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[硕士论文] 董其燕
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:恶性肿瘤现已成为我国居民的主要死亡原因。转移是恶性肿瘤难治、易复发的主要原因,其中肿瘤脑转移是恶性肿瘤转移的最严重后果之一,一旦发生脑转移,预后非常差,5年存活率极低。因此,研究肿瘤细胞脑转移机制对于我国癌症病人来说具有重要意义。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易发生脑转移的三种癌症。本课题旨在应用模式动物斑马鱼,建立用于肿瘤脑转移机制研究的活体模型,并进一步探索肿瘤脑转移的分子机制以及肿瘤细胞外泌体在肿瘤脑转移中的作用。研究结果总结如下:
  1.在血脑屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑马鱼胚胎心包腔部位注射带有红色荧光标记的鼠源性黑素瘤细胞tfRFP-B16-F10,对肿瘤细胞的转移进行检测和统计:胚胎存活率、注射部位含有肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。同时我们选取移植后的幼鱼进行活体成像实验,实时观察肿瘤细胞突破血脑屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)进入脑组织的过程,我们发现肿瘤细胞是通过不断地变形穿过脑内皮细胞间隙进入脑实质,在脑内皮细胞间紧密连接出现以后,肿瘤细胞的脑转移率大大降低,而紧密连接正是血脑屏障实现其功能的主要一部分,因此,我们得出结论:血脑屏障在抑制肿瘤细胞脑转移的过程中发挥了重要作用,另外,通过对发生脑转移2d后的斑马鱼幼鱼进行长时程转盘共聚焦拍摄,我们发现脑转移的肿瘤细胞沿着血管壁扩增延伸,细胞集群不断扩大,这与之前文献报道的脑转移生长情况相符,而且通过本部分实验,我们成功建立了研究肿瘤脑转移的斑马鱼模型。
  2.在血脑屏障开始形成后即3dpf的斑马鱼幼鱼心包腔部位注射3-D纤维软胶培养富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性细胞和普通培养的tfRFP-B16-F10肿瘤细胞,分别统计注射不同培养肿瘤细胞的胚胎存活率、注射部位肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。数据统计结果表明3-D纤维软胶培养的高致瘤性细胞无论是总体转移率还是脑转移率都要高于普通培养瓶培养的肿瘤细胞。因此,高致瘤性细胞的转移潜能更强。另外,我们利用荧光显微镜连续观察同一条幼鱼体内转移的肿瘤细胞,可以很明显的观察肿瘤细胞在转移部位的生长。
  3.外泌体是30-100um的囊泡结构,在肿瘤细胞转移过程中起重要作用,然而对于其作用机制的了解还不全面,因此我们拟利用本课题所建立的肿瘤脑转移斑马鱼模型研究外泌体促进脑转移的分子机制。我们利用DiI荧光染料使体外提取的外泌体带上红色荧光,将DiI-exosomes注射进2dpf的斑马鱼胚胎心包腔部位,利用转盘共聚焦显微镜观察外泌体与血脑屏障脑内皮细胞间的相互作用,我们发现外泌体可以被绿色荧光标记的脑微血管内皮细胞吸收,并且红色荧光与脑内皮细胞的绿色荧光存在共定位长达4h甚至更长,结果说明外泌体与脑内皮细胞间存在相互作用,而这种相互作用很可能对肿瘤细胞穿过血脑屏障具有重要影响。我们先后尝试了5次tfRFP-B16-F10及其外泌体的共注射以及1次非小细胞肺癌细胞A549及其外泌体的共注射,监测脑转移,并进行统计分析,然而实验结果与预期有较大出入,我们需要探究新的建模方式来构建斑马鱼模型研究外泌体对肿瘤细胞脑转移的影响。
[博士论文] 常继伟
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:如何从大量数据中挖掘出有意义的信息,如何把复杂的研究对象用精确而简明的模型描述出来一直是数据处理工作中的中心课题。针对这个问题有两种截然不同的方法:数据挖掘和复杂网络理论。复杂网络和数据挖掘方法不仅有着相似的研究目的,而且其分析对象在多数情况下也相同。但在实验数据分析中将两者协同应用解决同一问题的情况比较少,主要原因是两者在分析对象上有较多重叠,在多数情况下仅用一种方式就可以解决问题。但实际上,将数据挖掘和复杂网络很好的结合起来解决问题会给数据分析提供新的思路。本研究将复杂网络和数据挖掘相结合,同时用于分析癌症相关基因/蛋白,结果表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。
  对癌症的研究积累了大量而且类型丰富的数据,利用这些数据发现癌细胞中关键的基因及其作用途径一直是重要的研究方向。得益于丰富的数据,癌症领域的数据分析方法也层出不穷,其中结合蛋白质相互作用网络分析基因及蛋白功能的方法是一个重要的类别。在癌症相关的信号传导,细胞定位和表达调控等过程中蛋白质相互作用扮演重要的角色,因此以蛋白质相互作用为基础整合其它组学数据的生物信息方法对分析参与这些过程的关键基因及蛋白至为重要。本研究不仅以人类蛋白质相互作用网络为基础,结合基因表达、基因重要性及基因突变数据优选并分析了癌症相关基因/蛋白和蛋白组合,还利用新的模型将生物网络与组学数据有效的结合起来,为后续分析提供帮助。本文的工作主要包含以下两个方面:
  (1)结合蛋白质相互作用网络和蛋白质、基因的表达数据预测新的癌症相关基因和蛋白质组合。蛋白质相互作用网络是典型的复杂网络,网络中每条边表示一对蛋白质的相互作用关系。表达数据包含基因或蛋白质在癌症组织、癌症细胞系和正常组织的样本中的表达量的信息,比较两类样本可以得到与癌症关联密切的基因或蛋白质。本研究将蛋白质相互作用网络用于构建稀疏的自动编码机,而后用癌症细胞系和正常组织的差异表达数据作为训练数据,训练后的自动编码机同时包含相互作用信息和差异表达信息。将训练得到的自动编码机用于构建一个深层模型,来模拟每个蛋白质/基因敲降对其它蛋白质/基表达的影响,最后将这种影响关系表示为有向网络的形式。蛋白间相互影响的有向网络可以用于鉴定新的癌症相关蛋白。在本研究优选的TOP500个高可信度的癌症相关蛋白中有211个为已知的癌症药物靶点,其余蛋白质的功能与癌症也密切相关。与其它方法相比较该方法有较高的AUC值(>0.8)。蛋白间相互影响的网络也可以用于预测蛋白组合。本文中提到的蛋白组合可以是合成致死组合,也可以是药物靶标的组合。这两类蛋白组合在蛋白相互影响网络中都与特定的蛋白存在密切联系。本研究利用已知的蛋白组合将这组蛋白质识别出来,并用于识别新的蛋白组合。交叉验证表明该策略有较高的准确度(>0.85),可以用于鉴别新的蛋白组合。进一步将该模型用于前列腺癌的单细胞测序数据集,单细胞测序可以检测病患体内癌细胞群体的演化,对临床治疗有重要意义。文中利用前列腺癌的数据集训练模型且计算了相应的蛋白影响网络,然后利用该网络识别了前列腺癌蛋白,其中包含已知的前列腺癌基因。这表明该模型适用于单细胞测序数据和小样本数据,具有良好的应用前景。
  (2)结合蛋白质相互作用网络和基因重要性数据寻找复杂的基因关联关系。在本研究中蛋白质相互作用网络依然表示两个蛋白质间的相互作用关系。基因重要性数据是通过CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)试验方法随机突变细胞系基因组得到,简单来讲基因重要程度越高,可以承受的突变越少。通过比较初始CRISPR随机突变的细胞系和经过一段时间的培养的细胞系间基因组的差异可以得到基因重要性数据。本研究将基因的重要性数据通过新方法转换为蛋白质相互作用的重要性。相互作用的重要性可以用于筛选重要的互作,计算相互作用间的相关性以及重新评估基因的重要性。本研究利用蛋白相互作用的相关性发现了以细胞因子信号通路相关的蛋白互作为核心的网络,为理解细胞因子对其它生物学途径的调控提供了方向。另外用高重要性相互作用构建的子网络包含了关键蛋白质行使功能时的互作信息,为优选关键相互作用提供了新的工具。最后本文利用该方法发现了差异表达基因与高频突变基因之间的关联。
  本研究通过以上的实验表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。两个方法都是以相互作用为基础,在模型构建时同时利用组学数据进行训练,因而可以将两种数据有机的结合在一起。对癌症相关基因/蛋白的分析表明这种结合对分析生物学数据是有帮助的。
[硕士论文] 余今菁
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究结直肠腺癌与腺瘤性息肉患者肠道微生物群落构成变化,探索肠道菌群和结直肠腺癌发生发展间的内在关系。
  方法:选取湖北地区于武汉天佑医院和十堰太和医院消化内科就诊的结直肠腺癌、腺瘤性息肉患者及健康对照人群的粪便样本,应用Illumina Miseq高通量测序平台进行16S rRNA基因V4区测序,采用生物信息学方法分析肠道微生物群落结构、丰度与多样性的变化,筛选与结直肠腺癌发病有显著相关的微生物种属。
  结果:1、本研究最终纳入结直肠腺癌51例,腺瘤性息肉54例,健康对照组42例,组间在年龄、性别上无差异(P>0.05);
  2、测序数据质控后进行OTU分析,共得到1416个OTU,采用稀释曲线、observed species指数、chao指数、shannon指数及simpson指数等Alpha多样性指数进行分析,证实测序量足够覆盖肠道菌群种属,各组样本的丰富度和均匀度良好,随健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化,组内物种多样性呈下降趋势;
  3、在门水平上,三组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门,且样本均表现出明显的个体差异,属水平上三组共包含168个菌属,其中菌群多样性最高的菌属属于厚壁菌门,丰度最高的菌属均来自拟杆菌门;
  4、PCA分析和PCoA分析发现,在结直肠腺癌与健康对照组、腺瘤性息肉与健康对照组间均展现出组间聚类,表明疾病组与对照组间肠道菌群物种多样性存在差异;结直肠腺癌组与腺瘤性息肉组在PCA分析中未表现明显差异,两组菌群构成较为相似;
  5、样品组间菌群构成显著性差异分析发现,门水平上,变形菌门、梭杆菌门相对丰度随健康-腺瘤-腺癌的疾病发展呈升高趋势,厚壁菌门的相对丰度随疾病发展呈降低趋势,厚壁菌门/拟杆菌门比值在CRA组与CRC组中降低;在属水平上,乳杆菌属、消化链球菌属、微单胞菌属、梭菌属、弯曲菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、副球菌属、Morganella菌属、Aggregatibacter菌属、海杆菌属、拟杆菌属、紫单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、Scardovia菌属、奇异菌属、Bulleidia菌属和密螺旋体属的相对丰度在健康、腺瘤、腺癌样本中逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);而罗氏菌属、粪球菌属、Faecalibacterium菌属、Blautia菌属、Anaerostipes菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度在健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化过程中显著降低(P<0.01)。
  结论:肠道菌群与结直肠腺癌及其癌前病变的发生发展存在密切关系,Faecalibacterium菌属、罗氏菌属等丁酸盐产生菌在腺癌及腺瘤性息肉中低表达,弯曲菌属、假单胞菌属、梭形菌属等细菌的丰度变化与癌变过程呈正相关。
[硕士论文] 程小玲
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:目前长链非编码RNA H19对于宫颈癌Hela细胞生物学功能的作用及其作用机制尚缺乏相关研究。本文主要探讨了LncRNA H19在宫颈癌Hela细胞中的生物学功能研究。
  方法:本研究选择在3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)和正常上皮细胞株(H8)中来检测LncRNA H19的表达。构建含H19基因的重组真核表达载体pCDNA3.1-GFP-H19,经双酶切及基因测序等鉴定构建成功,并合成siRNA的LncRNA H19干扰序列,同时设置空白对照组、pCDNA3.1-GFP组及si-NC组。各组细胞转染48h后采用RT-qPCR法检测LncRNA H19mRNA相对表达水平;采用CCK-8法检测在转染后24h、48h、72h及96h细胞的增殖率;采用流式细胞仪分别检测各组24h和48h细胞凋亡率;采用细胞划痕实验检测各组细胞转染后的迁移数,评估细胞迁移能力;采用Transwell细胞体外侵袭实验检测各组细胞转染后的侵袭能力;采用Western blotting的方法检测LncRNAH19对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达。
