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[硕士论文] 魏翠云
生态学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:全氟辛基磺酸盐(Perfluorooctane sulfonate,PFOS),作为一种典型的全氟类化合物,具有生殖毒性、发育毒性、神经毒性、基因毒性等多种生物毒性效应,但目前关于PFOS影响脂代谢和糖代谢的分子致毒机制尚不清楚。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,Celegans)作为一种模式生物,体内的多不饱和脂肪酸合成通路结合了植物和动物的过程,与高等动物相比,具有完整的从头合成多不饱和脂肪酸的能力。本文以C.elegans作为研究对象,用不同浓度梯度PFOS暴露C.elegans研究其对脂代谢与糖代谢的影响,主要研究结果有:
  1.建立了C.elegans脂肪酸甲酯化方法,并用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)定量检测了C.elegans体内9种典型脂肪酸含量,实验结果表明用0.5%甲酯化试剂(H2SO4/MeOH),甲酯化时间2h,甲酯化回收率较高,且GC-MS检出限都在ng/mL范围,远远低于C.elegans体内的μg/mL浓度范围,分析方法灵敏度高。
  2.不同浓度梯度(0,0.01,0.1,0.5,1.5μmol/L)PFOS暴露L1期C.elegans72h,GC-MS定量检测结果表明PFOS会导致C.elegans中脂肪酸含量降低,与饱和脂肪酸相比,不饱和脂肪酸降低相对显著;进一步发现脂肪酸合成关键基因,如乙酰辅酶A羧化酶的相关基因acc-4,△9去饱和酶的相关基因fat-7相对表达量随PFOS浓度的增加而显著下调(p<0.05),说明PFOS可能通过影响脂肪酸合成初期反应关键酶的表达,而导致C.elegans体内各脂肪酸含量下降。
  3.脂质代谢与糖代谢与氧化磷酸化水平密切相关,PFOS暴露72h后,C.elegans中葡萄糖含量也随PFOS浓度的升高而降低,1μmol/L PFOS暴露后C.elegans中的丙酮酸和ATP含量都显著降低于对照组(p<0.05);我们分别测定了C.elegans体内与葡萄糖代谢有关的糖异生、糖酵解和胰岛素通路中相关基因pck-1,pyk-1,pyk-2,pfk-1.1,gpd-2,ctl-1,daf-2,daf-16的相对表达量,结果表明PFOS暴露可能通过影响C.elegans体内与糖代谢相关基因的相对表达,从而导致C.elegans体内糖代谢紊乱;PFOS暴露会导致C.elegans中脂肪酸、葡萄糖含量的降低,而丙酮酸和ATP含量下降,提示三羧酸循环也发生紊乱,这可能是PFOS暴露造成C.elegans死亡的原因。
  总之,本文建立了灵敏可靠的C.elegans体内脂肪酸的GC-MS分析方法,定量测定了PFOS暴露对C.elegans体内脂肪酸代谢及相关基因表达的影响,并进一步分析了PFOS暴露对C.elegans体内糖代谢和三羧酸循环的影响,实验结果表明PFOS可以显著抑制C.elegans体内脂代谢、糖代谢和ATP的合成,具有明显的毒性效应。
[博士论文] 褚欣奕
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:银屑病是一种在全球范围内发病率较高且难以治愈的慢性皮肤疾病。其发病机制十分复杂,涉及多个基因和调控通路间的相互作用,而目前还没有能够系统地整合这些因素的疾病模型。内源性网络理论(endogenous network theory)提出了一种从复杂疾病表型出发研究其内在机制的系统生物学框架。该理论认为控制生物表型的机制可以用一组关键调控者间通过相互作用构成的网络,以及该网络的稳定状态来进行描述。本研究借助内源性网络理论,尝试从系统的层面整合银屑病发病机制信息,阐释发病的调控机制,探索新的治疗方式。
  首先,本研究根据银屑病的主要症状以及发病机制中的关键因素,构建了银屑病内源性网络。该网络包含免疫调节、细胞周期控制和reactive oxygen species(ROS)平衡三个模块。网络的动力学模拟结果与银屑病的特征及患者的基因表达数据相吻合,表明该网络在一定程度上能够描述疾病背后的调控机制。之后,基于此网络的研究显示,现有的抗银屑病药物的作用机制多与网络的免疫调节以及细胞周期控制模块有关,而ROS平衡模块亦包含一些潜在的银屑病治疗靶标。这一结果不仅进一步证明了本研究中构建网络的准确性,同时也预示调节ROS是一种潜在的银屑病治疗方式。
  其次,本研究对ROS平衡的核心调控者Nrf2的激活剂进行了筛选,并进行了初步验证。基于connectivity map(cMap)数据的双聚类分析得到的候选化合物,本研究依据其分子结构和是否上市进行了二次筛选,共获得了22个非亲电子性药物。随后选取9个药物利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证了其激活Nrf2靶基因表达的能力。结果显示其中6个药物能够显著上调Nrf2靶基因的表达。被测药物中阿司咪唑尤为突出,表现出了高于阳性对照-D,L-萝卜硫素的Nrf2激活能力。
  最后,本研究利用咪喹模特诱导的银屑病小鼠模型验证了阿司咪唑的抗银屑病活性。实验结果显示,腹腔注射阿司咪唑能够抑制模型小鼠中表皮过度增生相关的银屑病症状以及组织病理变化。另外,阿司咪唑与现有的抗银屑病药物甲氨蝶呤的组合显示出了较后者单药更强的抗银屑病效果。
  综上所述,本研究通过构建内源性网络对银屑病发病机制进行了系统地阐释,籍于此找到了潜在抗银屑病药物阿司咪唑,并利用实验手段初步验证了阿司咪唑的抗银屑病活性,为银屑病的治疗提供了有潜力的新药物。
[硕士论文] 赵晶
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究以4-壬基酚(4-Nonylphenol,NP)为受试物,以SD雄性大鼠和睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)为研究对象,应用生物光谱技术研究NP的雄性生殖毒性效应。
  方法:
  1、用对照组(玉米油)、系列浓度(25、50、100mg/kg)NP腹腔注射,每两天一次,连续20天染毒不同日龄(21、35、50日龄)SD雄性大鼠,构建动物模型;取睾丸组织、提取原代睾丸细胞后,分别用Raman光谱和ATR-FTIR光谱检测大鼠睾丸组织和细胞的生物化学改变;
  2、用对照组(DMSO)、系列浓度(2.5、5、10和20μM)NP对睾丸SCs进行染毒培养24h,细胞经消化、洗涤、固定后用ATR-FTIR检测;
  3、采用主成分分析和线性判别分析(PCA-LDA)对获取的图谱进行多变量分析。
  结果:
  1、ATR-FTIR检测不同日龄大鼠的睾丸细胞,NP暴露组和对照组之间集群分离明显;且除了脂质区50日龄组中25mg/kgNP暴露组(P>0.05),其他暴露组与对照组的差异均具有统计学意义(P<0.001),并且显示出剂量-效应关系;聚类向量分析显示不同NP暴露下各组发生变化的生物标记物不同且与对照组相比具有明显的差异(P<0.001);在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、肽聚集水平、酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ比率及磷酸盐与碳水化合物比率相比对照组均存在显著性差异(尸<0.001);
  2、ATR-FTIR分析不同浓度NP暴露下体外培养的睾丸SCs,NP暴露组和对照组集群图是分离开的,且在LD1平面NP暴露组和对照组效应差异显著(P<0.001);聚类向量分析显示各组发生变化的生物标记物不相同且与对照组相比具有明显的差异(P<0.001);在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、肽聚集水平、酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ比率及磷酸盐与碳水化合物比率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001);
  3、Raman分析不同日龄大鼠的睾丸组织,观察到各组大鼠的睾丸间质组织远离对照组,且不同NP暴露组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.001)。聚类向量分析显示各组发生变化的生物标记物不相同且与对照组相比具有明显的差异;在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、不饱和脂肪水平与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001);
  结论:
  1、通过体内体外实验发现,不同浓度的NP对于睾丸组织和细胞产生的效应是不同的,而且伴有剂量效应关系;同时对不同的日龄大鼠所产生的的效应也各不相同;
  2、通过检测细胞的生物分子特征性变化,发现NP暴露可以干扰睾丸SCs和睾丸间质细胞脂代谢和糖代谢等细胞代谢过程,对睾丸细胞增殖活性有影响,也可以诱导蛋白质二级结构发生改变.
