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[硕士论文] 伍享
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:结核病(Tuberculosis)是一种古老的慢性消耗性人兽共患传染病,主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起。结核病不仅造成巨大的经济损失,还严重危害着人类的健康。结核分枝杆菌在宿主细胞寄生过程中会分泌一些蛋白,然而这些分泌蛋白的作用机制并不清楚,探讨这些分泌蛋白在结核分枝杆菌致病的过程中的作用机制,能够为新的结核疫苗研发提供理论基础。另外,我国结核病的状况十分严峻,传统的检测方法已经不能满足临床需求,此种状况同样存在于我国牛场。本实验针对结核病的诊断方法及疫苗研发的分子机制这两个方面展开研究:
  1.利用CRISPR/Cas9的系统构建稳定表达ESAT6,MPT64和串联亲和层析标签ZZtag-3×Flag的三个Raw264.7细胞系。成功扩增如下片段:Neomycin、ZZtag、TEV剪切酶识别位点,3×Flag,mCherry以及重组同源臂Arm1和Arm2,经过多次重叠PCR成功融合这7个片段后获得串联亲和层析用重组载体命名为pMD18T-TAP。本实验成功构建用于串联亲和层析的6个重组质粒pMD18T-TAP、pMD18T-TAP-ESAT6、pMD18T-TAP-CFP10、pMD18T-TAP-HspX、pMD18T-TAP-MPT64和pMD18T-TAP-Ag85B,利用CRISPR/Cas9系统分别构建稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白(ESAT6、MPT64)以及串联亲和层析标签组合ZZtag-3×Flag的Raw264.7细胞系,然后利用串联亲和层析联用质谱的方法成功筛选出与ESAT6互作的宿主蛋白为Serine/arginine repetitive matrix protein1,后续将验证ESAT6与Serine/arginine repetitive matrix protein1的互作。
  2.本实验初步建立能在实验室检测结核分枝杆菌H37Ra的三种方法:TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR。实验选取IS6110基因为靶基因,发现TB-LAMP、MDA-PCR能在几十个结核分枝杆菌H37Ra存在时扩增出阳性,且比直接菌液PCR扩增的灵敏度高一个数量级。本实验首次尝试改进传统HCR的方法将其用于结核分枝杆菌H37Ra的检测,得到阳性结果,且靶定三个基因(IS6110,CFP10,GryB)时,提高了HCR方法检测的检出率。本实验研究建立了TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR这三个方法,能够用于结核分枝杆菌H37Ra的基因IS6110的检测,并且首次将MDA-PCR和HCR的方法用于结核分枝杆菌H37Ra的检测。
[博士论文] 吕艳
内科(呼吸) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病。结核病历史悠久,在七干多年前的新石器时代的人类骨化石上就被发现有脊柱结核的踪影。结核分枝杆菌可以侵犯许多器官,最常见的是肺结核,它是危害人类健康的重要疾病之一。世界卫生组织(WHO)2016年全球报告统计,在2015年全世界大约有10,400,000例新发结核病患者,中国有918,000例,其中女性296,000例,男性622,000例,其病死率为4%。近些年来,随着流动人口的增加,在结核菌病治疗方面又遇到了两大较为突出的难题,那就是耐药结核病和结核病伴有HIV感染患者的治疗。2015年中国数据显示已知耐多药肺结核(MDR-TB)和耐利福平肺结核(RR-TB)患者约57000例,结核病伴有HIV阳性患者10034例,而接受正规治疗的有3750例,仅占37%。这两类患者不仅治疗费用昂贵,而且治疗效果差,且易引起传播,是目前结核病防治的重点。中国是全球结核病负担较重国家之一,在相当长时间内排名一直居于第二位,2015才降为第三位,一方面说明了中国政府对结核病的重视和投入,并收到了一定的效果,另一方面也说明了中国结核病疫情的严峻性。在2016年中国政府投入结核病的经济花费大约为3720万美元,折合人民币约为大约250080万,这对于中国来说是个庞大的经济负担。
  糖尿病和肺结核一样都是严重威胁人类健康的慢性疾病。随着人们生活饮食方式的变化,比如更多的年轻人作息不规律、熬夜、饮食不健康、久坐、活动减少,以及老龄化人口增多、肥胖症患者的增加,糖尿病的发病率逐年增高。2015年国际糖尿病联盟(IDF)在糖尿病全球报告里详细展示了目前全球糖尿病患病情况和经济负担。2015年全球糖尿病患者人数高达4.15亿,患病率为8.8%。其中75%的患者分布在中低收入国家。估计2040年全球糖尿病患者数将达6.42亿,患病率将上升至10.4%(大致范围8.5%-13.5%)。
  糖尿病患者感染肺结核的风险是普通人群的3倍。主要原因可能与糖尿病患者糖、蛋白、脂肪代谢紊乱,使得患者的营养状态变差,抵抗力下降,同时受损组织的修复能力越来越差,长期处于一种免疫力低下的状态。同时血液及组织内糖量增多,甘油产物的蓄积,是细菌的良好培养基,而肺部血容量丰富,亦有利于结核菌的生长繁殖。患有结核病的糖尿病患者的血糖往往偏高,难以良好控制。而在患糖尿病的肺结核患者中,经过抗结核治疗后,血糖会随着治疗的时间逐渐下降,部分在发现肺结核时确诊的糖尿病患者在抗结核治疗结束后血糖可降至正常。所以糖尿病和肺结核的发生互相影响,存在互为因果的关系,并互相影响治疗效果。
  近些年来,关于microRNA的研究越来越多。MicroRNA(miRNA)是一种机体内源性表达的单链小分子RNA,位于基因组非编码区,在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用,长度为18~25核苷酸。由60~110nt的可以形成发夹状的内源性转录前体加工而成。
  众多文献发现,miR-144在结核病患者中表达上调,并且能在患者的血清、痰液和胸腔积液中均能检测到。所以本文选择miR-144进行研究。miR-144在其他的许多领域已经有众多的研究,比如miR-144是红系分化的重要调控因子,参与了许多癌症的发病,包括结肠癌、胰腺癌、喉癌、恶性间皮瘤、骨肉瘤的发病。
  miR-144在结核感染过程中的机制已有众多发现,总结归纳后发现:miR-144主要在T细胞中表达,并参与管理T细胞免疫功能,它能抑制两种主要的免疫因子γ-干扰素和肿瘤坏死因子-α的产生,所以miR-144能阻止T细胞的增殖,导致结核杆菌病原体清除困难,在结核感染系统扮演了重要角色。
  在关于糖尿病的研究中发现miR-144不仅仅通过蛋白调控影响胰岛素基因的表达,又能作用于肝脏、脂肪、骨骼肌等胰岛素的靶受体。胰岛素受体底物蛋白1(IRS1)是它的靶基因,通过调控IRS1表达的控制因子,使其表达下调,从而影响胰岛素的功能,产生胰岛素抵抗。miR-144在糖尿病患者的外周血中明显升高,所以miR-144可以作为一个糖尿病生物学标记物。
  基于以上考虑,来做这项研究,进一步探讨miR-144在肺结核病和肺结核合并糖尿病的诊断和疗效评价中的应用价值。
  研究目的:
  1.观察肺结核病患者治疗前后痰液及血清miR-144水平变化,探讨miR-144在肺结核患者中的诊断价值。
  2.观察肺结核合并糖尿病患者与无糖尿病患者痰液及血清miR-144水平变化。
  3.观察miR-144与γ-干扰素的水平变化之间的关系,对miR-144参与结核感染过程机制进行探讨。
  研究方法:
  收集124例肺结核病患者入实验组,分为A、B、C三组。其中,A组为痰菌阳性伴有空洞患者,共53例;B组:为痰菌阴性伴有空洞患者,共20例;C组:为痰菌阴性无空洞患者,共51例。
  124例肺结核患者中有糖尿病患者53例,无糖尿病患者71例。两组的年龄和性别均无显著性差异(P值均>0.05)。
  治疗6个月后,124例患者中失访17例,剔除10例,其中5例出现肝功能损害;3例出现白细胞显著减少;2例出现药物性皮疹。
  研究结果:
  1.总体比较
  1.1 治疗前肺结核患者的痰液和血清miR-144均比对照组高(P均<0.001);
  1.2 治疗1个月后肺结核患者的痰液和血清miR-144均较治疗前显著下降(P均<0.05);治疗6个月后痰液和血清miR-144较治疗1个月时显著下降(P均<0.05)。
  1.3 治疗6个月后肺结核患者的痰液和血清miR-144仍然高于健康对照组(P均<0.001)。
  2.实验组A、B、C三组组间比较
  2.1 治疗前痰液和血清miR-144水平比较:A、B、C组均高于对照组;A组高于B组和C组,B组高于C组(P均<0.05)
  2.2 治疗1个月后痰液和血清miR-144下降水平比较:A组及B组均下降显著(P均<0.05),C组下降不明显(P>0.05)。
  2.3 治疗1个月后痰液的miR-144水平比较:A和B组均显著高于C组及对照组(P均<0.05)。然而C组治疗1个月后与对照组比较,痰液的miR-144无显著差别(P>0.05)。治疗1个月后血清的miR-144比较:A、B、C三组均高于对照组(P均<0.05)。
  2.4 治疗6个月后,在痰液组,A组和B组之间、C组与B组比较差异无明显差异(P均>0.05),A组比C组明显偏高(P<0.05);在血清组,A组和B组之间、C组与B组之间、A组与C组之间比较无明显差异(P均>0.05)
  3.病情好转组和病情无好转组比较
  3.1 病情好转的患者在治疗后痰液和血清miR-144的表达是显著下降的(P均<0.001)。
  3.2 病情无好转的患者治疗后痰液和血清miR-144的表达无显著变化(P>0.05,P-0.891)。
  3.3 治疗1个月后A、B、C三组病情好转患者以及A组病情无好转患者痰液和血清miR-144均显著下降(P均<0.001)。
  3.4 C组病情无好转的患者,痰液和血清miR-144是上调的(P均<0.05),而B组病情无好转的患者,痰液和血清miR-144无明显变化(P均>0.05)。
  4.特异度和敏感度测定
  4.1 痰液miR-144ROC分析显示AUC是0.954(95%CI(0.925,0.983),P<0.001)。当cut-off值为1.185,敏感度为86.29%,特异度为99.15%,均为最高点。
  4.2 血清miR-144ROC分析显示AUC是0.997(95%CI(0.993,1.000),p<0.001)。当cut-off值为0.848,敏感度为99.19%,特异度为94.87%,均为最高点。
  5.无论是治疗前还是治疗1个月后,肺结核合并糖尿病组患者的痰液和血清miR-144水平均比无糖尿病肺结核组显著升高(P均<0.01)。
  研究结论:
  1.本实验的ROC曲线结果证明无论是痰液和血清miR-144在肺结核病的诊断方面都有很高的灵敏度以及特异度。这表明miR-144可以作为肺结核病的辅助诊断指标。
  2.实验组患者较健康对照组痰液及血清miR-144水平是显著上调的;但是在抗结核治疗1个月以及6个月后会显著下降。表示miR-144随着结核病治疗的好转是逐渐下降的。
  3.抗结核治疗前痰液和血清miR-144检测结果提示,A组显著高于B组、C组,B组显著高于C组,表明miR-144在痰涂片阳性并伴有空洞的严重肺结核患者中显著偏高,能判断结核病的严重程度。
  4.在治疗1个月后:病情好转组患者,治疗前后痰液和血清的miR-144下降明显;病情无好转组患者,治疗前后痰液和血清的miR-144无明显差别,可以再次证明在抗结核治疗有效后miR-144是有显著下降的。
  5.肺结核合并糖尿病组无论在治疗前还是在治疗1个月后,痰液和血清中的miR-144均比无糖尿病肺结核组高。
  6.miR-144对γ-干扰素进行负性调控。
[博士论文] 景辉
临床检验诊断学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  2011年,WHO推荐使用GeneXpert MTB/RIF试验作为快速诊断活动期肺结核及利福平耐药的方法,GeneXpert MTB/RIF试验在涂阳肺结核的敏感度高于95%,涂阴肺结核的敏感度高于55%[1]。本研究的目的是评价GeneXpertMTB/RIF试验在肺结核及肺外结核患者直接诊断结核分枝杆菌和利福平的耐药性的应用价值。
  研究方法:
  第一部分:本研究是在山东省胸科医院开展的,是山东省唯一的一个省级防治结核病和其它肺部疾病的医院。山东省是中国第二大省份,拥有9千6百万的人口,其中59%的农村人口。山东省每年新发病例约4万。本研究收集2013年7月到2014年6月在山东省胸科医院住院治疗的共506名疑似结核病患者的标本,包括疑似肺结核患者229名(痰标本229例),疑似肺外结核患者277名(101例脑脊液标本,124例胸腔积液标本,22例组织标本,21例尿液标本和9例腹腔积液标本),每例疑似结核病患者取3份标本,一份采用荧光染色显微镜镜检;一份采用BACTECTMMGITTM960 Mycobacterial Detection System(BD,NJ,USA)进行结核菌快速培养;一份用于GeneXpert MTB/RIF检测。GeneXpert MTB/RIF检测结果与金标准结核分枝杆菌培养结果及临床诊断分别比较,评价GeneXpert MTB/RIF对痰液样本及包括脑脊液、胸腔积液等肺外样本中检出结核分枝杆菌的敏感度和特异性。并以临床诊断为标准分别评估涂片荧光染色显微镜检测、BACTECTM MGITTM960 MycobacterialDetection System结核菌快速培养、GeneXpert MTB/RIF检测及三种方法联合使用诊断结核病患者的敏感度。临床诊断结核病主要通过临床症状,胸部影像学表现,阳性的实验室检查(涂片显微镜检查,结核分枝杆菌培养和GeneXpert MTB/RIF试验等)和经过抗结核试验性治疗好转作为依据[3]。
  第二部分:BACTECTM MGITTM960 Mycobacterial Detection System培养阳性的标本经涂片染色镜检确定为抗酸杆菌,使用结核分枝杆菌抗原MPT64试剂盒鉴定是否为结核分枝杆菌。经鉴定为结核分枝杆菌的样本,采用BACTECTM MGITTM960Mycobacterial Detection System药敏试剂盒进行药物敏感试验,主要包括2种一线抗结核药物:异烟肼、利福平。使用标准菌株H37Rv作为质控菌株进行室内质量控制。MGIT960液体药敏结果与第一部分GeneXpert MTB/RIF检测结果中利福平的药敏检测结果进行比对,评估GeneXpert MTB/RIF检测利福平耐药的敏感度和特异性,及预测MDR-TB的敏感度和特异性;对于GeneXpert MTB/RIF检测与结核分枝杆菌药敏试验(DST)检测结果有差异的样本提取DNA,应用焦磷酸测序的方法确认差异的菌株的基因型,评估GeneXpert MTB/RIF检测ropB基因突变的准确性。所有的检测都在山东省胸科医院汉光微生物实验室(通过IS015189医学实验室认可的结核病检测实验室)内进行。
  研究结果:
  第一部分:229名疑似肺结核患者中,GeneXpert MTB/RIF检测结果为130例(56.8%)结核分枝杆菌阳性,98例(42.8%)结核分枝杆菌阴性,还有1例不明确;结核分枝杆菌培养结果为125例(54.6%)结核分枝杆菌阳性,88例(38.4%)结核分枝杆菌培养阴性,10例(4.4%)为非结核性分枝杆菌,6例(2.6%)为标本污染;荧光染色涂片镜检结果为128例(55.9%)阳性,101例(44.1%)阴性。GeneXpert MTB/RIF试验和结核分枝杆菌培养的阳性一致率为94.3%(k=0.885;95% CI,0.824-0.946);GeneXpert MTB/RIF试验和荧光染色涂片镜检阳性的一致率为75.1%(k=0.751;95% CI,0.665-0.838)。
  在277名疑似肺外结核患者当中, GeneXpert MTB/RIF检测结果为40例(14.4%)结核分枝杆菌阳性,237例(85.6%)结核分枝杆菌阴性;结核分枝杆菌培养结果50例(18.1%)结核分枝杆菌阳性,227例(81.9%)结核分枝杆菌培养阴性,未检出非结核分枝杆菌;荧光染色涂片镜检结果只有11例(4.0%)阳性,266例(96%)阴性。GeneXpert MTB/RIF试验和结核分枝杆菌培养两种方法在尿液标本中有较高的一致率(n=2;100%; k=1.0),在组织标本中阳性一致率比较低(n=11;54.6%,k=0.091)。共有210名疑似肺外结核患者被临床诊断为活动性结核病例,以临床诊断为标准,GeneXpert MTB/RIF试验、结核分枝杆菌快速培养、荧光染色涂片显微镜检查及三者相结合的方法的敏感度分别是19.0%(40/210)、23.8%(50/210)、5.2%(11/210)和34.3%(72/210)。不同种类的标本GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度相差比较大(12.3%-61.1%),但是GeneXpert MTB/RIF试验对于肺结核和肺外结核的诊断特异性均为100%.
  第二部分:121例肺结核和肺外结核分离菌株进行了DST检测。GeneXpertMTB/RIF检测出21例利福平耐药,DST检测22例利福平耐药,其中17例也存在异烟肼耐药,即多重耐药(MDR), GeneXpert MTB/RIF试验和DST检测利福平耐药的一致率是92.6%(k=0.746和95% CI,0.588-0.903)。以DST作为标准,GeneXpert MTB/RIF试验检测利福平耐药的敏感度为77.2%和特异性为96.0%,在预测MDR-TB方面敏感度为76.5%(13/17),特异性为96.2%(100/104)(Table3)。GeneXpert MTB/RIF试验和结核菌药敏检测利福平耐药不一致的有9例,GeneXpert MTB/RIF试验检测利福平耐药而DST检测敏感有4例, GeneXpertMTB/RIF试验检测利福平敏感而DST检测耐药有5例,焦磷酸测序结果GeneXpertMTB/RIF试验检测利福平耐药的4例样本存在基因突变, GeneXpert MTB/RIF试验检测利福平敏感的5例样本均未检测到突变,GeneXpert MTB/RIF试验检测结果与焦磷酸测序结果一致。
  研究结论:
  GeneXpert MTB/RIF试验对肺结核病的诊断有具有较好的敏感度和特异性,以临床诊断为标准诊断肺结核病的敏感度为67.7%,特异性为100%,以结核菌培养为标准诊断肺结核病的敏感度为96.8%,特异性93.8%,阳性预测值与阴性预测值都达到了95%以上。对于肺结核病患者来说GeneXpert MTB/RIF试验检测时间短,操作简单,与结核菌培养的一致性高于涂片镜检,而且可以排除非结核分枝杆菌(NTM)感染,对于肺结核病的诊断具有很好的应用价值。
  对于肺外结核的病例研究发现,结核分枝杆菌培养的敏感度要高于GeneXpertMTB/RIF试验(23.8% vs.19%.0),远高于涂片镜检(5.2%),三种方法联合使用敏感度可达到34.3%,表明GeneXpert MTB/RIF试验单独用于诊断肺外结核病会导致检出率偏低,容易漏诊部分病人,同时进行结核菌快速培养和涂片荧光染色镜检检测,三种方法联合使用才能有效诊断肺外结核,不至于导致误诊或漏诊。不同的肺外样本GeneXpert MTB/RIF试验敏感度相差较大,对于组织样本GeneXpertMTB/RIF试验敏感度远高于其他两种方法,与其他两种方法相比GeneXpertMTB/RIF试验更适合于组织样本检测。
  BACTECTM MGITTM960 Mycobacterial Detection System药敏实验和GeneXpertMTB/RIF检测利福平药敏的样本共121例,其中MDR17例,占总数的14.05%,高于第五次全国流行病学调查报告报道的全国平均水平6.8%[4]。其中GeneXpertMTB/RIF检测利福平耐药的为21例,其中13例为MDR,检测为敏感的100例,其中包括4例MGITTM960药敏检测为MDR的菌株。以MGITTM960药敏作为金标准GeneXpert MTB/RIF检测利福平的敏感度为77.27%,特异性为95.96%,GeneXpert MTB/RIF试验检出76.5%(13/17) MDR-TB,低于部分国家学者报道GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度。有研究报道在结核病流行的国家混合型的结核分枝杆菌感染占结核病例的50%,病人可能同时感染敏感细菌和耐药细菌,在这些病例中GeneXpert MTB/RIF试验的敏感度可能降至80%左右,这与我们的研究结果一致[9]。因此,在结核病高流行的中国GeneXpert MTB/RIF还不足以用来提示MDR-TB,需要同时进行药敏试验。
[硕士论文] 王作飞
内科学(呼吸系病) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过对济南市疾病预防控制中心结核病防治所提供的2005-2015年确诊新登记的结核病患者病例进行流行病学描述分析,从而掌握济南市流动人口结核病的发病特点和流行趋势,以期为制定济南市结核病的预防和控制策略和措施提供科学依据。
  方法:
  根据济南市疾控中心新登记的结核病患者的病案资料,录入Excel2010软件进行编辑整理,然后通过SPSS19.0对数据进行单因素和多因素统计分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。
  结果:
  1.2005-2015年济南市流动人口结核病的发病率呈现波动变化,2005-2007年呈缓慢上升趋势,2007-2008年急剧升高,2008-2013年逐渐下降,2013-2015年再次迅速升高。
  2.2005-2015年济南市流动人口中结核病发病特征结果显示,患者以浸润型肺结核类型为主,痰涂片结果以涂阴为主,其中男性多于女性,以年龄在18-30岁之间的青壮年居多,流动人口结核病患者以市内流动最多,职业分布中以农民患者最多,2005-2015年每年发病人数中民工和从事商业服务人员的比例基本上呈下降趋势,而离退人员和家政家务及待业的比例呈上升趋势。
  3.济南市流动人口结核病患者主要来源是出现症状就诊,其次是转诊,转诊率为31.3%,有40.6%的患者是延迟就诊的,大多在症状出现后的4-8周内就诊。
  4.济南市流动人口的结核病发病率高于本地人口,且18-30岁的青壮年中发病率高于本地人口,性别方面没有显著差异,流动人口和本地人口均以农民的发病率最高,但流动人口中学生的发病率高于本地人。
  5.2005-2015年济南市流动人口中结核病患者的治愈率很高,总治愈率为98.5%,其中结核性胸膜炎的成功率最高,治疗失败者中以民工和学生为主,分别占32.3%和25.8%。
  6.对肺结核治疗效果影响因素的单因素分析结果表明,职业、延迟就诊和痰涂片分类(涂阳)是影响肺结核治疗效果的主要因素。
  7.对肺结核治疗效果影响因素的多因素logistic分析结果表明,延迟就诊和痰涂片分类(涂阳)是影响肺结核治疗效果的主要因素。
  结论:
  1.2005-2015年济南市流动人口结核病的发病率高于本地人口,没有明显趋势,但总体来说呈现波动变化。
  2.2005-2015年济南市流动人口中结核病的发病以18-30岁的青壮年男性为主要发病人群,市内流动居多,农民的发病率最高,学生的发病率高于本地人,将近一半的患者是延迟就诊。
  3.2005-2015年济南市流动人口中结核病患者的治愈率很高,总治愈率为98.5%,治疗失败者中以民工和学生为主,结核性胸膜炎的成功率最高。
  4.延迟就诊和痰涂片分类(涂阳)是影响结核病治疗效果的主要因素。
[博士论文] 饶华祥
流行病与卫生统计学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  针对疾病发病水平的监测数据存在时间、空间自相关性和空间异质性的特点,采用时空统计分析方法和空间计量经济模型,对青海省肺结核病监测数据和地区主要社会经济指标及气象因子数据,在生态学层面开展肺结核病系统研究,准确探测发病高危区域和定量分析影响发病率的相关社会环境因素,并借助气象因子的变化,对发病率进行合理预测。通过本研究探讨空间地理信息系统、时空聚集性分析方法和空间计量经济模型在具有时空属性的传染病监测数据挖掘中的应用价值,为类似研究提供分析思路和方法学参考,也为政府决策提供科学依据。
  方法:
  通过中国疾病预防控制信息系统收集青海省肺结核病发病资料,《青海省统计年鉴》收集青海省人口学资料和相关社会因素及气象因素资料,开展如下研究:
  1、采用流行病学“三间”分布描述、集中度法、圆形分布法、季节指数法和三维趋势分析等方法对2009-2013年青海省肺结核病流行病学特征进行分析。
  2、针对传染病监测数据时空不独立性,采用Moran’s I和Getis-Ord G空间自相关分析以及SaTScan时空扫描分析对2009-2013年青海省县级水平肺结核病空间、时间以及时空聚集特征进行分析,对发病高危聚集区域及范围进行准确探测,并评价其风险强度。
