绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
导航
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 97
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 1939 条结果
[硕士论文] 贺小琴
药物分析学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:寡核苷酸适配体(简称适配体,aptamer),系指经指数富集配基系统进化(SELEX)技术筛选得到的一段短的单链寡核苷酸序列(ssDNA或RNA)。适配体通过折叠成一定的三维结构,经空间构型互补与靶分子形成高亲和力,高特异性结合,故又称为“化学抗体”。其与靶分子之间的分子识别作用与抗体极为相似,但特异性和亲和力甚至更高。与抗体相比,适配体稳定性好、能够进行大量的化学合成、并且无免疫原性、无毒性。另外,适配体具有核酸自身变性复性快速可逆、易功能化修饰与标记、及作为优良的纳米器件等诸多特点,是一类重要的“明星分子”。
  随着新型SELEX筛选技术、高通量测序、生物芯片等序列活性评价技术的快速应用,所筛选出来的适配体分子种类逐年增多,作用的靶分子范围从离子、小分子、转录因子、蛋白(酶),到细胞、组织、细菌、病毒等等,也更加广泛。适配体在分析传感、临床诊断和治疗方面存在巨大潜力。然而,到目前为止,仅有少量适配体进入到临床试验研究阶段,仅有一种适配体药物经FDA批准上市,即治疗老年相关性黄斑病变的哌加他尼。做为商业化临床诊断元件的适配体亦寥寥无几,此点与蓬勃发展的适配体研究趋势并不匹配。其主要技术瓶颈应在于其自身二三级结构不清、与药靶的相互作用机制不明、体内生物利用度尚待提高等方面。
  从分子相互作用基础层面而言,大多数适配体存在结构上的易变性、多样性,在与靶分子发生特异性的亲和识别时,多以“自适应”形成优势构型,但大多数适配体—靶分子的精确结构模型尚未得到,多数识别模式的判别具有片面性、经验性。另外,经SELEX技术筛选得到的适配体全长序列中,仅有部分序列存在亲和活性,亟需发展有效的技术方法指导结构剪裁及修饰,从中寻找亲和性更高、特异性更强、序列更短的适配体,除去冗余序列,提高适配体识别研究的容错度、通用性和稳定性。这就使得SELEX后优化(Post-SELEX)成为研究“热点”。Post-SELEX中多采用试错法,依据核酸二级结构及自由能(ΔG)的经验性判断,对适配体序列进行较为随机的剪裁或定点突变。其主要缺点在于随机方法效率较低、难度较大,尚无系统的理论指导和较好的解决方案。
  本学位论文的主要内容则针对上述post-SELEX中的基础科学问题进行了深入研究,共分为五章。
  第一章为前言(文献综述)部分,概述了适配体的特点、应用前景以及适配体研究存在的主要问题;对适配体后筛选优化途径、以及相应的相互作用评价优化方法进行了总结和评述;以及对适配体结构表征方法、适配体做为分析传感元件的应用现状进行了综述。最后提出本论文的立题依据及主要的研究内容。
  第二章为一种步进型组合文库的构建及基于SPR的亲和评价优化方法研究。在本章中,我们基于组合化学思想,以重组人促红细胞生成素α(EPO-α)的适配体807-39nt为模式分子,发明设计了四组步进型序列,构成新型的多方向、步进型适配体小型组合文库。该文库包含向左收缩、向右收缩、两端收缩和两端扩展等四组分子群,共35条序列。并开发了免标记SPR方法,对上述适配体序列进行快速、高效的筛选评价。最终得到了最短适配体—In27,仅保留了初始适配体39nt二级结构中的环部部分,但亲和活性与之相当。从而证实了该小型步进型组合文库构建的合理性和高效性。
  第三章为最短适配体In27的简并序列及结合位点研究。本章使用定点碱基突变的方法,结合结构域划分,筛选评价得到In27序列中对结合产生较大影响的关键碱基。考虑到In27仍然保留了适配体39nt中富含连续鸟嘌呤核苷酸的序列,符合G四聚体(GQ)形成的一般原则,我们在圆二色谱(CD)表征的基础上,将In27上的碱基按-GG(G)-骨架为间隔,划分为D1~D5个结构域,并构建了各定点突变分子群,共6组,分别命名为D1、D2、D3&4、D5、GQ和简并序列定点突变分子群,共32条序列。我们使用表面等离子共振(SPR)方法筛选评价,从该定点突变分子群中最终得到In27的简并序列,从而明晰了最短适配体In27的关键作用碱基。进一步,我们采用亲和竞争作用分析,界定了多种亲和识别分子,如适配体39nt及In27、EPO受体(EPOR)、EPO的单克隆抗体以及麦胚凝集素(WGA),在EPO-α上的结合作用模式。上述研究即为适配体的结构作用特点研究及适配体做为分析传感元件的成功应用奠定了基础。
  第四章为多种光谱技术对于适配体In27的活性高级结构特征研究。适配体的结构具有多样性,其“自适应”式优势构型较易受到包括pH、阳离子类型、稳定保护剂、甚至界面等在内的微环境的影响与调控,这也是大多数适配体和靶分子间相互作用特点尚待厘清和阐明的主要原因之一。本章发展和使用SPR、CD及荧光探针等多种光谱技术,研究和明确了In27的活性与构型间的关系。我们发现阳离子Na+的存在和浓度是影响In27产生特异性亲和识别的关键因素;Na+诱导下In27形成了平行/反平行的混合GQ构型;两种GQ荧光探针硫磺素T(ThT)和 N-甲基间卟啉IX(NMM)在该体系中可用做一对特征性的荧光探针,均可用于表征In27的活性高级构型。EPO-α的加入可与ThT和NMM形成竞争,从而便于利用这两种GQ荧光探针创建活性EPO-α的“光开关”型检测方法。上述研究为阐明新型适配体的活性构型提供了有效的技术组合手段,亦为分析、传感、诊断等应用领域提供了一类作用特点清晰的适配体元件。
  第五章为基于适配体的免标记检测方法研究。生物膜干涉技术(BLI)是一种新型的表面传感技术,具有免标记、灵敏、快速、作用模式多样等特点。本章中将生物素化的适配体39nt或In27固定于链霉亲和素(SA)传感芯片上,优化了用于表面固定的适配体元件的取向、浓度、非特异性作用的克服、再生条件等因素,并利用WGA和适配体作用于EPO-α的不同位点的特征,构建信号放大传感体系,用于溶液中EPO-α蛋白的灵敏检测。同时比较了SPR和BLI技术方法的异同并阐述可能原因。本研究拓宽了适配体做为分析传感元件的应用范围。
  总之,本学位论文立意于创建创新性的小型多方向步进型适配体组合文库,从而高效地筛选优化得到了最短适配体—In27,并在明确其关键碱基位点的贡献基础上构建简并序列。以多种光谱学技术手段,明确和简化得到影响适配体活性构型的关键溶液微环境因素,深入阐明了Na+诱导下的适配体In27的活性高级结构形成特点。最后,基于适配体实现了EPO-α蛋白的免标记、高灵敏检测。在为分析、传感、诊断等应用领域提供了一类作用特点清晰的适配体元件的同时,也为优化适配体结构,阐述适配体与靶蛋白相互作用时结构特征等提供了有效的技术手段。
[硕士论文] 梁红丽
药学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  制备均一性、分散性良好的金纳米颗粒(AuNPs),考察物理化学性质不同的金纳米棒(AuNRs)与金纳米颗粒(AuNPs)对牛血清白蛋白(BSA)与鸡蛋清溶菌酶(HEWL)淀粉样纤维化的影响。
  方法:
  采用经典Frens法制备AuNPs,通过紫外-可见吸收光谱法、动态光散射及Zeta电位分析、透射电子显微镜、电感耦合等离子体质谱法对AuNRs与AuNPs的理化性质进行表征,评价其均一性与分散性。
  以BSA和HEWL作为蛋白质淀粉样纤维化研究对象。采用ThT荧光法、同步辐射圆二色谱法(SRCD)、原子力显微镜(AFM)、SDS-PAGE凝胶电泳法对形成的淀粉样纤维进行表征,考察AuNRs与AuNPs对淀粉样纤维的动力学生长曲线、二级结构、形态学及分子量的影响。
  结果:
  TEM结果显示,AuNPs的平均尺寸为18.48±0.56 nm,Zeta电位为-36.80±0.44,浓度为155.82μg·mL-1,具有良好的均一性和分散性;AuNRs尺寸分别为20×40 nm、20×60 nm、20×80 nm,Zeta电位分别为43.13±1.16、39.83±0.76、20.40±1.11 mV。AuNRs-2、AuNRs-3、AuNRs-4与AuNPs在水溶液中的平均粒径分别为(1.63±0.04)×(51.36±0.75)、(5.06±0.06)×(82.73±0.78)、(5.47±0.20)×(104.61±6.5)、34.29±0.19。
  BSA纤维化动力学曲线遵循指数型增长规律。相同浓度的AuNRs对BSA纤维化的抑制作用明显大于AuNPs。纤维化过程中,BSA二级结构中的α-螺旋结构含量逐渐降低,β-折叠结构含量逐渐升高,AuNRs与AuNPs的加入对上述过程均具有抑制作用。BSA成熟纤维形态相互缠结,呈网状结构,高浓度AuNRs组纤维较短且分散,AuNPs组纤维多数团聚,形成大的无定型团聚体。SDS-PAGE结果表明,高浓度AuNRs与AuNPs组BSA形成的大分子量纤维均明显减少。