[硕士论文] 董伟
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1.以新上市的抗肿瘤药物奥拉帕尼为先导化合物,设计、合成新的(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物,并评价其抑制PARP-1酶的活性及其对肿瘤细胞抗增殖能力的影响,以期获得的具有PARP-1抑制活性的新型靶向抗肿瘤化合物。鉴于PARP-1也可能是治疗AD的新型靶点,本研究同时也检测了目标化合物对AChE和BuChE的酶抑制活性,以评价其作为抗AD的多靶点配体的潜力。
  2.以Pubchem数据库中现有的PARP-1抑制剂为筛选对象,通过计算机辅助药物设计技术,筛选出具有AChE抑制活性的小分子化合物,并进行分子动态模拟,以期获得具有PARP-1和AChE双靶点抑制的抗AD化合物,为新型抗AD药物研究提供基础。
  方法:
  1.目标化合物的设计和合成:保留奥拉帕尼的主要药效团,对分子尾部的环丙基进行改造。选取分子长度适宜且尾部链自由度较小的共轭结构—取代芳香基丙烯酰基结构,对环丙基进行结构替换,设计和合成16个奥拉帕尼类似物。其合成方法为:以2-甲酰基苯甲酸为原料,经环合、氧化、还原等反应,合成重要中间体2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酸;以取代的芳香甲醛为原料,与丙二酸发生Knoevenagel反应,得到取代芳香基丙烯酸,与1-叔丁氧羰基哌嗪发生酰胺反应,脱去保护基团叔丁氧羰基后,与2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酸发生酰胺化反应,得到目标产物。
  2.目标化合物生物活性评价:(1)采用HT同源PARP荧光法抑制试剂盒(Trevigen,Cat#4690-096-K)检测所合成的目标化合物对PARP-1酶的抑制活性,然后采用MTT法测定目标化合物对人结肠癌SW-620和人乳腺癌MDA-MB-436细胞增殖能力的影响;(2)采用Ellman法评价目标化合物对AChE和BuChE的抑制能力。
  3.虚拟筛选:使用AutoDock Vina软件对具有PARP-1抑制活性的859个化合物进行虚拟筛选,寻找具有AChE抑制活性的潜力分子。使用GROMACS软件对目标分子进行动力学模拟,探究其分子识别机制和动态结合模式。
  结果:
  1.本研究设计、合成了16个(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物,其结构通过1H-NMR、13C-NMR、IR和质谱进行了确证。
  2.(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物生物活性的评价:PARP-1酶活性的测试结果显示,化合物44d、44e、44n对PARP-1酶具有较强的抑制活性(IC50分别为41.50±2.65、37.90±1.89和16.10±1.25nM,阳性对照药奥拉帕尼的IC50为8.20±1.06nM);MTT测试结果显示,化合物44d、44e、44n对具有BRCA基因缺陷的人乳腺癌MDA-MB-436细胞有较强的抑制增殖活性(IC50分别为10.25±2.20、13.95±1.28和11.62±2.15μM,阳性对照药奥拉帕尼的IC50为8.63±1.25μM),而对人结肠癌SW-620细胞无明显的抑制作用,提示化合物44d、44e、44n对PARP-1可能有较好的选择性和靶向性,特别是化合物44n值得进一步研究;采用Ellman法评价了目标化合物对AChE和BuChE的抑制作用。结果表明,化合物44d、44e、44n对AChE酶的IC50分别为27.44±0.46、12.24±0.49和24.55±1.10μM(阳性对照药甲基硫酸新斯的明的IC50为0.04±0.01μM),对BuChE酶的IC50分别为13.17±0.23、5.93±0.19和9.16±0.91μM(阳性对照药甲基硫酸新斯的明的IC50为12.01±4.05μM)。化合物44d、44e、44n对BuChE显示了较好抑制活性,而对AChE抑制作用稍弱。
  3.使用AutoDock Vina软件虚拟筛选出10个目标化合物,其中8个化合物都具有吡咯并咔唑母核结构,该结构可能在AChE活性位点外周阴离子结合位点的分子识别中具有重要作用。CID71605390和CID57390505在与AChE的对接和分子动态模拟中显示出较高亲和力和稳定性。
  结论及创新点:
  1.本研究以奥拉帕尼为先导化合物,合成并确证了16个未见报道的(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物。其中化合物44d、44e、44n对PARP-1酶具有较强的抑制活性,且对具有BRCA基因缺陷的人乳腺癌MDA-MB-436细胞具有较强的抗增殖活性,提示化合物44d、44e、44n对PARP-1具有较好的选择性和靶向性,特别是化合物44n值得进一步研究。其中化合物44d、44e、44n还对BuChE显示了较好抑制活性。
  2.通过对Pubchem数据库中的PARP-1抑制剂进行虚拟筛选,初步筛选出具有较强AChE和PARP-1双靶点抑制作用的10个化合物,发现吡咯并咔唑母核结构可能在AChE活性位点外周阴离子结合位点的分子识别中具有较重要作用,并对目标化合物进行进一步的分子对接和分子动态模拟,优选出化合物CID71605390和CID57390505,为寻找用于治疗阿尔茨海默病的新型AChE和PARP-1双靶点抑制剂提供了新的思路。
[硕士论文] 余静
药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在基因治疗的过程中,病毒载体和非病毒载体作为两大转载工具被广泛运用。但是由于病毒载体具有较高的细胞毒性以及其他缺陷,它的使用已经越来越受到实际条件的限制。此时,阳离子脂质体(cationic liposomes,CLs),作为最有发展前景的非病毒载体逐渐被重视。CLs作为一种常用的非病毒载体,可用来输送基因或药物分子进入细胞,是一种具有巨大临床应用潜力的纳米载体。由于其能够反复、多次运用于转染实验,表面不含有抗原反应成分并且可以携带转染的外源性基因的容量大等优势,近年来在医学研究方向得到了快速的发展。但是,也有部分研究人员从另一方面指出,尽管CLs已经具备了多种优势,但是仍然无法避免细胞毒性现象的出现。尽管多年来研究人员致力于优化CLs的制备方法以及结构改良,但是都无法避免的存在一定的细胞毒性问题。由于脂质体粒径较小,进入生物体后,靶向聚集于肝脏等体内器官,引起炎症等不良反应以及毒副作用,更可惜的是,尽管CLs的毒性现象很早就被察觉,到目前为止,很多文献也仅报道了CLs出现细胞毒性的现象以及部分作用机制,对于CLs产生毒性的深层次研究并没有十分透彻。因此,想要在纳米毒理学方面获得全部的、准确的生物信息是目前研究面临的最大挑战,这也在一定程度上阻碍了CLs的临床应用。
  有研究指出,CLs具有较高的细胞膜活性,在进入机体穿过生物膜后,会影响细胞膜和细胞器膜的完整性和功能,引起毒性反应。本文通过整合多种系统生物学方法,构建CLs造成细胞毒性的蛋白-代谢层面分子网络机制图,用以阐述CLs细胞毒性的潜在机制。用于研究CLs毒性机制的细胞模型较多,但鉴于人体内摄入和产生的绝大多数化合物的代谢和清除主要经过肝脏,而肝脏也因此被公认是药物和纳米颗粒进行代谢的主要场所;同时,100-200nm范围内的纳米颗粒主要优先沉积于肝脏,肝细胞株作为机体致癌性和肝毒性有关研究的主要模型广泛应用于各类细胞毒性试验,也是大多数纳米载体作用的靶细胞。因此,本实验也选用人正常肝细胞L02作为靶向分析的对象进行后续研究。薄膜分散法因为操作简便、对仪器精密度要求不高而且操作方便等优势被广泛运用于制备过程中。本课题采用薄膜分散法制备出了一批物理特征明显、性质稳定的CLs,通过CCK-8实验计算得到这批CLs的半数致死量(IC50值),并以1/2IC50值作为后期实验组给药剂量。再利用多组学技术平台对L02细胞内物质进行全面分析和检测。
  通过对特定研究对象内全部的蛋白质的表达水平以及翻译过程进行探索和研究的方法就叫做蛋白质组学(Proteomics)。某一细胞或者组织内全部的蛋白、特定时间或条件生物体内全部的蛋白都可以作为蛋白质组学的研究对象,并可采取不同特性的技术平台对其进行定性、定量或者功能性分析研究。其中,同位素标记相对和绝对定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ),是最近几年来建立起来的一种具有较多优势的蛋白质组学定性、定量检测技术。iTRAQ方法对于实验样品的选择性较低,无论是复杂样品、单一体液还是特殊成分的蛋白质鉴定分析都具有一定的精确性和准确性。代谢组学所研究的对象主要是某一特定时间下生物体内全部的、分子量小于1000的代谢物,通过对基因、蛋白下游的这些代谢物进行分析,不仅能够直观展示出生物体内发生的改变,也可用于探索外界刺激或药物对于机体的相互作用以及作用机制。其中,液质联用技术对测试样品的适应性非常好,而且还具备较高的精确性和灵敏度,因此被广泛应用于代谢组学研究中。通过对实验数据的深入挖掘,一共筛选出65个差异代谢物和368个差异蛋白质。再借助各类组学数据分析软件对寻找到的差异代谢物和差异蛋白质进行了整合分析,构建出CLs导致细胞毒性的蛋白-代谢整体网络机制图。
  随后,本实验利用了蛋白免疫印迹方法对前期聚焦寻找到的核心差异蛋白进行分析验证。根据免疫印迹试验数据结果,发现这些差异蛋白的含量变化趋势与iTRAQ数据完全一致。总而言之,本实验采用的基于iTRAQ技术的蛋白质组学方法用于分析CLs纳米粒细胞毒性机制具有准确性和适用性。本研究表明,单一的组学分析方法只能给出部分层面的信息,将多种组学技术结合进行研究是必需而可行的。因此本文选用的多组学技术整合策略方法能够进一步全面的探索CLs导致细胞毒性的潜在机制。
[博士论文] 蔡瞻
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:真菌耐药的情况日益严重,尤其是念珠菌属,对各类抗真菌药物均出现不同程度的耐药性,如唑类药物、多烯类药物和棘白菌素类药物。而且其耐药机制错综复杂。侵袭性真菌感染在全球的发病率急剧上升,日益严重的真菌耐药性被公认为导致免疫缺陷病人侵袭性真菌感染的发病率和死亡率逐年升高的主要原因之一。其严重威胁到广大人民群众的健康安全,为建设健康中国,如何解决真菌耐药问题,研究出新型抗耐药真菌药物成为当务之急,同时有必要深入探索机会性真菌的耐药机制,为开发抗真菌新药提供新的靶点。
