及微生物感染后的转录与表达水平。BmAPI5基因在家蚕卵、幼虫和蛹中均有不同程度的转录和表达,其中以5龄幼虫的转录水平显著为高。在不同组织中,BmAPI5以脂肪体中的转录和表达水平显著较高。家蚕核型多角体病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovirus,BmNPV)和大肠杆菌侵染均能快速显著诱导BmAPI5基因的转录与表达,其中以BmNPV的诱导作用较为明显。这表明BmAPI5可能参与BmNPV-宿主的互作机制。⑶在家蚕BmN细胞中分别构建BmAPI5过表达和抑制表达体系的基础上,分别采用流式细胞技术和Caspase活性检测技术分析BmAP I5表达变化对家蚕细胞凋亡的影响。流式细胞仪检测结果表明,在家蚕BmN细胞中过量表达BmAPI5基因可显著降低经PBS饥饿诱导的细胞凋亡水平;而抑制表达该基因则可导致PBS饥饿诱导的细胞凋亡水平显著较高。对不同处理的Caspase活性检测结果与流式细胞仪检测结果一致。这表明BmAPI5具有抑制细胞凋亡的功能。
[硕士论文] 王薇
生态学 河北农业大学 2017(学位年度)
摘要:桑天牛(Apriona germari)是我国重要的蛀干害虫,严重影响了我国的生态效益和经济效益。多年来,对桑天牛的防治不仅防治效率低,而且效果不明显。桑天牛卵啮小蜂是桑天牛卵期重要的寄生性天敌,在林间具有较高的寄生率,在桑天牛生物防治方面起着重要作用。茉莉酸(jasmonic acid,JA)是一种重要的植物生长激素,是植物抵抗植食性昆虫的重要调节者。为此,本试验以JA为诱导因子,以桑树为研究对象,通过对桑天牛成虫取食的生物测定试验和对桑天牛卵啮小蜂的生物测定试验,从直接抗虫作用和间接抗虫作用两个方面,研究外源JA诱导桑枝对桑天牛产生抗性的化学机制,旨在为桑天牛治理提供理论依据,主要研究结果如下:
  (1)以浓度为10、100和1000μmol/L的JA分别处理桑枝,测定不同时间段各处理桑枝对桑天牛成虫取食面积的影响。结果表明:不同浓度的JA处理桑枝24或48h后,桑天牛成虫对桑枝的取食面积与对照无显著差异(P>0.05)。处理72h后,桑天牛仅对1000μmol/LJA处理桑枝的取食面积明显低于对照(P=0.037)。Sperman等级相关性分析表明,JA浓度与桑天牛成虫的取食面积呈极显著负相关(r=-0.311,P=0.000)。因此,诱导桑枝对桑天牛产生直接抗性的茉莉酸最佳浓度为1000μmol/L。
  (2)以浓度为1000μmol/L的JA处理桑枝,分别测定处理不同时间后桑枝内抗虫次生物质含量及防御酶活性的动态变化。结果表明:JA处理后的4~72h,桑枝内多酚氧化酶(PPO)活性均明显高于对照,且在48h时达到最大值;胰蛋白酶抑制剂(TI)活性和单宁含量随着时间的延长均呈逐渐上升的趋势,但仅在72h时明显高于对照;JA也促进了桑枝内总酚含量的提高,且在处理后48h时达到显著程度,72h时又降低至对照水平。说明外源JA可促进桑枝内抗虫次生物质含量及防御酶活性显著提高。以不同浓度的胰蛋白酶抑制剂和单宁分别处理桑枝,以蒸馏水处理的桑枝为对照,通过选择试验研究不同处理桑枝对桑天牛成虫取食面积的影响。结果表明,0.01、0.1mg/mL的单宁和0.1mg/mL的胰蛋白酶抑制剂均可使桑天牛成虫的取食面积显著降低(P<0.05),说明胰蛋白酶抑制剂和单宁是抑制桑天牛取食的重要物质。可见,JA通过诱导桑枝内胰蛋白酶抑制剂活性及单宁含量的提高抑制桑天牛成虫取食,是JA诱导桑枝对桑天牛产生直接抗性的重要化学机制。
  (3)以浓度为10、100和1000μmol/L的JA分别处理桑枝,利用Y-型嗅觉仪测定不同时间段各处理桑枝对桑天牛卵啮小蜂趋性行为的影响。结果表明:在10μmol/L JA处理后的不同时间内,桑枝对桑天牛卵啮小蜂均未表现出明显的引诱作用;当JA浓度为100μmol/L时,桑枝仅在处理48h后对桑天牛卵啮小蜂具有显著的引诱活性;然而,1000μmol/LJA处理24和48h后,桑枝对桑天牛卵啮小蜂的引诱活性明显高于对照(24h,P<0.05;48h,P<0.01),72h后桑枝的引诱作用消失。Spearman等级相关性分析表明,JA浓度与桑枝对桑天牛卵啮小蜂的引诱百分率显著正相关(ρ=0.791,P=0.006)。因此,诱导桑枝对桑天牛卵啮小蜂产生引诱作用的JA最佳浓度为1000μmol/L。
  (4)用浓度为1000μmol/L的JA处理桑枝,以蒸馏水处理的桑枝为对照,采用动态顶空法收集JA处理不同时间后的桑枝挥发物,利用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)对桑枝挥发物进行定性定量分析,研究JA处理对桑枝挥发物的组分及释放速率的影响。结果表明:JA处理后的桑枝挥发物组分包括醇类、酯类、萜类物质、芳香族化合物和含氮化合物,其中萜类物质种类最多(13种)。随着处理时间的变化,桑枝挥发物组分及总释放速率也随之发生改变。处理24h后,桑枝释放出18种组分,比对照多11种组分,其总释放速率也明显提高,为对照的8.2倍;48h后桑枝释放出22种组分,比对照多15种组分,其总释放速率进一步提高,为对照的44.6倍;72h后桑枝释放出13种组分,比对照多6种组分,其总释放速率大幅降低,为对照的3.9倍,但与对照无显著差异。可见,JA能诱导桑枝挥发物的大量释放及新组分的产生。
  (5)采用动态顶空法收集JA(1000μmol/L)处理48h后的桑枝挥发物,通过气相色谱-触角电位联用仪(GC-EAD)和气相色谱/质谱联用仪(GC/MS)筛选和鉴定对桑天牛卵啮小蜂有EAD活性的化合物,并比较这些活性组分的释放速率在JA处理桑枝与对照桑枝间的差异。结果分析表明:桑枝经JA处理后,其挥发物中的Z-3-己烯醇、γ-萜品烯、β-水芹烯、紫苏烯、水杨酸甲酯及3种未知化合物使桑天牛卵啮小蜂产生明显的EAD反应,并且β-水芹烯、紫苏烯和水杨酸甲酯的释放量明显高于对照,其中β-水芹烯和紫苏烯仅存在于茉莉酸处理后桑枝的挥发物中,而Z-3-己烯醇的释放速率与对照无显著差异。利用不同浓度的化学标准品分别对桑天牛卵啮小蜂进行嗅觉行为测定。结果表明:不同浓度的Z-3-己烯醇、γ-萜品烯对寄生蜂的引诱作用与对照均无显著差异;β-水芹烯(0.1%)、紫苏烯(0.1%)和水杨酸甲酯(0.01%、0.001%)对该寄生蜂具有显著的引诱作用。综上所述,JA通过诱导桑枝大量释放β-水芹烯、紫苏烯和水杨酸甲酯等对桑天牛卵啮小蜂具有引诱活性的化合物,是外源JA诱导桑树对桑天牛产生间接抗性的重要化学机制。
