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[博士论文] 周贵龙
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:自交不亲和性是开花植物抑制自交、促进异交的自然现象,是杂种优势利用的重要途径。已有研究表明,花粉端SP11/SCR(S-locus protein11or S-locus Cys-rich protein)与柱头端SRK(S-locus receptor kinase)相互识别及SRK下游信号传导导致甘蓝型油菜自交不亲和性。本文研究芸薹属BnSCR1-BnSRK1-BnARC1自交不亲和信号通路在拟南芥中的保守性,自交不亲和系“W-3”的BnSCR1基因和BnSRK1基因启动子顺式作用元件及反式调控因子,为进一步揭示甘蓝型油菜自交不亲和机理、芸薹属自交不亲和信号路径奠定基础。主要结果如下。
  1.构建pORE_O4-BnSCR1+BnSRK1和pORE_O4-BnSCR1+BnSRK1+BnARC1两种过表达载体,分别导入Col-0和C24两种生态型拟南芥,获得Col-0和C24过表达BnSCR1+BnSRK1转基因植株21株和13株,Col-0和C24过表达BnSCR1+BnSRK1+BnARC1转基因植株12株和9株。通过授粉试验观察、角果长度和每角果粒数考察及外源基因表达检测,发现所有转基因植株自交亲和,说明在拟南芥Col-0和C24中,芸薹属自交不亲和信号通路BnSCR1-BnSRK1-BnARC1不起作用。
  2.克隆了BnSRK1基因2kb启动子序列;启动子分析表明,PR1-GUS(-1809~-1bp)和PR2-GUS(-1314~-1bp)能够驱动GUS基因在柱头中表达;启动子缺失分析结果表明,调控BnSRK1基因表达的关键调控区域位于-1314~1000bp。克隆了Ⅱ类S单倍型的BnSCR-1300基因翻译起始位点上游504bp启动子和BnSCR-6基因翻译起始位点上游416bp启动子,启动子分析表明60P-GUS(-504~-1bp)和15P-GUS(-416~-1bp)均能驱动GUS基因在转基因拟南芥花药发育的第9期至11期的绒毡层表达。
  3.通过酵母单杂交实验获得了与BnSCR1基因684bp启动子结合的转录因子BnPHL2α。两轮诱饵序列截短实验表明BnPHL2α与p16X-3-AbAi的16bp(TTTAATTTCTTGCATA)序列互作。亚细胞定位结果表明BnPHL2α定位在细胞核中。利用AH109酵母菌株没有检测到BnPHL2α的转录活性;通过BnPHL2α转录激活/抑制结构分析,发现BnPHL2α存在两个保守区域(位于136-185aa的MYB CC结构域、37-90aa的MYB DNA结合结构域)可能是该蛋白的抑制区域。双荧光素酶报告(Dual luciferase reporter,DLR)系统检测BnPHL2α基因对BnSCR1启动子P342活性表明,BnPHL2α基因抑制P342启动子的活性;P342启动子区域(-310至-295bp)序列(TTTAATTTCTTGCATA)的一系列突变实验表明,BnPHL2α对BnSCR1启动子P342活性调控的抑制位点位于-310至-295bp区域。EMSA实验验证,BnPHL2α蛋白能够与“TTTAATTTCTTGCATA”序列互作。利用CRISPR技术敲除“Westar”中BnPHL2α基因,获得了4株T0代阳性苗,测序分析阳性苗均为嵌合体突变的植株。
[硕士论文] 陶雨婷
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:根据从营养生长转向生殖生长的不同需求,甘蓝型油菜可以被分为三种生态型:冬性、半冬性和春性;其中冬性甘蓝型油菜主要分布在欧洲需要一个月以上的低温(小于4℃),我国主要种植的是半冬性和春性甘蓝型油菜,两者没有严格的界限,所以存在一些广适性品种。特定的地区只适宜特定生态型的生长,为了开发能检测不同生态型的标记,并为判定油菜适宜种植地区提供参考,本研究首先利用全基因组关联分析找到了与开花时间相关的位点,并结合已发表的标记,开发出了7个能为油菜生态型判定提供参考的PCR标记。主要试验结果如下:
  利用实验室收集的495份甘蓝型油菜自交系组成的自然群体,并结合先前提供的八个环境表型数据和郭亮老师课题组提供的基因型数据,我们成功检测到了166个与开花时间相关的SNP/InDel位点。其中,5个位点能在多个环境当中重复检测到,这些位点附近有拟南芥FLC、FRI、EMF2同源的油菜基因;另外,有21个由毗邻(物理距离小于150kb)的SNP组成的区段,其中也包括了许多与拟南芥开花基因同源的油菜基因。
  从495份甘蓝型油菜自交系材料中选出452份进行生态型分类,将全基因组关联分析得到的166个标记与前人研究中的标记转化成PCR标记,通过PCR检测找到能够区分冬性、半冬性、春性材料的标记,最终找到7个能够鉴定不同生态型的标记。其中,BnaA3-FRI-53-76和BnaA3-FRI-69-20分别有62%和46%的概率可以鉴定出冬油菜,BnaA3-FRI-53-78有92%的概率可以鉴定出冬油菜。7个标记根据关联到的基因不同分类组合形成不同的单倍型,位于在A3FRI上的标记BnaA3-FRI-53-76、BnaA3-FRI-69-20和BnaA3-FRI-53-78共构成5种单倍型,Hap000是最有可能检测出春性油菜的单倍型。标记Bn-A10-p15106056和标记BnvaAnn_random28331198分别位于FLC和CDF1附近,所以将这两个标记组合形成了4种单倍型。其中,Hap00检测出半冬性油菜的概率最大。
[硕士论文] 柳亮
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育系FM195AB是由宜3AB转育而来,其育性受复等位基因BnMS5控制。BnMS5的3个等位基因分别是BnMS5a(恢复基因)、BnMS5b(不育基因)和BnMS5c(正常可育或临保系基因),其显隐性关系为BnMS5a>BnMS5b>BnMS5c。通过细胞学观察发现造成FM195A雄性不育的原因是减数分裂停滞在减数分裂前期Ⅰ的细线期。辛强(2016)克隆了BnMS5基因,通过序列比对发现BnMS5只在芸薹属特异存在,是一个进化上新近产生的芸薹属特异的功能未知基因。为了进一步阐明BnMS5影响减数分裂的分子机制,本研究检测了近等基因系FM195R(纯合恢复系:BnMS5a BnMS5a)和FM195A(纯合不育系:BnMS5b BnMS5b)的雄蕊转录组,每个样品2个重复。通过比较分析得出如下主要结果:
  1.通过Illumina HiSeq-150平台进行测序产出Raw data共114G,过滤后的Cleandata共108G。通过Hisat2把过滤后clean reads比对到ZSll的参考基因组上,匹配率都在90%以上。比对到Exon(外显子)区域的clean reads占比也都达到90%以上。
  2.结合Ballgown与DEseq2的差异表达基因分析结果,发现在不育雄蕊中上调表达的基因有522个,下调表达基因有831个;在可育雄蕊中特异表达基因有1727个,在不育雄蕊中特异表达基因有1598个。
  3.通过Blast2GO对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。结果显示,BnMS5可能通过影响表达调控相关基因,进而影响了染色体和染色质形态、细胞周期调控过程、与细胞分裂有关的染色体运动过程,最终影响减数分裂。
  4.本研究分析了拟南芥中功能已知的影响减数分裂和雄性不育相关基因的差异表达,发现BnMS5调控了与染色体浓缩、重组解旋酶和拓扑异构酶相关基因的表达,进而影响了染色体形态建成,导致同源重组、联会、染色体配对等过程异常;BnMS5还调控细胞周期相关抑制因子、影响染色体运动和细胞分裂。BnMS5的功能缺失导致这些过程异常,致使减数分裂阻滞在了减Ⅰ细线期,间接引起绒毡层发育异常,最终导致FM195A雄性不育。
[硕士论文] 王卫芳
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:干旱是最常见的环境胁迫之一,是作物生产中最严重的限制因素。油菜是我国重要的油料作物,油菜的抗旱性在不同种质之间有较大差异。本试验通过PEG6000模拟干旱,采用504份油菜材料进行试验比较,从中筛选出10份抗性不同的材料,系统研究干旱胁迫对油菜苗期生长的影响,主要得到以下结论:
  (1)干旱胁迫不同程度的降低油菜地上部鲜重、地上部干重、根系干重和植株含水量,但是不同材料的降低幅度各不相同;不同抗性材料根系形态如主根长、总根长、根系表面积、根系体积、根系平均直径、根尖数对干旱胁迫的响应各不相同;干旱胁迫能提高不同抗性材料的根冠比。
  (2)对504份油菜材料进行抗旱性综合评价,油菜苗期各指标间的相关分析表明,抗旱隶属值U与地上部鲜重、地上部干重、根系干重、总干重、总根长、根系表面积、根系体积的相关系数r均达大于0.7;其中,与根系干重、根系表面积和根系体积的相关系数均达到0.8以上。结果表明,根系表型中根系表面积和根系体积表征油菜苗期抗旱性更强,可以作为抗旱材料筛选指标。
  (3)对504份油菜材料以抗旱隶属函数值U作为因变量,以各性状指标的抗旱系数作为自变量进行回归分析,结果表明:根系表型如根系干重、根系表面积及根系体积对抗旱隶属函数值U的变异解释率较高,均在70%以上,而地上部鲜重、地上部干重、总干重、总根长仅在50%左右。
  (4)相同长势的油菜材料,抗性强的材料具有更加发达的根系。干旱条件下,抗旱型材料根系形态如主根长、总根长、根系表面积、根系体积、根尖数表现为增加或降低不显著,而干旱敏感型材料的根系形态表现为显著或极显著降低。
  (5)基于抗旱系数的抗旱隶属函数值法对504份材料进行综合评价,筛选出强抗型材料33个,干旱敏感型材料13个。对不同抗性材料的形态指标进行综合分析,发现正常条件下干旱敏感型材料的地上部较大,而抗旱型材料地上部较小。干旱条件下,干旱敏感型材料的主根长、总根长、根系表面积、根系体积、根尖数下降,而根系平均直径上升;抗旱型材料主根长、总根长、根系表面积、根系体积、根尖数升高,而根系平均直径下降。
  (6)相关关系分析得出,干旱敏感型材料与抗旱隶属函数值相关性最强的是根尖数,而根尖数又与总根长、根系表面积极显著正相关;抗旱型材料与抗旱隶属函数值相关性最强的是根系表面积。
  (7)对不同抗性油菜材料抗旱性进行水培验证试验表明,抗性材料(61)脯氨酸、可溶性蛋白的积累及叶片丙二醛含量比敏感型材料(408)低。
  (8)对不同抗性油菜材料抗旱性进行盆栽验证表明,干旱胁迫能极显著降低油菜苗期光合作用,同一干旱胁迫下,抗旱性较强材料(61、404)的净光合速率、气孔导度及蒸腾速率比抗旱性较弱材料(141、408)大。
[硕士论文] 刘丹
药用植物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:茅苍术是一种广泛用于抗衰老、抗癌、抗炎、保肝利胆、抗溃疡等的中药材,野生茅苍术的过度采挖导致资源逐渐枯竭,人工种植就成为茅苍术药材来源的必然选择。由于茅苍术结实率低且种子存活率不高,人工种植中长期采用块茎作为种源进行无性繁殖,导致种质退化严重、病害大规模频发,急需筛选优良品系解决茅苍术规模化种植的现实问题。本研究利用自己开发的SSR分子标记,对81株茅苍术材料、5株白术材料进行遗传多样性分析,并构建了DNA指纹图谱;同时考察29份材料的表型数据、药用品质,构建化学指纹图谱。研究结果如下:
  1.筛选得到的239对SSR引物中共鉴定出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR标记83对,用于供试材料的遗传多态性分析。83对SSR引物共扩增出420个位点,其中多态性位点数408个,占97.14%。多态性信息含量PIC值、有效等位基因数Ne、Shannon's信息指数Ⅰ、观测杂合度Ho、期望杂合度He的平均值依次是0.43、2.27、0.92、0.36、0.47。说明引物具有较高的多态性,供试材料的遗传变异与杂合度较高,这对栽培及育种更加有利,可减少因品种退化对栽培种产量及品质的影响。其中引物PLD136有18个多态性位点,是多态性含量最高的引物;引物PLD150检测的杂合度是0,说明该引物扩增的位点在所有材料中具有保守性。
  2.基于SSR分子标记的聚类分析,以遗传距离是0.63处为阈值,可将茅苍术与白术分为两个亚群。在遗传距离为0.59时,可将81株茅苍术分为两个亚群。第Ⅰ亚群中有71株,包括大部分材料;第Ⅱ亚群包含两个保康Ⅰ的材料ByⅠa1、ByⅠa2和8株英山的材料。第1个大群在遗传距离是0.49时可分为4个亚群,亚群i包括所有京山、保康Ⅱ和6份保康Ⅰ的材料,亚群ii只有1株保康Ⅰ的材料ByⅠc3,亚群iii只有13株英山材料,亚群iv只有一株保康Ⅲ的材料Bb1;第Ⅱ个大群可在遗传距离为0.56时分为两个亚群,亚群v只有一株保康Ⅰ的材料,亚群vi包含一株保康Ⅰ的材料ByⅠa2和8株英山材料。聚类结果显示,京山材料的遗传距离最接近,同时聚在了亚群i中,保康Ⅰ材料的遗传信息最丰富,聚类情况最复杂。结合分子标记主坐标分析结果,发现聚类分析与主坐标分析结果相同。群体结构分析验证,表明本研究中白术群体的遗传背景单一,保康Ⅰ的遗传背景复杂。