  HEWL纤维化动力学曲线遵循“S”型增长规律,纤维化过程中α-螺旋结构特征峰峰位置发生蓝移,AuNRs与AuNPs加入后其蓝移程度增大。HEWL成熟纤维形态呈较长的丝状纤维结构,AuNRs组 HEWL形成蛋白质的无定型聚集体,AuNPs组HEWL形成较短的丝状纤维。
  结论:
  BSA与HEWL纤维化能够形成形态良好的淀粉样纤维,其具有蛋白质淀粉样纤维的典型属性,AuNRs与AuNPs均可抑制两者的纤维化,且具有浓度依赖性。相同浓度下,AuNRs的抑制作用大于AuNPs。
  本课题为国家自然科学基金“核分析技术指导下的生物稳定和安全性量子点生物荧光探针的设计和合成”(编号:11375211)。
[硕士论文] 卫莺
药物分析学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  利用光谱法、计算机辅助药物分子设计和药物亲和反应靶标稳定技术研究四种有机锡化合物[二-(2,6)-二氟取代二正丁基锡(DBDFT)、二-(2,4)-二氟取代二苯基锡(DPDFT)、二-(2,4)-二氯取代二苯基锡(DPDCT)和二-4-氯取代二正丁基锡(DBDCT)]与 CYP3A4代谢酶的相互作用,比较不同有机锡化合物与CYP3A4代谢酶相互作用的大小,并研究有机锡化合物对CYP3A4代谢酶构象的影响。
  方法:
  (1)用紫外可见光谱法研究有机锡化合物是否能与CYP3A4代谢酶形成配合物;用荧光光谱法研究有机锡化合物与CYP3A4蛋白形成配合物的猝灭机制和结合参数,并对四种有机锡化合物与 CYP3A4的作用力大小进行比较;荧光光谱法与紫外可见光谱法相结合研究有机锡化合物与CYP3A4蛋白是否发生非辐射能量转移。(2)用同步荧光光谱法、三维荧光光谱法、圆二色谱法和计算机辅助药物分子设计中的分子对接模块研究有机锡化合物对CYP3A4蛋白构象的影响,明确有机锡化合物对CYP3A4蛋白中色氨酸和酪氨酸微环境、肽链骨架的微环境、α螺旋含量的影响以及形成氢键的位置。(3)用药物亲和反应靶标稳定技术研究有机锡化合物与CYP3A4蛋白反应后对消化酶的抵抗作用,明确CYP3A4代谢酶和有机锡化合物形成的的配合物能够保护CYP3A4蛋白。
  结果:
  (1)不同结构类型的有机锡化合物与 CYP3A4代谢酶的结合参数、作用力类型和能量转移值不同:1)当四种有机锡化合物(4×10-5 mol·L-1)与CYP3A4蛋白反应后,在280 nm处, DBDFT-CYP3A4、DPDFT-CYP3A4、DPDCT-CYP3A4和蛋白的保护作用比较明显,DPDCT对裂解的CYP3A4蛋白几乎没有保护作用,可能是由于DPDCT与CYP3A4的结合作用比较弱,没有观察到对CYP3A4蛋白的保护作用,这与前述四种有机锡化合物与CYP3A4代谢酶的结合强弱顺序基本一致。
  结论:
  有机锡化合物与CYP3A4代谢酶结合形成了较为稳定的配合物,它们可能结合在CYP3A4的活性区域,二者发生相互作用可使得CYP3A4的肽链和二级结构发生改变。有机锡化合物与CYP3A4的结合作用力强弱不同,会影响其在体内的代谢过程。结合课题组前期实验结果推测它们与CYP3A4代谢酶的结合导致酶活性抑制,从而使得有机锡化合物在体内的抗癌作用时间增加,抗癌活性增强。
[硕士论文] 王彤颖
药物分析学 福建中医药大学 2017(学位年度)
摘要:石杉碱甲(HupA)是一种高效且可逆的乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,是目前治疗老年痴呆症(又称阿尔茨海默病,AD)最有前景的药物。随着世界人口老龄化的加快,阿尔茨海默病患者逐年增加,国内外对其需求量日益增加。当前医学界尚没有发现合适的HupA替代品,人工合成法也局限于实验室使用,目前HupA主要从石杉属和马尾杉属等植物中提取获得,然而该类植物野生资源匮乏,且HupA含量甚微。因此建立高灵敏度的HupA检测方法,对充分利用该类资源具有十分重要的现实意义。
  近年来,纳米技术发展迅速,尤其是纳米金标记技术备受业界关注。该技术具有简便、快速、准确及无毒等优点,为药物的分析测定提供一种新的研究思路。纳米金的表面积大、生物兼容性好,其表面能够通过静电作用与抗体、酶等生物大分子相结合,还可以与巯基或PolyA修饰的DNA相结合,形成探针后后生物分子的活性基本不受影响,且性质较为稳定,这些功能化的纳米金探针用于免疫分析中,可显著提高方法的检测灵敏度。免疫磁珠(磁珠探针)是近年来新兴的一种功能材料,指偶联了抗原或抗体的磁性微球。磁珠具有较强的磁响应性,通过引入磁场,可以实现快速分离、富集目标物,具有操作简便、快速高效和不影响生物活性等优点,在免疫分析领域、细胞分离等方面具有独特的优越性。
  本论文利用纳米金探针和磁珠探针的特性,以竞争免疫分析为基础,研发了检测HupA的新型酶标免疫分析方法,并应用于实际样品的含量测定,为药物中有效成分的微量测定提供新的分析策略。论文共分为三章,主要内容如下:
  第一章:酶标纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。
  采用柠檬酸三钠还原法合成纳米金,将酶和抗体修饰于纳米金颗粒表面制备纳米金探针,并对探针制备条件进行优化,如标记pH、最适抗体标记量、酶和抗体标记比例等,采用紫外分光光度法和透射电镜对制备好的纳米金探针进行表征。将制备好的纳米金探针引入到免疫分析中,采用竞争免疫分析模式,建立了一种检测HupA的新方法。并对实验条件如包被抗原和纳米金探针稀释比例、最佳竞争反应时间进行了优化,在最佳实验条件下,该方法测定HupA的线性范围为0.5~150ng/mL,线性方程为I=0.2985 lgC+0.1704(r=0.9960),检测限为602.56 pg/mL。将该法应用于蛇足石杉中HupA含量测定,经国标法验证,二者测定结果基本一致,回收率在97.08~106.11%之间,结果较好。该法检测时间短,灵敏度高且重复性好,是一种简便、高效、经济的检测体系,有利于推广应用。
  第二章:磁珠和酶标纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。
  本研究引入磁性载体-磁珠,代替传统的96孔酶标板,将石杉碱甲完全抗原(HupA-OVA)标记在磁珠上。基于磁性分离,利用纳米金探针,建立了快速、高效、灵敏度高的检测石杉碱甲的酶标免疫新方法。考察并优化了磁珠探针和纳米金探针的稀释比例、最佳竞争反应时间等免疫分析条件,最终确立了检测体系,在优化实验条件下,该方法在HupA浓度为0.075~180ng/mL之间,抑制率与HupA浓度的对数值lgC呈良好的线性关系,线性方程为I=0.2813 lgC+0.3051(r=0.9950),检测限为160.32 pg/mL。将该法应用于石杉碱甲片剂含量测定,检测结果与国标法所测结果基本一致,该方法的灵敏度较前一种方法更高、线性范围更宽且缩短了检测时间。
  第三章:磁珠和DNA-纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。
  在前两种方法研究的基础上,基于磁珠建立了DNA-纳米金探针检测方法,并对该方法的精密度、重复性、专属性等进行了考察,结果均在允许范围内,该方法在HupA浓度为0.008~16 ng/mL之间,抑制率与HupA浓度的对数值lgC呈良好的线性关系,线性方程为I=0.3006 lgC+0.6142(r=0.9952)检测限为19.41pg/mL。并对蛇足石杉内生真菌发酵液中HupA进行了检测,加标回收率在99.33~103.73%之间,结果令人满意。DNA的引入进一步提高了方法的灵敏度,此方法较前两种方法灵敏度更高。
[硕士论文] 刘颖
药物分析学 湖北中医药大学 2017(学位年度)
摘要:人血白蛋白(Human serum albumin,HSA)是由健康人的血浆经低温乙醇分离提取并经病毒灭活后制成的生物制品,临床上用于出血性、外伤性体克、烧伤、肝硬化伴腹水和水肿、恶性肿瘤、肾病水肿等。
  目前国内企业采用低温乙醇法压滤工艺分离血浆蛋白,该工艺具有蛋白收率高,生产成本低,经济效益好,因而在工业化生产中大规模应用。然而低温乙醇法特异性不高,在生产的过程中不能完全除去杂蛋白成分,各企业的工艺参数也不尽相同,因此在终产品中会存在一定量的杂蛋白。据文献表明,制剂中存在的这些杂蛋白是引起的临床不良反应的主要原因之一[1],不良反应类型主要为全身过敏反应和多器官损坏,包括过敏性休克、热原样反应、肾脏损害等。因此探究血液制品中的未知蛋白可为临床不良反应提供参考,本课题旨在建立杂蛋白分离分析的方法并测定人血白蛋白制剂中的杂蛋白的组成,为各企业的生产工艺优化提供了数据支持,同时为产品的一致性评价奠定基础。
  为了初步了解各企业的杂蛋白含量和种类的差异,对五家企业近两年的批签发数据进行统计分析,共获得323批白蛋白制剂的纯度数据。结果显示,五家企业生产的白蛋白制剂纯度范围在96.2%~98.3%之间,企业间差异较大。其中A企业生产的制剂纯度较为均一,提示生产工艺较为稳定;B企业生产的制剂纯度较其他四所企业低,显示产品中存在一定量的未知蛋白。为了进一步分析各企业制剂的蛋白组成异同,对白蛋白制剂进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,初步探究其组成成分的异同,结果显示各企业间生产的白蛋白制剂差异较小,各企业制剂的杂蛋白有8~9条带。鉴于醋酸纤维素薄膜电泳与SDS-PAGE方法的局限性,不能特异性地鉴定出杂蛋白成分,本研究尝试建立未知蛋白谱鉴定方法,进而确定各企业生产的人血白蛋白制剂的未知蛋白组成。