  结果:3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)中LncRNA H19的表达明显高于正常上皮细胞株(H8)中LncRNA H19的表达。首先,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外增殖和抑制其凋亡,沉默LncRNA H19可以显著抑制Hela细胞体外增殖和促进其凋亡。其次,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外迁移、侵袭,沉默LncRNA H19可以抑制Hela细胞体外迁移、侵袭,该效应直接与EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达相关。
  结论:上调LncRNA H19可以显著促进宫颈癌细胞增殖和抑制宫颈癌细胞凋亡,下调LncRNA H19表达则反之;上调LncRNA H19促进宫颈癌细胞迁移、侵袭,下调LncRNA H19表达则反之,同时可以引起EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达发生改变。LncRNAH19在宫颈癌的发生、发展及预后中充当了重要角色,有可能作为一个发现及判断其预后的潜在生物标记物。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[硕士论文] 司秀花
计算机科学与技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:前mRNA剪接是一种复杂且无处不在的核过程,它是基因表达中引起致癌错误的天然来源。此外,过去20年来的许多研究报道了在没有基因组突变的情况下癌症特异性的选择性剪接。受影响的蛋白质包括转录因子,细胞信号转导子和细胞外基质的组分。针对癌细胞上可选剪接产物的抗体目前正在进行临床试验,跨越选择性剪接区域的竞争性逆转录PCR被用作简单的诊断测试。除了与癌症相关之外,替代基因产物的性质通常与癌症中的积极作用一致;因此,可变剪接过程本身就是基因治疗的潜在目标。因此本文的主要工作如下:
  (1)随着大量DNA序列的快速增长,基因预测已成为生物信息学的一个难题。剪接位点预测在基因鉴定中起关键作用。因此,开发提高剪接点预测精度的新方法具有重要意义。通过将RF与三种最新的编码方法(MM1,MM2和MCM)相结合,我们证明了所提出的方法与基于SVM的方法执行大致相同并且通常更好。此外,所提出的方法简单,快速,易于使用并且可以应用于大规模人类基因组数据以鉴定剪接位点。作为未来的研究,这些方法也可用于鉴定其他调控区域,如翻译起始位点和启动子。
  (2)尽管已知的可变剪接事件的目录从此一直在增长,但在疾病情况下或在大量人群中工作时,通常会观察到新的异构体。鉴于完整同种型的鉴定在技术上是具有挑战性或昂贵的,将重点放在单剪接事件上作为转录组特性的替代物对于广泛的分析是富有成效的。我们提供SplAdder,一种基于RNA-Seq数据的大规模分析选择性剪接事件的新方法。SplAdder已成功应用于各种生物体的拼接分析,与其他各种先进方法相比,显示出高度的整体准确性,并可轻松应用于数千个样本的数据集。我们正在努力进一步改进SplAdder,以便本机处理高性能计算集群并生成更多交互式可视化。
  (3)我们已经鉴定出许多在正常和癌性组织之间差异剪接的基因。大多数实验验证的组织特异性选择性剪接事件发生在涉及细胞骨架结构,细胞外基质或细胞-细胞相互作用的基因中。这些事件中的一些报道了以组织特异性方式发生的剪接变体,并且可能由于结肠上皮和平滑肌细胞去分化而代表组织功能的丧失而不是帮助转化或转移。确定这些剪接事件的作用需要更详细的研究,但在大多数情况下,这些基因以前与肿瘤进展中的活性作用有牵连。
[博士论文] 耿朝辉
护理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  本课题立足于体力活动(Physical Activity,PA)对乳腺癌患者化疗期及长期康复产生的积极作用,旨在充分了解乳腺癌患者化疗期体力活动水平与亚人群特质,获悉患者体力活动纵向变化轨迹的前提下,结合乳腺癌患者及医务人员对体力活动的体验及认知,初探乳腺癌患者化疗期体力活动规律,基于此,构建乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案,并完成干预依托的移动手机应用程序(Application,App)开发,进而检验其干预效果,以期达到增强患者活动意识,改善体力活动行为现状,进一步提升患者化疗期体验,提高生活质量的目的。
  研究方法:
  本研究共分为三部分:
  1、乳腺癌患者化疗期体力活动规律的研究
  (1)乳腺癌患者化疗期体力活动的现状调查及人群特质研究
  基于前期文献及理论研究,确立横断面研究纳入的变量,进而对435名乳腺癌患者进行问卷调查,了解其化疗期体力活动水平现状,并通过潜在类别分析(Latent Class Analysis,LCA)探究患者体力活动行为的亚人群特征。
  (2)乳腺癌患者化疗期体力活动纵向变化轨迹的研究
  采用纵向研究设计,分别对153名乳腺癌患者化疗前、化疗第一疗程后、化疗6周后及化疗3个月后T1-T4四个时间点体力活动进行问卷调查,运用增长混合模型(Growth Mixture Model,GMM)识别样本子总体的体力活动随时间变化的不同轨迹类型。
  (3)乳腺癌患者及医务人员对化疗期体力活动体验与认知的质性研究
  采用质性研究方法,分别对18名乳腺癌患者及14名医务人员进行质性访谈,了解患者化疗期体力活动的体验,并探究医务人员对化疗期体力活动的认知,收集体力活动相关临床照护实践经验,探究影响体力活动的有益因素或阻碍,进而探讨开展体力活动移动干预的必要性及可操作性建议。
  2、基于体力活动规律的乳腺癌患者化疗期移动医疗干预方案的构建
  基于前期挖掘出的化疗期体力活动规律,在社会认知理论、自我效能理论、计划行为理论的框架指导下,结合文献研究起草体力活动干预文稿及配套管理方案,召开专家工作组会议并进行专家一对一咨询,修订并确定干预方案的细节、后期技术开发要点,最终确立干预方案终稿。
  3、基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与应用
  (1)基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与测试
  依据前期阶段性研究结果明确的乳腺癌患者移动医疗干预需求,应用敏捷开发模式,由技术人员与研究者通力合作进行iOS系统、Android系统及PC端后台数据管理系统的研发与测试。3名研究人员在开发过程中对不断交付的分模块进行功能检测,软件开发完成后纳入4名乳腺癌患者对App测试版进行功能测试并完成研究后系统可用性评估问卷调查及反馈,对应用程序进行初步评价。
  (2)基于App的乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案的适用性检验
  以成功研发的“乳腺康”手机应用程序为主要技术手段,采用混合研究方法,对20名乳腺癌化疗期患者开展为期三个月的体力活动干预,对移动医疗干预方案进行适用性检验,通过量性研究确认该方案对提升乳腺癌患者化疗期体力活动水平的作用效果,通过质性访谈了解患者对干预方案及App使用的感受及体验。
  研究结果:
  1、乳腺癌患者化疗期体力活动规律的研究
  (1)乳腺癌患者化疗期体力活动的现状调查及人群特质研究
  横断面调查结果显示乳腺癌患者化疗期总体力活动平均水平为1441.94±1880.703MET-min/w,每周静坐时间约为5小时,完全静坐人数达43.7%,研究对象中仅有15例有重体力活动,176例报告了有中等体力活动,总体体力活动达标人数为40.9%。LCA结果显示研究对象被识别为三类亚人群:体力差、睡眠情绪障碍组(N=69),体力中低等、疲乏组(N=108)与体力中低等、无明显症状组(N=258)。
  (2)乳腺癌患者化疗期体力活动纵向变化轨迹的研究
  153名乳腺癌患者化疗期T1-T4体力活动纵向数据描述性结果显示,除T4外,患者的T1-T3体力活动三个时间点的总体力活动平均水平均比横断面调查平均水平低,T2即化疗第一疗程结束后,体力活动水平下降至最低水平。该样本体力活动等级水平分类结果显示:T1与T2时间点静坐人数比例最大,分别占到44.7%与68.8%;T3与T4时间点体力活动活跃者人数比例较大,分别为44.4%与56.8%。增长混合模型将该人群识别为两类:类别1(N=99)的个体体力活动起始值较高同时随时间总体呈上升趋势;类别2(N=54)的个体体力活动值起始较低在化疗第一疗程下降至最低点,随即缓慢上升。
  (3)乳腺癌患者及医务人员对化疗期体力活动体验与认知的质性研究
  通过对18名乳腺癌患者的质性访谈分析得出四个主题:化疗扭转生活常态,体力活动动机不足;治疗相关副作用应接不暇,体力活动步履维艰;躯体心智遇折磨,社交经济遭挑战;化疗适应促成长,社会支持添动力。通过对14名医务工作者的质性访谈分析得到的主题如下:患者体力活动需求凸显,潜在益处逐步感知;体力活动相关指导匮乏,连续专业性照护支持待加强;推荐个性化安全的体力活动干预,多角度增强患者依从性及参与度。
  2、基于体力活动规律的乳腺癌患者化疗期移动医疗干预方案的构建
  经专家工作会议及专家一对一咨询后确立的干预方案终稿包含以下内容:拟实现的干预目标、干预核心内容、其它干预要素(干预时间、地点、对象、手段、流程、策略及效果评价工具等);确立的软件开发功能要点包括移动用户终端及后台数据管理平台两部分。
  3、基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与应用
  (1)基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与测试
  经过三名软件工程师系统开发及研究者与用户的多轮软件测试及修正,“乳腺康”手机应用程序客户端最终锁定为以下五个主页面:首页、日历、圈子、运动、个人中心。后台数据管理系统可实现用户管理、知识库管理、动态管理、评论管理、短信发送、数据Excel导出等功能。4名乳腺癌患者就App的系统有用性、信息质量、界面质量与总体评价等方面做出初步评价,问卷测评得分分别为4.5,4.33,4.78与4.5。
  (2)基于App的乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案的适用性检验
  纳入干预的20名研究对象,有12名患者表示其运动习惯或兴趣为散步或快走,根据其基线测评结果进行群组差异化干预,分为活跃组(N=12)及静坐组(N=8)。三个月后观察结果显示,用户累计使用App的时间平均每人每周达40min,每人每周登录App的次数为3次。量性研究结果表示患者的总体体力活动有所改善,总体体力活动平均增长了945.70MET-min/w。干预前后患者在交通有关、闲暇时间、步行及总体力活动水平有统计学差异。质性研究结果提示患者对干预方案及App的认可度高,在有用性及易用性方面评价较好。
  研究结论:
  乳腺癌患者化疗期体力活动总体水平偏低,体力活动达标人数严重不足;横断面调查识别出的体力活动三组潜类别人群、纵向研究探究到的两组潜类别发展轨迹,合并患者及医务人员的质性访谈共同为构建乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案提供依据与理论支撑,该方案对促进患者化疗期体力活动行为的改变,提高其活动意识、改善化疗期体验具有重要作用,研发的手机App具有较高的接受度,易用性、可用性及有效性效果突出。
[博士论文] 王蒙蒙
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:原发性肝癌是目前威胁人类健康的主要恶性肿瘤类型之一。在我国,肝癌的发病率处于所有恶性肿瘤的第四位,死亡率位居第三位。由于大部分患者确诊时肿瘤已处于中晚期,手术治疗后复发率、转移率高,因而远期生存质量差,五年生存率低。早期诊断、早期干预对肝癌患者的预后改善至关重要。血清甲胎蛋白(AFP)是目前最常用的肝癌诊断标志物。但其敏感性仅为60~70%,且在部分肝脏良性疾病中表达上升,诊断效能不能满足临床需要。因此,寻找更加理想的生物标志物或多参数诊断模型是肝癌诊疗研究的重要方向。此外,对于影响肝癌预后的重要病理因素,采用血清无创性检测方法做出预测,对患者的个体化诊疗和临床医生治疗方案的制定具有重要价值。
