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[硕士论文] 董伟
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1.以新上市的抗肿瘤药物奥拉帕尼为先导化合物,设计、合成新的(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物,并评价其抑制PARP-1酶的活性及其对肿瘤细胞抗增殖能力的影响,以期获得的具有PARP-1抑制活性的新型靶向抗肿瘤化合物。鉴于PARP-1也可能是治疗AD的新型靶点,本研究同时也检测了目标化合物对AChE和BuChE的酶抑制活性,以评价其作为抗AD的多靶点配体的潜力。
  2.以Pubchem数据库中现有的PARP-1抑制剂为筛选对象,通过计算机辅助药物设计技术,筛选出具有AChE抑制活性的小分子化合物,并进行分子动态模拟,以期获得具有PARP-1和AChE双靶点抑制的抗AD化合物,为新型抗AD药物研究提供基础。
  方法:
  1.目标化合物的设计和合成:保留奥拉帕尼的主要药效团,对分子尾部的环丙基进行改造。选取分子长度适宜且尾部链自由度较小的共轭结构—取代芳香基丙烯酰基结构,对环丙基进行结构替换,设计和合成16个奥拉帕尼类似物。其合成方法为:以2-甲酰基苯甲酸为原料,经环合、氧化、还原等反应,合成重要中间体2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酸;以取代的芳香甲醛为原料,与丙二酸发生Knoevenagel反应,得到取代芳香基丙烯酸,与1-叔丁氧羰基哌嗪发生酰胺反应,脱去保护基团叔丁氧羰基后,与2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酸发生酰胺化反应,得到目标产物。
  2.目标化合物生物活性评价:(1)采用HT同源PARP荧光法抑制试剂盒(Trevigen,Cat#4690-096-K)检测所合成的目标化合物对PARP-1酶的抑制活性,然后采用MTT法测定目标化合物对人结肠癌SW-620和人乳腺癌MDA-MB-436细胞增殖能力的影响;(2)采用Ellman法评价目标化合物对AChE和BuChE的抑制能力。
  3.虚拟筛选:使用AutoDock Vina软件对具有PARP-1抑制活性的859个化合物进行虚拟筛选,寻找具有AChE抑制活性的潜力分子。使用GROMACS软件对目标分子进行动力学模拟,探究其分子识别机制和动态结合模式。
  结果:
  1.本研究设计、合成了16个(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物,其结构通过1H-NMR、13C-NMR、IR和质谱进行了确证。
  2.(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物生物活性的评价:PARP-1酶活性的测试结果显示,化合物44d、44e、44n对PARP-1酶具有较强的抑制活性(IC50分别为41.50±2.65、37.90±1.89和16.10±1.25nM,阳性对照药奥拉帕尼的IC50为8.20±1.06nM);MTT测试结果显示,化合物44d、44e、44n对具有BRCA基因缺陷的人乳腺癌MDA-MB-436细胞有较强的抑制增殖活性(IC50分别为10.25±2.20、13.95±1.28和11.62±2.15μM,阳性对照药奥拉帕尼的IC50为8.63±1.25μM),而对人结肠癌SW-620细胞无明显的抑制作用,提示化合物44d、44e、44n对PARP-1可能有较好的选择性和靶向性,特别是化合物44n值得进一步研究;采用Ellman法评价了目标化合物对AChE和BuChE的抑制作用。结果表明,化合物44d、44e、44n对AChE酶的IC50分别为27.44±0.46、12.24±0.49和24.55±1.10μM(阳性对照药甲基硫酸新斯的明的IC50为0.04±0.01μM),对BuChE酶的IC50分别为13.17±0.23、5.93±0.19和9.16±0.91μM(阳性对照药甲基硫酸新斯的明的IC50为12.01±4.05μM)。化合物44d、44e、44n对BuChE显示了较好抑制活性,而对AChE抑制作用稍弱。
  3.使用AutoDock Vina软件虚拟筛选出10个目标化合物,其中8个化合物都具有吡咯并咔唑母核结构,该结构可能在AChE活性位点外周阴离子结合位点的分子识别中具有重要作用。CID71605390和CID57390505在与AChE的对接和分子动态模拟中显示出较高亲和力和稳定性。
  结论及创新点:
  1.本研究以奥拉帕尼为先导化合物,合成并确证了16个未见报道的(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物。其中化合物44d、44e、44n对PARP-1酶具有较强的抑制活性,且对具有BRCA基因缺陷的人乳腺癌MDA-MB-436细胞具有较强的抗增殖活性,提示化合物44d、44e、44n对PARP-1具有较好的选择性和靶向性,特别是化合物44n值得进一步研究。其中化合物44d、44e、44n还对BuChE显示了较好抑制活性。
  2.通过对Pubchem数据库中的PARP-1抑制剂进行虚拟筛选,初步筛选出具有较强AChE和PARP-1双靶点抑制作用的10个化合物,发现吡咯并咔唑母核结构可能在AChE活性位点外周阴离子结合位点的分子识别中具有较重要作用,并对目标化合物进行进一步的分子对接和分子动态模拟,优选出化合物CID71605390和CID57390505,为寻找用于治疗阿尔茨海默病的新型AChE和PARP-1双靶点抑制剂提供了新的思路。
[博士论文] 蔡瞻
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:真菌耐药的情况日益严重,尤其是念珠菌属,对各类抗真菌药物均出现不同程度的耐药性,如唑类药物、多烯类药物和棘白菌素类药物。而且其耐药机制错综复杂。侵袭性真菌感染在全球的发病率急剧上升,日益严重的真菌耐药性被公认为导致免疫缺陷病人侵袭性真菌感染的发病率和死亡率逐年升高的主要原因之一。其严重威胁到广大人民群众的健康安全,为建设健康中国,如何解决真菌耐药问题,研究出新型抗耐药真菌药物成为当务之急,同时有必要深入探索机会性真菌的耐药机制,为开发抗真菌新药提供新的靶点。
  小檗碱、连翘酯苷A和黄芩素等天然产物已被发现可以作为抗耐药白念珠的增效剂。国内外也有报道钙调磷酸酶抑制剂、5α-还原酶抑制剂和热休克蛋白90抑制剂等也可协同唑类药物抗耐药真菌。虽然已有大量不同种类的化合物已被发现和报道具有协同抗真菌药物抗耐药真菌的活性,然而目前为止鲜有药物作为抗耐药真菌的增效剂上市,甚至于进入临床研究的都是寥寥无几。大量目前已报到的增效剂具有协同抗耐药真菌的活性MIC值一般在1.0μg/ml,而小于0.1μg/ml的增效剂是不常见的。增效剂活性不够好,可能为其原因一。至今为止,如小檗碱、连翘酯苷A和黄芩素等天然产物没有形成其作用机制清晰的结论,更没有发现关键的生物大分子,可能为其原因二
  在之前的研究中发现小檗碱具有协同FLC抗耐药真菌的作用,并对其进行改造获得几类结构更为简化,活性与小檗碱相当或略优于小檗碱的化合物。在这个研究基础上,挑选出本课题组已发现的活性最优的两个小分子作为先导化合物1-1和先导化合物1-2。并对其进行全面的结构改造,分别对其左侧的胡椒基,中间的酰胺键,右侧的芳环和柔链进行结构优化。通过体外活性筛选实验,采用微量稀释法和棋盘式微量稀释法获得化合物的活性数据。数据结果显示,具有协同抗耐药白念珠菌活性的的化合物有99个。与8.0μg/ml氟康唑合用时,MIC80小于0.1μg/ml的化合物有10个分别为化合物F2,F6,F8,F13,F14,F21,G8,G9,G10和G15,其中化合物F2、F6和F8采用棋盘式微量稀释法进一步证实其活性数据的可靠性。这类化合物的构效关系表明,其中先导化合物1-1中的胡椒基是其发挥生物活性的重要部分,酰胺键也是必不可少的部分,将酰胺键转变为逆酰胺键可以略微提高其生物活性,将苯环替换成对位联苯结构可以进一步提高其生物活性,将联苯结构中的一个苯环替换成噻吩环,可以保持与联苯类化合物相当的活性,另外当柔链长度为5-6个碳为最佳。
  由此,选择活性最优的化合物F6(CZ-66)对其进行抗耐药白念珠菌机制研究,对耐药菌103的ROS实验中,FLC、F5(CZ-65)单用不能引起ROS升高,F5(CZ-65)与FLC联用ROS升高约3倍,F6(CZ-66)单用ROS升高约10倍,F6(CZ-66)与FLC联用ROS升高约26倍。结果表明化合物F6(CZ-66)单用和联用FLC都能显著提高ROS水平,然而结构与其相似的化合物F5(CZ-65)单用时并未能提高ROS水平。对耐药菌103的罗丹明外排实验中,加入葡萄糖(2mM)后,罗丹明6G外排增强,且随着时间延长而增长。各用药组罗丹明6G外排与对照组无明显差异,说明化合物F5(CZ-65)、F6(CZ-66)、FLC及联用药对耐药菌103荧光蛋白外排无影响。CT-LINK反向分子对接找靶,通过PDB数据库检索,经分析CT-LINK中获取的可能靶点,只有Mitogen-activated protein kinase,NADH-ubiquinone oxidoreductase chain1和Mothers against decapentaplegic homolog3在真菌中是有报道存在的。结合已报道的相关参考文献,本文推测F6(CZ-66)可能作用于ROS-MAPK通路。另外本课题挑选了靶点相对明确的HSP90抑制剂BIIB021作为先导化合物2-1。对其嘌呤环上的2位、6位和9位分别进行结构改造,当保留先导化合物9位取代基,在2位和6位上进行简单改造,2位和6位分别以氯或者氨基做为取代基时,对化合物的活性影响并不大。如化合物H1-H3的MIC80均为4.0-8.0μg/ml之间。当9位的芳香环替换为脂肪环时,活性略有提升,其中以六元脂肪环为最优。当2位上引入芳环后,活性消失。因此,2位保留氟或氨基这类小原子团结构是保留化合物活性所必要的。化合物H12和H19是由先导化合物2-1改造获得的活性最优的两个化合物,虽然它们的活性并未超越由先导化合物1-1和1-2改造获得的化合物F6,但其活性与小檗碱相当,FICI优于小檗碱。作为一类靶点比较明确的分子,值得进一步结构改造和优化。
[硕士论文] 夏清明
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:前列腺癌是目前西方发达国家中男性肿瘤发病率和死亡率最常见的肿瘤之一。近年来我国前列腺癌发病率也在逐年攀升。雄激素剥夺治疗一直以来是前列腺癌最经典的治疗方式,但随着治疗的前行,前列癌晚期几乎都会发展为雄激素非依赖性,传统的治疗方式对雄激素非依赖性前列腺癌疗效不佳。肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤的一种新型治疗手段,在肿瘤临床治疗上已取得了较好的疗效。本课题选用含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的脱氧核寡核苷酸(Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs,CpG ODN)免疫激活剂,通过穿膜肽修饰的多壁碳纳米管为介导,研究其抗雄激素非依赖性前列腺癌的体内外作用。
  本课题第一部分报道了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体的构建和表征。通过多肽固相合成法合成含有3个组氨酸和6个精氨酸的多肽H3R6,利用制备液相进行纯化以及高效液相色谱和质谱进行纯度分析,检测其纯度符合实验要求。用浓硫酸和浓硝酸对多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)进行羧基化,然后再和多肽反应形成载体MHR。利用核磁共振氢谱,红外光谱、透射电镜和热比重分析鉴定复合物合成成功。利用MHR载体中精氨酸富含正电荷,CpG是核酸类物质带负电荷,通过静电作用形MHR/CpG纳米复合物。在N/P=6时,MHR载体能够有效负载CpG免疫激活剂,当N/P=20时电位处于一个较稳定的状态,电位约=25±2.62mV。通过HEK293转染实验,得出MHR载体在N/P=20转染效率较高。