  3.对不同居群材料进行群体结构遗传分析,发现遗传变异来源于群体内,不是群体间。基因流Nm=1.597,说明京山、保康、英山茅苍术居群间可以进行正常的基因交流,地理隔离不是阻碍基因交流的因素。茅苍术居群间的Nei's遗传距离(GD)小于0.1771,遗传一致度(GI)均大于0.8377,说明茅苍术群体间的遗传相似性较高,变异来源于群体内。居群间的聚类分析结果显示,白术与茅苍术之间遗传基础相差较大,但在茅苍术居群间差异较小,也验证了遗传变异来自群体内,而不是群体间。
  4.对供试材料的表型数据与药用品质数据进行相关性分析与聚类分析,发现茎粗与株高和折干率、株高与上部分枝数之间都表现出极显著正相关(P<0.01);油室面积与根茎总面积的比值(Q)与苍术素含量之间呈显著负相关(P<0.05);β-桉叶醇含量与醚浸出物含量之间呈极显著正相关。
  5.基于供试材料建立的HPLC化学指纹图谱,比较化学指纹图谱相似度并分析共有峰峰面积量化后的聚类结果,发现供试材料指纹图谱相似度在0.80-1.00之间,说明不同居群茅苍术材料的化学组成成分差异较大;白术与茅苍术的相似度达到0.89,说明茅苍术与白术相似度较高。白术单独聚为一个群,所有的茅苍术材料聚为一个群,与SSR标记的聚类结果一致。
[博士论文] 易丽聪
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:开花是受多个基因控制的数量性状,适时开花有利于植物躲避不利外界环境并顺利繁殖后代;对于农作物而言,适时开花是获得稳定产量的前提条件。甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物,具有重要的经济价值。按照其开花对春化的需求甘蓝型油菜被分为三种生态型:春油菜、半冬性油菜和冬油菜。QTL定位结合与拟南芥的比较基因组分析在油菜基因组中检测到大量控制开花的主效QTL位点和候选基因。尽管如此,甘蓝型油菜的开花调控机制还尚未清楚:1)主效开花QTL缺乏深入的分子机理解析;2)多数易受环境影响的微效QTL位点很少被检测更缺乏分子水平的研究;3)开花QTL/基因间的互作缺乏研究。
  为了进一步揭示甘蓝型油菜的开花调控,本研究分析了开花主效基因BnaA3.FRI与油菜生态型和适应性之间的关系,并深入解析了BnaA3.FRI调控开花的分子机制。此外,实验室前期利用早花亲本No.2127为供体亲本,晚花亲本中油821(ZY821)为轮回亲本,构建了染色体片段代换系。本研究利用已构建的代换系,通过连锁分析在A2染色体上定位到一个调控油菜开花的微效QTL位点。主要结果如下:
  1.甘蓝型油菜开花调控因子BnaA3.FRI的功能分析
  FRI是决定拟南芥开花和生态型的关键基因,通过激活开花抑制基因FLC的表达来抑制开花。甘蓝型油菜共包含四个FRI同源基因:BnaA3.FRI、BnaA10.FRI、BnaC3.FRI和BnaC9.FRI,连锁分析和关联分析同时表明BnaA3.FRI变异与油菜的冬春性分化和开花调控相关。本研究对5份冬油菜和5份春油菜的4个FRI拷贝进行测序分析发现其中三个拷贝BnaA3.FRI、BnaA10.FRI、BnaC3.FRI包含丰富的遗传变异,其中在BnaA3.FRI的ATG上游200bp和2.2Kb的基因区范围内共检测到30个多态性位点、在BnaA10.FRI和BnaC3.FRI基因区分别检测到30和50个多态性位点,而BnaC9.FRI这个拷贝的序列高度保守,没有检测到多态性位点。进一步利用InDel标记分别检测17份冬油菜中BnaA3.FRI、BnaA10.FRI、BnaC3.FRI的单倍型发现,所有的冬油菜都包含相同的BnaA3.FRI单倍型,但包含不同的BnaA10.FRI和BnaC3.FRI的单倍型。
  随后对另外20份不同生态型油菜中BnaA3.FRI进行测序分析,最终在BnaA3.FRIATG上游200bp和2.2Kb的基因区共检测到33个多态性位点,包含5个InDel(两个InDel位于ATG上游)和28个SNP(全部位于基因区,其中16个SNP导致氨基酸序列缺失/突变)。这些多态性位点共构成了9种单倍型(其中包含3种主要单倍型hap1、hap2和hap8,分别出现10次、8次和5次)。将其中三个InDel开发为分子标记并对174份甘蓝型油菜品系进行BnaA3.FRI单倍型分析(marker-based haplotype,mHAP),共检测到三种主要单倍型:mHAP1(22.4%)、mHAP2(60.3%)和mHAP3(15.5%)。对不同生态型油菜的BnaA3.FRI基因型组成分析发现:冬油菜中mHAP1基因型的频率(17/17,100%)显著高于半冬性油菜和春油菜中mHAP1的频率(分别为8/118,6.8%和15/39,38.5%)。同时,对不同地区油菜的BnaA3.FRI基因型组成分析发现:亚洲地区油菜中mHAP1的频率(5/108,4.6%)和mHAP3基因型的频率(11/108,10.2%)显著低于mHAP2(90/108,83.3%);与之相反,欧洲地区的油菜中mHAP1的频率高达58.5%(24/41)。这些结果表明BnaA3.FRI基因型与油菜的生态型和地区适应性相关。
  分别对半冬性和春油菜中不同单倍型油菜的开花期进行比较发现,不同BnaA3.FRI单倍型的开花期存在显著性差异。进一步对BnaA3.FRI的hap1和hap2两种单倍型进行转基因功能互补验证发现:hap1和hap2都能激活拟南芥FLC的表达并推迟开花,但hap1的推迟开花的功能明显比hap2强。为了进一步分析BnaA3.FRI序列变异对其表达和功能的影响,我们利用hap1启动子驱动其他3种BnaA3.FRI单倍型表达(hap2,hap3和hap8),同时又用hap2的启动子驱动hap1表达。通过转化拟南芥进行功能比较发现:在替换启动子之后,hap1依旧可以显著激活拟南芥FLC表达并推迟开花;而hap2,hap3和hap8虽然可以推迟开花但功能明显比hap1弱。这些结果表明BnaA3.FRI基因区序列变异导致其功能弱化,并由此调控开花期变异。
  2.基于染色体片段代换系的花期QTL定位