  3、针对横截面数据空间分布非独立,采用Moran’s I空间自相关分析和空间截面回归模型,对2011年和2013年青海省各县级行政区域肺结核病年发病率与政府医疗卫生支出(千元/人)、教育支出(千元/人)、医疗机构床位数(张/千人)、医疗机构人员配备情况(人/千人)、农村居民人均纯收入(千元)以及人均 GDP(万元)等6项社会指标关系进行双变量空间自相关分析和回归分析,研究社会因素的空间聚集特征,以及在扣除邻近地区发病率的影响后,定量探讨影响肺结核病年发病率的社会因素。
  4、由于肺结核病发病具有一定的季节特征,气象因素和前期发病率可能对本地区发病率的影响存在时间滞后性,以及邻近地区间发病率的相互影响,以2009-2013年青海省各市(州)肺结核病月发病率数据为应变量,同期到6个月滞后间隔的月平均气温(℃)、降水量(mm)、日照总时数(hours)、平均风速(m/s)和发病率为自变量,进行不同滞后间隔的面板数据模型回归分析,探讨气象因素对发病率影响的最佳滞后期;利用F检验、Hausman检验、误差项Moran’s I检验以及拉格朗日乘数(LM)检验确定最优分析模型,定量分析影响肺结核病月发病率的气象因素。
  5、利用上述气象因素与发病率的最佳滞后期空间面板数据模型进行发病率预测时,由于自变量中包含着邻近地区同期发病率,故尝试采用专家建模器对预测时段各地区发病率进行预估,再利用空间面板数据模型对各地区发病率进行预测,评价预测精度,比较专家建模器联合空间面板数据模型的预测效果;探讨联合模型进行发病率短期预测的可行性和可靠性。
  结果:
  1、青海省肺结核病年均报告发病率为98.26/10万,明显高于全国平均水平,且近年有略微上升趋势;中老年人群发病率最高,其次为青壮年;男性高于女性,新发病例以农牧民为主;具有明显的周期性和微弱的季节性,发病高峰主要集中在3-5月;南北方向呈北低南高的弧形变化趋势,东西方向呈明显的倒“U”型。
  2、全局空间自相关Moran’sI和GeneralG值均大于期望值,取值范围分别为0.398-0.581和0.029-0.034,表明肺结核病年发病率地区分布存在明显的高发地区聚集倾向;SaTScan时空扫描分析结果显示青海省肺结核病在时间、空间以及时空上存在明显的高发病风险聚集性,时空一类聚集区域位于青海省西南部,中心位置在囊谦县(东经96.12°,北纬32.17°),覆盖囊谦县、玉树市和杂多县等8个县(市),聚集半径为421.00Km,发病高峰期为2012年1月到2013年6月,相对危险度(RR)为4.58;叠加分析显示,以RR>2作为判断标准比较合理,高危聚集区域主要集中在青海省西南部的玉树和果洛州所辖12个县(市)。
  3、双变量Moran’sI空间自相关分析显示2011年医疗机构床位数、医疗机构人员配备情况、农村居民人均纯收入和人均GDP共4项社会指标与肺结核病年发病率间均具有统计学意义(P<0.05),提示以上社会因素可能影响地区发病水平;以发病率对数值建立的普通最小二乘回归显示回归残差不独立(Moran’sI=0.16,P<0.05),而依据LM检验,空间滞后模型为最佳模型,该模型显示:空间自相关系数?=0.4041,说明相邻区域的发病率存在空间外溢现象(空间自相关性),即当其它影响因素固定不变时,相邻地区肺结核病年发病率每增加9倍,本地区年发病率将增加1.54倍;在扣除了发病率的空间自相关性后,农村居民人均纯收入是影响肺结核病年发病率的主要社会因素,b=-0.0657,即农村居民人均纯收入每增加1千元,本地区肺结核病年发病率将降低14%;空间截面回归模型与普通最小二乘回归模型相比,回归系数绝对值有所下降(-0.0657 vs-0.0883),说明充分考虑了发病率的空间自相关性后,估计结果更为合理,而传统回归模型没有考虑空间自相关性,夸大了社会因素的作用。2013年分析结果与2011年结果一致。
  4、面板数据模型分析结果显示气象因素对发病率的影响存在3个月的滞后期;发病率对数转换构建的固定效应模型(F=193.90,H=10.41,P<0.05)显示回归残差不独立(Moran’s I=0.20,P<0.05),而依据LM检验,空间滞后固定效应面板数据模型为最佳模型,该模型显示:不同地区截距项不同,体现了发病率的空间异质性;空间自相关系数?=0.3017,说明相邻区域的月发病率存在空间外溢现象,即相邻地区肺结核病月发病率每增加9倍,本地区月发病率将增加1倍;相比气象因素而言,当前发病率对滞后3个月的发病率影响更明显;在扣除了发病率的空间自相关性、空间异质性以及前期发病率的影响后,平均气温和降水量是影响滞后3个月发病率的主要气象因素;当前发病率每增加9倍,滞后3个月的发病率将增加36%,平均气温每升高10℃,滞后3个月的发病率将降低9%,降水量每增加2cm,滞后3个月的发病率将降低3%;与空间截面回归模型类似,空间面板数据模型与传统回归模型相比,估计结果也更为合理。
  5、2013年10-12月各地区发病率时间序列专家建模器预测相对误差为0.90%-136.14%,平均相对误差为28.99%;专家建模器联合空间面板数据模型预测相对误差为0.17%-94.20%,平均相对误差为21.09%;2014年1-3月平均相对误差分别为26.60%和19.79%;专家建模器联合空间面板数据模型的预测精度明显提高。
  结论:
  本研究首次采用时空统计分析方法和空间计量经济模型,从生态学角度对青海省肺结核病监测数据进行了详细探讨,得出如下结论:
  1、针对传染病监测数据时空非独立性特点,空间自相关分析和时空扫描分析是疾病时空聚集特征和高危区域探测的理想分析方法,准确探测出了青海省肺结核病高危聚集区域主要集中在该省西南部,最大危险区以玉树市为中心,r=259Km,覆盖玉树、囊谦、称多、杂多、玛多和曲麻莱等6县(市),RR=3.77。
  2、考虑到发病率的时空属性,空间截面回归模型和空间面板数据模型是生态学影响因素研究的理想分析模型,在公共卫生领域具有广泛应用价值。扣除发病率的时空影响后,农村居民人均纯收入、气温以及降水量是影响地区肺结核病发病率的主要社会环境因素。
  3、相比单纯时间序列专家建模器预测,专家建模器联合空间面板数据模型的预测策略,在考虑了邻近地区间发病率的相互影响以及气象因子的作用后,预测精度明显提高,可应用到实际工作中发挥预警作用。
  通过本研究既为青海省肺结核病防控措施的合理制定提供了理论依据,也为具有时空属性特征数据的研究提供了分析思路和方法学参考。
公共卫生 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  尽管结核病曾在以往肆虐过,但其现在对世界的公共卫生仍然构成重大威胁。世界上三分之一的人口被感染,许多人生病。其中,大部分人每年死于疾病,中华人民共和国及撒哈拉以南非洲国家均被列为负担沉重的国家之一。该国的结核患病率估计为12%,平均每年流行病例为140万例,平均死亡人数为13,000例。然而,2010年进行的最新全国调查显示,结核病在全国分布不均匀。江苏省会南京前几年的流行呈上升趋势。因此,该研究旨在分析2012-2016年江苏南京的结核病流行特征。
  方法:
  从CDC系统收集南京市2012年1月至2016年12月结核病检测数据进行回顾性描述分析。根据不同性别,年龄,职业和地区进行描述性分析和估计结核病的发病率及死亡率,并评估5年以上发病率及死亡率趋势。采用SPSS19.0软件统计分析,Pearson卡方检验分析分布的差异。
  结果:
  研究期间共有13845例结合病例,其中74人死亡。从2012-2016年起,结核病患病率从33.32/10万人次下降到31.4/10万人次。死亡率由0.20/10万人下降到0.18/10万人,患病比例也从0.6%略有下降到0.58%。男性和女性的结核感染及死亡率的年龄分布具有统计学差异(P<0.001)。25-44岁和45-64岁年龄组别的个体在女性和男性中分别为患结核病的高风险人群。12,992例(99.6%)年龄在15岁以上,其中男性结核病总数超过女性(68.8%>31.2%),大部分死亡病例为男性。结核病患病率及死亡率随年龄增长而增加,而65岁及以上的个体发病率呈下降趋势。在全体人口中,农民所占比例最大(36.5%)。职业对结核的患病和死亡率由显著影响(P<0.001)。此外,病情趋势显示,医务人员,退修人员和家庭佣工失业人数上升。江宁区共1073人(16%)所占比例最大,高淳的农村受影响大,占死亡人数的26.7%。地区分布显示,41%的病例发生在玄武,鼓楼,建业,秦淮和雨花台等区,大部分死亡人数均在农村和城市地区报告(42.2%)。结核病的感染率和死亡率在地区分布的差异有统计学意义。
  结论:
  结核病的感染和死亡率略微有下降。结核病预防和控制应该更加重视感染或者未感染的高危人群,其中包括:青少年直到老年人,男性,农民,家庭和退修人员及居住于大城市的人群,从而有效降低结核病的发病率。
[硕士论文] 徐雪维
免疫学 安徽理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:早期分泌型抗原靶6能够通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制自噬的作用,从而促进卡介苗的生长增殖,研究ESAT6对溶酶体与自噬小体的融合之间的相互作用关系,为EAST6介导的免疫逃逸机制提供实验依据。
  方法:
  1.对转染不同时间pCMV-HA-ESAT6质粒的RAW264.7细胞,进行细胞裂解,BCA法测蛋白浓度,蛋白免疫印记(Western Blot)法检测细胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的量。然后对转染pCMV-HA-ESAT6重组质粒、氯喹(CQ)、pCMV-HA对照质粒和CQ与pCMV-HA-ESAT6转染联合处理条件下的RFP-GFP-LC3-RAW264.7小鼠巨噬细胞,荧光显微镜下记录结果,并用计算机软件计数;进行细胞裂解,用BCA法测蛋白浓度,蛋白免疫印记(Western Blot)法检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的量。
  2.对EBSS(Earle平衡盐溶液)以及转染pCMV-HA-ESAT6重组质粒、pCMV-HA对照质粒处理的RAW264.7细胞进行细胞裂解,然后接种于罗琴培养基上,观察BCG的生长情况。然后对转染pCMV-HA-ESAT6重组质粒、氯喹(CQ)、pCMV-HA对照质粒和CQ与pCMV-HA-ESAT6转染联合处理条件下的RAW264.7小鼠巨噬细胞,进行细胞裂解,接种于罗琴培养基上,观察BCG的生长情况。
  3.对转染pCMV-HA-ESAT6的小鼠巨噬细胞(RAW264.7),进行细胞裂解,测蛋白浓度,用Western Blot的方法检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p-mTOR、p-70S6K、p62的蛋白水平。然后用mTOR的抑制剂Torin1和ESAT6共同处理RAW264.7,用LysoTracker Red染色溶酶体,并用计算机软件计数溶酶体的数量;用蛋白免疫印记法检测p-70S6K、p62、p-mTOR的量;对细胞进行裂解后进行BCG的培养。
  结果:
  1.转染ESAT6质粒的RAW264.7细胞随着时间的延长,LC3Ⅱ的水平逐渐增加,对用ESAT6和CQ处理的三组RAW264.7小鼠巨噬细胞,其LC3Ⅱ的量相差不多,组间无统计学意义,但都高于对照组,荧光显微镜结果显示,ESAT6和CQ处理组自噬体数目差不多,但都高于对照组;
  2.经EBSS处理的BCG的生长较对照组减少,经ESAT6处理的BCG的生长较对照组增加;经CQ以及ESAT6处理的BCG生长都较对照组增加,且三组生长水平差不多。
  3.经转染ESAT6的RAW264.7细胞,免疫印记结果显示,LC3Ⅱ、p-mTOR、p-70S6K、p62的水平都较对照组增加;经ESAT6和Torin1处理的RAW264.7细胞Western Blot结果显示p62和p-mTOR的量比ESAT6单独处理时减少,LysoTracker Red染料法结果显示在Torin1单独存在或与ESAT6共同存在时,恢复了ESAT6单独处理时所致的染色减少;BCG结果显示在Torin1单独存在或与ESAT6共同存在时,BCG的生长情况都较ESAT6单独处理时减少。
  结论:本研究说明了MTB分泌型毒力因子ESAT6(早期分泌抗原靶6)可以通过诱导mTOR的激活,抑制溶酶体与自噬小体的融合,从而抑制自噬流量,并能够促进巨噬细胞内BCG的增值。
[硕士论文] 李改梅
中西医结合儿科学 南京中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:评价牛贝消核验方治疗结核病的临床疗效;了解结核分枝杆菌标准株H37Rv在Middle brook7H9液体培养基中的生长规律和牛贝消核提取物对结核分枝杆菌标准株H37Rv增殖的影响;研究牛贝消核提取物对结核分枝杆菌标准株H37Rv蛋白质组的影响,确定牛贝消核作用的关键蛋白,阐明牛贝消核提取物抗结核的作用机制,为发现新的抗结核药物靶标和新药研发提供实验基础。