  本课题第二部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂进行体外细胞学评价,RAW264.7细胞明显对负载CpG纳米免疫制有较高的摄取,CpG能够和胞内内吞体膜上的TLR9受体结合。CCK8细胞毒性实验中,MHR载体对DU145、RM-1和RAW264.7细胞的毒性较低。体外免疫活性ELISA和PCR实验结果显示,MHR/CpG对RAW264.7细胞刺激促进IL-6和TNF-α促炎因子的分泌明显高于单体CpG组,和LPS(10ng/ml)刺激效应具有可比性。
  本课题第三部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂体内的抗前列腺癌效应和免疫活性。我们成功构建了DU145前列腺癌BALB/c裸鼠和RM-1前列腺癌BALB/c小鼠模型,通过小动物活体成像系统观察结果显示,MHR/CpG可以有效的在肿瘤和肿瘤引流淋巴结部位蓄积,有靶向效果。体内药效结果表明MHR/CpG对前列腺癌的增殖有较强的抑制作用,从小鼠脾脏淋巴细胞流式分析看出MHR/CpG可以在体内有效刺激CD4和CD8T细胞的分化增殖。同时从小鼠的肾脏和肺肺脏的HE染色图看出,MHR/CpG的体内用药安全性较高。
  本课题成功构建了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体,为去势抵抗性前列腺癌治疗提供了新策略,同时也为其它肿瘤的治疗提供了好的参考和借鉴。
[硕士论文] 王卫平
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  临床上mTOR抑制剂应用于多种肿瘤的治疗,以依维莫司在转移性肾癌治疗中的应用较为广泛。但实际应用中疗效个体差异较大,耐药现象较为常见,大大限制了其疗效。在mTOR抑制剂耐药机制中,肿瘤的遗传学改变与之关系密切。现有相关研究多局限于从有限差异疗效病例中寻找耐药相关基因靶点,尚缺乏从全基因组水平评估基因的功能改变与mTOR抑制剂药敏之间相关性。而CRISPR/Cas9技术的发展应用为研究基因功能提供了巨大的便捷。将采用CRISPR/Cas9文库筛选的方法,从全基因组水平筛选mTOR抑制剂耐药相关靶点,并进行靶点功能验证及临床相关性分析,以期为逆转mTOR抑制剂耐药提供新的理论和依据。
  方法:
  1、通过质粒文库扩增、病毒文库制备、筛选条件摸索、耐药筛选等过程建立肾癌依维莫司耐药靶点CRISPR/Cas9筛选模型,并进行高通量测序。
  2、利用MAGeCK等一系列生物信息学方法,进行测序数据的质控和分析,结合体外耐药细胞株转录组测序分析,筛选若干潜在耐药靶点;
  3、利用CRISPR敲除、质粒转染方法,结合药敏实验、平板克隆和凋亡实验等,对靶点进行进一步的功能验证;
  4、利用实时定量PCR的方法,在接受依维莫司治疗的肾癌组织标本中验证耐药靶点表达水平与临床疗效的相关性;
  5、利用组织芯片的方法,结合临床数据库数据,分析新型靶点在评价肾癌预后中的临床价值。
  结果:
  通过CRISPR/Cas9耐药基因筛选、生信分析、临床疗效相关性分析以及药敏功能验证,发现,靶向敲除MAGIX后能够介导肾癌依维莫司耐药,而过表达则能逆转该过程。较正常肾癌细胞肾,在同样浓度依维莫司作用下,靶向敲除MAGIX后,细胞克隆形成能力明显增强,而凋亡细胞比例明显减少。同时,组织芯片分析和TCGA数据库分析发现,在肾癌患者整体人群中,MAGIX表达水平越低提示患者预后越差。
  结论:
  MAGIX的差异表达水平与肾癌依维莫司治疗药物反应性相关,可作为指导肾癌依维莫司个体化治疗的生物标记物。在临床病理标本中发现,MAGIX在依维莫司耐药组中表达水平低于敏感组。此外,MAGIX的低表达提示肾癌患者预后差,具有预测肾癌预后的潜在临床价值,相关作用机制尚需进一步探讨明确。
[博士论文] 吕权真
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近几年,随着临床上癌症治疗、器官移植中免疫抑制剂的使用以及艾滋病等疾病导致的免疫受损患者的增多,真菌感染的发病率也在不断攀升。院内血源性感染中真菌感染已经上升至第4位。即便在现有的抗真菌药物治疗下,系统性真菌感染导致的死亡率仍高达40%-70%。现有的抗真菌治疗手段有限,而唑类药物作为常用抗真菌药物出现了严重的耐药现象。在经过唑类药物长期治疗的患者中,分离的白念珠菌对唑类药物的耐药率高达40%。因此,阐明唑类药物的耐药机制,寻找新的抗真菌治疗的手段是临床抗真菌感染急需解决的问题。
  白念珠菌对于唑类药物的耐药机制研究已经取得了一些进展,主要是关于唑类合成通路以及外排泵相关基因的突变和高表达导致的耐药问题。阐明白念珠菌对于靶向于麦角甾醇合成的唑类药物的耐药机制,解决唑类耐药问题,需要彻底阐明白念珠菌麦角甾醇合成通路的调控网络。已有的研究表明,白念珠菌甾醇合成通路主要通过转录因子Upc2p调控相关甾醇合成酶的表达。但在酿酒酵母中,甾醇合成的调控不仅局限于转录水平还包括翻译后调控等方式,但这种翻译后调控的方式在白念珠菌中很少有文献报道,仍需要进一步研究。本文选取了与酿酒酵母中调控羟甲基戊二酰乙酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶稳定性的NSG2同源基因ORF19.273基因作为研究对象,研究其对于甾醇合成通路和唑类药物敏感性的影响。首先,通过HIS1-ARG4-LEU2营养筛选策略和融合PCR的方法构建了白念珠菌ORF19.273(NSG2)敲除菌和回复菌。初步考察ORF19.273缺失菌的表型发现,ORF19.273基因对于白念珠菌增殖速率、菌丝和被膜形成并无影响。而通过药物敏感性考察,发现ORF19.273敲除菌对于唑类药物敏感性升高,但对于唑类药物上游的抗真菌药物洛伐他汀、特比萘酚以及下游的抗真菌药物丁苯吗啉敏感性没有差异,对于两性霉素B耐受。对于洛伐他汀药物敏感性无差异提示ORF19.273和酿酒酵母中NSG2基因功能并不完全一致。透射电镜分析结果显示ORF19.273缺失菌细胞膜会出现轻微缺损,而在氟康唑作用下,ORF19.273缺失菌细胞膜损伤更为严重。除此之外,ORF19.273缺失后细胞膜通透性发生变化,对于不能透过细胞膜的碘化丙啶(PI)通透性增加,说明ORF19.273基因缺失后,白念珠菌细胞膜结构和功能均出现损伤。在白念珠菌中,麦角甾醇合成是影响唑类药物敏感性和细胞膜完整性的重要物质。通过气质联用(GC-MS)分析亲本菌和ORF19.273缺失菌以及回复菌中甾醇的百分比发现,ORF19.273敲除后,含有14α-甲基的甾醇obtusifoliol和14α-methylfecosterol在胞内累积,在氟康唑作用后,亲本菌中累积的主要是lanosterol,而ORF19.273缺失菌中累积的主要是含有14α-methylfecosterol、obtusifoliol、eburicol,这说明ORF19.273基因可以调控白念珠菌中各类甾醇的平衡,而在文献报道中,白念珠菌甾醇分布平衡是维持其对于唑类药物耐受的重要机制。因此,认为ORF19.273主要通过降低细胞内含有14α-甲基甾醇的比例维持白念珠菌对于唑类药物的耐受。体内结果与体外研究一致,在小鼠系统性白念珠菌感染模型中,ORF19.273基因缺失菌感染组在氟康唑治疗后,小鼠肾脏荷菌量和死亡率明显低于亲本菌感染组。本部分研究证实ORF19.273基因通过调控obtusifoliol和14α-methylfecosterol的水平,维持白念珠菌细胞膜完整性和白念珠菌对于唑类药物的耐受。
  除了化学药物治疗外,免疫治疗真菌感染领域也研究较为广泛。白念珠菌作为机会性致病真菌,其致病性与机体免疫系统的状态有着密切关系。近几年,文献已经报道了多种有效的抗真菌感染的单克隆抗体、减毒活疫苗以及重组蛋白疫苗,但关于疫苗的作用机制研究还相对较少。通过研究不同疫苗的作用机制和免疫系统清除真菌的关键环节可以为开发新的抗真菌治疗手段提供思路。本研究中发现白念珠菌转录因子FLO8缺失菌作为基因改造的白念珠菌弱毒株可以激活野生型小鼠的免疫保护作用。尾静脉注射flo8△活菌预免后,小鼠对于侵袭性白念珠菌感染、金黄色葡萄球菌感染以及肺部的烟曲霉菌感染和铜绿假单胞菌感染均能产生较好的免疫保护效果。通过长期预免策略,发现flo8△活菌可以刺激机体产生高水平的与白念珠菌结合的抗体,flo8△活菌预免的血清可以增强巨噬细胞对于白念珠菌的调理杀伤能力。在短期预免保护策略中发现flo8△活菌的保护作用不仅仅依赖于抗体,更依赖于其刺激产生的抗炎因子IL-10,IL-10可以降低正常毒力菌株SC5314二次感染时造成的急性炎症损伤,减少单核细胞和中性粒细胞的募集。同时IL-10可以保护胸腺在白念珠菌感染过程中不发生萎缩,通过上调抗凋亡基因BCL-2和BCL-XL的表达抵御白念珠菌感染引起的CD4+CD8+细胞凋亡。通过分析FLO8基因缺失菌细胞壁成分的变化,发现FLO8基因缺失菌表面的甘露聚糖,尤其是血清诱导后的甘露聚糖刺激巨噬细胞产生IL-10的水平升高。小鼠腹腔注射FLO8缺失菌甘露聚糖后,二次感染SC5314时,小鼠肾脏荷菌量降低,生存率升高,这说明FLO8表面的甘露聚糖是FLO8基因缺失菌诱导免疫保护效应的基础。在体外刺激巨噬细胞时,还发现FLO8缺失菌经过血清诱导后,可以特异性刺激巨噬细胞产生NO。标准菌株SC5314则需要在Pam3CSK4协同下刺激巨噬细胞产生NO,说明FLO8缺失后白念珠菌表面刺激NO产生的抗原增多,后来经过分离提取确定是白念珠菌氯仿甲醇提取物中的正丁醇部分能够刺激巨噬细胞产生NO。但体内研究发现,NO并不参与FLO8基因缺失菌诱导的免疫保护效应。综上所述,FLO8基因缺失菌主要通过表面的甘露聚糖刺激CARD9介导的IL-10的生成保护二次感染后小鼠的胸腺并提高小鼠的生存率。这种免疫保护机制可以为后续疫苗的开发以及抗真菌治疗提供新的理论指导。
[硕士论文] 苏东安
精神病与精神卫生学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:抑郁症是一种常见的情感障碍,主要临床表现为情绪低落、兴趣减低,甚至可出现极端消极观念和自杀行为,致残及致死率非常高,预计到2020年,抑郁症将成为全球第二大常见疾病[1];先前研究发现抑郁症的发病机制可能与相应脑区神经营养因子水平下调及促炎性因子的异常激活有关[2-4]。大量研究指出氯胺酮作为一类临床常用的全身麻醉药,其可发挥快速起效的抗抑郁作用,且对伴有自杀倾向的难治性抑郁患者亦有改善作用[5,6],本研究旨在通过构建抑郁动物模型和临床实验进一步证实氯胺酮对抑郁症的治疗作用,并试图阐明氯胺酮抗抑郁机制,从而为临床治疗抑郁症提供理论基础。
  一、氯胺酮对抑郁大鼠白介素-1β和白介素-6表达的影响
  目的:观察氯胺酮对抑郁大鼠前额皮层及海马区组织内白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)表达的变化。
  方法:Wistar大鼠雄性20只,2月龄,体重180~220g。按随机方式分为2组(n=10),分别给予生理盐水(对照组,C组)、给予氯胺酮药物治疗组为K组。应用行强迫游泳实验15min的方法建立大鼠抑郁模型,建模后第2天腹腔注射氯胺酮10mg/kg或等体积生理盐水。注射30min后再次进行强迫游泳试验5min,记录大鼠不动时间。然后立即处死大鼠,剥前额皮层及海马组织测定IL-1β和IL-6的表达。
  结果:与对照组相比,氯胺酮干预后大鼠强迫游泳不动时间明显减少(p<0.01),大鼠前额皮层及海马区的IL-1β和IL-6表达均明显下调(p<0.05)。