  小檗碱、连翘酯苷A和黄芩素等天然产物已被发现可以作为抗耐药白念珠的增效剂。国内外也有报道钙调磷酸酶抑制剂、5α-还原酶抑制剂和热休克蛋白90抑制剂等也可协同唑类药物抗耐药真菌。虽然已有大量不同种类的化合物已被发现和报道具有协同抗真菌药物抗耐药真菌的活性,然而目前为止鲜有药物作为抗耐药真菌的增效剂上市,甚至于进入临床研究的都是寥寥无几。大量目前已报到的增效剂具有协同抗耐药真菌的活性MIC值一般在1.0μg/ml,而小于0.1μg/ml的增效剂是不常见的。增效剂活性不够好,可能为其原因一。至今为止,如小檗碱、连翘酯苷A和黄芩素等天然产物没有形成其作用机制清晰的结论,更没有发现关键的生物大分子,可能为其原因二
  在之前的研究中发现小檗碱具有协同FLC抗耐药真菌的作用,并对其进行改造获得几类结构更为简化,活性与小檗碱相当或略优于小檗碱的化合物。在这个研究基础上,挑选出本课题组已发现的活性最优的两个小分子作为先导化合物1-1和先导化合物1-2。并对其进行全面的结构改造,分别对其左侧的胡椒基,中间的酰胺键,右侧的芳环和柔链进行结构优化。通过体外活性筛选实验,采用微量稀释法和棋盘式微量稀释法获得化合物的活性数据。数据结果显示,具有协同抗耐药白念珠菌活性的的化合物有99个。与8.0μg/ml氟康唑合用时,MIC80小于0.1μg/ml的化合物有10个分别为化合物F2,F6,F8,F13,F14,F21,G8,G9,G10和G15,其中化合物F2、F6和F8采用棋盘式微量稀释法进一步证实其活性数据的可靠性。这类化合物的构效关系表明,其中先导化合物1-1中的胡椒基是其发挥生物活性的重要部分,酰胺键也是必不可少的部分,将酰胺键转变为逆酰胺键可以略微提高其生物活性,将苯环替换成对位联苯结构可以进一步提高其生物活性,将联苯结构中的一个苯环替换成噻吩环,可以保持与联苯类化合物相当的活性,另外当柔链长度为5-6个碳为最佳。
  由此,选择活性最优的化合物F6(CZ-66)对其进行抗耐药白念珠菌机制研究,对耐药菌103的ROS实验中,FLC、F5(CZ-65)单用不能引起ROS升高,F5(CZ-65)与FLC联用ROS升高约3倍,F6(CZ-66)单用ROS升高约10倍,F6(CZ-66)与FLC联用ROS升高约26倍。结果表明化合物F6(CZ-66)单用和联用FLC都能显著提高ROS水平,然而结构与其相似的化合物F5(CZ-65)单用时并未能提高ROS水平。对耐药菌103的罗丹明外排实验中,加入葡萄糖(2mM)后,罗丹明6G外排增强,且随着时间延长而增长。各用药组罗丹明6G外排与对照组无明显差异,说明化合物F5(CZ-65)、F6(CZ-66)、FLC及联用药对耐药菌103荧光蛋白外排无影响。CT-LINK反向分子对接找靶,通过PDB数据库检索,经分析CT-LINK中获取的可能靶点,只有Mitogen-activated protein kinase,NADH-ubiquinone oxidoreductase chain1和Mothers against decapentaplegic homolog3在真菌中是有报道存在的。结合已报道的相关参考文献,本文推测F6(CZ-66)可能作用于ROS-MAPK通路。另外本课题挑选了靶点相对明确的HSP90抑制剂BIIB021作为先导化合物2-1。对其嘌呤环上的2位、6位和9位分别进行结构改造,当保留先导化合物9位取代基,在2位和6位上进行简单改造,2位和6位分别以氯或者氨基做为取代基时,对化合物的活性影响并不大。如化合物H1-H3的MIC80均为4.0-8.0μg/ml之间。当9位的芳香环替换为脂肪环时,活性略有提升,其中以六元脂肪环为最优。当2位上引入芳环后,活性消失。因此,2位保留氟或氨基这类小原子团结构是保留化合物活性所必要的。化合物H12和H19是由先导化合物2-1改造获得的活性最优的两个化合物,虽然它们的活性并未超越由先导化合物1-1和1-2改造获得的化合物F6,但其活性与小檗碱相当,FICI优于小檗碱。作为一类靶点比较明确的分子,值得进一步结构改造和优化。
[硕士论文] 夏清明
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:前列腺癌是目前西方发达国家中男性肿瘤发病率和死亡率最常见的肿瘤之一。近年来我国前列腺癌发病率也在逐年攀升。雄激素剥夺治疗一直以来是前列腺癌最经典的治疗方式,但随着治疗的前行,前列癌晚期几乎都会发展为雄激素非依赖性,传统的治疗方式对雄激素非依赖性前列腺癌疗效不佳。肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤的一种新型治疗手段,在肿瘤临床治疗上已取得了较好的疗效。本课题选用含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的脱氧核寡核苷酸(Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs,CpG ODN)免疫激活剂,通过穿膜肽修饰的多壁碳纳米管为介导,研究其抗雄激素非依赖性前列腺癌的体内外作用。
  本课题第一部分报道了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体的构建和表征。通过多肽固相合成法合成含有3个组氨酸和6个精氨酸的多肽H3R6,利用制备液相进行纯化以及高效液相色谱和质谱进行纯度分析,检测其纯度符合实验要求。用浓硫酸和浓硝酸对多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)进行羧基化,然后再和多肽反应形成载体MHR。利用核磁共振氢谱,红外光谱、透射电镜和热比重分析鉴定复合物合成成功。利用MHR载体中精氨酸富含正电荷,CpG是核酸类物质带负电荷,通过静电作用形MHR/CpG纳米复合物。在N/P=6时,MHR载体能够有效负载CpG免疫激活剂,当N/P=20时电位处于一个较稳定的状态,电位约=25±2.62mV。通过HEK293转染实验,得出MHR载体在N/P=20转染效率较高。
  本课题第二部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂进行体外细胞学评价,RAW264.7细胞明显对负载CpG纳米免疫制有较高的摄取,CpG能够和胞内内吞体膜上的TLR9受体结合。CCK8细胞毒性实验中,MHR载体对DU145、RM-1和RAW264.7细胞的毒性较低。体外免疫活性ELISA和PCR实验结果显示,MHR/CpG对RAW264.7细胞刺激促进IL-6和TNF-α促炎因子的分泌明显高于单体CpG组,和LPS(10ng/ml)刺激效应具有可比性。
  本课题第三部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂体内的抗前列腺癌效应和免疫活性。我们成功构建了DU145前列腺癌BALB/c裸鼠和RM-1前列腺癌BALB/c小鼠模型,通过小动物活体成像系统观察结果显示,MHR/CpG可以有效的在肿瘤和肿瘤引流淋巴结部位蓄积,有靶向效果。体内药效结果表明MHR/CpG对前列腺癌的增殖有较强的抑制作用,从小鼠脾脏淋巴细胞流式分析看出MHR/CpG可以在体内有效刺激CD4和CD8T细胞的分化增殖。同时从小鼠的肾脏和肺肺脏的HE染色图看出,MHR/CpG的体内用药安全性较高。
  本课题成功构建了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体,为去势抵抗性前列腺癌治疗提供了新策略,同时也为其它肿瘤的治疗提供了好的参考和借鉴。
[硕士论文] 王卫平
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  临床上mTOR抑制剂应用于多种肿瘤的治疗,以依维莫司在转移性肾癌治疗中的应用较为广泛。但实际应用中疗效个体差异较大,耐药现象较为常见,大大限制了其疗效。在mTOR抑制剂耐药机制中,肿瘤的遗传学改变与之关系密切。现有相关研究多局限于从有限差异疗效病例中寻找耐药相关基因靶点,尚缺乏从全基因组水平评估基因的功能改变与mTOR抑制剂药敏之间相关性。而CRISPR/Cas9技术的发展应用为研究基因功能提供了巨大的便捷。将采用CRISPR/Cas9文库筛选的方法,从全基因组水平筛选mTOR抑制剂耐药相关靶点,并进行靶点功能验证及临床相关性分析,以期为逆转mTOR抑制剂耐药提供新的理论和依据。
  方法:
  1、通过质粒文库扩增、病毒文库制备、筛选条件摸索、耐药筛选等过程建立肾癌依维莫司耐药靶点CRISPR/Cas9筛选模型,并进行高通量测序。
  2、利用MAGeCK等一系列生物信息学方法,进行测序数据的质控和分析,结合体外耐药细胞株转录组测序分析,筛选若干潜在耐药靶点;
  3、利用CRISPR敲除、质粒转染方法,结合药敏实验、平板克隆和凋亡实验等,对靶点进行进一步的功能验证;
  4、利用实时定量PCR的方法,在接受依维莫司治疗的肾癌组织标本中验证耐药靶点表达水平与临床疗效的相关性;
  5、利用组织芯片的方法,结合临床数据库数据,分析新型靶点在评价肾癌预后中的临床价值。
  结果:
  通过CRISPR/Cas9耐药基因筛选、生信分析、临床疗效相关性分析以及药敏功能验证,发现,靶向敲除MAGIX后能够介导肾癌依维莫司耐药,而过表达则能逆转该过程。较正常肾癌细胞肾,在同样浓度依维莫司作用下,靶向敲除MAGIX后,细胞克隆形成能力明显增强,而凋亡细胞比例明显减少。同时,组织芯片分析和TCGA数据库分析发现,在肾癌患者整体人群中,MAGIX表达水平越低提示患者预后越差。
  结论:
  MAGIX的差异表达水平与肾癌依维莫司治疗药物反应性相关,可作为指导肾癌依维莫司个体化治疗的生物标记物。在临床病理标本中发现,MAGIX在依维莫司耐药组中表达水平低于敏感组。此外,MAGIX的低表达提示肾癌患者预后差,具有预测肾癌预后的潜在临床价值,相关作用机制尚需进一步探讨明确。
[硕士论文] 胡杰伟
生物化学与分子生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  中国已逐步进入老年社会,骨质疏松症是老年人尤其是中老年妇女的常见病,尽管降钙素是临床上用来治疗骨质疏松症的有效药物,但其也存在着诸如成本高、半衰期较短、免疫原性高等问题。因此,发掘更高效的降钙素具有重要临床意义。
  目的:
  通过对多种新型海洋来源的降钙素基因序列进行序列对比、进化树分析、活性检测,发现高效新型降钙素,为临床应用奠定基础;建立高通量挖掘验证活性多肽的技术平台,为发现新功能多肽提供技术储备。
  方法:
  1、利用鲑鱼降钙素序列进行BLAST获得其他物种的降钙素序列,由两部分组成:NCBI非冗余蛋白库和华大基因水生生物基因组数据库。
  2、通过clustal omega软件进行序列比对,结合物种选取具有代表性的序列使用MEGA7软件构建进化树。
  3、根据进化树结果,结合物种分类选择包括鲑鱼降钙素在内的13条序列进行化学合成。