  实验室之前通过构建全基因组染色体片段代换系(CSSL)得到多个表现为早花的家系,对BC4F1代进行前景选择和背景选择得到3个表现为早花的A2染色体片段代换系:3W066、3W071和3W081。3个株系的F2群体的平均开花期分别为:145.7±18.3天、84.3±34.14天和136.8±29.27天,都显著早于晚花亲本ZY821当年的花期(161.7±4.34天)。我们选择株系3W066(遗传背景恢复率为94.75%)进行后续的开花QTL定位,并利用16个SSR和InDel标记重新构建了A2染色体导入区段的遗传连锁图。分别在WH2011(2011/2012,半冬性环境)和GS2012(2012,春环境)中考察BC4F3和BC4F4群体的开花期,结合单株的基因型数据我们在两个环境中各检测到2个QTL位点:其中WH2011环境下qFTA2.1a和qFTA2.1b分别解释开花期变异的25.4%和49.1%;GS2012环境下qFTA2.2a和qFTA2.2b分别解释开花期变异的13.1%和3.7%。
  在半冬性环境下连续三年(WH2011、WH2012和WH2013)对BC4F3、BC4F4和BC4F5群体的基因型和表型进行分析,最终将qFTA2.1a定位在标记KH77和KH78之间,对应于甘蓝型油菜参考基因组245Kb的范围,该区段包含一个重要的开花基因BnaFT.A2。此外,利用精细定位过程中检测到的交换单株进行自交,共得到3种包含不同导入片段的近等基因系:NIL-1、NIL-2和NIL-3(NIL-1包含的片段最长并涵盖NIL-2和NIL-3中的导入片段,NIL-2包含qFTA2.1a和qFTA2.1b两个位点,NIL-3只包含qFTA2.1a位点)。这3个导入系和ZY821在2013/2014(WH2013)环境下的开花期分别为66.5±11天、140±8.94天、156.3±7.18天和163.1±2.03天;说明A2染色体导入片段包含两个以上开花调控位点且位点之间具有加性效应,而我们分离的qFTA2.1a只是其中一个微效QTL位点。
[硕士论文] 何菲菲
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:通过远缘杂交可以研究物种间的亲缘和进化关系、还可创建新的种质资源。西洋菜(Nasturtium officinaleR.Br.,别名豆瓣菜)为芸薹科(Brassicaceae)豆瓣菜属的多年生水生草本植物,可药用与食用,为油菜耐渍性改良的优异资源。本论文进行了甘蓝型油菜(Brassica napusL.)与西洋菜的族间有性杂交,并对杂种及其后代进行了形态学、细胞学、分子生物学和脂肪酸组分分析,研究结果如下:
  1.杂种及其后代的形态学
  以三个不同来源的甘蓝型油菜材料为母本、西洋菜为父本,进行大量人工去雄授粉后结合幼胚培养,获得6株表现一些父本性状的Fl杂种植株(F1-NSA、F1-2、F1-19、F1-32、F1-33、F1-209),与母本相比它们的株型都偏矮小、花也明显变小,花粉育性范围在51.5%-80.0%,平均值65.9%。杂种F1-NSA产生的后代中出现雄蕊不育的花,盛花期不育花比例可达83.0%,同时还有花瓣数量变异的植株,其中5瓣的居多,最多可达7瓣,且雄蕊不育和花瓣数量随时间和环境发生改变;后代中89.7%的植株育性高于杂种。杂种F1-32自交后代出现表型分化,株高和花体积变异大,有的植株柱头先露十分严重、且只有4枚雄蕊。杂种F1-209的自交后代保留叶脉、茎秆、角果紫红色性状;一半以上的F3植株花瓣出现触须状或片状突起,同时还有多花瓣或少于4瓣的性状。
  2.杂种及其后代的细胞学
  根据统计的体细胞染色体数目将6株杂种分为三类:第一类2n=32-38,第二类2n=29,第三类2n=25-29。观察了6株杂种终变期花粉母细胞(PMCs)的染色体配对及后期Ⅰ的分离情况,第一类以19Ⅱ配对及19∶19分离为主,第二类和第三类有多种配对构型,但以15∶14分离为主。这些杂种减数分裂后期Ⅰ、ⅡPMCs中均出现异常分裂,其比例与花粉育性相关。主要对杂种F1-NSA后代进行细胞学分析,统计的10株NSA-F2代的体细胞染色体数目范围在32-38条,与杂种F1-NSA相同,且均为混倍体;在NSA-F2代的PMCs中染色体主要配对成19Ⅱ(46.2%),以19∶19、19∶18、19∶17三种分离方式为主(70.4%)。
  3.杂种及其后代的AFLP分析
  AFLP分析表明,在6株杂种中除母本带型外均扩增出3种特异的多态性条带:父本西洋菜特异带、相对于双亲的新增带和母本油菜的缺失带,新增带比例最高,平均比例为6.4%(35.7条),缺失带平均比例为2.6%(14.5条),特异带所占比例最低,平均比例为1.4%(7.8条)。杂种F1-2、F1-19、F1-32、F1-33有大量相同的多态性条带,特别是新增带。在10株F1-NSA的自交(8株)和回交(2株)后代中均扩增出3种多态性条带,且每对引物都能扩增出10株杂种共有的多态性条带,相同特异带为20条(占共有的76条多态性条带比例为26.3%)、相同新增带达47条(61.8%)、相同缺失带9条(11.8%)。
  4.杂种及其后代的脂肪酸组分
  西洋菜的芥酸(21.49%)及二十碳烯酸含量显著比油菜亲本的高。检测的两个杂种F1-NSA、F1-209自交及回交后代的脂肪酸组分与油菜亲本的相似,没有明显的变化。
  综合上述结果,本研究获得的甘蓝型油菜与西洋菜的族间有性杂种为非预期杂种,即不含有双亲配子染色体之和的染色体数及组成;这可能是由于在杂种胚与植株的发育过程中发生了父本染色体的部分消除,只保留了少量的染色体与片段,并且有染色体片段整合到甘蓝型油菜染色体上。由此,不同的杂种植株具有不同的染色体数及遗传组成,表现不同程度的父本特性;经自交与回交后,快速选育到育性较好的甘蓝型油菜渗入系。
[硕士论文] 刘欣欣
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:棉花既是重要的纤维作物,也是重要的油料作物。陆地棉棉籽的含油量十分丰富,在20%-40%之间。我国的食用油短缺,多数依赖进口,提高棉籽油的产量可以缓解这一问题。脂肪酸是生物膜的重要组成成分,因此脂肪酸对于生物体具有十分重要的意义。根据脂肪酸的合成路径,发现KASI是催化脂肪酸合成十分重要的酶。KASI主要催化C4-ACP生成C16-ACP的过程。本研究利用候选基因关联分析成功关联到陆地棉中与棉籽含油量相关的基因GhA05KASI,为提高棉花棉籽含油量提供了理论基础。
  本研究的主要结果如下:
  1.结合陆地棉503份自然种质材料和8个环境中的表型数据在TASSEL2.1中基于一般线性模型检测到1个标记与目标性状相关,该标记为GrKASI-3705。该标记与8个环境的陆地棉自然群体含油量性状都存在显著关联,解释率在7.46%-18.38%之间,平均解释率为14.23%。该标记对应的基因为雷蒙德氏棉中预测的KASI基因;