  在建立质谱分析方法时,首先对供试品浓度进行选择,再对质谱鉴定参数进行优化。结果显示,白蛋白浓度超过5mg/ml时,超过仪器鉴定阈值,导致白蛋白主成分未能被成功鉴定,提示蛋白浓度不能过高。蛋白浓度在1mg/ml-2mg/ml时,主成分白蛋白肽图较为完整,但未知蛋白检出效率低;对白蛋白肽图中的肽段进行b/y离子连续性分析发现,蛋白鉴定得分大于150分,结果具有较高的可信度。以上结果提示主成分蛋白浓度过高,掩盖未知蛋白的的信号,未知蛋白的鉴定需要对未知蛋白进一步分离。
  结合前期结果,对各企业的白蛋白中未知成分进行分离纯化、酶切方法的优化,确立其分离纯化方法,并分析各企业未知蛋白的种类、数量、分子量、等电点分布及其工艺相关性。采用阴离子交换柱与凝胶过滤层析柱分别对白蛋白进行分离,结果显示,使用阴离子交换层析只能得到主成分单一峰,而使用凝胶过滤层析得三组峰,因此采用凝胶过滤层析对白蛋白中位置组分进行分离。采用胃蛋白酶和胰蛋白酶分别对各分离组分进行酶切,结果显示,胃蛋白酶酶切结果重复性较差且蛋白得分较低,而使用胰蛋白酶重现性良好,蛋白鉴定得分较高。对胰蛋白酶酶切效果进行进一步确证,结果发现,三次平行实验,共有11个蛋白被检出,其中共有8个蛋白每次均检出,说明方法稳定性较好。最终采用胰蛋白酶对人血白蛋白中的未知蛋白成分进行鉴定,结果显示五家生产企业产品,除一家企业杂蛋白较少外,另外四家企业所有批次样品均含有载脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprotein A-II)、人结合珠蛋白(Haptoglobin)、人血色素结合蛋白(Hempoexin)、α-1B-糖蛋白(Alpha-1B-glycoprotein)、α-2-HS-糖蛋白(Alpha-2HS-glycoprotein),且略有差异。对未知蛋白等电点进行分析发现,未知蛋白等电点与白蛋白较接近,可能在乙醇共沉淀时与白蛋白共同析出,初步可以说明未知蛋白为工艺相关蛋白;对未知蛋白分子量进行分析发现,未知蛋白以多聚体的形式存在于白蛋白中。
  以上结果表明,在临床应用中,应更加关注上述未知蛋白的过敏效应,在工业生产中,应优化生产工艺,尽可能去除无关蛋白,提高产品质量。本课题建立的白蛋白制剂杂蛋白质谱分析方法为探究临床不良反应提供了数据支持,为白蛋白制剂的一致性评价提供了新的方法,为血液制品的质量控制奠定了基础、提供了新思路。
[硕士论文] 李志满
药物分析学 延边大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  肝纤维化是由多种致病因素引起的肝内结缔组织发育不良的病理过程,肝纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化。在肝纤维化过程中,其特征是肝星状细胞和其他细胞外基质细胞的激活。本实验采用二甲基亚硝胺建立慢性肝纤维化体内模型和活化肝星状细胞体外实验,探究垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge,SS)改善肝纤维化进程、脂质沉积、细胞凋亡以及炎症因子的作用,并分析其围绕Sirt1-AMPK-LXR信号通路的调控机制。
  方法:
  体内实验中,取Wistar雄性大鼠随机分为五组,每组六只,即为正常组、DMN组、垂盆草提取物低剂量组(100mg/kg)、垂盆草提取物高剂量组(300mg/kg)和扶正化瘀阳性对照组(2g/kg)。DMN组与各药物治疗组每周连续三次腹腔注射1% DMN(2ml/kg)诱导肝纤维化;造模的同时各治疗组分别灌胃给予垂盆草提取物(100或300mg/kg)或扶正化瘀(2g/kg),每天一次,连续5周。在末次给药6h后,将动物安乐死,收集血液和肝组织。利用试剂盒检测血清中丙氨酸氨基转氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基转氨酶(AST)的水平。利用H&E,Masson染色和免疫组化染色方法观察垂盆草对大鼠肝组织形态学的影响;通过蛋白印迹方法和PCR法检测肝脏中α-SMA,CollagenⅠ,TIMP-1,SREBP-1,FASN, ACCa, Caspase3, Caspase9, FLIP, Bax, Bcl-2, Bid, Caspase1,TNF-α,Sirt1,AMPKα,p-AMPKα,LXRα,LXRβ蛋白或mRNA的表达。
  体外实验中,将HSC-T6和LX-2细胞培养在含有10%胎牛血清(FBS),100mg/ml青霉素和100mg/ml链霉素的培养基(DMEM)中,在37℃,5%CO2饱和湿度环境的二氧化碳培养箱中培养。将细胞以5×105/孔的密度接种在6孔板中,用TGF-β(10ng/ml)刺激HSC-T6和LX-2细胞2小时后,分别给予垂盆草提取物(6.25、12.5、25或50μg/ml)孵育24小时。收集细胞提取总蛋白和核蛋白,分别进行蛋白印迹、PCR和细胞免疫荧光分析,检测了α-SMA,CollagenⅠ,Sirt1,AMPK,p-AMPK,LXRα和LXRβ蛋白表达情况。此外,TGF-β(10ng/ml)刺激HSC-T6和LX-2细胞2小时后,再分别给予垂盆草提取物(25或50μg/ml),AICAR(AMPK激动剂)和GW3965(LXR激动剂)处理HSC-T6和LX2细胞6小时后,收集细胞提取总蛋白和核蛋白进行检测。利用蛋白印迹实验和细胞免疫荧光技术检测垂盆草对肝星状细胞中Sirt1,AMPKα, p-AMPKα,LXRα和LXRβ蛋白的表达的影响。
  结果:
  体内实验结果显示垂盆草提取物显著抑制二甲基亚硝胺诱导的肝损伤大鼠血清中ALT,AST活力的升高。H&E染色和Masson染色结果显示,垂盆草提取物可以显著改善二甲基亚硝胺诱导的肝组织病变,且存在剂量依赖性。同时也能够抑制肝组织中α-SMA,CollagenⅠ,TIMP-1蛋白和mRNA表达的升高,与α-SMA免疫组化结果具有一致性。RT-PCR结果显示,垂盆草提取物显著降低了SREBP1,ACCa,FASN mRNA表达。垂盆草提取物能够抑制肝脏中Caspase1,TNFα的表达;并且通过减少FLIPL表达,抑制了Bid,导致cleaved-Bid表达的升高,Bax的表达受到抑制,从而提高Bcl-2的水平。垂盆草给药组显著增加Sirt1,p-AMPKα,LXRα,LXRβ的表达水平。
  体外实验结果显示,垂盆草提取物可以显著降低HSC和LX2细胞中α-SMA,CollagenⅠ两种纤维形成标记物的表达来抑制肝星状细胞的活化,并且免疫荧光结果较为明显看出,垂盆草明显抑制了α-SMA蛋白的表达。此外,垂盆草具有显著促进活化的肝星状细胞中Sirt1,LXRα,LXRβ和AMPK磷酸化表达的作用,具有剂量依赖性。
  结论:
  垂盆草通过抑制纤维化指标,减轻脂肪堆积,抑制炎症和凋亡起到肝保护作用,同时垂盆草激活Sirt1-AMPK-LXR信号通路显著抑制二甲基亚硝胺诱导肝纤维化和活化的肝星状细胞。
[硕士论文] 郑今花
药物分析 延边大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  二氢槲皮素是一种黄酮类化合物,据前期研究发现二氢槲皮素有很强的抗氧化作用,具有很高的潜力。本研究通过狂饮酒精性脂肪肝模型和急性酒精性脂肪肝模型,探讨二氢槲皮素是否对酒精性脂肪肝小鼠有抑制脂肪蓄积的作用。
  方法:
  1.狂饮酒精性脂肪肝小鼠模型的体内实验:给药低中高剂量组每天给予不同浓度的二氢槲皮素(1mg/kg、5mg/kg、25mg/kg)共5天,给药第5天时给药4小时候每隔30分钟给予33%酒精共3次。用试剂盒检测血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)水平和肝组织中的甘油三酯(TG)的水平,通过HE染色和免疫组织化学染色方法观察二氢槲皮素对小鼠肝脏组织形态学变化的影响。
  2.急性酒精性脂肪肝小鼠模型的体内实验:酒精组隔12小时给予33%酒精(5g/kg)共3次,给药低中高剂量组每隔12小时同时给予二氢槲皮素(1mg/kg、5mg/kg、25mg/kg)和酒精共3次。用试剂盒检测血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)水平和肝组织中的甘油三酯(TG)的水平,通过HE染色和免疫组织化学染色方法观察二氢槲皮素对小鼠肝脏组织形态学变化的影响;通过蛋白印迹观察小鼠肝脏LKB1、乙酰辅酶a羧化酶(Acetyl CoACarboxylase,ACC)、AMP依赖的蛋白激酶α(AMP-activated Kinaseα,AMPKα)等脂肪合成与氧化相关因子及炎症小体相关因子表达变化。