  4、按照中国药典标准降钙素活性检定方法,对化学合成的13条降钙素在SD大鼠模型上进行活性验证。
  5、对包括鲑鱼降钙素在内的13条序列进行CD谱分析,使用ProtParam工具对各降钙素序列的各种理化性质进行计算,如等电点、GRAVY值、预计半衰期等;使用HeliQuest分析各降钙素序列的氨基酸组成比例、疏水性等。应用Swiss-Model、Swiss-PdbViewer、PEP-FOLD等软件对各降钙素序列的空间结构进行评估、预测。
  6、根据降钙素活性结果和序列、空间特点,总结活性规律。并在此基础上计算机辅助设计优化新的降钙素序列。
  7、设计降钙素序列的化学合成。
  8、按照中国药典标准降钙素活性检定方法,对化学合成的6条降钙素在SD大鼠模型上进行活性验证。
  9、用ELISA法初步分析设计降钙素序列的半衰期。
  10、用ELISA法初步分析设计降钙素序列的免疫原性。
  结果:
  1、利用鲑鱼降钙素序列进行BLAST获得其他物种的降钙素序列,分析各物种降钙素序列,共得到来自软骨鱼纲,辐鳍鱼纲,两栖纲,蜥形纲(鸟纲),合弓纲(哺乳纲)64种降钙素。
  2、通过序列比对和聚类,选取26种(条)具有代表性的降钙素序列构建进化树。
  3、根据进化树结果,结合物种分类选择包括鲑鱼降钙素和人降钙素在内的13条序列进行化学合成。
  4、对化学合成的13条降钙素在SD大鼠上进行活性验证,其中4种降钙素活性比鲑鱼降钙素活性高30%,3种与鲑鱼降钙素相当,4种比鲑鱼降钙素低。
  5、CD谱分析表明这11条天然降钙素二级结构与鲑鱼降钙素相似。
  6、软件分析表明活性较高的降钙素序列通常具有较高的亲水性。提示可能与降钙素整体“柔性”有关。
  7、序列对比分析发现16位或22位的苯丙氨酸/异亮氨酸的出现会显著影响降钙素序列活性。提示可能影响α螺旋的稳定与C端的折叠。
  8、结合前述这些结果,计算机辅助优化设计了6条降钙素序列。
  9、对这6条新设计的降钙素序列(CT-01~06)在SD大鼠上进行活性验证,其中2种活性比鲑鱼降钙素活性高50%,1种比鲑鱼降钙素高30%,3种比鲑鱼降钙素低。
  10、用ELISA法初步分析了CT-01、CT-04、CT-06这3条序列在SD大鼠体内的半衰期,发现与鲑鱼降钙素相当。
  11、用ELISA法初步分析了CT-01、CT-04、CT-06这3条序列在C57小鼠动物模型上的免疫原性,发现比鲑鱼降钙素低。
  结论:
  1、通过对天然海洋生物降钙素的活性检测,发现了Mdo、Oan、Gga、Cau4种序列活性比鲑鱼降钙素活性高30%,Tni、Pbi、Loc3种序列与鲑鱼降钙素相当,Cmi、Spa、Bpe、Hip4种序列比鲑鱼降钙素低。
  2、通过总结降钙素活性规律,最终优化设计得到3条活性较高、半衰期长、免疫原性低的降钙素序列。
  3、课题组通过对降钙素的研究,初步建立了高通量挖掘验证活性多肽的技术平台。
[硕士论文] 周婷
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:骨质疏松是一种年龄退行性疾病,主要症状是骨量减少、骨微结构发生变化。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是成骨细胞的祖细胞,具有多向分化功能,但是老化的BMSCs细胞的成骨分化能力减弱,成脂分化能力增强,因此,老年人的骨质疏松治疗难度较大。抑制BMSCs老化,促进其成骨分化能力是提高老年人骨骼质量的一个突破途径。白藜芦醇具有抗氧化、抗炎等功能,那么白藜芦醇能否抑制BMSCs老化,促进其成骨分化,进而治疗老年入骨质疏松呢?本研究对来源不同月龄小鼠的BMSCs研究发现,随着月龄增加,老化的BMSCs占比增加,细胞增殖速率减慢。加入白藜芦醇后,BMSCs老化现象减少,且呈现浓度依赖性,同时,BMSCs的成骨分化能力显著增强。进一步研究发现,白藜芦醇逆转BMSCs老化的作用是通过激活AMPK信号通路,抑制细胞内活性氧的产生而实现的。这些结果的发现,揭示了白藜芦醇促进BMSCs成骨分化的机制,为老年人骨质疏松的治疗提供了新的方向。
[博士论文] 吕权真
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近几年,随着临床上癌症治疗、器官移植中免疫抑制剂的使用以及艾滋病等疾病导致的免疫受损患者的增多,真菌感染的发病率也在不断攀升。院内血源性感染中真菌感染已经上升至第4位。即便在现有的抗真菌药物治疗下,系统性真菌感染导致的死亡率仍高达40%-70%。现有的抗真菌治疗手段有限,而唑类药物作为常用抗真菌药物出现了严重的耐药现象。在经过唑类药物长期治疗的患者中,分离的白念珠菌对唑类药物的耐药率高达40%。因此,阐明唑类药物的耐药机制,寻找新的抗真菌治疗的手段是临床抗真菌感染急需解决的问题。
  白念珠菌对于唑类药物的耐药机制研究已经取得了一些进展,主要是关于唑类合成通路以及外排泵相关基因的突变和高表达导致的耐药问题。阐明白念珠菌对于靶向于麦角甾醇合成的唑类药物的耐药机制,解决唑类耐药问题,需要彻底阐明白念珠菌麦角甾醇合成通路的调控网络。已有的研究表明,白念珠菌甾醇合成通路主要通过转录因子Upc2p调控相关甾醇合成酶的表达。但在酿酒酵母中,甾醇合成的调控不仅局限于转录水平还包括翻译后调控等方式,但这种翻译后调控的方式在白念珠菌中很少有文献报道,仍需要进一步研究。本文选取了与酿酒酵母中调控羟甲基戊二酰乙酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶稳定性的NSG2同源基因ORF19.273基因作为研究对象,研究其对于甾醇合成通路和唑类药物敏感性的影响。首先,通过HIS1-ARG4-LEU2营养筛选策略和融合PCR的方法构建了白念珠菌ORF19.273(NSG2)敲除菌和回复菌。初步考察ORF19.273缺失菌的表型发现,ORF19.273基因对于白念珠菌增殖速率、菌丝和被膜形成并无影响。而通过药物敏感性考察,发现ORF19.273敲除菌对于唑类药物敏感性升高,但对于唑类药物上游的抗真菌药物洛伐他汀、特比萘酚以及下游的抗真菌药物丁苯吗啉敏感性没有差异,对于两性霉素B耐受。对于洛伐他汀药物敏感性无差异提示ORF19.273和酿酒酵母中NSG2基因功能并不完全一致。透射电镜分析结果显示ORF19.273缺失菌细胞膜会出现轻微缺损,而在氟康唑作用下,ORF19.273缺失菌细胞膜损伤更为严重。除此之外,ORF19.273缺失后细胞膜通透性发生变化,对于不能透过细胞膜的碘化丙啶(PI)通透性增加,说明ORF19.273基因缺失后,白念珠菌细胞膜结构和功能均出现损伤。在白念珠菌中,麦角甾醇合成是影响唑类药物敏感性和细胞膜完整性的重要物质。通过气质联用(GC-MS)分析亲本菌和ORF19.273缺失菌以及回复菌中甾醇的百分比发现,ORF19.273敲除后,含有14α-甲基的甾醇obtusifoliol和14α-methylfecosterol在胞内累积,在氟康唑作用后,亲本菌中累积的主要是lanosterol,而ORF19.273缺失菌中累积的主要是含有14α-methylfecosterol、obtusifoliol、eburicol,这说明ORF19.273基因可以调控白念珠菌中各类甾醇的平衡,而在文献报道中,白念珠菌甾醇分布平衡是维持其对于唑类药物耐受的重要机制。因此,认为ORF19.273主要通过降低细胞内含有14α-甲基甾醇的比例维持白念珠菌对于唑类药物的耐受。体内结果与体外研究一致,在小鼠系统性白念珠菌感染模型中,ORF19.273基因缺失菌感染组在氟康唑治疗后,小鼠肾脏荷菌量和死亡率明显低于亲本菌感染组。本部分研究证实ORF19.273基因通过调控obtusifoliol和14α-methylfecosterol的水平,维持白念珠菌细胞膜完整性和白念珠菌对于唑类药物的耐受。
  除了化学药物治疗外,免疫治疗真菌感染领域也研究较为广泛。白念珠菌作为机会性致病真菌,其致病性与机体免疫系统的状态有着密切关系。近几年,文献已经报道了多种有效的抗真菌感染的单克隆抗体、减毒活疫苗以及重组蛋白疫苗,但关于疫苗的作用机制研究还相对较少。通过研究不同疫苗的作用机制和免疫系统清除真菌的关键环节可以为开发新的抗真菌治疗手段提供思路。本研究中发现白念珠菌转录因子FLO8缺失菌作为基因改造的白念珠菌弱毒株可以激活野生型小鼠的免疫保护作用。尾静脉注射flo8△活菌预免后,小鼠对于侵袭性白念珠菌感染、金黄色葡萄球菌感染以及肺部的烟曲霉菌感染和铜绿假单胞菌感染均能产生较好的免疫保护效果。通过长期预免策略,发现flo8△活菌可以刺激机体产生高水平的与白念珠菌结合的抗体,flo8△活菌预免的血清可以增强巨噬细胞对于白念珠菌的调理杀伤能力。在短期预免保护策略中发现flo8△活菌的保护作用不仅仅依赖于抗体,更依赖于其刺激产生的抗炎因子IL-10,IL-10可以降低正常毒力菌株SC5314二次感染时造成的急性炎症损伤,减少单核细胞和中性粒细胞的募集。同时IL-10可以保护胸腺在白念珠菌感染过程中不发生萎缩,通过上调抗凋亡基因BCL-2和BCL-XL的表达抵御白念珠菌感染引起的CD4+CD8+细胞凋亡。通过分析FLO8基因缺失菌细胞壁成分的变化,发现FLO8基因缺失菌表面的甘露聚糖,尤其是血清诱导后的甘露聚糖刺激巨噬细胞产生IL-10的水平升高。小鼠腹腔注射FLO8缺失菌甘露聚糖后,二次感染SC5314时,小鼠肾脏荷菌量降低,生存率升高,这说明FLO8表面的甘露聚糖是FLO8基因缺失菌诱导免疫保护效应的基础。在体外刺激巨噬细胞时,还发现FLO8缺失菌经过血清诱导后,可以特异性刺激巨噬细胞产生NO。标准菌株SC5314则需要在Pam3CSK4协同下刺激巨噬细胞产生NO,说明FLO8缺失后白念珠菌表面刺激NO产生的抗原增多,后来经过分离提取确定是白念珠菌氯仿甲醇提取物中的正丁醇部分能够刺激巨噬细胞产生NO。但体内研究发现,NO并不参与FLO8基因缺失菌诱导的免疫保护效应。综上所述,FLO8基因缺失菌主要通过表面的甘露聚糖刺激CARD9介导的IL-10的生成保护二次感染后小鼠的胸腺并提高小鼠的生存率。这种免疫保护机制可以为后续疫苗的开发以及抗真菌治疗提供新的理论指导。
[硕士论文] 苏东安
精神病与精神卫生学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:抑郁症是一种常见的情感障碍,主要临床表现为情绪低落、兴趣减低,甚至可出现极端消极观念和自杀行为,致残及致死率非常高,预计到2020年,抑郁症将成为全球第二大常见疾病[1];先前研究发现抑郁症的发病机制可能与相应脑区神经营养因子水平下调及促炎性因子的异常激活有关[2-4]。大量研究指出氯胺酮作为一类临床常用的全身麻醉药,其可发挥快速起效的抗抑郁作用,且对伴有自杀倾向的难治性抑郁患者亦有改善作用[5,6],本研究旨在通过构建抑郁动物模型和临床实验进一步证实氯胺酮对抑郁症的治疗作用,并试图阐明氯胺酮抗抑郁机制,从而为临床治疗抑郁症提供理论基础。