  既往的肿瘤生物标志物研究主要集中在蛋白及核酸研究中,忽略了糖链或聚糖这类重要的生物大分子。糖链通过共价结合的方式连接在蛋白多肽骨架的特定氨基酸上的过程称为蛋白质糖基化。N-糖基化和O-糖基化是两种主要的糖基化类型。人体内大约70%的蛋白质是糖蛋白。糖基化是最常见、最复杂的蛋白质翻译后修饰形式,对蛋白的结构和功能具有重要的调节作用。糖链的功能涉及细胞粘附、细胞间相互作用、信号转导、免疫调节等一系列生物学过程。大量研究表明:聚糖直接参与了人类几乎所有重大疾病包括肿瘤的病理生理学过程。因此,对糖科学知识的了解为疾病相关的基础和临床研究提供了一个新的角度,糖组学、糖蛋白质组学、糖生物学逐渐受到关注。目前临床使用的肿瘤标志物大部分是糖蛋白,包括AFP、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)等。研究癌症相关的特征性糖链对肿瘤的诊断、病程监测、预后评估及靶向治疗具有重要价值。但是糖链的复杂性及多样性为相关结构与功能研究带来巨大挑战,糖科学的发展远远落后于基因组学及蛋白组学。
  本研究采用目前主流的糖基化研究技术包括质谱、毛细管电泳等对血清特定蛋白来源的N-糖链、总血清池N-糖链结构进行分析,探究其对肝癌的诊疗价值。尝试建立位点特异的N-糖肽分析方法,对糖基化的微观不均一性进行表征。同时,通过转录组测序对异常糖基化相关的调控机制进行初步探索。
  第一部分:血清IgG来源的N-糖链结构分析及其在原发性肝癌中的诊断价值研究
  本部分采用基于基质辅助激光解吸电离-质谱的分析方法对对不同病因来源的肝细胞癌(HCC)、肝硬化(LC)患者血清中IgG来源的糖链进行鉴定与比较。结果表明:肝癌发生过程中,血清IgG上主要的糖链结构会发生改变。总体上,与LC患者相比,HCC患者血清IgG上N-糖链的半乳糖基化水平呈下降趋势。不同的糖链结构在HCC和LC中是否存在显著性差异与病因学因素有关。对于HCV相关的HCC患者,部分糖链结构与临床病理指标如肿瘤大小、TNM分期等存在相关性。此外,血清IgG来源的N-糖链对HCC特别是AFP阴性的HCC患者具有重要的补充诊断价值。
  第二部分:血清蛋白N-糖谱与HBV相关HCC患者临床病理特征的相关性研究
  本部分采用快速、高通量的DSA-FACE技术对HBV相关的HCC患者血清蛋白N-糖表达谱进行分析,并探讨与临床病理指标间的关系。结果表明:血清聚糖结构的丰度与微血管侵犯(MVI)、肿瘤大小、门静脉癌栓(PVTT)、肝硬化、分化情况等重要的临床病理因素具有相关性。同时,尽管N-糖结构和相应的诊断模型对MVI的预测能力并不理想,但其诊断效能并不低于经典的标志物AFP。通过病例随访及数据分析发现,Peak12(NA4Fb,含一个分支岩藻糖的四天线聚糖结构)是患者术后复发的独立危险因素,Peak9'(NA3F,核心岩藻糖基化的三天线聚糖结构)、Peak12是术后死亡的独立危险因素。
  第三部分:基于LC-MS的位点特异的N-糖肽分析方法研究
  本部分以血清Alpha-1抗胰蛋白酶(A1AT)和纤连蛋白(Fibronectin)为研究靶蛋白,采用液相色谱-质谱技术探索建立血清糖蛋白位点特异的N-糖肽分析方法,实现对A1AT和Fibronectin糖基化的微观不均一性的表征。同时,采用免疫沉淀的方法纯化HCC和LC患者血清A1AT并进行位点特异的N-糖肽分析,发现三种差异糖肽结构,为更加精确的揭示肿瘤发生发展过程中蛋白的糖基化异常提供参考。
  第四部分肝癌细胞株(SMMC-7721)中Alpha-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)的敲除及转录组测序
  本部分在肝癌细胞株SMMC-7721中对核心岩藻糖结构形成的关键酶Alpha-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)进行敲除及验证。同时,对敲除前后的细胞采用Illumina Hiseq平台进行转录组测序,采用荧光定量PCR对测序数据进行验证。通过生物信息学分析对211个差异基因的功能进行注释并对涉及的主要信号通路(PI3K/AKT通路等)进行富集,为肝癌异常糖基化调控的分子机制研究提供线索。
  综上,本课题综合采用多种研究方法,在多个层面对血清特定蛋白的N-糖链、血清总蛋白N-糖表达谱及完整的N-糖肽进行分析,寻找与肝癌相关的异常糖基化结构,为糖科学在肿瘤临床诊疗中的应用提供依据。此外,通过转录组测序对异常糖基化的调控网络进行了初步探索,相关机制还需要进一步研究。
[博士论文] 陈昕
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景和目的:
  原发性肝癌是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,其中,肝细胞性肝癌(Hepatocellular Carcinomas,HCCs,简称肝癌)是最常见的原发性肝恶性肿瘤的类型之一,它在男性恶性肿瘤中死亡率中位居第二位。我国是乙肝高发区之一,肝癌患者占世界一半以上。但是,由于HCC早期在临床上无特征性表现,就诊时往往已是中晚期。肝癌最有效的治疗手段是根治性切除,但是目前根治性切除率较低,这是肝癌预后差的主要原因之一。因此,肝癌的早期预警和早期干预有着重要的意义,进一步深入研究肝癌早期发生的分子机制以及早期诊断的改进显得尤为重要。
  其中,肿瘤早期发生很可能受到ceRNA的调控。“ceRNA假说”于2011年被提出后,研究人员从生物信息学、细胞生物学和动物模型等不同水平验证了该假说。ceRNA分子,比如mRNA,lncRNA、假基因等,被认为能够通过microRNA(miRNA)应答元件(MicroRNA Response Element,MRE)竞争结合相同的miRNA来行使调节各自表达水平的作用。基因转录后调控得到了ceRNA假说的补充,在肿瘤等疾病发生发展中提供了转录组研究的新思路。环状RNA是ceRNA家族新成员,不同于线性RNA,环状RNA没有5'末端帽子结构和3'末端多聚腺苷酸(poly A)尾巴结构,而是以共价键形成首尾相连的闭合环形结构,天然并于广泛存在于不同种族的真核细胞系中。最近,一些circRNA已被证明含有多个保守的miRNA结合位点,可以调控基因的表达,肿瘤的发生和发展过程受到这些表观遗传学上的改变的调控。所以,深入研究HCC发生发展过程中重要信号通路以及节点分子的表达谱,将极大地促进HCC早期诊断及治疗手段的发展,具有较高的科研价值。
  近年来大量非编码RNA,特别是miRNA和长链非编码RNA(Long non-codingRNA,lncRNA),在肝癌生物学功能调控以及肝癌临床诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。近年来环状RNA的发现与进一步认知,丰富了转录后翻译水平调控家族。越来越多互相作用、互相影响并且在幕后控制分子修饰与表达的环状RNA分子参与了转录后翻译水平的调控。目前,研究已发现并证实circRNA参与多种肿瘤细胞生物学功能的调节,包括结直肠癌、食管鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌和基底细胞癌等等。环状RNA表达失调与多种恶性肿瘤相关,在不同肿瘤类型中,环状RNA可能起到抑癌基因或是癌基因的作用。但是,目前环状RNA参与调控肝癌早期发生及分子机理方面的报道甚少,肝癌早期相关环状RNA表达谱仍需要深入的研究。
  在本研究中,利用环状RNA芯片,我们对比了10对极早期(BCLC0期)肝癌与配对癌旁新鲜组织环状RNA表达谱,并通过大样本定量检测从早期肝癌样本中筛选与早期肝癌发生相关的环状RNA,建立肝癌早期发生表型相关特征环状RNA谱,最终选取肝癌组织比癌旁组织升高表达最显著的环状RNA Circ-0008285作为候补circRNA,探讨其作为早期肝癌发生独立预警分子和治疗靶点的应用价值。
  基于以上背景,我们系统研究了环状RNA Circ-0008285这一与HCC早期发生相关的特异性环状RNA在肝癌起始过程中的作用,发现其可以通过竞争性结合miR-892a上调肝癌细胞中miR-892a的靶基因HDGF表达,从而促进HCC的发生,为预测HCC提供了新思路、新方法和早期肝癌潜在治疗靶点。
  方法:
  1.通过生物芯片筛选,建立肝细胞癌差异表达circRNA谱,确定重点研究circRNA,利用RT-PCR的方法,结合临床大样本筛选鉴定并规模验证肝癌早期发生相关差异circRNA;
  2.选取肝癌比癌旁升高表达最显著的环状RNA Circ-0008285作为候补circRNA,进行后续功能验证;
  3.设计反向扩增PCR引物,产物扩增回收后结合一代测序技术明确Circ-0008285成环形式及成环序列的具体核酸信息,确认其来源母基因;
  4.荧光定量PCR检测现有10种肝癌细胞系(SMMU7721、Huh7、HepG2、HCCLM3、PLC/ARF5、97H、97L等),2种相对正常肝细胞系(L02和QSG7701)和2种免疫细胞系(THP-1和U-937)中Circ-0008285的表达水平,分别确定两株高低表达Circ-0008285的肝癌细胞系用于功能分析;
  5.通过慢病毒表达系统构建环状RNA Circ-0008285的干扰和过表达细胞系,并检测干扰和过表达的效果;
  6.通过细胞核质分离实验,确认环状RNA Circ-0008285在细胞中的定位,并根据其具体定位进行相应的功能学实验;
  7.分别对Circ-0008285高表达细胞系使用干扰慢病毒、对Circ-0008285低表达细胞系使用过表达慢病毒,观察干预Circ-0008285后细胞干性、增殖表型的变化;
  8.使用上述干预手段预处理干扰Circ-0008285细胞系,通过体外以及体内有限稀释实验,研究Circ-0008285对肿瘤发生过程的影响;
  9.通过RT-PCR及Western Blot技术检测干扰和过表达环状RNA Circ-0008285后对其母基因线性转录本表达是否具有影响;
  10.结合生物信息学分析可能与Circ-0008285相互作用的miRNA,使用RNA Pulldown实验确定预测的miRNA是否与Circ-0008285发生相互作用;
  11.利用建立的环状RNA Circ-0008285稳定干扰肝癌细胞系(HC CLM3)进行mRNA芯片分析筛选,以期验证在肝癌细胞中哪些理论上的miRNA靶基因的表达受到Circ-0008285的调控;
  12.使用荧光定量PCR、Western Blot和目的基因3'非翻译区报告双荧光素基因质粒确定Circ-0008285调控关键节点基因的主要方式;
  13.通过生物信息学分析的与Circ-0008285相互作用的miRNA潜在靶基因中寻找可能调节关键信号通路活性的分子,干扰或过表达后通过干性表型分析确认Circ-0008285是否通过竞争性吸附miRNA、恢复相应基因表达水平、调节细胞增殖、干性表型;
  14.通过Western Blot实验技术研究Circ-0008285引起的信号通路分子活性改变,确认这些信号通路是否参与Circ-0008285调控的肝癌早期发生过程;
  结果:
  1.完成10对极早期肝癌与配对癌旁新鲜组织circRNA异常表达分析,选取癌比癌旁升高表达最显著的Circ-0008285作为目标研究对象。
  2.大样本验证Circ-0008285在极早期和早期肝癌组织中表达情况,发现Circ-0008285在极早期和早期肝癌组织中普遍比相对应的癌旁组织中表达升高。
  3.Circ-0008285在肝癌细胞系中普遍表达较高,并主要分布于细胞质中,可以竞争性结合miR-892a,行使miRNA海绵的作用,影响其下游基因HDGF的表达。
  4.Circ-0008285可以促进细胞的自我更新和增殖。
  5.Circ-0008285在体内及体外均能够促进肝癌细胞的干性表型和肿瘤生长。
  6.Circ-0008285可升高肝癌细胞中HDGF的表达,增强其与膜受体NCL相互作用,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。
  7.Circ-0008285可升高肝癌细胞中HDGF的表达,增强其与膜受体NCL相互作用,激活PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin通路,促进β-catenin的核转位。
  结论:
  本研究通过不同临床分期的肝癌及配对癌旁样本和不同的肝癌细胞系的表达验证实验,证实在早期肝癌中环状RNA Circ-0008285的表达异常升高。环状RNACirc-0008285可以作为miRNA海绵竞争性地结合miR-892a,促进miR-892a下游靶基因HDGF的表达升高。HDGF作为分泌性肝癌相关癌蛋白与其受体NCL结合后进入胞内,激活PI3K/AKT/mTOR通路以及PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路,提高了EPCAM+的肝肿瘤起始细胞比例,并促进了肝癌细胞的自我更新和增殖,最终促使了肝癌的发生。这些是Circ-0008285实现对肝癌发生的重要调节机制。综上所述,本研究结果提示环状RNACirc-0008285是HCC早期诊断以及治疗的潜在干预靶点。