  3.急性酒精性脂肪肝体外实验:HepG2细胞给予不同浓度的二氢槲皮素,间隔1小时后给予大剂量酒精诱导肝细胞损伤,24小时后刮蛋白做蛋白印迹实验,检测AMPKα、ACC、IL-1β的表达;HepG2细胞敲除P2x7R,间隔30小时后给予二氢槲皮素和酒精,24小时后通过荧光染色观察SREBP-1的表达;LPS+ATP刺激肝癌细胞株HepG2,并通过Western Blot检测、HepG2胞内P2x7R和pro-IL-1β活化片段。
  结果:
  1.狂饮酒精性脂肪肝小鼠模型中,二氢槲皮素组能够明显降低小鼠血清及肝脏组织中TG的含量,减少血清中ALT、AST的含量;HE染色和免疫组化结果表明二氢槲皮素能明显减轻酒精引起的肝脏脂肪变性。
  2.急性酒精性脂肪肝小鼠模型中,二氢槲皮素组能够明显降低小鼠血清及肝脏组织中TG的含量,减少血清中ALT、AST的含量;HE染色和免疫组化结果表明二氢槲皮素能明显减轻酒精引起的肝脏脂肪变性;二氢槲皮素明显减少了P2x7R、Caspase-1及NLRP3炎症小体的阳性表达,减少了巨噬细胞及中性粒细胞的炎性募集。同时二氢槲皮素能够活化AMPKα、SIRT-1,抑制ACC和SREBP-1的表达。
  3.体外实验中二氢槲皮素明显抑制了酒精诱导的肝细胞中ACC、IL-1β的表达,同时激活了AMPKα、LKB1。
  结论:
  本实验证明二氢槲皮素对狂饮酒精性脂肪肝小鼠和急性酒精性脂肪肝小鼠肝脏脂肪积蓄有一定的保护作用,同时对脂肪肝伴有的炎症也有一定的抑制作用。
[硕士论文] 孙晓迪
药物分析学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过不同释放介质下的体外溶出度试验、GastroPlus软件模拟的体内吸收试验以及体内生物利用度试验,对国产的硝苯地平缓控释制剂和盐酸二甲双胍肠溶制剂进行质量一致性评价。并通过体内外相关性研究,为这两类制剂选择有体内预测力的溶出方法。
  方法:
  1.硝苯地平缓控释片体外溶出及虚拟生物等效性研究
  采用中国药典、美国药典、日本橙皮书中收载的溶出方法,测定6种市售硝苯地平缓控释制剂的体外溶出曲线,并用f2相似因子评价溶出曲线的相似性;选取其中的4种缓释制剂,利用GastroPlus软件进行虚拟生物等效性评价。
  2.二甲双胍肠溶制剂体外溶出、体内相对生物利用度及体内外相关性研究
  选择3种二甲双胍肠溶制剂,采用转篮法测定其在不同条件下的溶出曲线;并采用三制剂、三周期、简单三交叉试验设计,考察6名健康志愿者单次口服二甲双胍肠溶制剂500 mg后的生物等效性;用GastroPlus软件进行体内外相关性研究。
  结果:
  1.两种硝苯地平控释片在三种介质中的溶出行为都相似,而四种硝苯地平缓释片用中国药典方法和日本橙皮书方法得到的溶出曲线均不相似;中国药典方法的体内外相关性更好。用中国药典溶出方法结合GastroPlus软件计算的四种硝苯地平缓释片体内吸收曲线相近,模拟生物等效。
  2.三种盐酸二甲双胍肠溶制剂在所考察的3种溶出介质中溶出行为差异显著。6名健康受试者空腹口服500 mg盐酸二甲双胍肠溶制剂G、H、I后的主要药动学参数如下:tmax分别为(4.583±1.158)、(4.917±0.861)和(7.000±2.000)h,Cmax分别为(1.543±0.646)、(1.189±0.249)和(0.808±0.406)μg·mL-1,AUC0-24h分别为(7.311±2.192)、(6.253±2.149)和(5.304±3.364)μg·h·mL-1。三种制剂两两之间均不具有生物等效性。三种二甲双胍肠溶制剂的体外溶出和体内吸收数据间未能建立显著的相关性。
  结论:
  1.用中国药典收载的溶出方法评价硝苯地平缓控释制剂的质量一致性有更好的体内外相关性。所考察的四种硝苯地平缓释片体外溶出行为不相似而模拟体内吸收等效。
  2.国产盐酸二甲双胍肠溶制剂的体外溶出差异显著,且难以建立体内外相关性,生物不等效风险高,必须通过人体试验进行生物等效性评价。
[硕士论文] 谢骁祥
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  建立稳定表达含无义突变位点荧光素酶的细胞株,用以筛选新的无义突变通读剂。
  方法:
  酶切质粒pGL4-WT和pGL4-MUT,得到野生型和无义突变荧光素酶编码cDNA,分别插入到慢病毒载体pLVX-IRES-Neo多克隆位点。酶切及PCR鉴定后,将重组载体包装成慢病毒颗粒,感染HEK293细胞,单克隆细胞抗性筛选获得稳定细胞株,提取总RNA,经逆转录PCR方法验证荧光素酶mRNA表达。最后用已知阳性无义突变通读剂G418处理细胞,Western blot方法检测处理前后荧光素酶蛋白表达水平,同时分析荧光素酶活性。
  结果:
  经酶切获得2.7 kb长野生型和无义突变荧光素酶编码cDNA,与pLVX-IRES-Neo连接获得重组慢病毒载体pLVX-WT、pLVX-MUT,EcoRⅠ单酶切、NheⅠ与BamHⅠ双酶切结果证明序列正确插入,PCR也扩增出目的片段;稳定感染慢病毒的HEK293WT和HEK293MUT细胞经逆转录PCR方法成功检测到荧光素酶mRNA表达;阳性通读剂G418处理细胞后发现,HEK293WT细胞在处理前后均表达荧光素酶蛋白,荧光素酶活性也基本相同,而HEK293MUT细胞在处理前不表达荧光素酶蛋白,无荧光素酶活性,处理后恢复了部分荧光素酶蛋白表达,其荧光素酶活性相当于HEK293WT细胞的20%。
  结论:
  成功建立了稳定表达无义突变荧光素酶的细胞株,可用于筛选新的无义突变通读剂。
[硕士论文] 徐凯
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:纺锤链霉菌(Streptomyces netropsis)SD-07是本实验室2007年发现的一株放线菌,它所产的多烯大环内酯类抗生素是以五烯和七烯为主的混合物,五烯含量最高,并且五烯类的抗生素已经解析出化学结构,命名为济南霉素(Jinanmycin),相比两性霉素B及制霉菌素,SD-07所产抗生素有更强的抗真菌活性,具有开发为新型抗真菌抗生素的潜力,因此有必要对济南霉素在SD-07中的生物合成路径以及其合成相关PKS基因簇的基因敲除工作进行一系列研究与探索。
  本文工作如下:
  1.纺锤链霉菌SD-07全基因组扫描测序完成,并对济南霉素在SD-07中的生物合成进行了详细生物信息学分析
  SD-07基因组碱基总数为7593656bp,经antismash预测分析,共得到46个基因簇,其中cluster32最有可能为纺锤链霉菌SD-07多烯大环内酯类抗生素的编码基因簇,定位于4266507-4419580 bp,总大小153074bp,其中PKS相关基因定位于4286507-4388174bp,总大小101667bp,推测为合成济南霉素的基因簇。接下来对济南霉素在SD-07中的生物合成路径进行了详细的描述与生物信息学分析:济南霉素大环内酯环的合成开始于JinA,经JinB、JinC、JinD、JinE和JinF一步步聚合,最后由JinF-TE将聚酮长链从PKS上水解下来并环化成大环内酯环,接下来对该大环内酯环进行后修饰,JinⅠ将C16甲基支链氧化成羧基,通过GDP-甘露糖脱水酶JinGⅢ,氨基转移酶JinGⅡ以及一些初级代谢中的酶将果糖-6-磷酸转化为GDP-放线菌糖胺,然后通过JinGⅠ将GDP-放线菌糖胺与两性霉素的糖苷配基核心相结合。最后可由JinMⅠ和JinMⅡ这两种ABC型转运蛋白负责将济南霉素主动运输到纺锤链霉菌SD-07外。本研究对SD-07的基因敲除工作奠定了基础。
  2.成功构建两个SD-07敲除载体,并进行基因敲除尝试
  在复制型质粒pJTU1278的基础上成功构建了敲除载体pJTU1278-⊿5883与pJTU1278-⊿2166,尝试用接合转移,电转化及PEG介导的原生质体转化法对纺锤链霉菌SD-07的基因敲除进行一系列尝试,并且对实验条件进行了一系列优化,但是最终都没能得到正确转化子。对于以上结果,我们认为复制型质粒不适合转入纺锤链霉菌SD-07。
  3.采用Red/ET重组对SD-07中PKS基因簇的克隆进行了探索
  Red/ET重组工程是在E.coli细胞内利用同源重组对DNA序列进行精确修饰的基因工程技术。通过Red/ET重组工程对多烯大环内酯类抗生素的相关PKS基因簇克隆进行了一系列尝试,将110kb左右的相关PKS基因簇通过酶切分为两部分进行克隆,较小的DNA片段为40kb左右,正确重组并成功筛选得到;然而当尝试将65kb左右的较大DNA片段与载体重组时,虽然成功长出很多克隆,但是当我们对其一进行筛选时,却得不到我们想要的正确克隆;再进行了多次尝试后,依然没有正确的克隆,分析可能是65kb的DNA片段较大,不容易进行克隆。我们又重新进行了实验方案的设计,将65kb的片段酶切成20kb左右以及40kb左右的片段进行克隆,对40kb左右的片段进行克隆时,同样没有出现正确的克隆。分析原因很可能是因为纺锤链霉菌SD-07某些基因的表达产物对Ecoli有毒,导致重组成功的克隆都死掉了。通过文献查询发现有过这种情况发生。
  尽管目前SD-07基因敲除的工作没有完成,但是本研究对今后的工作提供了一系列指导,本实验室会继续进行SD-07基因敲除这个难题的攻克。
[硕士论文] 李玲霄
化学 陕西科技大学 2017(学位年度)
