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[硕士论文] 贺子君
食品科学与工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)是一种接合生殖的丝状真菌。B.trispora的天然菌株能够发酵生产类胡萝卜素,因此在食品工业上常使用B.trispora发酵生产抗氧化剂。本研究发现,植物激素乙烯可以促进B.trispora中β-胡萝卜素的产生,本研究采用基于二维蛋白电泳的蛋白质组学方法结合代谢组学数据,共发现31个代谢物和9个蛋白质与B.trispora对乙烯的响应有关。这些代谢物和蛋白质主要参与三羧酸循环(TCA),碳水化合物代谢,氨基酸代谢,脂肪酸代谢和甲羟戊酸途径等过程。研究结果表明,乙烯导致TCA循环代谢流的下降和乙酰辅酶A的积累,这有助于代谢流向产生β-胡萝卜素的方向移动。同时乙烯诱导了甲羟戊酸途径中hmgR,ipi,carG,carRA和carB等关键基因的转录上调,直接带来了β-胡萝卜素产量增加。
  为了更全面地了解乙烯对B.trispora的转录调控,本研究还对B.trispora进行基于RNA-seq测序的基因转录组学分析,在B.trispora中拼接出总共27095个转录本。通过差异表达基因分析,B.trispora对乙烯的转录响应主要发生在稳定期,乙烯能够诱导菌体提前进入稳定期。KEGG通路富集分析结果表明,乙烯很可能引起了细胞的氧化应激反应。通过分析胞内丙二醛水平,超氧化物歧化酶活性和过氧化氢酶活性,进一步证实在乙烯处理后,B.trispora中氧化压力增加,导致了氧化应激反应的产生和β-胡萝卜素含量增加。这项研究为进一步揭示B.trispora对乙烯响应的分子机制并实现β-胡萝卜素高产提供了丰富的信息。
[硕士论文] 侯朝
农药学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:生物素(Biotin)为B族维生素之一,是一种水溶性维生素。生物素是生物羧化转羧基反应中至关重要的辅酶,参与微生物、植物和动物中糖异生、脂肪酸的生物合成及氨基酸代谢等重要的代谢过程。植物、微生物可以合成自身所需的生物素,但参与生物素合成的酶类在高等动物中是不存在的,因此基于生物素合成过程中所涉及到的酶而设计合成的抑制剂能最大限度的减少对非靶标生物的毒害。脱硫生物素合成酶是是当前研究最为深入的生物素合成酶,本研究基于脱硫生物素为靶标设计合成得到两个系列的化合物,并对其进行了活性筛选,取得主要成果如下:
  1.以5-溴-2,3-二氨基吡啶为材料,经乙酰乙酸乙酯环化制得中间体化合物6-溴-1-异丙烯基-1H-咪唑[4,5-b]吡啶-2-酮,再经N-酰化反应得到17个新的6-溴-1-异丙烯基-1H-咪唑[4,5-b]吡啶-2-酮酰胺衍生物;以2-氯-4,6-二甲氧基嘧啶为原料,得到2-氨基4,6-二甲氧基嘧啶,再经过N-酰化和醚化反应合成得到26个嘧啶-2-胺衍生物,并通过1HNMR、13C NMR和ESI-MS对其结构进行了表征。
  2.采用滤纸片法评价了上述两个系列的化合物对白菜软腐病菌(Erwiniacarotovora)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)6种细菌的抑菌活性。结果表明,化合物B-03、B-05、B-13、MD-06、MD-17、MD-21对蜡状芽孢杆菌表现出较好的抑菌活性。
  3.采用抑制菌丝生长速率法对目标化合物抗真菌活性进行了初筛,并测定了高活性化合物的抑制中浓度(IC50)。结果表明,6-溴-1-异丙烯基-1H-咪唑[4,5-b]吡啶-2-酮类化合物B-01、B-03、B-04、B-05、B-06和B13对部分供试病原真菌菌丝生长有明显的抑制作用,其中B-06(丁酰基衍生物)抑菌活性最为突出,其对小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)和番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的抑制中浓度IC50值分别为8.23、4.01μg/mL;而2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶系列衍生物仅对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotioru)的菌丝生长的抑制活性比较明显,其中MD-09(环丙酰基衍生物)、MD-16(庚酰基衍生物)、MD-20(间甲基苯甲酰基衍生物)、MD-22(邻氯苯甲酰基衍生物)活性尤为突出,其中以MD-09对油菜菌核病菌的活性最为突出,IC50值为4.92μg/mL。
  4.采用抑制孢子萌发法初步评价了合成化合物对玉米弯孢霉病菌孢子萌发的抑制活性,并测定了高活性化合物的抑制中浓度(IC50),其中B-04和B-06的抑制中浓度IC50分别为17.30和14.67μg/mL。
  5.采用番茄果实活体实验验证了化合物对番茄活体上番茄灰霉菌体生长的抑制作用,实验结果表明供试化合物B-01、B-06、MD-09、MD-20、MD-26均表现出较好的抑制真菌生长活性,200μg/mL的浓度下抑制率均超过50%,为新农药的开发提供了依据。
  6.外源添加和分子对接试验证实去硫生物素合成酶为2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶类衍生物抑菌作用靶标,该结果为脱硫生物素合成酶抑制剂的设计合成提供了初步理论依据。
[硕士论文] 唐亚平
