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[博士论文] 常继伟
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:如何从大量数据中挖掘出有意义的信息,如何把复杂的研究对象用精确而简明的模型描述出来一直是数据处理工作中的中心课题。针对这个问题有两种截然不同的方法:数据挖掘和复杂网络理论。复杂网络和数据挖掘方法不仅有着相似的研究目的,而且其分析对象在多数情况下也相同。但在实验数据分析中将两者协同应用解决同一问题的情况比较少,主要原因是两者在分析对象上有较多重叠,在多数情况下仅用一种方式就可以解决问题。但实际上,将数据挖掘和复杂网络很好的结合起来解决问题会给数据分析提供新的思路。本研究将复杂网络和数据挖掘相结合,同时用于分析癌症相关基因/蛋白,结果表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。
  对癌症的研究积累了大量而且类型丰富的数据,利用这些数据发现癌细胞中关键的基因及其作用途径一直是重要的研究方向。得益于丰富的数据,癌症领域的数据分析方法也层出不穷,其中结合蛋白质相互作用网络分析基因及蛋白功能的方法是一个重要的类别。在癌症相关的信号传导,细胞定位和表达调控等过程中蛋白质相互作用扮演重要的角色,因此以蛋白质相互作用为基础整合其它组学数据的生物信息方法对分析参与这些过程的关键基因及蛋白至为重要。本研究不仅以人类蛋白质相互作用网络为基础,结合基因表达、基因重要性及基因突变数据优选并分析了癌症相关基因/蛋白和蛋白组合,还利用新的模型将生物网络与组学数据有效的结合起来,为后续分析提供帮助。本文的工作主要包含以下两个方面:
  (1)结合蛋白质相互作用网络和蛋白质、基因的表达数据预测新的癌症相关基因和蛋白质组合。蛋白质相互作用网络是典型的复杂网络,网络中每条边表示一对蛋白质的相互作用关系。表达数据包含基因或蛋白质在癌症组织、癌症细胞系和正常组织的样本中的表达量的信息,比较两类样本可以得到与癌症关联密切的基因或蛋白质。本研究将蛋白质相互作用网络用于构建稀疏的自动编码机,而后用癌症细胞系和正常组织的差异表达数据作为训练数据,训练后的自动编码机同时包含相互作用信息和差异表达信息。将训练得到的自动编码机用于构建一个深层模型,来模拟每个蛋白质/基因敲降对其它蛋白质/基表达的影响,最后将这种影响关系表示为有向网络的形式。蛋白间相互影响的有向网络可以用于鉴定新的癌症相关蛋白。在本研究优选的TOP500个高可信度的癌症相关蛋白中有211个为已知的癌症药物靶点,其余蛋白质的功能与癌症也密切相关。与其它方法相比较该方法有较高的AUC值(>0.8)。蛋白间相互影响的网络也可以用于预测蛋白组合。本文中提到的蛋白组合可以是合成致死组合,也可以是药物靶标的组合。这两类蛋白组合在蛋白相互影响网络中都与特定的蛋白存在密切联系。本研究利用已知的蛋白组合将这组蛋白质识别出来,并用于识别新的蛋白组合。交叉验证表明该策略有较高的准确度(>0.85),可以用于鉴别新的蛋白组合。进一步将该模型用于前列腺癌的单细胞测序数据集,单细胞测序可以检测病患体内癌细胞群体的演化,对临床治疗有重要意义。文中利用前列腺癌的数据集训练模型且计算了相应的蛋白影响网络,然后利用该网络识别了前列腺癌蛋白,其中包含已知的前列腺癌基因。这表明该模型适用于单细胞测序数据和小样本数据,具有良好的应用前景。
  (2)结合蛋白质相互作用网络和基因重要性数据寻找复杂的基因关联关系。在本研究中蛋白质相互作用网络依然表示两个蛋白质间的相互作用关系。基因重要性数据是通过CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)试验方法随机突变细胞系基因组得到,简单来讲基因重要程度越高,可以承受的突变越少。通过比较初始CRISPR随机突变的细胞系和经过一段时间的培养的细胞系间基因组的差异可以得到基因重要性数据。本研究将基因的重要性数据通过新方法转换为蛋白质相互作用的重要性。相互作用的重要性可以用于筛选重要的互作,计算相互作用间的相关性以及重新评估基因的重要性。本研究利用蛋白相互作用的相关性发现了以细胞因子信号通路相关的蛋白互作为核心的网络,为理解细胞因子对其它生物学途径的调控提供了方向。另外用高重要性相互作用构建的子网络包含了关键蛋白质行使功能时的互作信息,为优选关键相互作用提供了新的工具。最后本文利用该方法发现了差异表达基因与高频突变基因之间的关联。
  本研究通过以上的实验表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。两个方法都是以相互作用为基础,在模型构建时同时利用组学数据进行训练,因而可以将两种数据有机的结合在一起。对癌症相关基因/蛋白的分析表明这种结合对分析生物学数据是有帮助的。
[硕士论文] 董其燕
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:恶性肿瘤现已成为我国居民的主要死亡原因。转移是恶性肿瘤难治、易复发的主要原因,其中肿瘤脑转移是恶性肿瘤转移的最严重后果之一,一旦发生脑转移,预后非常差,5年存活率极低。因此,研究肿瘤细胞脑转移机制对于我国癌症病人来说具有重要意义。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易发生脑转移的三种癌症。本课题旨在应用模式动物斑马鱼,建立用于肿瘤脑转移机制研究的活体模型,并进一步探索肿瘤脑转移的分子机制以及肿瘤细胞外泌体在肿瘤脑转移中的作用。研究结果总结如下:
  1.在血脑屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑马鱼胚胎心包腔部位注射带有红色荧光标记的鼠源性黑素瘤细胞tfRFP-B16-F10,对肿瘤细胞的转移进行检测和统计:胚胎存活率、注射部位含有肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。同时我们选取移植后的幼鱼进行活体成像实验,实时观察肿瘤细胞突破血脑屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)进入脑组织的过程,我们发现肿瘤细胞是通过不断地变形穿过脑内皮细胞间隙进入脑实质,在脑内皮细胞间紧密连接出现以后,肿瘤细胞的脑转移率大大降低,而紧密连接正是血脑屏障实现其功能的主要一部分,因此,我们得出结论:血脑屏障在抑制肿瘤细胞脑转移的过程中发挥了重要作用,另外,通过对发生脑转移2d后的斑马鱼幼鱼进行长时程转盘共聚焦拍摄,我们发现脑转移的肿瘤细胞沿着血管壁扩增延伸,细胞集群不断扩大,这与之前文献报道的脑转移生长情况相符,而且通过本部分实验,我们成功建立了研究肿瘤脑转移的斑马鱼模型。
  2.在血脑屏障开始形成后即3dpf的斑马鱼幼鱼心包腔部位注射3-D纤维软胶培养富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性细胞和普通培养的tfRFP-B16-F10肿瘤细胞,分别统计注射不同培养肿瘤细胞的胚胎存活率、注射部位肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。数据统计结果表明3-D纤维软胶培养的高致瘤性细胞无论是总体转移率还是脑转移率都要高于普通培养瓶培养的肿瘤细胞。因此,高致瘤性细胞的转移潜能更强。另外,我们利用荧光显微镜连续观察同一条幼鱼体内转移的肿瘤细胞,可以很明显的观察肿瘤细胞在转移部位的生长。
  3.外泌体是30-100um的囊泡结构,在肿瘤细胞转移过程中起重要作用,然而对于其作用机制的了解还不全面,因此我们拟利用本课题所建立的肿瘤脑转移斑马鱼模型研究外泌体促进脑转移的分子机制。我们利用DiI荧光染料使体外提取的外泌体带上红色荧光,将DiI-exosomes注射进2dpf的斑马鱼胚胎心包腔部位,利用转盘共聚焦显微镜观察外泌体与血脑屏障脑内皮细胞间的相互作用,我们发现外泌体可以被绿色荧光标记的脑微血管内皮细胞吸收,并且红色荧光与脑内皮细胞的绿色荧光存在共定位长达4h甚至更长,结果说明外泌体与脑内皮细胞间存在相互作用,而这种相互作用很可能对肿瘤细胞穿过血脑屏障具有重要影响。我们先后尝试了5次tfRFP-B16-F10及其外泌体的共注射以及1次非小细胞肺癌细胞A549及其外泌体的共注射,监测脑转移,并进行统计分析,然而实验结果与预期有较大出入,我们需要探究新的建模方式来构建斑马鱼模型研究外泌体对肿瘤细胞脑转移的影响。
[硕士论文] 余今菁
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究结直肠腺癌与腺瘤性息肉患者肠道微生物群落构成变化,探索肠道菌群和结直肠腺癌发生发展间的内在关系。
  方法:选取湖北地区于武汉天佑医院和十堰太和医院消化内科就诊的结直肠腺癌、腺瘤性息肉患者及健康对照人群的粪便样本,应用Illumina Miseq高通量测序平台进行16S rRNA基因V4区测序,采用生物信息学方法分析肠道微生物群落结构、丰度与多样性的变化,筛选与结直肠腺癌发病有显著相关的微生物种属。
  结果:1、本研究最终纳入结直肠腺癌51例,腺瘤性息肉54例,健康对照组42例,组间在年龄、性别上无差异(P>0.05);
  2、测序数据质控后进行OTU分析,共得到1416个OTU,采用稀释曲线、observed species指数、chao指数、shannon指数及simpson指数等Alpha多样性指数进行分析,证实测序量足够覆盖肠道菌群种属,各组样本的丰富度和均匀度良好,随健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化,组内物种多样性呈下降趋势;
  3、在门水平上,三组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门,且样本均表现出明显的个体差异,属水平上三组共包含168个菌属,其中菌群多样性最高的菌属属于厚壁菌门,丰度最高的菌属均来自拟杆菌门;
  4、PCA分析和PCoA分析发现,在结直肠腺癌与健康对照组、腺瘤性息肉与健康对照组间均展现出组间聚类,表明疾病组与对照组间肠道菌群物种多样性存在差异;结直肠腺癌组与腺瘤性息肉组在PCA分析中未表现明显差异,两组菌群构成较为相似;
  5、样品组间菌群构成显著性差异分析发现,门水平上,变形菌门、梭杆菌门相对丰度随健康-腺瘤-腺癌的疾病发展呈升高趋势,厚壁菌门的相对丰度随疾病发展呈降低趋势,厚壁菌门/拟杆菌门比值在CRA组与CRC组中降低;在属水平上,乳杆菌属、消化链球菌属、微单胞菌属、梭菌属、弯曲菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、副球菌属、Morganella菌属、Aggregatibacter菌属、海杆菌属、拟杆菌属、紫单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、Scardovia菌属、奇异菌属、Bulleidia菌属和密螺旋体属的相对丰度在健康、腺瘤、腺癌样本中逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);而罗氏菌属、粪球菌属、Faecalibacterium菌属、Blautia菌属、Anaerostipes菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度在健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化过程中显著降低(P<0.01)。
  结论:肠道菌群与结直肠腺癌及其癌前病变的发生发展存在密切关系,Faecalibacterium菌属、罗氏菌属等丁酸盐产生菌在腺癌及腺瘤性息肉中低表达,弯曲菌属、假单胞菌属、梭形菌属等细菌的丰度变化与癌变过程呈正相关。
[硕士论文] 程小玲
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:目前长链非编码RNA H19对于宫颈癌Hela细胞生物学功能的作用及其作用机制尚缺乏相关研究。本文主要探讨了LncRNA H19在宫颈癌Hela细胞中的生物学功能研究。
  方法:本研究选择在3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)和正常上皮细胞株(H8)中来检测LncRNA H19的表达。构建含H19基因的重组真核表达载体pCDNA3.1-GFP-H19,经双酶切及基因测序等鉴定构建成功,并合成siRNA的LncRNA H19干扰序列,同时设置空白对照组、pCDNA3.1-GFP组及si-NC组。各组细胞转染48h后采用RT-qPCR法检测LncRNA H19mRNA相对表达水平;采用CCK-8法检测在转染后24h、48h、72h及96h细胞的增殖率;采用流式细胞仪分别检测各组24h和48h细胞凋亡率;采用细胞划痕实验检测各组细胞转染后的迁移数,评估细胞迁移能力;采用Transwell细胞体外侵袭实验检测各组细胞转染后的侵袭能力;采用Western blotting的方法检测LncRNAH19对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达。