  (6)JA(1000μmol/L)处理24和48h后,桑枝对桑天牛卵啮小蜂的引诱活性逐渐增强,在48h时对寄生蜂的引诱活性达到最大值,而此时间段内桑枝对桑天牛的取食量并没有显著影响;JA处理72h后,桑枝对寄生蜂时引诱活性消失,但此时桑枝对桑天牛的取食却表现出明显的阻食作用。由此可见,JA处理后,桑枝对桑天牛的直接和间接抗性此消彼长。以上现象证明,外源JA诱导桑枝对桑天牛产生的直接和间接抗性间存在生态a适应平衡关系。
[博士论文] 孙钰
生物化学与分子生物学 安徽农业大学 2017(学位年度)
摘要:柞蚕(Antheraea pernyi)作为一种重要的野生经济昆虫,其丝可用于纺织工业,蛹和蛾可以作为食品和保健品而深受群众喜爱。研究柞蚕先天免疫防御机制对于增强柞蚕抗病能力,对提高柞蚕茧丝量及经济效益具有重要的理论和实际意义。
  本研究克隆了柞蚕的Hemolin(Ap-Hemolin)和Yippee(Ap-Yippee)基因,并对其免疫学功能和相互作用机制进行了探讨。研究结果如下:
  1.Ap-Hemolin和Ap-Yippee基因的克隆及原核表达。
  根据已获得的部分基因序列设计引物,经过PCR扩增得到了Ap-Hemolin和Ap-Yippee基因序列。其中Ap-Hemolin基因序列全长1418bp,包括41bp5'端非编码区序列,1242bp的开放阅读框(ORF)以及135bp的3'端非编码区序列。系统进化分析显示Ap-Hemolin属于Hemolin家族,含有Hemolin保守性结构域。Ap-Yippee基因开放阅读框大小为366bp,编码121个氨基酸。Ap-Yippee属于Yippee-Mis18超家族,具有一个锌指结构域。
  分别将Ap-Hemolin和Ap-Yippee的ORF构建入Pet-28a(+)表达载体进行原核表达,均得到了与预测分子量大小相符的重组蛋白。然后利用镍亲和柱进行重组蛋白的纯化,并制备兔多克隆抗体。为进一步验证Ap-Hemolin和Ap-Yippee的功能奠定了基础。
  2.Ap-Hemolin和Ap-Yippee的时空表达分析。
  检测了Ap-Hemolin和Ap-Yippee在五龄三天柞蚕幼虫不同组织中的表达情况。结果表明Ap-Hemolin和Ap-Yippee在几乎所有的组织中均有表达。Ap-Hemolin在血淋巴及脂肪体中表达水平较高,而Ap-Yippee在脂肪体和马氏管中表达水平较高。在时期表达特征分析中发现Ap-Hemolin基因在蛹期和蛾期表达明显高于其他其他时期,而Ap-Yippee基因则在蛹期和卵期表达较高。
  3.Ap-Hemolin和Ap-Yippee之间的相互作用关系。
  利用先前制备的Ap-Hemolin和Ap-Yippee多克隆抗体,采用Far-Western在体外进行了Ap-Hemolin和Ap-Yippee蛋白之间互作实验。结果表明柞蚕Ap-Hemolin和Ap-Yippee重组蛋白可以在体外相互结合。并通过RNAi技术分别沉默AP-Hemolin和AP-Yippee基因,发现在AP-Hemolin基因沉默后,AP-Yippee基因表达量降低,而AP-Yippee基因沉默后,AP-Hemolin基因的表达量也有所降低。说明二者之间确实存在着某种调控关系,但是其调控过程很可能有别的基因参与。
  4.Ap-Hemolin和Ap-Yippee蛋白的免疫学功能分析。
  采用柞蚕核多角体病毒(AP-NPV)、大肠杆菌(E.coli)、白僵菌(B.bassiana)对柞蚕五龄三天幼虫进行免疫刺激后分析检测Ap-Hemolin和Ap-Yippee在血淋巴及脂肪体中表达模式的差异。发现免疫刺激后Ap-Hemolin和Ap-Yippee在mRNA和蛋白水平上均有上调且在不同病原微生物刺激下表达模式也不尽相同,表明Ap-Hemolin和Ap-Yippee在柞蚕的免疫应答过程中具有重要作用。体外凝集试验发现,重组的Ap-Hemolin蛋白在体外依然具有活性并可以发挥对大肠杆菌的凝集作用。
[硕士论文] 何洪飞
电子与通信工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:随着丝绸产品的流行,丝绸业的发展势头良好,养蚕为众多企业和农户带来可观的收入。现在,国内的养蚕业已经进入社会化大生产阶段,实行催青企业集中统一催青,待蚕种转青后发给蚕农,蚕农负责饲养桑蚕,待蚕化蛹后将茧卖给企业,最后由企业负责再加工的商业模式。催青是桑蚕养殖的第一阶段,其决定了蚕卵的活化率、齐整度,幼蚕的免疫力,以及蚕的发病率、成活率,因此,蚕种催青在整个养蚕周期中起着决定性的作用。
  蚕种催青时,需要根据蚕种活化的程度、孵化齐整度、以及预期孵化结束时间,调控催青室内的温湿度状态,保证蚕卵能够正常活化,在特殊情况下,需要人为地加速或者抑制蚕卵的活化进度。针对蚕种催青工作,顺应企业用户的应用需求,本文设计了一款新型的蚕种催青测控系统,其采用较新的硬件资源,以液晶屏为人机交互界面,具有远程监控功能,使用模糊PID控制算法,其能够达到用户对温湿度控制的精度要求,能够有效地满足蚕种催青工作的需求。
  本文主要针对蚕种催青测控系统进行研究和设计,研究内容包括:
  (1)确定系统方案:研究蚕种催青的工作流程,分析用户的需求,分析原有测控系统的优缺点,确定系统的设计需求以及注意事项。按照对系统的分析,选取合适的资源,并构造硬件系统。
  (2)选择并设计控制算法:比较常用控制算法的优缺点,根据控制精度的要求,确定测控系统使用的控制算法。研究控制器的设计要点和注意事项,设计并调试其性能。
  (3)系统的软件设计:在系统硬件平台的基础上,完成硬件资源底层驱动和应用功能的开发,使各硬件资源协同工作。软件设计的工作可分为:传感器数据的采集和处理、历史数据的存储与提取、与计算机的协同、人机交互界面的设计、控制算法的代码实现。
[硕士论文] 邱剑超
电路与系统 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:一直以来,蚕种养殖是蚕农的主要收益之一。随着近年来社会和科技的迅速发展,蚕农也越来越关心蚕种的质量和经济效益。实践表明,只有不断提高蚕种催青技术和完善催青管理系统,才可以培育出高质量和高效益的蚕种。
  蚕种催青系统主要是为了帮助将蚕种催青室的温湿度控制在一个适当的范围,给蚕种提供一个最合适的生长环境。本蚕种催青系统采用的是自适应模糊PID算法,能有效的控制催青室的温湿度,提高控制效果。随着网络科技的发展,需要一套远程催青系统测控软件来给蚕种催青提供更好的帮助。因此,本课题就针对蚕种催青测控系统设计出一个蚕种催青系统远程测控软件,该测控软件是在蚕种催青系统的基础上进行开发,用来观察、记录催青室的情况,对催青室的温度、湿度等数据进行采集、存储,且能够远程监控催青室的情况。