  2.将雷蒙德氏棉中KASI基因的序列比对到陆地棉基因组中,我们得到6个拷贝基因,分别位于A05、D05、A06、D06、A09和D09染色体上。针对这6个候选基因设计特异性引物,结合陆地棉表型数据在TASSEL2.1软件中基于一般线性模型检测到GhA05KASI-3705标记与目标性状相关,该标记位于A05染色体,与标记GrKASI-3705的关联结果一致;
  3.对GhA05KASI进行RT-PCR和qRT-PCR分析。结果发现高油材料和低油材料在30DPA时期存在显著差异,在低油材料中目的基因的表达模式与表达谱一致。对GhA05KASI的蛋白质序列进行预测,发现两个与酮脂酰相关的保守结构域;
  4.对GhA05KASI进行重测序,共测序10份陆地棉极端材料,其中包括5份低油材料和5份高油材料。结果在内含子区域和3'UTR区域各发现一个突变位点,启动子区域发现10处突变,尤其是位于起始密码子上游784bp位置处存在一处11bp的缺失,这11bp缺失位点包含一个ATTAAT的作用元件,该元件参与植物对光的响应反应。针对这些突变位点设计引物,结合陆地棉群体含油量表型进行关联分析,发现3处突变位点与8个环境中陆地棉自然群体含油量表型都显著相关,分别是位于内含子区域的突变,位于3'UTR区域的突变和启动子11bp的缺失;
  5.构建转基因载体。本实验构建了超表达载体、启动子GUS载体和Crispr载体对GhA05KASI进行后期验证。
[硕士论文] 赵丽
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:油菜生产中,产量、抗倒性表现优良品种所具有的特征对后期选育新品种有重要借鉴意义。本试验于2015-2017年采取多点试验方法,选用20个品种,在长江流域(武汉、黄冈、武穴、南昌、昆明、成都、南京)生态区种植,筛选出不同类型品种,同时研究与品种相关的关键农艺性状,探索气象因子(日照时数、温度、有效积温、太阳辐射量、降雨量等)与产量、倒伏关系。
  1.高产适应性强与低产适应性弱油菜产量均受到地上生物量、单株角果数影响,限制低产适应性弱油菜产量提高的因素同时有根茎粗、分枝数,故选育高产品种时,可优先考虑增加植株单株角果数、地上生物量,在保证较大单株角果数、地上生物量基础上,增加植株分枝数、根茎粗。茎秆生化成分中,油菜低产适应性弱特性受茎秆中纤维素、木质素含量的影响,高产适应性强特性与纤维素、木质素无明显相关性,当油菜茎秆中纤维素含量较多,木质素含量较少,有助于提高低产适应性弱品种的产量。低产适应性弱品种产量易受到环境因子的影响,影响地上生物量关键气象因子为太阳辐射量、降雨量、日均温差,其中降雨量为影响地上生物量的关键指标(Y=55.5187+1.4873X1-1.6843X3-3.1133X4,R2=0.7403,其中Y、X1、X3,X4分别代表地上生物量、苗期、花期、角果期降雨量),苗期降雨量较多,花期、角果期降雨量较少,有利于地上生物量的提高;影响单株角果数的关键气象因子为太阳辐射量、日照时数、平均温度,其中日照时数为影响单株角果数的主要指标(Y=-107.4756-41.0334X1+51.4413X4+57.3412X5,R2=0.7974,其中Y、X1、X4、X5分别代表单株角果数、苗期、角果期、全生育期日照时数),苗期日照时数相对较少,角果期、全生育期日照时数相对较多,有利于增加油菜产量。
  2.高抗适应性强品种与低抗适应性弱品种影响抗倒性主要因素为抗折力,限制低抗适应性弱品种抗倒性增强的因素同时有分枝高、株高,故选育高抗品种,可优先考虑增强植株茎秆抗折力,在保证植株较大茎秆抗折力基础上,降低植株分枝高、株高。茎秆生化成分中,高抗适应性强品种与低抗适应性弱品种均受到茎秆中纤维素含量影响,低抗适应性弱品种倒伏指数同时受到茎秆中木质素含量的影响,故增强低抗适应性弱品种抗倒伏能力可首先增加植株茎秆纤维素含量,其次考虑木质素含量的增加。低抗适应性弱品种倒伏性状易受到环境因子的影响,影响分枝高关键气象因子为日均温差、太阳辐射量、日照时数,最关键影响因子为日温差(Y=192.0558-5.2729X2-7.8765X3,R2=0.8271,其中Y、X2、X3分别代表分枝高、薹期、花期日温差),薹期、花期较大日温差有利于增加植株抗倒性;低产适应性弱品种株高主要受到太阳辐射量、日照时数、降雨量的影响,最关键影响因子为降雨量(Y=130.0967+8.3776X1+15.4994X2+9.8460X5,R2=0.8616,其中Y、X1、X2、X5分别代表株高、苗期、薹期、全生育期降雨量),苗期、薹期、全生育期降雨量不宜过多。
  3.品种中影响产量最关键指标为单株角果数;影响倒伏最关键指标为抗折力,故单株角果数177.8个-209.2个可作为长江流域高产且生态适应性好的品种选择的指标,抗折力99.1N-121.8N可作为长江流域高抗且生态适应性好的品种选择的指标。抗折力、纤维素可作为协调产量、抗倒性的综合指标,油菜茎秆抗折力较大、纤维素含量较多,则产量较高,抗倒性较强,适宜的抗折力在99.1N-121.8N,纤维素含量在24.67%-30.11%。
[博士论文] 王转茸
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:菌核病是由核盘菌引起的一种严重威胁油菜产量和品质性状的真菌性病害。核盘菌通过向寄主植物分泌细胞壁降解酶CWDEs、多聚半乳糖醛酸酶PGs和病原菌相关的分子PAMPs等与寄主植物建立侵染关系。为了抵御病原菌的侵染,植物进化出一类多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIPs来抑制PGs的活性。本研究在甘蓝型油菜7-5(低抗)、P61-5(高感)和T45(高感)材料中超表达水稻的OsPGIP2基因,通过分子鉴定和抗性鉴定筛选出了16个菌核病抗性显著提高的T1代转基因家系,之后继续对转基因家系的T2、T3和T4代进行分子鉴定、菌核病抗性鉴定、种子品质性状和千粒重的考察,最终获得了菌核病抗性显著改良且遗传稳定的转基因油菜种质资源。此外,利用RNA-seq技术分析了转基因和非转基因家系核盘菌侵染后的差异表达基因,提出转基因甘蓝型油菜中由OsPGIP2介导的抗病调控网络。主要研究结果如下:
  1.转基因家系中OsPGIP2的拷贝数鉴定和表达量分析
  对16个转基因家系进行Southern blot检测,确定7-5B、7-5C、7-5D、7-5G、7-5H、7-5J、T45B#1、T45B#2和T45C为单拷贝插入植株,7-5A、P61-5A、P61-5B#1和P61-5B#2为双拷贝插入植株,7-5M含有5个拷贝。qPCR检测发现,在不同转化事件的转基因家系中,OsPGIP2基因的表达水平存在较大差异;在同一转化事件中,OsPGIP2基因的表达量无显著性差异;在含有5个拷贝的7-5M家系中,OsPGIP2基因的表达量最低。同时,T2和T3代抗病性鉴定显示,除了7-5M家系,其它转基因家系菌核病抗性与非转基因对照相比都提到了显著提高。这些结果表明OsPGIP2基因已成功整合到甘蓝型油菜基因组中,OsPGIP2基因的低拷贝插入事件能够增加甘蓝型油菜的抗病性,而多拷贝插入事件易导致目的基因沉默。