  结论:氯胺酮的抗抑郁作用可能与前额皮层及海马IL-1β和IL-6的表达下调有关。
  二、氯胺酮对抑郁症患者血清脑源性神经营养因子及5-羟色胺水平的影响
  目的:探索单次小剂量静脉注射氯胺酮对抑郁症患者血清脑源性神经营养因子(BDNF)及5-羟色胺(5-HT)水平的影响。
  方法:39名抑郁症患者随机分为两组:对照组(n=20),氯胺酮组(n=19)。氯胺酮组静脉持续推注0.5mg/kg盐酸氯胺酮溶液50ml,推注时间40min,对照组推注等容量生理盐水50ml。在治疗前及治疗后第1、3、7天完成汉密尔顿(HAMD)量表评分及测定外周静脉血BDNF及5-HT的含量。
  结果:与对照组相比,氯胺酮组患者在干预后第1、3、7天HAMD评分均明显降低(p<0.05),治疗后第1天BDNF水平明显上升(p<0.01),尽管第3天有所回落但仍显著高于对照组(p<0.05),第7天无明显差异(p>0.05),5-HT水平各时间节点与对照组无明显差异(p>0.05)。
  结论:氯胺酮的抗抑郁作用可能与上调血清BDNF的表达有关,与5-HT的关系尚需进一步研究证实。
[硕士论文] 余史丹
药物分析学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:新型抗艾滋病复方药物(富马酸替诺福韦酯200mg+拉米夫定300mg+依非韦伦400mg,q.d.)是由加利福尼亚大学洛杉矶分校(UCLA)何志明院士课题组采用反馈系统控制(FSC)技术按照不同药物组合和剂量进行测试筛选优化得到的低毒高效的抗艾滋病复方药物。本课题建立高灵敏度、高特异性的LC-MS/MS方法对新型抗艾滋病复方药物进行了临床前药代动力学研究,了解其在动物体内吸收、分布、代谢及排泄等药动学及其相互作用过程,为新药的申报和进一步临床试验研究提供试验资料和参考依据。
  一、生物样品中替诺福韦、拉米夫定及依非韦伦定量分析方法的建立与确证
  本文建立了快速、灵敏、可靠的LC-MS/MS方法测定不同生物样品中替诺福韦(TEF)、拉米夫定(3TC)及依非韦伦(EFV)的浓度。选用阿昔洛韦(ACV)、双氢氯噻嗪(HCT)及恩曲他滨(FTC)作内标,样品采用蛋白沉淀法处理,色谱柱选用AgilentZORBAX SB-Aq(4.6×150mm,5μm)和Ultimate XB-C18(4.6×50mm,5μm);流动相为甲醇-水(25mM醋酸铵+0.1%甲酸)和乙腈-水(0.1%甲酸);梯度洗脱,流速为1mL/min,3∶7分流。采用ESI离子源,MRM检测模式,正离子扫描模式下,用于定量的离子通道分别为m/z288.3→176.4(TEF)、m/z230.3→111.9(3TC)、m/z316.0→244.0(EFV)、m/z226.1→152.2(ACV,IS)、m/z247.8→129.9/101.1(FTC,IS);负离子扫描模式下,用于定量的离子通道分别为m/z314.0→243.9(EFV)、m/z296.0→204.8(HCT,IS);不同生物样品中TEF、3TC及EFV定量分析方法学验证结果均符合FDA、CFDA等颁布的生物样品定量分析相关指导原则且成功应用于新型抗艾滋复方药物的临床前药代动力学研究。
  二、新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内药代动力学相互作用研究
  采用自身对照、随机交叉试验方法对新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内的药代动力学相互作用进行评价。通过比较Beagle犬单剂量口服给药抗艾滋病单一组分和复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药时曲线及相应药动学参数,发现不同Beagle犬个体间差异较大,而TEF、3TC及EFV的主要药代动力学参数均不存在显著性差异(P>0.05),即不存在药物相互作用。提示TEF、3TC与EFV不存在相互作用,是否与Beagle犬个体差异大而掩盖了药物相互作用相关有待进一步的考察研究。
  三、新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内药代动力学研究
  采用LC-MS/MS法对新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内的药代动力学过程进行考察。对Beagle犬单剂量口服给药低、中、高三个剂量组抗艾滋病复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药动学参数Cmax、AUC0-τ与相对应的给药剂量进行线性回归,得TEF的相关系数为R2=0.4214(Cmax)和R2=0.6849(AUC0-τ),3TC的相关系数为R2=0.7889(Cmax)和R2=0.8286(AUC0-τ),提示TEF和3TC的药动学参数AUC0-τ与给药剂量基本呈正相关,而EFV的相关系数仅为R2=0.2289(Cmax)和R2=0.3047(AUC0-τ)。Beagle犬多剂量给药复方药物第四天后,体内TEF、3TC及EFV的血药浓度基本上达到稳态。单剂量和多剂量口服给药抗艾滋病复方药物后TEF、3TC及EFV的平均药时曲线AUC累积比分别为1.89、0.95和1.17。以药物生物等效性的接受标准为参比(上限界定为1.25),提示连续给药7天后TEF在Beagle犬体内有蓄积,3TC及EFV无蓄积。
  四、新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内药代动力学研究
  采用LC-MS/MS法对新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内的药代动力学及相互作用进行考察。对SD大鼠单剂量口服给药低、中、高三个剂量组抗艾滋病复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药动学参数Cmax、AUC0-τ与相应给药剂量进行线性回归,得TEF相关系数为R2=0.3035(Cmax)和R2=0.7803(AUC0-τ),3TC相关系数为R2=0.6134(Cmax)和R2=0.8646(AUC0-τ),EFV相关系数为R2=0.6886(Cmax)和R2=0.5314(AUC0-τ),提示TEF、3TC及EFV的药动学参数AUC0-τ与给药剂量基本呈正相关。比较SD大鼠单剂量口服给药抗艾滋病复方药物各单一组分和复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药时曲线及相应药动学参数,发现TEF及3TC各参数无显著性差异(P>0.05);EFV的药动学参数Cmax、MRT存在显著性差异(P<0.05)。提示SD大鼠口服给药抗艾滋病复方药物后对TEF、3TC体内药代动力学无显著影响,对EFV在体内的吸收、消除过程有一定的影响,即可能存在药物间相互作用。
  五、新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内组织分布及排泄研究
  采用LC-MS/MS法对新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内主要脏器组织中的分布状况及其排泄特征进行研究。从抗艾滋病复方药物在各组织中的分布结果中发现,富马酸替诺福韦酯(TDF)经胃肠道吸收后迅速代谢成TEF,在肾脏中分布最快、浓度最高,肝脏次之。TEF不易通过血脑屏障进入脑组织,在脑组织中分布较少。给药2h后,3TC在肾组织中迅速达峰且分布浓度最高,24h仍维持较高浓度的分布。3TC在血流灌注丰富的组织(心、肝、脾、肺)中也有较为广泛的分布且达到较高浓度水平,在脑组织中分布较少。EFV在各组织中的浓度分布顺序为肝>心、脾、肾、脑>肺。药物EFV经胃肠道吸收,原型药物在肝脏中分布最快、浓度最高,其易于通过血脑屏障,因此在脑组织中浓度较高。
  从排泄实验结果中可以看出,SD大鼠口服给药抗艾滋病复方药物后,TDF主要以代谢物TEF形式从尿液、粪便及胆汁中排泄,平均累积排泄率分别为12.50%、28.84%和0.285%;3TC在尿液、粪便和胆汁中的平均累积排泄率分别为21.37%、27.61%和1.293%,主要以原型形式排泄;EFV在SD大鼠体内存在广泛的代谢过程,以原型形式在尿液、粪便和胆汁中的平均累积排泄率分别为0.005%、5.86%和0.014%,总排泄率仅为5.879%,后期需进一步研究依非韦伦的体内代谢产物。
[硕士论文] 程丹
药剂学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:脂肪酸类化合物在哺乳动物体内有较为完整的吸收代谢途径,研究发现脂肪酸能作为生物前体物质或能量被细胞摄取,因此广泛用于前药的设计之中。文献报道的脂肪酸修饰的抗肿瘤药物多以二十二碳六烯酸(DHA)、α-亚麻酸(α-LNA)、共轭亚油酸(LA)为代表的不饱和脂肪酸,但是关于长链饱和脂肪酸抗肿瘤前药的研究较少。本研究以临床较为常用的抗肿瘤药物紫杉醇(Paclitaxel,PTX)为模型药物,选择两种长链饱和脂肪酸——棕榈酸(Palmitate acid,PA)和硬脂酸(Stearate acid,SA),以及两种不饱和脂肪酸——亚麻酸(Linolenate acid,LNA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)作为配体,合成了四种紫杉醇脂肪酸酯前药,将其制备成脂质体,并对其体内外性质进行研究,以期比较紫杉醇饱和与不饱和脂肪酸酯前药在抗肿瘤效果方面的差异,并筛选出一种低毒高效的紫杉醇前药制剂。
  本研究首先通过酯化法合成了紫杉醇饱和与不饱和脂肪酸酯,即PTX-PA、PTX-SA、PTX-LNA和PTX-DHA,产物经ESI-MS与1H NMR确证为目标化合物。处方前研究表明,各种化合物的脂溶性均有不同程度增加。
  采用薄膜分散-探头超声法制备紫杉醇棕榈酸酯脂质体(PTX-PA-L)、紫杉醇硬脂酸酯脂质体(PTX-SA-L)、紫杉醇亚麻酸酯脂质体(PTX-LNA-L)和紫杉醇二十二碳六烯酸酯脂质体(PTX-DHA-L)。对其制备工艺和处方成分进行单因素考察优化后,最终确定处方工艺如下:磷脂与药物比例为25∶1,磷脂与胆固醇比例为25∶1,DSPE-PEG2000用量为0.4%,;制备过程中的薄膜制备时间和探头超声时间分别为45℃和90s。对最终处方进行验证后发现,与PTX-LNA和PTX-DHA相比,PTX-PA和PTX-SA制备出的脂质体粒径更小,过膜较顺畅,包封率较高,在制剂制备中更有优势。
  体外血浆转化研究表明,四种前药脂质体均能在大鼠血浆中缓慢释放出活性药物紫杉醇。PTX-PA-L、PTX-SA-L、PTX-LNA-L和PTX-DHA-L在血浆中孵育30h的转化率分别为3.49%、6.74%、8.55%和10.26%。体外细胞毒性研究结果表明,血浆中较稳定,转化较慢的PTX-PA-L和PTX-SA-L药物细胞毒性较低,而血浆中活性药物释放较快的PTX-LNA-L和PTX-DHA-L毒性相对较高。
  在体外研究的基础上,进行了体内药动学和组织分布实验。考察了紫杉醇注射液、PTX-PA-L、PTX-SA-L、PTX-LNA-L和PTX-DHA-L的体内药动学特征。实验结果发现血浆中累积释放速度较慢,血浆清除率低的PTX-PA和PTX-SA代谢出的活性母药PTX平均滞留时间长,代谢出的PTX的药时曲线下面积和半衰期分别为紫杉醇注射液的2倍和5倍。清除速率较快的PTX-LNA和PTX-DHA代谢出的PTX药时曲线下面积较小,半衰期短,与紫杉醇注射液相比并不具备优势。组织分布研究表明,肿瘤组织中,PTX-PA-L代谢出的PTX的AUCTumor(56.08μg/g*h)显著高于PTX-LNA-L(28.82μg/g*h)。证明PTX-PA-L在肿瘤组织可以更多的转化为PTX,增加药物在肿瘤部位的蓄积。