  结果:3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)中LncRNA H19的表达明显高于正常上皮细胞株(H8)中LncRNA H19的表达。首先,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外增殖和抑制其凋亡,沉默LncRNA H19可以显著抑制Hela细胞体外增殖和促进其凋亡。其次,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外迁移、侵袭,沉默LncRNA H19可以抑制Hela细胞体外迁移、侵袭,该效应直接与EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达相关。
  结论:上调LncRNA H19可以显著促进宫颈癌细胞增殖和抑制宫颈癌细胞凋亡,下调LncRNA H19表达则反之;上调LncRNA H19促进宫颈癌细胞迁移、侵袭,下调LncRNA H19表达则反之,同时可以引起EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达发生改变。LncRNAH19在宫颈癌的发生、发展及预后中充当了重要角色,有可能作为一个发现及判断其预后的潜在生物标记物。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[硕士论文] 司秀花
计算机科学与技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:前mRNA剪接是一种复杂且无处不在的核过程,它是基因表达中引起致癌错误的天然来源。此外,过去20年来的许多研究报道了在没有基因组突变的情况下癌症特异性的选择性剪接。受影响的蛋白质包括转录因子,细胞信号转导子和细胞外基质的组分。针对癌细胞上可选剪接产物的抗体目前正在进行临床试验,跨越选择性剪接区域的竞争性逆转录PCR被用作简单的诊断测试。除了与癌症相关之外,替代基因产物的性质通常与癌症中的积极作用一致;因此,可变剪接过程本身就是基因治疗的潜在目标。因此本文的主要工作如下:
  (1)随着大量DNA序列的快速增长,基因预测已成为生物信息学的一个难题。剪接位点预测在基因鉴定中起关键作用。因此,开发提高剪接点预测精度的新方法具有重要意义。通过将RF与三种最新的编码方法(MM1,MM2和MCM)相结合,我们证明了所提出的方法与基于SVM的方法执行大致相同并且通常更好。此外,所提出的方法简单,快速,易于使用并且可以应用于大规模人类基因组数据以鉴定剪接位点。作为未来的研究,这些方法也可用于鉴定其他调控区域,如翻译起始位点和启动子。
  (2)尽管已知的可变剪接事件的目录从此一直在增长,但在疾病情况下或在大量人群中工作时,通常会观察到新的异构体。鉴于完整同种型的鉴定在技术上是具有挑战性或昂贵的,将重点放在单剪接事件上作为转录组特性的替代物对于广泛的分析是富有成效的。我们提供SplAdder,一种基于RNA-Seq数据的大规模分析选择性剪接事件的新方法。SplAdder已成功应用于各种生物体的拼接分析,与其他各种先进方法相比,显示出高度的整体准确性,并可轻松应用于数千个样本的数据集。我们正在努力进一步改进SplAdder,以便本机处理高性能计算集群并生成更多交互式可视化。
  (3)我们已经鉴定出许多在正常和癌性组织之间差异剪接的基因。大多数实验验证的组织特异性选择性剪接事件发生在涉及细胞骨架结构,细胞外基质或细胞-细胞相互作用的基因中。这些事件中的一些报道了以组织特异性方式发生的剪接变体,并且可能由于结肠上皮和平滑肌细胞去分化而代表组织功能的丧失而不是帮助转化或转移。确定这些剪接事件的作用需要更详细的研究,但在大多数情况下,这些基因以前与肿瘤进展中的活性作用有牵连。
[硕士论文] 伍睿
外科学(肝胆外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  胆囊癌(Gallbladder Carcinoma,GBC)和胆管癌(Cholangiocarcinoma)同属胆道系统恶性肿瘤,其中胆管癌根据原发肿瘤起源于胆管树上皮位置的不同,分为肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和肝外胆管癌(Extrahepatic Cholangiocarcinoma,EHC),肝外胆管癌又可再细分为肝门部胆管癌(Hilar Cholangiocarcinoma,HCCA)和远端胆管癌(Distal Cholangiocarcinoma,DCCA)。胆道肿瘤恶性程度高,转移侵袭性强,易复发,预后差。迄今为止,手术根治切除仍然是获得较好预后的唯一方法。通常术前依靠肿瘤标志物结合影像学检查结果对手术可行性进行评估并制定手术方案,但由于胆道肿瘤位置特殊周围结构复杂、易于侵犯周围肝脏和大血管,局部扩散和淋巴结转移等情况在术前评估中往往不易被发现,最终影响手术过程和效果。
  循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是指从肿瘤原发灶脱落至外周血中的肿瘤细胞,因为在肿瘤转移过程中发挥重要作用,近年来在越来越多的肿瘤相关领域被广泛研究。现已逐步证实循环肿瘤细胞与肿瘤的临床分期和预后状况紧密相关。循环肿瘤微癌栓(Circulating Tumor Microemboli,CTM)是指外周血中发现的由2个或更多循环肿瘤细胞聚集在一起组成的细胞团。其相比与单个循环肿瘤细胞,具有更强的侵袭和转移潜力。目前对于不同类型的肿瘤,循环肿瘤细胞及循环肿瘤微癌栓相关研究已逐步展开,但在胆道肿瘤研究中,其在临床应用中的价值尚不明确
  本研究旨在通过检测胆囊癌及胆管癌患者术前循环肿瘤细胞计数水平及循环肿瘤微癌栓阳性率,结合各肿瘤术后临床病理分期情况,评估其作为诊断指标的诊断效能,并探索其与传统肿瘤标志物在疾病诊断评估方面的优势。
  研究方法:
  1、根据预先设计的纳入标准,选取拟行手术治疗的胆囊癌、胆管癌患者共105例,于术前1日采集静脉血通过使用带孔滤膜法系统鉴定循环肿瘤细胞和循环肿瘤微癌栓,根据排除标准,最终76例行手术治疗患者被纳入研究;
  2、术后采集研究患者的临床基本信息、CEA、CA19-9水平及病理相关资料,并根据最新美国癌症分期联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版胆道肿瘤分期标准对每个患者进行TNM分期;
  3、进行统计分析,评价CTCs计数水平、CEA水平、CA19-9水平在不同胆道肿瘤中对不同TNM分期的诊断效能,并分析CTM发现阳性率在不同胆道肿瘤的不同TNM分期中的差异性。
  研究结果:
  1、在胆囊癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分胆囊癌和良性病的诊断敏感性为95.45%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.964(P=0.0001)。当截断值选择>5个/5ml时,CTCs计数显示可以区分肿瘤T分期T1+2和T3+4的诊断敏感性为66.67%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.875(P=0.0001)。当截断值选择>3个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤TNM分期Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的诊断敏感性为85%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.9(P=0.0001);
  2、在肝内胆管癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分肝内胆管癌和良性病的诊断敏感性为76.47%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.916(P=0.001)。当截断值>3个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤T分期T1和T2+3+4期的诊断敏感性为78.57%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.905(P=0.0001)。当截断值>5个/5ml时,CTCs计数显示区分肿瘤M0和M1期的诊断敏感性为100%,特异性为71.43%,ROC曲线下面积为0.893(P=0.0024);当截断值>5个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤TNM分期Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的诊断敏感性为58.33%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.808(P=0.0045);
  3、在肝门部胆管癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分肝门部胆管癌和良性病的诊断敏感性为80%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.896(P=0.001)。但CTCs计数对肝门部胆管癌TNM各分期之间诊断效能较差(P>0.05);
  4、远端胆管癌组,选取CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分远端胆管癌和良性病的诊断敏感性为91.67%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.9333(P=0.0001)。当截断值>4个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤T分期中T2和T3期的诊断敏感性为80%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.875(P=0.0001);
  5、CTM在胆囊癌、肝内胆管癌、肝门部胆管癌、远端胆管癌各组的阳性率分别为0%、16%、12%、16%。各组内CTM阳性率在T分期、N分期、M分期及TNM分期中未见明显差异(P>0.05)。
  研究结论:
  1、术前CTCs计数作为诊断指标在区分胆道肿瘤良恶性疾病时,普遍具有较好的诊断价值,可作为传统肿瘤标志物的辅助参考依据;
  2、术前CTM在胆道肿瘤中阳性率普遍很低,且与TNM分期间无明显相关性。
[硕士论文] 王宇璐
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  探讨在中国汉族人群中,GSTP1基因rs1695位点多态性与肺癌易感性的关系。并根据年龄、性别、吸烟情况、肿瘤家族史和病理类型进行分层分析,观察在各亚层中GSTP1基因rs1695位点多态性与肺癌易感性之间的关联。
  研究方法:
  采用病例对照研究方法,选取上海及江苏泰州地区汉族人群中经病理诊断为肺癌患者974例和健康体检者1005例入组本研究。采集研究对象的外周静脉血标本,然后采用血液基因组DNA小量提取试剂盒提取基因组DNA,采用SNPscanTM方法对GSTP1基因rs1695位点进行基因分型。基因分型质量控制按照质量控制(QC)流程进行,包括大于95%的成功检出率、重复检出基因型、内部阳性对照样本检测以及Hardy—Weinberg遗传平衡检验。
  采用Student t检验及x2检验比较病例组与对照组在年龄、性别、吸烟状态、肿瘤家族史方面的差异,以及两组GSTP1基因rs1695位点A、G等位基因频率及AA、GA、GG基因型频率分布差异。用非条件logistic回归分析等位基因模型、基因型模型、显性基因模型和隐性基因模型与肺癌风险的关联,并对研究对象的年龄、性别、吸烟状况和肿瘤家族史进行校正,结果以比值比(odds ratios,ORs)及其95%的置信区间(confidence intervals,CIs)表示。采用SPSS19.0统计学软件进行所有统计分析,所有的p值都是双侧检验,p<0.05为具有统计学意义。
  研究结果:
  1.本研究包括974例肺癌患者及1005例健康体检者,两组性别、年龄比较差异无统计学意义(p=0.101,p=0.944)。肺癌组中吸烟者及有肿瘤家族史者均多于对照组,差异均有统计学意义(p<0.001)。
  2.本研究中基因分型检出率为99.9%。GSTP1基因rs1695A/G位点基因型频率符合Hardy—Weinberg遗传平衡(p>0.05)。
  3.肺癌组与对照组中A、G等位基因频率差异无统计学意义(x2=3.785,p=0.053),G等位基因携带者罹患肺癌的风险降低(OR=0.811,95%CI0.684-0.961,p=0.016)。两组间各基因型的分布频率差异无统计学意义(x2=4.072,p=0.131)。GG基因型使肺癌风险降低(OR=0.591,95%CI0.347-0.988,p=0.048),GA基因型与肺癌风险无明显关联(OR=0.838,95%CI0.683-1.028,p=0.091)。
  4.分层分析显示,G等位基因携带者罹患肺癌的风险在男性(OR=0.784,95%CI0.639-0.962,p=0.020)、有吸烟史的人群(OR=0.732,95%CI0.591-0.906,p=0.004)、无肿瘤家族史的人群(OR=0.782,95%CI0.643-0.950,p=0.014)以及肺腺癌患者(OR=0.798,95%CI0.641-0.990,p=0.042)中有所下降。在女性、无吸烟史的人群、有肿瘤家族史的人群以及肺鳞癌患者和小细胞肺癌患者中,是否携带G等位基因与肺癌发生风险之间无明显关联(p>0.05)。
  研究结论:
  GSTP基因rs1695位点多态性与肺癌发病风险相关联,有望成为肺癌风险预测的靶点。
[博士论文] 秦文昊
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景与目的:
  胆固醇对于维持细胞正常的生理功能有着重要的意义。随着人类生活方式及饮食结构的改变,高胆固醇血症患者急剧增多。大量研究表明,高胆固醇血症是许多严重疾病的危险因素,包括动脉粥样硬化,冠心病及脑卒中等。但是,胆固醇与恶性肿瘤之间的关系一直备受争议。在一些流行病学研究中,血液总胆固醇水平与肝癌、食管癌、肺癌、胃癌等的发病呈明显的负相关,而与膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌等的发病呈正相关,而且相关关系会受性别和人种等差异的影响。这些结果表明胆固醇在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用,且在不同类型的肿瘤中具有不同的作用模式,但其分子机制一直未被阐述清楚。因此,深入研究高胆固醇血症对肿瘤的影响并明确相关分子机制,对于肿瘤的预防和治疗均具有重要意义。
  方法及步骤:
  1.利用循证医学方法研究血胆固醇水平与多种肿瘤发生风险的关系
  检索收集已发表文献,提取数据进行循证医学统计和分析,明确胆固醇代谢异常对总肿瘤、肝癌、肺癌发病率的影响,为本项目的研究题目提供可靠的现实依据。
  2.构建饮食诱导及基因型诱导小鼠高胆固醇血症模型
  高胆固醇饮食诱导:给予6-8周龄野生型C57小鼠高胆固醇饮食4周,诱导小鼠产生高胆固醇血症。
  ApoE基因缺失小鼠:C57遗传背景下的ApoE-/-小鼠会自发产生高胆固醇血症。被广泛用于动脉粥样硬化相关研究,本研究采用6-8周龄ApoE-/-小鼠进行后续实验。
  3.在高胆固醇血症小鼠模型基础上,构建小鼠荷瘤、诱癌以及肿瘤转移模型
  荷瘤模型:采用皮下荷瘤的方法,观察黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌细胞在高胆固醇血症小鼠模型中的生长情况。
  诱癌模型:通过给予出生15天小鼠腹腔DEN注射(25mg/kg)诱发肝癌形成,观察高胆固醇血症小鼠的肝癌发生发展情况。通过支气管灌注Cre病毒的方法,诱发KrasG12D小鼠肺部特异性的Kras突变激活,诱发小鼠肺癌,观察小鼠高胆固醇血症对肺癌发生发展的影响。
  黑色素瘤肺转移模型:经小鼠尾静脉注射黑色素瘤细胞,构建小鼠黑色素瘤肺转移模型,观察小鼠高胆固醇血症对黑色素瘤肺转移的影响。
  4.通过转录组测序等方法探寻高胆固醇影响肿瘤发生发展的途径
  收集对照组及高胆固醇组的小鼠荷瘤组织,进行转录组测序分析,并对差异基因进行KEGG及GSEA分析,探索相关的基因及信号通路改变。
  5.检测高胆固醇对免疫细胞的影响,明确发挥作用的关键免疫细胞亚群
  利用PCR及流式检测方法检测荷瘤组织中免疫细胞的相对比例,观察自然杀伤细胞(NK)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NKT细胞及DC细胞的相对比例和绝对数变化。
  利用相应清除性抗体清除各类免疫细胞,观察对照小鼠及高胆固醇小鼠的肿瘤生长差异,明确发挥作用的免疫细胞亚群。
  6.检测高胆固醇对于关键免疫细胞功能以及杀伤能力的影响
  利用PCR及流式检测方法,分析高胆固醇组免疫细胞的活性,并通过细胞毒性实验、脱颗粒实验及细胞过继实验,证明高胆固醇组来源的免疫细胞在体内外,均具有较强的杀伤肿瘤细胞的能力。
  检测对照组及高胆固醇组免疫细胞胆固醇含量的变化,并通过体外人为调节免疫细胞胆固醇水平,调节其杀伤肿瘤细胞的能力。
  7.探索高胆固醇影响关键免疫细胞功能的分子机制
  检测对照组及高胆固醇组免疫细胞中免疫受体数量、定位的变化,相关通路的活化情况,明确高胆固醇调控免疫细胞功能的关键通路与分子事件。
  8.探索通过调节胆固醇代谢改善免疫细胞抗肿瘤活性的方式方法
  利用慢病毒过表达低密度脂蛋白受体(LDLR)或PCSK9抗体抑制免疫细胞表面LDLR的降解,检测这些方法对免疫细胞内胆固醇含量及其肿瘤杀伤能力的影响。
  结果:
  首先,我们通过荟萃分析(Meta),发现人群恶性肿瘤总体发病率,以及肝癌、肺癌的发生率与血总胆固醇水平呈明显的负相关。在高胆固醇组小鼠体内,多种肿瘤的发生、生长及转移受到抑制。转录组测序分析证明,对照组与高胆固醇组的差异基因在免疫系统及免疫细胞活化相关通路有着明显富集。同时,高胆固醇血症对肿瘤的抑制现象在NSG小鼠中不复存在,这表明此抑制作用可能和免疫系统密切相关。随后,我们发现在高胆固醇小鼠的肿瘤组织中NK细胞比例明显上调,而其他免疫细胞的比例则没有显著变化。NK细胞清除性抗体或清除剂可以消除高胆固醇对肿瘤生长的抑制作用,这表明高胆固醇主要通过NK细胞发挥抗肿瘤作用。
  随后,我们检测发现高胆固醇组小鼠体内NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力明显增强,细胞内总胆固醇含量及膜胆固醇含量明显上升。在体外,以胆固醇处理正常NK细胞可增强其细胞毒性,而用环糊精降低细胞胆固醇含量可下调高胆固醇组NK细胞肿瘤杀伤能力。在机制方面,我们发现细胞内胆固醇蓄积会增加细胞表面的脂筏数量,使NK细胞的激活性受体NCR1及NKG2D在脂筏定位增多,下游的信号通路激活,从而上调了NK细胞的活化能力。
  最后,我们证实过表达LDLR,或通过PCSK9抗体抑制免疫细胞表面LDLR的降解,均可以增加NK细胞的胆固醇含量,进而增强其抗肿瘤活性。
  结论:
  血液中的胆固醇水平对免疫细胞的抗肿瘤作用具有重大影响。NK细胞内胆固醇蓄积可增加细胞膜表面的脂筏数量,促进激活性受体向脂筏的移位,进而激活下游信号通路,增强其肿瘤杀伤能力。目前,肿瘤的免疫治疗正在快速发展。我们的研究表明升高免疫细胞内胆固醇水平,可增强其杀伤功能,改善其抗肿瘤作用,为肿瘤的免疫治疗提供了新思路与新策略。
[博士论文] 王扬
内科学(血液病学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究第一部分应用新型基因表达谱芯片筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人存在显著差异表达的lncRNA CUST37778。采用定量PCR技术在新的独立样本中验证前期的筛选结果。第二部分观察分析lncRNA CUST37778表达水平与急性B淋巴细胞白血病临床参数及预后的相关性。第三部分阐明了lncRNA CUST37778可增强急性B淋巴细胞白血病的增殖活性和浸润能力
  第一部分 急性B淋巴细胞白血病中差异表达的lncRNA的筛选
  目的:应用新型基因表达谱芯片筛选出在急性B淋巴细胞白血病中存在显著差异表达的lncRNA。
  方法:应用新型基因表达谱芯片检测lncRNA,筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人表达存在显著差异的lncRNA。采用定量PCR技术在新的独立样本中验证前期的筛选结果。利用核质分离实验确定lncRNA CUST37778的亚细胞分布。
  结果:1.采用新型表达谱芯片检测了6对初发急性B淋巴细胞白血病患者单个核细胞和正常人单个核细胞,获得lncRNAs差异表达谱,发现lncRNA CUST37778在初发或复发急性B淋巴细胞白血病中的表达水平明显高于急性B淋巴细胞缓解组与正常对照组。
  2.扩大临床样本量,利用定量PCR对差异表达的lncRNA CUST37778进行验证,27例初发及复发急性B淋巴细胞白血病骨髓单个核样本,32例急性B淋巴细胞白血病完全缓解骨髓单个核样本及48例健康人骨髓单个核样本,检测发现lncRNA CUST37778在初发及复发样本中的表达显著高于完全缓解组及对照组。
  3.lncRNA CUST37778同时存在于急性B淋巴细胞白血病细胞的胞质和胞核,胞核中含量约占总量的60%。
  结论:应用新型基因表达谱芯片筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人显著高表达的lncRNA CUST37778,且lncRNA CUST37778同时存在于细胞胞质和胞核。
  第二部分 lncRNA CUST37778表达水平与初发及复发ALL患者临床参数相关性分析
  目的:观察分析lncRNA CUST37778表达水平与急性B淋巴细胞白血病临床参数及预后的相关性
  方法:收集自2015年8月至2016年10月在我院血液科诊疗的27例初发及复发急性B淋巴细胞白血病患者的临床资料,观察指标为基本临床特征及诊断信息即性别、年龄、初诊外周血白细胞计数、初诊骨髓原始细胞比例(%)、细胞遗传学及分子生物学异常、预后分层评估、首次诱导治疗后是否达完全缓解(CR1)、生存情况(包括复发或死亡)。利用ROC曲线分析界定lncRNA CUST37778的表达量界值,将27例初发及复发B-ALL患者分为高、低表达两组,统计分析在lncRNA CUST37778高、低表达组中所收集的B-ALL患者的临床参数是否存在统计学差异。两组间比较采用卡方检验,生存资料分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比较采用log-rank检验,生存分析采用COX比例风险模型进行单因素和多因素分析,所有多变量回归分析均列出OR或HR以及95%的置信区间用于风险评估。
  结果:1.利用ROC曲线分析界定27例初发及复发B-ALL患者中lncRNA CUST37778的表达量界值为0.2135,将27例初发及复发B-ALL患者分为高表达、低表达两组。外周血血小板计数<100×109(p=0.0370*)、骨髓原始细胞比例≥42%(p=0.0130*)在lncRNA CUST37778高表达组中的发生率显著高于lncRNA CUST37778低表达组中。而高表达组和低表达组在性别(p=0.125)、年龄(p=0.8947)、外周血白细胞计数(p=0.2059)、外周血血红蛋白水平(p=0.8857)、是否Ph染色体阳性(p=0.3261)、危险分层(p=0.4113)方面均无显著统计学差异。
  2.27例B-ALL患者接受一个疗程诱导化疗后,共14例达缓解,首次诱导缓解率为51.85%,lncRNA CUST37778高表达组与低表达组在首次诱导完全缓解率上未发现存在统计学差异(P=0.7448)。
  3.1ncRNA CUST37778高表达患者存在较差的预后趋势,与低表达组相比OS(p=0.0436)和DFS(p=0.0471)存在显著统计学差异。
  结论:利用ROC曲线分析界定27例初发及复发B-ALL患者中lncRNA CUST37778的表达量界值为0.2135,在lncRNA CUST37778高表达组中的患者更易出现较低的外周血血小板水平和较高的骨髓原始细胞比例。lncRNA CUST37778的表达水平对患者对化疗敏感性并无明显影响。lncRNA CUST37778高表达患者存在较差的预后趋势。
  第三部分 lncRNA CUST37778增强急性B淋巴细胞白血病的增殖活性和浸润能力
  目的:明确lncRNA CUST37778在B-ALL发生发展中的作用机制。
  方法:利用Real-time PCR方法检测B-ALL和Nalm-6细胞中lncRNA CUST37778的表达水平。筛选出干扰效率最佳的siRNA,应用其对于lncRNA CUST37778在B-ALL和Nalm-6细胞中的表达水平进行干扰,Real-time PCR鉴定干扰效率;干扰B-ALL和Nalm-6细胞后,CCK-8检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,Q-PCR和Western blot检测细胞凋亡与细胞增殖关键因子Bcl-2、Bax、PCNA、P21、P27的表达水平;Western blot检测MAPK通路关键因子ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、P38、p-P38的表达和PI3K-AKT信号通路关键分子AKT、p-AKT、NF-kB、p-NF-kB、STAT3、p-STAT3、β-catenin和Notch1的表达。构建过表达lncRNA CUST37778的稳转Nalm-6细胞,Real-time PCR验证过表达效率,对上述干扰实验所得结果应用受影响的关键分子的相应抑制剂进行进一步验证。
  结果:1.利用Real-time PCR方法确认lncRNA CUST37778在BALL-1细胞、Nalm-6细胞中高表达,与非B-ALL细胞系K562细胞、Molt4细胞存在显著统计学差异。
  2.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可促进B-ALL肿瘤细胞凋亡,抑制B-ALL肿瘤细胞增殖,使得G1期延长、G2期缩短。
  3.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可促进促凋亡因子Bax、P21和P27的表达,抑制癌基因Bcl-2和核蛋白PCNA的表达,从而促进B-ALL肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖。
  4.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可显著抑制MAPK通路关键因子ERK1/2磷酸化水平,故选择ERK1/2抑制剂PD98059进行进一步挽救实验。