  本课题是基于C/S模式下在Visual Studio和Eclipse平台上进行开发,设计出一套图形界面化显示的测控软件。在PC机上设计的客户端和服务器软件,是基于C/S(客户端/服务器)架构模式,采用C#语言进行开发设计的。手机客户端软件是基于Eclipse的Android开发环境,采用Java语言进行开发设计。采用SQL Server数据库进行数据存储和管理。各个部分之间都是基于TCP/IP协议通过套接字Socket进行数据传输,该协议是面向对象,提供可靠传输,可保证数据的实时性和安全性。
  该催青测控软件主要包括五大部分:第一部分为接口通信,主要是催青测控软件与催青测控机之间的数据通信、温湿度设定值的传输等;第二部分主要是催青测控服务器软件图形界面设计,主要包括温湿度的实时显示、信息配置等;第三部分主要是服务器和客户端之间的通信,采用 C/S架构模式进行通信;第四部分主要是客户端的图像界面设计。第五部分主要是数据管理,相关的数据信息都是采用SQL Server数据库进行存储,并且采用双机备份,以防止数据的丢失问题。
[硕士论文] 徐国庆
机械工程 重庆理工大学 2017(学位年度)
摘要:我国是世界蚕桑的起源国和传播国,蚕茧作为我国的国计民生的重要组成部分,在多个领域内具有广泛的应用。蚕茧养殖业在每年育种时,通过将蚕茧割开,从中取出蚕蛹并进行人工亲本雌雄识别来保证优良蚕种的杂交优势,避免因同亲本繁殖而造成的影响蚕丝质量等问题。
  到目前为止,我国桑蚕养殖业制种削口作业仍然以手工作业的形式为主,但这种作业方式存在诸多如生产效率低、劳动工作强度大、容易切伤手指的弊端。为解决此类问题,蚕种生产领域内急需高效、实用、安全的机械削茧装备来代替手工作业。
  论文针对目前手工切削蚕茧劳动强度大,切削效率低的难题,主要展开了以下几个方面的研究:
  (1)针对目前手工切削存在的主要问题,根据蚕茧切削的相关要求提出了蚕茧制种切削装备整体设计方案,并搭建了实体模型,通过实际工作效果验证方案的可行性。根据模块化的设计理念,按照功能要求将蚕茧切削装备分为粘结分离器、排列输送装置、压紧装置、夹持切削系统四个模块。
  (2)针对蚕茧的粘结问题,提出了满足分离要求的粘结分离器设计方案,对粘结分离器进行了结构设计和动力选型,并建立了三维模型,制作出实体零部件。
  (3)根据蚕茧制种切口的姿态要求,提出了蚕茧排列输送装置的设计方案,对其进行了结构设计及动力选型,并建立了三维模型,并制作出实体零部件。
  (4)根据蚕茧的物理特征,提出了压紧装置的设计方案,完成了压紧装置结构设计,建立了三维模型,并制作了实体零部件。
  (5)结合了不同种类蚕茧的物理形态特征,对比了不同的切削方式,提出了满足不同品种大小蚕茧切削需求的夹持切削方案,完成夹持切削系统的设计,建立了三维模型,并制作出实体零部件。
  (6)对整机进行了模态分析,通过分析数据确定了整机的固有频率,确保了整机工作时不会发生共振。
  (7)根据整机各个功能部件的工作原理和整机设计方案,搭建出实体样机,提出了切实可行控制系统方案,对控制系统的元器件进行了硬件选型和软件设计,结合整机结构进行控制系统的开发和装备调试。
  (8)设计了整机装备切削效果验证的实验方案,对实验数据进行了处理,分析了所设计的机械存在的问题,并提出了改进意见。
[硕士论文] 李巧丽
林木遗传育种 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:叶绿体基因组的结构和组成较为保守且其片段的变异速率适中,适合用于研究植物的系统进化。桑树是在亚洲地区栽培的重要经济作物,本实验以广东桑(Morusatropurpurea Roxb)的栽培品种“一串红”和鲁桑(Morus multicaulis Perr)的栽培品种“日本胡橙”为实验材料,利用高通量测序技术对广东桑和鲁桑叶绿体基因组进行测序,研究桑属栽培种广东桑和鲁桑的叶绿体基因组结构,结合蒙桑(Morus mongolica Schneid)、印度桑(Morus indica Linne)和川桑(Morus notabilis Schneid)的叶绿体基因组,对桑属植物的亲缘关系进行研究。主要研究结果如下:
  1.广东桑和鲁桑叶绿体基因组是典型的四部分结构,广东桑叶绿体基因组总长159113 bp,两个反向互不重复区(IRa和IRb)均长25707 bp,被小单拷贝区(SSC)和大单拷贝区(LSC)分隔开,SSC和LSC的长度分别是87824 bp和19875 bp;鲁桑叶绿体基因组全长159154 bp,包括一对反向重复区长为25678 bp,一个大的单拷贝区长为87763 bp和一个小的单拷贝区长为20035 bp。
  2.广东桑和鲁桑的叶绿体基因组注释相同数量的基因,共有130个基因,包含85个蛋白编码基因(18个基因位于反向重复区)、8个核糖体RNA基因(r RNA)和37个转运RNA基因(t RNA)。且广东桑和鲁桑中含有内含子的基因的数量是一样的,均为24个,其中有22个基因只包含1个内含子(包括12个蛋白编码基因、8个t RNA基因和2个假基因),另外有2个基因含有2个内含子,分别是clpP基因和ycf3基因,广东桑和鲁桑叶绿体基因的数目、种类以及CG含量与其他的桑属植物相类似。
  3.通过生物信息学分析,广东桑有83个简单重复序列(SSR)位点,单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重复基序的个数分别是60个、8个、3个、10个和2个,未发现六核苷酸重复序列,数量最多的重复序列是A/T和AT/TA,这些重复基序占总数的79.8%;而鲁桑共搜索到82个SSR位点,单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重复基序分别有63个、7个、2个、9个和1个,同样未发现六核苷酸,单核苷酸重复基序在鲁桑的叶绿体基因组总重复基序中占76.8%。所有的单核苷酸和14个SSR的多核苷酸由A和T组成。对SSR位置进行探讨,10个核苷酸重复基序位于编码区,其余的位于非编码区。大多数位点都偏向由A或T组成。
  4.用MEGA6.0软件通过最大似然法(ML)和邻近法(NJ)对包括5个桑属物种在内的27个物种的叶绿体全基因组序列进行聚类分析,桑属物种聚成一组,其中广东桑和蒙桑聚成一个小组,再和鲁桑聚在一起,印度桑和川桑聚成一个小组。研究结果对于叶绿体基因组工程研究、桑属种间的分子标记开发和优良品种培育具有一定参考价值。
[硕士论文] 于慧敏
生物化学与分子生物学 安徽农业大学 2017(学位年度)
摘要:柞蚕(Antheraea pernyi)最早在中国山东地区发现并开始养殖驯化,是我国重要的一类野生绢丝昆虫。丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)在昆虫的先天免疫中通过与丝氨酸蛋白酶相互制约达到一定的动态平衡,从而调节生物体内很多的生命活动,在昆虫的先天免疫中发挥重要的作用。本文主要研究serpin-like基因的表达模式和在柞蚕先天免疫中的功能,研究结果如下:
  本研究利用PCR技术成功克隆并获得一个读码框为837bp的serpin-1like基因,其含有一个保守的serpin结构域,进化树分析显示其与印度柞蚕亲缘关系最近,同源性高达为82.1%。
  通过构建原核表达载体pET-28a-Ap-serpin-like,并经不同浓度IPTG诱导成功获得了重组pET-28a-Ap-serpin-1like蛋白。大量诱导后使用蛋白纯化柱对重组蛋白进行纯化,得到浓度和纯度都非常高的pET-28a-Ap-serpin-1like蛋白,蛋白浓度约为0.5mg/ml。以获得的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,通过实验室常规取血方法取血得到Ap-serpin-1like抗体并检测效价约为1∶128000。
  利用PCR技术和Western Blot实验操作方法检测serpin-llike基因在柞蚕五龄三天幼虫的血淋巴、表皮、丝腺、脂肪体、中肠和马氏管中的表达情况,结果表明Ap-serpin-like在柞蚕中属于组成性表达,在脂肪体中表达最高,在血淋巴中表达量最低。
  同时利用实时定量PCR技术检测柞蚕不同发育阶段serpin-1like基因的表达情况,发现serpin-1like在蛹期表达量最高,在四龄时候表达量低,其他几个龄期表达差异不显著。
  随后研究了在四种病原微生物刺激下柞蚕五龄三天幼虫免疫功能所受到的影响。利用实时定量PCR技术分别检测脂肪体、血淋巴和中肠中Ap-serpin-like基因在病原微生物刺激后的转录表达水平。实验结果表明在三种组织中都能明显上调或下调Ap-serpin-like的表达。
  实验发现:在脂肪体中,Ap-serpin-1like除了注射B.bassiana在24-48h下调之外,其他三种菌的各个时间段均表达量上调,但各时间段上调程度有所不同。在血淋巴中,注射B.bassiana和M.luteus,Ap-serpin-1like mRNA表达量在24h达到最高,而注射E.coli在第一个检测时间点1.5h的时候表达量高于其他的检测时间点。柞蚕的中肠中,表达情况是有所不同的:注射B.bassiana对柞蚕刺激后,Ap-serpin-1like mRNA在48h表达明显高于其他的时间段。注射NPV后Ap-serpin-like在24h表达水平达到最高。M.luteus诱导后,Ap-serpin-like的转录水平在1.5h表达量最高。而注射E.coli对Ap-serpin-1like mRNA表达影响较小。
  综上所述,Ap-serpin-1like在柞蚕的先天性免疫应答中可能有重要的作用和功能,本研究可以为进一步从分子水平上解释丝氨酸蛋白酶抑制剂在柞蚕生理病理过程中对柞蚕免疫所产生的影响,并且也可以为研究丝氨酸蛋白酶抑制剂在其他动物、植物和微生物的各项生命活动中所承担的主要作用的研究提供参考。
[硕士论文] 彭亚纯
农业昆虫与害虫防治 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:家蚕是重要的经济昆虫,在养殖过程中容易受到病原微生物的感染引发蚕病,给桑蚕业带来巨大的经济损失,因此,家蚕抗病等免疫机制的深入研究非常迫切。家蚕依赖其先天免疫系统抵抗病原微生物的侵染,抗菌肽(AMP)的产生是家蚕的主要免疫应答反应。抗菌肽主要由IMD(immune deficiency)途径和Toll途径产生,Rel/NF-κB是两种途径中的转录因子,作为关键调节子来调节免疫相关基因。在果蝇体内,作用于Toll途径的Rel/NF-κB转录因子Dorsal被真菌和革兰氏阳性菌激活。Dorsal在细胞质内与Cactus相互作用,当受到免疫刺激时,Dorsal与Cactus分离进入细胞核,进而产生抗菌肽。在家蚕体内,目前没有直接证据证明Dorsal作用于Toll途径,在受到病原菌感染后是否从细胞质进入细胞核还不清楚。
  本研究中以家蚕为模式生物,克隆Dorsal基因,构建原核表达菌株并表达、纯化Dorsal蛋白,制各家蚕Dorsal抗体。选取了革兰氏阳性菌黑胸败血菌Bacillusbombysepticus和革兰氏阴性菌假结核耶尔森氏菌Yersinia pseudotuberculosis、大肠杆菌Escherichia coli分别注射感染家蚕,取感染后12h、24h脂肪体细胞进行核质蛋白提取,分别检测细胞核、细胞质中Dorsal蛋白的含量变化及蛋白分子量,通过其含量变化和分子量的变化推测Dorsal的激活、转运。选取了革兰氏阳性菌黑胸败血菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌注射感染家蚕,检测Attactin2,CercropinE,Lebocin,Gloverin3,Moricin五种抗菌肽表达量的变化是否与Dorsal蛋白的变化一致。结果如下:
  (1)利用大肠杆菌表达家蚕Dorsal蛋白,获得家蚕Dorsal抗体。
  (2)提取感染后的家蚕脂肪体细胞核质蛋白,用Dorsal抗体检测核质内Dorsal蛋白,发现感染12h时,Dorsal蛋白可能以二聚体形式存在于细胞质中,在细胞核中并未检测到Dorsal蛋白;24h时,细胞质中Dorsal被激活,在蛋白水平发生改变,并且在受到细菌感染后部分活化的Dorsal蛋白由细胞质转运后进入细胞核,感染革兰氏阳性菌后转运效果更明显。
  (3)利用实时定量PCR检测发现,家蚕在感染黑胸败血菌和大肠杆菌后,Attactin2,CercropinE,Lebocin,Gloverin3,Moricin在家蚕脂肪体中的表达水平均有显著上升,说明家蚕感染病原菌后会激活抗菌肽的表达。
  结果表明:家蚕感染细菌24h后激活Dorsal蛋白,Dorsal在蛋白水平发生变化,并且部分蛋白从细胞质转运进入细胞核,且革兰氏阳性菌的激活作用较革兰氏阴性菌更明显。
[博士论文] 杨锐
特种经济动物饲养 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:杆状病毒是发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒。其中家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,简写BmNPV)是家蚕主要病害-血液型脓病的主要病原,每年给蚕桑业造成巨大的经济损失。由于对于BmNPV侵染增殖机制研究并不深入,迄今为止对于其感染家蚕导致的核型多角体病仍无有效控制的方法。虽然杆状病毒大多数基因的功能已经被阐明,然而仍有部分基因在病毒生活史中的作用未知,这严重制约了对该病毒感染分子机制的深入了解。本研究以BmNPV两个保守基因但功能仍然未知的基因,bm58a和bm109,作为研究对象,对其转录、表达以及亚细胞定位与病毒结构定位进行了系统研究,进一步利用Bac-to-Bac系统和Red同源重组系统,构建了基因缺失的重组病毒,阐明了它们在病毒生活史中所起的生物学功能。主要结论如下:
  1.BmNPV bm58a基因的研究。
  bm58a基因位于BmNPV基因组nt56,183-nt56,310处,全长183bp,编码60个氨基酸。RT-PCR分析表明,病毒感染后24h可检测到其转录产物,蛋白印迹结果显示病毒感染后24h可检测到Bm58a的表达。这些结果证明bm58a是极晚期基因。通过构建缺失型突变体发现,bm58a的缺失并不影响病毒的感染力,电镜分析显示病毒组装、多角体形成以及ODV包埋入多角体均未受到影响。生物学分析表明,bm58a并不影响病毒的经口感染,但昆虫死亡后的液化过程却受到严重干扰,说明Bm58a参与昆虫液化过程并发挥重要作用。
  2.BmNPV bm109基因的研究。
  bm109基因位于BmNPV基因组nt103,571-nt103,802处,全长663bp,编码220个氨基酸。RT-PCR分析表明,病毒感染后12h可检测到其转录产物,蛋白印迹结果显示病毒感染后12h可检测到Bm109的表达。这些结果证明bm109是晚期基因。通过构建基因敲除突变体发现,bm109的缺失显著降低了病毒的感染力。进一步分析显示,虽然Bm109是病毒衣壳蛋白,但病毒组装、多角体形成以及ODV包埋入多角体均未受到影响,但是核衣壳由病毒发生基质向核膜转运的过程却受到严重影响。在Bm109缺失的基础上,利用转座将不同的截短型的Bm109蛋白补回到Bm109缺失型病毒中,结果表明Bm109的C端对于该病毒的功能至关重要。进一步利用双向酵母双杂交系统对Bm109与杆状病毒其他结构蛋白之间的相互作用进行了研究,结果表明Bm109与FP和49K蛋白存在相互作用。
[硕士论文] 严婷婷
生物制药 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)的感染引起的,导致仔猪发病率和致死率都极高的一种猪常见的病,研制新的安全有效的疫苗十分必要。鉴于纤突蛋白S是PEDV主要的中和表位和受体结合域,与病毒抗原性和吸附入侵密切相关,我们将PEDV S1(1~735 aa)区插入到GP64信号肽与特定膜锚定结构(TMD)之间,并与eGFP基因融合,构建到转移载体pFastBacHTB上,利用Bac-to-Bac系统构建重组家蚕杆状病毒rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD。重组病毒感染BmN细胞后,Western Blot检测到约为150 kDa及400kDa的两条带,初步推断是由于S1蛋白发生了N-糖基化以及形成了三聚体。
  本研究以该重组病毒为免疫原雾化免疫BALB/c小鼠,野生病毒WT-BmNPV为阴性对照,TGEV/PEDV二联灭活疫苗为阳性对照。间接ELISA检测雾化免疫16d后小鼠血清中PEDV特异性的抗体水平。ELISA结果表明,在重组病毒rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD和TGEV/PEDV二联灭活苗雾化免疫16d的小鼠血清中均检测到较高水平的PEDV特异性的抗体,且效价均可达1∶6400,说明重组病毒rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD和TGEV/PEDV二联灭活苗雾化免疫能很好的刺激小鼠体液免疫反应。针对分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的酶联免疫分析结果显示,不管是血清还是肺泡灌洗液,rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD免疫组产生的sIgA浓度均显著高于TGEV/PEDV二联灭活苗免疫组,说明rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD免疫小鼠后能刺激小鼠产生高水平的sIgA,引起了较强的黏膜免疫反应。脾淋巴细胞增殖实验表明与WT组相比,rvB mBacmid-SP-S1-eGFP-TMD组和TGEV/PEDV二联灭活苗组均发生明显增殖(P<0.05),说明rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD和TGEV/PEDV二联灭活苗免疫组小鼠淋巴细胞对抗原的重新接触表现出了增殖效应,对小鼠淋巴细胞的活化具有明显的刺激作用,使小鼠产生了细胞免疫反应。免疫鼠脾CD8+T淋巴细胞的流式细胞仪检测结果显示rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD组和TGEV/PEDV二联灭活苗组CD8+T细胞比例均高于WT组,说明rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD、TGEV/PEDV二联灭活苗免疫小鼠可以使小鼠淋巴细胞表现出较好的分化能力,具有较好的激活T细胞产生免疫应答的能力。
[硕士论文] 曹赟洁
生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:Argonaute(AGO)蛋白是RNA诱导沉默复合物(RISC,RNA-indeced silencing complex)的核心元件,能够与小RNA结合,对靶基因进行剪切或抑制其表达。小分子RNA是生命活动重要的调控因子,在基因转录和转录后加工,个体发育,遗传和表观遗传等生命活动中发挥重要的作用。近来研究发现,转座子(TE,Transposable element)可以产生小RNA发挥作用,而家蚕中近一半的基因组序列为转座子基因。课题前期研究我们通过RIP-seq法鉴定和分析了家蚕BmN细胞中BmAGO2蛋白结合的RNA,发现BmAGO2结合RNA中存在大量TEs及TEs来源的小RNA(TE-siRNA),其中BmAGO2结合TEs中,Bm1645的丰度远远大于其它结合的TEs,而Bm1645来源的TE-siRNA丰度也远远大于其它TEs来源的小RNA,表明Bm1645转座子是TE-siRNA的“生产基地”。在前期研究基础上,本课题进一步通过RIP-seq方法鉴定了家蚕五龄幼虫中BmAGO2蛋白的结合TE-siRNA和TEs,同时研究了转座子Bm1645来源TE-siRNA与BmAGO2蛋白的结合及其对Bm1645表达调控的关系。