  2.OsPGIP2转基因家系的抗病性鉴定与种子千粒重和品质性状分析
  T4代转基因家系离体叶片接菌72hpi的菌斑面积都显著小于非转基因家系;喷菌丝存活率实验显示转基因家系具有良好的苗期抗性;成株期模拟极端疾病压力实验证明转基因家系的发病率低于非转基因家系;在离体茎秆接菌和田间茎秆接菌实验中,转基因家系菌斑长度都显著小于非转基因家系。成株期接种核盘菌后,转基因家系种子中芥酸和蛋白质的含量与非转基因家系相比无显著差异,而转基因家系种子千粒重和含油量都显著高于非转基因家系。以上结论证明,转化OsPGIP2基因能够改良甘蓝型油菜7-5、T45和P61-5的苗期和成株期菌核病抗性,同时能够保证种子的千粒重和品质性状更少的受到菌核病影响。
  3.解析OsPGIP2介导的防卫反应途径
  RNA-seq结果显示,OsPGIP2介导的抗病反应主要依赖于调节与RLKs(receptor-like kinases)、细胞内钙和离子转运、过氧化物产生和H2O2清除相关基因、JA/ET及生长素、转录因子、疾病防卫反应相关基因、细胞壁重建、CYP/GSH/Histone、碳源代谢和转运等相关的植物先天免疫反应路径。DAB staining和qPCR结果显示,OsPGIP2转基因家系中H2O2的积累和氧化还原反应相关基因的表达都显著高于非转基因家系。OsPGIP2转基因家系茎秆细胞壁单糖含量的测定结果显示,油菜茎秆中阿拉伯糖、木糖、纤维素、甘露糖和木质素的含量随花期的发展逐渐增加,在终花期OsPGIP2转基因家系的纤维素、半纤维素和甘露糖的含量都显著高于非转基因家系,说明转入OsPGIP2可能影响细胞壁糖类组成相关途径来提高油菜的菌核病抗性。
  4.SsPGs和OsPGIP2互作分析
  油菜叶片提取物培养核盘菌发现,核盘菌在加入OsPGIP2转基因叶片提取物的培养基上生长显著延缓,菌丝排布紧密,而对照中核盘菌生长快,菌丝排列松散。qPCR检测接菌茎秆中的核盘菌致病基因SsPGs的表达量显示,OsPGIP2转基因家系中SsPGs的表达显著低于对照。比较OsPGIP2与核盘菌PGs之间互作的亲和性发现,OsPGIP2与SsPG3和SsPG6的亲和性高于OsPGIP2与SsPG1和SsPG5的亲和性。利用Splite luciferase(LUC)互作实验进一步证实OsPGIP2能够与SsPG3和SsPG6互作,而不与SsPG1和SsPG5互作。
  综上所述,在油菜中超表达OsPGIP2能显著增强甘蓝型油菜的苗期和成株期菌核病抗性,而不损害种子的千粒重和品质性状。OsPGIP2转基因家系的叶提取物能延迟病原菌侵染,从而增强其对核盘菌的抗性。组成型表达OsPGIP2可增加活性氧的产生,提高茎秆细胞壁纤维素、半纤维素和甘露醇的含量,并影响油菜先天免疫反应相关基因的表达。同时,OsPGIP2蛋白能与核盘菌SsPG3和SsPG6发生互作,表明OsPGIP2在转基因甘蓝型油菜防卫反应机制中起着重要作用。
[硕士论文] 金诚
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物油脂不仅为人体提供能量与营养,也是重要的工业原料。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国第一大油料作物,菜籽油是我国食用油的主要来源之一。近年来,食用植物油消费总量不断提高,提高油菜种子含油量是保障我国食用植物油供需平衡的关键因素。了解油菜种子油脂合成调控机制可以为油菜高油育种提供理论支持。
  本研究从500余份油菜种质资源挑选出2个“双低”油菜材料中双11号(ZS11,高含油量)和WH5557(低含油量)并利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)测定了不同发育阶段种子的脂肪酸含量及组成。结果表明,ZS11与WH5557成熟种子的含油量和脂肪酸组成具有明显差异,并且在种子发育过程中ZS11油脂积累速度显著快于WH5557。
  利用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术(MALDI-MSI)分析了成熟种子不同组织(外子叶、内子叶与胚根)中三酰甘油(TAG)与磷脂酰胆碱(PC)的含量与组成。结果显示,不同组织之间的TAG与PC的含量与组成存在显著差异,脂质分布具有空间分布差异性。同时通过电喷雾质谱串联质谱(ESI-MS/MS)分析了种子中的TAG及PC各组成成分的mol%,此结果与MALDI-MSI的结果总体一致,表明MALDI-MSI结果是可靠的。在显微镜下分离成熟种子的外子叶、内子叶及胚根并提取脂质,利用液相色谱电喷雾质谱串联质谱(LC-ESI-MS/MS)检测了种子各组织的脂质含量及组成成分。结果表明,不同组织中脂质含量与组成具有显著差异。此结果与MALDI-MSI结果一致,进一步验证了MALDI-MSI结果的可靠性。
  收集发育34天的种子,提取种子不同组织的RNA并进行转录组测序。转录组数据表明,糖酵解、脂肪酸从头合成、TAG合成、脂滴形成等油脂代谢途径中多个关键基因的表达量均存在差异。以上结果表明,油脂合成过程中的关键基因的表达水平对不同种类脂质的空间分布起着一定的作用。而2个材料中蛋白质、可溶性糖及淀粉含量的差异则暗示了WH5557种子中的碳更倾向于积累到碳水化合物中,这可能是造成其含油量低的原因之一。
  此外,为了更高效地分析油菜脂质代谢物,实现高通量脂质组分析,我们开发并建立了基于高分辨质谱UPLC-TripleTOF的脂质组高通量分析方法。相比于传统的脂质组分析方法,此方法具有高效、快速、样品需求量少和准确度高等特点。基于此方法,我们分析了ZS11的根、茎、叶、叶柄及发育中的种子的脂质含量及组成成分。结果表明,基于UPLC-TripleTOF的脂质组分析方法重复性良好,可以对甘油酯、磷脂和糖脂等13类脂(总计146个脂质分子)进行准确地定性与定量。油菜中不同器官及不同发育阶段种子的脂质组的测定为脂质组学的研究提供了参考依据。基于UPLC-TripleTOF的脂质组学分析方法可成为高通量脂质组分析的重要手段。
[博士论文] 黄聪