  最后,采用小鼠S180肉瘤细胞模型,考察了紫杉醇注射液、PTX-PA-L和PTX-LNA-L的体内抗肿瘤效果和骨髓抑制毒性。结果显示,等摩尔剂量下,虽然两种前药脂质体抗肿瘤效果均优于紫杉醇注射液,但PTX-PA-L(紫杉醇饱和脂肪酸酯脂质体)的抑瘤作用约为PTX-LNA-L(紫杉醇不饱和脂肪酸酯脂质体)的1.23倍,说明PTX-PA-L能够更为显著的提高药物的体内抗肿瘤活性,进一步说明血浆中释放较慢,血浆清除速率慢,肿瘤部位PTX浓度高的药物,药效更好。血常规检测结果发现,PTX-PA-L与其他两给药组相比,与骨髓抑制毒性有关的白细胞和血小板水平明显较高,说明体外细胞毒性较小的PTX-PA-L对荷瘤小鼠的骨髓抑制毒性同样较小。
[硕士论文] 丁涛
内科学(肾病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:糖尿病肾病是终末期肾脏病的主要病因之一,是心血管疾病的独立危险因素,目前缺少积极有效的治疗手段。二氢槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)作为重要的二氢黄酮类化合物,具有显著的抗氧化、抗炎和抗纤维化生物活性,其对糖尿病肾病的作用尚无研究。
  目的:
  本研究目的在于通过体内外实验探讨二氢槲皮素对糖尿病肾病肾脏保护作用及机制。
  方法:
  利用高脂饮食/链脲佐菌素腹腔注射大鼠构建糖尿病肾病动物模型:采用ELISA法检测尿微量白蛋白和空腹血清胰岛素水平;运用生化试剂盒测定血清肌酐、血清葡萄糖、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平;肾脏组织切片进行苏木精-伊红和过碘酸希夫染色评价肾脏病理损害;利用免疫组化检测肾脏炎性因子IL-1β表达,从而探讨二氢槲皮素对糖尿病肾病大鼠的治疗作用。利用高浓度葡萄糖刺激大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1和人近端肾小管上皮细胞HK2构建糖尿病肾病细胞模型:采用MTT法测定细胞增殖;采用DCFH-DA法和激光共聚焦显微镜检测细胞内和线粒体活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成;利用免疫印迹法检测NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β、Fibronectin和CollagenⅣ等蛋白表达,从而研究二氢槲皮素对糖尿病肾病肾脏细胞的作用及机制。
  结果:
  1.高脂饮食/链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠表现24h尿微量白蛋白水平、血清肌酐、空腹血清葡萄糖、空腹血清胰岛素水平、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平明显升高,胰岛素敏感性指数明显降低,肾组织病理学损害明显,肾小球系膜细胞增生和系膜基质增多,肾小球IL-1β表达水平增加。给予高剂量的二氢槲皮素(100mg/kg/day)治疗12周后,糖尿病肾病大鼠的24h尿微量白蛋白水平降低,血清肌酐、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平明显下降,肾组织病理学损害减轻,肾小球系膜细胞增生和系膜基质扩张减轻,肾小球IL-1β表达水平较前降低,而胰岛素水平及胰岛素敏感性指数无明显变化。
  2.HBZY-1和HK2细胞经高浓度葡萄糖刺激后,细胞增殖明显,细胞内和线粒体ROS生成增多,NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β和肾纤维化相关细胞外基质蛋白Fibronectin和CollagenⅣ过表达。给予二氢槲皮素处理后,细胞增殖显著被抑制,ROS生成减弱,NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β、Fibronectin和CollagenⅣ等蛋白表达较前下调。
  结论:
  二氢槲皮素能够通过减轻尿微量白蛋白排泄、改善脂质代谢紊乱、减轻肾脏组织病理损害和肾脏炎性因子分泌等发挥肾脏保护作用,其可能的机制是抑制细胞增殖、降低ROS的生成、抑制NLRP3炎性小体的激活和抑制肾脏纤维化。
[硕士论文] 傅维佳
内科学(传染病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:随着HBsAg定量检测技术的发展,临床研究发现HBsAg定量水平在抗病毒治疗过程中有重要的意义。但是HBsAg不仅来源于Dane颗粒(含有完整病毒核酸的感染颗粒),还有更多来源于管状或球形颗粒(非感染性的病毒空壳),所以HBsAg水平与抗病毒治疗并不完全平行,且目前缺乏大样本的临床研究,尚未形成标准化的评价体系。本研究旨在通过回顾性研究,观察核苷(酸)类药物长期治疗的CHB患者其基线HBsAg、HBeAg及HBVDNA定量水平及治疗过程中的动态变化,分析这些指标在CHB患者治疗过程中的临床意义。
  方法:回顾分析从2012年1月至2016年12月期间在第二军医大学附属长海医院感染科就诊及随访的4000例初治慢性乙肝患者,收集相关的临床病例资料,分析指标包括HBsAg、HBeAg、HBVDNA、年龄、性别,共筛选出其中资料齐全的940例样本进行分析。
  结果:1.HBeAg阳性CHB患者(439例)年龄小于HBeAg阴性组(501例),基线HBsAg,HBVDNA定量水平大于HBeAg阴性组。2.HBeAg阳性组中,基线HBsAg与HBeAg,HBVDNA呈正相关,基线HBeAg与HBVDNA呈较弱的正相关。3.HBeAg阴性组中,基线HBsAg与年龄成显著的负相关,与HBVDNA不相关。4.HBeAg阳性组中,经过长期抗病毒治疗,HBsAg,HBeAg,HBVDNA定量水平均有明显下降。治疗初始6个月HBsAg定量水平下降速率越高,基线HBsAg,HBeAg定量水平越低时越有可能达到SR。经过4年抗病毒治疗,达到SR者138例,其中ETV组35,LDT组75,LDT+ADV组11,ETV+ADV组9,LAM+ADV组8例。5.HBeAg阴性组中,经过4年抗病毒治疗,全部达到VR,HBsAg,HBVDNA定量水平均有明显下降。没有发现对疗效有预测价值的因素。
  结论:HBeAg阳性CHB患者,抗病毒治疗初始6个月HBsAg定量水平下降速率越高,基线HBsAg,HBeAg定量水平越低时越有可能达到血清学应答。HBeAg阴性组中,没有发现对应答有预测价值的因素。
[硕士论文] 杨启维
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:临床上许多进展期肾癌患者已经失去手术机会,接受手术的患者将近有三分之一会发生复发和转移。抗血管治疗药物是针对血管内皮生长因子(VEGFR)受体的较为有效的治疗方法,抗血管药物同时阻滞络氨酸激酶受体(RTK),目前肾癌治疗一线靶向药物中舒尼替尼最为常用。令人惋惜的是有将近五分之一的肾癌患者对抗血管治疗不敏感,剩下的患者最终再接受一到多个疗程之后也会发展为耐药。许多患者因为中断了舒尼替尼的治疗最终导致快速的复发和转移,所以开发新型的抗肿瘤药物迫在眉睫。
  随着纳米科技的快速发展,各种纳米药物的药效学得到深入研究,其中一些甚至进入临床试验和临床治疗。在这些纳米药物中,无机纳米药物得到广泛研究,其中一些也在临床试验中得到理想效果。四氧化三铁纳米粒已经被美国FDA食品与药品监督局批准并认可应用于贫血的治疗。最近,四氧化三铁纳米粒显示出抗巨噬细胞的效应,这样就有潜能应用于肿瘤的生物免疫治疗。而且,银纳米粒已经在妇产科感染性疾病的治疗中取得一定疗效。其它无机纳米药物,例如:纳米氧化锌和纳米金,仍然有成为抗肿瘤药物的很大潜藏价值。在我们的前期研究中,氧化亚铜纳米粒(Cuprous Oxide Nanoparticles,CONPs)展示出理想的抗肿瘤效果和很低的生物毒性。铜伴侣蛋白调节细胞内铜离子转运和剂量,在肿瘤的进展中也扮演了重要角色。纳米药物和铜伴侣蛋白相互作用的机制尚未得到深入研究。
  目的:
  明确CONPs如何左右肾癌细胞的生物学行为,并在肾癌在体动物模型的实验中进行验证。在药效学实验阳性的基础上,迸一步探讨CONPs对抗肾癌进展的分子学机制,并寻找该药物抑制肾癌生长并诱导其凋亡的靶点。
  方法:
  1、通过CCK8法评估CONPs作用于肾癌细胞后,其细胞活力和增殖效应的变化,并通过TRANSWELL实验检测CONPs对肾癌细胞迁移和侵袭的影响,采用AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒在流式仪上对CONPs是否诱导肾癌细胞凋亡进行验证。通过流式仪并利用Cell cycle staining Kit检测CONPs对肾癌细胞周期的效应。
  2、RNA提取和qRT-PCR检测CONPs作用后肾癌细胞转录水平RNA变化情况,WB实验在蛋白水平检测CONPs对肾癌细胞蛋白质翻译有何影响,shRNA干扰靶蛋白寻找并验证CONPs的靶点。
  3、透射电子显微镜观察CONPs作用于肾癌细胞器的亚细胞结构,细胞内铜离子含量通过电感耦合等离子体质谱法的铜总量吸收实验所测定,通过对肾癌细胞内ROS和钙离子浓度的检测来检验细胞内氧化活性反应和内质网应激通路的激活。
  4、裸鼠皮下成瘤在体实验验证CONPs在动物体内是否能发挥抗肾癌效应。取裸鼠皮下瘤体标本TUNEL和KI67实验,进一步在体内实验中验证CONPs对肾癌增殖和凋亡的影响。
  结果:
  1、CONPs对肾癌细胞生长产生抑制,并且阻滞肾癌细胞周期于S和G2期。同时,CONPs抑制了肾癌细胞的侵袭和转移。
  2、透射电子显微镜观察到CONPs使肾癌细胞内质网肿胀,并且用流式细胞技术也检测到CONPs使肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度显著提高,并且与用药浓度和用药时间正相关,ROS水平和钙离子浓度的上升都是内质网应激的使动因素。
  3、CONPs诱导细胞内铜离子积聚,并且靶向作用铜伴侣蛋白发挥抗肿瘤效应。CONPs诱导肾癌细胞内质网应激并促进其细胞凋亡,WB实验验证了内质网通路和凋亡通路上关键蛋白的激活。
  4、CONPs在体内动物模型实验中抑制裸鼠皮下肾癌瘤体的生长。并且靶向AXL和MET蛋白,恢复肾癌耐药细胞对舒尼替尼的敏感性,体内实验的瘤体也同时验证内质网和凋亡通路的激活,以及对耐药蛋白的抑制。
  结论:
  我们系统性了CONPs的药理学效应,以及无机纳米药物在抑制肾癌和耐药肾癌模型的进展,多项研究表明CONPs在体内和体外实验中抑制了肾癌的生长。并且我们研究了CONPs作用于铜伴侣蛋白ATOX1和CCS的药理学效应。我们发现CONPs可以显著影响ATOX1和CCS的功能,干扰细胞内铜转运,并且释放铜元素,导致细胞内铜元素累积,CONPs提高肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度,从而导致内质网应激的发生,并在抑制其增殖的同时促进凋亡。CONPs在抗肾癌细胞的同时显示了极低的肝肾毒性,并且通过下调AXL、MET、AKT、ERK来抑制舒尼替尼耐药。这些研究都可以说明CONPs值得开发为新型抗肿瘤纳米药物从而应用到对进展期肾癌和舒尼替尼耐药肾癌的临床治疗中,这样可以极大程度上促进中晚期肾癌患者的预后。
[博士论文] 吴卉乔
外科学(骨外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 Nampt参与介导椎间盘退变过程
  背景:
  腰痛在临床上极为常见,超过80%的人一生某个时间中将受到下腰痛的困扰,是目前导致人类残疾的首要原因。椎间盘退变及其继发疾病的一系列相关疾病是导致腰痛最重要的病因。研究证实,椎间盘退变伴随炎症因子表达增加,炎症反应是介导椎间盘退变最重要的病理生理过程,炎症因子或介质不仅能诱导细胞外基质分解酶表达增加、降低细胞外基质合成基因表达、还能诱导神经血管长入,从而引发椎间盘退变及疼痛。
  烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)又称内胀脂肪素(Visfatin)和前B细胞克隆增强因子(PBEF),在1994年被首次发现。Nampt在有机体内广泛存在,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)补救合成途径的限速酶,研究表明,Nampt具有类炎症细胞因子样作用,参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,在免疫调节、炎症反应、代谢等相关疾病中均发挥重要作用。研究已证实Nampt可通过促炎作用介导细胞外基质降解,参与骨关节炎、类风湿关节炎等疾病的发生。但Nampt在椎间盘退变中的作用目前尚无文献报道,考虑椎间盘退变与骨关节炎、类风湿关节炎具有相似的病理生理机制,本研究拟对Nampt在椎间盘退变中的具体作用机制进行探讨。
  目的:
  1、探讨Nampt在椎间盘退变过程中的表达;
  2、探讨阻断Nampt对椎间盘细胞外基质代谢的影响。
  方法:
  1、获取因腰椎滑脱、腰椎管狭窄、腰椎间盘突出症需手术治疗患者的椎间盘组织(50例),按Pfirrmann分级分组,退变等级Ⅱ级和Ⅲ级为轻度退变组,退变等级Ⅳ级和Ⅴ级为重度退变组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白印迹(WesternBlot)和免疫荧光法检测Nampt在不同退变等椎间盘标本中的表达。
  2、获取椎间盘标本后,采用酶消化法消化、培养髓核细胞,给予不同浓度IL-1β干预48小时或给予IL-1β(10ng/mL)干预不同时间后,采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,采用NAD活性检测试剂盒检测干预后髓核细胞NAD的活性。
  3、采用Nampt酶活性抑制剂APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。
  4、采用IL-1β(10ng/mL)、或APO866(10nmol/L)、或APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞后联合IL-1β(10ng/mL)共干预髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、以及MMP-3和MMP-13的表达差异;采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞合成相关基因蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况。
  5、构建三种shRNA质粒敲除载体(shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#)转染髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。
  6、采用空质粒颗粒Src、shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#预先转染髓核细胞后,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,细胞免疫荧光检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况。
  结果:
  1、本研究纳入的50例标本中,轻度退变等级26例,重度退变等级24例;qRT-PCR检测结果显示重度退变组Nampt在mRNA表达水平显著高于轻度退变组;蛋白印迹法和免疫组化结果显示重度退变组Nampt在蛋白表达水平也显著高于轻度退变组。2、不同浓度IL-1β干预后检测发现Nampt在mRNA水平和蛋白水平表达均随着IL-1β干预浓度增加而增加,呈剂量依赖性;且IL-1β干预不同时间后也发现Nampt表达随着干预时间延长而逐步增加,呈时间依赖性。
  3、APO866干预细胞后,Nampt表达不变,且APO866并不影响IL-1β诱导Nampt表达上调的作用;但APO866可显著降低髓核细胞中NAD活性,且可显著抑制IL-1β上调NAD活性的作用。
  4、IL-1β干预可显著上调细胞外基质分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的表达,且显著下调细胞外基质合成基因蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;而APO866并不影响这些基因的表达,但可显著抑制IL-1β上调ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的作用,以及抑制IL-1β下调蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用。
  5、三种质粒载体均可显著敲除髓核细胞中Nampt基因表达,无论mRNA层面还是蛋白层面,且可显著抑制细胞NAD活性。
  6、Nampt敲除后并不影响ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用,但shRNA1#和shRNA3#转染后可显著逆转IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调作用,且显著逆转IL-1β对蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分解的作用。
  结论:
  1、椎间盘退变过程中伴随Nampt表达增加,且Nampt表达水平与椎间盘退变严重程度呈正相关,说明Nampt参与介导椎间盘退变过程。
  2、IL-1β具有诱导Nampt表达上调的作用,且抑制Nampt酶活性或敲除Nampt均可显著抑制IL-1β对细胞外基质分解的作用,说明IL-1β可能通过诱导Nampt介导椎间盘细胞外基质分解,从而诱导椎间盘退变,且阻断Nampt具有逆转椎间盘退变的作用。该研究为为椎间盘退变及腰痛的治疗提供新思路和新策略。
  第二部分 APO866诱导细胞自噬延缓椎间盘退变的作用及机制
  背景:
  自噬是哺乳动物体内细胞的一种分解代谢方式,在细胞代谢增加或在缺氧、营养匮乏等应激条件下,细胞将通过自噬机制,将受损的细胞器或蛋白等物质转运至自噬溶酶体中进行降解。细胞自噬是细胞发育和存活的重要途径,自噬持续时间过久或程度过强,超出细胞自身调节能力,将导致细胞代谢紊乱甚至凋亡等变化,因此细胞自噬对于维持细胞稳态具有重要作用。目前研究已证实,自噬与多种疾病的发生发展均密切相关,如炎症及免疫性疾病、神经及心血管系统疾病、以及癌症等。椎间盘退变与细胞衰老、缺氧、营养匮乏等具有紧密联系,椎间盘细胞凋亡、衰老或功能减弱是导致椎间盘退变的主要原因。近年来,研究发现细胞自噬也参与椎间盘退变过程,且大多数情况下对椎间盘退变起到保护作用。
  Nampt参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,既往研究表明,APO866可诱导细胞自噬,在缓解急性肝损伤以及抑制肿瘤方面发挥重要作用。然而,APO866是否具有诱导髓核细胞自噬及其在椎间盘退变中的作用目前尚不明确。
  目的:
  1、探讨APO866诱导髓核细胞自噬的作用
  2、探讨APO866通过细胞自噬拮抗IL-1β对椎间盘细胞外基质降解的作用。
  方法:
  1、体外培养髓核细胞,采用不同浓度APO866(0、1、5、10、20、100nmol/L)干预48小时后、或采用APO866 (10nmol/L)干预不同时间(0、24、48、72、96h)后,CCK-8法检测细胞活性、单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。
  2、米用自噬抑制剂3-MA、或烟酰胺单核苷酸(NMN)、或人重组Nampt(rNampt)预处理髓核细胞,再辅助IL-1β干预与不干预,单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。
  3、髓核细胞单独给予IL-1β(10ng/mL)、或APO866(10nmol/L)、或APO866预干预2小时后给予IL-1β共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA(10mmol/L)和IL-1β(10ng/mL)共处理48小时,无干预髓核细胞作为对照。qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况;Tunel检测细胞凋亡情况。
  结果:
  1、APO866干预浓度达到20nmol/L以上时,髓核细胞活性显著下降。MDC染色发现髓核细胞自噬小体形成数量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。蛋白印迹检测发现LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性,且APO866干预48h时表达量达到峰值。细胞免疫荧光检测显示LC3蛋白阳性的自噬体膜含量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。
  2、自噬抑制剂3-MA可显著抑制由APO866诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。NMN和rNampt干预同样可抑制由APO866诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。
  3、自噬抑制剂3-MA并不能影响IL-1β对Nampt的诱导作用;APO866抑制IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调的作用被3-MA显著逆转;APO866抑制IL-1β降解蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用被3-MA显著逆转;APO866具有拮抗IL-1β诱导髓核细胞凋亡的作用,而这一作用被3-MA所逆转。
  结论:
  Nampt酶活性抑制剂APO866具有诱导髓核细胞自噬的作用,且通过自噬作用可显著逆转由IL-1β介导的髓核细胞外基质分解作用。提示APO866有望成为治疗椎间盘退变新的分子靶点及药物。
[硕士论文] 吕洪伟
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见的致命性恶性肿瘤之一。肿瘤中被称为癌症干细胞(cancer stem cells,CSCs)或肿瘤起始细胞(tumor initiating cells,TICs)的一小群细胞被认为是肿瘤发生、发展、转移和耐药的关键驱动力。维生素C(vitamin C,VC)(又称L-抗坏血酸或抗坏血酸盐)作为一种癌症疗法,有一段争议历史。20世纪70年代,著名诺贝尔化学奖、和平奖双料得主莱纳斯·鲍林(Linus Pauling)和外科医生伊万·卡梅伦(Ewan Cameron)报道称静脉滴注加口服大剂量维生素C(10g/d)能有效延长晚期肿瘤患者的生存期。随后,美国权威医疗机构梅奥诊所(Mayo Clinic)却通过临床试验证实口服大剂量维生素C并不能改善癌症生存率,因而否定了维生素C在癌症治疗中的作用。直到近些年,科学家才发现给予维生素C途径的差异是造成之前两次研究结果不同的主要原因。大剂量维生素C只有通过静脉注射而不是口服,才能在人体内达到药理学浓度,从而对多种肿瘤细胞产生杀伤效应。这些证据再次激发了全球科学界和医学界对维生素C治疗癌症的兴趣。然而,维生素C对肝癌干细胞的杀伤效果及机制尚未探明。