[硕士论文] 黄晓培
公共卫生 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)是目前应用最为广泛的新型纳米纤维材料,在纤维特征和暴露方式上与石棉极其相似,故其对人体能否产生与石棉类似的危害效应受到高度关注。现有研究表明,MWCNTs能诱导动物间皮瘤(2017年被国际癌症研究机构列为2B类致癌物),对人类具有巨大的潜在威胁,但其作用机制不明;中国是MWCNTs的生产和消费大国之一。所以,研究MWCNTs致胸膜间皮瘤的分子机制,可为更准确地评价其安全性,制定有效防治措施提供科学依据,无疑具有重要的科学意义和实际意义。
  MWCNTs的炎性诱导作用是其目前较公认的主要毒效应机制之一,慢性炎症是石棉致胸膜间皮瘤发生发展中的重要因素,胸膜腔持续的慢性炎症也是MWCNTs致小鼠胸膜腔间皮瘤的显著特征。所以,慢性炎症在MWCNTs致胸膜间皮瘤过程中起什么作用,是通过何种途径实现,成为阐明MWCNTs致胸膜间皮瘤分子机制的关键问题。但目前对慢性炎症在MWCNTs致胸膜间皮瘤作用机制研究中,存在以下问题:(1)动物实验均采用高剂量、一次性注射的给药方式。MWCNTs致胸膜间皮瘤是一个长期、低剂量持续作用过程,一次性注射在暴露途径和暴露剂量上无法模拟MWCNTs的真实暴露情况。(2)体外实验多采用单细胞培养,无法模拟胸膜腔内的细胞环境。认为只有基于真实暴露剂量和暴露环境的实验体系,才有可能阐明MWCNTs致间皮瘤的分子机制。
  本研究采用低剂量、长期染毒的作用模式,通过人胸膜间皮细胞和巨噬细胞共培养体系探讨慢性炎性反应在MWCNTs致胸膜间皮细胞恶性转化中的作用及其分子机制,以期为纳米材料从业人员的职业安全防护提供科学依据,为间皮瘤的治疗提供新的思路和借鉴。
  方法:
  本实验分为四组,人胸膜间皮细胞组、巨噬细胞+人胸膜间皮细胞组、MWCNTs+人胸膜间皮细胞组和MWCNTs+巨噬细胞+人胸膜间皮细胞组;MWCNTs的终浓度为0.1μg/mL;作用时间为3个月;利用以下实验进行研究:
  1.通过扫描电镜和透射电镜来考察受试MWCNTs的纤维特征是否符合“病理性纤维”的前提条件;
  2.通过比较不同组别间细胞因子的表达量变化,考察MWCNTs是否能诱导炎性反应以及间皮细胞与巨噬细胞之间的相互作用;
  3.通过细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、克隆形成实验、染色体畸变实验和动物成瘤实验,考察炎性细胞在MWCNTs致人胸膜间皮细胞恶性转化中的作用;
  4.通过转录组测序技术筛选MWCNTs致人胸膜间皮细胞的恶性转化中相关候选基因;并用qRT-PCR及western blot实验技术对候选基因进行验证,提出可能的分子作用机制;
  5.构建候选基因稳转敲低的胸膜间皮细胞株,在MWCNTs作用下与巨噬细胞共培养后,通过比较不同组别之间细胞增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力,考察候选基因在MWCNTs致间皮细胞恶性转化中的作用;
  6.构建候选基因稳转敲低的间皮细胞株,通过western blot技术检测候选基因敲除的间皮细胞+MWCNTs+巨噬细胞体系中间皮细胞的蛋白表达含量,确定基因之间相互作用关系。
  结果:
  通过以上实验,得到了如下结果:
  1.本实验所用的MWCNTs平均长度范围为10-20μm,管径范围为30-50nm,符合病理性纤维的特征。
  2.MWCNTs作用于巨噬细胞可引起IL-1β细胞因子表达的显著改变;巨噬细胞与间皮细胞之间存在密切联系:MWCNTs作用于巨噬细胞所分泌的IL-1β能显著增强间皮细胞IL-8、TNF-α和IL-6等炎性因子的释放。
  3.在低剂量MWCNTs的长期作用下,体外培养的间皮细胞染色体畸变增加;MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中,间皮细胞染色体畸变率均高于其它组,差异具有统计学意义;此结果表明,低剂量的MWCNTs体外长期作用于间皮细胞可使其染色体畸变有增加的趋势,巨噬细胞可能对MWCNTs致染色体畸变效应具有促进作用;
  4.在低剂量MWCNTs的长期作用下,体外培养的间皮细胞发生恶性转化;MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中,间皮细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力均明显高于其它组,差异具有统计学意义;此结果表明:巨噬细胞对MWCNTs致间皮细胞的恶性转化作用具有明显的促进作用。
  5.皮下接种MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中间皮细胞的裸鼠,其肿瘤体积和成瘤组织中细胞的Ki67阳性率明显高于其它组,差异具有统计学意义;此结果提示与巨噬细胞共培养后的间皮细胞恶性转化程度更高。
  6.通过转录组测序,筛选出一系列差异表达基因;结合前部分的研究结果,认为其中NF-κB(p65),IL-6,STAT3基因与MWCNTs致间皮细胞恶性转化关系最为密切;qRT-PCR及western blot实验结果显示,MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中间皮细胞的NF-κB(p65),IL-6,STAT3基因和蛋白质表达量均明显升高,与其他组比较差异具有统计学意义。以上结果提示:NF-κB(p65),IL-6,STAT3基因在MWCNTs致胸膜间皮细胞恶性转化中发挥作用。
  7.间皮细胞(sh-p65or sh-IL-6R or sh-STAT3)+MWCNTs+巨噬细胞共培养体系中,间皮细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力均明显低于间皮细胞(sh-NC)+MWCNTs+巨噬细胞组,差异具有统计学意义;此结果证明,NF-κB、IL-6、STAT3在MWCNTs致胸膜间皮细胞恶性转化中发挥重要作用。
  8.间皮细胞(sh-NC or sh-p65or sh-IL-6R or sh-STAT3)+MWCNTs+巨噬细胞共培养体系中,敲低NF-κB(p65)后,IL-6、STAT3蛋白水平表达量均降低;敲低IL-6R后,NF-κB蛋白水平表达量不变,STAT3蛋白表达量降低;敲低STAT3后,NF-κB(p65)、IL6R蛋白表达量均不变。此结果表明在MWCNTs致胸膜间皮细胞的恶性转化中存在NF-κB/IL-6/STAT3分子级联,且NF-κB/IL-6/STAT3通路具有重要作用。
  结论:
  通过上述研究,得出了以下结论:
  1.MWCNTs刺激巨噬细胞所分泌的以IL-1β为主的细胞因子能显著增强间皮细胞炎性因子的释放;
  2.在低剂量MWCNTs的长期作用下,体外培养的人胸膜间皮细胞可发生恶性转化;
  3.炎性反应可显著促进MWCNTs致人胸膜间皮细胞的恶性转化作用
  4.NF-κB/IL-6/STAT3分子通路在炎性反应促MWCNTs致人胸膜间皮细胞的恶性转化中发挥重要作用。
[博士论文] 丁凯
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本课题即着重于研究表达SOX9的肝细胞和SOX9基因在肝细胞癌发生中的作用,并进一步探究其机制。
  方法:
  一、小鼠原发性肝细胞癌模型诱导
  为明确SOX9对肝癌发生的影响,本研究共使用三种方法诱导小鼠发生原发性肝细胞癌,并选择不同时间点处死小鼠。
  二、探究小鼠原发性肝癌是否来自表达过SOX9的肝细胞
  1、Sox9-Flp/Ai65D小鼠的构建
  利用基因打靶技术,将IRES-Flp-polyA基因敲入到SOX9第3外显子后的终止序列和UTR之间,建立Sox9-Flp小鼠。将该品系小鼠与受Flp和Cre双酶调控的红色荧光蛋白TdTomato(TdTom)示踪小鼠Ai65D小鼠杂交,抽提鼠尾DNA,普通PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳,鉴定其基因型,获得双基因杂合小鼠即可用于示踪实验。
  2、Sox9-Flp/Ai65D小鼠肝脏中TdTom的表达情况检测
  Sox9-Flp/Ai65D小鼠经尾静脉注射特异性作用于肝细胞的腺相关病毒AAV8-TBG-Cre后,将肝脏中表达过SOX9的肝细胞标记为红色荧光阳性。
  3、Sox9-Flp/Ai65D小鼠示踪肝癌细胞的起源
  AAV8-TBG-Cre处理Sox9-Flp/Ai65D小鼠,并按照上述STZ-HFD和DEN×1次的造模方式,诱导小鼠发生肝癌,检测肝癌细胞表达TdTom的情况。
  三、肝脏特异性敲除SOX9在肝癌发生中的作用
  1、Sox9LKO小鼠肝脏中SOX9表达情况的检测
  将Sox9f/f小鼠与白蛋白驱动Cre重组酶表达的Alb-Cre小鼠杂交获得肝脏特异性敲除SOX9的Sox9LKO小鼠。提取Sox9f/f和Sox9LKO两组小鼠肝脏组织蛋白,Western blotting检测肝脏组织中SOX9的表达量;免疫组化检测肝组织中SOX9的原位表达情况。
  2、观察肝脏特异性敲除SOX9对小鼠肝癌发生的影响
  选择对照组Sox9f/f小鼠和肝脏特异性敲除SOX9的Sox9LKO小鼠,按上述三种方式诱导小鼠发生肝癌。在不同时间点处死小鼠,观察小鼠肝癌发生率,肿瘤数量和肿瘤大小等。检测两组小鼠血清中肝功能指标,并对两组小鼠肝组织进行组织病理学分析。
  四、肝细胞特异性敲除SOX9在肝癌发生中的作用
  1、Sox9HKO小鼠肝脏中SOX9的表达情况的检测
  腺相关病毒AAV8-TBG-Cre处理雄性Sox9f/f小鼠后,特异性敲除肝细胞Sox9基因获得Sox9HKO小鼠,对照病毒AAV8-TBG-Control处理的Sox9f/f小鼠为对照小鼠。STZ-HFD造模后,分离小鼠原代肝细胞,提取mRNA和蛋白。RT-PCR和Western blotting检测两组小鼠SOX9的表达。
  2、肝细胞特异性敲除SOX9对肝癌发生的影响
  选择雄性Sox9f/f小鼠经AAV8-TBG-Cre或AAV8-TBG处理后,获得Sox9HKO小鼠和对照小鼠,以STZ-HFD和DEN×1次的方法诱导小鼠原发性肝癌。并在不同时间点处死小鼠,观察小鼠肝癌发生率,肿瘤大小、数量等。检测两组小鼠血清中肝功能指标,并对两组小鼠肝组织进行组织病理学分析。
  3、肝脏特异性敲除SOX9与肝细胞特异性敲除SOX9对肝癌发生作用的对比
  在STZ-HFD和DEN×1次两种肝癌模型中,对比Sox9HKO小鼠和Sox9LKO小鼠在同种肝癌模型中造模相同时间后,小鼠肝癌的发生情况。
  五、SOX9敲除后促进肝癌发生的机制研究
  1、RNA-seq检测SOX9基因敲除对肝癌发生过程中基因表达的影响
  DEN×25次模型中,Sox9f/f组和Sox9LKO组小鼠DEN注射13次后,抽提肝脏RNA,检测RNA质量,RT-PCR检测两组SOX9的表达,确定Sox9LKO组SOX9表达下调后,委托生物公司测序分析,寻找SOX9敲除组与对照组差异表达的基因。
  2、根据RNA-seq分析结果,选择Wnt通路发生变化的基因,用测序样本的RNA对RNA-seq结果进行验证。
  3、进一步在STZ-HFD模型的Sox9f/f和Sox9HKO小鼠(高脂喂养8周)的原代肝细胞和肝组织RNA中验证上述Wnt通路变化的基因。
  4、Western blotting检测不同模型的Sox9LKO小鼠和Sox9HKO小鼠中,与肝癌发生相关的信号通路的变化。
  结果:
  一、肝细胞表达SOX9不是肝癌发生的必要条件
  1、Sox9-Flp/Ai65D小鼠成功构建
  抽取Sox9-Flp/Ai65D小鼠的鼠尾基因组DNA行普通PCR,琼脂糖凝胶电泳观察突变条带,选择双基因阳性的即可作为示踪小鼠。
  2、Sox9-Flp/Ai65D小鼠注射AAV8-TBG-Cre后,表达过SOX9的肝细胞特异性表达TdTom,并保持数量稳定
  3、表达过SOX9的肝细胞不是肝癌细胞的唯一来源
  二、肝脏特异性敲除SOX9促进肝癌发生
  1、Sox9LKO小鼠肝脏中胆管细胞和肝细胞中SOX9表达都显著减少
  2、肝脏特异性敲除SOX9促进小鼠发生肝癌
  肝功能指标检测:与对照组小鼠相比,Sox9LKO组小鼠血清转氨酶ALT、AST升高约2倍、总胆红素升高约3倍,总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和甘油三脂(TG)也升高,胆汁淤积指标碱性磷酸酶(ALP)和总胆汁酸(TBA)分别升高约4倍和30倍。
  三、肝细胞特异性敲除SOX9促进肝癌发生
  1、Sox9HKO小鼠肝细胞中SOX9显著减少
  RT-PCR及Western blotting检测STZ-HFD造模后的对照组和Sox9HKO组原代肝细胞中SOX9的表达量,可见Sox9HKO组SOX9表达较对照显著降低。