  5.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可显著抑制PI3K-AKT信号通路p-AKT和p-NF-kB的表达,故选择AKT抑制剂LY294002进行进一步挽救实验。
  6.过表达lncRNA CUST37778可促进细胞增殖和缩短G1期,抑制细胞凋亡,ERK1/2抑制剂PD98059和AKT抑制剂LY294002可以阻断lncRNA过表达的作用。
  7.过表达lncRNA CUST37778可促进p-ERK1/2激活,ERK1/2抑制剂PD98059可以阻断此作用;还可促进p-AKT激活,AKT抑制剂LY294002可以阻断此作用。
  8.过表达lncRNA CUST37778可促进裸鼠皮下肿瘤生长,干扰其则可抑制皮下肿瘤生长。
  9.lncRNA CUST37778过表达接种组和Nalm-6空载接种组的裸鼠肝脏存在Nalm-6细胞来源的白血病浸润灶。
  结论:lncRNA CUST37778在BALL-1细胞、Nalm-6细胞中高表达,干扰lncRNA CUST37778的表达水平可抑制B-ALL细胞增殖活性,促进细胞凋亡,使G1期延长、G2期缩短,促进促凋亡因子Bax、P21和P27的表达,抑制癌基因Bcl-2和核蛋白PCNA表达,并可显著抑制PI3K-AKT信号通路中p-AKT和p-NF-kB的表达水平、抑制MAPK信号通路中p-ERK1/2的表达水平。过表达lncRNA CUST37778促进细胞增殖和缩短G1期,抑制细胞凋亡,促进Bcl-2和PCNA表达,并促进p-ERK1/2和p-AKT激活,ERK1/2抑制剂PD98059和AKT抑制剂LY294002可以阻断lncRNA过表达的作用。体内实验证实lncRNA CUST37778可促进裸鼠皮下肿瘤生长及浸润能力。
[博士论文] 姚云峰
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  肺癌是致死率高的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌(NSCLC)大约占肺癌类型的80%。2004年,人们发现在NSCLC中存在表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶结构域的突变,且大多数突变阳性的患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)如吉非替尼及厄洛替尼等敏感。接受EGFR-TKI治疗的EGFR突变阳性的NSCLC患者中位生存期较化疗明显提高。然而,即使存在EGFR敏感突变,其中仍有20-30%的患者对EGFR-TKI原发性耐药,且治疗有效的患者不可避免的会产生获得性耐药。目前,有关EGFR-TKI获得性耐药的机制研究较多,如EGFR看守基因的二次突变(T790M)(约占50%)、MET扩增(约20-25%)、肝细胞生长因子(HGF)高表达及向小细胞肺癌转化等。但有关原发性耐药机制研究相对滞后。
  Bim基因是Bcl-2家族促凋亡成员之一。有研究发现,Bim基因的表达状态可能与EGFR突变阳性患者对EGFR-TKI的疗效存在相关性,但Bim基因的表达调控机制不明。人抗原R(HuR)是胚胎致死视觉异常(ELAV)家族的RNA结合蛋白,它可调节多种分子mRNA的稳定性,如cyclin A、cyclin B、TNF-α、IL-6和IL-8等。HuR都是通过与靶基因的3'UTR端ARE元件结合,调控靶基因mRNA稳定性及蛋白的表达。我们分析Bim基因的mRNA序列后发现,其3'UTR端含有多个AU元件,具备与RNA结合蛋白相互作用的分子基础。因此,我们推测作为RNA结合蛋白之一的HuR可能会调控Bim表达。
  目的:
  研究HuR与Bim在NSCLC中的表达与EGFR-TKI药物敏感性的关系,对HuR通过调控Bim表达影响EGFR突变阳性的肺腺癌细胞株对EGFR-TKI原发耐药进行深入的研究,以期为临床判断EGFR-TKI药物治疗效果及克服耐药提供理论依据。
  方法:
  1、免疫组织化学法检测HuR和Bim蛋白在EGFR突变阳性NSCLC组织中的表达(54例临床评价敏感和27例临床评价原发耐药),并分析肿瘤HuR与Bim表达、临床病理特征间的关系,进一步亚组分析EGFR-TKI敏感患者中HuR、Bim表达与PFS之间的关系。
  2、以H1650、HCC827及PC-9肺癌细胞为主要体外模型,给予吉非替尼药物处理后,用CCK-8法检测三种细胞的增殖情况。
  3、应用Western blotting、定量RT-PCR方法检测三种细胞HuR、Bim mRNA和蛋白水平的表达。
  4、在HCC827细胞中用siRNA干扰HuR表达,用吉非替尼药物处理后,用CCK-8、AnnexinⅤ/PI双染色法检测干扰组与对照组细胞增殖和凋亡情况,并计算其IC50值。
  5、Western blotting和定量RT-PCR分别检测HCC827细胞干扰组及对照未干扰组HuR及Bim在mRNA和蛋白水平变化,以明确干扰HuR对Bim的影响。
  6、构建过表达HuR的慢病毒载体,包装病毒,随后感染H1650细胞;用CCK-8、AnnexinⅤ/PI双染色法检测感染组与对照组细胞增殖和凋亡情况,并计算其IC50值。
  7、Western blotting和定量RT-PCR分别检测H1650细胞感染组及对照组HuR及Bim在mRNA和蛋白水平变化,体外分析高HuR水平对H1650细胞Bim表达的影响。
  8、用Balb/c小鼠,建立高表达HuR的H1650细胞皮下移植瘤模型,并观察吉非替尼药物处理后移植瘤生长情况,分析高HuR水平对EGFR-TKI药物敏感性的影响。
  9、RT-PCR及Western blotting检测移植瘤HuR、Bim mRNA和蛋白表达情况。
  10、免疫组化染色检测H1650移植瘤、对照组移植瘤中HuR及Bim表达情况。
  结果:
  1、临床评价敏感组及原发耐药组NSCLC患者在性别方面存在显著差别(p=0.01),耐药组女性患者占18.5%,敏感组女性患者占57.4%。敏感组及耐药组在年龄、PS评分、突变类型、pTNM分期、是否有既往手术史、化疗史及是否存在脑转移等方面未见明显差别。
  2、在原发耐药组患者中,胞浆HuR阴性表达占81.5%;在敏感组患者中,阴性表达占20.4%;两组间表达率存在显著差异(p<0.001),耐药组患者HuR阴性表达率显著高于敏感组患者。同样,在原发性耐药的NSCLC患者中,Bim阴性表达占70.4%;在敏感组患者,阴性表达占7.4%;两组间表达率存在差异(p<0.001),耐药组患者Bim阴性表达率显著高于敏感组患者。
  3、在耐药组的患者中,胞浆HuR阴性表达与Bim阴性表达呈正相关(p<0.01);Bim表达与患者年龄、性别及突变类型不相关。
  4、在敏感组患者中,Bim阳性表达患者PFS为12.8个月,阴性表达组PFS为9.7月。Kaplan-Meier生存曲线显示,Bim阳性组PFS显著高于阴性组(p<0.01)。
  5、在敏感组患者中,HuR阳性表达患者PFS为16.5个月,阴性表达组PFS为9.7月。Kaplan-Meier生存曲线显示,HuR阳性组中位PFS显著高于阴性组。
  6、PC-9、HCC827及H1650细胞株对吉非替尼药物的细胞毒性实验结果发现:三种细胞的IC50值分别为0.05μml/L、0.004μml/L及21.28μml/L,三者比较前两种细胞对吉非替尼高度敏感,H1650细胞则对吉非替尼表现为耐药(p<0.01)。
  7、RT-PCR分析发现在三种肺癌细胞株中,HuR及Bim表达量存在差异,其中在H1650细胞株中HuR、BimmRNA表达显著低于另外两株细胞(p<0.01);Western blotting结果显示,在H1650细胞株中HuR及Bim蛋白表达显著低于另外两株细胞株。
  8、我们利用小于扰RNA对高表达HuR的HCC827细胞进行瞬时转染,转染后行吉非替尼药物毒性试验,结果发现HCC827未干扰组其IC50值为0.004μM,干扰组为8.142μM,干扰组细胞表现出对吉非替尼耐药。两组细胞给予吉非替尼药物处理后行细胞凋亡检测发现,HCC827细胞干扰组调亡率较对照未干扰组降低(p<0.05)。
  9、RT-PCR检测结果提示HCC827干扰组细胞HuR mRNA表达量低于未干扰组(p<0.01);Western blotting结果显示干扰组HuR蛋白表达显著低于未干扰组。我们对HCC827细胞Bim mRNA及蛋白进行检测,RT-PCR结果发现干扰组Bim mRNA表达明显低于未干扰组(p<0.01),Western blotting结果显示蛋白表达干扰组低于未干扰组。
  10、我们构建了过表达HuR慢病毒表达载体(GV365-HuR),转染H1650细胞后获得稳定过表达HuR的H1650细胞株。
  11、过表达HuR的H1650细胞株及对照组细胞分别给予吉非替尼处理,CCK-8法测定结果发现IC50值分别为0.875μM、21.28μM(p<0.01),提示过表达HuR增加了NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性。细胞凋亡结果提示,过表达HuR的H1650细胞凋亡率较对照组显著升高(p<0.01)。
  12、RT-PCR结果提示,过表达HuR的H1650细胞HuR及Bim mRNA表达量显著高于对照组(p<0.01);Western Blotting结果显示HuR及Bim蛋白表达水平也显著高于对照组。
  13、动物实验结果显示,过表达HuR的移植瘤经吉非替尼处理后,与对照组比较肿瘤生长明显受到抑制。处死小鼠后发现,过表达HuR的移植瘤体积及重量显著低于对照组。
  14、免疫组化结果显示,过表达HuR移植瘤肿瘤胞浆HuR阳性、Bim阳性均高于对照组。
  15、RT-PCR及Western blotting结果显示过表达HuR移植瘤HuR和Bim表达水平显著高于对照组。
  结论:
  证实Bim基因表达下调是引起EGFR突变型NSCLC对EGFR-TKI天然耐药的重要因素,同时确定HuR通过调节Bim表达,导致耐药。
[硕士论文] 王晓宇
药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常见的恶性肿瘤,伴随着较高的致死率,BC的治疗引起人们的广泛关注。常规的治疗手段有手术、放疗和化疗,但是会引起各种不良反应,以及后续引发的多药耐药现象(multidrug resistance,MDR),对患者的身体健康和生活质量产生不良影响。中药治疗以其多靶点作用、辨证施治、整体调理等特点在BC的治疗过程中可以发挥重要的辅助作用,目前已经有一些中药单体或复方应用于BC临床治疗,但是仍旧主要依赖于广大医生的临床经验,发挥其抗乳腺癌药效的机制仍不清楚。因此,从中药中快速筛选出其中发挥药效的活性成分,并对其机制进行研究是十分重要的工作。
  细胞膜色谱(cell membrane chromatography,CMC)是从上世纪九十年代开始发展迅速的一种生物亲和色谱技术,以细胞膜和硅胶载体作为固定相,采用色谱分析的方法,可在体外模拟小分子化合物与细胞膜受体的相互作用过程。细胞膜色谱法将成分分离与活性筛选相结合,具有操作方便、快速稳定,灵敏度高等优点,尤其适用于中药等复杂成分体系的活性筛选。
  本课题的主要研究内容分为以下三个部分:
  1、P-gp高低表达的MCF7和MCF7/ADR全二维细胞膜色谱系统的构建
  以MCF7和MCF7/ADR两株细胞为研究对象,用流式细胞术和Western Blot方法验证MCF7细胞膜表面P-gp呈低表达水平,MCF7/ADR细胞株呈高表达水平,且无药培养两周后表达水平并没有发生显著变化。搭建了经APTES修饰的MCF7和MCF7/ADR-C18柱/TOF-MS全二维细胞膜色谱系统,同时构建硅胶色谱柱和经APTES修饰的硅胶色谱柱全二维分析系统作为参比,进行系统的有效性和专属性考察。系统有效性考察结果显示,吉非替尼在硅胶色谱柱和经APTES修饰的硅胶色谱柱上没有保留行为,但是在MCF7和MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有显著的保留行为;相应的,地塞米松在四种色谱柱上均没有表现出任何保留行为,证明该系统有效性良好。系统的专属性考察结果显示,Tariquidar在硅胶色谱柱、经APTES修饰的硅胶色谱柱和MCF7细胞膜色谱柱上没有显著的保留行为,但是MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有显著的保留行为,显示该系统有一定的专属性。可以用于筛选中药中抗乳腺癌潜在活性化合物。
  2、基于全二维乳腺癌细胞膜色谱法对中药抗乳腺癌活性成分的筛选
  首先选择了八种有抗乳腺癌作用的中药材作为对象,构建其化学成分库,制备了中药提取液,并用HPLC/TOF-MS系统对中药提取液进行了分离和分析,并且为后续的全二维分析提供第二维分离的优化条件。应用经APTES修饰-MCF7/CMC-C18/TOF-MS和经APTES修饰-MCF7/ADR/CMC-C18/TOF-MS全二维分析系统实现对八种中药中抗乳腺癌潜在活性成分的筛选,结果显示,大黄和黄芩保留成分较多,保留行为较好,因此继续以大黄和黄芩为研究对象,完成了保留成分全二维等高线图谱的绘制和TOF-MS初步鉴定结果表,并用标准品进行了验证。结果显示,大黄提取液在MCF7细胞膜色谱柱上共有14种保留成分,在MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有15种保留成分,其中在两株细胞都有保留的成分有10种,并对其中食用大黄苷、大黄酚、丹叶大黄素、大黄素甲醚、云杉鞣酚和大黄素六种成分进行了验证。黄芩提取液在MCF7细胞膜色谱柱上共有15种保留成分,在MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有14种保留成分,其中在两种细胞膜色谱柱都有保留的成分有10种,并对其中的汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A、黄芩素和汉黄芩苷五种成分进行了验证。为下一步潜在活性成分的药效验证研究和活性成分与P-gp之间关系研究奠定了良好的基础。