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:陆地棉为世界纺织业提供了最多的天然纤维,是我国最重要的经济作物之一。生育期、株型、产量和纤维品质等是陆地棉重要的农艺性状,关乎到棉花的经济价值和生产方式。这些性状为复杂的数量性状,受到微效多基因的控制,通过传统的育种方法很难改良。解析这些性状的遗传基础对实现高效的陆地棉分子育种具有重要意义。
  关联分析作为近年来发展起来的一种检测QTL的高效手段,被得到广泛应用。本研究主要基于两个群体关联分析解析陆地棉生育期、株型、产量和纤维品质性状的遗传基础。
  1基于503份种质资源全基因组关联分析解析陆地棉重要农艺性状的遗传基础
  本研究广泛收集了中国国内的503份陆地棉种质资源,这些种质资源主要包括国内的5个主要棉区的栽培品种以及美国和前苏联引进的品种。利用CottonSNP63K芯片以及一张己发表的基于该芯片构建的高密度遗传图谱对503份材料进行基因分型,筛选获得了11975个高质量的多态性SNP。群体的多态性系数和遗传多样性系数均值分别为0.332和0.391。通过估算群体的连锁不平衡水平,发现LD衰减距离为6.1cM(r2=0.1)。经过STRUCTURE模拟、PCA分析和绘制N-J进化树,将503种质资源划分成了3个明显的亚群。考察获取了503份种质材料8个环境共16个重要农艺性状的表型值。利用11975个SNP标记和BLUP后的表型值,选择能够很好地控制假阳性的混合线性模型MLM(Q+K)进行全基因组关联分析。16性状共检测到324个显著关联的SNPs,解释率范围为3.17%-9.04%。参考LD衰减距离将324个显著关联到的SNPs划分为160个QTLs,其中有7个QTLs在最近的研究中被报道。有28个QTL区间和11个处于连锁的QTLs与多个性状关联,表现出位点或基因的多效性,通过绘制QTL网络图展示了性状与QTL之间的网络联系。此外,参考基因组织表达信息和已报道基因的功能,分别筛选出了336和18个可能的候选基因。在一个LD衰减较快的位点上,鉴定到了一个可能跟LP相关的候选基因(Gh_D08G2376)。
  2基于8亲本MAGIC群体的关联分析解析陆地棉重要性状的遗传基础
  构建了一个8亲本的陆地棉MAGIC群体,群体大小为960个株系(MLs)。MAGIC群体及亲本在2013-2015年共进行了5个环境的表型实验,考察了14个重要农艺性状。性状的的遗传力在PMs和MLs中的变化范围分别为0.11-0.87和0.17-0.85。比较表型的变异范围,发现单环境和BLUP的表型值中,MLs的变异范围都高于PMs,说明MLs比PMs的表型变异更丰富。
  在研究前期,利用PMs从本实验室发表的高密度的陆地棉-海岛棉遗传图谱上筛选获得284个高质量且多态性好的SSR标记。基于284个SSR标记对MLs进行基因分型。SSR标记遗传多样性系数在PMs和MLs中的平均表现为0.415和0.463,MLs的遗传变异比亲本丰富。此外,通过PCA分析发现MAGIC群体没有明显的群体结构。估算MAGIC群体的LD水平,衰减距离为0.76cM(r2=0.1)。利用忽略群体结构干扰的混合线性模型MLM(K)将14个性状BLUP的值与SSR标记关联,在p<0.01水平上检测到139个显著关联的SSR标记。显著位点的解释率范围为0.71%-7.23%。139个位点覆盖了96个SSR标记,有40个标记在前人的研究中被报道,6个被报道的结果与本研究结果一致。另外有26个SSR标记同时关联到多个性状,表现出位点多效性。此外,我们发现了9个热点位点,这对后续的遗传研究和指导育种具有非常重要的价值。
  为了深度对MAGIC群体进行基因分型,基于表型和219对SSR标记挑选出了一个较小的MAGIC群体(SMLs),群体包含372株系。在2016年增加了一个地点的SMLs的表型试验。利用SLAF-seq技术对PMs和SMLs进行基因分型获得60495个SNPs。估算SMLs的连锁不平衡水平,当r2衰减到0.1时,LD衰减距离为600kb。利用SNP基因分型数据和SMLs的表型数据进行全基因组关联分析。14个性状6个单环境和BLUP的表型数据共检测到975个显著关联的SNP,覆盖400个QTLs,对表型变异的解释率范围为5.08%-53.80%,平均值为11.01%。其中有30个QTLs在多个环境中被检测到,另外有88个QTL区表现出位点多效性。参考组织表达模式数据库,在144QTL区间内筛选到了271个相关组织特异表达的基因,此外鉴定到18个功能已知的基因位于相关性状的QTL区间内,这些基因可以作为候选基因。
[硕士论文] 刘红玲
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:棉花是世界上极其重要的油料作物和纤维作物。在整个生长周期中,棉花会遭受各种各样昆虫的为害,严重影响棉花的品质和产量。在棉花和昆虫长期的博弈中,棉花形成了复杂的防御体系来应对昆虫的袭击。昆虫取食植物时,植物会产生伤口(Wounds),同时植物也可以感知昆虫口腔分泌物(OS),进而产生防御响应。本研究中,对棉花进行机械损伤后,在机械伤口处滴加昆虫口腔分泌物(W+OS)和水(W+W),比较在OS是否存在的情况下,植物转录水平上的差异,来探究OS在植物响应昆虫中的作用。从转录组获得的差异表达基因中选取9个,利用CRISPR-Cas9技术进行基因敲除,且对其中的LOX基因进行基因家族进化分析,本研究主要结果如下:
  1.对发生机械损伤和昆虫口腔分泌物处理的棉花进行比较转录组分析
  对转录组测序得到的reads进行过滤、拼接、组装和样品间基因差异表达分析。在这两种口腔分泌物处理的样品中,下调表达的基因数量均多于上调表达的基因数量。GO(Gene Ontology)富集分析中,差异表达基因主要富集于“酶的催化活性”、“转运蛋白”、“转录调节因子”和“对刺激的响应”等类别。W+OS和W+W处理的样品中,茉莉酸(JA)和茉莉酸-异亮氨酸(JA-Ile)的含量随着时间的推移均升高,但是W+OS处理的植物中,JA和JA-Ile含量比W+W高1倍多。两种口腔分泌物处理的共同差异基因主要富集在“倍半萜和三萜生物合成”、“苯丙烷代谢”和“类黄酮生物合成”等抗虫代谢路径。这些结果意味着,由于鳞翅目昆虫口腔分泌物的存在,棉花调整体内基因的表达,以应对昆虫的继续危害,并且印证了口腔分泌物在棉花-昆虫互作中起着重要的作用。
  2.基因的遗传转化和LOX基因家族的全基因组鉴定和进化分析