  方法:
  1.牛贝消核验方治疗结核病的临床疗效评价。对1998年~2012年就诊于四川省内江仁爱医院传染科和内江陈氏诊所的90例结核病患者的临床资料进行回顾性研究。
  2.牛贝消核提取物对结核分枝杆菌标准株H37Rv增殖的影响。在接种有结核分枝杆菌标准株H37Rv的Middle brook7H9液体培养基中加入蒸馏水为阴性对照组,加入异烟肼为阳性对照组,加入牛贝消核提取物为实验组,每隔7天取100μL培养物,10倍梯度稀释,涂板,培养3-4周菌落计数(CFU),绘制细菌生长曲线。
  3.牛贝消核提取物对结核分枝杆菌标准株H37Rv蛋白质组的影响。在培养至对数期的结核菌Middle brook7H9液体培养物中,加入蒸馏水为阴性对照组,加入异烟肼为阳性对照组,加入牛贝消核提取物为实验组,分别于加入药物前以及加入药物后6h和7d取出培养物,应用双向电泳和质谱技术比较分析牛贝消核提取物作用前后结核分枝杆菌标准株H37Rv蛋白表达谱的差异。
  结果:
  1.牛贝消核验方治疗结核病的临床疗效评价:治疗1~2个疗程后,汤剂组83例患者中治愈46例(55.42%),显效29例(34.94%),有效6例(7.23%),无效2例(2.41%),总有效率97.59%;散剂组7例患者中,治愈5例(71.43%),显效2例(28.57%),总有效率100%。
  2.牛贝消核提取物对结核分枝杆菌标准株H37Rv增殖的影响:培养28天后阴性对照组菌落数增多[(CFUs/ml) Log10=5.93±0.11],INH组菌落数为0,牛贝消核提取物组菌落数减少[(CFUs/ml) Log10=4.31±1.09],各组间有显著性差异(P=0.0118,0.01<P<0.05)。
  3.牛贝消核提取物对结核分枝杆菌标准株H37Rv蛋白质组的影响:与阴性对照组相比,牛贝消核提取物组有142个差异蛋白斑点,INH组有147个差异蛋白斑点,合计149个;选取其中的71个斑点进行质谱鉴定,得到41个高可信度蛋白,其中INH组有35个(7个上调,28个下调),牛贝消核提取物组有39个(5个上调,34个下调),两组共同差异蛋白为33个。分析其生物学功能,可知:参与免疫反应的有免疫蛋白MPT64(immunogenic protein MPT64)、角质酶培养滤液蛋白21(CFP21)、富于丙氨酸和脯氨酸的分泌蛋白Apa(alanine and proline-rich secreted protein Apa);参与蛋白合成的有50S核糖体蛋白L7/L12(50S ribosomal protein L7/L12)、30S核糖体蛋白S1(30S ribosomal proteinS1)、触发因子(trigger factor)、分子伴侣GroEL(molecular chaperone GroEL)、热休克蛋白X(heat shock protein hspX);参与能量代谢的蛋白有:磷酸甘油酸变位酶(phosphoglyceromutase)、磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase)、磷酸丙酮酸水合酶(phosphopyruvate hydratase)、转醇醛酶(transaldolase)、腺苷酸激酶(adenylate kinase)、磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)葡萄糖转运蛋白ⅡA(glucose transportersubunitⅡA)和糖原累积调节蛋白GarA(glycogen accumulation regulator GarA);参与抗氧化应激的蛋白有:2-半胱氨酸过氧化物还原酶(2-Cys peroxiredoxin)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)和DNA饥饿/固定相保护蛋白(DNAstarvation/stationary phase protection protein,Dsp);参与氨基酸合成的蛋白有:磷酸甘油酸脱氢酶(phosphoglycerate dehydrogenase)、γ-谷氨酰磷酸还原酶(gamma-glutamyl phosphatereductase)和4-羟基-tetrahydrodipicolinate还原酶(4-hydroxy-tetrahydrodipicolinatereductase);与细菌的应激力有关的蛋白有:热休克蛋白X(heat shock protein hspX)和普遍应激蛋白家族(Universal stress protein family)。其中抗氧化应激、糖酵解和热休克蛋白等与结核分枝杆菌的潜伏感染有关。
  结论:1.牛贝消核复方汤剂和散剂治疗结核病疗效显著。
  2.1 mg/ml的牛贝消核提取物能抑制结核分枝杆菌标准株H37Rv的生长。
  3.牛贝消核提取物可通过抑制结核分枝杆菌的蛋白合成、能量代谢、抗氧化应激,减弱结核分枝杆菌在巨噬细胞中的生存能力,影响其潜伏感染,从而发挥抗结核作用。
[硕士论文] 陶成武
遗传学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:结核病仍然是严重威胁人类健康的全球性疾病,伴随着耐药菌株的出现和快速传播,以及卡介苗预防保护能力有限,使得结核病一直保持着较高的发病率,全球发病形势仍然严峻。我国是结核病高负担国家之一,结核病始终威胁着公众的健康安全,加强对结核病全身免疫的探索,能够深入了解结核病发生发展的免疫机制,加快推动结核病的研究与治疗手段的发展。流式细胞术具有快速、精准、多细胞因子检测等特点,随着流式细胞术的发展,系统研究结核病患者的免疫状态成为了可能。本研究基于流式细胞术,成功建立了一套精准分析T细胞亚群的复杂多色流式细胞术实验方案,并以其为基础系统分析了结核病患者T淋巴细胞亚群的变化特征。
  1基于多色流式细胞术检测T细胞亚群方法的建立
  根据研究要求,确定T细胞亚群染色需要的表面分子种类,经过摸索与测试,调整荧光抗体的荧光搭配与用量,再经不断优化方案,最终建立了一套染色效果好,结果稳定的T细胞亚群表面分子染色实验方案,通过该方案可以清楚的区分结核病患者外周血中αβT细胞(CD3+TCRαβ+)、γδT细胞(CD3+TCRαβ-)、CD4+T细胞(CD3+TCRαβ+CD4+CD8-)、CD8+T细胞(CD3+TCRαβ+CD8+CD4-)、Th细胞(CD3+TCRαβ+CD4+CD8-CD127+CD25-/low)、Treg细胞(CD3+TCRαβ+CD4+CD8-CD127-CD25+)等多种细胞亚群,并且能区分中央记忆T细胞(CCR7+CD45RA-Tcm)和效应记忆T细胞(CCR7-CD45RA-Tem)两种功能亚群。
  2结核病患者外周血中T细胞亚群研究
  按照成功建立的多色流式细胞术实验方案,对40例临床确诊的结核病患者与26例非感染对照样本进行了T细胞亚群变化的研究。结果显示,结核病患者组与对照组相比,T细胞总数、αβT细胞、黏膜相关恒定T细胞(MALT)、Vδ1+γδT细胞、辅助性T细胞(Th)、调节性T细胞(Treg)等细胞群的数量无明显差异;γδT细胞、Vδ2+γδT细胞、CD8+T细胞等细胞群的数量显著下降,而CD4+T细胞亚群数量显著增多;中央记忆T细胞(Tcm)、效应记忆T细胞(Tem)亚群无显著差异。以上结果显示,结核病患者的T细胞亚群发生了广泛的变化,多种细胞参与了结核免疫应答。本研究促进了结核病全身免疫的研究,加深了对结核病免疫应答的认识。
  3结核病追踪样本T细胞亚群研究
  对结核病患者进行6个月追踪研究,共有12个患者完成了完整的追踪。追踪研究结果显示,这些患者接受治疗后健康状况均持续得到改善,T细胞总数持续减少,但无显著差异;γδT细胞数量0-3个月间增加,3个月后有所降低,但整体水平仍然高于初发水平;αβT细胞数量0-3个月间减少,3-6个月间小幅增多,同时,其CD4+T、CD8+T细胞亚群数量变化趋势与之相同。Treg细胞亚群数量在0-3个月间持续升高,3-6个月间略有降低。CD4+T细胞的主要功能亚群为Tcm,在治疗后其百分比持续降低;CD8+T细胞的主要功能亚群为Tem,治疗后其百分比持续升高。对结核病抗原特异性IFN-γ+T细胞以及IFN-γ+TNF-α+多功能T细胞亚群的研究发现,这些特异性T细胞的数量在患者接受治疗后持续减少,提示与患者的健康状况有紧密的联系,这将有利于加深对结核病免疫应答变化的理解,有助于探寻新型结核病诊断指标与愈后评价指标。
[硕士论文] 张学璇
临床检验诊断学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  ⑴检测活动性结核病患者外周血T淋巴细胞和Treg细胞(CD4+CD25+FoxP3+T淋巴细胞) PI3K-Akt-mTOR信号通路中各分子:Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、PTEN的表达水平及T淋巴细胞中FoxP3的表达情况,探讨活动性结核病患者T淋巴细胞及Treg细胞PI3K-Akt-mTO R信号通路的活化状态。⑵检测结核病患者外周血血清中结核分枝杆菌特异性分泌蛋白早期分泌靶抗原6(ESAT-6)、抗原85B(Ag85B)及细胞因子IL-10、TGF-β1、IL-35的水平,探讨分析ESAT-6、Ag85B水平与T淋巴细胞及Treg细胞PI3K-Akt-mTOR信号通路活化状态的相关性。
  方法:
  ①流式细胞术检测57例活动性结核病患者外周血T淋巴细胞(n=31)和Treg细胞(n=26)中 PI3K-Akt-mTOR信号通路中各分子:Akt、磷酸化 Akt(p-Akt)、mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、PTEN及FoxP3的表达水平。另外以48例健康志愿者作为对照组。②ELISA方法检测活动性结核病患者和健康志愿者外周血中结核分枝杆菌特异性分泌蛋白ESAT-6、Ag85B及细胞因子IL-10、TGF-β1、IL-35的表达水平。③比较活动性结核病患者和健康对照组p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的差异,分析血清中特异性分泌蛋白ESAT-6、Ag85B的浓度分别与 T淋巴细胞和 Treg细胞Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、FoxP3、PTEN的表达的相关性。
  结果:
  ⑴活动性结核病患者外周血T淋巴细胞中PI3K-Akt-mTOR通路中各分子:Akt、p-Akt、mTOR、p-mTO R、PTEN的表达水平与正常对照组相比明显下降,而FoxP3的表达水平相比正常对照组却显著升高(p<0.05)。⑵活动性结核病患者外周血 Treg细胞中 PI3K-Akt-mTO R通路中各分子:Akt、p-Akt、mTOR、p-mTO R、PTEN的表达水平与正常对照组相比显著降低(p<0.05)。⑶活动性结核病患者血清中特异性分泌蛋白ESAT-6、Ag85B和细胞因子IL-10、TGF-β1的浓度比正常对照组相比均显著升高(p<0.001),但IL-35的浓度与正常对照组相比却显著降低(p<0.001)。⑷活动性结核病患者血清中结核分枝杆菌特异性分泌蛋白ESAT-6和Ag85B的水平与T淋巴细胞、Treg细胞PI3K-Akt-mTOR信号通路各分子之间的相关性分析结果显示差异无统计学意义(p>0.05)。
  结论:
  活动性结核病患者外周血T淋巴细胞和Treg细胞中PI3K-Akt-mTOR通路中各分子表达水平均明显下降,显示结核病患者中该信号通路处于相对抑制状态,提示结核病患者外周血Treg细胞增高可能与该通路受抑制有关。
[硕士论文] 郭培军
公共卫生 山东大学 2017(学位年度)
摘要:结核病是由结核分枝杆菌感染所导致的慢性传染性疾病,人群普遍易感。历史上曾有“白色瘟疫”之称。据世界卫生组织报告,2015年全球新发结核病患者1040万,140万人死于结核病,2014年至2015年结核病发病率下降速度仅为1.5%,由于部分发展中国家结核病报告管理系统依然不够完善,结核病流行规模仍大于此前的估计,结核病仍是全球关注的公共卫生问题。