  3、潜在活性成分抗乳腺癌活性及其与P-gp的关系研究
  根据全二维MCF7和MCF7/ADR细胞膜色谱系统对中药大黄和黄芩的筛选结果,选择其中可获得11个化合物为对象。首先对其潜在抗乳腺癌的作用进行体外增殖抑制的药效验证,结果显示,大黄中丹叶大黄素、云杉鞣酚和大黄素,黄芩中汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A和黄芩素对MCF7和MCF7/ADR两株细胞均有一定杀伤作用,且对两株的敏感性不同。进而采用流式细胞术考察它们是否通过细胞凋亡这个途径发挥其杀伤作用。结果显示,丹叶大黄素、云杉鞣酚、汉黄芩素和黄芩素是通过凋亡途径对MCF7细胞产生杀伤作用,而其他化合物则不是。丹叶大黄素、汉黄芩素和千层纸素A是通过凋亡途径对MCF7/ADR细胞产生杀伤作用,而其他化合物则不是。之后,为了研究同一个化合物对两株细胞杀伤作用的差异是否与P-gp作用相关,考察了大黄中丹叶大黄素、云杉鞣酚和大黄素,黄芩中汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A和黄芩素对P-gp酶活的作用,结果显示黄芩苷是P-gp酶活性的抑制剂,而其他6种成分是P-gp酶活性的激动剂。进一步研究黄芩苷和P-gp之间关系,采用流式细胞术和Western blot检测不同浓度的黄芩苷对MCF7/ADR细胞中P-gp表达量的影响,结果显示黄芩苷并没有显著影响P-gp表达。黄芩苷和DOX之间的协同作用,结果显示黄芩苷可以逆转MCF7/ADR细胞对阿霉素的耐药性。
[博士论文] 乔苏迟
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是骨骼系统最常见的的原发恶性肿瘤,年发病率约(1-3)/1000,000,可于任何年龄发病,但高级别骨肉瘤(High-grade osteosarcoma,HGOS)主要发生于10-20岁的青少年和儿童。OS多累及长骨末端,尤其是生长快速的骨骼,如股骨远端、胫骨近端、肱骨近端等。
  得益于新辅助化疗的发展、假体以及材料学技术的进步,目前OS的保肢率和生存率都得到了较大的提升。但复发及远处转移的患者预后仍然较差,新型药物的研发也迟滞不前,OS的治疗已经进入到瓶颈。阐明OS发生发展的分子机制,研发新型药物是目前迫切需要解决的问题。
  长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)的是一类重要的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。已有大量研究报道,LncRNA出现异常表达或是突变,与恶性肿瘤增殖、侵袭、转移、耐药等机制密切相关。而在OS中,LncRNA的相关研究尚处于起步阶段,是否可以利用下调或上调异常表达的LncRNA方式治疗OS,或是逆转OS耐药,有待深入探索。此外,LncRNA能否作为OS患者临床诊断的重要参考,以及判断化疗敏感性和预后的分子标志物,有待临床实践检验。
  LINC00511是一个较为全新的LncRNA,在非小细胞肺癌、舌鳞癌以及胰腺导管腺癌中,已证实LINC00511呈现高表达,并在其中作为癌基因发挥作用,促进相应恶性肿瘤增殖、迁移,与患者预后不良密切相关。
  通过芯片筛选等前期预实验,发现,相对于癌旁正常组织,LINC00511在OS组织中呈现低表达。本研究旨在进一步探索LINC00511在OS中的表达情况,并分析其表达与患者临床特征及预后的相关性,此外,分别从体外和体内层面对LINC00511的功能展开研究并初步揭示LINC00511在OS中的调控机制。
  第一部分:LINC00511在骨肉瘤组织、细胞株中的表达及其意义
  第一部分研究中,通过定量PCR检测LINC00511在OS组织标本和癌旁正常组织标本的表达情况,并结合临床资料分析LINC00511的表达水平与OS患者年龄、性别、肿瘤分期、化疗敏感性、预后等临床特征之间的相关性。此外,同时采用定量PCR检测LINC00511在不同OS细胞株及正常成骨细胞细胞株中的表达水平差异。结果显示,LINC00511在OS组织及细胞株中呈现低表达;LINC00511的表达与患者肿瘤坏死率显著相关,高表达患者呈现出更好的化疗敏感性;LINC00511的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分期、肿瘤体积变化、手术方式等无关;LINC00511表达水平与骨肉瘤患者预后明显相关,高表达患者三年生存率更高,预后更好。上述结果提示,LINC00511可能是骨肉瘤疾病发生发展中的重要抑癌基因,其表达升高预示更好的化疗敏感性及预后,有望成为骨肉瘤诊断以及预后判断中的重要分子标志物。
  第二部分:LINC00511对骨肉瘤细胞生物学行为的影响及其作用
  第二部分研究中,构建了OS细胞株MG-63及Saos-2的LINC00511的过表达稳定株,并检测比较肿瘤生物学行为的变化。在体外细胞层面上,LINC00511表达上调后,进行CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验、细胞划痕实验、细胞transwell实验等观察LINC00511对OS细胞增殖、凋亡以及迁移的影响。在体内层面上,通过裸鼠成瘤实验,进一步验证LINC00511对OS发生发展的作用。结果显示,MG-63及Saos-2中过表达LINC00511能够显著抑制OS细胞增殖、迁移,但不影响细胞凋亡;裸鼠成瘤实验中LINC00511过表达的裸鼠肿瘤生长更慢,相同时间内肿瘤体积更小,肿瘤质量更轻。上述结果提示,LINC00511在OS中能够抑制肿瘤细胞增殖、迁移,是其发病机制中重要的抑癌基因。
  第三部分:LINC00511对骨肉瘤疾病进展的调控机制的初步研究
  第三部分研究中,对LINC00511调控OS的分子机制进行初步的研究。从OS上皮间质转化及PI3K/Akt信号通路的调控两方面进行观察。在Saos-2各组细胞中,利用Western Blot检测EMT相关蛋白E-cadherin、Vimemin和α-SMA的表达,以及PI3K/Akt信号通路中PI3K和p-Akt的蛋白表达量,初步探讨LINC00511抑制OS增殖、迁移的分子调控机制。结果显示,Saos-2中过表达LINC00511后OS中的E-cadherin蛋白表达显著升高,而Vimentin和α-SMA蛋白表达显著降低,OS的EMT受到显著抑制。此外,PI3K和p-Akt(308)蛋白表达显著降低,而p-Akt(473)蛋白表达并无明显变化,PI3K/Akt信号通路受到明显抑制。上述结果提示,LINC00511可能通过抑制OS的EMT以及PI3K/Akt信号通路,对OS细胞增殖、迁移产生调控作用,其中,PI3K/Akt信号通路产生作用的Akt的磷酸化位点是苏氨酸308(Thr308)。
[硕士论文] 罗旭
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肝炎-肝硬化-肝癌被认为是肝癌发生过程中“三部曲”。临床大量资料显示,大多数肝癌患者有肝纤维化或肝硬化背景,且伴肝硬化背景的肝癌患者中位生存期下降,肝窦内压力增加及肝硬化促进肝癌进展。研究发现肝脏硬度可作为肝癌发生的独立危险因素,患者肝纤维化程度越重,肝癌肝内转移率也越高,说明肝纤维化与肝癌细胞增殖及侵袭转移间也存在非常重要的关系。门脉高压时,肝窦内压力大幅增加,肝窦显著扩张,肝细胞受到了肝窦压力和肝窦扩张后的张应变力等生物力学因素直接或间接的作用。但是,肝纤维化所致张应变力的变化对肝癌细胞的影响及其相关机制,如牵涉到的MicroRNAs(miRNAs)等未见报道。众所周知,miRNA是一种长21~23核苷酸的非编码RNA分子,在调控细胞增殖、分化和凋亡中起着重要的作用。一些研究发现miRNAs同时与张应变力和肝癌均有关系。所以本研究运用流式细胞术及cck-8,Brdu等方法测定张应变力对人肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响。使用Agilent单色标记芯片实验筛选差异表达MicroRNAs,再使用RT-PCR证实。并运用GO和Pathway分析基因。为肝癌力学微环境是如何影响肝癌细胞的行为提供有用的信息。
  方法:
  一、肝癌细胞最适张应变力加载条件的确定
  周期性张应变加载细胞主要有三个参数:张应变幅度、张应变频率和张应变时间。通过固定其中两个参数,变化另一个参数以观察此参数下的张应变对肝癌HepG2细胞的影响(除此三个参数外其余实验条件均相同)。
  (一)细胞牵拉力加载方法
  采用Flexcell FX4000T张应变力加载装置进行张应变力加载。方法是将体外培养的人肝癌细胞系HepG2细胞用不含PBS的DMEM培养基同步化24h后接种在鼠尾胶原包被后的Flexcell六孔板上,细胞贴壁后把六孔板置于培养箱内的BioFlex Culture Plate底座上,首先开启真空泵和桥接器,然后在相连电脑上启动Flexercell Strain中央控制器,根据需要设定张应变力参数进行张应变力加载。
  (二)最适张应变力加载条件的确定
  把实验分为三组:1.张应变时间组:固定频率1Hz、张应变幅度15%,设立张应变时间分别为2h、6h、12h、24h、48h共5个实验组,另设不加载张应变组为对照组。2张应变频率组:固定张应变幅度15%、时间24h,设立张应变频率分别为0.5Hz、1Hz共2个实验组,另设不加载张应变组为对照组。3.张应变幅度组:固定张应变时间24h、张应变频率1Hz,设立张应变幅度分别为5%、15%共2个实验组,另设不加载张应变组为对照组。张应变力加载结束后,以标准程序用流式细胞仪检测,评价不同张应变力加载条件对细胞增殖的影响,确定最适张应变条件。
  二、张应变力加载对肝癌细胞增殖活性的影响
  将同步化24h的HepG2细胞同样在Flexcell FX4000T张应变力装置进行张应变力加载,另设无张应变力加载组为对照组。使用BrdU法和CCK-8法验证上步确定的肝癌细胞最适张应变力加载条件对HepG2细胞增殖能力的影响。
  三、肝癌细胞张应变力加载后差异表达MicroRNAs的筛选
  (一)差异miRNAs的筛选
  采用上海欧易生物医学科技有限公司的Agilent Human miRNA芯片。样品总RNA使用Trizol法提取后,参照其公司芯片标准流程进行样本的标记、芯片的杂交以及洗脱。采用Feature Extraction软件处理原始图像提取原始数据。接着利用Genespring软件进行quantile标准化和后续处理。利用T检验的P值和倍数变化值进行差异miRNA筛选,筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>=2.0且P值<=0.05。
  (二)筛选出的差异miRNAs的验证
  采用Trizol法提取实验各组HepG2细胞的总RNA,紫外检测仪分别在260nm和280nm波长下检测RNA的浓度及纯度。用逆转录试剂盒(Thermo Fisher)合成cDNA,以此为模板进行实时荧光定量PCR扩增。实验同步以U6作为内参照。mRNA表达量的分析采用比较Ct数据法(2-△△Ct)进行。验证筛选出的差异miRNAs是否准确。
  四、张应变力调节肝癌细胞增殖功能的生物信息学分析
  利用3个数据库(Targetscan,microRNAorg,PITA)共同对差异miRNA进行靶基因预测,接着对预测出的靶基因进行GO分析和KEGG富集分析,以判定差异miRNA主要影响的生物学功能或者通路。最后,对差异miRNA进行非监督层次聚类,利用热图的形式展示差异miRNA在不同样本间的表达模式。探索其影响肝癌细胞功能的可能生物学过程。
  结果:
  一、肝癌细胞最适张应变力加载条件的确定
  摸索出使用Ⅰ型鼠尾胶原包被BioFlex六孔板使HepG2细胞稳定贴壁生长的方法,选定张应变幅度15%、频率1Hz、时间24h为后续实验条件。
  二、张应变力加载对肝癌细胞增殖活性的影响
  BrdU法与CCK-8法结果均显示与control组相比,张应变幅度15%、频率1Hz、24h的张应变力加载促进了细胞增殖和代谢活力,结果具有统计学意义(P<0.0001)。
  三、肝癌细胞张应变力加载后差异表达MicroRNAs的筛选
  (一)差异miRNAs的筛选
  使用张应变力加载条件:幅度15%,频率1Hz加载HepG2细胞24h后,使用miRNA芯片实验筛选差异表达miRNAs,共检出2557个miRNA,其中7个差异较大(表达差异>2倍,且P<0.05)miRNA,分别是hsa-miR-296-5p、hsa-miR-6752-5p、hsa-miR-6794-5p、hsa-miR-6889-5p、hsa-miR-7845-5p(上调),hsa-miR-4428、hsa-miR-503-5p(下调)。
  (二)筛选出的差异miRNAs的验证
  使用RT-PCR实验验证筛选出的7个差异表达miRNA,结果显示qRT-PCR检测到的7种miRNAs变化趋势与miRNA芯片结果一致。