  一、氯胺酮对抑郁大鼠白介素-1β和白介素-6表达的影响
  目的:观察氯胺酮对抑郁大鼠前额皮层及海马区组织内白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)表达的变化。
  方法:Wistar大鼠雄性20只,2月龄,体重180~220g。按随机方式分为2组(n=10),分别给予生理盐水(对照组,C组)、给予氯胺酮药物治疗组为K组。应用行强迫游泳实验15min的方法建立大鼠抑郁模型,建模后第2天腹腔注射氯胺酮10mg/kg或等体积生理盐水。注射30min后再次进行强迫游泳试验5min,记录大鼠不动时间。然后立即处死大鼠,剥前额皮层及海马组织测定IL-1β和IL-6的表达。
  结果:与对照组相比,氯胺酮干预后大鼠强迫游泳不动时间明显减少(p<0.01),大鼠前额皮层及海马区的IL-1β和IL-6表达均明显下调(p<0.05)。
  结论:氯胺酮的抗抑郁作用可能与前额皮层及海马IL-1β和IL-6的表达下调有关。
  二、氯胺酮对抑郁症患者血清脑源性神经营养因子及5-羟色胺水平的影响
  目的:探索单次小剂量静脉注射氯胺酮对抑郁症患者血清脑源性神经营养因子(BDNF)及5-羟色胺(5-HT)水平的影响。
  方法:39名抑郁症患者随机分为两组:对照组(n=20),氯胺酮组(n=19)。氯胺酮组静脉持续推注0.5mg/kg盐酸氯胺酮溶液50ml,推注时间40min,对照组推注等容量生理盐水50ml。在治疗前及治疗后第1、3、7天完成汉密尔顿(HAMD)量表评分及测定外周静脉血BDNF及5-HT的含量。
  结果:与对照组相比,氯胺酮组患者在干预后第1、3、7天HAMD评分均明显降低(p<0.05),治疗后第1天BDNF水平明显上升(p<0.01),尽管第3天有所回落但仍显著高于对照组(p<0.05),第7天无明显差异(p>0.05),5-HT水平各时间节点与对照组无明显差异(p>0.05)。
  结论:氯胺酮的抗抑郁作用可能与上调血清BDNF的表达有关,与5-HT的关系尚需进一步研究证实。
[硕士论文] 余史丹
药物分析学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:新型抗艾滋病复方药物(富马酸替诺福韦酯200mg+拉米夫定300mg+依非韦伦400mg,q.d.)是由加利福尼亚大学洛杉矶分校(UCLA)何志明院士课题组采用反馈系统控制(FSC)技术按照不同药物组合和剂量进行测试筛选优化得到的低毒高效的抗艾滋病复方药物。本课题建立高灵敏度、高特异性的LC-MS/MS方法对新型抗艾滋病复方药物进行了临床前药代动力学研究,了解其在动物体内吸收、分布、代谢及排泄等药动学及其相互作用过程,为新药的申报和进一步临床试验研究提供试验资料和参考依据。
  一、生物样品中替诺福韦、拉米夫定及依非韦伦定量分析方法的建立与确证
  本文建立了快速、灵敏、可靠的LC-MS/MS方法测定不同生物样品中替诺福韦(TEF)、拉米夫定(3TC)及依非韦伦(EFV)的浓度。选用阿昔洛韦(ACV)、双氢氯噻嗪(HCT)及恩曲他滨(FTC)作内标,样品采用蛋白沉淀法处理,色谱柱选用AgilentZORBAX SB-Aq(4.6×150mm,5μm)和Ultimate XB-C18(4.6×50mm,5μm);流动相为甲醇-水(25mM醋酸铵+0.1%甲酸)和乙腈-水(0.1%甲酸);梯度洗脱,流速为1mL/min,3∶7分流。采用ESI离子源,MRM检测模式,正离子扫描模式下,用于定量的离子通道分别为m/z288.3→176.4(TEF)、m/z230.3→111.9(3TC)、m/z316.0→244.0(EFV)、m/z226.1→152.2(ACV,IS)、m/z247.8→129.9/101.1(FTC,IS);负离子扫描模式下,用于定量的离子通道分别为m/z314.0→243.9(EFV)、m/z296.0→204.8(HCT,IS);不同生物样品中TEF、3TC及EFV定量分析方法学验证结果均符合FDA、CFDA等颁布的生物样品定量分析相关指导原则且成功应用于新型抗艾滋复方药物的临床前药代动力学研究。
  二、新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内药代动力学相互作用研究
  采用自身对照、随机交叉试验方法对新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内的药代动力学相互作用进行评价。通过比较Beagle犬单剂量口服给药抗艾滋病单一组分和复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药时曲线及相应药动学参数,发现不同Beagle犬个体间差异较大,而TEF、3TC及EFV的主要药代动力学参数均不存在显著性差异(P>0.05),即不存在药物相互作用。提示TEF、3TC与EFV不存在相互作用,是否与Beagle犬个体差异大而掩盖了药物相互作用相关有待进一步的考察研究。
  三、新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内药代动力学研究
  采用LC-MS/MS法对新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内的药代动力学过程进行考察。对Beagle犬单剂量口服给药低、中、高三个剂量组抗艾滋病复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药动学参数Cmax、AUC0-τ与相对应的给药剂量进行线性回归,得TEF的相关系数为R2=0.4214(Cmax)和R2=0.6849(AUC0-τ),3TC的相关系数为R2=0.7889(Cmax)和R2=0.8286(AUC0-τ),提示TEF和3TC的药动学参数AUC0-τ与给药剂量基本呈正相关,而EFV的相关系数仅为R2=0.2289(Cmax)和R2=0.3047(AUC0-τ)。Beagle犬多剂量给药复方药物第四天后,体内TEF、3TC及EFV的血药浓度基本上达到稳态。单剂量和多剂量口服给药抗艾滋病复方药物后TEF、3TC及EFV的平均药时曲线AUC累积比分别为1.89、0.95和1.17。以药物生物等效性的接受标准为参比(上限界定为1.25),提示连续给药7天后TEF在Beagle犬体内有蓄积,3TC及EFV无蓄积。
  四、新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内药代动力学研究
  采用LC-MS/MS法对新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内的药代动力学及相互作用进行考察。对SD大鼠单剂量口服给药低、中、高三个剂量组抗艾滋病复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药动学参数Cmax、AUC0-τ与相应给药剂量进行线性回归,得TEF相关系数为R2=0.3035(Cmax)和R2=0.7803(AUC0-τ),3TC相关系数为R2=0.6134(Cmax)和R2=0.8646(AUC0-τ),EFV相关系数为R2=0.6886(Cmax)和R2=0.5314(AUC0-τ),提示TEF、3TC及EFV的药动学参数AUC0-τ与给药剂量基本呈正相关。比较SD大鼠单剂量口服给药抗艾滋病复方药物各单一组分和复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药时曲线及相应药动学参数,发现TEF及3TC各参数无显著性差异(P>0.05);EFV的药动学参数Cmax、MRT存在显著性差异(P<0.05)。提示SD大鼠口服给药抗艾滋病复方药物后对TEF、3TC体内药代动力学无显著影响,对EFV在体内的吸收、消除过程有一定的影响,即可能存在药物间相互作用。
  五、新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内组织分布及排泄研究
  采用LC-MS/MS法对新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内主要脏器组织中的分布状况及其排泄特征进行研究。从抗艾滋病复方药物在各组织中的分布结果中发现,富马酸替诺福韦酯(TDF)经胃肠道吸收后迅速代谢成TEF,在肾脏中分布最快、浓度最高,肝脏次之。TEF不易通过血脑屏障进入脑组织,在脑组织中分布较少。给药2h后,3TC在肾组织中迅速达峰且分布浓度最高,24h仍维持较高浓度的分布。3TC在血流灌注丰富的组织(心、肝、脾、肺)中也有较为广泛的分布且达到较高浓度水平,在脑组织中分布较少。EFV在各组织中的浓度分布顺序为肝>心、脾、肾、脑>肺。药物EFV经胃肠道吸收,原型药物在肝脏中分布最快、浓度最高,其易于通过血脑屏障,因此在脑组织中浓度较高。
  从排泄实验结果中可以看出,SD大鼠口服给药抗艾滋病复方药物后,TDF主要以代谢物TEF形式从尿液、粪便及胆汁中排泄,平均累积排泄率分别为12.50%、28.84%和0.285%;3TC在尿液、粪便和胆汁中的平均累积排泄率分别为21.37%、27.61%和1.293%,主要以原型形式排泄;EFV在SD大鼠体内存在广泛的代谢过程,以原型形式在尿液、粪便和胆汁中的平均累积排泄率分别为0.005%、5.86%和0.014%,总排泄率仅为5.879%,后期需进一步研究依非韦伦的体内代谢产物。
[硕士论文] 程丹
药剂学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:脂肪酸类化合物在哺乳动物体内有较为完整的吸收代谢途径,研究发现脂肪酸能作为生物前体物质或能量被细胞摄取,因此广泛用于前药的设计之中。文献报道的脂肪酸修饰的抗肿瘤药物多以二十二碳六烯酸(DHA)、α-亚麻酸(α-LNA)、共轭亚油酸(LA)为代表的不饱和脂肪酸,但是关于长链饱和脂肪酸抗肿瘤前药的研究较少。本研究以临床较为常用的抗肿瘤药物紫杉醇(Paclitaxel,PTX)为模型药物,选择两种长链饱和脂肪酸——棕榈酸(Palmitate acid,PA)和硬脂酸(Stearate acid,SA),以及两种不饱和脂肪酸——亚麻酸(Linolenate acid,LNA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)作为配体,合成了四种紫杉醇脂肪酸酯前药,将其制备成脂质体,并对其体内外性质进行研究,以期比较紫杉醇饱和与不饱和脂肪酸酯前药在抗肿瘤效果方面的差异,并筛选出一种低毒高效的紫杉醇前药制剂。