  中国结核病防控工作在政府的领导下,各级政府相继实施了3个全国结核病防治十年规划和1个全国结核病防治五年规划,使得结核病高发疫情得到控制,从2015年开始,我国每年结核病新发患者数量由之前的全球第二位下降至第三位。但我国目前仍是全球22个结核病高负担国之一,在结核病高负担国、多重耐药性结核病高负担国以及结核病/艾滋病病毒高负担国名单中均榜上有名,全球约有10%结核病患者来自中国。2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示,全国仍有活动性肺结核患者499万,虽然活动性肺结核的患病率呈现下降趋势,但由于我国人口数量大,且不断增长,2010年全国活动性肺结核病患者的数量反而超过了2000年第四次结核病流行病学调查结果的数量,依然庞大的活动性肺结核患者数量提示我国的结核病负担仍然很重。作为发展中国家,中国结核病的防治工作依然是我国的重大公共卫生问题。
  虽然从全国来看山东省属于东部经济发达的结核病低疫情省份,但2005年以来,山东省的结核病报告发病率比1997年以前有明显的增加,并且近年来结核病的报告发病率下降速度缓慢。因此需要对山东省以及省级以下的地市级结核病发病情况进行具体分析,以发现更详细的结核病发病特征和影响因素,采取因地制宜的结核病防控措施。
  随着空间流行病学的不断发展,应用地理信息系统工具,能更好地对结核病发病和流行规律进行研究。研究表明,结核病具有空间自相关性和空间异质性。运用空间流行病学和统计学的方法,对某一地区结核病分布状况和流行趋势进行分析研究,能更好地揭示该地区结核病发病的时空分布特点及其影响因素。
  但目前为止几乎没有研究烟台市结核病发病情况进行空间分析,以发现有统计学意义的结果和结核病聚集区域。本研究通过获取山东省烟台市2009-2014年结核病防治机构登记报告的结核病患者个案资料,计算报告发病率,对其进行描述性流行病学分析,并利用ArcGIS、GeoDa和SaTscan等空间统计分析软件进行空间自相关分析及空间扫描分析,探索讨论结核病发生和流行传播背后的影响因素,为烟台市结核病控制提供防控策略,并为政府制定适当的结核病控制政策提供建议和参考。
  研究结果
  1.流行病学三间分布特征:(1)山东省烟台市2009-2014年共报告登记结核病15338例,年均报告发病率为36.85/10万;(2)各年度每月均有报告病例,3月至6月为报告高峰期,4月报告发病数最多;(3)2009-2014年男女性结核病发病差异均有统计学意义(x2值分别为523.17、448.12、450.34、431.59、410.18和380.16,P值均小于0.01),男性结核病发病风险分别为女性的2.51倍、2.37倍、2.48倍、2.46倍、2.53倍和2.51倍;结核病患者15-34岁年龄组青年人占比39.94%,45-64岁年龄组中老年人病例占比29.98%;(4)发病数前五位的职业依次为农民9460例(61.68%)、家政家务待业人员2151例(14.02%)、工人1097例(7.15%)、学生861例(5.61%)和民工763例(4.97%);(5)莱阳市和蓬莱市两个县市区结核病报告发病率超过全市平均水平的1.25倍,莱山区、开发区、福山区和莱州市四个县市区发病率低于全市平均水平的0.75倍。
  2.空间分布特征:(1)2009-2014年,烟台市各年度结核病报告发病率全局空间自相关系数Moran'sⅠ分别为-0.2295(P=0.1950)、-0.3715(P=0.0300)、-0.1998(P=0.2370)、-0.1654(P=0.3290)、0.0217(P=0.2950)和0.0994(P=0.1590);局部空间自相关分析,2009-2014年,烟台市结核病报告发病存在空间异质性,有统计学意义的2个区域是“高-低区域”为芝罘区,“低-高区域”为栖霞市;(2)2009-2014年烟台市结核病累计报告发病率经单纯空间扫描分析共发现5个高发病率聚集区,分别是莱阳市(LLR=226.63,P<0.0001,RR=1.59)、蓬莱市(LLR=39.01,P<0.0002,RR=1.31)、芝罘区(LLR=21.67,P<0.0001,RR=1.17)、牟平区(LLR=19.90,P<0.0001,RR=1.21)和招远市(LLR=0.40,P=0.9940,RR=1.03)。
  研究结论
  1.烟台市各年度3月至6月为结核病报告发病高峰期;结核病以男性为主,男性结核病发病风险高于女性;15-34岁年龄组病例数最多;烟台市结核病发病人群职业以农民、家政家务待业人员、工人、学生和民工为主,合计占比93.43%;结核病患者以本地为主,但外来人口结核病发病率均高于本地户籍人口。
  2.莱阳市和蓬莱市结核病发病率的超额危险比居全市前两位。
  3.烟台市各县市区结核病报告发病存在空间异质性,栖霞市报告发病低于周边的莱阳市、海阳市和牟平区;芝罘区报告发病高于周边的莱山区、福山区和开发区。
  4.莱阳市、蓬莱市、芝罘区和牟平区是烟台市结核病报告发病主要聚集区域。
[硕士论文] 曲吉
微生物学 西藏大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分:Sp110、TLR-2基因多态性与世居藏族肺结核易感性研究
  目的:
  研究Sp110基因rs1135791、rs722555、rs9061单核苷酸多态性位点及TLR-2基因rs5743708单核苷酸多态性位点在世居藏族人群中的分布,关联分析4个单核甘酸多态性位点与世居藏族人群肺结核发生的相关性,以期为预测世居藏族人群肺结核患病风险提供遗传背景数据。
  方法:
  1.研究对象:本研究采用病例对照研究设计。病例组来自于西藏自治区第三人民医院肺科,为依照国家肺结核诊断标准所确诊的藏族肺结核患者,共343例,其中男性187例,女性156例,平均年龄为31.09±16.23岁。对照组,与病例组年龄、性别等因素相匹配的健康体检藏族个体,共260例,其中男性137例,女性123例,平均年龄为32.0±16.39岁。
  2.基因分型:采用iMLDR分型技术检测Sp110基因rs1135791、rs722555、rs9061单核苷酸多态性位点及TLR-2基因 rs5743708单核苷酸多态性位点的等位基因和基因型,计算其等位基因频率及基因型频率在病例组和对照组人群中的分布;
  3.统计分析方法:使用Excel2007与SPSS20.0统计软件进行数据录入及分析,病例组与对照组组间一般情况(性别、年龄)比较采用卡方检验(x2)和t检,采用x2检验分析研究对象Hardy-Weinberg遗传平衡性,采用x2检验、回归分析等统计方法分析rs1135791、rs722555、rs9061、rs5743708单核苷酸多态性与世居藏族肺结核易感的关联性。
  结果:
  1.Sp110基因rs1135791单核苷酸多态性位点T等位基因在病例组和对照组频率分别为78.1%、79.8%,C等位基因在病例组和对照组中的频率分别为21.9%、20.2%,两组间等位基因分布差异无统计学意义(x2=0.50;p=0.48)。 rs1135791位点T/T、T/C、C/C基因型频率在病例组分别为61.5%、33.2%、5.3%;对照组分别为63.5%、32.7%、3.8%,两组间基因型分布差异无统计学意义(x2=0.73;p=0.69)。rs722555位点G等位基因在病例组和对照组中出现的频率分别为57.4%、57.5%,A等位基因在病例组和对照组中的出现的频率分别为42.6%、42.5%,两组间等位基因分布差异无统计学意义(x2=0.0005;p=0.98)。rs722555位点 G/G、G/A、A/A基因型频率在病例组分别为36.1%、42.6%、21.3%;对照组分别为32.7%、49.6%、17.7%,两组间基因型分布差异无统计学意义(x2=3.09;p=0.21)。rs9061位点G等位基因在病例组和对照组中出现的频率分别为91.7%、89.6%,A等位基因在病例组和对照组的出现的频率分别为8.3%、10.4%,两组间等位基因分布差异无统计学意义(x2=1.53;p=0.22); rs9061位点G/G、G/A、A/A基因型频率在病例组分别为83.4%、16.6%、0%;对照组分别为80.8%、17.7%、1.5%,两组间基因型分布差异无统计学意义(x2=3.09;p=0.21)。rs9061在隐性遗传模型下,其基因型的分布具有统计学差异(OR=6.022;p=0.021)。
  2.TLR-2基因 rs5743708单核苷酸多态性位点在病例组和对照组中的基因型全部为GG、没有检测到G/A和A/A基因型。提示TLR-2基因rs5743708单核苷酸多态性位点在世居藏族人群中可能不存在多态性。
  结论:
  Sp110基因rs1135791、rs722555、rs9061和TLR-2基因rs5743708单核苷酸多态性位点与世居藏族人群肺结核易感无相关性。该4个单核苷酸多态性位点可能不是世居藏族人群肺结核易感相关因素。
  组中的频率分别为21.9%、20.2%,两组间等位基因分布差异无统计学意义(x2=0.50;p=0.48)。rs1135791位点T/T、T/C、C/C基因型频率在病例组分别为61.5%、33.2%、5.3%;对照组分别为63.5%、32.7%、3.8%,两组间基因型分布差异无统计学意义(x2=0.73;p=0.69)。rs722555位点G等位基因在病例组和对照组中出现的频率分别为57.4%、57.5%,A等位基因在病例组和对照组中的出现的频率分别为42.6%、42.5%,两组间等位基因分布差异无统计学意义(x2=0.0005;p=0.98)。rs722555位点G/G、G/A、A/A基因型频率在病例组分别为36.1%、42.6%、21.3%;对照组分别为32.7%、49.6%、17.7%,两组间基因型分布差异无统计学意义(x2=3.09;p=0.21)。rs9061位点G等位基因在病例组和对照组中出现的频率分别为91.7%、89.6%,A等位基因在病例组和对照组的出现的频率分别为8.3%、10.4%,两组间等位基因分布差异无统计学意义(x2=1.53;p=0.22);rs9061位点G/G、G/A、A/A基因型频率在病例组分别为83.4%、16.6%、0%;对照组分别为80.8%、17.7%、1.5%,两组间基因型分布差异无统计学意义(x2=3.09;p=0.21)。rs9061在隐性遗传模型下,其基因型的分布具有统计学差异(OR=6.022;p=0.021)。
  2.TLR-2基因rs5743708单核苷酸多态性位点在病例组和对照组中的基因型全部为GG、没有检测到G/A和A/A基因型。提示TLR-2基因rs5743708单核苷酸多态性位点在世居藏族人群中可能不存在多态性。
  结论:
  Sp110基因rs1135791、rs722555、rs9061和TLR-2基因rs5743708单核苷酸多态性位点与世居藏族人群肺结核易感无相关性。该4个单核苷酸多态性位点可能不是世居藏族人群肺结核易感相关因素。
  第二部分:西藏地区高中生肺结核病防治知信行情况调查
  目的:
  了解西藏拉萨市高中生结核病防治知识、态度和行为现状及获取结核病知识的主要途径,为今后更好地开展学校结核病健康教育提供参考依据。
  方法:
  采用随机整群抽样的方法对拉萨市6所高中729名学生进行结核病防治知识、态度、结核病知识来源现状问卷调查,使用SPSS20.0统计软件进行数据的录入及分析,其中计量资料均数间比较采用t检验和F检验,描述性分析采用x2检验。
  结果:
  西藏拉萨市729名高中生结核病防治知识总体知晓率为45.6%、全部知晓率为1.5%,结核病态度持有率为60.3%,汉族学生防治知识得分(t=7.145,p=0.001)、态度得分(t=5.179,p=0.001)均高于藏族学生;文科学生的知识得分(t=3.471,p=0.001)高于理科学生;城镇学生的结核病防治知识得分(F=26.841,p<0.001)、态度得分(F=19.160,p=0.001)均高于农牧区的学生;高二学生肺结核防治知识得分低于高一、高三学生(F=4.195,p=0.015);结核病防治知识的来源主要是“电视”,最喜欢的防治结核病的宣传材料是“图画为主的宣传材料”。
  结论:
  西藏拉萨市高中生结核病防治知识知晓率、态度持有率都较低,有待普及针对高中生的以学校为主导的结核病防治知识的健康教育。
[硕士论文] 黄洁云
内科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  本文以利福喷丁(Rifapentine,RIF)和利奈唑胺(Linezolid,LZD)为模型药物,以聚乳酸-羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]为载体,制备了载利福喷丁与利奈唑胺聚乳酸-羟基乙酸缓释微球(Rifapentine-linezolid-loaded poly(lactic acid-co-glycolic acid)microspheres,RLPMs),用于解决肺结核支气管镜介入治疗时所选用的药物缓释效果差和有效药物浓度维持时间短的问题。
  方法:
  首先,建立利福喷丁与利奈唑胺高效液相色谱检测法(high-performance liquid chromatography,HPLC),绘制其标准曲线,用于检测利福喷丁与利奈唑胺药物浓度。然后,采用水包油(Oil-in-Water,O/W)的乳化溶剂挥发法制备载药微球,并通过对不同制备工艺下所制备微球的形态、粒径大小、载药量和包封率等理化特性进行考察,筛选出最佳制备工艺。最后,对缓释微球的体外释放特性、肺内粘附性、留滞特性以及支气管和肺组织病理观察进行了评价。
  结果:
  最佳制备工艺所制备的微球呈球形,表面有圆形凹陷,微球粒径大小为27.38±1.28μm,利福喷丁与利奈唑胺的载药量分别为18.51±0.26%和8.42±0.24%,包封率分别为55.53±0.78%和16.87±0.47%(n=3)。在体外释放试验的突释期内,利福喷丁3d内释放21.37±0.68%,利奈唑胺1d内释放43.56±2.54%,随后二者进入平稳释放期,最终利福喷丁与利奈唑胺14d累计释放率分别为27.61±1.52%和51.01±3.31%(n=3)。通过肺内粘附性试验、滞留性试验以及支气管和肺组织病理观察,缓释微球能够在犬支气管黏膜表面缓慢释放并滞留20d,并且不会对支气管黏膜造成损害,安全可靠。
  结论:
  本研究所制备的微球具有明显的缓释效果以及能有效滞留于支气管黏膜表面,安全可靠,达到了实验预期设计的目标。
[硕士论文] 谷战英
社会医学与卫生事业管理 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  2015年,我国有918万人患有肺结核,35万人死于肺结核,肺结核是我国重点防治的重大传染病之一。随着结核病防治策略和防治模式的转变,不同机构间的职责也随之调整,定点医院开始承担原来由疾病预防控制机构负责的一般性结核患者的免费筛查、登记报告、诊断治疗和健康教育等职责。在疾病预防控制机构负责一般性结核患者期间,国家以中央专项经费的方式补偿其提供的结核病服务。但是,职责调整后,并没有出台配套的定点医院提供结核病服务的补偿政策,而结核病的门诊治疗纳入基本医疗保障刚刚起步,如何与政府投入及其他社会救助资源相结合尚在探索阶段,这已经严重影响了结核病防治工作的有效开展,探讨定点医院结核病服务提供补偿策略显得尤为重要。
  研究目的:
  本研究通过收集结核病定点医疗机构承担结核病诊疗服务的补偿现状以及职责调整前后医院运行和结核病防治工作质量的变化情况,探讨可能的影响因素,总结经验,提出定点医疗机构承担结核病免费诊疗服务的补偿策略。
  研究方法:
  本研究按照经济发展水平在全国东中西部分别抽取山东、湖南、陕西三个省为样本省,根据结核病定点医院工作开展情况采用目的抽样方法在每个样本省抽了两个县(市、区)作为样本县,收集定点医院提供结核病服务的补偿现状,职责调整前后样本县定点医院的运行情况、结核患者登记和治疗效果变化情况;通过访谈了解定点医院模式存在的问题和困难,以及对定点医院模式的补偿建议。收集的定量资料用Microsoft Access2007建立数据库,数据的统计分析用SPSS20.0完成。定性资料用Nvivo10进行主题归纳分析。
  主要结果:
  (1)多数地方政府对定点医院承担结核病服务投入以疾控原有的设备为主,对医院提供的部分结核病公共卫生服务缺乏补偿,部分地区结核病门诊服务还没有纳入医保门诊报销的范畴。
  (2)在不同补偿模式下,职责调整前后定点医院总收入均呈上升趋势,收入结构的变化不大。实行定点医院模式以后,所有补偿模式医院的医疗收入占总收入的比例一直94%以上,财政补助收入占总收入的比例都低于5%,提供公共卫生服务的收入少,结核科的收入占医院收入比例在0.81%-5.89%之间。
  (3)除了全面补偿模式的长沙,其他模式定点医院的结核科医务人员收入是医院员工平均收入的30%-90%,结核科室医务人员的绩效奖金收入占总收入的比例在50%-60%,结核病诊疗队伍的稳定性和可持续性受到影响。
  (4)在不同的补偿模式下,结核病的治愈率和治疗完成率基本都在85%以上,基本能够满足国家防治规划的要求。结核患者登记率除了补偿人员模式,其他模式下降了21.4%-78.1%,下降幅度由大到小依次是补偿匮乏模式、补偿服务模式和全面补偿模式。
  结论与建议:
  目前政府对定点医院提供结核病服务的投入不足,对定点医院提供的结核病公共卫生服务缺乏补偿,医院的收入结构没有发生改变,结核科的业务量在增加,结核科医务人员收入普遍低于医院的平均水平;在投入和补偿相对全面,但是缺乏监督和考核的情况下,结核病登记管理工作质量效果并不理想;在补偿人员模式下,政府或者医院对结核病从业人员工资的政策倾斜,将工作数量与质量与补偿挂钩的情况下,结核病登记管理工作质量最好,在补偿匮乏模式下,结核病登记管理工作质量出现严重下滑。因此提出以下建议:
  (1)将结核病门诊服务纳入医保门诊报销的范畴,制定符合结核病疾病特点的医保补偿政策。
  (2)增加和完善定点医院承担结核病公共卫生服务的补偿政策。
  (3)建立有效的人员激励机制,保障结核病医务人员的工资待遇,稳定结核病防治人才队伍。
  (4)建立定点医院结核病服务提供的考核监督机制,确定监管主体,明确各方职责,提高结核病患者管理登记的工作质量。
[硕士论文] 汪春雷
外科学(神外) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:结核性脑膜炎(TBM)是由结核分支杆菌(MTB)引起的中枢神经系统非化脓性炎症,其病理变化主要发生在蛛网膜、软脑膜进而累及脑血管、脑实质。中枢神经系统结核病为最严重的结核病(TB),约占所有活动性结核病的1%。结核性脑膜炎的预后主要在于早期诊断及尽早治疗,而早期、适量、合理、有效的治疗能够快速减轻患者的症状、改善预后、减少后遗症。近年来,TBM流行病学特点及临床表现都发生了一些变化,通过分析和研究TBM的流行病学特征、临床表现特点,可为临床早期诊断及制定合理的治疗方案提供指导依据。本研究通过对山东省2007-2016年期间1873例TBM患者应用回顾性分析方法,分析TBM患者的年龄、性别、职业、地区及发病时间分布,总结患者发病的流行病学特征,临床表现,辅助检查结果,治疗与转归。
  研究方法:
  1.资料来源病例资料来源于“国家传染病疫情网络直报系统”的2007-2016年山东省结核性脑膜炎监测资料。人口资料来源于“国家疾病监测信息报告管理系统基本信息系统”的2007-2016年山东省人口数据资料。
  2.方法通过国家传染病疫情网络直报系统,收集整理2007-2016年山东省17个市结核性脑膜炎疫情监测资料,分析山东省人群结核性脑膜炎发病率,发病人群的“三间”分布,总结山东省人群结核性脑膜炎流行趋势和特点、临床表现、实验室及影像学检查结果、治疗和转归。
  3.诊断标准一、具备以下一项或多项脑膜炎的症状和体征:头痛、易激惹、呕吐、发热、颈强直、抽搐、局灶性神经功能缺损、意识障碍或倦怠。二、患者应符合A或B的标准:A符合临床标准,同时具备以下一项或多项:脑脊液中找到抗酸杆菌;脑脊液结核菌培养阳性;脑脊液结核菌核酸检测阳性;B脑或脊髓中发现抗酸杆菌或结核性病理改变,同时又有临床征象和相应的脑脊液改变或尸检脑膜改变。
  4.检查方法患者入院后均行腰椎穿刺术,将部分脑脊液标本立即送检,行脑脊液腺苷脱氨酶(ADA)、白细胞介素-23(IL-23)、乳酸、蛋白、葡萄糖、氯化物等指标检测;在治疗一年后再次行腰椎穿刺术,行脑脊液ADA、IL-23、乳酸、蛋白、葡糖糖、氯化物等指标检测。ADA、乳酸采用酶法,仪器为日立生化分析仪,试剂由德赛诊断系统(上海)有限公司提供;IL-23实验采用ELISA法,试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。
  5.实验室检测指标正常值范围乳酸1.0-2.8mmol/L;葡糖糖2.5-4.4mmol/L; ADA3.5-5.5U/L; IL-239.4-11.2pg/ml;蛋白0.20-0.45g/L;氯化物120-130mmol/L。
  6.治疗方法所有病人均采用一线抗结核药物四联疗法:异烟肼(INH),利福平,吡嗪酰胺,链霉素(SM)合并治疗,疗程1~1.5年。INH:10~20mg/(kg·d),一次顿服,最大量不超过每天400mg,疗程1~1.5年。异烟肼口服或静脉滴注的同时,为防止出现多发性周围神经病等毒副作用给予维生素B6。利福平:10~15mg/(kg·d),最大量不超过每天450mg,疗程6~9个月,必要时1年。SM:20~30mg/(kg·d),每天肌注1次,最大量不超过每天750mg。1~2个月后根据病情改为隔天1次,链霉素可导致听力及前庭功能损害,一般连续肌内注射不超过2个月,总疗程一年左右。吡嗪酰胺:20~30mg/(kg·d),口服,每天最大量不超过1.5g,疗程3~6个月。442例结核性脑膜炎并脑积水患者予以鞘内注射抗结核药物:剂量:INH20~50mg/次,2~4周为1疗程,一般应用1~3疗程。其中,33例重度梗阻性脑积水患者行额角脑室外引流术,12例重度交通性脑积水患者在控制结核症状后行脑室腹腔分流术。
  7.临床疗效评价治疗后进行随访,记录病人的临床症状缓解时间,应用PCR法测脑脊液的ADA、IL-23及TB-DNA;应用抗酸染色法测抗酸杆菌;并测脑脊液蛋白、葡糖糖及氯化物含量,并检测脑脊液压力,来评估治疗效果。病人临床疗效评价标准如下:显效:临床症状消失,脑脊液ADA、IL-23、葡糖糖、蛋白、氯化物以及TB-DNA和抗酸杆菌结果正常。有效:临床症状缓解,脑脊液ADA、IL-23、葡糖糖、蛋白、氯化物以及TB-DNA和抗酸杆菌结果较之前好转。无效:临床症状无明显好转或加重,脑脊液ADA、IL-23、葡糖糖、蛋白、氯化物以及TB-DNA和抗酸杆菌结果无明显变化。
  8.统计分析数据录入Excel2003统计软件,应用SPSS17.0统计分析软件进行统计分析双侧检验,三组间测定值的比较进行方差分析,两组间差异比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
  研究结果:
  1.各年发病率山东省2007年至2016年共报告1873例TBM患者,年平均报告发病率为0.23/10万,发病率范围在0.06/10万-0.41/10万。结核性脑膜炎发病率最高的是2007年0.41/10万(306例),最低的是2016年0.06/10万(58例),报告发病率呈现下降趋势。
  2.地区分布2007-2016年,山东省17市均有TBM发生。菏泽市报告病例数最多,为232例,占总病例数的12.39%(232/1873);其次是临沂、济宁和聊城市,分别占11.16%(209/1873)、9.29%(174/1873)和8.65%(162/1873)。从报告发病率来看,菏泽市报告发病率最高为0.97/10万,其次是聊城、临沂和济宁市,分别为0.86/10万、0.71/10万和0.49/10万。2007-2016年,疫情下降明显的有烟台、威海和日照市,报告发病率分别由2007年的0.21/10万、0.18/10万、0.20/10万下降到2016年的0.10/10万、0.09/10万、0.09/10万。
  3.年龄分布1873例TBM病例中,各年龄组均有发病,发病年龄集中于30-60岁,占全部病例数的73.41%(1375/1873)。
  4.性别分布1873例TBM病例中,男性1569例,占83.77%,女性304例,占16.23%。男女性别比为5.16∶1.00。
  5.城乡及职业分布病例职业以农民为主,占全部病例数的79.07%(1481/1873)。其余依次为家务待业、学生、餐饮服务、离退人员、散居儿童、工人、医务人员。
  6.时间和季节分布山东省TBM全年均有病例发生,发病时间集中在第11月-第二年4月份,占发病数的66.04%(1237/1873)。呈现明显的季节性周期,秋冬季发病较多,春夏季发病较少。
  7临床表现1873例TBM患者中,结核性脑膜炎1431例,占全部病例数的76.40%(1431/1873);结核性脑膜炎并脑积水442例,占全部病例数的23.60%(442/1873)。临床表现以头痛、低热居多,分别有1809例和1799例,分别占总病例数的96.58%和96.05%;其次为全身无力和项强,分别有1303例和1211例,分别占总病例数的69.57%和64.66%。
  8.实验室及影像学检验结果1873例TBM患者中,脑脊液压力升高1764例,占全部发病数的94.18%(1764/1873);CSF白细胞数升高1428例,占全部发病数的76.24%(1428/1873); CSF白细胞由数十个至数百个、多呈混合型,以单核细胞占优势者约占85%; CSF蛋白含量升高937例,占全部发病数的50.03%(937/1873);CSF氯化物降低1252例,占全部发病数的66.84%(1252/1873);CSF葡萄糖降低1368例,占全部发病数的73.04%(1368/1873);CSF ADA升高1328例,占全部发病数的70.90%(1328/1873);CSF IL-23升高1402例,占全部发病数的74.85%(1402/1873);CSF细菌涂片及细菌培养检出率较低、皮肤结核菌素试验阳性率低。X线摄胸片检查发现肺结核病灶1185例,占全部发病数的63.27%(1185/1873);脑CT和MR发现脑内异常793例,占全部发病数的42.34%(793/1873)。