  研究方法与结果:钠依赖的维生素C转运体(sodium-dependent vitamin C transporter2,SVCT-2)在HCC中高表达;SVCT-2表达越高HCC患者生存期越短,肿瘤恶性程度越高。有趣的是,SVCT-2在肝癌干细胞中表达进一步升高,且与HCC临床样本中的干性相关基因表达呈正相关。另外,SVCT-2是肝癌干细胞干性维持所需,包括自我更新、耐药及成瘤能力。
  体内和体外实验表明高浓度维生素C可以杀死肝癌细胞;肝癌细胞对维生素C细胞毒性的敏感度由SVCT-2决定。更重要的是,与非干细胞相比,更高表达SVCT-2的肝癌干细胞对维生素C诱导的死亡更加敏感。与CSCs普遍耐受的传统化疗药顺铂相反,高浓度维生素C处理可以显著下调HCC细胞及肿瘤球中的干性相关基因表达,而且还能降低CD133阳性或EpCAM阳性CSCs的所占比例。另外,与OV6阴性的非干细胞相比,OV6阳性CSCs对高浓度维生素C的毒性更敏感,但对化疗药顺铂的毒性更耐受。此外,高浓度维生素C不仅抑制肝癌干细胞自我更新或体外成球能力,而且还以时间和剂量依赖的方式阻碍HCC细胞来源的肿瘤球的形成和生长。通过不同SVCT-2表达水平的人源性HCC组织异种移植模型(PDX模型),进一步证实大剂量维生素C抑制体内肿瘤生长,清除肝癌干细胞,且治疗效果与SVCT-2表达相关。机制上,维生素C通过SVCT-2进入细胞内,增加胞内ROS水平,进而诱导DNA损伤和ATP耗竭,最终通过引起细胞周期阻滞和caspase依赖的凋亡导致细胞死亡,而不是自噬或坏死性凋亡。因此,高浓度维生素C优先杀死高表达SVCT-2的肝癌干细胞。
  最后,通过对613例接受肝癌切除术作为首次治疗的HCC患者的回顾性队列研究发现术后静脉滴注维生素C治疗(2g/d)显著延长患者的无病生存期(DFS)(adjusted HR=0.622,95%CI0.487to0.795,p<0.001)。先前药代动力学研究证实静脉滴注2g维生素C在体内可达到的血浆浓度约1.5mM,而体外实验表明1.5mM的维生素C足以引起肝癌细胞和肝癌干细胞的死亡。因此,静脉滴注2g维生素C可能在体内杀伤术后残余肿瘤细胞,从而降低HCC复发风险。
  研究结论:1.SVCT-2在肝癌干细胞中高表达,且是肝癌干细胞干性维持所需;
  2.SVCT-2决定肝癌对维生素C诱导的细胞死亡的敏感度;
  3.高浓度维生素C优先杀死高表达SVCT-2的肝癌干细胞;
  4.机制上,维生素C通过SVCT-2进入细胞后生成ROS,进而诱导DNA损伤和ATP耗竭,最终导致细胞周期阻滞和凋亡;
  5.回顾性队列研究表明静脉滴注维生素C显著降低肝癌患者术后复发风险。
[硕士论文] 苏晓玲
妇产科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  卵巢癌是妇科致命的妇科恶性肿瘤,由于其发病隐匿,缺少特异可靠的筛查诊断指标,发现时往往已是晚期。转移是卵巢癌患者死亡的主要原因。应激与肿瘤的关系的研究越来越受到关注。应激包括患者因患肿瘤引发的心理应激被认为能促进肿瘤的进展。糖皮质激素(GC)是重要的应激激素,具有强大的免疫抑制、抗炎和维持内环境稳定的作用,并能在其受体(GR)的介导下调节细胞的新陈代谢、分化、增殖及存活。此外GC还是临床广泛使用的药物。除了治疗自身免疫性疾病和炎症外,还被作为实体肿瘤/癌症的化疗或放疗的辅助药物,用来减少放化疗的副反应,增加患者的耐受性。尽管GC与肿瘤的关系的研究一直受到关注,但结果一直不明确。研究证实GC可抑制一些实体肿瘤的增殖和进展,因此,有将GC单药或者联合细胞毒性药物(如5氟尿嘧啶)治疗乳腺癌和前列腺癌,并取得了一定的效果。反之近年来对多种肿瘤的研究表明,GC可以增强肿瘤细胞对放化疗的抵抗,减少放化疗诱导的细胞凋亡,促进肿瘤细胞存活,而这些作用加上GC的免疫抑制作用则有助于肿瘤的发生和发展。因此GC对肿瘤的作用还不清楚,其作用是否因肿瘤的不同类型而异需要进一步研究。
  缺氧是肿瘤常见微环境特征之一,低氧可诱导低氧诱导因子HIF-1的表达。HIF-1是重要的转录因子,由HIF-1α和HIF-1β组成,其中α亚基为氧调节亚基。HIF-1α表达增加被认为与临床上肿瘤患者预后不良相关。研究表明卵巢痛组织中HIF-1α的表达明显高于正常卵巢组织;并且HIF-1α在卵巢癌组织中的表达水平高与卵巢癌患者的预后差呈正相关。近年来研究认为HIF-1α的高表达促进多种肿瘤细胞的迁移和侵袭,因此HIF1-α已经成为几种类型肿瘤进展的关键预测因子。而HIF-1α对卵巢癌细胞侵袭和迁移的研究较少,现有的研究亦认为缺氧下HIF-1α促进卵巢癌细胞的侵袭转移。
  MUC1是一种跨膜黏蛋白,常过表达于一些上皮肿瘤,能够与膜上的多种蛋白相互作用,激活细胞内的PI-3K/AKT通路、Wnt通路等多条信号转导通路,从而调节细胞的侵袭转移等。近年来,MUC1被当作一种新的低氧诱导因子受到人们的关注,有报道MUC1与HIF-1α之间存在相互作用,但确切作用机制还不清楚。小G蛋白Rho激活的蛋白激酶ROCK2作为一个下游信号通路分子可通过调节细胞骨架进而调节细胞运动,与肿瘤细胞的转移密切相关。有国外学者在其研究中发现,Rho/ROCK途径可以调节HIF-1α信号转导。
  我校病生教研室前期的研究发现GC在体内和体外可以明显促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和转移,并且GC可以上调卵巢癌细胞中MUC1及ROCK2的表达。本课题在此基础上进一步探讨GC是否能影响卵巢癌细胞中HIF-1α信号通路进而促进卵巢癌细胞的迁移,并且探讨其可能的机制,主要观察了MUC1和ROCK2与GC增加HIF-1α蛋白进而促进卵巢癌细胞迁移中的作用的关系。
  研究方法:
  我们在细胞水平进行实验,以卵巢癌细胞系HO-8910、SKOV3为研究对象,实验过程中用含10%去激素血清的1640培养基培养细胞,去除血清中的激素对细胞的影响,用100nM DEX对细胞处理不同的时间。用Western Blot的方法检测HIF-1α蛋白的表达水平。siRNA干扰实验分别对HIF-1α、MUC1的表达进行干扰,继而使用Western Blot的方法验证MUC1、ROCK2及HIF-1α的表达。利用Transwell小室检测卵巢癌细胞的垂直迁移能力。
  研究结果:
  1.DEX可以明显上调卵巢癌细胞中HIF-1α蛋白的表达,干扰HIF-1α的表达明显阻断DEX促卵巢癌细胞迁移的作用。
  2.DEX能上调卵巢癌细胞中MUC1的表达,干扰MUC1的表达不仅可以明显阻断DEX促卵巢癌细胞迁移的作用,也能明显阻断DEX上调HIF-1α的作用;反之干扰HIF-1α却不影响DEX诱导MUC1表达的作用。
  3.干扰HIF-1α并不影响DEX上调ROCK2的表达。
  研究结论:
  DEX能明显增加卵巢癌细胞中HIF-1α蛋白的表达水平,该作用与Dex上调MUC1的表达密切相关。DEX上调MUC1进而增加HIF-1α在DEX促进卵巢癌细胞迁移中具有重要作用。
[硕士论文] 谢芳
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症(sepsis)是指严重感染导致的全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),宿主针对感染的特异性免疫反应失调,进而可导致脓毒性休克、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),乃至引发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),是ICU患者的主要死亡原因,其发病率仍然很高。脓毒症急性呼吸窘迫综合征的病理生理学机制非常复杂,包括炎症激活、炎细胞浸润、凝血系统激活和肺上皮屏障损伤等,其中肺上皮是急性呼吸窘迫综合征时肺部防御损伤的一种重要结构。在ARDS的致病过程中,各种炎症因子、粘附分子、趋化因子和细胞因子等不断释放参与肺部炎症反应,如肿瘤坏死因子、IL-6、IL-8、IL-1家族和干扰素。肺上皮细胞能够分泌多种细胞因子调控肺的天然免疫,目前却没有关于肺上皮细胞表达能够调控肺部天然免疫的分泌蛋白。因此,对于肺上皮细胞在脓毒症急性呼吸窘迫综合征的基因表达及相关分泌蛋白的机制探讨值得研究,肺上皮细胞表达的分泌蛋白有望成为临床上治疗脓毒症的新的分子靶点。
  sectm1b基因是一种新型人类编码基因,其基因表达的蛋白为sectm1b,即跨膜与分泌蛋白1b,属于免疫球蛋白超家族。目前sectm1b基因表达调控机制以及效应并不清楚,关于sectm1b的研究也非常少。有研究认为:sectm1b可以抑制TCR介导的T细胞活化从而发挥促炎的功能。炎症反应的失衡是脓毒症所致急性呼吸窘迫综合征的主要原因。右美托咪定作为ICU临床常用的镇静药物,最近几年,因为发现其具有抗炎的作用而逐渐被大家所关注,但目前没有关于右美托咪定对脓毒症ARDS时sectm1b表达的影响及抗炎作用的研究。另外,肺上皮细胞分泌的sectm1b能够促进中性粒细胞表达和释放促炎症因子,对中性粒细胞募集到肺部感染部位具有调控作用。但是,sectm1b对脓毒症ARDS时肺上皮细胞功能的作用及其可能的机制,目前尚未见报道。
  本研究拟通过在体与离体实验,探讨肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS的影响及作用机制。首先,对脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的筛选及验证;其次,探讨肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS促炎作用及机制;最后,探讨右美托咪定对脓毒症ARDS小鼠抗炎作用及其机制的研究,同时探讨了右美托咪定在脓毒症ARDS发挥抗炎保护作用时对肺上皮细胞sectm1b表达的影响。
  第一部分 脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的筛选及验证
  目的:
  脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的基因芯片筛选与分析,在体实验和离体实验验证脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b。
  方法:
  1.取雄性C57小鼠,构建CLP所致脓毒症ARDS小鼠模型,分离CLP术后0h、6h、12h、24h的左肺组织,利用基因表达谱芯片检测CLP术后不同时间及正常对照小鼠肺上皮细胞基因表达差异。利用基因表达热图分析、genecard软件分析及查阅文献重点分析细胞因子与趋化因子等分泌性蛋白的表达。
  2.取约8周龄雄性C57小鼠,随机分为四组,分别为:CLP术后0h、CLP术后6h、CLP术后12h、CLP术后24h。
  a.取每组小鼠肺组织,左肺组织行HE染色,并进行病理学评分;右肺组织提取mRNA,采取RT-PCR技术检测sectm1b mRNA的表达情况。
  b.取每组小鼠支气管肺泡灌洗液,采用ELISA法检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平及流式细胞术进行中性粒细胞计数。
  c.于每组小鼠行眼球取血,离心后取血清,采用ELISA法检测IL-6、IL-1β、TNF-α的表达情况。
  3.用LPS刺激小鼠肺上皮细胞MLE12,于LPS诱导后0h、6h、12h、24h提取mRNA,利用RT-PCR检测肺上皮细胞sectm1b mRNA的表达,同时收集上清,采用ELISA检测上清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。
  结果:
  1.脓毒症ARDS小鼠肺组织中基因表达差异显著,其中sectm1b在CLP术后12h表达显著增高,24h表达下降。
  2.