  本研究主要内容包括:⑴利用前期获得的高效价BmAGO2蛋白单克隆抗体,通过免疫共沉淀法获得家蚕五龄幼虫内源性BmAGO2蛋白复合物,并成功分离其结合RNA,将50nt以下小RNA与200nt以上长链RNA分别进行高通量测序及生物信息学分析,鉴定BmAGO2结合的TEs和TE-siRNA。结果表明,家蚕五龄幼虫BmAGO2结合RNA中同样含有大量TEs和TE-siRNA,其中转座子Bm1645丰度(RPKM=73982.57)远远大于其他转座子丰度,同时Bm1645来源TE-siRNA丰度(1814707)也远远大于其他转座子来源TE-siRNA丰度,与前期BmN细胞实验结果相符。上述结果进一步证明,家蚕BmAGO2蛋白可结合大量TE-siRNA和TEs,尤其是Bm1645转座子及其来源的TE-siRNA,推测Bm1645来源TE-siRNA可能结合BmAGO2介导Bm1645的表达。⑵选取来源于Bm1645的6条TE-siRNAs,通过凝胶阻滞实验验证TE-siRNA能否与BmAGO2蛋白结合。结果表明,有4条TE-siRNAs可以和BmAGO2蛋白结合产生凝胶阻滞条带,分别为TE-siRNA134、TE-siRNA610、TE-siRNA671和TE-siRNA688,表明这4个TE-siRNAs可能结合BmAGO2蛋白行使功能。推测Bm1645来源的TE-siRNA能够与具有活性的BmAGO2蛋白结合,从而影响Bm1645的表达。进一步采用双荧光素酶实验验证了4个TE-siRNAs在Bm1645上的识别位点。选取四个TE-siRNAs在Bm1645基因上对应的靶位点序列及其突变序列,分别克隆到pIEx-1-Rluc-Luc载体(本实验室构建的双荧光素酶载体)。将重组后的载体与合成的TE-siRNA共转染家蚕BmN细胞,采用双荧光素酶报告法检测。结果显示,与突变对照相比,转染正常靶位点序列载体和TE-siRNA后,报告基因萤火虫荧光素酶催化底物的发光值显著降低(p<0.05)。说明TE-siRNA134、TE-siRNA610、TE-siRNA671和TE-siRNA688能够结合Bm1645的靶位点并抑制基因表达。⑶验证了TE-siRNA对Bm1645转座子的表达调控作用。将合成的TE-siRNA134、TE-siRNA610、TE-siRNA671和TE-siRNA688 mimics分别转染家蚕BmN细胞,荧光定量PCR法检测Bm1645的转录水平。结果显示,与阴性对照相比,转染TE-siRNA mimics后Bm1645在BmN细胞中的转录水平均出现了显著的下调(p<0.05),进一步证实TE-siRNA能够与BmAGO2蛋白相互作用,并调控TEs的转录水平。本课题首次鉴定了家蚕转座子来源TE-siRNA可以结合BmAGO2蛋白并在其介导下调控转座子的表达,为家蚕乃至昆虫中新型小RNA的鉴定与功能研究打下基础。
[硕士论文] 斯洪强
生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:环形RNA(circRNA)是具有闭合环状结构的单链RNA,其序列包含外显子信息,是基因转录后修饰的副产物。环形RNA广泛存在于真核细胞中,目前,在人和小鼠细胞中鉴定的环形RNA已达数千条,其功能涉及亲本基因的表达调控、miRNA的吸附和某些疾病的生物标志物,而家蚕环形RNA研究至今还未有相关报道。本研究通过高通量测序和生物信息学预测两种方法对家蚕环形RNA进行了规模化鉴定与分析,为家蚕乃至昆虫中新型RNA分子的鉴定和研究提供了参考。
  本研究主要内容包括:⑴通过高通量测序方法,对家蚕中的环形RNA进行规模化鉴定与分析。提取家蚕总RNA,通过试剂盒去除其中的rRNA后进行高通量测序,共获得112271320个测序read。采用环形RNA预测软件mapsplice和findcirc从获得的测序read中预测环形RNA,其中mapsplice预测到环形RNA共9778条,而findcirc预测到环形RNA共1659条,两个预测软件共同预测到的环形RNA有1598条,为鉴定的家蚕潜在环形RNA分子。设计特异性的正反向PCR引物对,选取其中17条SRPBM最高的环形RNA,进一步开展环形RNA的正反向PCR鉴定。结果显示,选取的17条环形RNA中,有11条可以通过PCR实验鉴定,其中,BmcircR_3621、BmcircR_8955、BmcircR_8926、BmcircR_6123、BmcircR_8349、BmcircR1198、BmcircR9535、BmcircR6215和BmcircR_7937在家蚕中以环的形式存在,并且主要成环位点与生物信息学预测结果一致,而BmcircR2196和BmcircR6226的成环位点与预测存在差异。⑵通过生物信息学方法,对家蚕环形RNA进行进一步的预测鉴定和分析。基于环形RNA的结构特征,采用perl语言编写环形RNA预测程序环形RNApredictor.pl,基于NCBI数据库中的家蚕高通量测序read(SRR315361)和家蚕基因组序列,共预测到家蚕环形RNA12955条,进一步将高通量测序read匹配预测的环形RNA序列,结果表明,许多环形RNA序列的5'和3'末端匹配的read还存在部分伸出序列,而且5'末端匹配read部分伸出序列和3'末端序列相同;同样,3'末端匹配read部分伸出序列和5'末端序列相同,证实预测的序列首尾重叠,为环状分子。另外,分析发现许多预测环形RNA之间存在同源关系。令人感兴趣的是,环形RNA与基因组的匹配分析发现,环形RNA BmCirc2091935在基因组中存在7个相似性较高的大小约为850 bp的基序,每个基序均通过一段67 nt的序列串连。对RNase R处理的家蚕总RNA进行正反向PCR鉴定,成功扩增出BmCirc2091935的相应片段,证实其以环的形式存在。进一步Northem Blot鉴定,结果表明BmCirc2091935同样存在6种成环形式,不同成环形式环形RNA之间的大小差异推测为单个基序长度的倍数。由此,我们推测BmCirc2091935可能通过可变剪切连接不同数量的基序,从而生成不同成环形式的环形RNA,目前尚未有关于此类环形RNA的报道,其成环机制和功能还有待进一步研究。
[硕士论文] 周燕燕
特种经济动物饲养(含蚕峰) 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:昆虫海藻糖酶在昆虫生长发育,飞行能量供给,几丁质合成的调节以及机体抗逆性等方面具有重要的作用。Treh1B基因是从全基因组水平对家蚕、红带袖蝶、君主斑蝶等多个鳞翅目昆虫的海藻糖酶基因进行分析新发现的海藻糖酶基因。以鳞翅目昆虫模式生物家蚕为研究对象,通过进化分析和共线性分析发现,它是通过Treh1A基因复制产生,这两个基因序列相似,结构相似,相邻串联在家蚕17号染色体上。两个基因分别编码一条578个和579个氨基酸多肽,两条多肽有49%的相似度。