  2、肝细胞特异性敲除SOX9促进肝癌发生
  (1)STZ-HFD模型
  病理学染色发现:Sox9HKO组和Sox9LKO组脂肪变程度较对照组更轻,Sox9LKO组小鼠肝脏汇管区胆管细胞增生明显,且有显著的纤维化,而Sox9f/f组和Sox9HKO组则未见明显增生,亦无纤维化发生。CK19染色显示Sox9f/f组和Sox9HKO组无明显CK19阳性细胞增多和胆管反应,而Sox9LKO组胆管细胞显著增多,汇管区胆管反应明显增强。
  分析各组小鼠血清肝功能指标发现:Sox9HKO组与对照组相比,ALT、AST、Tbil、TBA、ALP都无明显差异,而Sox9LKO组小鼠以上各项指标均较Sox9HKO组和对照组升高。
  (2)DEN×1次模型
  肝脏组织学分析可见到与STZ-HFD模型一致的结果。天狼猩红染色示Sox9HKO组和Sox9f/f组无明显纤维化,Sox9LKO组汇管区出现轻度的纤维化。CK19染色显示Sox9f/f组和Sox9HKO组无明显胆管反应,而Sox9LKO组胆管反应增加。
  与对照组相比,Sox9HKO组各项肝功能指标无明显变化,而Sox9LKO组则较Sox9HKO组和对照组升高。
  3.胆管细胞SOX9缺失引起胆管反应和肝纤维化对肝癌发生具有促进作用
  Sox9HKO组和Sox9LKO组在STZ-HFD和DEN×1次两种模型中,可见造模至相同时间,Sox9LKO组较Sox9HKO组发生肿瘤更早,肿瘤更多,更大。组织病理学染色显示Sox9LKO组较Sox9HKO组出现显著的肝纤维化和胆管反应。
  四、SOX9敲除后促进肿瘤发生的机制可能与Wnt通路、AKT通路和ERK通路的活化相关。
  (1)利用RNA-Seq技术寻找造模后Sox9f/f组和Sox9LKO组差异表达的基因并进行分析后发现:SOX9敲除后的差异基因以表达上调的基因为主,KEGG分析发现Sox9LKO组肿瘤相关信号通络基因表达上调,GSEA分析可见Wnt、Hedgehog、趋化因子和肿瘤相关信号通路活化。
  (2)RT-PCR法验证RNA-seq结果:检测所用测序样本(DEN×13次肝组织RNA)中Wnt通路上调基因:wnt5a、wnt7a、wnt7b、FZD2、FZD6等,RT-PCR结果与RNA-seq一致。
  (3)Wnt通路表达上调的基因,在STZ-HFD模型Sox9HKO小鼠的原代肝细胞和肝组织RNA中的表达和对照组相比也明显上调。
  (4)Western blotting检测发现,不同的肝癌模型中,肝脏特异性敲除SOX9和肝细胞特异性敲除SOX9都可见p-AKT和p-ERK表达上调。
  结论:
  1、肝细胞表达SOX9不是肝癌发生的必要条件。
  2、肝脏特异性敲除SOX9导致胆管反应和肝纤维化,促进HCC发生。
  3、肝细胞特异性敲除SOX9不会引起胆管反应和肝纤维化,但仍然促进HCC发生。
  4、胆管细胞缺失SOX9可能引起胆管反应和肝纤维化,促进HCC发生。
  5、敲除SOX9后,Wnt、AKT和ERK等通路活化,参与促进肝癌发生。SOX9在肝癌的发生和发展中可能起不同的作用。
[博士论文] 王慧
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:结直肠癌是消化道常见肿瘤,近年来发病率有上升趋势。虽然粪隐血实验、结肠镜检等检查提高了结直肠癌的诊断率,但是,非侵入性的液体活检技术仍是早期发现结直肠癌、降低结直肠癌相关死亡率的预期诊断策略。目前大多数筛查方法都不足以取代传统的结直肠癌诊断方法(直肠指诊、影像学检查、结肠镜检查、病理检查),且癌胚抗原(CEA)作为疾病诊断标志物,对早期肿瘤的诊断价值不大。随着技术的进步及对癌症相关分子的深入研究,外泌体被认为是一种潜在的新型生物标志物。外泌体是一种直径30-200nm的微囊泡,细胞通过内质网传递、胞吐等过程将外泌体释放到外周血、尿液、唾液、组织液等体液中。外泌体因其囊泡样结构携带大量生物分子,其中包括能够反映和代表宿主细胞来源的核酸和蛋白质。而且,癌细胞释放出的外泌体具有特异性的遗传信息和表观遗传修饰,使其在信号传递、肿瘤转移等方面发挥重要作用。结直肠癌肿瘤细胞在分泌外泌体的过程中,在外泌体表面、囊泡内都组装了结直肠癌细胞特异性的分子,如A33(vaccinia virus antigen)、上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、CEA等。从临床检测角度分析,携带有肿瘤特异性分子的外泌体,因其广泛分布于各种体液中,因此可以作为液体活检的新型检测标志物,应用于非侵入性的临床诊断操作。但是外泌体为纳米级结构,且肿瘤早期其在外周血中的数量相对较少,现有的常规临床检测方法很难对外泌体进行分离、富集和精确的定量检测,因此,建立快速、灵敏的外泌体检测方法是目前的研究需要。
  (一)新型纳米材料在微量检测中的应用越来越广,其中氧化石墨烯因其良好的生物相容性、比表面积大等特性,已被大量用于生物分子、活细胞检测。适配体是寡核苷酸单链,能够特异性地与检测目标(包括小分子化合物、蛋白、活细胞及外泌体等)结合,具有亲和力高、特异性强、可对其进行多种化学修饰等优点,氧化石墨烯能够与适配体通过分子间相互作用力结合,从而引起相关化学特性的改变。目前已有多项研究利用GO及适配体进行小分子化合物及活细胞的检测。但是,氧化石墨烯与荧光DNA单链适配体相互作用的方法在外泌体检测中还未有报道。本文在第一部分建立了一个基于氧化石墨烯与荧光DNA单链适配体相互作用的结直肠癌外泌体快速荧光检测方法,以结直肠癌外泌体特异性蛋白CD63和EpCAM为联合检测靶点,该体系利用荧光DNA单链适配体-GO复合体为探针,在与结直肠癌外泌体相互作用的过程中,复合体发生构象变化,GO对荧光DNA单链适配体的吸附和解离导致荧光猝灭和荧光恢复,通过荧光强度变化可对结直肠癌外泌体进行定量检测。实验过程中我们对反应条件及体系进行了优化,并以脱氧核糖核酸酶为工具酶,对荧光信号进行放大,最终得到对结直肠癌外泌体检测灵敏度达到2.1×104particles/μl的检测方法,该检测可在30分钟内完成。用19例临床血清样本(5μl)对该方法进行验证,其可有效区分健康对照和结直肠癌患者(P<0.05),证明该方法在临床实验室检测中具有潜在的应用价值。但是,该检测体系选择的检测靶点为EpCAM,EpCAM在胰腺癌、乳腺癌等肿瘤外泌体中也过量表达,因此该方法的特异性有待进一步提高。在下一步研究中,本课题将针对检测的特异性及灵敏度进行改进。
  (二)质谱检测具有灵敏度高、检测动态范围广、特异性强等特性,目前已被广泛应用于疾病诊断、微生物检测、药物分析等领域。为简化质谱检测方法,一些新型的常压电离方法已被开发出来,如纸喷雾电离技术。纸喷雾电离质谱检测具有高效、简便、无需对样品进行前处理等优点,但是在对生物样本进行检测时,因无样本前处理步骤,而生物样本内容物复杂,其他离子或蛋白质等分子会抑制待测物的信号,导致灵敏度较差。生物大分子因其分子量大,直接进行质谱分析时所得数据量大,不易分析。若在生物大分子上标记反应可逆的小分子化合物,通过检测小分子化合物间接对生物大分子进行定量分析,可极大提高检测效果。为进一步提高结直肠癌外泌体的检测灵敏度,本文在第二部分建立了一种基于免疫反应的接触式纸喷雾离子化质谱检测方法,用于检测样品中的结直肠癌外泌体。该方法构建了一个双层纸芯片用于样品前处理,用免疫方法对外泌体进行捕获,捕获抗体为抗CD63抗体,从而实现外泌体的纯化与富集;并且构建了两种可裂解的小分子离子探针(DMG-probe,DPA-probe),用离子探针对外泌体特异性检测抗体抗A33抗体进行标记,离子探针被裂解后进入质谱仪完成检测。本实验利用纸芯片实现了免疫反应与纸喷雾检测小分子离子探针的集成分析,DMG-probe和DPA-probe对结直肠癌外泌体的最低检测浓度分别为1.7×102particles/μl和2.5×102particles/μl,其灵敏度是第一部分氧化石墨烯方法的100倍。而且,该纸芯片可对捕获的外泌体样本进行长期有效保存(30天),因此可用于患者自助式分析,即患者在家中或其他场所完成纸芯片上的免疫反应,然后将纸芯片送至质谱检测机构进行检测。
  本文分别利用新型纳米材料和纸喷雾离子化质谱方法建立了两种结直肠癌外泌体快速检测平台,两种方法均具有快速、方便、高灵敏度的特点,在肿瘤外泌体的临床诊断中具有很大的应用前景。
[博士论文] 汤雨潇
劳动卫生与环境卫生学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究通过比较肝癌转移患者与未转移患者的肝癌组织铁含量,以及体内外实验明确缺铁与肝癌转移的关系和机制,为系统了解肝癌铁代谢特点及其在肝癌细胞转移中的作用,同时为今后肝癌转移防治措施的完善,尤其是铁螯合剂在肝癌治疗中的应用提供科学依据。
  方法:
  一、肝癌组织铁含量的检测
  1.磁共振成像检测铁含量
  采用GE Signa HDx1.5T MR扫描仪对肝癌患者进行术前扫描,按设定参数扫描后利用自带的工作站软件建立R2*图,随后在R2*图手动标出目标区域,通过软件分析得到R2*值。
  2.火焰原子吸收法检测组织铁含量
  剪下适量组织,烘干后称重,置于玻璃消化管中,加入1ml硝酸和高氯酸混合酸(硝酸/高氯酸=1/4)。放入高温消化炉消化至组织溶解,溶液澄清,随后定容至10ml,作为待测液。以铁标准贮备液(100μg/mL)为标准品配置标准曲线测定液,随后与待测样本同时进原子吸收分光光度计检测,根据标准曲线计算出溶液中铁含量,再比上各组织重量得到组织中铁含量(μg/g)。
  二、细胞实验
  1.细胞培养与处理
  Huh7细胞和HepG2细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM培养液中,SMMC-7721细胞和H22细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养液中。DFO的使用浓度为100μM,Dp44mT的使用浓度为10μM,处理时间为24小时。HIF1α抑制剂PX478的使用浓度为20μM,SP1抑制剂Mithramycin A的使用浓度为100nM,在添加铁螯合剂的同时加入培养液中。
  2.原代肝细胞提取
  人原代肝细胞购于Sciencell公司并附鉴定报告。小鼠原代肝细胞提取:消化酶灌流后取出肝,重悬细胞过400目筛网过滤,随后通过Percoll分离液分离细胞,转移细胞至细胞培养瓶培养并洗去未贴壁细胞。
  3.细胞增殖检测
  采用ThermoFisher Click-iT(@)Plus EdU Alexa Fluor(@)488Flow Cytometry Assay Kit检测细胞增殖。
  4.细胞迁移侵袭实验
  采用transwell小室定性检测肝癌细胞迁移能力,采用Cell Biolabs迁移能力检测试剂盒定量分析缺铁作用下肝癌细胞迁移能力变化。侵袭能力定性检测采用预包被基质胶的transwell小室,采用Cell Biolabs侵袭能力检测试剂盒定量分析缺铁作用下肝癌细胞侵袭能力变化。
  5.细胞转染
  采用lipo3000进行siRNA转染,siRNA浓度为100μM,lipo3000用量及操作参照试剂说明书,隔天换液,转染48小时后进行后续操作。
  6.荧光素酶标记
  细胞荧光素酶标记使用荧光素酶标记试剂盒(上海中乔新舟,货号A1001-8),该试剂盒内含慢病毒介导的萤光素酶标记液及辅助感染的polybrene,通过CAG启动子过表达萤光素酶从而作为报告基因,感染后可在细胞中稳定表达。
  7.细胞TFRC基因敲降
  使用携带TFRC shRNA的慢病毒敲降Huh7细胞和H22细胞的转铁蛋白受体,将shRNA序列克隆进pLVX-shRNA1慢病毒载体后进行包装和生产,得到病毒感染液后感染细胞并筛选稳定细胞系进行后续成瘤实验。
  8.荧光淬灭法检测细胞内铁含量
  使用Phen GreenTM FL试剂(Thermo Fisher)检测细胞内铁含量。细胞内二价铁与荧光试剂结合使其荧光淬灭,通过荧光显微镜观察细胞内荧光强度定性检测细胞内铁含量的变化。
  9.转录因子活性芯片
  DFO干预Huh7细胞24h后提取核蛋白,与对照组核蛋白一起分别与TranSignalTM Protein/DNA Array试剂盒中345种特异性与转录因子结合的探针孵育结合,随后洗去未结合的探针,接着分离探针/核蛋白复合体得到探针,与transignal芯片杂交,检测每种探针产生的信号变化,以此反应各探针对应的转录因子结合活性的变化。
  10.染色质免疫共沉淀
  采用CST的酶解法染色质免疫共沉淀试剂盒检测三种转录因子HIF1α、SP1和YY1对SPNS2转录活性的变化
  。
  结果:
  一、肝癌转移患者癌组织铁含量显著低于未转移患者
  1.与正常组织或癌旁组织相比,肝癌组织铁含量下降
  10例肝癌患者肝癌组织的R2*值显著低于癌旁组织和远处正常肝组织的R2*值。由于R2*值与铁含量呈正相关,提示肝癌组织铁含量低于癌旁组织及正常肝组织。