摘要:定量构效关系(Quantitative Structure Activity Relationship, QSAR)研究的目的是通过采用化学结合数学与计算机科学的方法在分子结构特征与其生物活性之间建立数学模型。多肽序列是由氨基酸构成,氨基酸对肽的生物学功能和空间结构起决定性作用。因此多肽的QSAR研究是基于对氨基酸在分子水平上的分析。
  本文主要采用氨基酸描述子、比较分子力场分析法(Comparative Molecular Field Analysis, CoMFA)、比较分子相似性指数分析法(Comparative Molecular Similarity Indices Analysis, CoMSIA)及异位体比较分子力场分析法(Topomer Comparative Molecular Field Analysis, Topomer CoMFA)对不同多肽药物进行QSAR建模并对其作用机理进行全面研究分析。对多肽的结构参数采用多元线性回归(Multiple Linear Regression)和偏最小二乘法(Partial Least Squares)技术建立模型。本论文研究内容如下:
  第一部分是以20种天然氨基酸的空间结构特征为基础,采用相关软件计算出氨基酸的三种三维结构指数:Gemetrical描述子、Molecular-propepty描述子和Whim描述子。通过对这三种描述子进行主成分分析后建立出一套新型的氨基酸描述子,即SVGMW。采用描述子SVGMW对血管紧张素转换酶抑制剂、苦味二肽和后叶催产素三种多肽药物分别进行结构表征,利用MLR方法构建QSAR模型,并采用内外部两种检验方法对模型的稳定性与预测能力进行验证,取得了较为成功的结果。说明 SVGMW几乎涵盖了Gemetrical描述子、Molecular-propepty描述子和Whim描述子的全部信息。因此,描述子SVGMW对多肽的QSAR研究有一定的指导作用。
  第二部分是以20种天然氨基酸的空间结构特征为基础,采用相关软件计算出氨基酸的三种三维结构指数:几何描述符、特征值信息和分子几何反比度信息,通过主成分分析后建立出一组新型的氨基酸描述子,即描述子SVGER。用SVGER分别对血管紧张素转换酶抑制剂、苦味二肽和后叶催产素三种多肽药物进行结构表征,采用PLS方法建立QSAR模型,取得较为满意的结果。结果表明,氨基酸描述子SVGER能够很好的表征多肽药物的结构信息,所建立的模型也具有较好的稳定性和预测能力。
  第三部分主要是采用CoMFA和CoMSIA方法对血管紧张素转换酶抑制剂、后叶催产素和苦味二肽进行QSAR建模分析。通过PLS建立的模型均具有较好的预测能力。此外,等势图分析结果表明:多肽药物中的氨基酸体积大小、正负电性以及氢键作用对药物活性都有一定的影响,可以为多肽药物的设计提供一定的理论依据。
  第四部分利用基于R基团的Topomer CoMFA方法分别对苦味二肽、后叶催产素和缓激肽增效剂进行QSAR相关分析研究,并得到最优模型的拟合系数以及系列复相关系数,建立的QSAR模型对药物活性具有较好的预测能力。基于所建模型并结合等势图的分析表明:氨基酸残基的正负电性以及体积大小均与多肽药物的活性有密切关系。该方法为多肽药物的设计提供了一定的理论基础。
[博士论文] 梅斌
化学生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:紫杉醇是临床上治疗肿瘤的有效化疗药物,不仅对多种肿瘤具有显著的抑制效应,而且能显著地增加肿瘤对放疗的敏感性。所以针对紫杉醇的药物设计研究一直是药物合成研究的热点,产生了大量的紫杉醇衍生药物。这些药物大多虽然具有与紫杉醇类似的结构和生物学效应,但很少探究这些紫杉醇类似物的作用机制、毒副作用等是否与紫杉醇相似等问题。本研究合成了多肽链共价修饰的紫杉醇水凝胶,研究过程中发现其对神经元分支的影响和紫杉醇具有统计学意义上的差异,这对紫杉醇衍生药物临床应用研究具有重要意义,故此我们开展了相关机制研究。
  本研究首先合成了紫杉醇水凝胶因子—化合物1(FmocFFK(taxol)Y(H2PO3)),该因子在碱性磷酸酶的作用下,脱去磷酸根,形成化合物2(Fmoc-FFK(taxol)Y(OH)),在溶液中能自动聚集组装成纳米纤维结构,从而形成超分子水凝胶。超分子水凝胶是小分子的凝胶因子通过非共价结合,如氢键、π-π堆积和静电等作用,相互结合,形成具有一定形态的超分子,由于小分子的生物兼容性较好,易代谢,故非常适宜于作药物载体。化合物1酶促自组装形成纳米纤维结构是化合物2通过氢键、π-π堆积或静电相互堆积形成的纳米纤维状结构,属于超分子水凝胶。金属负染冷冻电镜观察结果显示,纳米纤维直径约为7.2纳米,可能为一种中空的管状结构。
  化合物1对C57BL/6胎鼠脑皮层神经元突起的形成具有促进作用,与紫杉醇具有显著的差异性,但两者均能促进神经元突起延长,导致神经元突起总长度无显著差异。为了探索造成这种差异在细胞层次的机理,我们比较分析了化合物1和紫杉醇这两种化合物在细胞毒性、细胞迁移、细胞内微管聚集等方面的差异,结果显示,两者无显著的统计学差异。为了进一步明确化合物1促进神经元分支的机理,我们利用微管蛋白在正常体温时组装、在低温时解组装的这一特点,提取了大鼠脑组织的微管,开展了体外微管组装实验,实验数据显示两者之间对微管体外组装的速度有显著影响:化合物1对微管体外组装具有明显的延迟效应。这提示,微管衍生物可能不仅具有促进微管蛋白纵向上连接和横向上连接,还有可能在时间上具有延迟的效应。为了确定是否是化合物1裂解后产生的影响,我们使用本实验室带有荧光的多肽链紫杉醇水凝胶化合物3(AC-Arg-Val-Arg-Arg-Cys(StBu)-Lys(taxol)-2-cyanobenzothiazole,CBT-Taxol)与微管结合蛋白已转染红色荧光蛋白的细胞进行共定位分析,分析结果显示两者共定位于细胞内(R=9.1),这说明化合物3至少有一部分是直接与微管结合的。据此我们推测化合物1或者化合物2至少有部分可能是与微管直接相结合的。化合物1与紫杉醇促进神经元分支上的差异,可能是与这部分化合物与微管蛋白相互作用的结果。
  依据已有的数据和前人的工作,我们推测化合物1促神经元分支的可能机制如下:化合物1在细胞内通过酶解脱磷酸根形成化合物2并组装成纳米纤维结构,这种纳米纤维结构一方面因为体积过大,在微管内腔中可能影响其他蛋白酶的活动范围,如乙酰化酶,或者超过两根纤维本身就无法被接纳的状态,延迟微管组装;另一方面,微管蛋白单体与化合物1(2)结合后,可能在微管正端端口大量聚集,干扰微管蛋白之间的聚集,从而影响微管的组装。所以化合物1最终可能是通过延迟微管组装,来促进神经元分支。
[硕士论文] 闫明明
化学生物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:在全世界,癌症是人类死亡的主要原因之一。利用单层细胞培养进行体外高通量的抗肿瘤药物测试,用于评估药物功效。但是,单层培养对于一种药物是否最终产生临床效果预测能力差。
  普遍认为三维肿瘤能够增强预测能力,减少动物评估实验,降低鉴定新药的时间和费用。传统的三维肿瘤培养操作方法包括,非粘附表面培养法,回旋法,悬滴法。悬滴法的优点是有效的形成尺寸均一的三维肿瘤,同时与高通量的测试仪器兼容。回旋法是一种形成三维肿瘤的简单方法。但这些方法的缺点是耗时、费力及试剂消耗大。
  与传统的细胞操作方法不同,微流控芯片具有试剂消耗少,通量高的优势。芯片材料聚二甲基硅氧烷具有良好透气性,适合活细胞操作;同时其具有优良的透光及生物相容性,在开展芯片内细胞操作分析方面具有显著优势。然而,目前建立的肿瘤芯片系统往往针对于特定尺寸的肿瘤操作,不具备三维肿瘤尺寸可控性,在系统性开展肿瘤生物学分析方面仍存在不足。
  基于此,本研究设计制备了一种可实现不同尺寸三维肿瘤制备、操作与在线分析的微流控芯片。通过开展微流控芯片设计与制备条件优化、芯片内细胞捕获定位操作、不同尺寸人肝癌HepG2和人胶质瘤U251三维肿瘤制备及其抗肿瘤药物分析应用四个部分研究,具体结果如下:
  1、采用软光刻技术,成功制备出本研究使用的双层微流控芯片,用于三维肿瘤操作分析研究。结果显示,用于制备芯片上下层的PDMS胶与固化剂比例分别为10∶1和20∶1,固化时间分别为13和23min时,芯片键合效果最好,有效避免了漏液现象。
  2、通过对细胞接种密度、流速和灌注时间条件优化,实现了芯片内HepG2和U251细胞的精确捕获定位,为进一步开展三维肿瘤培养研究奠定基础。
  3、完成了芯片内不同尺寸HepG2和U251三维肿瘤的培养。结果显示,所制备的特定尺寸三维肿瘤均一性较好,肿瘤细胞活性高,适于开展后期的抗肿瘤药物分析应用。
  4、实现了基于三维肿瘤芯片的两种抗肿瘤药物分析研究。结果显示随着药物浓度的增大,细胞活性降低。博来霉素和替拉扎明两种抗肿瘤药物处理人肝癌HepG2三维肿瘤,在相同的浓度条件下,替拉扎明的处理人肝癌细胞活性较低。
  该研究结果表明设计的微流控芯片能够实现不同尺寸的三维肿瘤制备及其抗肿瘤药物分析应用。
[博士论文] 赵宏鑫