  本课题主要包括以下5部分的研究:
  1、首先通过序列分析对鳞翅目昆虫海藻糖酶的进化和功能分歧进行了分析,结果显示Treh1基因只有在鳞翅目昆虫中发生了复制,产生了Treh1B基因,而且复制基因发生功能分歧,有趣的是鳞翅目昆虫中还存在两种不同的Treh1B。
  2、以鳞翅目昆虫模式生物家蚕为研究对象研究Treh1B,即BmTreh1B,首先研究了它的mRNA和蛋白质表达谱,结果显示在幼虫期表达量低,在蛹期和成虫期表达量高,而且在成虫中的前后翅,腿和触角中表达量相对较高。
  3、在BmN家蚕卵巢细胞中分别对BmTreh1A,BmTreh1B和BmTreh2进行亚细胞定位,结果显示,BmTreh1A定位在细胞质中;BmTreh2定位在核膜和细胞器膜上;而BmTreh1B定位在细胞器中,推测是溶酶体中。
  4、用杆状病毒表达系统表达并用镍柱纯化了BmTreh1A,BmTreh1B,BmTreh2,TvTreh1B和short BmTreh1B重组蛋白,然后用纯化的重组蛋白分别测定了它们的酶动力学性质,如底物特异性,最适pH,抑制剂,Km和Vmax值。结果显示,BmTreh1A,BmTreh1B,BmTreh2特异性水解海藻糖,最适pH均为酸性,但BmTreh1B的耐酸性更强,最适pH为5,BmTreh1A和BmTreh2最适pH为6,井冈霉素对三个海藻糖酶的抑制效果显著,而α-葡萄糖苷抑制剂的抑制效果不显著;与BmTreh1A和BmTreh2相比,BmTreh1B的Km值较大。而TvTreh1B和相应截短的BmTreh1B却没有酶活性。
  5、用CRIPRS/Cas9技术获得了三种纯合Bm Treh1B突变体基因型,并进行了表型的初步分析,结果发现BmTreh1B基因的缺失导致了家蚕各个时期个体偏小和成虫翅膀的畸形,说明BmTreh1B可能调控翅膀的发育。
  综上所述,在鳞翅目昆虫中新发现了一个海藻糖酶Treh1B基因,本课题研究Bm Treh1B基因发现它在时空表达和亚细胞定位以及酶动力学性质都存在差异,而且突变体表型初步分析发现会导致翅膀畸形。该研究结果为今后进一步深入研究Treh1B的功能和作用机制奠定了重要的基础。
[硕士论文] 邱传振
生物学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:昆虫嗅觉是一种高度特异和敏感的化学检测系统,可识别环境中特异的气味分子,在寻找食物、配偶和产卵地等过程中起着重要作用。触角是昆虫最重要的外周嗅觉器官,分布有大量的感受器。触角感受器内有大量的嗅觉蛋白和气味降解酶,是昆虫识别气味分子的重要基础。昆虫的嗅觉反应可大致归纳为:外界环境中亲脂性的气味分子可以通过嗅觉感器的微孔进入亲水性的感器淋巴液,经感器淋巴液中的气味结合蛋白(odorant-binding proteins,OBPs)结合并运转到位于神经元膜上的嗅觉受体(olfactory receptors,ORs),嗅觉反应被激活,随后这些气味分子被感器淋巴腔或支持细胞中的气味降解酶(odorant-degrading enzyme,ODE)降解,以保持嗅觉的灵敏性。
  约5000年前,家蚕(Bombyx mori)由野桑蚕(B.mandarina)驯化而来,历经长期的人工驯化,家蚕与野桑蚕在行为和生理上都表现出了一定的差异,比如体色和蚕蛾个体的大小等。事实上,除了显而易见的性状外,驯化过程也影响了蚕蛾的嗅觉神经生理响应,已有研究发现家蚕对环境气味分子的嗅觉反应已大大降低。近年来,家蚕的全基因组测序的完成和大量嗅觉相关蛋白数据的公布,为研究驯化对家蚕嗅觉感受影响的分子机制奠定了基础。本文基于前人研究的基础上,利用转录组技术分析家蚕和野桑蚕雌/雄触角转录组,鉴定差异表达的嗅觉相关基因,并结合家野蚕重测序基因组数据鉴定受选择基因的嗅觉基因和分子群体进化,揭示驯化对家蚕嗅觉系统的影响。所得主要结果如下:
  1.家蚕和野桑蚕触角转录组的比较分析
  利用RNA-seq方法对家蚕和野桑蚕的成虫触角进行转录组测序,质控分析后,我们总共得到转录组的有效碱基数为61.2Gb,将其与家蚕参考基因组比对和组装,共获得22768基因,其中16904基因有表达信号。其中9个基因在家蚕和野桑蚕中呈极度高的表达水平(FPKM>10000),这些基因主要是编码嗅觉感知和化学感受的蛋白,如BmPBP1、BmGOBP2和BmABPX都是结合性信息素的相关气味结合蛋白。我们对嗅觉相关基因进行了鉴定,基于前人对嗅觉相关基因在家蚕基因组中的注释信息,我们在触角转录组中新鉴定2个气味结合蛋白、7个气味受体、5个离子受体、一个羧酸酯酶以及一个细胞色素P450。我们对四个样本的6个比较组差异表达基因进行统计,共获得2109个。所有差异表达基因GO富集显示:有大量与嗅觉感知相关的GO term被显著富集。本研究重点关注了家蚕与野桑蚕同一性别间的差异表达基因,D_FvsW_F和D_MvsW_M比较组的差异表达基因分别为1173和1410个。两组比较鉴定出嗅觉基因和气味降解酶差异表达基因分别为30和19个,其中野桑蚕上调表达的嗅觉基因19个,编码气味降解酶的基因有14个。结果表明家蚕中下调的嗅觉相关基因要远远多于野桑蚕,这可能是家蚕相对野桑蚕嗅觉灵敏度显著降低的重要原因。
  2.基于群体基因组数据对差异表达的嗅觉基因进化分析
  基于本实验室已经测序获得的8个家蚕品系和7个地域野桑蚕高质量的重测序基因组数据,我们对家蚕与野桑蚕同一性别间呈现差异表达的OBPs和ORs基因进行了群体遗传分析。利用DnaSP软件对差异表达嗅觉基因的π、θπ和Tajima’s D等遗传参数进行计算,发现上述嗅觉基因在家蚕中的进化速率低于野桑蚕。利用SIFT软件对家蚕和野桑蚕特有的非同义突变位点进行耐受性分析,发现家蚕OR30和OR57的2个多态性非同义替换分别导致的316氨基酸位点和的220氨基酸位点的突变是有害的。事实上,家蚕OBPs和ORs的非同义突变明显少于野桑蚕,而在家蚕中却积累了这些有害突变,这可能是家蚕嗅觉反应降低的另一重要原因。
  综上所述,基于家蚕和野桑蚕触角转录组数据分析,本研究鉴定了家蚕与野桑蚕桑蚕相同性别间呈差异表达的嗅觉基因和气味降解酶基因,分别为30和19个,其中野桑蚕上调表达的嗅觉相关基因要远多于家蚕,这可能是家蚕嗅觉反应下降的重要原因之一。虽然家蚕OBPs和ORs的非同义突变要少于野桑蚕,但是野桑蚕在野外环境下为保证嗅觉高度敏感而能够清除有害突变,家蚕在室内环境对嗅觉依赖度低从而积累了一定的有害突变。本研究初步揭示了驯化导致家蚕嗅觉退化的分子基础,为阐明其分子机理提供了可靠的候选基因,具有重要的理论和实践价值。
[硕士论文] 刘怡