  四、张应变力调节肝癌细胞功能的生物信息学分析
  利用生物信息学对7种差异miRNAs的潜在靶基因进行了搜索,数据库miRNAorg、PITA和TargetScan分别预测了2306、1277和16205个靶基因,取3个数据库的交集,共224个目标基因,其中SMAD7和SP1值得关注。为了解这些目标基因的生物学特性,GO分析结果显示目标基因的生物学功能集中在:细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物,微管细胞骨架,蛋白激酶,RNA聚合酶Ⅱ活性,DNA模板转录的正调控,骨骼肌组织发展的正调控,血管形成等一系列生物学功能上。KEGG Pathway分析发现52个显著的通路,包括乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、内分泌抵抗等疾病相关通路和TGF-β,MAPK,PI3K-Akt,FoxO,Ras等信号通路。
  结论:
  一、使用Ⅰ型鼠尾胶原包被BioFlex六孔板可以使HepG2细胞稳定贴壁生长,张应变力加载能促进人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖,特别是在牵拉幅度为15%,牵拉频率为1Hz,牵拉时间为24小时的牵拉条件下促进效果最显著。
  二、使用最适条件加载后的HepG2细胞miRNAs表达产生明显变化,筛选出7个差异较大的miRNA和224个目标基因,其中SMAD7和SP1值得后续进行探索相关功能和机制。
  三、GO和KEGG分析显示目标基因的生物学功能集中在与多种癌症相关的功能上,也包括TGF-β、MAPK、PI3K-Akt等与各种癌症关系密切的信号通路上。待验证的可能机制为张应变力相应的hsa-miR-503-5p调节SMAD7基因与TGF-β信号通路。
[硕士论文] 林健
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  乳腺癌(breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤,约占女性所有肿瘤的30%,具有侵袭性,难治愈性,且易复发转移,近年来,乳腺癌死亡率已成下降趋势。然而,中国乳腺癌的发病率增长非常快,复发转移率依旧比较高。
  肿瘤转移是导致乳腺癌死亡的最主要原因。及时了解乳腺癌患者肿瘤负荷,准确掌握抗肿瘤转移情况,以及应用确切有效的治疗手段,是降低乳腺癌患者死亡率的关键。近年来一些研究发现,肿瘤细胞存在很大的异质性。一些肿瘤细胞具有较强的自我更新能力和侵袭性,其生物学特征与干细胞的基本特性十分相似,因此,有学者提出肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell,CSC)的理论,而寻找最具转移性和侵袭性的乳腺癌肿瘤干细胞是乳腺癌治疗和预后的关键。目前,尚无公认的肿瘤干细胞的标志物。CD133、三磷酸腺苷结合转运体(AB CG2)和乙醛脱氢酶(ALDH1)在多种来源的干细胞膜均有表达,不能区分正常与肿瘤干细胞。表达CD44+CD24-的乳腺癌细胞因具有肿瘤产生能力而被认为是肿瘤于细胞。
  最新研究报道多巴胺受体(Dopamine Receptor,DR)可能是一个肿瘤干细胞的生物标志物,研究者发现正常人多能干细胞不表达多巴胺受体,而肿瘤干细胞表达所有五种多巴胺受体,在三阴性乳腺癌中发现CD44+CD24的肿瘤干细胞同样表达多巴胺受体。另外,研究者筛选到多巴胺受体拮抗剂硫利达嗪,能通过表达在肿瘤干细胞上的D2受体家族,特异性地作用于肿瘤干细胞,抑制肿瘤干细胞的增殖生长,而不影响人普通干细胞。这不仅提示肿瘤干细胞特异性地表达多巴胺受体,并且能通过多巴胺受体信号途径靶向抗肿瘤干细胞治疗,也说明了多巴胺受体既是一个肿瘤干细胞的生物标志物,也是一个潜在靶向抗肿瘤干细胞的药物靶点,具有十分重要的研究价值。
  多巴胺是一种重要的神经递质,根据生化和药理学特点分为两类:D1样(D1-like)和D2样(D2-1ike)受体。D1样受体包括DRD1和DRD5受体;D2样受体包括DRD2,DRD3和DRD4受体。已有众多研究利用多巴胺受体激动剂或拮抗剂进行乳腺癌的体外或体内试验,实验结果表明,多巴胺受体与乳腺癌的发生、发展、预后和疗效等密切相关,通过多巴胺受体信号途径,具有显著的抗乳腺癌的效果。但目前,多巴胺受体在乳腺癌中作用机制还不是十分清楚,尤其是多巴胺受体五个亚型在乳腺癌中的具体表达情况尚不清晰,这是开展多巴胺受体信号途径与乳腺癌机制研究的基础。
  因此,本研究拟针对多巴胺受体五个亚型在乳腺癌中的表达情况展开检测,具体分析各亚型在乳腺癌及其癌旁组织中的表达情况和分布特征,并结合TCGA数据库中有关乳腺癌组织多巴胺受体表达情况来验证,结合病人临床病理特征,进一步分析DR的表达情况与乳腺癌的关系,研究结果将为今后乳腺癌肿瘤干细胞的研究积累数据,为乳腺癌循环肿瘤干细胞研究提供参考,也为今后多巴胺受体靶向药的开发利用奠定基础。
  方法:
  一、TCGA数据库生物信息分析
  从癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas,TCGA)TCGA数据库下载乳腺癌样本,筛选多巴胺受体表达信息的样本,筛选得到样本癌和癌旁组织的DR表达的数据,分析乳腺癌样本中DR的五种亚型基因的表达情况,并结合病人临床病理资料进行分析。
  二、实时荧光定量PCR(real time PCR,RT-PCR)
  收集长海医院确诊乳腺癌患者的癌和癌旁组织样本,抽提RNA,反转录为cDNA,用RT-PCR技术检测乳腺癌组织癌与癌旁DR五种亚型的表达情况。以GAPDH基因为内参基因,检测癌和癌旁组织在RT-PCR反应中的Ct值,根据2-△△Ct来估算DR亚型基因在该患者癌组织中的相对表达量。另取最大△Ct为对照,计算所有样本的相对表达量,以此分析各亚型的表达情况,并结合病人临床病理资料进行分析。
  三、蛋白质免疫印迹法(Westen Blot,WB)
  收集长海医院确诊乳腺癌患者的癌和癌旁组织样本,用Western Blot方法检测DR五种亚型在乳腺癌患者癌和癌旁组织中的蛋白表达情况。将肿瘤组织剪碎,加入RIPA裂解液(含PMSF,蛋白酶等)提取总蛋白,以BCA法测定总蛋白浓度。各取适量抽提好的蛋白样品进行变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,转膜后分别进行DR的五种亚型抗体和GAPDH内参抗体孵育。显色拍照,分析DR的五种亚型在乳腺癌组织和癌旁组织中的蛋白表达水平。
  四、免疫组织化学(immunohistoehemistry,IHC)
  收集长海医院确诊乳腺癌患者的癌和癌旁组织样本,肿瘤组织一部分用福尔马林固定后,进行石蜡包埋,然后进行组织切片。选择肿瘤组织面积较大、形态保存较为完好的石蜡切片,进行免疫组化染色。经过一系列脱蜡和水化之后,用PBS缓冲液配制的多巴胺受体抗体室温避光孵育2h,然后用免疫组化试剂盒进行显色反应。每个样本进行10片以上石蜡组织的IHC染色,人工阅片,结合使用Image-pro plus图片分析软件分析。使用Image-pro plus软件进行平均光密度分析,软件自动根据免疫组化图片黄染程度的不同,得出不同的光密度值,半定量地计算阳性染色,根据选取的测量区域面积(atea of interest,AOI)、累积光密度值(integrated optical density,IOD),最后得出IOD/AOI的比值为检测结果,最后综合分析该组织样本对多巴胺受体的表达水平。
  结果:
  一、TCGA数据库乳腺癌样本DR表达情况
  从TCGA数据库下载了112例乳腺癌患者癌和癌旁组织的DR表达的数据,分析乳腺癌样本中DR的五种亚型基因的表达情况。其中DRD4基因在癌组织中的表达显著高于癌旁组织(p<0.05),DRD1和DRD2基因在癌组织中的表达显著低于癌旁组织(p<0.05),DRD3和DRD5基因在癌和癌旁组织中的表达无显著差异(p=0.9565,p=0.5441)。结合病人临床病理特征研究发现,DRD1基因在乳腺癌中表达与年龄相关,按年龄50岁分层,大于50岁的患者更多表现为DRD1基因在癌中表达下调(x2=13.852,p<0.05)。腋窝淋巴结转移情况,可能与DRD4的表达存在相关性(Likelihood Ratio=5.8,p=0.055)。
  二、乳腺癌组织癌与癌旁多巴胺受体基因表达检测情况
  收集了20例乳腺癌患者的癌和癌旁手术样本,通过RT-PCR实验检测分析DR亚型基因在该患者癌组织中的相对表达量。
  检测结果表明,20例患者的乳腺癌样本中,DRD1基因在9例样本中表达上调,11例样本表达下调;DRD2-DRD4基因都发现在6例样本中表达上调,14例样本表达下调;DRD5基因在4例样本的表达上调,16例样本的DRD5基因表达下调。通过所有DR亚型在癌和癌旁中表达情况分析比较可见,DRD5基因在癌旁组织(18.29±3.34)和癌组织(15.44±3.16)、DRD4基因在癌旁组织(14.15±6.11)和癌组织(11.17±5.04)的相对表达量较高,两者癌与癌旁组织基因表达差异有差异,DRD4基因、DRD5基因在癌组织中表达下调(11.17±5.04VS14.15±6.11;15.44±3.16VS18.29±3.34)(p<0.05)。
  三、乳腺癌组织癌与癌旁多巴胺受体蛋白检测结果
  选取5例乳腺癌患者,使用Western Blot的方法检测了DR的五种亚型在乳腺癌患者癌和癌旁组织中的蛋白表达情况。分析DR的五种亚型在乳腺癌组织和癌旁组织中的蛋白表达水平。
  结论:
  通过本研究检测分析,总结所得到的DR在乳腺癌中的表达情况结果如下:TCGA数据库生信分析和免疫组化实验结果均提示DRD1、DRD2在乳腺癌组织中低表达,在癌旁组织高表达。而实时荧光定量PCR、蛋白质印迹实验检测则提示两者癌与癌旁表达无差异。在免疫组化实验中提示DRD3蛋白在乳腺癌组织低表达,在癌旁组织高表达,其余分析及实验检测提示DRD3在癌与癌旁组织表达无差异。除免疫组化实验提示无差异外,TCGA数据库生信分析、蛋白质印迹实验检测均提示DRD4蛋白在乳腺癌组织中高表达、在癌旁组织低表达,而RT-PCR检测则得出了相反的结论。RT-PCR检测和免疫组化实验均提示DRD5蛋白在癌旁组织高表达,在乳腺癌组织低表达,且提示DRD5在癌旁组织的表达高于所有亚型在癌和癌旁的表达,但是蛋白印迹实验结果得出了相反的结论,TCGA数据库生信分析未得出差异结论。同时,分析乳腺癌患者临床病理特征与多巴胺受体亚型表达的关系表明:DRD1基因在乳腺癌中表达与年龄相关,腋窝淋巴结转移情况可能与DRD4的表达存在相关性,而分子分型与DR各亚型的表达关系比较密切。
  综上所述,通过生信分析及实验结果,得出DR在乳腺癌中的表达情况为:DRD1蛋白、DRD2蛋白在乳腺癌旁组织高表达,在乳腺癌组织低表达;DRD3蛋白在乳腺癌和癌旁组织中表达无差异;DRD4蛋白在乳腺癌组织中高表达,在癌旁组织低表达;而DRD5在乳腺癌组织中表达下调,在癌旁组织中高表达,且其表达水平高于所有亚型。DR表达与乳腺癌患者的临床特征密切相关。
[博士论文] 鲍蕾蕾
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,基因组测序技术的快速发展,加深了人们对肿瘤异质性的认识,含有大量肿瘤临床样本多组学数据库的TCGA及Oncomine分析平台为肿瘤个体差异的基因分型、治疗与生存期的整合研究提供了大样本数据库,受到国内外学者的广泛关注,并越来越多地运用到肿瘤的个体化精准治疗的研究中来。
  肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤之一,现已成为中国第二世界第三位的癌症死亡原因。中国为肝癌高发病率国家,手术切除被认为是可能治愈初诊HCC患者的疗法,但只有约10%~20%的患者肿瘤可切除,且手术病人面临肿瘤复发的可能,最近的统计发现2000年至2014年间中国肝癌患者5年生存率仅为14.1%。
  近年来针对肝癌靶向治疗药物的研发逐渐成为热点,但由于大量不同癌基因以及抑癌基因的突变参与了肝细胞癌的发生发展,而其精确的分子机制尚不完全清楚,导致靶向制剂对肿瘤患者个体的治疗效果差异大,药物靶向性较低。目前,作为首个美国FDA批准上市,用于晚期HCC靶向治疗的多激酶抑制剂索拉菲尼,其有效率也仅为25%。
  1995年Lever在The Lancet杂志发表一项大型开创性回顾研究,发现服用血管紧张素酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEIs)和血管紧张素受体抑制剂(angotensin recepter blockers,ARBs)的病人比未服用该类药物的病人患乳腺癌和肺癌的风险更低。随后另一部分的学者进行相关研究却未得到类似结果。这个不同的研究结果引起众多学者的关注,在这些研究中除了入选患者种族、人群及服药周期等不同因素外,由于受到基因测序技术的限制,大部分的患者未做个体基因表达谱测定,导致患者个体基因差异未做考虑。在后续的研究中发现,在肾素血管紧张素系统中一个关键受体AT1R(type-1angiotensinⅡ)其编码的基因AGTR1在多个肿瘤中发生异质性表达,并且高表达该基因会引起多种肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等的不良预后,但是AGTR1基因在肝细胞癌中的表达及对肝癌的影响却少有报道。对TCGA数据库中全部3个肝细胞癌的临床374例RNA芯片数据的AGTR1基因表达与临床生存期的相关性进行分析,提示AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用的基础上,进行了AGTR1在肝细胞癌中的表达及其对肝癌影响的研究。