  a.HE染色结果显示:CLP术后小鼠肺组织病理损伤明显加重,且术后12h损伤程度强于24h,病理学评分增高(P<0.05)。sectm1b mRNA表达差异显著(12小时大于正常约30倍)(P<0.05)。
  b.ELISA结果显示:与正常对照比较,肺泡灌洗液和血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显升高(P<0.05)。CLP术后中性粒细胞计数明显增多(P<0.05)。
  3.与正常相比,脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞sectm1b表达增高(P<0.05),上清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。
  结论:
  脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b,脓毒症ARDS小鼠在体实验模型与离体实验模型建立成功,为后续的在体和离体实验提供了可靠的实验基础。
  第二部分 肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS促炎作用及机制探讨
  目的:
  研究sectm1b对LPS诱导的肺上皮细胞在脓毒症ARDS炎症反应中的作用及其机制探讨。
  方法:
  采用siRNA转染技术沉默sectm1b基因的表达,研究在LPS诱导的肺上皮细胞MLE12在沉默sectm1b时对脓毒症ARDS炎症反应的作用及其机制。实验分为:NCsiRNA组和sectm1b siRNA组,转染48小时后,分别用LPS刺激,提取LPS刺激后不同时间点的细胞总mRNA、蛋白、上清。用RT-PCR技术检测sectm1b、IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的表达,用ELISA技术检测IL-6、IL-1β、TNF-α水平,利用western-blot方法检测炎症相关信号通路(NF-κβ/MAPK)相关分子的表达。
  结果:
  1.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导12h后,RT-PCR显示sectm1b siRNA组sectm1b的mRNA表达水平明显低于NC-siRNA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
  2.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导6h、12h、24h后,sectm1b siRNA组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平较NC siRNA组降低(P<0.05),同时ELISA结果显示sectm1b siRNA组上清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平较NCsiRNA组降低(P<0.05)。
  3.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导12h后,与NC siRNA组相比,sectm1bsiRNA组的p65/p38/erk磷酸化表达水平下降(P<0.05)。
  结论:
  肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS具有促炎作用,其促炎作用可能与NF-κβ/MAPK信号通路的激活有关,表明sectm1b在脓毒症肺上皮细胞的损伤具有重要作用。
  第三部分 右美托咪定对脓毒症小鼠肺上皮细胞sectm1b表达的影响及保护作用研究
  目的:
  探讨右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)在脓毒症小鼠肺上皮细胞炎症反应中的作用及其对sectm1b表达的影响。
  方法:
  将C57小鼠随机分为3组:CLP组、CLP+Dex组、Sham组。给药组在小鼠CLP术前15min腹腔注射右美托咪定(50ug/Kg),CLP组小鼠在术前15min腹腔注射等体积的无菌生理盐水。收集每组CLP术后0h,6h,12h,24h的血清和肺泡灌洗液(BALF),用酶联免疫吸附试验检测血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,记录24h内小鼠的存活率。体外培养传代小鼠肺上皮细胞MLE12,分为空白对照组(未进行任何处理)、脂多糖组(LPS,1ug/ml)、脂多糖+右美托咪定组(LPS,1ug/ml+Dex,0.2ug/ml),RT-PCR检测总细胞中sectm1b mRNA的表达,酶联免疫吸附实验检测上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,蛋白质印迹实验检测ERK1/2和JNK磷酸化水平。
  结果:
  1.与CLP组相比,右美托咪定组脓毒症小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达下降,小鼠24h内的存活率上升(P<0.05)。
  2.与脂多糖组相比,右美托咪定组上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达减少,并且ERK1/2和JNK的磷酸化水平下降(P<0.05)。
  3.与脂多糖组相比,右美托咪定组肺上皮细胞sectm1b mRNA的表达下降(P<0.05)。
  结论:
  右美托咪定能够影响脓毒症小鼠肺上皮细胞sectm1b的表达,同时能够减少脓毒症小鼠血清和肺泡灌洗液中炎症因子的产生,提高脓毒症小鼠24h内的存活率,对小鼠肺上皮细胞炎症反应发挥保护作用,且右美托咪定的这种作用可能与抑制ERK1/2和JNK的激活有关。
[硕士论文] 蔡文昌
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的和背景:随着肝脏外科手术技术的提高,器械设备和医用材料的发展,肝脏外科在各种肝脏良恶性疾病的治疗中发挥着越来越重要的作用。而且可进行手术范围更广、难度更大、危险度更高的肝脏外科手术。但是成功而又安全地完成这些手术后也需要更为理想的药物保证术后的顺利恢复。N-α-三甘氨酰-8-赖氨酸-加压素(Terlipressin,特利加压素,后简称为加压素)作为一种人工合成的血管加压素类似物,能选择性的收缩胃肠道的毛细血管床,从而显著的降低门静脉的压力,对肝硬化门静脉高压的一些常见并发症有良好的疗效。近期发现加压素能使肝大部切除术后肝功能得到明显改善,降低小肝综合征甚至肝功能衰竭的发生概率。更有研究证明加压素可以通过降低肝切除术后的高门静脉压力,从而促进残肝的再生。本研究旨在进一步探讨加压素对肝大部切除术后肝细胞再生的促进作用及其机制。
  研究方法:收集2016年11月至12月和2017年5月至12月在上海东方肝胆外科医院特需治疗一科/肝移植科行肝部分切除术的患者42例,其中术后静脉应用加压素21例,作为用药组;未应用加压素21例,为对照组,进行回顾性队列研究。监测其术后第一天和第三天的肝功能的结果进行对比。模拟人体肝大部切除建立小鼠肝大部切除模型,选取术后(24小时、48小时、72小时和96小时)4个时间点将应用加压素的实验组和安慰剂组的小鼠肝脏再生指标进行比较。然后对小鼠肝脏标本进行基因表达谱芯片的检测,探索加压素促进残肝细胞再生的可能机制。采用人正常肝细胞株(normal liver cells,HL7702)进行体外分组实验。以添加了加压素的培养基培养的细胞作为实验组细胞,普通培养基培养的细胞作为对照组细胞。利用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK8)对两组细胞的相对增殖活性进行比较。利用流式细胞仪(Flow cytometry instrument,FCM)进行两组细胞细胞周期的检测和比较。最后采用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)对基因芯片筛选出的可能的机制进行验证。
  研究结果:临床结果显示肝大部切除术后第一天用药组和对照组丙氨酸氨基转移酶(Alamine aminotransferase,ALT)分别为:188.71±136.22和444.43±290.40U/L,(P=0.004);天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)分别为:377.76±147.56和648.67±421.07U/L,(P=0.009);凝血酶原时间(Prothrombin time,PT)分别为:13.41±1.47和14.76±1.54S,(P=0.028);总胆红素(Total bilirubin,TB)分别为:22.79±11.44和37.35±19.14μmol/L,(P=0.008)。上述指标两组间均具有显著差异。术后第三天两组的ALT分别为:166.24±96.91和273.62±133.89U/L,(P=0.025);TB分别为:33.92±18.71和45.19±24.61μmol/L,(P=0.008);白蛋白(Albumin,ALB)分别为:40.10±3.40和37.12±2.55g/L,(P=0.002);前白蛋白(Prealbumin,PA)分别为:88.57±27.71和57.00±20.56mg/L,(P=0.000);PT分别为:13.67±0.98和15.35±1.87S,(P=0.003)。上述指标两组间均具有显著差异。小鼠肝大部切除模型显示:实验组小鼠肝体重比显著高于安慰剂组。其中术后24小时,实验组和安慰剂组分别为:0.02533±0.000577和0.01667±0.002082,(P=0.002);术后48小时两组分别为:0.02881±0.004116和0.02174±0.000659,(P=0.043)。实验组的残肝细胞核分裂像显著多于安慰剂组,分别为:31.33±2.082和20.67±1.528,(P=0.002)。术后24小时和48小时实验组残肝组织免疫组化Ki67染色阳性率也显著高于安慰剂组。术后24小时两组分别为:30.1%±0.42和8.57%±1.06,(P=0.001);术后48小时两组分别为:42.14%±4.92和9.42%±1.11,(P=0.012)。术后24小时和术后48小时实验组血清HGF显著高于安慰剂组,术后24小时两组分别为:3663.35±200.86和1936.77±394.22pg/ml(P=0.002);术后48小时两组分别为:532.80±65.38和274.68±19.46pg/ml(P=0.003)。残肝组织的基因表达谱芯片结果显示用药组相较于安慰剂组高表达的基因主要与细胞周期相关。细胞实验显示加压素处理的实验组第96小时的CCK8检测值显著高于对照组,两组的倍增数分别为:6.28±0.18和5.46±0.01,(P=0.009)。FCM细胞周期检测结果实验组处于S期的细胞比例明显高于对照组,分别为:25.19%和17.55%。RT-PCR结果也证实了加压素分别处理24小时和48小时后实验组细胞Cyclin B1基因和CDC20基因的表达明显高于对照组。术后24小时和48小时Cyclin B1基因两组表达结果分别为:2.82±0.08和1.00±0.04,(P=0.001),以及3.11±0.06和1.00±0.03,(P=0.000);术后24小时和48小时CDC20基因两组表达结果分别为:3.27±0.07和1.00±0.03,(P=0.001),以及3.89±0.03和1.00±0.05,(P=0.000)。
  研究结论:加压素可以加速患者肝大部切除术后残肝功能的恢复,可以促进肝大部切除术后小鼠残肝的再生,也可以促进HL7702细胞株细胞的增殖;其促进残肝再生和肝细胞增殖可能的作用机制是通过上调Cyclin B1基因和CDC20基因的表达实现的。
[硕士论文] 王昌理
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征是多器官功能障碍综合征在肺部的重要临床表现。急性肺损伤的病因包括脓毒症、烧伤、重症肺炎或者严重创伤等。其病理生理特点是肺泡毛细血管内皮-上皮屏障受损,炎症细胞浸润,失控的炎症反应以及氧化应激损伤等。虽然研究人员对急性肺损伤的早期诊断和治疗策略进行了深入研究,但急性肺损伤的发病率和死亡率一直居高不下,这对公共卫生健康造成极大影响。哇巴因(Ouabain)是一种钠钾ATP酶抑制剂,曾用于治疗充血性心力衰竭。近年来,有较多研究发现哇巴因在器官损伤、免疫反应及肿瘤治疗中发挥重要作用。目前,哇巴因在急性肺损伤中是否具有保护作用还未见报道。本研究的目的是探讨哇巴因是否抑制脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤,并初步探寻其潜在机制。
  研究方法:
  8-12周雄性C57BL/6小鼠(20g-25g)随机分为三组:对照组(Control);肺损伤组(LPS);哇巴因组(LPS+OUB)。对照组和肺损伤组小鼠腹腔注射无菌PBS溶液,连续3天;哇巴因组小鼠腹腔注射哇巴因,连续3天。第3天腹腔注射哇巴因1h后,肺损伤组和哇巴因组小鼠在七氟醚麻醉下,经鼻吸入溶解于无菌PBS的LPS溶液,对照组小鼠吸入等体积PBS溶液。LPS吸入6h和24h后,使用二氧化碳吸入法处死小鼠,收集各组小鼠肺组织和肺泡灌洗液进行肺损伤相关指标检测。
  实验结果:
  1.LPS处理6h和24h后,肺组织H&E染色病理切片显示肺损伤组小鼠肺间质水肿、出血、肺间隔增厚或受损以及显著的炎细胞浸润;哇巴因组小鼠的肺组织H&E染色切片显示肺组织病变程度减轻。肺损伤病理评分也表明哇巴因组病理评分显著低于肺损伤组,这说明哇巴因可降低LPS造成的肺组织损伤。
  2.LPS显著增加小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平;而哇巴因可降低肺泡灌洗液中上述细胞因子的含量。qRT-PCR检测结果表明,LPS可致小鼠肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达升高,哇巴因可抑制上述细胞因子的mRNA水平。
  3.LPS处理后,小鼠肺组织湿/干比升高,哇巴因可改善ALI小鼠的湿/干比;LPS可显著增加小鼠支气管肺泡灌洗液蛋白含量,而哇巴因可减少小鼠支气管肺泡灌洗液蛋白含量;Evans蓝尾静脉注射1h后,肺损伤组小鼠肺组织Evans蓝含量最高,而哇巴因可显著下调肺组织Evans蓝的含量。
  4.与对照组相比,肺损伤组小鼠肺泡灌洗液总细胞数、中性粒细胞和巨噬细胞比例显著增加,哇巴因可一定程度减少这些细胞浸润。此外,哇巴因也能降低小鼠肺组织MPO活性。
  5.肺损伤组小鼠肺组织NF-κB p65的磷酸化水平显著高于对照组,哇巴因可降低肺组织NF-κB p65的磷酸化水平;哇巴因组小鼠肺组织磷酸化的ERK、JNK和p38表达高于对照组,但低于肺损伤组。
  研究结论:
  哇巴因可改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤严重程度,其机制可能与哇巴因抑制ERK、JNK、p38和NF-κB p65磷酸化水平相关,从而调控TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子分泌并抑制炎性细胞浸润。
[硕士论文] 于金
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:便秘是一组临床常见的复杂症状,表现为排便次数减少、排便困难、粪便干硬。排便次数减少指每周排便少于3次。排便困难包括排出困难、排便费力、排便不尽感、排便费事以及需要手法辅助排便。由于缺乏有效的治疗方法,它给病人带来了巨大的经济负担,极大地影响了患者的生活质量,促使人们寻找新的、有效的方法来治疗便秘。2015年,Ron等人10进行了一项验证振动胶囊安全性和通过其来治疗便秘的潜在功效的研究。该胶囊是利用电磁信号和固定的振动档位(A或B,由医师推荐)预定延迟6-8h使胶囊到达结肠后开始振动。
  结果报告没有发生严重的不良反应,有暂时的轻微的副作用。26例患者中有23例肠蠕动平均数显著增加。但是该振动胶囊只有一种振动模式,且无法在体外对服用的胶囊进行监测和调试。
  目的:
  我们和上海安翰医疗技术有限公司合作,研制出一种经智能手机体外调控的、多档位的创新型振动胶囊系统(Vibrating Capsule,VC),该系统由振动胶囊本身和通常称为适配器的外部配置装置(external configuration device,ECD)组成。VC有各自的半导体芯片,每个芯片都有自己独自的序列号,以利于被ECD识别和控制。我们利用该系统先后对8条比格犬和便秘患者应用来验证其安全性,并探索其可能对排便的影响和便秘的治疗作用。
  方法:
  在第一部分实验中,8条比格犬均先后依次喂服低、中、高3个档位的VC并运用常规方法和设备测其相应的一般生理指标(包括体温、心率、呼吸、体重、行为活动状态,每日摄食量、每日饮水量等)、血液指标(血白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白,血小板计数,丙氨酸氨基转移酶,天冬氨酸氨基转移酶,总胆红素,直接胆红,总蛋白,白蛋白,尿素氮,血肌酐,钾,钠)、粪便指标(排便量、排便次数,排便的布里斯托大便性状评分,粪便常规及粪便潜血检查)等;之后对8条犬喂服超高档位的VC,并行腹部CT及安乐死后解剖取样行病理检查。
  在第二部分试验中,我们设计了一项计划45例功能性便秘患者的双盲、安慰剂对照研究,以评价振动胶囊对于缓解和治疗功能性便秘的有效性及对肠道传输的作用。包括2周不服用胶囊的基础期,6周双盲、安慰剂对照治疗阶段,及最后一次使用胶囊后14天随访阶段(随访至胶囊排出停止)。受试者参与这个试验的总持续时间约10至14周,包括基础期阶段、治疗阶段及试验后随访阶段。
  结果:
  在动物试验中(1)应用VC前后犬的一般生理指标和血液指标并无明显差异(P>0.05)。腹部CT及病理检查均未见明显异常。(2)应用VC后犬的排便次数增加(P<0.05或<0.01),但不同档位之间的VC没有显著差异(P>0.05)。(3)随着胶囊档位的不同,排出VC的时间呈缩短趋势,但统计学没有显著差异(P>0.05)。(4)VC对犬排便的性状未产生明显影响(P>0.05)。(5),能够顺利通过智能手机检测到犬体内的VC信号,并进行参数调试。
  在临床试验中的初步结果显示(1)已完成振动胶囊治疗的患者,无明显与试验器械有关的不良事件发生。(2)胶囊自服用到自发排出时间未发生超过14天的情况。(3)第6周达到≥3SCBM的受试者百分比:假胶囊组为33.3%,而振动胶囊组为60%。(4)临床试验目前仍在进行中。
  结论:
  在动物实验中,VC是安全的,应用VC能使犬的排便次数增加,随着胶囊档位的不同,排出VC的时间的均值呈现缩短趋势;VC对犬排便的性状无明显影响;体外通过智能手机调控VC是可行的。
  在临床试验中,初步认为振动胶囊是安全的,对受试者生活质量具有改善作用。
[硕士论文] 王瑜
外科学(普通外科学) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  在中国胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,在新增的胃癌患者中90%以上为进展期。对于此类患者,外科手术常难以获得根治性效果,因此,临床开展胃癌新辅助化疗,对于提高手术根治率、提高可切除率以及延长患者生存时间具有重要意义。然而,患者对化疗药物存在个体差异,甚至有部分患者化疗形成耐药后,肿瘤会形成报复性生长。是什么导致肿瘤呈现报复性生长?