  火焰原子吸收法定量检测29位肝癌患者手术标本癌旁组织和癌组织,发现肝癌组织铁含量显著低于癌旁组织,与磁共振扫描的结果一致。
  与癌旁组织相比,肝癌组织铁稳态分子TFRC、HAMP、Ferritin的表达显著改变,符合肝癌组织缺铁的表现。上述结果表明,肝癌组织铁含量低于癌旁组织及正常肝组织。
  2.发生转移肝癌患者的癌组织铁含量显著低于未发生转移肝癌患者
  收集术后5年内发生转移复发的肝癌患者15例,未发生转移复发患者15例,通过检测手术标本(5年前首次手术的标本)的铁含量及铁稳态分子表达,发现发生转移的肝癌患者其肝癌组织铁含量显著低于未发生转移的肝癌患者,提示铁含量下降在肝癌转移中可能发挥一定作用。
  二、体内外实验证实缺铁促进肝癌细胞转移
  1.缺铁抑制人肝癌细胞增殖,但促进人肝癌细胞迁移和侵袭
  通过添加DFO(100μM)和Dp44mT(10μM)两种铁螯合剂造成细胞缺铁模型。采用EdU标记方法观察缺铁对三种人肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721增殖的影响,结果发现缺铁时三种肝癌细胞增殖均受到显著抑制。
  但是,定性及定量检测结果显示,在两种铁螯合剂的作用下,Huh7、HepG2、SMMC-7721三种肝癌细胞均表现出显著的迁移侵袭增强。
  2.缺铁促进人肝癌细胞Huh7在裸鼠体内转移
  2.1系统性缺铁模型
  在体内缺铁是否促进肝癌转移尚不清楚。首先通过给裸鼠喂食缺铁饲料造成裸鼠系统性缺铁模型,观察人肝癌细胞Huh7在裸鼠体内的转移情况。通过检测肝组织、肺组织铁含量和血清铁含量、铁蛋白含量、转铁蛋白饱和度等指标以及免疫荧光检测肝组织、肺组织的铁蛋白表达,确认喂食缺铁饲料后裸鼠缺铁模型制作成功。
  为了更好地观察肝癌细胞在体内转移的情况,采用活体成像技术定期观察肝癌细胞在体内的生长、扩散。Huh7细胞进行荧光素酶标记(Huh7-fluc),扩增到足够数量后通过肝脏原位种瘤和尾静脉注射种瘤两种方式进行体内荷瘤实验。每10天进行一次活体成像拍照,并利用软件分析肝癌细胞在体内的增殖数量与转移面积。结果发现,与正常组相比,在两种荷瘤模型中缺铁组均表现出明显的肝癌细胞转移范围增大和肺部转移增强。提示缺铁会促进Huh7细胞的体内转移。
  2.2肝癌细胞(Huh7)缺铁模型
  为了更贴合人肝癌组织铁含量下降而整体并不缺铁的情况,通过敲降Huh7细胞转铁蛋白受体,限制其摄入铁的能力而造成细胞内缺铁。检测TFRC mRNA表达和TfR1蛋白表达显示,敲降Huh7-fluc细胞TfR1成功,同时细胞内铁含量低于未敲降组。
  Huh7-fluc-TFRCknockdown细胞与Huh7-fluc细胞扩增足量后以同样细胞量通过原位种植和尾静脉注射两种方式进行裸鼠荷瘤实验,敲降组与未敲降组裸鼠喂食同样的正常饲料。相比于Huh7-fluc细胞,Huh7-fluc-TFRCknockdown细胞在裸鼠体内转移显著增强,肺部转移显著。
  3.缺铁促进小鼠肝癌细胞H22在C57小鼠体内转移
  系统性缺铁模型
  为了排除免疫系统缺陷对肝癌细胞转移的影响,在C57小鼠体内种植小鼠肝癌细胞H22,观察缺铁对H22在体内转移的影响。通过检测铁相关指标,确认喂食缺铁饲料后C57小鼠系统性缺铁。
  同样,H22细胞标记荧光素酶(H22-fluc)后,以肝原位种瘤和尾静脉注射两种方式荷瘤。活体成像拍照分析结果显示缺铁组小鼠比正常组小鼠成瘤面积大,肺部转移肿瘤面积增大。
  结论:
  本研究通过检测肝癌转移患者和未转移患者癌组织铁含量,并在整体和细胞水平制作多种缺铁模型,观察缺铁对肝癌细胞转移的作用及其机制。从所取得的实验结果上得出以下结论:
  1.发生转移肝癌患者癌组织铁含量明显降低;
  2.在体内和体外,缺铁均促进肝癌细胞转移;
  2.SPNS2上调是缺铁促进肝癌细胞转移的关键环节;
  3.HIF1α和SP1在缺铁引起SPNS2上调中发挥重要作用。
[硕士论文] 李善心
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的与背景:
  近年来,结肠癌的发病率与死亡率不断升高,已成为导致我国癌症病人死亡的主要原因之一。结肠癌患者的死亡多是由于发生了肝转移,约有60%以上的晚期结肠癌病人均伴有不同程度的肝转移。结肠癌的发病机理十分复杂,干细胞理论认为肿瘤组织中具有干细胞样特性的细胞才是导致结肠癌发生的原因。
  不同于一般的肿瘤细胞,肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)可以在增殖过程中保持自我更新,同时还具有较强免疫逃逸能力;虽然CSC数目很少,但可引起肿瘤的发生或者转移;而且CSC对传统的治疗手段有着相当高的抗性,容易导致肿瘤复发。因此,靶向CSC被认为是新的、有效的治疗包括结肠癌在内的大多数肿瘤的重要手段之一。
  肿瘤的发生除了伴有重要功能基因的突变以外,还与一些特定基因的表观遗传学修饰有关系。表观遗传学修饰中甲基化修饰方面的报道居多,且机制比较明确。异常的DNA甲基化,会引起一些重要的基因表达发生变化,不断累积后会使细胞功能发生改变,进而导致细胞分化或增殖异常,致使各类疾病甚至是肿瘤发生。
  有趣的是,DNA甲基化是一种特殊的、可逆的生化修饰方式,通过DNA甲基转移酶(DNMT)进行调控。研究表明,DNMT的异常表达会导致肿瘤的发生或恶化。最近的研究发现,DNMT抑制剂可通过抑制肿瘤细胞内抑癌基因的DNA甲基化使其重新表达,从而有效抑制肿瘤细胞的生长。此外,DNMT抑制剂还能靶向肿瘤内的CSC从而降低肿瘤细胞的成瘤能力。因此,抑制DNMT可能是治疗结肠癌的有效策略。然而,关于DNMT在结肠癌细胞干性维持和肝转移中的作用与机制尚不清楚。
  在本文的研究中,我们检测了DNMT抑制剂对结肠癌干性相关特征与肝转移瘤生长的影响,并全面探讨了其作用机制。
  方法与结果:
  第一部分:首先,我们通过DNMT活性检测、生长计数、克隆形成、成球实验、皮下成瘤实验和transwell侵袭实验等检测了DNMT抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-AzaDC)对结肠癌HCT116和SW620细胞生长与干性特征的影响;同时,我们通过流式细胞术和Westen blot(WB)的方法检测了5-AzaDC对结肠癌细胞CD44和CD133表达的影响,从而研究DNMT在结肠癌细胞HCT116和SW620干性维持中的作用;采用HCT116细胞裸鼠肝转移瘤模型以及HE和IHC染色等方法检测了结肠癌细胞在裸鼠体内的生长,从而对体外相关结果进行验证。
  第二部分:我们采用了免疫荧光、WB、Q-PCR、MSP及IHC等方法,结合TCGA数据库研究了Wnt通路抑制基因甲基化在结肠癌细胞干性维持中的相关分子机制进行的探索;同时,通过基因过表达的方法研究了Wnt/β-catenin通路抑制基因SFRP1在HCT116细胞干性维持中的作用。结果表明:SFRP1在结肠癌临床样本和细胞株中的表达都非常低,且其mRNA的表达受甲基化的调控,而SFRP1去甲基化后可降低β-catenin的蛋白水平并抑制其入核,从而抑制Wnt通路下游靶基C-myc,CyclinD1与MMP7的转录和表达;IHC结果显示经DNMT抑制剂处理后,肝转移瘤组织细胞内的β-catenin的表达分布发生了明显的变化,β-catenin在核内和胞浆内的表达显著降低;SFRP1过表达后抑制了β-catenin的表达并降低了HCT116细胞的自我更新能力,使CD44阳性细胞比例显著减少。
  结论:
  我们的研究结果表明,DNMT可通过甲基化特异性抑制Wnt通路抑制基因SFRP1的表达,在结肠癌细胞的干性维持中发挥作用,DNMT抑制剂可以有效抑制结肠癌细胞的干性和肝转瘤的生长。因此,抑制DNMT有可能成新的对抗结肠癌的重要方法和手段之一。
[硕士论文] 罗荣
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 臭氧化生理盐水治疗兔VX2肿瘤的有效性及安全性研究
  目的:研究瘤内注射臭氧化生理盐水治疗VX2肿瘤的有效性及安全性。
  方法:72只载瘤新西兰大白兔随机分为4组,每组18只,经耳缘静脉注射浓度为3%硫酸戊巴比妥钠(0.8-1ml/Kg)麻醉后,于心脏搏动最强处采血3ml,超声检测肿瘤大小,记录肿瘤最大切面的长径(a)及相垂直的短径(b),按公式V=1/2ab2计算肿瘤体积;B超引导下分别予以注射单次2倍肿瘤体积的低温生理盐水(A组)、单次臭氧化生理盐水(B组)、2次臭氧化生理盐水(连续2天,C组)、3次臭氧化生理盐水(连续3天,D组);于术后第4天、8天、12天分别心脏采血3ml,检测血液中白细胞计数、红细胞计数、血小板、血红蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐及尿素的变化,并用超声检测肿瘤的大小,计算肿瘤体积及肿瘤生长率。各组各时间节点随机选取6只经耳缘静脉注射空气15-20ml死亡后,切除肿瘤浸泡于10%福尔马林中。采用TUNEL法检测肿瘤内细胞凋亡情况。统计学方法采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
  结果:1、各组各时间节点肿瘤均不同程度增大,臭氧化生理盐水组的肿瘤生长速率明显低于生理盐水组,且B组效果最佳,于各时间节点B组与A组相比较均存在统计学意义(第4天时P=0.000,第8天时P=0.003,第12天时P=0.009),而臭氧化生理盐水组之间肿瘤生长率无统计学意义(P>0.05);2、各组各时间节点白细胞计数、红细胞计数、血小板、血红蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐及尿素之间均不存在统计学意义(P>0.05);3、各组各时间节点之间肿瘤内细胞凋亡之间亦不存在统计学意义。
  结论:瘤内注射臭氧化生理盐水能够明显减慢肿瘤的生长速度,单次瘤内注射似乎优于连续多次注射(未呈现统计学差异)。瘤内注射臭氧化生理盐水对肿瘤内的凋亡情况无影响,因此臭氧化生理盐水可能并不是通过增加肿瘤内的细胞凋亡来减慢肿瘤生长速度的,同时瘤内局部注射臭氧化生理盐水对肝肾功能、血常规无影响,因此瘤内注射臭氧化生理盐水是一种安全、有效的抗肿瘤方法。
  第二部分 臭氧化生理盐水瘤内注射对肿瘤浸润淋巴细胞的影响
  目的:探讨臭氧化生理盐水VX2瘤内注射对肿瘤内浸润性淋巴细胞的影响。
  方法:经臭氧化生理盐水或者生理盐水治疗后的肿瘤标本采用免疫组化技术检测肿瘤内CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的浸润情况,用Image proplus 6.0生物医学影像分析系统进行相应染色强度即累积吸光度检测,记录单位面积的累积吸光度值。统计学方法采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
  结果:1、C组、D组肿瘤内CD3+T淋巴细胞浸润在各时间节点均高于A、B组,但仅在第4天时与B组存在统计学意义(相对应的P值依次为0.009,0.03),其余各时间节点及各组间均不存在统计学意义。2、第4天时,C组肿瘤内CD4+T细胞浸润高于A、B组,且与A、B组均存在统计学意义(P<0.05),D组肿瘤内CD4+T细胞浸润亦高于A、B组,但仅与A组有统计学意义(P=0.010),其余各组间无统计学意义;第8天时C组肿瘤内CD4+T细胞浸润高于A、B、D组,但仅与D组存在统计学意义(P=0.036),其余各组间无统计学意义;第12天时D组肿瘤内CD4+T细胞浸润高于A、B、C组,但均无统计学意义,且高于第8天时D组肿瘤内CD4+T淋巴细胞(P=0.012),其余各组内无统计学差异存在。3、C组肿瘤内CD8+T淋巴细胞浸润在各时间节点高于A、B、D组,第8天时与A组存在统计学意义(P=0.030),第12天时与A、B组均存在统计学意义(P<0.05),D组肿瘤内CD8+T细胞浸润在各时间节点高于A、B组,但仅在第12天时与A、B组存在统计学意义(P<0.05),其余各组及各时间节点内无明显意义。
  结论:单次臭氧化生理盐水瘤内注射对肿瘤内浸润性CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的无明显影响,2次或者3次臭氧化生理盐水瘤内注射在某些时间节点能够增加肿瘤内CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的浸润,且以连续2天注射效果最佳。
[硕士论文] 胡思颖
全科医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:静脉血栓栓塞症是目前恶性肿瘤的一种常见并发症,而肺癌作为我国发病率最高的恶性肿瘤受到人们高度关注和重视。国内外的多项研究提示静脉血栓栓塞症与肺癌的治疗和预后密切相关。合并VTE的肺癌患者预后差,死亡率更高,而规范的预防性抗凝治疗可降低VTE的发生率。由此可见,认识肺癌合并VTE的高危因素及高发时段,并做到早期预防、早期诊断及早期治疗有着十分重要的临床意义。