生物物理 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:糖尿病的死亡率仅次于心脑血管疾病和癌症,目前全球糖尿病患者高达到4亿人,而中国的糖尿病患者已经超过1亿人,成为名副其实糖尿病大国。如果能开发一种像胰岛素一样的内源蛋白来治疗糖尿病,将会给糖尿病患者带来福音。成纤维细胞生长因子21(FGF21)是近几年新发现的一种具有治疗糖尿病潜力的蛋白质,可以促进脂肪细胞吸收葡萄糖,改善胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗,拥有比胰岛素更持久的降血糖效果,没有低血糖和癌症诱导的风险。但是在临床应用上存在血清稳定性低,半衰期短的限制。因此本论文针对FGF21的结构和药物设计展开研究。
  我们利用核磁共振方法解析了FGF21核心区(FGF21core)的高分辨溶液核磁结构。研究中发现,FGF21的β2-β3区域具有第二种不稳定的构象,这种松散构象是造成FGF21不稳定性的主要原因。基于高分辨溶液核磁结构,我们在β2和β3上设计了一对二硫键,成功地将构象稳定在β折叠构象。核磁共振化学位移扰动分析表明,β2和β3二硫键的形成,影响了β1-β2之间的loop的构象,进而影响FGF21的活性。因此我们将拥有7个残基的loop替换成FGF19的8个残基,并通过细胞实验,动物实验验证了FGF21突变体(FGF21-LG)的功能。我们发现FGF21-LG在低浓度时具有比野生型更显著的降血糖效果,并且拥有更长的血清半衰期。CD实验也证明了FGF21-LG的热稳定性显著好于野生型。这些优点为它成为治疗糖尿病药物奠定了基础。
  此外,我们对FGF21与β-Klotho蛋白(KLB)和成纤维细胞生长因子受体1c(FGFR1c)相互作用机制进行了研究,我们通过昆虫表达系统表达出KLB和FGFR1c的胞外区,并利用MST测得了FGF21与KLB的平衡解离常数Kd约为15.6 nM,KLB和FGFR1c Kd约为110nM,但是FGF21与FGFR1c的结合太弱无法获得相应的结合常数。我们还将全长的FGFR1c组装在一种新的类生物膜nanodisc体系,并通过酶活实验验证了组装的FGFR1c具有良好的生物活性,为后续的跨膜信号转导机制研究奠定了基础。
  本论文中的另一方面的研究内容是关于趋磁细菌AMB-1蛋白Mms6识别晶面机制的研究。Mms6蛋白在细胞内或细胞外,可以调控磁性纳米颗粒的形成,我们通过NMR滴定实验发现Mms6在滴定磁小体(Fe3O4)时其C端的DEEVE区域发生构象变化,同时其N端疏水区域的聚集对于C端的功能起到了很重要的作用。这项研究阐明了Mms6识别晶面的分子机理,同时为在其它生物矿化体系中研究蛋白识别无机物晶体提供了理论指导。
[硕士论文] 向辉
纳米物理与化学 重庆师范大学 2017(学位年度)
摘要:流动注射化学发光是一种利用体系内被检测的物质的浓度,与化学发光强度在一定环境中呈一定的线性关系,而建立起来的一种在线的测定方法,其特点是灵敏度很高,检测快速,操作简单。但是其对物质的检测没有特异性,难以对复杂的混合物中的物质进行测定,所以,研究一种对物质特异性识别的检测方法就受到了广泛的关注。分子印迹法是利用目标分子合成的一种对目标分子有特异性识别的印迹聚合物,将此印迹柱与流动注射化学发光分析仪连用,就能精确的测定出目标分子,从而弥补了流动注射化学发光分析仪无特异性识别的缺点,由此建立起来的分子印迹流动注射化学发光分析方法特异性识别强,灵敏度高,操作简单,应用范围广。
  本文主要研究了核苷、磺胺类药物对在酸性条件下的高锰酸钾-甲醛发光体系的增强现象,并建立了对核苷、磺胺类物质检测的体系,以及各项优化参数。具体介绍如下:
  1.在酸性条件下,利用KMnO4-HCHO发光体系,结合流动注射化学发光分析仪,对尿嘧啶核苷进行了测定,结果显示回归方程:ΔI=86.58×105C(mol/L)+0.6,相关系数为R=0.9955,检出限是8×10-6 mol/L,对浓度为1×10-3 mol/L的尿嘧啶核苷平行测定11次,相对标准偏差为4.3%,运用此方法对尿嘧啶核苷成功进行了检测。
  2.将流动注射系统与化学发光联用来测定鸟嘌呤核苷,可以快速的测定出其含量,实验所得其线性方程:ΔI=49.67×105C(mol/L)-302.77,相关系数为R=0.9993,检出限是1.5×10-7 mol/L,对浓度为1×10-6 mol/L的鸟嘌呤核苷平行测定11次,相对标准偏差为2.7%。
  3.胞嘧啶核苷为目标分子,合成对其有专一性识别的分子印迹聚合物(MIP),在酸性条件下,利用HCl-KMnO4-HCHO发光体系,结合流动注射化学发光(FI-CL)分析方法,创建对胞嘧啶核苷测定有特异性识别的MIP-FI-CL分析方法,其线性范围是8×10-5 mol/L-1×10-3 mol/L,检出限是4×10-5 mol/L,利用此方法测定复杂样品中的胞嘧啶核苷的含量,结果令人满意。
  4.在酸性条件下,利用HCl-KMnO4-HCHO发光体系,结合流动注射化学发光(FI-CL)分析方法,以磺胺二甲基嘧啶为目标分子,合成对其有专一性识别的分子印迹聚合物(MIP),创建对磺胺二甲基嘧啶测定有特异性识别的MIP-FI-CL分析方法,其线性范围是1×10-4 mol/L-1.5×10-3 mol/L,检出限是6×10-5 mol/L,利用此方法测定复杂样品中的磺胺二甲基嘧啶的含量,结果令人满意。
[博士论文] 丁璇
药物分析学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:细胞膜色谱(Cell Membrane Chromatography,CMC)是一种将细胞膜提取后键合到固定相表面的生物色谱,它结合了生物材料的生物学活性以及传统分析色谱法在线分离、高通量的优势,使得从中药等复杂体系中筛选出有效的活性成分成为可能,而且更加高效、便利。中药具有整体性、复杂性的特点,这些特点赋予了它多靶点、多途径调节的优势和特色。然而,正是由于这些特性,导致中药中的主要活性成分并不明确,其作用效果和现代理论基础也较为薄弱,主要的临床应用仍旧依赖几千年来无数中医前辈所积累的经验所推理得到的富含辩证关系的中医理论。细胞膜色谱作为一种新兴的生物色谱技术,在中药活性筛选的研究领域得到了较为广泛的应用。本研究在原有细胞膜色谱模型基础之上进行了创新,研发出一种新型的经APTES修饰后的细胞膜色谱模型,并对新型细胞膜色的模型的方法学进行了考察和优化,在中药活性成分筛选领域内多方面开展了应用研究,从而为细胞膜色谱制备的进一步科学化、规范化、合理化提供依据,并有利于进一步拓展细胞膜色谱的应用范围。
  1.新型经APTES修饰的细胞膜色谱方法学的建立及考察
  细胞膜色谱是一种新型的生物亲合色谱,该模型使用特定细胞膜键合于硅胶上作为色谱固定相。但是细胞膜色谱存在寿命较短,易失活等问题,一直以来影响细胞膜色谱的普及。除此以外,由于不同实验室制备条件不一致,还存在重现性较差的问题。因此本章针对细胞膜色谱柱寿命较短的问题,创新性地采用了一种新型的经过(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷((3-aminopropyl)triethoxysilane,APTES)共价修饰后的硅胶应用到了细胞膜色谱的制备过程中。本研究首次提出使用共价修饰的方法,研发新型的细胞膜色谱技术。其原理就是利用APTES作为桥梁,在硅胶表面键合了醛基,该醛基可以与细胞膜上丰富的氨基基团以共价键的形式结合。通过这种方式,细胞膜和硅胶间的结合力将会极大增强,从而使得细胞膜的脱落失活现象得到一定程度的缓解。经实验考察,所制备的新型的经APTES共价修饰的细胞膜色谱柱可以具有更高的柱效和更长的寿命,从原有的不足3天提高到现在的12天左右。为了解决重现性较差的问题,本研究还对新建立的经APTES共价修饰的细胞膜色谱法进行了方法学考察,对细胞膜色谱制备过程的关键步骤进行了考察,如细胞量、细胞破碎条件等,并制定了相应的用量标准和操作规程。
  2.经APTES修饰的MCF7全二维细胞膜色谱的构建及其应用
  为进一步扩展在第一章基础上所搭建好的经共价修饰后的新型细胞膜色谱模型的应用,并探索阐明中药元胡的抗癌作用机制,筛选中药元胡中的潜在抗癌活性成分或者药物前体,在本章中,拟选用元胡作为中药材的研究对象,通过使用MCF7细胞系构建经APTES修饰的MCF7细胞膜色谱,在线对元胡提取液中的各组分进行高通量筛选。在确保APTES修饰的2D MCF7/CMC-C18柱/TOF-MS系统的稳定性、选择性的基础上,我们从中药元胡中筛选鉴别到了3种潜在活性化合物,即氧海罂粟碱、普鲁托品、小檗碱。这三种活性成分可以有效地对MCF7细胞进行浓度依赖性的杀伤,其在MCF7细胞中的IC50值分别为36.16μM、29.30μM和45.52μM;且经过细胞凋亡和死亡实验进行考察后发现,这三种活性成分主要是通过诱导细胞凋亡来发挥药效的。本研究结果表明所构建的经APTES修饰后的2D MCF7/CMC-C18柱/TOF-MS系统是一种用于中药抗乳腺癌活性成分筛选的可行方法。
  3.经APTES修饰的DU145全二维细胞膜色谱的构建及其应用