  众多研究表明,衰老是凋亡、自噬之外细胞对于化疗介导DNA损伤反应的一种重要应答形式。通过新辅助化疗的人体内标本研究发现,胃癌新辅助化疗后很大一部分细胞发生衰老。因此,对化疗介导的DNA损伤诱导衰老这重要临床现象进行深入研究,对于提高临床化疗效果具有重要意义。化疗介导衰老细胞的产生,将对化疗本身产生两方面重要影响。首先,该群细胞本身处于不可逆的G0期,因此对放、化疗的反应性极低而难以被彻底清除,成为耐药与复发的重要来源;其次,该群细胞还维持活跃的生理学特性,其重要要特征是持续不断分泌大量生物生物活性物质,如IL-6、IL-8、IL-1α/β、MMPs以及相关生长因子等,即衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)。
  科室前期使用以紫杉醇类药物为基础的联合方案对胃癌患者进行新辅助化疗,化疗无效组胃癌组织IL-6表达水平显著高于有效组,说明由化疗介导的胃癌组织SASP相关因子IL-6与化疗不敏感密切相关。提示:SASP在胃癌新辅助化疗耐药过程中发挥了重要作用。那么SASP和肿瘤的报复性生长是否存在一定的联系?
  如果SASP和肿瘤报复性生长存在联系,那么它是通过什么机制产生的呢?近年来,有研究表明固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)在多种肿瘤中过表达,提示肿瘤细胞的快速增殖和脂类的快速合成具有密切相关性,抑制SREBPs表达可以显著抑制肿瘤细胞生长。SREBPs转录因子家族成员包括SREBP1和SREBP2。前者在非饱和脂肪酸和甘油三酯合成中起主要调节作用,而后者在调节胆固醇内环境稳态中起关键作用,它是调节脂类平衡的主要转录因子。SREBPs调控多种脂类合成相关基因的表达,如在人胶质母细胞瘤中SREBP1上调并促进及其下游靶基因ACC和FASN的表达;此外,在去年2月,Ayano Kondo等在Cell Reports上发表论文指出,细胞外H+通过激活SREBP2上调胆固醇合成相关酶基因如:IDI1、MSMO1、INSIG1的表达,促进胰腺癌进展。因此,推测SASP可能通过激活SREBP2来促进胃癌细胞增殖,从而促进肿瘤进展。
  方法:
  在科室前期研究基础上,提出如下科学假设:新辅助化疗药物紫杉醇能够诱导胃癌细胞发生衰老,衰老胃癌细胞通过分泌SASP激活SREBP2促进未衰老的肿瘤细胞增殖。
  (化疗→细胞衰老→SASP→SREBP2专细胞增殖)
  具体研究分两部分进行:一、现象验证,即SASP促进胃癌细胞增殖;二、机制研究即SASP通过激活SREBP2促进细胞增殖。
  一、现象验证
  体外实验方法利用紫杉醇(paclixel,PTX)处理BGC823细胞构建衰老细胞模型,使用β-半乳糖苷酶染色证实衰老细胞模型的建立;ELISA检测SASP-CM中主要的SASP因子的浓度;CCK8比色法及细胞克隆形成实验检测SASP-CM对BGC823细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。所获得BGC823细胞培养上清,即胃癌衰老细胞相关分泌表型条件培养基(senescence-associated secretory phenotype conditioned medium group,SASP-CM),以不加PTX处理的BGC823细胞培养上清为肿瘤细胞条件培养基组(control condition medium group,CTR-CM组)和正常培养基组(normal medium group,NOR-CM组)为对照,共计3组实验。
  体内实验方法裸鼠皮下成瘤实验分2组,即实验组:5周龄雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接种200μL等比例胃癌衰老细胞和正常肿瘤细胞混合悬液(5×107/mL)。对照组:5周龄雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接种200μL正常肿瘤细胞悬液(5×107/mL),观察成瘤大小。
  结果PTX35nmol/L诱导BGC823细胞72h可建立稳定的细胞衰老模型,此条件下衰老细胞比例最高(66.95±3.54)%。SASP-CM中主要SASP因子IL-6、IL-8、CXCL1、CCL2、INF-γ浓度均高于CTR-CM。SASP-CM组细胞的相对克隆形成率高于CTR-CM组(P<0.001)和NOR-CM组(P<0.05)。48、72、96h时SASP-CM组细胞的增殖活性高于CTR-CM组和NOR-CM组(P<0.05)。SASP-CM组的S期细胞比例高于CTR-CM组和NOR-CM组(P<0.01),细胞凋亡率各组间差异无统计学意义。裸鼠皮下成瘤实验实验组瘤体重量、体积显著高于对照组(P<0.01)。
  二、机制研究
  1、用SASP-CM和CTR-CM培养BC823细胞72h后,提取总RNA做基因表达谱分析,并根据差异表达基因做GO分析。2、SREBP2是胆固醇合成通路中关键转录因子,因此,通过qRT-PCR验证SREBP2及其靶基因表达,免疫荧光及WB证实SREBP2激活。3、用siRNA干扰SREBP2表达,并利用qRT-PCR、验证干扰效果,然后用SASP-CM培养SREBP2干扰和未干扰的BC823细胞,cck8检测细胞增殖活性。
  结果:
  1、通过基因表达谱分析发现:衰老细胞条件培养基能够促进BGC-823细胞胆固醇合成通路中相关酶表达;2、胆固醇合成通路中关键转录因子SREBP2及其靶基因IDI1,MSMO1,INSIG1mRNA表达水平显著上调;衰老细胞条件培养基导致SREBP2激活并发生核转移;3、siRNA干扰SREBP2表达能够降低衰老细胞条件培养基促进BGC-823细胞增殖的能力。
  结论:
  新辅助化疗药物紫杉醇能诱导胃癌细胞发生衰老,衰老的胃癌细胞通过衰老相关分泌表型激活SREBP2促进未衰老的胃癌细胞增殖。
[硕士论文] 林文婷
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  隐球菌性脑膜炎是预后十分凶险的深部真菌感染,它好发于免疫缺陷人群,若不积极治疗,死亡率高。两性霉素B(简称AMB)是国内外治疗指南中治疗隐球菌性脑膜的首选用药,但因为其副作用多且严重,难以透过血脑屏障,使隐脑治疗效果下降。鞘内给药能提高脑脊液中AMB的浓度,但神经毒性较大,而且需要反复腰穿,难以达到理想的药代动力学水平,对疾病控制不利。PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物是一种可注射性智能型水凝胶,生物兼容性良好,在低于体温时是液态,能够包载药物,达到体温时变为凝胶状态,能够缓慢控制释放药物。本实验用PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物来负载AMB,并进行鞘内注射,使AMB在脑脊液中得到缓慢释放,减少给药次数,减轻AMB的毒副作用,解决隐球菌脑膜炎目前的治疗困境。
  方法:
  第一部分,AMB凝胶的获取和相关性质检测。首先合成了PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物,用核磁共振和凝胶渗透色谱仪确定该聚合物的分子结构和并对其性能进行表征。用生理盐水将聚合物溶解成不同浓度的聚合物水溶液,测定其凝胶化温度,根据结果选择合适的浓度的聚合物水溶液进行后续研究;用物理载药方法将聚合物AMB负载于聚合物水溶液中(简称AMB凝胶),并对载药前后的聚合物水溶液进行流体力学检测,以判断AMB对该水凝胶是否有影响。
  第二部分,AMB凝胶的体外实验。配制2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL三个浓度的AMB凝胶,置于缓释液中,定时更换缓释液,测定AMB凝胶体外缓释度,绘制体外释放曲线,计算累计释放度,用药物缓释曲线中的一阶方程对缓释数据进行拟合。
  第三部分,AMB凝胶的体内实验。在毒理学研究方面,选取健康大鼠为实验对象,将AMB凝胶、普通AMB、空白凝胶、生理盐水分别进行鞘内注射,每天观察每组大鼠给药后的情况,用Tavlor's评分评估四肢活动能力,记录大鼠死亡或存活情况,在给药后的第7天取做大鼠脊髓做HE染色观察脊髓损伤程度,与以上三个指标比较各组药物对脊髓的神经毒性。在药效学研究方面,建立大鼠隐球菌脑膜炎模型,在建模后的第7天开始用AMB凝胶、普通AMB、空白凝胶进行鞘内注射,在造模后的第14天和第21天取脑脊液做脑脊液培养计数和乳胶凝集试验,进行治疗效果的评价。
  结果:
  第一部分,通过对三嵌段聚合物的结构和性能表征,结果显示该聚合物分平均分子量为1790-1500-1790,聚合物的结构分布控制非常好,是理想的产物。其液体-凝胶转变相温度为34℃,25wt%聚合物水溶液课用于医用。载药前后聚合物水溶液的流体力学行为不发生变化,说明AMB对该聚合物水溶液没有影响。
  第二部分,体外缓释结果表明AMB凝胶可以缓慢释放AMB长达36天,2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL三个浓度的AMB凝胶累积释放度分别为89.0%、77.1%、65.6%,AMB缓释数据符合药物缓释的一阶方程(R2>0.95)。
  第三部分,在毒理学实验中,AMB凝胶组大鼠四肢的Tavlor's评分高于普通AMB(P<0.05),AMB凝胶组大鼠的生存率明显高于普通AMB(P<0.05),HE染色结果显示AMB凝胶的脊髓损伤程度较普通AMB轻,以上结果表明AMB凝胶的神经毒性明显低于普通AMB。在药效学实验中,脑脊液培养结果显示AMB凝胶组大鼠脑脊液中菌体数量低于普通AMB组(P<0.05),乳胶凝集试验结果表明AMB凝胶组脑脊液隐球菌抗原滴度数低于普通AMB组(P<0.05),这都说明AMB凝胶的治疗效果优于普通AMB。
  结论:
  PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物水溶液负载AMB所得到的AMB凝胶较普通AMB有较多优势。它能缓慢释放AMB超过30天,体内的抗菌效果优于普通AMB制剂,此外它还能减轻鞘内注射AMB的神经毒性,减少鞘内给药次数,是比较理想的治疗隐球菌脑膜炎的药物,同时也是一种很好的鞘内缓控给药的手段。隐球菌性脑膜炎作为模式疾病,为其它疾病的鞘内缓控给药提供借鉴意义。
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