  研究目的:
  分析合并静脉血栓栓塞症肺癌患者的临床特征,探寻肺癌患者发生VTE的高危因素,提高对高风险患者的预防及诊断意识。观察预防性抗凝在我院肺癌病人中的应用情况,并对比预防性抗凝治疗前后患者实验室指标的变化情况,了解预防性抗凝治疗的必要性和相关风险。
  研究方法:
  回顾性分析海军军医大学附属长海医院2012年6月至2016年6月共收治的2325例肺癌患者,选取其中有完整病历资料的50例合并静脉血栓栓塞症的患者为研究组(VTE组),分析VTE的临床特征(发生时间、发生部位、临床表现、治疗方式及临床转归)。随机选取同期入院但未合并静脉血栓栓塞症的100例肺癌患者作为对照组(非VTE组)。记录和分析两组患者的一般情况(包括年龄、性别、合并基础疾病、吸烟史),肿瘤相关情况(包括肺癌病理类型、TNM分期及肿瘤治疗方式),是否预防性抗凝治疗,实验室检查(包括凝血功能,白细胞计数,血红蛋白及血脂等)。并选取上述150例患者中预防性抗凝的47例患者作为研究对象(干预组),未预防性抗凝的103例患者为未干预组,记录干预组患者当次及下一次入院时凝血功能指标、白细胞计数及血红蛋白,对比两者是否有统计学差异。所有数据均应用SPSS21.0统计软件对结果进行统计处理和分析,检验水准α=0.05,以P<0.05差异具有统计学意义。
  研究结果:
  静脉血栓栓塞症在肺癌确诊后的6个月内发生率高达78.0%,以下肢深静脉血栓和肺血栓栓塞症最为多见。合并静脉血栓栓塞症组和未合并静脉血栓栓塞症组单因素分析结果显示,VTE组血浆D-二聚体、自细胞计数、凝血酶原时间高于非VTE组(P<0.05),肺腺癌、晚期肺癌患者(Ⅲb-Ⅳ期)、放疗、化疗的患者VTE发生率更高,差异有统计学意义(P<0.05)。预防性抗凝治疗的患者静脉血栓栓塞症发生率明显低于未预防抗凝的患者(12.8%VS47.7%),P<0.001。多因素回归分析显示腺癌、化疗及凝血功能异常D-二聚体水平升高是肺癌患者合并静脉血栓栓塞症栓塞的独立危险因素(P<0.05),预防性抗凝治疗可以降低肺癌患者VTE的发生率,12.8%VS47.7%,(P<0.001)。预防性抗凝的肺癌患者血浆D-二聚体较前有明显下降,统计学有明显差异(P<0.05),凝血酶原时间、部分凝血酶原时间、纤维蛋白原、白细胞计数、血红蛋白等指标均未存在统计学差异性。
  研究结论:
  肺腺癌、化疗、D-二聚体升高是肺癌合并VTE的独立危险因素;静脉血栓栓塞症多发生在肺癌确诊后的6个月内。预防性抗凝治疗可以明显降低肺癌患者血浆D-二聚体水平,有效降低VTE的发生率。而对其他凝血功能指标及白细胞,血红蛋白等均无明显影响。预防性抗凝患者出血风险并未增加。临床上应对具有以上高危因素及处于高发时段的肺癌患者提高警惕,积极检查,早期诊断,并给予及时预防性抗凝治疗干预,降低VTE的发生率。
[硕士论文] 房蒙
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  乳腺癌作为女性所罹患恶性肿瘤中最常见的病种之一,约占所有恶性肿瘤的30%。尽管包括手术、放疗、化疗和内分泌治疗在内的综合治疗显著降低了早期死亡率,但乳腺癌仍然是女性癌症死亡最常见原因中的第二位。恶性肿瘤的发生是由多种致癌因素引起的,其特点是细胞增殖失控和远处转移。骨是晚期乳腺癌最常见的转移部位,据报道发生率约为60-80%,骨转移大大增加了病理性骨折和脊髓压迫等并发症,严重影响生活质量。鉴于晚期乳腺癌患者发生骨转移的后续治疗策略及疗效较为有限。故探明乳腺癌骨转移的分子生物学机制,寻求新的药理学靶点,对患者的预后意义重大。
  微纤维相关蛋白5(Microfibrillar-associated protein5,MFRP5)也称为微纤维相关糖蛋白2(microfibril-associated glycoprotein2,MAGP2),是细胞外弹性微纤维的一个组成部分,在骨骼生长、心血管发育、肺泡弹性发育和马凡综合征中发挥重要作用。研究表明,MFAP5由骨髓间充质基质细胞(Bone marrow mesenchymal stromal cell,BMSC)分泌,并在造血和免疫系统中发挥作用,而MFAP5的缺失可预防小鼠骨质疏松。这些结果表明MFAP5在骨微环境中的关键作用。最近的研究进一步表明,MFAP5在头颈部恶性肿瘤、胰腺癌、肺癌和舌癌中过度表达,但是MFAP5在这些肿瘤中的作用仍有待阐明。已有研究表明,血清MFAP5水平与卵巢癌患者预后负相关,而癌细胞分泌的MFAP5能够促进肿瘤增殖,内皮细胞迁移,肿瘤血管生成和化疗药物耐药。然而,课题组成员经过文献检索,发现关于MFAP5在乳腺癌骨转移中作用机制的文献尚属少数。
  由于MFAP5在恶性肿瘤和骨微环境中的重要作用,设计实验,想进一步了解MFAP5在乳腺癌骨转移中的作用。在本研究中,首先验证了MFAP5在乳腺癌骨转移灶中的高表达,并探究了MFAP5对乳腺癌肿瘤细胞增殖和迁移的影响,并进一步探讨了可能的分子机制,特别是ERK/MMP信号通路。
  方法:
  我们的研究采用在海军军医大学附属长征医院收集的乳腺癌原发病灶、癌旁正常组织及骨转移组织。首先,进行MFAP5的免疫组化染色,随后通过western blot及qR-T PCR实验,分别在蛋白水平和mRNA水平验证MFAP5的表达。
  第二部分的实验中,首先构建MFAP5过表达质粒,并通过PCR扩增的MFAP5的密码序列插入pcDNA3.1+质粒中。一方面进行CCK8实验:在含10%胎牛血清的DMEM培养基中常规培养两珠乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231,细胞用DNA转染试剂或siRNA转染质粒。用过表达质粒或siRNA转染的MCF7和MDA-MB-231细胞以每孔5×103的起始密度接种在96孔板中,48h后使用细胞计数试剂盒进行计数,使用酶标仪在450nm处测量吸光度来测量结果。随后,使用8-μm孔径的transwell室进行transwell迁移试验。消化并计数用过表达(OE)质粒或siRNA转染的MCF7和MDA-MB-231细胞。
  为进一步研究MFAP5调控乳腺癌骨转移的分子机制,进行western blot实验,研究MFAP5与MMP2,MMP9,p-FAK,FAK,p-Erk1/2,Erk1/2,p-cJun(Set63),p-cJun(Set73),cJun之间表达的相互影响及关系。
  实验中,均使用SPSS19.0统计软件进行统计分析。数据格式为平均值±平均值的标准误差,数据比较使用独立样本t检验。所有实验均重复3次,并纳入代表性结果。p<0.05被认为是有统计学意义的。
  结果:
  IHC显示MFAP5主要在细胞间隙中表达,并且在骨转移灶中的表达显著高于原发灶。western blot检测进一步证实MFAP5在骨转移中的表达高于原发灶。此外,qRT-PCR检测结果显示,在乳腺癌骨转移灶中MFAP5的mRNA水平显著高于原发灶(p<0.05)。MFAP5在MDA-MB-231细胞中MFAP5的表达水平最高,在MCF7细胞中最低。
  Western blot实验证实了过表达质粒和siRNA分别对MFAP5的表达起到促进及抑制作用。MCF7和MDA-MB-231细胞中进行的CCK8实验显示,MFAP5过表达后细胞活力明显增强,而抑制MFAP5后细胞增殖明显下调,表明MFAP5介导乳腺癌的细胞增殖。Transwell实验显示,MFAP5过表达的细胞迁移能力明显增强,而抑制MFAP5后,细胞迁移能力显著降低。这些结果提示MFAP5可能通过增强细胞的迁移能力而促进乳腺癌的转移。
  在MCF7和MDA-MB-231细胞中,MFAP5过表达时MMP2和MMP9的mRNA水平显着增高,而MMP7和MMP14的mRNA水平几乎不变。Western blot进一步表明,与OE-Ctrl质粒相比,转染OE-MFAP5质粒的MMP2和MMP9的表达显著上调,相反,siRNA对MFAP5的抑制则明显抑制了MMP2和MMP9的表达。这些结果表明MFAP5可能通过调节MMP2和MMP9的表达在乳腺癌骨转移中发挥作用。MFAP5的过表达对FAK,Erk1/2和cJun的表达无明显影响,但MFAP5明显激活了FAK,Erk1/2和cJun的磷酸化。相反,通过siRNAs抑制MFAP5的表达则明显抑制了p-FAK,p-Erk1/2和p-cJun的表达。这些结果提示MFAP5可能通过ERK信号通路调控MMP2和MMP9的表达。
  结论:
  通过本研究,首先报道了乳腺癌骨转移灶中MFAP5表达水平相比原发灶的明显上调,并进一步发现MFAP5过表达加速了乳腺癌细胞的增殖和迁移,而当MFAP5被抑制时则呈现相反的效果。此外,MFAP5能够能激活ERK信号通路,增加MMP2和MMP9的表达,相反,抑制MFAP5的表达后,MMP2、MMP9、p-FAK、p-Erk1/2和p-cJun的表达也受到抑制。这些结果表明MFAP5作为癌基因在乳腺癌骨转移中发挥作用,希望通过我们的研究能够找到乳腺癌骨转移新的诊断和治疗方法。
[博士论文] 鲍一
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肾癌是人类常见的恶性肿瘤,近年来发病率逐年上升。约有20%的患者在初次诊断时就已经发生转移,而近30%的局限性肾癌在手术切除肿瘤后仍会出现复发转移。索拉非尼(Sorafenib)早在2006年就被国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准作为肾癌的一线治疗,然而,约有20%的患者在初次用药时即表现出对索拉非尼的先天耐药,而剩余的绝大多数患者在6-15个月左右也会出现继发性耐药,这些因素导致患者在使用索拉非尼治疗后总生存期延长有限。目前肾癌靶向治疗的难点在于耐药机制不明,缺乏有效的生物学标志物来预测索拉非尼的疗效,在出现耐药后没有很好的方法逆转耐药。血管生成素类似物(ANGPTL)在肾癌靶向耐药过程中所起到的作用以及机制尚未见报道。本研究拟探讨血管生成素类似物在肾癌索拉非尼耐药过程中所起到的作用,寻找相关的分子标志物以及逆转耐药的联合治疗靶点,为提高肾癌靶向治疗的效果、进一步延长患者的总生存期提供依据。
  方法:
  1.选取7种常见的肾癌细胞系,测定索拉非尼对其的半数抑制浓度(IC50);同时测定这些细胞中ANGPTL家族8个成员(ANGPTL1-8)的mRNA表达量,结合IC50筛选可能与肾癌索拉非尼耐药相关的成员。
  2.选取20例接受索拉非尼治疗的肾癌患者肿瘤组织标本,其中对索拉非尼耐药和敏感的各10例。测定其中ANGPTL1-8的mRNA表达量,进一步筛选与肾癌索拉非尼耐药相关的成员。结合1的结果,发现ANGPTL3与肾癌索拉非尼耐药关系最大,于是选择ANGPTL3为进一步验证的对象。
  3.进一步扩大样本量验证ANGPTL3mRNA表达量和肾癌索拉非尼耐药的关系。在一个有68例肾癌样本的队例中研究ANGPTL3mRNA表达量和其对索拉非尼反应性之间的关系。
  4.在蛋白层面验证ANGPTL3表达量和肾癌索拉非尼耐药的关系。选择32例肾癌(16例耐药和16例敏感)组织标本进行Western blot检测,比较ANGPTL3表达量和对索拉非尼敏感性之间的关系。收集136例肾癌患者的肾癌资料(70例术后索拉非尼治疗,66例术后无辅助治疗),免疫组化检测ANGPTL3表达量并进行生存分析。
  5.使用两条独立的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)敲低肾癌细胞株中ANGPTL3的表达量,使用CCK-8增殖实验、Western blot测定凋亡蛋白和流式细胞检测测定细胞凋亡等方法检测肾癌细胞对索拉非尼敏感性的变化。
  6.使用慢病毒转染肾癌细胞株,构建稳定过表达ANGPTL3的肾癌细胞株,使用CCK-8增殖实验、Western blot测定凋亡蛋白和流式细胞检测测定细胞凋亡等方法检测肾癌细胞对索拉非尼敏感性的变化。
  7.将稳定过表达ANGPTL3的OS-RC-2细胞注射于裸鼠皮下构建皮下荷瘤模型。裸鼠予以索拉非尼灌胃(80mg/kg/day)模拟临床给药。每周测量肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线,并通过小动物活体成像检测肿瘤大小。
  8.使用人类蛋白组芯片筛选和ANGPTL3结合的蛋白,并通过siRNA缩小筛选范围,最后用蛋白质免疫共沉淀和激光共聚焦验证获得与ANGPTL3相结合的蛋白。并通过构建ANGPTL3的截短体明确ANGPTL3发挥作用的结构域。
  9.利用Rescue方法,证明上述筛选的蛋白在ANGPTL3促进肾癌索拉非尼敏感性过程中发挥作用,并进一步明确其介导调控肾癌索拉非尼敏感性的具体机制。
  结果:
  1.肾癌细胞株中ANGPTL3和ANGPTL7的mRNA表达量与索拉非尼对肾癌的半数抑制量相关。