  为进一步确证经共价修饰后的新型细胞膜色谱模型的有效性,从而为细胞膜色谱的进一步发展应用探索道路,本章在第一章、第二章基础上所搭建好的经共价修饰后的新型细胞膜色谱模型基础上,探索筛选中药元大黄、黄芩中的潜在抗癌活性成分或者药物前体。在本章中,拟选用大黄和黄芩作为中药材的研究对象,通过使用经APTES修饰后的硅胶,构建了2D DU145/CMC-C18柱/TOF-MS系统,在线对大黄和黄芩提取液中的各组分进行高通量筛选。在确证经APTES修饰的2DDU145/CMC-C18柱/TOF-MS系统的选择性、适用性的基础上,我们从中药大黄和黄芩中筛选鉴别到了三种潜在活性化合物,即木蝴蝶素A、丹叶大黄素和大黄素。经过细胞增殖实验的考察,发现这三种活性成分均可以有效地对DU145细胞进行浓度依赖性的杀伤,其在DU145中的IC50分别为151.1μM、55.66μM和85.81μM;且经过细胞凋亡和死亡实验进行考察后,进一步确证了这三种活性成分的药效,并发现其药效作用主要是通过诱导细胞凋亡来发挥药效的。本研究结果表明所构建的经 APTES修饰后的2D DU145/CMC-C18柱/TOF-MS分析系统是一种从中药中筛选抗前列腺癌活性成分的可行方法。
  4.经APTES修饰的全二维HepG2干细胞膜色谱系统的构建及其应用
  最近一段时间,肿瘤干细胞的研究在抗癌研究领域引起了人们的广泛关注。它们是一类具有自我更新能力的特殊肿瘤细胞,在肿瘤的复发、转移和迁移中发挥着重要作用。杀死肿瘤干细胞将会显著提高肿瘤的治愈率,同时也能大大降低肿瘤的复发率。但是通常来说分离和培养肿瘤干细胞是十分困难且耗时的过程,获得足够量的肿瘤干细胞进行相关研究时,对我们的实验要求也更高、更苛刻。而我们新建立的APTES修饰的细胞膜色谱寿命长、效率高,恰好十分适用于肿瘤干细胞。因此在本研究中,我们通过APTES修饰的硅胶建立了一种新的HepG2-CSC/CMC,并选择一种著名的中药丹参(Salvia miltiorrhiza,其炮制部位为唇形科植物丹参的干燥根和根茎)作为理想的中药复杂体系进行活性成分筛选。有报道研究证明,在1981至2006年之间,临床上70%的新批药物来源于天然产物。因此从中药中筛选出潜在的具有抗肿瘤干细胞的活性成分是一项很有前景的研究。此外,根据本课题组的前期研究报道,我们还拟采用全二维色谱法,以进一步提高CMC的分离度。在这些条件下,本研究搭建了一个经APTES共价修饰的HepG2肿瘤干细胞细胞膜色谱全二维分析系统,对丹参中的活性成分进行了筛选,得到了丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮I这三种潜在活性成分。结合后期的细胞增殖抑制实验考察得到其IC50值分别为10.300μM,17.850μM,2.53μM,然后通过细胞凋亡实验进一步确证其药效,并利用虚拟对接技术,确证其潜在药效作用靶点可能为细胞膜上的VEGFR。使用经APTES修饰的硅胶构建的全二维细胞膜色谱是一种有效的从复杂体系(如中药等)中筛选具有潜在抗癌活性的目标化合物的新方法,特别是对于一些珍稀的、较难以获得的生物材料。
  总之,针对细胞膜色谱应用过程中所面临的柱寿命短、稳定性差的问题,本课题通过对硅胶表面进行共价修饰,创新性地利用APTES在硅胶表面键和醛基从而与细胞膜表面大量的游离氨基形成共价键,首次通过共价修饰的方式延长了细胞膜色谱柱寿命并提高其稳定性。后续系统考察优化了细胞膜色谱制备方法学,制订了一系列标准,从而保证新搭建的细胞膜色谱模型的重现性。在此基础上构建新型MCF7、DU145和HepG2干细胞的全二维细胞膜色谱分析系统应用于中药抗肿瘤活性组分的筛选,大大提升了通量,筛选到抗乳腺癌、抗前列腺癌癌和专属性杀伤肝癌干细胞的活性成分。通过本课题的相关研究,研发出了一套新型的经APTES修饰的细胞膜色谱模型,进一步扩展了细胞膜色谱的应用范围,也为中药活性成分的高通量筛选提供了新的理念和借鉴。
[硕士论文] 袁旭寒
药学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:手性化合物广泛应用于催化化学、食品科学、精细化工、制药工程等众多领域,然而不同的手性对映体产生的效能往往存在显著差异,这使得手性对映异识别技术的开发在各种学科领域中至关重要;多数传统手性分离技术存在耗时、成本高和依赖大型仪器等缺点。近年来,手性传感器因具有简单经济、实时快速和高效便捷等优点而在手性识别中得到了快速的发展。表面增强拉曼散射光谱(SERS)具有单分子级别的检测灵敏度,可提供分子结构信息和表面分子吸附取向等相关信息,目前已在环境科学、材料科学、化学、物理学、生命科学等领域中广泛得以应用,然而将SERS技术用于手性传感识别方面的应用研究还十分罕见,所以本文致力于构建一种新型的手性席夫碱SERS传感界面应用于手性对映体的识别。
  本论文主要包含以下四个方面的内容:
  ①第一章综述SERS技术的发展概况,手性识别方法的研究进展以及SERS技术应用于手性传感识别的现状。
  ②首先采用柠檬酸钠作为还原剂和稳定剂,合成制备平均粒径约45nm的金纳米颗粒,然后通过静电作用组装构建具有SERS活性的金纳米膜,并利用紫外可见吸收光谱(UV-vis)和电子扫描显微镜(SEM)对其组装结构进行详细的表征,同时考察组装时间对金纳米表面等离子体共振的影响及其SERS活性的影响。研究结果表明,改变组装时间可制得不同覆盖度的纳米薄膜,此外通过SERS面扫实验表明金纳米组装基底在连续激光下具有较好的稳定性、均一性和重复性。
  ③在金纳米膜基底上,通过共价作用修饰上手性席夫碱分子,在功能化席夫碱分子膜构建过程中,采用接触角(CA)、SERS、X射线光电子能谱(XPS)、石英晶体微天平(QCM)和原子力显微镜(AFM)等多种表征方法对其进行详细的研究。最后将席夫碱金纳米SERS传感膜应用于苹果酸对映体的手性识别,并提出该新型席夫碱金纳米膜SERS传感界面对苹果酸对映体识别作用机制。实验结果表明,席夫碱分子纳米传感界面对苹果酸对映体具有良好的识别能力,通过金纳米席夫碱膜SERS谱图的差异就能实现对映体的快速识别。总之,我们成功构建了新型席夫碱SERS传感器并应用于有机羧酸苹果酸对映体的手性识别。
  ④采用AutoDock Vina进行分子对接模拟主体识别分子席夫碱与客体苹果酸对映体之间的相互作用,同时通过采用Gaussian09计算分析席夫碱分子与苹果酸复合体系的电荷分布以及轨道能级模拟,进一步探索手性席夫碱分子传感界面对于苹果酸对映体的识别机理。
[硕士论文] 张立娜
药物分析 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:过敏反应在临床上经常发生,严重时可致人死亡,尤以中药注射液、注射用药用辅料、β-内酰胺类抗生素等药物最为突出,经研究发现,这些药物中残留的大分子蛋白可引起过敏反应,故为了保证用药安全,去除这些杂质是非常重要的,药品生产者也通过不断的技术改进尽量去除这些大分子蛋白杂质,因此需要建立一个灵敏度高、选择性好的方法对生产工艺进行验证和监测。然而由于这些药物生产过程复杂,大分子蛋白在生产过程中可能发生一系列的聚合、裂解等反应,故不适合用基于抗体-抗原反应的检测特异性活性蛋白的免疫法对其进行测定,也不适合使用基质影响大、灵敏度低的传统的光谱法对其进行检测,故建立一个准确度高、特异性好、灵敏度高的蛋白检测方法是药物分析者面临的一个难题。
  中药注射液中的植物蛋白等大分子杂质易随提取过程残留到终产品中,本文以茵栀黄注射液为研究对象,针对中药注射液成分复杂但大多是小分子这一特性,利用根据分子量大小对化合物进行分离的高效凝胶排阻色谱法(HPSEC)分析技术对其中的大分子蛋白含量进行了研究,为了进一步提高灵敏度,优选了检测波长,选取蛋白吸收更高的末端吸收作为检测波长。色谱柱为 TSK gel SuperSW2000色谱柱(4μm,4.6×300 mm),流动相为磷酸盐缓冲溶液,流速为0.3 mL/min,紫外检测波长为220 nm,样品溶液经过滤后可直接进样,结果该方法在0.312-40.0μg/mL线性范围内关系良好(R2=0.999),回收率均大于81%,重复性良好,RSD为0.6%,检测限可以达到0.104μg/mL,灵敏度比常用的测定蛋白的灵敏度最高的方法考马斯亮蓝法(Bradford)还提高了10倍左右,且只对样品进行简单处理即可进行分析,结果表明,该方法操作简便快速,重现性好,为其他同类药物中的大分子杂质的检测提供了一种可借鉴的分析手段。