生物学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:昆虫具有高效的先天性免疫系统以防御病原菌和寄生虫对自身的侵袭,体液免疫和细胞免疫为昆虫的两大免疫系统。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是昆虫体液免疫反应中的重要效应因子,对于防御外来微生物入侵发挥着重要作用,可以直接抑制入侵微生物的增殖甚至直接将其杀死。已有的研究表明蜕皮激素20E(20-hydroxyecdysone,20E)对昆虫的先天性免疫反应有重要调控作用,当昆虫遭到病原菌入侵时,其机体的20E通过Immune Deficiency(IMD)信号通路上调AMPs等免疫相关基因的表达。但是,20E是怎样调控AMPs等免疫相关基因表达的分子机制仍不清楚。本文对转录因子BmBrC-Z是否在家蚕体液免疫反应中介导了20E诱导抗菌肽基因表达进行了探究,结果证实了BmBrC-Z确实介导了20E上调BmAMPs的表达。主要结果如下:
  1、分别用大肠杆菌E.coli和黑胸败血芽孢杆菌B.bombyseptieus侵染家蚕五龄3天的幼虫,发现若在侵染前注射外源20E,家蚕的存活率显著升高,血液中菌落数量显著降低,表明蜕皮激素20E可以促进家蚕的免疫反应。
  2、分别在体内和体外用20E诱导家蚕的脂肪体进行并检测7个BmAMPs基因的表达水平,发现20E上调BmAMPs基因的表达且不同基因之间差异显著,初步筛选出表达量最高的BmCeCE作为主要研究对象之一。
  3、对11个BmAMPs基因启动子区域的转录因子结合位点进行预测,发现其中10个基因的启动子区域均存在BrC-Z元件,预测BmBrC-Z基因对BmAMPs基因具有调控作用;随后在BmNs细胞系中过表达BmBrC-Z基因并检测7个BmAMPs基因的表达水平,选出表达量最高的两个基因BmLeB3和BmGlv2,与BmCeCE一同作为进一步转录探究的抗菌肽基因。
  4、构建家蚕BmCeCE、BmGlv2和BmLeB3启动子的荧光报告载体并在BmNs细胞系中用20E诱导,证实这3个BmAMPs基因的确受20E信号的上调,将BmLeB3启动子上的BrC-Z4调控元件突变后启动子活性显著降低且不再受20E调节,表明BrC-Z是20E诱导BmAMPs的重要调控元件。
  5、在转染BmAMPs启动子报告基因的BmNs细胞系中将BmBrC-Z基因过表达后发现BmAMPs启动子活性显著升高,更直接地表明BmBrC-Z基因可以介导BmAMPs的表达。
  综上所述,在家蚕的体液免疫系统中,20E信号可以上调抗菌肽基因BmCeCE、BmGlv2和BmLeB3的表达,BmBrC-Z转录因子介导了这一过程。
[博士论文] 陈瑞婷
特种经济动物饲养(含蚕蜂) 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:家蚕是一种重要的经济动物和模式昆虫,丝腺是家蚕非常重要的吐丝器官,直接决定着家蚕产丝量的多少。在家蚕由幼虫到蛹的变型期,丝腺器官发生了剧烈的退化,在短时间内消亡,这一过程涉及到了细胞凋亡。目前,细胞凋亡分子调控机制在哺乳动物中研究的较为清楚,但对于家蚕中的凋亡分子机制知之甚少。Dredd为caspase家族同源蛋白,本研究克隆到了家蚕BmDredd基因,并分别在细胞水平和丝腺组织水平揭示了其功能,调查了其与相关凋亡蛋白BmFadd的互作关系。同时,利用高通量测序技术,进行了家蚕五龄第3天和吐丝36h后部丝腺mRNA、lncRNA与miRNA的差异表达分析,并对差异表达lncRNAs与miRNAs的靶基因做了GO功能预测。分析了BmDredd与lncRNA、miRNA的互作网络。对这些内容的探索使得家蚕细胞及丝腺凋亡的分子调控机制研究更为完善,主要研究内容和结果如下:
  1)克隆到了BmDredd基因,并且对其生物学信息进行了分析,其ORF全长1632bp,编码543个氨基酸,分子量大小约为63KDa,含有N端的long prodomain和C端的CASc domain。
  2)在细胞水平进行BmDredd的功能研究:对BmN细胞进行了诱导凋亡、dsRNA干扰处理。我们发现凋亡的细胞中BmDredd表达量升高,而RNA干扰BmDredd的表达则可以减小细胞凋亡率,提高正常细胞数量。另外,我们构建了BmDredd的N端、C端融合表达载体以及ORF序列过表达载体,结果发现过表达BmDredd可以引起细胞凋亡,细胞凋亡时,BmDredd由细胞质迁移到细胞核中,其核定位片段既不是独立的N端long prodomain序列,也不是C端CASc序列,推测定位序列位于376-987bp之间。dsRNA干扰凋亡相关基因后实时定量检测其他基因表达量结果显示,BmDredd与BmDaxx,BmCide-b,BmFadd,BmCreb之间存在着复杂的调控关系,他们一起参与调控细胞凋亡的执行。
  3)丝腺水平的BmDredd功能研究:我们检测了不同时期家蚕丝腺中BmDredd表达量以及家蚕不同组织在吐丝18h时BmDredd表达量,发现丝腺凋亡期间,BmDredd表达量升高,表明BmDredd与丝腺凋亡有着极重要的联系。并且,在蜕皮激素饲喂家蚕后,BmDredd表达量升高,说明BmDredd属于蜕皮激素下游靶基因。Caspase抑制剂处理丝腺可以降低BmDredd表达量,注射dsRNA-BmDredd到家蚕丝腺可以延迟丝腺凋亡,在丝腺中过表达BmDredd引起过表达部位caspase-3活性的升高,所有结果都显示BmDredd参与和诱导丝腺凋亡。
  4)Fadd属于Fas结合蛋白,在哺乳动物中可以与procaspase-8结合形成DISC(Death-inducing signalling complex),引起细胞死亡。本实验我们纯化到了含GST标签的BmFadd蛋白,通过与凋亡细胞胞质总蛋白孵育,清洗和洗脱后质谱检测,发现凋亡时BmFadd并没有与BmDredd蛋白发生互作。
  5)使用二代测序技术发现被归到Death相关功能下的mRNAs在表达量上都没有显示出显著性变化,这从侧面反应了lncRNA和miRNA在丝腺凋亡发生期间对mRNA的调节可能十分重要。共鉴定到家蚕中10947个lncRNAs,预测到索引号为TCONS_00023629、TCONS_35829、TCONS_28940、TCONS_28943、TCONS_30941的lncRNAs参与了凋亡过程。另外有344个miRNAs靶向调节着285个mRNAs都与GO条目下Death process有关。这说明,相比于lncRNA,miRNA在家蚕丝腺凋亡的分子调控中起到了更为广泛和重要的作用。最后,筛选出了可能与BmDredd互作的746个lncRNAs和20个miRNAs,并做了三者间的网络互作图。
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