  2.小样本的肾癌组织筛选发现ANGPTL3的mRNA表达量和肾癌索拉非尼耐药性相关。结合1的结果发现ANGPTL3和肾癌索拉非尼耐药性可能有关,于是选择ANGPTL3作为进一步的研究对象。
  3.扩大样本量验证上述结论:在对索拉非尼耐药的组织和细胞系中ANGPTL3低表达,而在对索拉非尼敏感的组织和细胞系中ANGPTL3高表达。
  4.蛋白水平的验证同样证实ANGPTL3表达量和肾癌索拉非尼敏感性相关。ANGPTL3的表达量和预后相关:ANGPTL3高表达组中,服用索拉非尼的肾癌病人预后要好于未服用索拉非尼的肾癌病人;但是ANGPTL3低表达组中服用索拉非尼无效。
  5.敲低ANGPTL3后肾癌细胞对索拉非尼的敏感性下降:IC50升高,凋亡减少。
  6.过表达ANGPTL3提高肾癌细胞对索拉非尼的敏感性:IC50降低,凋亡增加。
  7.体外实验证实过表达ANGPTL3提高肾癌细胞对索拉非尼的敏感性:过表达ANGPTL3的肾癌移植瘤在索拉非尼作用下肿瘤生长更慢。
  8.ANGPTL3的FBG-like结构域和Focal adhesion kinase(FAK)相互结合。
  9.过表达FAK可以促进肾癌细胞对索拉非尼的耐药,而过表达ANGPTL3可以逆转此效应。敲低ANGPTL3可以提高肾癌细胞对索拉非尼的耐药性,同时敲低FAK可以抵消此效应,而使用FAK的激酶抑制剂PF-562271则并不能逆转ANGPTL3敲低所导致的耐药性提高。进一步研究发现索拉非尼可以抑制FAK的磷酸化,并且促进FAK的入核,进而导致了p53的降解;而过表达ANGPTL3可以抑制FAK的入核,从而抑制p53的泛素化降解,提高p53的表达量。
  结论:
  ANGPTL3在肾癌索拉非尼敏感的组织中高表达,在索拉非尼耐药的组织中低表达,并且索拉非尼在治疗ANGPTL3高表达的肾癌时有着较好的疗效。在索拉非尼作用下FAK进入细胞核促进p53的泛素化降解,导致细胞的耐药;ANGPTL3通过结合FAK,影响了FAK的入核,抑制了p53的泛素化,从而促使p53保持在一个较高的水平,促进了细胞的凋亡等过程,提高了索拉非尼的治疗效果。因此,ANGPTL3可能作为预测肾癌索拉非尼敏感性的生物学标志物,其下游FAK的入核以及p53的泛素化降解也有望成为肾癌靶向治疗的新靶点,有着较好的临床转化前景。
[硕士论文] 楼棪
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨转移是乳腺癌患者肿瘤发展的终末期。多达70%的BC患者在尸体解剖时可见骨转移灶。骨转移病灶主要是溶骨性的,因为BC细胞可以调节骨肿瘤微环境。乳腺癌细胞分泌的细胞因子可以进一步促进破骨细胞分化成熟,促进破骨活动,破骨细胞活动增强可释放更多的因子刺激乳腺癌细胞,进一步促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,进一步促进转移病灶的发展。形成一个“恶性循环”。目前治疗BC骨转移的策略主要集中在打破这种“恶性溶骨循环”。绝大多数乳腺癌产生溶骨性骨转移。该过程的特征在于过度活化的破骨细胞形成和随后的骨破坏。BC细胞在定植于骨之后,甚至之前,可形成一个复杂的多基因程序性“恶性溶骨循环”,重塑骨微环境,促进癌症发展。IL-6,PTHRP(甲状旁腺激素相关蛋白)和TNFα(肿瘤坏死因子α)等BC细胞分泌的细胞因子可刺激成骨细胞,上调RANKL/OPG(骨保护素)比例,从而进一步刺激髓系破骨细胞前体细胞的分化。同时其他细胞因子如IL-11(白细胞介素11)和OPN(骨桥蛋白)也能直接促进其向破骨细胞分化。活化的破骨细胞降解骨基质,并释放主要储存在骨基质中的TGFβ(转化生长因子β),BMPs(骨形态发生蛋白)和IGFs(胰岛素样生长因子),反过来,促进BC进展。
  有研究已经证明了乳腺癌细胞系中PAF及其受体PTAFR的表达。在肿瘤微环境中,PAF由浸润的炎症细胞和肿瘤细胞本身分泌和积累,形成自分泌循环。PTAFR是G蛋白偶联受体(GPCR)。PAF/PTAFR信号通路激活导致复杂的细胞反应,包括细胞运动的增加,IL-6(白细胞介素6)和MMP(基质金属蛋白酶)表达的上调以及NF-κB信号的激活。迁移能力的增加是癌细胞形成转移性病变的重要特征,包括骨转移。已发表的文献和我们的结果都揭示了PAF处理后乳腺癌细胞的迁移能力增加。
  在本实验中,我们首先通过生物信息学分析提供了PAF/PTAFR信号通路在调节BC骨转移和破骨细胞生成中起重要作用的线索。
  在目前的研究中,我们证明PAF可以促进BC细胞迁移并诱导BMMs分化。海风藤酮可以减弱这两个过程,并且表现出很小的细胞毒性,可以被认为是BC骨转移的潜在治疗剂。与“恶性溶骨循环”相比,PAF能够通过两种平行方式促进BMMs分化为破骨细胞。一方面,PAF能刺激BC细胞上调IL-6,IL-11,MMPs和NF-κB等下游信号,进一步激活破骨细胞生成。另一方面,PAF也可以直接激活BMMs分化成破骨细胞。另一方面,PAF也可以直接激活BMMs分化成破骨细胞。在目前的研究中,我们证明了海风藤酮可以抑制BC诱导或PAF直接刺激破骨细胞生成。海风藤酮处理后破骨细胞分化标记的表达均下调。这个过程主要是由于NF-κB激活的抑制。
  总之,海风藤酮可能是一种有效的策略,通过阻断PAF/PTAFR信号通路,减弱乳腺癌形成的溶骨性骨转移。
[硕士论文] 李腾达
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  第一部分 PANC-1及HPDE6-C7细胞系外泌体的分离鉴定及特征性因子的检测
  本部分实验采用常规培养方法分别培养胰腺癌细胞系PANC-1和正常细胞系HPDE6-C7。外泌体分离采用超高速密度梯度离心法。分离得到的外泌体于透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)下进行粒径和大小的观察。外泌体计数采用纳米分子追踪分析(Nanosight Tracking Analysis,NTA)技术,经计算五次实验得到均值作为其最终浓度。外泌体表面分子的鉴定采用磁珠捕获结合流式分析法和流式纳米分析法,蛋白定量采用BCA法,ZETA电位经Zetasizer Nano仪器测得。经实验,透射电镜结果显示,PANC-1与HPDE6-C7细胞系来源的外泌体(以下简称EXO-PANC1,EXO-HPDE6-C7)直径在30-180nm之间;NTA分析得到EXO-PANC1溶液的浓度为2.72*1010±2.05*109个/ml,EXO-HPDE6-C7溶液的浓度为2.43*1010±2.21*109个/ml;BCA法测定EXO-PANC1溶液的蛋白浓度为111.31μg/ml,EXO-HPDE6-C7溶液为109.89μg/ml;Zeta电位分析得到EXO-HPDE6-C7的ZETA电位为-25.4mV,EXO-PANC1为-10.1mV。磁珠结合流式分析结果显示,CD9,CD63不能显著地将EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7区别开,而磷脂酰肌醇聚糖-1(Glypican-1,GPC-1)和巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)可明显将两者区别开来,流式纳米分析结果显示EXO-PANC1表面高表达MIF与GPC1抗原。本部分结果证明PANC-1与HPDE6-C7得到的外泌体符合目前文献规定的相关特性(粒径大小,CD9,CD63分子的表达),在胰腺癌细胞系来源的外泌体中高标达的GPC1与MIF分子可作为后续实验检测的靶向分子。
  第二部分 包被抗体的多巴胺芯片及SERS探针相关制备条件的摸索
  本部分实验中我们初步拟定了多巴胺芯片的制备步骤并探讨了多巴胺溶液浓度对芯片合成效果的影响。对用于表面增强拉曼散射(surface-enhanced raman scattering,SERS)技术检测的纳米探针的合成,我们首先采用经典途径合成18nm AuNPs作为核心,进而逐渐形成Au@Ag@pATP材料结构。为了保护较为脆弱的银层,我们在银表面添加了一层保护性牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)。为将检测抗体连接到纳米颗粒表面同时不影响其稳定性和生物相容性,我们利用多巴胺的聚合作用将抗体黏附到纳米颗粒表面,从而形成了多层包被的纳米球SERS探针结构。我们对SERS探针的TEM镜下成像、紫外光谱、SERS光谱等特性进行了鉴定,并对探针合成过程中关键性影响因子-AgNO3溶液浓度及pATP溶液浓度进行了摸索。经实验,我们得知在多巴胺溶液浓度为33mM时芯片合成聚合效果最佳。SERS探针合成过程中AgNO3溶液为0.096mM,pATP溶液为9.6mM时效果最佳。TEM电镜下观察到Ag层的厚度为1nm左右,多巴胺为3nm左右,紫外可见吸收光谱观察到金纳米颗粒仅有一个吸收峰(521nm),而SERS探针有两个吸收峰(400nm与500nm),分别来源于银与金纳米颗粒。拉曼光谱显示SERS探针有较强的拉曼信号峰(1072-1076cm-1)。在低功率(0.05mW)和短扫描时间(10ms)的条件下,拉曼信号依旧可以获得。经本部分实验摸索得到的上述多巴胺芯片-SERS体系的优化条件将用于进一步实验体系的建立。
  第三部分 多巴胺芯片-SERS检测系统用于细胞系外泌体的检测及其体系优化
  本部分实验我们分别以不同抗原为靶点,利用前期建立的多巴胺芯片-SERS体系对EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7进行了检测。结果表明以GPC1或MIF为靶点的多巴胺芯片-SERS检测体系能够将EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7进行区分,以CD9,CD63为检测位点不能有效地将两者区分。我们进一步加入表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR),对分别以MIF,GPC1,EGFR,CD63这四种抗原为靶点的多巴胺芯片-SERS体系的检测效能进行了评价,发现MIF/GPC1/EGFR组具有相同的最低检测限(9.0*10-19mol//L),而CD63组不能检测到该最低浓度下的外泌体。从各组得到的线性方程式来看,MIF组线性方程式的斜率最高,证明其检测灵敏度更高。接下来,我们以MIF为检测靶点对EXO-PANC1进行了检测,并对其进行了标准曲线绘制,低浓度外泌体溶液条件下的线性拟合方程公式为y=-2.4152+1.2392x。该体系可检测到2μl浓度为5.44*102个/ml外泌体溶液中的EXO-PANC1,相比较于商业化ELISA试剂盒灵敏度大大提高。本部分结果显示以MIF为靶点的多巴胺芯片-SERS检测体系其诊断效能远高于其他体系,可用于后续临床标本的测定。
  第四部分 多巴胺芯片-SERS检测系统用于胰腺癌患者血清标本的检测及检测效能的评价
  本部分实验中我们首先以MIF/GPC1/EGFR为靶点利用多巴胺芯片-SERS体系对胰腺癌患者和健康人血清标本进行了检测,结果表明仅MIF-SERS体系能够将胰腺癌患者与正常人、胰腺癌患者P1~2与P3期、胰腺癌患者转移与未转移组进行区分(P<0.05)。我们进一步将MIF-SERS体系检测结果与临床检测指标癌抗原(cancer antigen19-9,CA19-9),癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)及MIF-ELISA商品化试剂盒检测结果进行了比较,发现CA199能够将胰腺癌患者与健康人区别开(P<0.05),但不能将胰腺癌患者P1~2与P3期、转移与未转移组进行区分(P>0.05),其与MIF-SERS体系有相似的灵敏度(68.2%vs62.5%)与特异性(72.7%vs76.2%)。对CEA的结果分析显示,该指标不能将上述三组进行区分(P>0.05),其灵敏度较MIF-SERS体系降低了21.6%,特异性降低了12.6%。ELISA法的灵敏度与特异性相比较于MIF-SERS体系分别降低了21.6%,16.2%。此外,与上述经典方法比较,MIF-SERS体系的血清用量大大减少(1-2mL vs2μL)。根据标本检测值我们初步制定以MIF为靶点的log(拉曼信号)的临床参考值范围为胰腺癌vs正常:3.77±0.15vs2.67±0.80,cutoff值为3.55,拉曼信号成像点的扫描信号强度阈值为20。接下来,我们用统计学方法对MIF,GPC1,EGFR三组的检测结果进行了联合分析,发现联合诊断的灵敏度较单独的MIF-SERS体系提高了12.5%,特异性与MIF-SERS体系相当(75.0%vs76.2%),经计算其cutoff值(胰腺癌患者vs健康人)为0.27。通过本部分实验,我们基本上构建了以MIF为靶点的多巴胺芯片-SERS检测体系,该体系结合GPC1,EGFR等检测指标,有希望应用于临床检测与胰腺癌的辅助诊断。
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