  本研究首先通过酯化法合成了紫杉醇饱和与不饱和脂肪酸酯,即PTX-PA、PTX-SA、PTX-LNA和PTX-DHA,产物经ESI-MS与1H NMR确证为目标化合物。处方前研究表明,各种化合物的脂溶性均有不同程度增加。
  采用薄膜分散-探头超声法制备紫杉醇棕榈酸酯脂质体(PTX-PA-L)、紫杉醇硬脂酸酯脂质体(PTX-SA-L)、紫杉醇亚麻酸酯脂质体(PTX-LNA-L)和紫杉醇二十二碳六烯酸酯脂质体(PTX-DHA-L)。对其制备工艺和处方成分进行单因素考察优化后,最终确定处方工艺如下:磷脂与药物比例为25∶1,磷脂与胆固醇比例为25∶1,DSPE-PEG2000用量为0.4%,;制备过程中的薄膜制备时间和探头超声时间分别为45℃和90s。对最终处方进行验证后发现,与PTX-LNA和PTX-DHA相比,PTX-PA和PTX-SA制备出的脂质体粒径更小,过膜较顺畅,包封率较高,在制剂制备中更有优势。
  体外血浆转化研究表明,四种前药脂质体均能在大鼠血浆中缓慢释放出活性药物紫杉醇。PTX-PA-L、PTX-SA-L、PTX-LNA-L和PTX-DHA-L在血浆中孵育30h的转化率分别为3.49%、6.74%、8.55%和10.26%。体外细胞毒性研究结果表明,血浆中较稳定,转化较慢的PTX-PA-L和PTX-SA-L药物细胞毒性较低,而血浆中活性药物释放较快的PTX-LNA-L和PTX-DHA-L毒性相对较高。
  在体外研究的基础上,进行了体内药动学和组织分布实验。考察了紫杉醇注射液、PTX-PA-L、PTX-SA-L、PTX-LNA-L和PTX-DHA-L的体内药动学特征。实验结果发现血浆中累积释放速度较慢,血浆清除率低的PTX-PA和PTX-SA代谢出的活性母药PTX平均滞留时间长,代谢出的PTX的药时曲线下面积和半衰期分别为紫杉醇注射液的2倍和5倍。清除速率较快的PTX-LNA和PTX-DHA代谢出的PTX药时曲线下面积较小,半衰期短,与紫杉醇注射液相比并不具备优势。组织分布研究表明,肿瘤组织中,PTX-PA-L代谢出的PTX的AUCTumor(56.08μg/g*h)显著高于PTX-LNA-L(28.82μg/g*h)。证明PTX-PA-L在肿瘤组织可以更多的转化为PTX,增加药物在肿瘤部位的蓄积。
  最后,采用小鼠S180肉瘤细胞模型,考察了紫杉醇注射液、PTX-PA-L和PTX-LNA-L的体内抗肿瘤效果和骨髓抑制毒性。结果显示,等摩尔剂量下,虽然两种前药脂质体抗肿瘤效果均优于紫杉醇注射液,但PTX-PA-L(紫杉醇饱和脂肪酸酯脂质体)的抑瘤作用约为PTX-LNA-L(紫杉醇不饱和脂肪酸酯脂质体)的1.23倍,说明PTX-PA-L能够更为显著的提高药物的体内抗肿瘤活性,进一步说明血浆中释放较慢,血浆清除速率慢,肿瘤部位PTX浓度高的药物,药效更好。血常规检测结果发现,PTX-PA-L与其他两给药组相比,与骨髓抑制毒性有关的白细胞和血小板水平明显较高,说明体外细胞毒性较小的PTX-PA-L对荷瘤小鼠的骨髓抑制毒性同样较小。
[硕士论文] 傅维佳
内科学(传染病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:随着HBsAg定量检测技术的发展,临床研究发现HBsAg定量水平在抗病毒治疗过程中有重要的意义。但是HBsAg不仅来源于Dane颗粒(含有完整病毒核酸的感染颗粒),还有更多来源于管状或球形颗粒(非感染性的病毒空壳),所以HBsAg水平与抗病毒治疗并不完全平行,且目前缺乏大样本的临床研究,尚未形成标准化的评价体系。本研究旨在通过回顾性研究,观察核苷(酸)类药物长期治疗的CHB患者其基线HBsAg、HBeAg及HBVDNA定量水平及治疗过程中的动态变化,分析这些指标在CHB患者治疗过程中的临床意义。
  方法:回顾分析从2012年1月至2016年12月期间在第二军医大学附属长海医院感染科就诊及随访的4000例初治慢性乙肝患者,收集相关的临床病例资料,分析指标包括HBsAg、HBeAg、HBVDNA、年龄、性别,共筛选出其中资料齐全的940例样本进行分析。
  结果:1.HBeAg阳性CHB患者(439例)年龄小于HBeAg阴性组(501例),基线HBsAg,HBVDNA定量水平大于HBeAg阴性组。2.HBeAg阳性组中,基线HBsAg与HBeAg,HBVDNA呈正相关,基线HBeAg与HBVDNA呈较弱的正相关。3.HBeAg阴性组中,基线HBsAg与年龄成显著的负相关,与HBVDNA不相关。4.HBeAg阳性组中,经过长期抗病毒治疗,HBsAg,HBeAg,HBVDNA定量水平均有明显下降。治疗初始6个月HBsAg定量水平下降速率越高,基线HBsAg,HBeAg定量水平越低时越有可能达到SR。经过4年抗病毒治疗,达到SR者138例,其中ETV组35,LDT组75,LDT+ADV组11,ETV+ADV组9,LAM+ADV组8例。5.HBeAg阴性组中,经过4年抗病毒治疗,全部达到VR,HBsAg,HBVDNA定量水平均有明显下降。没有发现对疗效有预测价值的因素。
  结论:HBeAg阳性CHB患者,抗病毒治疗初始6个月HBsAg定量水平下降速率越高,基线HBsAg,HBeAg定量水平越低时越有可能达到血清学应答。HBeAg阴性组中,没有发现对应答有预测价值的因素。
[硕士论文] 杨启维
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:临床上许多进展期肾癌患者已经失去手术机会,接受手术的患者将近有三分之一会发生复发和转移。抗血管治疗药物是针对血管内皮生长因子(VEGFR)受体的较为有效的治疗方法,抗血管药物同时阻滞络氨酸激酶受体(RTK),目前肾癌治疗一线靶向药物中舒尼替尼最为常用。令人惋惜的是有将近五分之一的肾癌患者对抗血管治疗不敏感,剩下的患者最终再接受一到多个疗程之后也会发展为耐药。许多患者因为中断了舒尼替尼的治疗最终导致快速的复发和转移,所以开发新型的抗肿瘤药物迫在眉睫。
  随着纳米科技的快速发展,各种纳米药物的药效学得到深入研究,其中一些甚至进入临床试验和临床治疗。在这些纳米药物中,无机纳米药物得到广泛研究,其中一些也在临床试验中得到理想效果。四氧化三铁纳米粒已经被美国FDA食品与药品监督局批准并认可应用于贫血的治疗。最近,四氧化三铁纳米粒显示出抗巨噬细胞的效应,这样就有潜能应用于肿瘤的生物免疫治疗。而且,银纳米粒已经在妇产科感染性疾病的治疗中取得一定疗效。其它无机纳米药物,例如:纳米氧化锌和纳米金,仍然有成为抗肿瘤药物的很大潜藏价值。在我们的前期研究中,氧化亚铜纳米粒(Cuprous Oxide Nanoparticles,CONPs)展示出理想的抗肿瘤效果和很低的生物毒性。铜伴侣蛋白调节细胞内铜离子转运和剂量,在肿瘤的进展中也扮演了重要角色。纳米药物和铜伴侣蛋白相互作用的机制尚未得到深入研究。
  目的:
  明确CONPs如何左右肾癌细胞的生物学行为,并在肾癌在体动物模型的实验中进行验证。在药效学实验阳性的基础上,迸一步探讨CONPs对抗肾癌进展的分子学机制,并寻找该药物抑制肾癌生长并诱导其凋亡的靶点。
  方法:
  1、通过CCK8法评估CONPs作用于肾癌细胞后,其细胞活力和增殖效应的变化,并通过TRANSWELL实验检测CONPs对肾癌细胞迁移和侵袭的影响,采用AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒在流式仪上对CONPs是否诱导肾癌细胞凋亡进行验证。通过流式仪并利用Cell cycle staining Kit检测CONPs对肾癌细胞周期的效应。
  2、RNA提取和qRT-PCR检测CONPs作用后肾癌细胞转录水平RNA变化情况,WB实验在蛋白水平检测CONPs对肾癌细胞蛋白质翻译有何影响,shRNA干扰靶蛋白寻找并验证CONPs的靶点。
  3、透射电子显微镜观察CONPs作用于肾癌细胞器的亚细胞结构,细胞内铜离子含量通过电感耦合等离子体质谱法的铜总量吸收实验所测定,通过对肾癌细胞内ROS和钙离子浓度的检测来检验细胞内氧化活性反应和内质网应激通路的激活。
  4、裸鼠皮下成瘤在体实验验证CONPs在动物体内是否能发挥抗肾癌效应。取裸鼠皮下瘤体标本TUNEL和KI67实验,进一步在体内实验中验证CONPs对肾癌增殖和凋亡的影响。
  结果:
  1、CONPs对肾癌细胞生长产生抑制,并且阻滞肾癌细胞周期于S和G2期。同时,CONPs抑制了肾癌细胞的侵袭和转移。
  2、透射电子显微镜观察到CONPs使肾癌细胞内质网肿胀,并且用流式细胞技术也检测到CONPs使肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度显著提高,并且与用药浓度和用药时间正相关,ROS水平和钙离子浓度的上升都是内质网应激的使动因素。
  3、CONPs诱导细胞内铜离子积聚,并且靶向作用铜伴侣蛋白发挥抗肿瘤效应。CONPs诱导肾癌细胞内质网应激并促进其细胞凋亡,WB实验验证了内质网通路和凋亡通路上关键蛋白的激活。
  4、CONPs在体内动物模型实验中抑制裸鼠皮下肾癌瘤体的生长。并且靶向AXL和MET蛋白,恢复肾癌耐药细胞对舒尼替尼的敏感性,体内实验的瘤体也同时验证内质网和凋亡通路的激活,以及对耐药蛋白的抑制。
  结论:
  我们系统性了CONPs的药理学效应,以及无机纳米药物在抑制肾癌和耐药肾癌模型的进展,多项研究表明CONPs在体内和体外实验中抑制了肾癌的生长。并且我们研究了CONPs作用于铜伴侣蛋白ATOX1和CCS的药理学效应。我们发现CONPs可以显著影响ATOX1和CCS的功能,干扰细胞内铜转运,并且释放铜元素,导致细胞内铜元素累积,CONPs提高肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度,从而导致内质网应激的发生,并在抑制其增殖的同时促进凋亡。CONPs在抗肾癌细胞的同时显示了极低的肝肾毒性,并且通过下调AXL、MET、AKT、ERK来抑制舒尼替尼耐药。这些研究都可以说明CONPs值得开发为新型抗肿瘤纳米药物从而应用到对进展期肾癌和舒尼替尼耐药肾癌的临床治疗中,这样可以极大程度上促进中晚期肾癌患者的预后。
[博士论文] 吴卉乔
外科学(骨外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 Nampt参与介导椎间盘退变过程
  背景:
  腰痛在临床上极为常见,超过80%的人一生某个时间中将受到下腰痛的困扰,是目前导致人类残疾的首要原因。椎间盘退变及其继发疾病的一系列相关疾病是导致腰痛最重要的病因。研究证实,椎间盘退变伴随炎症因子表达增加,炎症反应是介导椎间盘退变最重要的病理生理过程,炎症因子或介质不仅能诱导细胞外基质分解酶表达增加、降低细胞外基质合成基因表达、还能诱导神经血管长入,从而引发椎间盘退变及疼痛。
  烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)又称内胀脂肪素(Visfatin)和前B细胞克隆增强因子(PBEF),在1994年被首次发现。Nampt在有机体内广泛存在,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)补救合成途径的限速酶,研究表明,Nampt具有类炎症细胞因子样作用,参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,在免疫调节、炎症反应、代谢等相关疾病中均发挥重要作用。研究已证实Nampt可通过促炎作用介导细胞外基质降解,参与骨关节炎、类风湿关节炎等疾病的发生。但Nampt在椎间盘退变中的作用目前尚无文献报道,考虑椎间盘退变与骨关节炎、类风湿关节炎具有相似的病理生理机制,本研究拟对Nampt在椎间盘退变中的具体作用机制进行探讨。
  目的:
  1、探讨Nampt在椎间盘退变过程中的表达;
  2、探讨阻断Nampt对椎间盘细胞外基质代谢的影响。
  方法:
  1、获取因腰椎滑脱、腰椎管狭窄、腰椎间盘突出症需手术治疗患者的椎间盘组织(50例),按Pfirrmann分级分组,退变等级Ⅱ级和Ⅲ级为轻度退变组,退变等级Ⅳ级和Ⅴ级为重度退变组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白印迹(WesternBlot)和免疫荧光法检测Nampt在不同退变等椎间盘标本中的表达。
  2、获取椎间盘标本后,采用酶消化法消化、培养髓核细胞,给予不同浓度IL-1β干预48小时或给予IL-1β(10ng/mL)干预不同时间后,采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,采用NAD活性检测试剂盒检测干预后髓核细胞NAD的活性。
  3、采用Nampt酶活性抑制剂APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。
  4、采用IL-1β(10ng/mL)、或APO866(10nmol/L)、或APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞后联合IL-1β(10ng/mL)共干预髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、以及MMP-3和MMP-13的表达差异;采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞合成相关基因蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况。
  5、构建三种shRNA质粒敲除载体(shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#)转染髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。
  6、采用空质粒颗粒Src、shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#预先转染髓核细胞后,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,细胞免疫荧光检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况。
  结果:
  1、本研究纳入的50例标本中,轻度退变等级26例,重度退变等级24例;qRT-PCR检测结果显示重度退变组Nampt在mRNA表达水平显著高于轻度退变组;蛋白印迹法和免疫组化结果显示重度退变组Nampt在蛋白表达水平也显著高于轻度退变组。2、不同浓度IL-1β干预后检测发现Nampt在mRNA水平和蛋白水平表达均随着IL-1β干预浓度增加而增加,呈剂量依赖性;且IL-1β干预不同时间后也发现Nampt表达随着干预时间延长而逐步增加,呈时间依赖性。
  3、APO866干预细胞后,Nampt表达不变,且APO866并不影响IL-1β诱导Nampt表达上调的作用;但APO866可显著降低髓核细胞中NAD活性,且可显著抑制IL-1β上调NAD活性的作用。
  4、IL-1β干预可显著上调细胞外基质分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的表达,且显著下调细胞外基质合成基因蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;而APO866并不影响这些基因的表达,但可显著抑制IL-1β上调ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的作用,以及抑制IL-1β下调蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用。
  5、三种质粒载体均可显著敲除髓核细胞中Nampt基因表达,无论mRNA层面还是蛋白层面,且可显著抑制细胞NAD活性。
  6、Nampt敲除后并不影响ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用,但shRNA1#和shRNA3#转染后可显著逆转IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调作用,且显著逆转IL-1β对蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分解的作用。
  结论:
  1、椎间盘退变过程中伴随Nampt表达增加,且Nampt表达水平与椎间盘退变严重程度呈正相关,说明Nampt参与介导椎间盘退变过程。
  2、IL-1β具有诱导Nampt表达上调的作用,且抑制Nampt酶活性或敲除Nampt均可显著抑制IL-1β对细胞外基质分解的作用,说明IL-1β可能通过诱导Nampt介导椎间盘细胞外基质分解,从而诱导椎间盘退变,且阻断Nampt具有逆转椎间盘退变的作用。该研究为为椎间盘退变及腰痛的治疗提供新思路和新策略。
  第二部分 APO866诱导细胞自噬延缓椎间盘退变的作用及机制
  背景:
  自噬是哺乳动物体内细胞的一种分解代谢方式,在细胞代谢增加或在缺氧、营养匮乏等应激条件下,细胞将通过自噬机制,将受损的细胞器或蛋白等物质转运至自噬溶酶体中进行降解。细胞自噬是细胞发育和存活的重要途径,自噬持续时间过久或程度过强,超出细胞自身调节能力,将导致细胞代谢紊乱甚至凋亡等变化,因此细胞自噬对于维持细胞稳态具有重要作用。目前研究已证实,自噬与多种疾病的发生发展均密切相关,如炎症及免疫性疾病、神经及心血管系统疾病、以及癌症等。椎间盘退变与细胞衰老、缺氧、营养匮乏等具有紧密联系,椎间盘细胞凋亡、衰老或功能减弱是导致椎间盘退变的主要原因。近年来,研究发现细胞自噬也参与椎间盘退变过程,且大多数情况下对椎间盘退变起到保护作用。
  Nampt参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,既往研究表明,APO866可诱导细胞自噬,在缓解急性肝损伤以及抑制肿瘤方面发挥重要作用。然而,APO866是否具有诱导髓核细胞自噬及其在椎间盘退变中的作用目前尚不明确。
  目的:
  1、探讨APO866诱导髓核细胞自噬的作用
  2、探讨APO866通过细胞自噬拮抗IL-1β对椎间盘细胞外基质降解的作用。
  方法:
  1、体外培养髓核细胞,采用不同浓度APO866(0、1、5、10、20、100nmol/L)干预48小时后、或采用APO866 (10nmol/L)干预不同时间(0、24、48、72、96h)后,CCK-8法检测细胞活性、单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。
  2、米用自噬抑制剂3-MA、或烟酰胺单核苷酸(NMN)、或人重组Nampt(rNampt)预处理髓核细胞,再辅助IL-1β干预与不干预,单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。
  3、髓核细胞单独给予IL-1β(10ng/mL)、或APO866(10nmol/L)、或APO866预干预2小时后给予IL-1β共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA(10mmol/L)和IL-1β(10ng/mL)共处理48小时,无干预髓核细胞作为对照。qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况;Tunel检测细胞凋亡情况。
  结果:
  1、APO866干预浓度达到20nmol/L以上时,髓核细胞活性显著下降。MDC染色发现髓核细胞自噬小体形成数量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。蛋白印迹检测发现LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性,且APO866干预48h时表达量达到峰值。细胞免疫荧光检测显示LC3蛋白阳性的自噬体膜含量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。
  2、自噬抑制剂3-MA可显著抑制由APO866诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。NMN和rNampt干预同样可抑制由APO866诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。
  3、自噬抑制剂3-MA并不能影响IL-1β对Nampt的诱导作用;APO866抑制IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调的作用被3-MA显著逆转;APO866抑制IL-1β降解蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用被3-MA显著逆转;APO866具有拮抗IL-1β诱导髓核细胞凋亡的作用,而这一作用被3-MA所逆转。
  结论:
  Nampt酶活性抑制剂APO866具有诱导髓核细胞自噬的作用,且通过自噬作用可显著逆转由IL-1β介导的髓核细胞外基质分解作用。提示APO866有望成为治疗椎间盘退变新的分子靶点及药物。
[硕士论文] 吕洪伟