  第一部分 AGTR1差异表达对肝细胞癌发展的影响
  选用Oncomine数据库中全部3个肝细胞癌的临床347例RNA芯片数据,发现AGTR1基因在这3个数据集中均位于过表达基因前5%,并在部分肝细胞癌患者中出现高表达。同时在TCGA数据库中对全部374例的肝细胞癌临床样本进行差异分析,发现AGTR1表达前80位和后80位的样本AGTR1的相对表达具有显著差异,进一步结合数据库中肝细胞癌样本预后数据,采用Kaplan-Meier生存分析,发现低表达组患者的生存期较高表达组显著延长。以上结果说明,AGTR1在部分肝细胞癌患者中呈高表达,且这种高表达与患者的生存期相关,由此初步推断AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用。为了证明AGTR1基因在肝细胞癌发生、发展及转移中的作用,筛选低表达AGTR1的SMMC-7721和BEL-7404细胞,对它们进行过表达AGTR1的改造,同时选择高表达AGTR1的MHCC-97H细胞进行干扰表达的改造,体内外研究AGTR1对肝细胞癌的作用。结果发现AGTR1在体外实验中具有促进肿瘤细胞增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移的作用,而在体内试验中能加速裸鼠皮下成瘤试验的肿瘤形成及生长。此外,采用含有luciferine片段的载体构建sh-AGTR1和sh-nc,稳筛低表达AGTR1的MHCC-97H细胞,采用小动物活体成像系统,在体观察不同AGTR1表达量的MHCC-97H细胞在脾脏肝转移模型中的转移情况,发现抑制AGTR1可以降低MHCC-97H肿瘤细胞的脾脏肝转移能力。
  第二部分 AGTR1差异表达影响肝细胞癌生长的作用机制研究
  为了探讨AGTR1促进HCC细胞生长、转移作用机制,采用Westen Blot方法检测过表达和干扰表达AGTR1对HCC细胞信号通路的影响,发现过表达HCC细胞中的AGTR1可以促进JAK2、STAT3、ERK的磷酸化,抑制AGTR1则可以降低相应分子的磷酸化。且JAK2特异性抑制剂AG490可以抑制AGTR1介导的HCC细胞的生长、克隆形成、迁移及侵袭能力。此外,先用TCGA数据库中374例肝细胞癌患者的mRNA芯片数据,对VEGF与AGTR1进行相关性分析,发现随着AGTR1的表达量的上升,VEGF与AGTR1表达相关性也随之上升。对低表达AGTR1的SMMC-7721,BEL-7404细胞过表达AGTR1,两个细胞内VEGF的表达也随着AGTR1的表达上升而上升。对高表达AGTR1的MHCC-97H细胞干扰表达AGTR1,VEGF的表达也随之下降,且因AGTR1的高表达或过表达引起的VEGFA的上调表达可以被AG490抑制。由此可以推断,AGTR1的高表达可能会促进细胞内JKA2的磷酸化,进而激活细胞质内STAT3、ERK等分子的磷酸化,这些磷酸化的分子可进入细胞核,启动VEGF等分子的转录、翻译、合成,促进细胞分泌VEGF等细胞因子,大量新分泌的VEGF与细胞表面的受体结合可能会进一步激活细胞内STAT3、MAPK等信号通路,促进肿瘤内新生血管的生成及细胞的增殖、迁移等生物学过程。
  第三部分 AGTR1抑制剂对HCC细胞体内外抗肿瘤作用效果研究
  本部分研究中选择临床应用时间最长、应用病例最多的洛沙坦作为靶向AGTR1的抑制剂考察其作用效果。在体外实验中,发现当洛沙坦浓度为1~100μM时,能够不同程度的抑制AGTR1高表达的MHCC-97H细胞和AGTR1过表达的SMMC-7721细胞的体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,但对AGTR1低表达的SMMC-7721细胞和AGTR1干扰表达的MHCC-97H细胞则无上述作用。体内实验中,选用高表达AGTR1的MHCC-97H细胞,在裸鼠皮下成瘤模型中,经过4周给药,相比空白对照组,20mg·Kg-1~80mg·Kg-1给药剂量的洛沙坦能不同程度的抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。免疫组化分析发现随着给药剂量的增加,瘤内AT1R、VEGFA及CD31蛋白的表达水平显著下降,血清VEGFA量也随着洛沙坦的给药剂量提高而受到不同程度的抑制。由此考察了洛沙坦在体内外水平对AGTR1高表达HCC细胞生长及肿瘤血管形成的抑制作用。
  综上所述,本课题通过TCGA数据库中全部肝细胞癌的临床374例RNA芯片数据,对AGTR1基因表达与临床生存期的相关性进行分析,提示AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用,在此基础上,进行了AGTR1在肝细胞癌中的表达及其对肝癌影响的研究。对6种不同的肝细胞癌细胞系(HepG2、BEL-7402、BEL-7404、SMMC-7721、MHCC97H、HLF)与正常肝细胞系(QSG-7701)进行AGTR1的mRNA及蛋白的表达检测,证实相比正常肝细胞系(QSG-7701),肝细胞癌细胞系MHCC97H、HLF中AGTR1mRNA和蛋白水平均有显著的上调表达,而在BEL-7404、SMMC-7721中AGTR1mRNA和蛋白水平的表达显著低于正常肝细胞的表达水平。通过验证临床肝癌样本中AGTR1的表达情况,显示33例肝细胞癌样本中有20例临床样本AGTR1呈上调表达或高表达。进一步通过体内外实验,发现过表达AGTR1后可促进HCC细胞体外增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移能力,加速裸鼠皮下肿瘤形成及生长;而抑制AGTR1的表达可降低HCC细胞体外增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移能力,并降低HCC肿瘤细胞的脾脏肝转移能力。通过对AGTR1相关通路的分析,揭示AGTR1高/过表达HCC细胞主要通过JAK2/STAT3通路介导其生长、增殖、迁移及侵袭过程,同时验证了AGTR1靶向抑制剂的作用。在药效实验中,探讨以AGTR1靶向抑制剂洛沙坦对HCC细胞的作用效果,结果发现在体外试验中,当洛沙坦浓度为1~100μM时,能够不同程度的抑制AGTR1高/过表达HCC细胞的体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。在体内实验的裸鼠皮下成瘤模型中,经过4周给药(20mg·Kg-1~80mg·Kg-1),洛沙坦能显著抑制AGTR1高表达HCC细胞裸鼠皮下肿瘤的生长,降低肿瘤组织中AGTR1、VEGFA及CD31蛋白表达。由此证明了洛沙坦在体内外水平具有抑制AGTR1高表达HCC细胞生长的作用。研究结果明确了AGTR1在肝癌发生发展中的作用,探讨了AGTR1促进肝细胞癌细胞异常生长的可能机制,为AGTR1高表达肝细胞癌靶向治疗药物的发现及应用提供了实验数据。
[硕士论文] 刘溪
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过研究PDLIM5在前列腺癌组织及细胞系中的表达水平,验证PDLIM5在前列腺癌中的异常高表达。筛选高表达PDLIM5细胞株进一步进行生物功能学实验,以探索PDLIM5介导肿瘤发生及转移的生物学功能及调控机制。
  方法:
  (一)PDLIM5在前列腺癌相关芯片数据库中表达分析及组织标本验证
  收集Oncomine、PROGGENE数据库中的前列腺癌样本中PDLIM5表达、转移及预后相关信息,验证PDLIM5在癌和正常腺体中的表达差异,明确高表达PDLIM5与PCa转移预后的相关性。进一步收集长征医院泌尿外科前列腺癌根治术后临床组织样本44例,运用免疫组织化学染色法检测癌和癌旁组织标本明确PDLIM5组织表达水平。
  (二)前列腺癌PDLIM5敲减细胞株筛选及构建与沉默效率验证
  在PCa常见细胞系中通过Western Blot和qPCR分析PDLIM5的表达情况,选取高表达PDLIM5的转移性PCa细胞株DU145和PC-3作为后续实验对象,构建包含靶向干扰PDLIM5的质粒的慢病毒进行细胞感染。观察质粒上的报告基因荧光强度,并分别在mRNA及蛋白水平验证PDLIM5的敲减效率,确认沉默PDLIM5的细胞株构建成功。
  (三)检测PDLIM5沉默后前列腺癌细胞株增殖、细胞周期凋亡水平变化及对侵袭转移能力影响
  在稳定沉默PDLIM5的DU145和PC-3细胞中,通过MTT比色法、克隆形成试验来评估肿瘤细胞增殖能力的变化;通过细胞流式术检测细胞周期及凋亡水平变化以明确PDLIM5敲减后对肿瘤细胞的周期阻滞及诱导凋亡作用;通过划痕愈合实验及TRANSWELL实验来检测PDLIM5对肿瘤迁移侵袭的影响。
  (四)PDLIM5对前列腺癌增殖转移调控机制的初步探究
  根据细胞表型相关实验结果及数据库信息分析,PDLIM5对肿瘤细胞的转移侵袭能力具有显著影响。首先在PDLIM5沉默状态下通过Western Blot和qPCR对上皮细胞-间充质转化(EMT)相关分子进行了检测,随后通过构建过表达质粒,在同种细胞株中过表达PDLIM5,检测EMT相关分子表达回复情况,并分别在PDLIM5敲减及过表达两种情况下对前列腺骨转移相关分析因子进行检测。最后通过免疫共沉淀,确定PDLIM5与AMPK的相互作用并对敲减PDLIM5后AMPK磷酸化水平进行检测,探索PDLIM5-AMPK-EMT的调控机制。
  (五)动物实验研究PDLIM5在体内功能作用
  使用沉默PDLIM5的DU145细胞进行裸鼠皮下成瘤实验,观察体内环境下PDLIM5敲减后对细胞成瘤及增殖能力的影响。随后将取瘤体组织进行裂解,通过Western Blot对PDLIM5蛋白表达水平进行检测,明确PDLIM5的沉默效率并检测AMPK、EMT相关信号通路分子表达变化,明确在动物实验中PDLIM5对细胞增殖转移的调控机制。
  结果:
  1.发现PDLIM5在PCa组织中异常高表达,并且与PCa生化复发与生存期相关。通过免疫组化及生物信息学分析方法,确认PDLIM5在PCa中较正常前列腺组织表达水平升高,且深入分析数据库芯片资料发现异常高表达的PDLIM5与预后不良因素如:转移、高Gleason评分及TMN分期相关。同时,通过多因素分析及生存分析发现高表达PDLIM5是PCa生化复发的独立危险因素并导致患者总生存率下降。
  2.成功建立稳定沉默PDLIM5的DU145及PC-3细胞株,通过相关细胞学实验发现沉默PDLIM5可导致前列癌细胞恶性增殖、克隆形成、侵袭转移能力受抑制,并可诱导G2/M阻滞和细胞凋亡的发生。
  3.检测PDLIM5敲减后上皮-间质转化(EMT)相关分子表达水平,通过Western Blot及qPCR发现人紧密连接蛋白1(ZO1)、波形蛋白(Vimentin)、SNAIL等出现不同程度下调,而EMT关键分子E-cadherin表达量上升,证实EMT过程受到抑制。
  4.在DU145及PC-3细胞中过表达PDLIM5可以在一定程度上通过上调SNAIL的表达,从而使及关键分子E-cadherin表达量下降,证实PDLIM5对细胞侵袭和转移的影响与EMT密切相关。同时在细胞实验中检测已知促进前列腺癌骨转移的相关分子,如结缔组织生长因子(CTGF),甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)。qPCR结果显示,沉默PDLIM5后,PC-3细胞中这些促肿瘤转移因子的表达显着下调。当PDLIM5过表达时,这些分子的表达水平出现上调,且在DU145细胞中也观察到类似的结果,进一步证实PDLIM5在促进肿瘤转移中起作用
  5.免疫共沉淀确定PDLIM5可与AMPK相结合,敲减PDLIM5后AMPK蛋白及磷酸化AMPK蛋白水平下降。随后通过放线菌素阻断上游蛋白质合成,在给药后不同时间点检测AMPK蛋白水平,结果发现PDLIM5沉默组AMPK蛋白降解加快。即PDLIM5可通过维持AMPK的稳定性,使AMPK通路持续性激活,从而促进前列腺癌的恶性增殖及转移。
  6.裸鼠成瘤实验证明在体内条件下,沉默PDLIM5可抑制肿瘤细胞生长。通过组织蛋白水平检测,在动物实验中PDLIM5同样可通过AMPK-EMT相关通路对前列腺癌细胞增殖及转移进行调控。
  结论:
  本研究证实了PDLIM5表达水平在PCa组织中发生上调,表明PDLIM5可能是PCa形成中的致癌基因。通过生物信息学分析探索PDLIM5与PCa复发和转移的关系,表明高表达PDLIM5是前列腺癌预后不良的相关因素。此外,细胞和动物实验都表明,PDLIM5通过激活AMPK通路可以促进癌细胞的增殖并增强EMT介导的侵袭和转移。探索PDLIM5相关相关通路及作用靶点可能有助于丰富PCa的进展和转移机制,并为mCRPC患者带来新的治疗策略。
[硕士论文] 沈皓
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:中国HCC的发病例数和死亡例数占全球的50%以上,但各个地区的HCC发病率差异明显。本研究旨在比较中国大陆肝癌高发地区(High HCC prevalence regions)和肝癌低发地区(Low HCC prevalence regions)的肝癌病人在肝切术后的远期预后情况,找出不同地区之间影响预后的危险因素的差异。
  研究方法:回顾性分析了1996-2010年间在东方肝胆外科医院进行肝癌切除术并获得组织病理学证实的肝癌病人临床病例资料。参照《2012年中国癌症登记年报》,将病人按照出生地分为高发地区组和低发地区组。计量资料的比较采用Mann-Whitney非参数U-检验,计数资料的比较采用卡方检验,生存资料的分析采用Kaplan-Meier法、对数秩检验和Cox风险回归分析。使用R3.4.1和SPSS18.0统计软件对统计结果进行分析。