口腔临床医学 遵义医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  观察1,25-二羟维生素D3(1,25(OH)2D3)对2型糖尿病伴牙周炎患者中性粒细胞凋亡及凋亡相关因子caspase-3,bax,bcl-2表达情况,探讨p38MAPK信号通路在1,25(OH)2D3对2型糖尿病伴牙周炎患者中性性粒细胞凋亡的调控机制。
  方法:
  2015年9月至2016年7月收集遵义市遵义医学院附属医院内分泌科有2型糖尿病并伴有牙周炎患者76例(男52例,女24例),采集患者外周血10ml,采用密度梯度离心法分离中性粒细胞,分为空白组(control组)、1,25(OH)2D3诱导组(medication组)、1,25(OH)2D3+SB203580D诱导组(medication+blocker组),使用流式细胞术(FCM)观察细胞凋亡情况,蛋白质印迹技术(Western Blot)检测p38MAPK信号通路相关蛋白p38、p-p38,凋亡蛋白 caspase-3、bax、bcl-2的表达;实时定量PCR(RT-PCR)检测p38、caspase-3、bax/bcl-2mRNA的表达。
  结果:
  1.FCM结果显示:通过使用浓度为10-8mol/L的1,25(OH)2D3作用于细胞24小时后,medication组凋亡率最高,medication组及medication+blocker组凋亡率均高于control组,两两比较均有统计学意义(P<0.01)。
  2.Western Blot结果显示:1,25(OH)2D3作用后,medication组磷酸化p38(p-p38)、caspase-3及bax蛋白表达最高,其次为medication+blocker组,control组最低,bcl-2蛋白的表达medication组灰度值最低,其次为medication+blocker组,control组最高。
  3.RT-PCR结果显示:control组、medication组、medication+blocker组p38mRNA水平组间比较无统计学差异(P>0.05);caspase-3、bax/bcl-2的mRNA水平在medication组高于control组和medication+blocker组,medication+blocker组高于control组,组间两两比较均有统计学意义(P<0.01)。
  结论:
  1.1,25(OH)2D3可通过激活P38MAPK信号通路诱导2型糖尿病伴慢性牙周炎患者中性粒细胞的凋亡。
  2.1,25(OH)2D3作用于2型糖尿病伴牙周炎患者中性粒细胞的凋亡存在其他的通路机制。
[硕士论文] 刘虹均
生物化学与分子生物学 江苏科技大学 2016(学位年度)
摘要:类胡萝卜素作为一种天然着色剂,是家蚕蚕茧的颜色来源。在家蚕血淋巴中对类胡萝卜素转运机理的研究可以为家蚕体内类胡萝卜素转运机制的相关研究提供参考和借鉴,同时也为家蚕生产发育的研究提供线索。
  本文经过色谱和质谱的分析技术确定家蚕幼虫血淋巴中具有结合类胡萝卜素能力的可能蛋白质。将家蚕幼虫血淋巴依次运用阴离子交换层析、阳离子交换层析及分子筛三步纯化后进行质谱分析,表明家蚕幼虫血淋巴中结合类胡萝卜素的可能蛋白质是载脂蛋白 II/I。同时对三种家蚕品种的血淋巴进行色谱分析,实验发现不同家蚕品种血淋巴中结合类胡萝卜素的可能蛋白质含量的存在差异,家蚕品种Kyp22和4001的血淋巴中结合类胡萝卜素的可能蛋白质相对于家蚕品种P50的血淋巴中的含量较多。
  色谱层析和质谱层析实验确定了家蚕血淋巴中结合类胡萝卜素的可能蛋白为载脂蛋白II/I,将载脂蛋白II的基因进行分段克隆和原核表达,实验发现分段表达的载脂蛋白II均为可溶性蛋白质,对载脂蛋白II分段原核表达的蛋白质进行色谱层析,发现目的蛋白LP-II-1(Met1-Leu409)结合类胡萝卜素的能力比目的蛋白LP-II-2(Glu300-Tyr687)和LP-II(Met1-Tyr687)结合能力稍强。
  为了进一步研究家蚕载脂蛋白,通过原核表达系统表达载脂蛋白III其表达量相对较低,为了研究如何提高其表达量,本实验在不同大肠杆菌表达菌株、不同 IPTG诱导浓度和不同诱导温度的条件下研究家蚕载脂蛋白 III的表达情况。结论如下:选择不同大肠杆菌表达菌株,家蚕载脂蛋白III的表达没有明显差异;随着 IPTG诱导浓度的提高,家蚕载脂蛋白 III的表达量也随之增加;诱导温度降低有利于家蚕载脂蛋白III可溶部分的表达,包涵体的表达量相对降低。
  家蚕血淋巴具有结合类胡萝卜素能力的蛋白为载脂蛋白 II/I,实验结果进一步完善了家蚕体内类胡萝卜素转运机制,为后续实验提供依据。
[硕士论文] 姜红
食品科学 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:黑胡萝卜是胡萝卜的变种,产于土耳其、阿富汗、埃及、巴基斯坦、印度和远东国家,距今已有3000多年的栽种历史,根部呈紫黑色,花色苷含量丰富,具有抑制癌细胞生长、抗氧化等活性。为了扩大黑胡萝卜色素在食品药品领域中的应用,本研究在对黑胡萝卜花色苷进行结构鉴定的基础上,对粗提物和单体与牛血清蛋白的相互作用进行研究,并对其稳定性和抗氧化能力进行评价,主要结果如下:
  1.黑胡萝卜色素粉末的花色苷含量为5.42%,主要花色苷种类为矢车菊素3-木糖(葡萄糖)半乳糖、矢车菊素3-木糖-半乳糖、矢车菊素3-木糖(芥子酸葡萄糖)半乳糖、矢车菊素3-木糖(阿魏酸葡萄糖)半乳糖、矢车菊素3-木糖(对香豆酸葡萄糖)半乳糖、天竺葵素3-木糖(阿魏酸葡萄糖)半乳糖,矢车菊素3-木糖(阿魏酸葡萄糖)半乳糖占50%以上。通过半制备液相色谱收集的矢车菊素3-木糖(阿魏酸葡萄糖)半乳糖纯度为98.92%。
  2.黑胡萝卜色素的水解平衡常数约为4.8,pH5.0条件下最不稳定。在70-90℃加热,黑胡萝卜色素降解速度较快。另外,黑胡萝卜色素对氧化剂双氧水和还原剂抗坏血酸比较敏感。Na+、K+对黑胡萝卜色素的贮藏稳定性无影响,高浓度Ca2+、Mg2+、Zn2+、Al3+能提高黑胡萝卜色素的贮藏稳定性,Cu2+和Fe3+能降低黑胡萝卜色素的贮藏稳定性。