  9.转归1873例TBM患者有1445例恢复良好,占全部病例数的77.15%;428例恢复不良,占全部病例数的22.85%,其中47例死亡,占全部病例数的2.51%。脑膜炎组、脑积水组和对照组的显效、有效和无效率分别为36.13%、51.43%和12.44%;13.35%、30.09%和56.56%;23.80%、62.20%和14.00%。三组差异有统计学意义(Kruskal-Wallis x2=11.541,p<0.001)。治疗前三组患者脑脊液的ADA、IL-23、蛋白、乳酸、葡糖糖和氯化物实验室指标差异有统计学意义(F分别=27.98、53.46、15.53、18.47、11.74和26.09,p均<0.001或0.01)。脑膜炎组患者治疗前后脑脊液的ADA、IL-23、蛋白、乳酸、葡糖糖和氯化物实验室指标差异均有统计学意义(t分别=-32.04、-64.45、-78.75、-32.91、42.73、52.64);脑积水组患者治疗前后脑脊液的ADA、IL-23、蛋白、乳酸、葡糖糖和氯化物实验室指标差异均有统计学意义(t分别=-26.93、-76.94、-38.87、-21.95、27.65、46.03,p均<0.001);治疗前脑膜炎组与脑积水组患者脑脊液的ADA、IL-23、蛋白、乳酸、葡糖糖和氯化物实验室指标比较,差异均有统计学意义(t分别=-8.80、-41.24、-11.26、-22.58、11.20、20.38);治疗后脑膜炎组与脑积水组患者脑脊液的ADA、IL-23、蛋白、乳酸、葡糖糖和氯化物实验室指标比较,差异均有统计学意义(t分别=-11.80、-27.04、-11.92、-8.98、44.04、8.55,p均<0.001)。
  研究结论:
  1.山东省2007-2016年间TBM发病率总体呈下降趋势,年发病率逐年降低,非沿海的,经济欠发达地区的男性、壮年、农民是TBM发病的主要人群,秋冬季是TBM发病的高峰。
  2.山东省近年的TBM患者的临床表现以轻、中型患者居多,预后较好;重型患者主要是结核性脑膜炎合并脑积水的患者,预后较差。早期诊断治疗是改善患者预后的关键因素。
  3.TBM患者脑脊液中ADA、IL-23、蛋白、乳酸、葡糖糖和氯化物等指标均出现异常改变,并且经抗结核治疗后能够明显好转。
[硕士论文] 陈必刚
内科学(呼吸病学) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的与背景:
  谈及人类健康风险,肺结核是无法回避的事实,人类与肆虐人间数千年“痨魔”之间的斗争一直在延续。根据各国结核病的流行情况,世界卫生组织重新划分出了30个结核病高负担国家,而中国由于其不容乐观的结核病流行情况而高居第4位。耐药肺结核的出现更是使我国本已严峻的结核病防控态势雪上加霜,因而,加强对耐药肺结核流行现状的认知和其流行趋势的把握,能为我国现阶段所采取的结核病防控策略的修改和完善提供些许参考价值;分析并识别耐药结核产生的相关风险,能够为临床医生等相关从事一线结核病防治工作的人员早期发现并诊断耐药结核病以及制定合理的结核化疗方案提供有益的参考。
  方法:
  收集于2011年01月01日-2014年12月31日期间,就诊于山东省胸科医院接受住院治疗的痰培养阳性且为结核分枝杆菌的肺结核患者的相关资料,采用SPSS19.0统计分析软件对入选患者总的耐药率及四种一线抗结核药的单药耐药率进行趋势分析,分析比较耐药组与敏感组之间患者相关临床特征的区别,辨别耐药患者的风险因素,在此基础上,进一步分析探讨单药耐药患者相关临床特征及风险因素。我们采用卡方检验的方法对本研究中分类资料进行不同组间的比较,当某组数据出现理论频数<5的情况时,为避免卡方检验结果出现偏差,我们采用Fisher确切检验进行分析。对于肺结核患者出现耐药情况风险的探寻,则使用logistic回归分析。对于总体分布特征不明确的不同样本,我们采用秩和检验进行统计分析。本研究中,我们采用的认定差异具有统计学意义的统计结果为P<0.05。
  结果:
  我们共收集到合格病例1815例,其中敏感菌株1240株(68.32%),耐药菌株575株(31.68%);多药耐药患者125例(6.89%),对四种药物均显示耐药性的患者共25例(1.38%);男性患者共1257例(69.26%),女性患者558例(30.74%);初治病例1467例(80.83%),复治病例348例(19.07%);该研究中所有入选患者年龄分布于10-90岁之间,平均53.2岁(均数±标准差为:53.2±18.8岁)。近四年总的耐药趋势无明显变化,单药耐药趋势分析发现,乙胺丁醇耐药率呈逐年下降趋势,而异烟肼、利福平、链霉素的耐药率则居高不下。根据logistic回归分析发现,下列因素能够增加肺结核患者耐药情况发生的分险:农村居民(OR=1.380,95%CI1.287-1.481),具有结核密切接触史(OR=1.429,95%CI1.342-1.520),胸部CT示空洞形成(OR=1.465,95%CI1.409-1.522)及双肺受累(OR=1.044,95%CI1.001-1.089),合并COPD(OR=13.640,95% CI12.976-14.337)以及长期使用糖皮质激素(OR=1.185,95%CI1.025-1.371);而合并糖尿病是耐药结核病产生的保护性因素(OR=0.759,95%CI0.726-0.793)。我们将所有入选肺结核患者分为耐药组和药物敏感组,由于患者的误诊时间和住院时长的数据不服从正态分布,因而,我们采用非参数统计的方法即秩和检验来分析耐药结核患者与药物敏感组患者间误诊时间、住院时长之间的差异,用均值和中位数来描述各自的数据特征。通过秩和检验分析,我们发现耐药组与敏感组肺结核患者误诊时间有所差异,耐药组平均误诊时间为5.94个月,而敏感组平均误诊时间为4.39个月(P=0.013);耐药组平均住院时长47.62天,高于敏感组的42.01天(P=0.003)。
  结论:
  山东省在近些年的肺结核防控工作中取得了显著成效,四种一线抗结核药物总的耐药率及单药耐药率明显低于全国水平。从近四年的耐药趋势来看,其中异烟肼、利福平、链霉素的耐药水平居高不下,而乙胺丁醇的耐药水平则呈下降趋势,但是,多药耐药结核水平未见明显下降趋势。对于具有下述风险因素的肺结核患者,我们要时刻警惕其耐药情况的发生:农村居民;具有结核密切接触史;胸部CT示空洞形成及双肺受累;罹患慢性阻塞性肺疾病(COPD)以及长期使用激素。因而,接下来结核防控工作需要加强对农村居民的肺结核的筛查,对于影像学征象不典型的肺结核患者中应当保持高度警惕,COPD的防治工作仍需加大力度,对于提高肺结核患者的依从性以及周边人群防护隔离工作的教育宣传要时刻不能松懈。耐药肺结核患者更容易误诊,临床医师对于该类患者应加强认识,提高诊断率。
[硕士论文] 武丽娟
内科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  评价T-SPOT.TB在肺外结核病诊断中的应用价值。
  方法:
  回顾性纳入2013年1月~2015年12月中国人民解放军第309医院病理科应用PCR反向斑点杂交法进行分枝杆菌菌种鉴定(以下简称分子病理)肺外组织标本280例,病案检索其外周血T-SPOT.TB检测结果,将检测结果与分子病理诊断结果进行比较,以敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比为评价指标。
  结果:
  以分子病理诊断与T-SPOT.TB比较,280例患者中T-SPOT.TB阳性170例,阴性110例;分子病理MCH阳性者1例,MGO阳性5例,MTC阳性共146例,结果阴性128例;分子病理阳性且T-SPOT.TB阳性共148例,分子病理阴性且T-SPOT.TB阳性共22例,分子病理阳性且T-SPOT.TB阴性共4例,分子病理阴性且T-SPOT.TB阴性共106例。敏感性为97.4%(148/152),特异性为82.8%(106/128),阳性预测值为87.0%(148/170),阴性预测值为96.4%(106/110),阳性似然比为5.69,阴性似然比为0.0318。其中骨关节脊柱分子病理例数较多,占54.64%(153/280)敏感度80.0%(60/75),特异度100.0%(78/78),阳性预测值100.0%(60/60),阴性预测值83.9%(78/93);以临床诊断与T-SPOT.TB比较,280例患者中T-SPOT.TB阳性170例,T-SPOT.TB阴性110例,临床诊断结果阳性192例,临床诊断结果阴性88例。临床诊断阳性且T-SPOT.TB阳性145例,临床诊断阴性且T-SPOT.TB阳性25例,临床诊断阳性且T-SPOT.TB阴性47例,临床诊断阴性且T-SPOT.TB阴性63例。敏感性为75.5%(145/192),特异性为42.7%(63/88),阳性预测值为85.3%(145/170),阴性预测值为57.3%(63/110),阳性似然比为2.66,阴性似然比为0.342。
  结论:
  本研究显示T-SPOT.TB检测对肺外结核诊断具有较高的敏感性,可对临床诊断提供有利的依据。较高的T-SPOT. TB阴性预测值提示对于排除肺外结核病有重要意义。
[硕士论文] 王卉
免疫学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的、对人类公共健康危害最大的传染病之一。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计,2015年新发结核病例1040万,其中48万为多重耐药结核,10万人为利福平耐药结核;结核致死人数高达140万,约19万人死于多重耐药结核。由此可见,结核病对人类的生命健康威胁仍然十分严峻,是亟待解决的全球性公共卫生问题。抗生素长期使用以及抗结核药物使用的不合理,导致耐多药结核菌株的产生和传播;结核-HIV的联合感染,使结核病的治疗变得更加复杂和困难。深入研究MTB致病机制、免疫病理及免疫系统杀伤和清除MTB的机制,对寻找有效的抗结核治疗和预防的新靶点,具有非常重要的意义。机体的免疫系统防御反应在抵抗MTB感染中发挥着至关重要的作用。MTB被肺泡和间质巨噬细胞、以及局部树突状细胞(dendritic cell,DC)识别时,引发先天免疫应答。巨噬细胞(macrophage,Mψ)是机体抗结核感染的第一道防线,通过表达Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)、免疫球蛋白受体、补体受体和凝集素受体等多种模式识别受体(pattern recognition receptors,PRR),与入侵的MTB相关抗原结合,从而介导MTB的粘附及吞噬,发挥胞内杀菌效应。
  Ras同源家族的小鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(The Rho family of smallGTP-binding proteins,Rho-GTPases)作为基本细胞活动的分子开关,通过结合GTP或GDP而发生活性与非活性状态的改变,在肌动蛋白细胞骨架重组、细胞迁移和粘附、活性氧形成和细胞凋亡中等多种细胞生命过程中发挥着至关重要的调控作用。鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)家族成员促进GTP与GDP交换,是确保Rho-GTPases在特定空间和时间激活的理想分子。在GEF家族中,鸟嘌呤核苷酸交换因子H1(GEF-H1)活性受微管结合的调节,从而参与细胞形变、p53肿瘤抑制基因的突变、细胞周期等生理生化过程。研究表明,GEF-H1的表达缺失或上调可调节细胞信号转导、Rho家族成员之一RhoA活性及抗感染免疫反应。然而,目前尚未见到GEF-H1调控被感染Mψ抵抗MTB感染的相关报道。
  本课题探究了MTB感染Mψ后GEF-H1的表达变化及调节机制,并探讨了GEF-H1通过调控p38MAPK、TBK1通路,调节MTB感染Mψ中促炎因子表达,最终影响Mψ抑菌活性的机制,为进一步研究GEF-H1在Mψ抗结核感染免疫中的作用机制奠定了基础,为开发通过GEF-H1调控Mψ抑菌活性的抗结核药物提供了潜在靶点,对结核的有效防控具有重要意义。
  目的:
  1.确定GEF-H1与MTB感染的相关性,阐明MTB感染如何诱导GEF-H1表达;
  2.揭示GEF-H1对Mψ清除MTB的调控作用;