  研究结果:本研究随访日期截止至2013年6月30日,中位随访时间为24.1个月。研究共纳入4919例病人,其中3370例来自肝癌高发地区,1549例来自肝癌低发地区。在全部病人中,高发地区组的5年肿瘤复发率明显高于低发地区组(82.9%比69.2%;p<0.001),而其5年生存率则低于低发地区组(48.8%比53.7%;p<0.001)。多因素分析发现,来自高发地区在肿瘤复发和总体生存中都是独立危险因素(TTR[HR]:1.18;OS[HR]:1.24)。
  按地区不同对病人进行亚组分析后发现,来自高发地区的病人HBsAg、HBeAg和HBcAb阳性率更高并且HBV-DNA>2000IU/mL,AFP>20ng/ml,微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)阳性及肿瘤低分化(Edmondson-Steiner分级:Ⅲ-Ⅳ级)的比例也更高。两地区病人共同的预后独立危险因素为AFP水平>20ng/mL,肿瘤直径>5cm以及MVI阳性。低发地区组的预后独立危险因素是年龄≤50岁,男性和输血,而高发地区组的独立危险因素为HBeAg阳性,HBV-DNA>2000IU/mL,TBIL>17.1umol/L,非解剖性肝切除以及肿瘤低分化。
  全部病人中,符合米兰标准的病人共2497例(高发地区组1739例,低发地区组758例);符合BCLC0期标准的病人共370例(高发地区组264例,低发地区组106例)。多因素分析发现,来自高发地区在以上两个分期中依旧是肿瘤复发和总体生存的独立危险因素(米兰标准:TTR:1.27;OS:1.37;BCLC0期:TTR:1.94;OS:2.50)。
  对全部病人、符合米兰标准的病人和符合BCLC0期标准的病人中HBeAg阳性病人分别进行亚组分析后发现,高发地区组的1、3、5年复发率均高于低发地区组(全部病人:p=0.030;米兰标准:p=0.004;BCLC0期:p=0.048),符合米兰标准的病人和符合BCLC0期标准的病人中高发地区组的1、3、5年生存率低于低发地区组(米兰标准:p=0.043;BCLC0期:p=0.046)。但在全部病人中,两者的1、3、5年生存率并没有明显差异(p=0.182)。
  研究结论:本研究首次发现了中国大陆肝癌高发地区和肝癌低发地区病人术后远期预后存在明显差异,来自高发地区的病人预后更差。来自高发地区在多个肿瘤分期中都是预后的独立危险因素。高发地区的病人HBV感染率更高且环境毒素暴露机会更多可能是导致这种现象的原因。
[硕士论文] 彭立嗣
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)不仅有细胞保护作用,而且参与抗癌药物耐药性的产生。但是,GST同工酶在胰腺癌化疗耐药中的作用仍不清楚。本研究将检测GSTM2基因在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株及接受新辅助化疗的胰腺癌患者癌组织中的表达。并通过siRNA及shRNA沉默GSTM2基因,分别转染胰腺癌细胞及注入裸鼠胰腺构建原位移植瘤模型后用吉西他滨处理,从体外、体内实验两个层面观察在胰腺癌中沉默GSTM2对吉西他滨敏感性的影响。最后分析GSTM2在胰腺癌患者中的表达及与临床预后的相关性。
  结果表明吉西他滨处理可以增加胰腺癌细胞株及胰腺癌组织中GSTM2的表达。沉默GSTM2可使经吉西他滨处理的胰腺癌细胞的凋亡增加、活力降低,体内实验进一步表明在裸鼠胰腺原位移植瘤模型中利用shRNA诱导GSTM2沉默,能增强吉西他滨化疗的药物敏感性。研究还发现,GSTM2在胰腺癌组织中的表达低于正常胰腺组织,而GSTM2的高表达则与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  综上所述,GSTM2能使接受吉西他滨处理的胰腺癌细胞产生耐药性并存活,故吉西他滨也能增加胰腺癌细胞株中GSTM2的表达,GSTM2在胰腺癌中的沉默有益于增强吉西他滨的化疗效果,胰腺癌患者中GSTM2的高表达与总体生存期显著相关。因此,GSTM2有潜力成为优化胰腺癌化疗方案选择和预测胰腺癌预后的生物标志物。
  一、GSTM2在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株及接受新辅助化疗的胰腺癌患者癌组织中的表达
  目的:分析吉西他滨处理胰腺癌细胞及癌组织对GSTM2表达的影响。
  材料和方法:利用qRT-PCR和western blot检测吉西他滨处理前后GSTM2在胰腺癌细胞株中的表达情况。收集接受吉西他滨新辅助化疗后手术和仅接受外科手术的胰腺癌患者的癌组织标本,进行免疫组化染色,比较两组中GSTM2表达水平的差异。
  结果:GSTM2在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株中的表达水平明显高于未经吉西他滨处理的对照组;在接受吉西他滨化疗的胰腺癌患者组织中的表达水平明显高于仅接受外科手术的患者。
  结论:吉西他滨能使胰腺癌细胞和胰腺癌组织中的GSTM2表达水平上升,初步证实GSTM2参与胰腺癌吉西他滨化疗耐药性产生。
  二、沉默GSTM2对胰腺癌化疗敏感性影响的体外实验研究
  目的:检测siGSTM2对吉西他滨处理胰腺癌细胞株的化疗敏感性的影响。
  材料和方法:运用siRNA技术沉默BXPC-3、Panc-1、L3.6pl和MPanc96四种胰腺癌细胞株中的GSTM2基因,利用qRT-PCR和western blot检测沉默效果。再用吉西他滨处理上述细胞株,通过流式细胞仪检测癌细胞的凋亡水平,应用MTT分析法检测细胞活力。
  结果:qRT-PCR和western blot检测结果示siRNA转染4种胰腺癌细胞株成功,沉默GSTM2效率高,均在60%以上。经吉西他滨处理后,siGSTM2组与siControl组相比癌细胞凋亡率明显更高、活力显著降低。
  结论:siGSTM2能在胰腺癌细胞株中高效沉默GSTM2基因。沉默GSTM2能增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。
  三、沉默GSTM2对胰腺癌化疗敏感性影响的体内实验研究
  目的:检测shGSTM2对裸鼠胰腺原位移植瘤行吉西他滨化疗敏感性的影响。
  材料和方法:用shGSTM2对胰腺癌细胞株Mpanc96进行转染,行qRT-PCR和western blot检测评估沉默效果。将证实已被shRNA成功转染的Mpanc96细胞株原位注入裸鼠胰腺,构建裸鼠胰腺原位转移瘤模型。用IVIS成像系统予以生物荧光成像明确成瘤效果。用吉西他滨处理胰腺癌原位瘤后,用Living Image软件程序进行定量分析瘤体体积变化。
  结果:shRNA转染Mpanc96成功且沉默GSTM2效果佳。生物荧光成像可见裸鼠胰腺位置有荧光信号,移植瘤成瘤,建模成功。shGSTM2+吉西他滨组裸鼠瘤体体积最小。
  结论:沉默GSTM2能在体内增强胰腺癌吉西他滨化疗的敏感性。
  四、GSTM2在胰腺癌患者中的表达与临床预后相关性的研究
  目的:分析GSTM2在胰腺癌患者中的表达及与临床预后的相关性。
  材料和方法:收集于我院确诊胰腺癌的50例手术患者的癌组织标本,以癌旁组织及正常人的胰腺组织样本作为对照,检测GSTM2的mRNA表达水平的差异。根据GSTM2的平均蛋白表达量将胰腺癌样本分为GSTM2低表达组和GSTM2高表达组,分析两组生存期的差异。
  结果:GSTM2在胰腺癌患者胰腺组织样本中的表达显著低于癌旁组织及正常人的胰腺组织样本。GSTM2低表达组的胰腺癌患者较高表达组患者的总体生存率低,预后差。
  结论:GSTM2在正常人中的表达高于胰腺癌患者,且GSTM2高表达与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  总结上述研究,可得出结论如下:
  1、吉西他滨可以增加胰腺癌中GSTM2的表达。
  2、沉默GSTM2可使经吉西他滨处理的胰腺癌细胞凋亡增加、活力降低。
  3、沉默GSTM2能使接受吉西他滨化疗的裸鼠胰腺原位移植瘤体积缩小,在体内增强吉西他滨化疗的敏感性。
  4、GSTM2在正常人中的表达高于胰腺癌患者,且GSTM2高表达与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  5、GSTM2有潜力作为生物标志物筛选对吉西他滨高敏感的胰腺癌患病人群行精准治疗,同时预测胰腺癌的预后。
[硕士论文] 唐渊
外科学(普通外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:胃癌是中国最常见的消化道恶性肿瘤,中国新发生的胃癌,其中90%以上患者是进展期胃癌。目前胃癌主要治疗方式是手术加上化疗,部分进展期的胃癌通常不能直接进行手术,需要进行术前的新辅助化疗。目前临床胃癌新辅助化疗,存在化疗耐药问题。课题组前期研究发现,胃癌新辅助化疗能够诱导肿瘤细胞衰老。衰老的细胞会分泌大量的炎性因子,趋化因子,蛋白酶体等,这种表型是细胞衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP),能够通过多种方式,导致化疗耐药。进一步研究发现胃癌新辅助化疗标本耐药的患者存在SASP相关因子升高。课题组前期对胃癌新辅助化疗组织标本进行回顾性研究发现:胃癌新辅助化疗的效果与tristetraprolin(TTP)的表达有着密切相关,TTP高表达的患者胃癌新辅助化疗敏感性好,TTP低表达的患者新辅助化疗敏感性差。TTP作为一个RNA结合蛋白,能够与大量细胞因子mRNA的3'UTR区的AU富集区(AU-rich element,ARE)结合,进而降解目标因子的mRNA,也是一个重要的抑炎和抑癌蛋白。TTP调控的靶因子的mRNA与SASP相关分泌因子的mRNA有大量重叠。由此推测:TTP可能通过调控胃癌新辅助化疗引起的SASP,进而增加胃癌新辅助化疗敏感性。TTP其有可能成为候选的胃癌新辅助化疗敏感性的生物标志物。本研究拟在此研究基础上,通过在体外胃癌细胞衰老模型下,研究TTP通过调控SASP相关因子表达,提高新辅助化疗敏感性具体作用及其分子调控机制。为进一步探讨如何通过TTP改善胃癌新辅助化疗敏感性,以及胃癌患者治疗个体化治疗方案,也为TTP作为胃癌新辅助化疗有效的生物标志物提供基础理论支持,具有重要的临床意义。
  方法:第一部分:根据课题前期相关实验结果,选取胃癌BGC-823细胞系。分别在0、25nM、35nM、45nM浓度下紫杉醇诱导处理BGC-823细胞24h、48h、72h。衰老相关的β-gal半乳糖苷酶染色,分析构建稳定体外的胃癌细胞衰老模型。
  第二部分:基于胃癌BGC-823细胞系构建TTP过表达和TTP干扰细胞株,嘌呤霉素筛选稳定表达和稳定干扰的细胞株。实验分为三组:TTP过表达组,TTP干扰组,空白对照组。在紫杉醇35nM浓度下,诱导胃癌BGC-823细胞72h,分别通过qPCR和ELISA检测SASP部分相关因子的mRNA水平和蛋白分泌水平。
  第三部分,在体外紫杉醇诱导胃癌BGC-823细胞衰老模型上,通过Western blot方法检测p65在TTP过表达,TTP干扰的细胞核内外表达水平变化。进一步通过细胞免疫荧光,确定核内外p65表达水平,使用Image pro plus软件进行核内外p65荧光强度半定量分析。
  结果:第一部分:成功构建胃癌BGC-823细胞衰老模型构建:在35nM浓度下,紫杉醇诱导BGC-823细胞72h,β-gal染色,染色阳性,说明成功构建体外的胃癌细胞BGC-823衰老模型,其中胃癌BGC-823细胞衰老染色在紫杉醇诱导72h细胞衰老的比例达到60%以上
  第二部分:构建胃癌BGC-823细胞的TTP过表达和TTP干扰的细胞株,通过RT-qPCR验证TTP过表达和TTP干扰细胞株构建成功。通过嘌呤霉素在2μg/ml浓度作用下,筛选得到TTP稳定过表达和TTP稳定干扰的胃癌BGC-823细胞株。在35nM浓度紫杉醇诱导胃癌BGC-823细胞72h,通过qPCR和ELISA分别检测SASP部分相关因子的mRNA和蛋白变化。结果显示:TTP过表达时,能够下调SASP部分相关因子的表达,TTP干扰时,上调SASP部分相关因子表达,相比空白对照组差异具有统计学意义。
  第三部分:为了进一步研究TTP对SASP调控分子机制,在紫杉醇诱导的胃癌BGC-823细胞衰老模型上,Western blot结果显示p65核内外的表达,TTP过表达组相比空白对照组显著减少,TTP干扰组核内p65相比空白对照也是显著增多。为了进一步验证TTP过表达和TTP干扰是否对p65入核影响,细胞免疫荧光,TTP过表达,TTP干扰组,空白对照组在紫杉醇诱导的胃癌BGC-823细胞72h条件下,细胞免疫荧光分析结果显示:在TTP过表达,核内的p65的荧光相比空白对照组和TTP干扰组有差异具有统计学意义。
  结论:成功构建紫杉醇体外诱导的胃癌BGC-823细胞衰老模型,在胃癌细胞衰老模型上,发现TTP能够调控胃癌BGC-823细胞的衰老相关分泌表型。TTP通过ARE结合途径直接降解SASP相关因子表达,还可以通过减少p65入核,抑制NF-κB信号通路激活,进而调控胃癌细胞衰老相关分泌表型。这也揭示:TTP可能通过调控SASP相关因子的表达,增加胃癌新辅助化疗敏感性。
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