  3.采用多光谱结合微量热泳动法对黑胡萝卜色素粗提物和矢车菊素3-木糖(阿魏酸葡萄糖)半乳糖与牛血清蛋白的相互作用进行研究。结果表明,黑胡萝卜色素和矢车菊素3-木糖(阿魏酸葡萄糖)半乳糖均能通过非辐射能量转移猝灭牛血清蛋白荧光,猝灭机制均为静态猝灭,形成1∶1的复合物,主要作用力为氢键和范德华力,并且黑胡萝卜色素粗提物的作用效果强于矢车菊素3-木糖(阿魏酸葡萄糖)半乳糖,结合距离为分别为4.010nm和3.813nm。在此过程中,牛血清蛋白的色氨酸和酪氨酸微环境均未发生变化,牛血清蛋白的二级结构发生变化,以α-螺旋含量变化为主,黑胡萝卜色素与牛血清蛋白的摩尔比为2.5∶1时,α-螺旋含量由52.21%降到46.84%,当矢车菊素3-木糖(阿魏酸葡萄糖)半乳糖与牛血清蛋白的摩尔比为2.5∶1时,牛血清蛋白的α-螺旋含量由52.21%降到51.35%。微量热泳动结果显示,矢车菊素3-木糖(阿魏酸葡萄糖)半乳糖与牛血清蛋白的结合常数为5208L/mol,与荧光光谱结果对应。不同浓度金属离子(Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe3+)猝灭牛血清蛋白荧光强度的能力较低,对黑胡萝卜色素粗提物和矢车菊素3-木糖(阿魏酸葡萄糖)半乳糖猝灭牛血清蛋白荧光方式、结合位点数和相互作用引起牛血清蛋白构象变化无影响。
  4.采用DPPH法、总还原力法、ABTS法和FRAP法对黑胡萝卜色素的抗氧化能力进行评价,结果表明,黑胡萝卜色素具有一定的清除DPPH和ABTS自由基的能力以及总还原能力和铁还原能力,其清除DPPH自由基和ABTS自由基的IC50值分别为26.51mg/L和167.49mg/L。并且随着浓度的提高,抗氧化能力增强,但总抗氧化能力不如抗坏血酸。
[硕士论文] 杨昭
生物工程 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:生物素是一种含硫的7碳脂肪酸衍生物。它是羧化反应酶,脱羧基反应酶及羧基转移反应酶的重要辅酶,参与脂肪酸合成,糖元合成和氨基酸代谢等多种反应。大多数细菌、真菌以及植物能够从头合成生物素,而哺乳动物和鸟类不能。从头合成一分子生物素要消耗20分子的ATP,对于这一昂贵的分子细菌通常采用一个很严格的机制来监管其合成。在生物素缺陷型谷氨酸棒状杆菌中发现一种 TetR转录因子家族的转录抑制因子,命名为BioQ,它在生物素的合成中起抑制作用。基因组分析发现大多数分枝杆菌中拥有一个bioQ同源物,多序列比对结果显示不同分枝杆菌中的BioQ同源物与谷氨酸棒状杆菌中的BioQ具有很高的相似性。这些证据暗示在分枝杆菌中BioQ可能作为生物素合成的负调控者。
  bioQ基因与生物素合成相关基因相邻存在的现象已广泛报道,BioQ蛋白可结合到生物素合成相关基因的启动子区或上游区域也已充分验证。BioQ蛋白识别的生物素合成相关基因的上游区域普遍存在一个13bp的回文序列(TGAAC-N3-GTTCA)。通过凝胶迁移实验证实了这一回文序列为 BioQ蛋白的结合位点。为解释耻垢分枝杆菌转录调控蛋白BioQ对目标DNA识别的分子机制,我们结合结构生物学的手段,通过获取高分辨率蛋白晶体的X射线衍射数据并解析单一BioQ蛋白和BioQ-DNA复合物的三维结构来直观展示这一识别机制。
  本论文通过将耻垢分枝杆菌转录调控蛋白BioQ的基因构建到pET15d载体并转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),过量表达并纯化BioQ蛋白。随后体外实验检测BioQ蛋白与目标DNA的亲和力。采用Hampton Reasearch公司的晶体筛选试剂盒,并利用气-液扩散法初步筛选获得有潜力的结晶条件。然后对初筛条件进行优化得到衍射数据较好的蛋白晶体,并在上海同步辐射光源收集分辨率高的衍射数据,随后解析蛋白质晶体的三维结构。2.3?的单一BioQ和2.4?的BioQ-DNA复合物晶体结构的获得,不但能直观展示BioQ蛋白特异识别DNA的分子机制,而且能为以BioQ为靶标的药物设计和筛选提供研究基础,还能为生物素合成的调控模式提供新的理解。
[硕士论文] 耿瑛
食品工程 天津商业大学 2016(学位年度)
摘要:随着高效液相色谱(HPLC)在分析领域的应用范围越来越广,其色谱填料的发展也日益引起国内外研究者的关注。目前,HPLC普遍使用的是硅胶色谱填料,但由于其具有适用的pH值范围窄(pH值为3-10)及对碱性化合物不可逆吸附等缺点,相较而言,钛胶色谱填料具有很好的化学稳定性、机械稳定性和热稳定性。例如,钛胶在pH值1-14范围都能够稳定存在;对碱性化合物具有很好的分离效果;可与含羟基、磷酸、羧酸等基团的化合物进行结合;且钛胶色谱柱在升高温度时具有较低的柱压,有利于化合物的分离分析。由于这些优于硅胶色谱柱的特点,近年来钛胶作为色谱填料,吸引了众多的国内外学者对其进行研究。
  维生素对于维护人体健康、预防及治疗多种疾病都有着重要的作用,虽然粮食、水果和蔬菜等食物中含有维生素,但目前出现了越来越多补充维生素的食品及保健品,因此对于维生素含量的分析与测定具有重要意义。钛胶反相色谱柱对维生素的分析未见报道,本文研究了反相钛胶色谱柱在分析水溶性维生素方面的应用。
  本课题的内容包括三部分:
  (1)建立了钛胶反相色谱柱对维生素B1的测定方法。研究了维生素B1的保留行为与甲醇含量、柱温和流速的关系,得出最优色谱条件:检测波长265nm,磷酸缓冲盐pH值7.0,浓度5.0mmol/L,甲醇65%,柱温30℃,流速1.0mL/min。线性范围为0.083-125μg/mL(R2=0.9998);检出限为0.025μg/mL;相对标准偏差(n=8)为0.56%;加标回收率范围为95.46%-105.40%。