  方法:
  1.检测MTB感染后GEF-H1的表达水平
  a.采用采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测MTB感染Mψ中GEF-H1的mRNA表达水平;
  b.采用Western blot,检测MTB感染Mψ中GEF-H1的蛋白表达水平。
  2.研究MTB感染诱导GEF-H1表达增加的机制
  a.采用多种信号通路抑制剂预处理Mψ后,Real-time PCR检测Mψ中GEF-H1的mRNA表达水平;
  b.免疫荧光-激光扫描共聚焦显微镜观察MTB感染Mψ中,GEF-H1与微管的共定位。
  3.探讨调节Mψ炎症反应及抑菌效应的分子机制
  a.采用siRNA沉默Mψ中GEF-H1的表达;
  b.通过平板菌落计数(CFU)实验,检测沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的抑菌活性;
  c.采用流式细胞术检测Mψ吞噬Texas-Red标记BCG的能力;
  d.Griess法和Western blot检测沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的NO产生和自噬发生情况;
  e.用Real-time PCR和ELISA检测GEF-H1表达沉默对MTB感染Mψ促炎因子表达的调节效应;
  f.Western blot检测沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的p38MAPK、TBK1通路活化;
  g.G-LISA检测沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的RhoA活性。
  结果:
  1.MTB感染Mψ细胞系后,GEF-H1的表达水平显著上调,并呈时间及感染剂量依赖性。
  2.MTB感染诱导的GEF-H1高表达依赖于p38、ERK、JNK及NF-κB信号通路,同时与MTB感染后微管的解聚有关。
  3.MTB感染Mψ后,GEF-H1促进Mψ吞噬及清除胞内MTB。
  4.MTB感染Mψ后,GEF-H1通过激活p38MAPK和TBK1信号通路促进Mψ表达与分泌促炎细胞因子IL-6、IL-1β,从而发挥抑菌活性,且该调控效应不依赖于RhoA的激活。
  5.GEF-H1的抑菌活性并不依赖MTB感染后Mψ中NO的产生以及自噬的发生。
  结论:
  本研究发现MTB感染诱导GEF-H1表达水平的显著上调,并进一步在体外MTB感染Mψ模型中揭示,GEF-H1通过活化p38和TBK1信号通路,促进Mψ表达与分泌促炎因子,继而促进Mψ吞噬并清除胞内MTB的新机制。本研究为寻找结核病治疗的新靶点,开发新的防治措施提供了理论依据。
[硕士论文] 杨晓帆
免疫学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起结核病的致病菌。MTB能通过多种免疫逃逸机制逃避巨噬细胞(macrophage,Mψ)的清除,从而长期寄生在Mψ内。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)广泛参与多种生物学进程并发挥关键作用,且可以作为多种疾病的诊断标志物和潜在的治疗靶标。但是lncRNA能否作为结核病的诊断标志物以及在MTB感染Mψ中的作用仍未清楚。
  研究目的:
  通过基因芯片检测MTB感染Mψ后lncRNA和mRNA表达谱的变化,筛选有望用于结核病诊断的生物标志物;初步探讨了lncRNA—ENST00000360485在MTB感染Mψ中的作用,以期发现Mψ抵抗MTB感染的新机制。
  研究方法:
  分别用MTB弱毒株H37Ra和强毒株H37Rv感染入原代巨噬细胞,使用lncRNA芯片(Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0)检测被感染巨噬细胞lncRNA和mRNA表达谱,以未感染Mψ为对照;分别挑选6条lncRNA和6条mRNA,使用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术验证基因芯片结果的可重复性;使用生物信息学方法对差异表达的mRNA进行GO分析(Gene Ontology analysis,GO analysis)和KEGG通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)biological pathway analysis);使用qRT-PCR检测32例健康志愿者和31例结核病患者的PBMC样本,筛选有望用于结核病诊断的生物标志物;使用siRNA抑制Mψ的lncRNA-ENST00000360485表达后,感染BCG,qRT-PCR检测其邻近基因和Mψ细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的RNA表达水平变化,采用Western Blot检测Mψ自噬水平的变化,通过克隆形成实验(colony-forming unit,CFU)检测Mψ清除MTB的效果。
  研究结果:
  基因芯片结果显示,H37Ra感染后,Mψ有972条lncRNA和2138条mRNA出现差异性表达,而H37Rv感染后,Mψ有1417条lncRNA和2478条mRNA出现差异性表达;所挑选的lncRNA和mRNA的表达趋势与基因芯片结果高度一致;GO和KEGG通路分析结果分别显示了H37Ra和H37Rv感染相关的功能和代谢通路;qRT-PCR检测发现3个在健康对照和结核病人之间存在显著性差异表达的lncRNA(ENST00000360485,MIR3945HG V1和MIR3945HG V2);ROC曲线分析结果显示:ENST00000360485、MIR3945HG V1、MIR3945HG V2的ROC曲线下面积(AUC)为0.798、0.925、0.956,敏感性分别是83.97%、90%、89.66%,特异性分别是71.88%、81.25%、90.63%;siRNA抑制ENST00000360485表达前后,ENST00000360485的上下游邻近基因(RAP1B和MDM1)和Mψ细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的RNA表达水平没有变化,Mψ自噬通路的活化水平和清除MTB的能力也没有显著性差异。
  研究结论:
  本研究发现,H37Rv和H37Ra诱导Mψ的lncRNA和mRNA表达谱具有显著性差异;生物信息学分析了差异表达的mRNA所富集的功能和代谢通路的差异;初步验证了3个lncRNA--ENST00000360485、MIR3945HG V1和MIR3945HG V2作为结核病诊断标志物的可行性;并对ENST00000360485功能的初步探讨,为后续深入研究奠定了基础。
[硕士论文] 何健淳
免疫学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的,经由呼吸道传播的慢性传染病,是全世界单一病原引起死亡人数最多的疾病,致死率已经超过艾滋病。据报道,2015年新发结核病例有1040万,结核致死人数高达180万。因此,结核病对全球人类的健康威胁十分严峻,是亟待解决的全球性公共卫生问题。
  MTB是一种兼性细胞内寄生菌,入侵机体后主要寄居于宿主巨噬细胞(macrophage,Mψ)。作为结核感染的第一道防线,巨噬细胞表达多种模式识别受体,其中,TLRs是介导宿主对结核分枝杆菌的识别及抗结核免疫反应的关键分子。MTB通过TLR被Mψ识别后,一方面,Mψ可被诱导产生一系列促炎因子,构建炎性微环境,发挥抗菌效应;另一方面,促进杀菌的炎症反应同时也是导致病理损伤的机制。宿主无论是处于潜伏期还是活动期,结核病所表现出的核心病理特征均体现为过度失调的炎症反应。因此,对于MTB感染诱导的Mψ炎症反应的调控是控制结核病发展的重要环节。
  β-arrestin2是TLR/IL-1R信号下游至关重要的免疫激活负调节器,能调控MAPK、NF-κB等信号通路的效应,而MAPK通路是参与抗MTB天然免疫的TLR下游关键信号通路。ERK1/2作为MAPK家族的成员之一,介导多种影响MTB感染结局的效应,从而受到广泛关注。因此,本研究主要着眼于β-arrestin2对ERK1/2通路的调控。
  泛素化修饰对β-arrestin2调控信号通路的效应至关重要。已有多项研究发现,β-arrestin2泛素化是其发挥ERK1/2支架蛋白活性,介导受体内吞所必须的。然而,MTB感染Mψ中β-arrestin2泛素化修饰对TLR下游ERK1/2通路的调控尚未见报道。本课题首次探讨了这一问题,发现沉默E3泛素连接酶Mdm2的表达,可显著抑制卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)感染后β-arrestin2依赖的、ERK1/2调控的促炎细胞因子表达。可见,β-arrestin2泛素化与ERK1/2信号通路在结核感染中的效应息息相关。
  目的:
  本课题探究了β-arrestin2通过调控ERK1/2通路调节MTB感染Mψ的炎症免疫应答的效应与机制,并初步探讨了β-arrestin2泛素化在此过程中的调节作用。通过探究上述机制,有助于开发通过β-arrestin2精准调控MAPK通路的抗结核药物,对结核病防治具有重要意义。
  研究内容
  1.检测MTB对Mψ中β-arrestin2的表达调控效应,以及β-arrestin2对Mψ抑菌活性的调节作用;
  2.检测β-arrestin2对MTB感染的Mψ中炎症反应的调节作用;
  3.探讨β-arrestin2调节Mψ炎症反应及抑菌效应的分子机制。
  方法:
  1.检测MTB对Mψ中β-arrestin2的表达调控效应,以及β-arrestin2对Mψ抑菌活性的调节作用
  1)采用实时荧光定量PCR与Western blot,检测MTB感染Mψ中β-arrestin2的mRNA与蛋白表达水平;
  2)通过平板菌落计数实验,检测沉默β-arrestin2后MTB感染Mψ的抑菌活性。
  2.检测β-arrestin2对MTB感染的Mψ中炎症反应的调节作用
  采用实时荧光定量PCR与Luminex技术检测沉默β-arrestin2后MTB感染Mψ的促炎因子与抗炎因子表达。
  3.探讨β-arrestin2调节Mψ炎症反应及抑菌效应的分子机制
  1)U0126抑制ERK1/2通路后,实时荧光定量PCR检测β-arrestin2表达沉默对MTB感染Mψ促炎因子表达的调节效应;
  2)Western blot检测沉默β-arrestin2后MTB感染Mψ的ERK1/2通路活化;
  3)免疫荧光-激光扫描共聚焦显微镜观察MTB感染Mψ中,β-arrestin2与p-ERK1/2共定位与转位;
  4)免疫共沉淀检测MTB感染Mψ中β-arrestin2与ERK1/2通路蛋白的结合,以及β-arrestin2的泛素化修饰;
  5)实时荧光定量PCR检测Mdm2表达沉默对MTB感染Mψ的细胞因子表达调节。
  结果:
  1.β-arrestin2mRNA表达水平在感染后Mψ中先下调、后上升;相反,β-arrestin2蛋白表达水平逐渐提高,至感染后72h开始下调;β-arrestin2表达被沉默后,促进了Mψ的抑菌活性。
  2.沉默β-arrestin2表达后,BCG感染THP-1-Mψ的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平显著上升,而抗炎因子IL-10、TGF-β在THP-1-Mψ与原代Mψ的变化则存在不同。β-arrestin2对促炎因子表达的调节效应与其对Mψ抑菌活性的调节效应一致,提示其通过调节促炎因子表达而发挥调节Mψ抑菌活性的效应。
  3.抑制ERK1/2通路后,可逆转β-arrestin2表达沉默对促炎因子表达的促进效应。β-arrestin2表达沉默不改变BCG感染THP-1-Mψ中ERK1/2通路的活化水平,但内源性β-arrestin2可抑制p-ERK1/2的核转位。同时,BCG的感染能促进β-arrestin2与p-ERK1/2、p-TPL2的结合,使β-arrestin2泛素化水平增加。与此相一致,沉默E3泛素连接酶Mdm2表达与沉默β-arrestin2对促炎因子表达的调节效应相似。
  结论:
  β-arrestin2在MTB感染Mψ中表达上调,并参与调节MTB诱导的ERK1/2核转位,由此调控被感染Mψ炎症反应及抑菌活性;该过程中,β-arrestin2泛素化水平上调,抑制泛素化则增强ERK1/2通路的转录调控效应。
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