  注射用乳糖是注射用药物生产中一种很好的药用辅料,但是由于乳糖来源于动物乳清,可能会残留有微量乳清蛋白引起过敏反应,故需要对其中的乳清蛋白进行严格控制。本研究同时建立了 HPSEC法和超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF)两种方法对乳糖中的α-乳白蛋白及β-乳球蛋白进行检测,HPSEC法使用的色谱柱为 TSK gel SuperSW2000色谱柱(4μm,4.6×300 mm),流动相为磷酸盐缓冲溶液,流速为0.3 mL/min,紫外检测波长为220 nm,结果该方法在α-乳白蛋白和β-乳球蛋白总浓度3.40~68.0μg/mL的范围内线性关系良好,回收率均大于87%,重复性良好,RSD为0.5%,检测限为1.13μg/mL,结果表明本研究建立的HPSEC法灵敏度较 UPLC-Q-TOF法稍高,且该方法操作简单快速,成本相对较低,适用性更广,易于普及,但由于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分子量接近,在 HPSEC色谱柱中不能完全分离,故不能分别对二者进行定量,只能测定二者含量总和。UPLC-Q-TOF法以0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液和0.1%TFA乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,经蛋白柱分离后,采用飞行时间质谱检测器(TOF)进行全离子扫描模式检测。应用 Peakview1.2分析软件,通过对化合物离子精确质荷比、特征二级质谱以及保留时间的比对,对目标物进行验证。α-乳白蛋白和β-乳球蛋白测定的线性范围分别在2.00~80.0μg/mL和6.00~240.0μg/mL之间,相关系数为0.997和0.996;检测限分别为1.00μg/mL和3.00μg/mL;加样回收率分别为82.9%~87.2%和96.1%~98.4%。结果表明,本方法特异性好,结果准确,但对蛋白直接测定灵敏度并不高。故在实际检测中,若需要操作简单快速,成本较低,灵敏度高且需对两种蛋白总和进行检测时可选用HPSEC法;若需要对蛋白特异性要求较高,对蛋白分别进行鉴定和检测且灵敏度要求不高时可采用 UPLC-Q-TOF;若需要对蛋白特异性要求较高且灵敏度要求也较高时,可对 UPLC-Q-TOF法前处理进一步研究,使大分子裂解成分子量较小的化合物再进行检测。
  青霉素类等β-内酰胺类抗生素因其发酵工艺,易产生并残留大分子蛋白,本研究以青霉素 V钾为模型药物,建立了一个中空纤维离心超滤(HFCF-UF)装置对蛋白大分子进行分离和富集,然后经末端吸收的HPSEC法对大分子进行分析测定。色谱柱为TSK gel SuperSW2000色谱柱(4μm,4.6×300 mm),流动相为磷酸盐缓冲溶液,流速为0.3 mL/min,紫外检测波长为220 nm,样品溶液经 HFCF-UF一步离心富集可直接进样,并对非特异性吸附(NSB)现象进行了考察。结果该方法富集倍数高达99倍,回收率均大于87%,基本消除了NSB现象,经HFCF-UF富集处理后,可成功检测到样品中低至30.3 ng/g的大分子蛋白。结果表明,本方法操作简便,结果准确,灵敏度高,可满足生产者在生产过程中对大分子蛋白的监控需求,同时也为同类药物中的大分子蛋白检测提供了有效手段。
[硕士论文] 黄新宝
控制科学与工程 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:太赫兹时域光谱(Terahertz Time Domain Spectroscopy, THz-TDS)技术作为一种新兴的光谱分析手段,已经在很多领域得到了研究。由于它一般不会对物质造成电离损伤,对于药物中的集体运动模式(晶格振动、同分异构体构型差异等)非常敏感,使得其在医药检测尤其是药物成分分析领域的应用成为了研究热点。本文主要面向医药生产、监管等领域需求,应用太赫兹波技术,重点研究了固体药物成分的识别分析以及含量检测方法,分析了不同固体药物成分的THz吸收有独特吸收峰、发生谱峰重叠以及没有吸收峰等响应情况,研究提出了向量-子空间夹角法等谱分析和间接硬建模(IHM)等谱分解技术,选用格列齐特、卡马西平以及利福平为药物特征活性成分(API)与乳糖一水合物、微晶纤维素和硬脂酸镁等药用辅料所组成的固体药物为例进行了分析验证。
  本文的主要工作和创新点如下:
  (1)为了揭示THz物质谱图的物理意义,提高基于谱图的算法分析准确度和可解释性,以格列齐特、卡马西平等物质为例,研究分析了固体药物成分的THz吸收谱图,研究了谱图的特征吸收与化学结构的运动模式之间的关联关系。其中时域光谱的分析为药物成分识别奠定基础,吸收峰的指认则为THz谱图分解与检测方法提供正向指导。
  (2)围绕实际应用中常常需要确定药物成分是否与其说明或配方相一致的需求,研究了基于THz-TDS的药物混合物成分识别以及未知物(配方以外的成分)检测方法。针对目前THz-TDS检测中常用的定性识别方法大多是用于物质类别的判断而对混合物组分识别效果有限的问题,研究了混合物多组分的识别方法,重点研究了向量-子空间夹角的模式识别技术,为了验证该算法进行多组分识别的可行性,以格列齐特、卡马西平以及利福平等三种混合物样品为例进行了检测,并讨论了谱图特征以及浓度对算法识别效果的影响;针对药物中出现的成分被未知物替代的问题,使用该算法进行了识别研究。此外,还对自主研发的THz-TDS混合物成分识别软件原型系统和使用情况进行了简单阐述。
  (3)根据对药物成分含量检测分析的需求,研究了基于THz-TDS的药物混合物成分含量检测方法,主要对谱图有独特吸收峰、发生谱峰重叠以及没有吸收峰等不同成分类型进行检测与量化分析。考虑到THz光谱数据本身特有的波形结构与成分浓度之间存在着固有物理联系的特点,研究了基于谱图分解的方法,重点研究了IHM技术。针对在太赫兹光谱分析中,IHM算法的纯物质参数化过程会影响光谱分解精度的问题,基于THz光谱的特点,通过理论分析对其参数化模型进行了改进。以格列齐特、卡马西平以及利福平等药物样品中API的含量检测为例进行了分析,并讨论了模型预测结果对训练样本数量的敏感性。
  固体药物中成分的谱图特征主要为有独特吸收峰、有谱峰重叠以及没有吸收峰等几种情况,本文主要围绕这三种谱图类型的成分开展了THz波时域光谱研究与解析工作,相关进展与成果对太赫兹时域光谱分析方法在药物成分检测中的应用具有借鉴意义。
[硕士论文] 刘尧尧
分析化学 上海师范大学 2017(学位年度)
摘要:体内药物分析是研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学。其主要任务包括:进行分析方法学研究、为药物体内研究提供数据、为临床治疗药物监测提供数据、内源性物质的监测和研究、滥用药物的检测。然而体内药物分析面临的最大挑战是生物样品成分复杂、药物及其代谢物浓度低,因此对分析方法的灵敏度要求较高。表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS)光谱具有样本处理简单、非侵入性检测、灵敏度高、能提供丰富的指纹图谱信息等优点,在实现高灵敏无损检测的同时还可获得目标检测物的分子结构信息,因此成为了一种新兴的体内药物分析手段。表面增强拉曼散射光谱应用的必须前提是要有好的拉曼信号增强基底,金、银纳米粒子是最常见的SERS基底。为了适用于复杂的生物样品对分离及灵敏度的要求,我们利用磁性材料对传统的SERS基底进行功能化制备Au/磁复合基底,这样在外磁场作用下就能快速、简便地实现基底与复杂样品的分离检测。
  本文进行尝试性研究,利用Fe@Fe3O4核壳结构、泡沫镍等磁性材料作还原剂模板,原位合成金纳米粒子,并进一步优化改进得到三种性能良好的磁性SERS基底,试图用于内源性物质多巴胺浓度检测及抗癌药物6-巯基嘌呤血药浓度检测,为表面增强拉曼光谱技术用于体内药物分析打下基础。具体工作内容如下:
  一、内源性生物标志物多巴胺(dopamine, DA)的含量与很多神经性疾病有关,如阿尔茨海默病、帕金森综合征等。本文用热分解法合成Fe@Fe3O4核壳纳米粒子,并以铁核作还原剂还原氯金酸,原位合成Au/Fe3O4纳米复合基底。采用便携式拉曼光谱仪检测血清中多巴胺浓度,最低检出限为5×10-9 M(S/N=3),方法简便快捷,重现性好,加标检测结果与高效液相-质谱(HPLC-MS)结果具有可比性,实现了表面增强拉曼散射光谱技术对于内源性物质的快速、灵敏检测。
  二、为了简化基底的磁优化步骤得到较干净的SERS基底,我们采用了泡沫镍作为原位还原模板,合成Au-NFs复合磁性SERS基底。泡沫镍是一种海绵状多孔金属镍材料,其独特的三维网状结构能够提供很好的吸附力和粗糙度。不仅基底制备过程及其快速简便,磁性很好能瞬间实现磁分离操作,而且SERS增强效果理想。检测药物分子6-巯基嘌呤最低检出限为1×10-9 M(S/N=3)。该研究为SERS基底的功能化提供了一种新的研究思路,有望在未来制备出一系列针对不同实际应用的磁功能化SERS基底。
  三、为了平衡基底干净操作快(工作二)和基底SERS性能及稳定性(工作一),且充分利用好泡沫镍的多孔结构制备出更具有实际应用价值的SERS基底,我们在泡沫镍与金纳米粒子之间引入了石墨烯材料。石墨烯不仅能够通过电荷转移的方式提高SERS增强性能(102-103)还具有较好的待测分子吸附性,同时,石墨烯优异的稳定性还可以保护表层的金纳米粒子。制备的Au/rGO/NFs磁性SERS基底检测探针分子4-MPy及药物分子6-MP的性能均比Au-NFs基底好,更具有实际应用价值,为表面增强拉曼光谱技术针对性的用于体内药物分析提供了努力的方向。
  本论文研究结果表明,表面增强拉曼散射光谱技术对内源性物质多巴胺、6-巯基嘌呤血药浓度进行检测,实验结果可靠,具有一定的临床参考价值。虽然还有很多工作有待探索改进,我们仍然可以展望未来,表面增强拉曼光谱作为一种快速、无损、安全的检测技术,在体内药物分析乃至临床检测中会有非常好的应用前景。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部