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见的致命性恶性肿瘤之一。肿瘤中被称为癌症干细胞(cancer stem cells,CSCs)或肿瘤起始细胞(tumor initiating cells,TICs)的一小群细胞被认为是肿瘤发生、发展、转移和耐药的关键驱动力。维生素C(vitamin C,VC)(又称L-抗坏血酸或抗坏血酸盐)作为一种癌症疗法,有一段争议历史。20世纪70年代,著名诺贝尔化学奖、和平奖双料得主莱纳斯·鲍林(Linus Pauling)和外科医生伊万·卡梅伦(Ewan Cameron)报道称静脉滴注加口服大剂量维生素C(10g/d)能有效延长晚期肿瘤患者的生存期。随后,美国权威医疗机构梅奥诊所(Mayo Clinic)却通过临床试验证实口服大剂量维生素C并不能改善癌症生存率,因而否定了维生素C在癌症治疗中的作用。直到近些年,科学家才发现给予维生素C途径的差异是造成之前两次研究结果不同的主要原因。大剂量维生素C只有通过静脉注射而不是口服,才能在人体内达到药理学浓度,从而对多种肿瘤细胞产生杀伤效应。这些证据再次激发了全球科学界和医学界对维生素C治疗癌症的兴趣。然而,维生素C对肝癌干细胞的杀伤效果及机制尚未探明。
  研究方法与结果:钠依赖的维生素C转运体(sodium-dependent vitamin C transporter2,SVCT-2)在HCC中高表达;SVCT-2表达越高HCC患者生存期越短,肿瘤恶性程度越高。有趣的是,SVCT-2在肝癌干细胞中表达进一步升高,且与HCC临床样本中的干性相关基因表达呈正相关。另外,SVCT-2是肝癌干细胞干性维持所需,包括自我更新、耐药及成瘤能力。
  体内和体外实验表明高浓度维生素C可以杀死肝癌细胞;肝癌细胞对维生素C细胞毒性的敏感度由SVCT-2决定。更重要的是,与非干细胞相比,更高表达SVCT-2的肝癌干细胞对维生素C诱导的死亡更加敏感。与CSCs普遍耐受的传统化疗药顺铂相反,高浓度维生素C处理可以显著下调HCC细胞及肿瘤球中的干性相关基因表达,而且还能降低CD133阳性或EpCAM阳性CSCs的所占比例。另外,与OV6阴性的非干细胞相比,OV6阳性CSCs对高浓度维生素C的毒性更敏感,但对化疗药顺铂的毒性更耐受。此外,高浓度维生素C不仅抑制肝癌干细胞自我更新或体外成球能力,而且还以时间和剂量依赖的方式阻碍HCC细胞来源的肿瘤球的形成和生长。通过不同SVCT-2表达水平的人源性HCC组织异种移植模型(PDX模型),进一步证实大剂量维生素C抑制体内肿瘤生长,清除肝癌干细胞,且治疗效果与SVCT-2表达相关。机制上,维生素C通过SVCT-2进入细胞内,增加胞内ROS水平,进而诱导DNA损伤和ATP耗竭,最终通过引起细胞周期阻滞和caspase依赖的凋亡导致细胞死亡,而不是自噬或坏死性凋亡。因此,高浓度维生素C优先杀死高表达SVCT-2的肝癌干细胞。
  最后,通过对613例接受肝癌切除术作为首次治疗的HCC患者的回顾性队列研究发现术后静脉滴注维生素C治疗(2g/d)显著延长患者的无病生存期(DFS)(adjusted HR=0.622,95%CI0.487to0.795,p<0.001)。先前药代动力学研究证实静脉滴注2g维生素C在体内可达到的血浆浓度约1.5mM,而体外实验表明1.5mM的维生素C足以引起肝癌细胞和肝癌干细胞的死亡。因此,静脉滴注2g维生素C可能在体内杀伤术后残余肿瘤细胞,从而降低HCC复发风险。
  研究结论:1.SVCT-2在肝癌干细胞中高表达,且是肝癌干细胞干性维持所需;
  2.SVCT-2决定肝癌对维生素C诱导的细胞死亡的敏感度;
  3.高浓度维生素C优先杀死高表达SVCT-2的肝癌干细胞;
  4.机制上,维生素C通过SVCT-2进入细胞后生成ROS,进而诱导DNA损伤和ATP耗竭,最终导致细胞周期阻滞和凋亡;
  5.回顾性队列研究表明静脉滴注维生素C显著降低肝癌患者术后复发风险。
[硕士论文] 苏晓玲
妇产科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  卵巢癌是妇科致命的妇科恶性肿瘤,由于其发病隐匿,缺少特异可靠的筛查诊断指标,发现时往往已是晚期。转移是卵巢癌患者死亡的主要原因。应激与肿瘤的关系的研究越来越受到关注。应激包括患者因患肿瘤引发的心理应激被认为能促进肿瘤的进展。糖皮质激素(GC)是重要的应激激素,具有强大的免疫抑制、抗炎和维持内环境稳定的作用,并能在其受体(GR)的介导下调节细胞的新陈代谢、分化、增殖及存活。此外GC还是临床广泛使用的药物。除了治疗自身免疫性疾病和炎症外,还被作为实体肿瘤/癌症的化疗或放疗的辅助药物,用来减少放化疗的副反应,增加患者的耐受性。尽管GC与肿瘤的关系的研究一直受到关注,但结果一直不明确。研究证实GC可抑制一些实体肿瘤的增殖和进展,因此,有将GC单药或者联合细胞毒性药物(如5氟尿嘧啶)治疗乳腺癌和前列腺癌,并取得了一定的效果。反之近年来对多种肿瘤的研究表明,GC可以增强肿瘤细胞对放化疗的抵抗,减少放化疗诱导的细胞凋亡,促进肿瘤细胞存活,而这些作用加上GC的免疫抑制作用则有助于肿瘤的发生和发展。因此GC对肿瘤的作用还不清楚,其作用是否因肿瘤的不同类型而异需要进一步研究。
  缺氧是肿瘤常见微环境特征之一,低氧可诱导低氧诱导因子HIF-1的表达。HIF-1是重要的转录因子,由HIF-1α和HIF-1β组成,其中α亚基为氧调节亚基。HIF-1α表达增加被认为与临床上肿瘤患者预后不良相关。研究表明卵巢痛组织中HIF-1α的表达明显高于正常卵巢组织;并且HIF-1α在卵巢癌组织中的表达水平高与卵巢癌患者的预后差呈正相关。近年来研究认为HIF-1α的高表达促进多种肿瘤细胞的迁移和侵袭,因此HIF1-α已经成为几种类型肿瘤进展的关键预测因子。而HIF-1α对卵巢癌细胞侵袭和迁移的研究较少,现有的研究亦认为缺氧下HIF-1α促进卵巢癌细胞的侵袭转移。
  MUC1是一种跨膜黏蛋白,常过表达于一些上皮肿瘤,能够与膜上的多种蛋白相互作用,激活细胞内的PI-3K/AKT通路、Wnt通路等多条信号转导通路,从而调节细胞的侵袭转移等。近年来,MUC1被当作一种新的低氧诱导因子受到人们的关注,有报道MUC1与HIF-1α之间存在相互作用,但确切作用机制还不清楚。小G蛋白Rho激活的蛋白激酶ROCK2作为一个下游信号通路分子可通过调节细胞骨架进而调节细胞运动,与肿瘤细胞的转移密切相关。有国外学者在其研究中发现,Rho/ROCK途径可以调节HIF-1α信号转导。
  我校病生教研室前期的研究发现GC在体内和体外可以明显促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和转移,并且GC可以上调卵巢癌细胞中MUC1及ROCK2的表达。本课题在此基础上进一步探讨GC是否能影响卵巢癌细胞中HIF-1α信号通路进而促进卵巢癌细胞的迁移,并且探讨其可能的机制,主要观察了MUC1和ROCK2与GC增加HIF-1α蛋白进而促进卵巢癌细胞迁移中的作用的关系。
  研究方法:
  我们在细胞水平进行实验,以卵巢癌细胞系HO-8910、SKOV3为研究对象,实验过程中用含10%去激素血清的1640培养基培养细胞,去除血清中的激素对细胞的影响,用100nM DEX对细胞处理不同的时间。用Western Blot的方法检测HIF-1α蛋白的表达水平。siRNA干扰实验分别对HIF-1α、MUC1的表达进行干扰,继而使用Western Blot的方法验证MUC1、ROCK2及HIF-1α的表达。利用Transwell小室检测卵巢癌细胞的垂直迁移能力。
  研究结果:
  1.DEX可以明显上调卵巢癌细胞中HIF-1α蛋白的表达,干扰HIF-1α的表达明显阻断DEX促卵巢癌细胞迁移的作用。
  2.DEX能上调卵巢癌细胞中MUC1的表达,干扰MUC1的表达不仅可以明显阻断DEX促卵巢癌细胞迁移的作用,也能明显阻断DEX上调HIF-1α的作用;反之干扰HIF-1α却不影响DEX诱导MUC1表达的作用。
  3.干扰HIF-1α并不影响DEX上调ROCK2的表达。
  研究结论:
  DEX能明显增加卵巢癌细胞中HIF-1α蛋白的表达水平,该作用与Dex上调MUC1的表达密切相关。DEX上调MUC1进而增加HIF-1α在DEX促进卵巢癌细胞迁移中具有重要作用。
[硕士论文] 缪雄
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:利用骨形态发生蛋白2(Bone Morphogenetic Protein2,BMP-2)提高脊柱手术植骨融合率及对缺损骨组织进行修复是近年来骨科领域研究的重点和热点,但其应用后出现的一系列副作用也越来越被研究者们所关注。BMP-2临床使用过程中发生的骨溶解现象是目前学者们最为关注、最棘手的副作用之一,一直没有更好的解决办法。研究认为骨溶解的发生可能与BMP-2促进破骨细胞的活化有关,但具体的途径和机制尚未完全明确。
  方法:在本课题中,首先我们通过构建能过表达BMP-2的慢病毒,将其注射进入C57小鼠胫骨髓腔,使其在胫骨内表达BMP-2,使用mircoCT观察BMP-2对骨骼组织的影响。其次我们建立了BMP-2诱导异位成骨的模型,观察异位骨组织中的骨吸收情况。在体外实验中,从4-6周龄C57小鼠的股骨和胫骨中分离出骨髓来源巨噬细胞(Bone Marrow-derived Macrophages,BMMs)进行培养,用M-CSF使其增殖,用RANKL和M-CSF共同诱导其分化为成熟的破骨细胞,建立稳定的诱导破骨细胞分化的体系。在使用M-CSF和RANKL诱导BMMs分化为破骨细胞的同时,加入不同浓度的BMP-2(0ng/ml、30ng/ml、60ng/ml、90ng/ml),采用TRAP染色观察破骨细胞分化成熟情况;采用扫描电镜观察不同浓度的BMP-2刺激的破骨细胞在骨片表面的骨吸收功能;采用实时定量PCR检测与破骨细胞分化相关的标志基因表达,采用Western blot分析BMP/Smad1和NF-κB信号通路相关蛋白的翻译情况;最后采用BMP受体抑制剂、shRNA沉默基因和免疫共沉淀等方法探索BMP受体在BMP-2调节破骨细胞分化中的作用。
  结果:通过研究我们发现在体内BMP-2能诱导小鼠胫骨出现显著的骨吸收现象,使得骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度明显下降;BMP-2在诱导异位成骨的同时也激活了破骨细胞,导致骨吸收的发生。在体外,BMP-2能促进并加速RANKL诱导的破骨细胞分化,增强破骨细胞骨吸收功能。BMP-2通过激活Smad信号通路,使磷酸化Smad1增多,协同促进IκBα的降解,释放NF-κB,随后加速p65磷酸化并进入细胞核内,调节破骨细胞分化。同时BMP受体,特别是BMP2型受体在协同RANK进一步促进破骨细胞活化,增强骨吸收功能方面也起到非常重要的作用。
  结论:我们的研究结果初步明确了BMP-2导致骨溶解的分子生物学机制,为临床上合理使用BMP-2、减少骨溶解的发生并最终解决骨溶解问题提供了重要的理论依据。
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