  (2)建立了高效液相色谱法同时测定维生素B2和维生素B5含量的检测方法。研究了两种维生素的保留行为与磷酸缓冲盐浓度、柱温和流速的关系,得出最优色谱条件:在270nm检测维生素B2,在210nm检测维生素B5,磷酸缓冲盐pH值2.5,浓度80mmol/L,柱温50℃,流速0.8mL/min。分析了两种维生素保留的热力学参数-焓、熵和吉布斯自由能。维生素B2和维生素B5线性范围分别为1.0-50.0μg/mL(R2=0.9999)和3.0-150.0μg/mL(R2=0.9998);维生素B2和维生素B5的检出限分别为0.300μg/mL和0.900μg/mL;两种物质的相对标准偏差低于0.22%;加标回收率范围为94.55%-104.06%。方法的精密度和准确度均可满足HPLC法的测定要求。
  (3)建立了高效液相色谱法同时测定五种维生素:生物素(维生素B7)、叶酸(维生素B9)、钴胺素(维生素B12)、烟酸和烟酰胺(统称维生素PP)含量的检测方法。研究了五种维生素的保留行为与磷酸缓冲盐pH、缓冲盐浓度、柱温和流速的关系,得出最优色谱条件:在210nm检测生物素和钴胺素,270nm检测烟酸、烟酰胺和叶酸,磷酸缓冲盐pH值7.0,浓度5.0mmol/L,柱温50℃,流速0.8mL/min。分析了五种维生素保留的热力学参数-焓、熵和吉布斯自由能。烟酸、生物素、烟酰胺、叶酸和钴胺素标准曲线线性良好(R2>0.9990);烟酸、生物素、烟酰胺、叶酸和钴胺素的检出限分别为0.006μg/mL、0.010μg/mL、0.020μg/mL、0.022μg/mL和0.008μg/mL;五种物质的相对标准偏差均低于1.36%;加标回收率范围为92.30%-107.20%。方法的精密度和准确度均可满足HPLC法的测定要求。
[硕士论文] 石明
生物化学与分子生物学 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:维他命是动物和其他生物饮食中不可或缺的重要成分,VB1是其中之一,它与多种细胞功能,包括能量代谢、糖和碳骨架的降解相关。另外它还与细胞和组织中及细胞和膜之间的神经交流、免疫系统激活、信号和维护过程相关。正因为VB1如此重要的功能,其在体内的吸收和转运过程才显得那么关键。它的吸收路径相对来说是比较复杂的,由一系列的蛋白参与,包括溶质载体阴离子转运蛋白、碱性磷酸酶转运系统和人神经元外单胺转运家族,其中包含一些多特异性的蛋白。参与VB1吸收的两个原核蛋白的结构被解析,显示这些蛋白结合VB1依靠的是强烈的静电相互作用。高等生物的VB1结合蛋白结构相关信息的缺乏是让我们理解VB1吸收过程的一大瓶颈。
  THI10是酿酒酵母的VB1转运蛋白,其结构的解析将对我们理解VB1转运机制有所帮助,同时也能提示VB1缺陷疾病的致病机理。
[硕士论文] 刘虹
化学工程 青岛大学 2015(学位年度)
摘要:当前,肌醇的主要生产方式是利用农副产品加工生产过程中产生的副产物--玉米浸泡水和米糠浸泡水等作为原料,经过中和沉淀得到中间产物菲汀,之后再通过对菲汀进行水解提纯等工序提取。该项生产工艺已经应用了许多年,虽然通过了各项改进,但还是存在工艺繁琐、产品质量低、工人劳动强度大、污染严重、臭味较大等弊端。所以,很有必要研究开发新的肌醇生产工艺,或者结合当前新型科学技术对当前工艺进行优化,提高生产技术含量、提高肌醇收率、降低成本、减少污染,提高市场竞争力。
  菲汀是肌醇生产过程中产生的中间产物,通过对相关文献的查阅和调研,本文采用实验与实际生产相结合的方式,对菲汀生产过程中产生气味污染的问题进行了研究和处理。当前广泛应用的菲汀(植酸钙)提取工艺方法是在玉米浸泡水中直接加石灰乳中和沉淀,然后通过板框压滤得到菲汀。该工艺虽然简单,但存在以下缺陷:一、在生产过程中臭味很大;二、滤液中含有大量Ca2+,在浓缩玉米浆过程蒸发器结垢严重。
  本文针对这个问题进行了实验探索。将一定量6Be°的玉米浸泡水在旋转蒸发器中进行不同程度的浓缩,然后再对浓缩的产品进行沉降,之后对所得上层清液进行中和操作,加入石灰乳,再将中和料液真空抽滤,所得滤饼即为菲汀,之后对菲汀进行称重检测。通过对所得数据比较得出,将玉米浸泡水浓缩至12Be°时,菲汀气味由酸味变成了玉米香,结垢情况轻微,菲汀质量较好。
  本实验方法可以有效的处理有玉米浸泡水生产肌醇过程中获得菲汀工序时产生气味污染和结垢严重的问题,可以由实验室阶段逐步向工业生产进行研究宽展,为肌醇生产工艺提供工了一项新的技术保障。
[硕士论文] 张茹惠
分析化学 青岛科技大学 2015(学位年度)
摘要:光致电化学分析法是基于光与电的能量转换,利用被测物质与光致电化学反应过程之间的相关性,实现对被测物质浓度的检测。这种以光电化学过程为基础的光致电化学分析法是一种新的检测技术。由于激发光源和检测信号的分离,互不干扰,所以空白值较低。与光学分析法相比,它具有设备简单,成本低廉的优点;而相对于电化学分析法,具有选择性好、灵敏度高的特点。黄素化合物是7,8-二甲基异咯嗪的衍生物,主要有核黄素(RF)、黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。从分子结构上看,黄素化合物分子中存在共轭双键、具有刚性的平面构造和发生氧化还原反应的位点,所以具有很好的光化学和电化学活性。另一方面,它们还具有光敏特性,是重要的光敏化试剂。基于黄素化合物的光电活性和光致电化学分析法,本文进行了光致电化学分析法检测黄素化合物的尝试,主要的研究工作内容如下:
  1.基于RF的光化学和电化学性质,通过探讨核黄素的光致还原反应机理,将核黄素的光致还原与其产物的电极反应纳入一个光电化学过程,发展了一种新的核黄素光致电化学分析法。文中,讨论了工作电极的种类,电极的表面积,缓冲溶液的pH值,偏压,电解时间,光照时间,光还原剂的种类,浓度以及光强度对光电化学过程和光电流响应的影响。在pH4.5的醋酸盐缓冲溶液中,以EDTA为光还原剂,在峰值波长为450 nm、能量为15 mW/cm2的光照下,在偏压0V处测得的光电流与5.00×10-10~5.00×10-5 mol/L核黄素浓度的对数值成正比,灵敏度为3.00×10-10 mol/L(S/N=3)。将该方法分别应用于多合维生素、小米中核黄素的测定,显示相对标准偏差小于7.86%,加标回收率为96%~105%。与其他测定核黄素的方法相比,本文提出的方法具有测量范围宽、灵敏度高、仪器设备简单、实验操作简便的优点。
  2.基于RF光致电化学分析法的研究结果,进一步发展了对FAD和FMN的定量检测同样适用的分析方法。文中通过缓冲溶液的pH值,电解时间,光照时间,偏压,EDTA的浓度及光强度的选择优化了测试条件,研究结果显示,光电流分别与5.00×10-10~1.00×10-5 mol/L FAD和1.00×10-10~1.00×10-5 mol/LFMN浓度的对数值成正比,并且呈现良好的线性关系。
[硕士论文] 于国强
化学工艺 浙江大学 2015(学位年度)
摘要:天然产物中的同系物因具有高度相似的结构和性质,其分离极具挑战。生育酚作为最有代表性的天然产物之一,含有α-、β-、γ-和δ-生育酚四种同系物,它们的生物活性为δ-<γ-<β-<α-生育酚,因此,从生育酚的同系混合物中分离α-生育酚具有重要的经济价值。
  鉴于现有生育酚同系混合物萃取分离溶剂体系的低分离效率和选择性,考虑到其同系物酸性的差异,我们首次提出以含有胺基的聚合物为萃取介质,用于生育酚同系混合物的萃取分离。为此,我们制备了三种不同分子量的甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的均聚物(PDMAEMA),与乙腈(ACN)组成萃取剂体系,与用纯ACN作为萃取剂相比,生育酚在PDMAEMA萃取剂体系中的分配系数和选择性系数都明显提高。PDMAEMA30-ACN(ω(PDMAEMA)=38.9%)为萃取剂时,δ-生育酚的分配系数是ACN作萃取剂时的4.4倍,δ-对α-生育酚的选择性系数是ACN作萃取剂时的1.6倍。
  我们进一步以支化聚乙烯亚胺(PEI)为萃取介质,分别考察了助溶剂的种类、PEI分子量和浓度对萃取的影响。当以PEI-ACN为萃取剂体系时,生育酚表现出良好的分配和选择性。PEI上胺基与ACN的摩尔比为0.485时,δ-生育酚的分配系数为7.05,相应δ-对α-生育酚的选择性系数为5.92。同时,研究发现PEI对CO2刺激有很好的响应能力,可用于萃取相中生育酚的快速回收:萃取相中通CO2,仅需正己烷3次反萃就可回收生育酚超过90%;而不使用CO2,理论上需要正己烷反萃12次,生育酚的回收率才能达到90%。经回收生育酚后的PEI萃取相通过加热和通N2,可释放出CO2重新作为萃取剂使用,经循环使用3次测试,生育酚的分配系数仅下降约10%,选择性系数几乎不变。
  由于PEI对生育酚具有良好的萃取选择性,我们进一步以二氧化硅负载的PEI为吸附剂,研究了采用吸附法从生育酚同系混合物中分离α-生育酚,同样获得了很高的生育酚吸附率和分离因子。吸附剂的质量与生育酚同系混合物溶液的体积之比为0.4g/mL时,δ-生育酚的吸附率为96.1%,δ-和α-生育酚的分离因子可达12.1。吸附生育酚后的二氧化硅负载的PEI可在ACN或者乙醇中高效脱附。
[硕士论文] 臧明丽
生物化学与分子生物学 华中科技大学 2015(学位年度)
摘要:类胡萝卜素是衡量小麦营养品质的重要指标。为提高小麦中的类胡萝卜素含量,本实验室将欧文氏菌类胡萝卜素脱氢酶基因(CrtI)和八氢番茄红素合成酶基因(CrtB)导入到了小麦模式品种Bobwhite中,并成功获得了这两个基因单转和共转的转基因小麦。通过对转基因后代的分析发现,导入这两个基因的单转和共转的转基因株系都导致了小麦胚乳中类胡萝卜素含量的增加。在不同的转基因株系中,CrtB和CrtI在转录水平上的表达情况已经进行了详细的检测分析。
  为了进一步检测这两个基因在转基因小麦中翻译水平上的变化情况与小麦类胡萝卜素含量之间的关系,本研究分别构建了CrtB和CrtI的原核表达载体pET32-CrtI和pET32-CrtB,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。通过IPTG诱导表达,分别得到了两个基因的融合蛋白 His-Trx-s-CrtI和 His-Trx-s-CrtB。将融合蛋白进行纯化、免疫家兔,成功获得了抗 CrtB和 CrtI蛋白的多克隆抗体。利用 western-blot技术分别对CrtB和CrtI在转基因小麦后代的表达情况进行了检测,结果表明,转基因阳性植株后代均不同程度地表达了外源基因蛋白CrtB和CrtI。本研究所获得的抗CrtB和CrtI的多克隆抗体可用于今后“黄金小麦”的分析研究。
[硕士论文] 万百惠
食品加工与安全 中国海洋大学 2014(学位年度)
摘要:近年来,DNA与壳聚糖作为两种生物材料得到广泛的研究与应用。1995年,科学家首次发现壳聚糖可与DNA通过静电作用相结合,并将壳聚糖用作基因载体。这种新型基因载体代替了原有的病毒载体,对生物体安全无毒,并具有良好的生物相容性。本论文研究了影响DNA凝聚的因素,并将DNA/壳聚糖凝聚复合体用于对脂溶性的类胡萝卜素(β-类胡萝卜素和虾青素)的包裹,同时采用多种方法对DNA/壳聚糖/类胡萝卜素纳米复合体系进行微观结构表征和稳定性研究,以期改善类胡萝卜素的水溶性和稳定性,拓宽类胡萝卜素功能制品在医药、食品等领域的应用范围。
  本研究主要内容可分为三部分,首先探索各试验因素对DNA凝聚的影响,包括溶液的pH值、温度、离子强度等对不同浓度和分子量的DNA的影响研究。研究发现,DNA在pH值为1.5的溶液中会出现凝聚现象,这与DNA的浓度和分子量、溶液的离子浓度及温度无关。此外,还发现DNA凝聚是一种可逆的变化。向凝聚产生的DNA凝聚物中加入中性缓冲溶液或水可以使其恢复溶解,DNA的平均回收率为74%。其次,本论文还研究了氨基葡萄糖、壳寡糖、壳聚糖等阳离子化合物对DNA凝聚的影响。研究表明,在pH1.5~7.0范围内,氨基葡萄糖对DNA的凝聚无明显影响,壳寡糖或壳聚糖溶液的加入均对DNA的凝聚有明显的促进作用,从而形成DNA/壳聚糖凝聚复合体,氨基磷酸比为1:1时,即使中性缓冲液中的DNA也可发生凝聚。最后,鉴于DNA与壳聚糖可在分子间非共价相互作用下自组装,本论文以鲑鱼精DNA、壳聚糖为壁材,对类胡萝卜素属的β-胡萝卜素和虾青素分别进行有效包载,形成的类胡萝卜素胶体粒径范围为100-500 nm,包封率最高可以达到70%,并可在低温下长期保存,且虾青素的含量损失较少。
  综上所述,本研究系统探究了pH值、反应温度、离子强度、DNA浓度、DNA分子量、阳离子物质对DNA在溶液中存在状态的影响,为将来DNA的基础研究提供理论依据和数据参考。成功地将脂溶性类胡萝卜素有效包载于DNA/壳聚糖凝聚复合体中,形成可以稳定分散于水溶液中的类胡萝卜素胶体,不仅为微/纳米功能食品提供了一种新型壁材,而且对于改善许多脂溶性物质的水溶性、稳定性,使其更好地应用于食品、医药领域,具有积极意义。
[硕士论文] 屈丽君
无机化学 山西大学 2014(学位年度)
摘要:铜和锌是人体生命活动所必需的微量元素,在生物体内发挥着非常重要的作用。但是人体内过量的铜会引起细胞活动失衡,从而成为一些疾病的发病源。近几年来,体内过量的铜还被怀疑有可能对婴儿的肝脏造成损害。同样,当人体内的锌离子浓度不足时,也会造成小孩生长发育缓慢,免疫能力下降,视力下降以及一些皮肤病。由此看来,为了维持生物体的正常运转,寻求更多快速有效的检测铜离子和锌离子的方法显得尤为重要。
  荧光素类衍生物是一类非常重要的荧光染料,是由于其具有良好的光物理学特性,比如荧光量子产率和消光系数都很高,光稳定性强,无毒,成本又低,因此常用于设计荧光探针。
  最近几年,我们也开发一些商业可用的化学探针,用来直接检测金属离子,这种方法方便、快捷,可以达到对离子的快速检测。
  本论文主要介绍三个化学传感器,第一个是基于吡哆醛的荧光素衍生物,这是本课题组发现的第二个双模式探针;第二个是吡哆醛肼,通过大量的光谱实验测定,我们发现,这两个衍生物的识别检测性能都具有很高的灵敏性,对离子的选择性非常好。同时我们还发现了一种商业可得的离子探针1,8-二氨基萘,可以直接用来灵敏、高效的检测铜离子。
  具体的工作如下:
  1.我们设计合成的基于吡哆醛的荧光素衍生物是一种新型的荧光探针,通过荧光素肼与吡哆醛在乙醇溶剂中反应制备而成。经过大量的光谱实验测定,我们发现通过紫外可见吸收光谱,这个探针可以很好的选择性识别并检测Cu2+,检测极限达到10-7μmol/L,肉眼可以观察到溶液的颜色由无色变为黄色;同时,在荧光光谱中可以很好的识别Zn2+,检测极限达到10-8μmol/L,这是一个可以同时检测两种金属离子Cu2+和Zn2+的基于吡哆醛的荧光素衍生物的双模式探针。
  2.我们设计合成了一种吡哆醛肼,体系本身是无色的,当加入铜离子以后,溶液的颜色由无色变成黄色,是由于探针与铜离子之间发生了配位反应,引起溶液颜色的变化。该探针不论是肉眼观察还是在紫外可见吸收光谱上都可以高效地选择性识别Cu2+。
  3.商业可得的1,8-二氨基萘在水溶液中具有很强的荧光,当加入铜离子以后,可以与铜离子发生配位反应,铜离子的顺磁效应可以有效的淬灭探针的荧光,从而达到对铜离子识别的目的。1,8-二氨基萘还可以通过生物成像来检测生物体内的铜离子。
[硕士论文] 曾科
无机化学 中南大学 2014(学位年度)
摘要:小分子荧光探针拥有灵敏度高、响应速度快、检测简便、可实时原位检测等优点,在细胞成像等生命研究领域得到了广泛的应用。本文以小分子荧光探针为切入点,基于分子内电荷转移(ICT)机制,构建了一种检测pH值的比值式荧光探针CyP。该探针以1-乙基-2,3,3-三甲基吲哚碘化物作为ICT荧光骨架,以对羟基苯甲醛作为目标物的识别基团。该探针在DMSO/水混合溶剂中对H+响应具有专一性,探针的荧光发射峰强度比值(I513 nm/I553 nm)在pH值5.4-7.2范围具有良好的线性关系,可有效的避开探针浓度、复杂环境因素等带来的干扰。另外发现探针在工作浓度下具有较低细胞毒性,同时探针能够在短时间内被细胞摄取。研究结果表明CyP是一类潜在的可用于检测分析细胞内pH值的荧光探针。
  脂质体作为药物运输载体,具有较好的生物相容性、被动靶向、可保护包覆的药物等优点,但同时存在稳定性差、无主动靶向性、包封药物易渗漏等不足。本课题组前期工作表明采用羧甲基葡聚糖(CMD)修饰脂质体(CMD-LIPs),可以使脂质体具有较好的稳定性,并具有pH敏感释放药物性质。本文延续上述工作,将对肿瘤细胞具有特异性靶向作用的叶酸偶联到CMD-LIPs表面制备主动靶向脂质体,以进一步改善脂质体的抗肿瘤性能。首先,以葡聚糖、叶酸等为原料,合成了叶酸修饰两亲性葡聚糖(FA-CMD),并以此为表面修饰材料,通过薄膜水化超声法制备了FA修饰脂质体(FA-CMD-LIPs)。该脂质体的表面电荷约为-18mV,粒径约200nm,4℃下可储存30天以上。通过硫酸铵梯度法制备了负载阿霉素(DOX)的FA-CMD-LIPs,包封率达到94%。体外药物缓释表明FA-CMD-LIPs对DOX的释放速率快于CMD-LIPs,且同样具有pH敏感性。细胞毒性实验表明,负载阿霉素的FA-CMD-LIPs对HeLa肿瘤细胞的生长抑制作用要高于负载阿霉素的CMD-LIPs。此外,荧光显微镜显示相比于载药CMD-LIPs,载药FA-CMD-LIPs体系中细胞摄取的DOX浓度较高,表明FA-CMD-LIPs抗肿瘤性能提高可能是由于叶酸修饰可以介导更多CMD-LIPs进入细胞内。
[硕士论文] 李方
公共卫生与预防医学 中南大学 2014(学位年度)
摘要:目的:了解长沙县“增补叶酸预防神经管缺陷项目”的开展情况,分析政策实施的影响因素,初步建立以村卫生室为基础的叶酸营养教育干预模式,并对干预效果予以评估,为促进农村育龄妇女增补叶酸的实施提供参考资料与依据。
  方法:
  采用多阶段分层群组随机抽样方法,于2013年7月在湖南省长沙县对10个乡镇60个村进行调查,调查对象包括计划怀孕育龄妇女(661人)、镇妇幼专干(10名)及村医与村计划生育专干(60名)。调查内容包括:(1)农村计划怀孕育龄妇女的一般人口学特征、叶酸知-信-行情况及对“增补叶酸预防神经缺陷项目”实施情况的认知;(2)镇妇幼专干、村医、村计划生育专干的一般情况、叶酸认知情况及“增补叶酸预防神经管缺陷项目”执行情况。将60个调查村随机分为对照组(30个村)和干预组(30个村),于2013年9月对干预组开展6个月的叶酸营养宣教干预,并于2014年3月对干预效果进行评估。
  结果:
  1.“增补叶酸预防神经管缺陷项目”实施现状
  村医、村计划生育专干叶酸认知平均得分为(5.7±1.5)分,叶酸执行自评得分为(8.1±0.8)分。
  2.农村育龄妇女增补叶酸预防神经管缺陷的知识、态度和行为
  农村育龄妇女的叶酸知识平均得分为(3.2±1.1)分,多元线性回归提示其与户口所在村村医叶酸知识得分X1(b=0.092)呈显著正相关,而与育龄妇女分类为外出务工X3(b=-0.642)呈显著负相关。农村育龄妇女叶酸增补态度评价得分为(9.3±1.3)分,多元线性回归提示其与户口所在村村医叶酸知识得分X1(b=0.130)和育龄妇女对叶酸的知晓X7(b=0.361)呈显著正相关,而与育龄妇女分类为外出务工X2(b=-2.138)呈显著负相关。农村育龄妇女叶酸知晓率为25.1%,服用率为72.1%,服用依从率为32.2%。
  长沙县农村育龄妇女叶酸知晓率和服用率均低于2011年总目标(分别为90%和90%),差异有统计学意义。
  3.叶酸营养宣教干预效果
  干预后,村医、村计划生育专干、镇妇幼专干对我国神经管缺陷情况、对神经管缺陷和叶酸预防神经管缺陷、“增补叶酸预防神经管缺陷”政策认知明显提高;育龄妇女叶酸知识得分随政策实施而提高,干预与时间存在交互作用,且随着时间的推移干预组叶酸知识得分的增高高于对照组的变化。多元线性回归显示育龄妇女叶酸相关知识得分与户口所在村村医叶酸知识得分X1(b=0.062)、受教育程度X6(b=0.171)、基线叶酸重要性得分X5(b=0.232)和干预对照分组为干预组X3(b=0.268)呈显著正相关。干预后,干预组近三个月叶酸服用依从率高于对照组。
  结论:
  1.长沙县农村村医、村计划生育专干对叶酸相关知识的掌握程度较低,与较高的自我报告叶酸政策执行力度脱节,叶酸项目培训可有效提高其叶酸相关知识的掌握程度。
  2.长沙县农村育龄妇女的叶酸知晓率、服用率未达到“增补叶酸预防神经管缺陷项目”规定的2011年总目标,叶酸服用依从率也较低。
  3.通过以村为基础的叶酸营养教育干预,可切实提高农村育龄妇女的叶酸知晓率、服用率和服用依从率。
[硕士论文] 金仁玲
免疫学 遵义医学院 2014(学位年度)
摘要:目的:研究胆碱酯酶催化活性浓度测量方法的影响因素,建立胆碱酯酶催化活性浓度测量参考方法。
  方法:⑴收集近20年国内外胆碱酯酶测量方法,按胆碱酯酶质量和酶催化活性浓度二类胆碱酯酶被测量将其测量方法分类,根据测量方法标准化、自动化的可行性、试剂来源与成本等条件筛选胆碱酯酶测量参考方法的被测量。⑵按胆碱酯酶测量原理将收集的测量方法分类,根据胆碱酯酶测量方法的优越性、测量方法的市场占有率、各测量方法的试剂来源及成本等因素选择适宜的胆碱酯酶测量原理,并以此原理筛选目前市售胆碱酯酶试剂盒,进行测量精密度与线性的评价,初步确定胆碱酯酶测量参考方法的测量原理。⑶根据酶学测量的基础理论、酶学测量参考方法的研究现状、胆碱酯酶催化活性浓度测量的原理和特点,确定影响胆碱酯酶催化活性浓度测量参考方法的测量因素及其最适测量条件。⑷应用经典的单因素分析法,选择影响胆碱酯酶催化活性浓度测量的试剂因素及其最适测量条件。⑸应用响应面分析法优化胆碱酯酶测量参考方法的关键影响因素的测量条件。⑹通过实验验证响应面分析法确定的各关键影响因素最佳测量条件的合理性。
  结果:⑴胆碱酯酶测量参考方法的被测量为胆碱酯酶催化活性浓度。⑵胆碱酯酶催化活性浓度测量参考方法的测量原理为:丁酰硫代胆碱/DTNB法。⑶胆碱酯酶催化活性浓度测量参考方法的测量因素及最适测量条件为:测量温度37℃、光径1cm、检测波长405nm、摩尔吸光系数13300LM-1cm-1、带宽2nm、样本体积比1:251(0.0040)、延迟时间60s、测量时间90s。⑷采用单因素分析法确定胆碱酯酶催化活性浓度测量参考方法的试剂因素及其测量条件为:丁酰硫代胆碱浓度1.48m mol/L、DTN B浓度0.3m mol/L、缓冲液pH值8.0。⑸应用响应面分析法优化胆碱酯酶催化活性浓度测量参考方法的关键影响因素的测量条件为:丁酰硫代胆碱浓度13.4 mmol/L、DTNB浓度0.29 mmol/L、缓冲液pH8.1。⑹以胆碱酯酶测量参考方法最适测量条件检测临床血清样本催化活性浓度值为8755U/L,为响应面模型理论最高酶催化活性浓度的95%以上。
  结论:应用单因素及响应面联合分析法可成功筛选出胆碱酯酶催化活性浓度的最适测量条件,建立胆碱酯酶催化活性浓度测量参考方法。
[硕士论文] 宋利芳
生物化学与分子生物学 上海师范大学 2014(学位年度)
摘要:目的:
  冬虫夏草(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)在临床上可用于多种肺部疾病的治疗。冬虫夏草菌(Ophiocordycepssinensis(Berk.))是冬虫夏草的无性型,近年发现冬虫夏草菌对部分肺疾有治疗作用,并能在一定程度上预防和阻滞肺纤维化的进程。前期研究发现,冬虫夏草菌的这些功效可能与抗炎活性有关。
  本课题以脂多糖(LPS)诱导大鼠NR8383肺泡巨噬细胞产生炎性反应为模型,对冬虫夏草菌菌丝体甲醇提取物(OSME)抑制炎性反应的机制进行了初步研究,用免疫印迹法(Westernblot)检测了iNOS(NO合成酶)和COX-2(PGE-2合成的关键限速酶)蛋白表达量;IκB的蛋白磷酸化变化以及NF-κB信号通路中关键信号分子NF-κB在细胞内的分布变化。
  结果:
  LPS(1μg/mL)诱导细胞内iNOS过度表达,相对表达量为细胞静息时的2.33±0.578倍(p<0.05);在加入LPS前分别用50、100、200μg/mLOSME预孵3h,则OSME可显著弱化LPS诱导的iNOS高表达,iNOS相对表达量比值分别降至0.91±0.088、0.56±0.067、0.54±0.018(p<0.05),与三个浓度对应的抑制率分别达到59.22%、74.87%、75.67%(p<0.05)。时效实验表明LPS诱导9h时OSME对iNOS过度表达的抑制作用最强。
  静息状态的NR8383细胞COX-2低表达,加入1μg/mLLPS诱导3h细胞COX-2蛋白高表达,达到静息组的10.17±1.682倍(p<0.05);提前用50、100、200μg/mL的OSME预孵细胞3h,则COX-2的过度表达受到抑制,相对表达量比值分别降至7.26±0.971、5.90±3.21、5.3±3.87,呈现量效关系(p<0.05),相应的抑制率为28.61%、41.98%、47.86%(p<0.05)。时效实验说明OSME对LPS诱导9h时COX-2过度表达的抑制最强。
  静息状态时NF-κB主要以无活性状态存在于胞浆中,1μg/mLLPS刺激细胞15min后NF-κB发生核转位,胞浆NF-KB含量为静息时的0.52±0.365倍,胞核NF-κB含量增加到静息时的1.64±0.278倍;50、100μg/mL的OSME预孵细胞3h,胞浆NF-κB含量回升至0.809±0.181、0.90±0.277,胞核NF-κB含量降至1.24±0.152、1.09±0.181(p<0.05),OSME可以抑制NF-κ.B核转位。
  对IκB的研究发现,LPS刺激15minp-IκB含量增加,为静息细胞的1.64±0.223倍(p<0.05),50、100、200μg/mL的OSME预孵细胞后,IκB磷酸化程度减弱,分别为静息时的0.21±0.023、0.79±0.022、0.58±0.058倍(p<0.05),OSME可以抑制LPS所致IKB磷酸化。
  结论:
  OSME(50-200μg/mL)可以通过抑制NF-κB通路进而抑制炎性蛋白iNOS和COX-2蛋白的过度表达,控制LPS所致细胞炎性反应。
分析化学 湖南大学 2013(学位年度)
摘要:比色方法由于操作简单易行,在生化分析检测中得到了广泛应用。金纳米颗粒具有独特的物理和光学性质,己广泛的应用于电化学、表面增强拉曼、荧光和比色分析中。该论文基于纳米金团聚的变色效应,发展了两种比色传感方法,成功的应用于生物素和链霉亲和素的检测。具体研究内容如下:
   1.简单的灵敏比色传感器对生物素检测。链霉亲和素功能化金纳米粒子用作探针(STV-AuNPs),在生物素存在时,由于链霉亲和素诱导金纳米粒子的聚集,STV-AuNPs颜色从红色变化到蓝色,从而实现生物素的比色检测。
   2.一种新型灵敏比色检测亲和素的方法。亲和素对HABA这种染料分子具有亲和力,利用巯基-DNA-HABA修饰在金纳米颗粒的表面,在亲和素存在下,加入一定量的氯化钠使金纳米颗粒团聚,从而实现对亲和素的比色测定。
[硕士论文] 栗振兴
生物工程 天津大学 2013(学位年度)
摘要:本文通过基因组重排得到了新的产核黄素枯草芽孢杆菌高产菌株,并且优化了培养基和流加发酵工艺,得到的主要结果如下:
  首先通过在Bacillussubtilis RH33工程菌中引入来源于谷氨酸棒杆菌的两个外源突变基因zwf243和gnd361,得到了核黄素产量提高的工程菌株Bacillussubtilis RH33-SGZ,并以此作为基因组重排实验的亲株一。通过发酵验证,相较于B.subtilis RH33,引入外源突变基因的工程菌B.subtilis RH33-SGZ产量提高了近29.7%。通过筛选得到产量恢复的工程菌株Bacillussubtilis X42,其核黄素产量恢复到7.08g/L,以此作为基因组重排实验的亲株二。
  然后通过基因组重排技术对两亲株进行融合得到融合子,并通过筛选得到核黄素产量提高的新的工程菌株Bacillussubtilis F311。经发酵验证,B.subtilis F311摇瓶发酵产量可以达到约8g/L,比亲株B.subtilis X42提高了约14.2%,比亲株B.subtilis RH33-SGZ提高了约66.7%。
  应用Plackett-Burman实验设计法对核黄素发酵培养基各个组分的重要性进行研究,确定了影响核黄素生成的3个重要成分分别为葡萄糖、尿素、CuCl2。其中CuCl2为负影响,底水平为0,实验中不再添加CuCl2。选择葡萄糖、尿素进行响应面分析,从而获得核黄素生产的优化培养基。该优化培养基在摇瓶培养中可获得核黄素8.58±0.32g/L,比对照培养基提高了6.98%。
  最后在5L发酵罐上进行放大培养,最终确定发酵罐培养基以及流加发酵工艺,流加发酵72h后产量可以达到12.8g/L。
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