  由棉花与鳞翅目昆虫互作的转录组数据,筛选到LOX(脂氧合酶)、PAL(苯丙氨酸解氨酶)、Gols(肌醇半乳糖苷合成酶)和MIPS(肌醇-1-磷酸合酶)等9个差异表达基因,利用CRISPR-Cas9技术进行基因敲除。通过全基因组分析,在四个已测序的棉种雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉和海岛棉中分别鉴定了18、13、23和28个LOX基因。系统进化分析将LOX基因家族基因分为三个亚组,9-LOX,Ⅰ类13-LOX和Ⅱ类13-LOX。在同一个亚组内,LOX基因结构相似。陆地棉中的23个LOX基因,随机的分布在14条染色体上。这些生物信息分析结果为今后棉花LOX基因的功能研究奠定了基础。
[硕士论文] 曾妮
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:硼是植物生长发育所必需的微量营养元素,其在植物细胞壁的构成、碳水化合物的运输和代谢、生殖器官的建成和发育等方面起到重要作用。Expansin是植物细胞壁的重要组成部分,通过调控纤维素微纤丝之间的非共价键,使细胞壁聚合物发生膨压诱导的蠕变,最终促进细胞伸展,以此缓解各种环境因子对细胞的压力。本研究利用生物信息学等方法分析了甘蓝型油菜expansin基因家族的结构特征,利用甘蓝型油菜硼高效和低效品种不同硼处理转录组数据鉴定了该基因家族的表达模式,采用营养液培养等方法研究了不同硼处理硼高效和低效品种根尖细胞形态、细胞壁组分和expansin基因表达的差异。取得的主要结果如下:
  (1)明确了甘蓝型油菜expansin基因家族的结构特征
  利用拟南芥expansin家族基因的基因组序列和十字花科基因组数据库BRAD,鉴定出109个甘蓝型油菜expansin家族成员。这些BnaEXPs基因分布在19条染色体上,基因长度680-17442bp,编码的氨基酸长度160-381aa。系统进化树表明BnaEXPs家族基因可分为EXPA、EXPB、EXLA和EXLB等4个亚家族,分别含79、21、5和4个成员。GO(Gene ontology)功能分析显示BnaEXPs家族基因参与的生物学过程主要为植物细胞壁组成和有性繁殖,且亚细胞定位均位于细胞外。
  (2)低硼胁迫甘蓝型油菜硼高、低效品种expansin基因家族的表达谱具有显著差异
  利用课题组前期获得的甘蓝型油菜硼高效品种(青油10号,QY10)和硼低效品种(Westar10,W10)不同组织部位(根、新叶和老叶)不同硼处理(25μMB和0.25μMB)转录组数据分析了BnaEXPs家族基因的表达模式,结果表明缺硼胁迫时,QY10根、新叶和老叶中分别有40、18和30个BnaEXPs基因显著上调或下调表达;W10根、新叶和老叶中分别有27、24和41个BnaEXPs基因显著上调或下调表达。QY10和W10相比,正常硼处理根、新叶和老叶中分别有26,9和17个BnaEXPs基因存在显著差异表达;低硼胁迫时,根、新叶和老叶中分别有7,4和18个expansin基因存在显著差异表达。利用DeGNServer在线工具对转录谱数据进行共表达基因网络分析,预测出16个BnaEXPs种子基因(seedgene)及其互作基因。利用硼高效QTLs的物理位置区间与甘蓝型油菜expasin家族基因的物理位置进行比较分析,检测到10个位于硼高效QTL区间内的expansin基因,其中BnaC04.EXPA6a、BnaC04.EXPA6b和BnaA03.EXPA8等3个expansin基因为seed gene。定量PCR分析结果显示BnaC04.EXPA6b在低硼胁迫QY10根中的表达量显著高于W10,可能与甘蓝型油菜的低硼耐受性相关。
  (3)初步揭示了甘蓝型油菜硼高、低效品种响应低硼胁迫的生理差异及其与expansin基因表达的关系
  低硼条件下,苗期W10的叶片和根系生长严重受阻,植株总干重、总根长、根表面积、根体积和根尖数均显著低于QY10,但硼、钙含量和钙硼比在缺硼QY10和W10的相同组织部位无显著差异。微分干涉相差(DIC)显微镜显示低硼胁迫QY10伸长区细胞长度显著大于W10。利用傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)分析细胞壁组分,发现低硼胁迫QY10根细胞壁的果胶甲基酯化度降低,蛋白质含量、果胶含量和纤维素含量均增加,而W10根细胞壁中果胶含量和果胶甲基酯化度增加,蛋白质含量保持不变,纤维素含量降低,且低硼胁迫处理W10根细胞壁中果胶含量和果胶甲基酯化度均显著高于QY10。定量PCR分析结果表明长期低硼胁迫QY10根中BnaC04.EXPA4和BnaC04.EXPA6b的表达量均显著高于W10,是调控低硼耐受性高低的关键基因。甘蓝型油菜响应缺硼胁迫时,硼高效品种因根系细胞壁中纤维素含量和expansin活性比硼低效品种高,而果胶含量和果胶甲基酯化度比硼低效品种低,因此根系细胞壁的稳定性和延伸性较低效品种更好,通过根细胞的相对稳定扩展,使植株最终表现出更强的低硼耐受性。
[博士论文] 孙程明
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:油菜是世界三大油料作物之一,是我国食用植物油的重要来源。人口的不断增长对食用油的产量增加提出了更高的要求。株高和分枝角度是油菜重要的株型性状,适度紧凑的分枝角度能提高油菜的种植密度,合适的株高能增强植株的抗倒性。因此,解析两个性状的遗传机制,挖掘优良的等位基因对株型育种具有重要价值。本研究中我们利用Illumina60K SNP芯片对520份甘蓝型油菜材料进行基因分型,在重庆、长沙、南京和武汉多点调查群体的分枝角度和株高。最终利用3种关联模型对2个性状进行了全基因组关联分析,主要研究结果如下:
  (1)经过Genome Studio软件的质控,剔除分型不明确的或多拷贝的SNP,最终得到19,167个高质量SNP标记。利用Structure软件和筛选出的SNP标记计算群体结构,将关联群体分为2个亚群。群体平均亲缘关系值为0.061,表明群体株系间的亲缘关系较弱。
  (2)当r2=0.1时,A,C亚基因组及全基因组的LD衰减距离分别是1,046、7,882kb和6,660kb。通过Haploview软件共检测到2,315个单倍型域(Haplotype Block),总长177.4Mb,占油菜已组装基因组的20.9%。A亚基因组的单倍型域总长只占全基因组单倍型总长的24.8%,显著少于C亚基因组的75.2%。9个单倍型域长度超过3Mb,除了一个在A06,其余分布在C亚基因组的5条染色体上。这6个超长单倍型域横跨或靠近着丝粒,与染色体的反转录转座子富集,基因密度低的区域重叠。
  (3)520份甘蓝型油菜株系在4个环境中的分枝角度变异范围广,单个环境极端自交系间差异最高达43.3°,广义遗传力是78.5%。利用GLM、MLM和A-D test三种模型,最终检测到56个显著位点,联合解释51.1%的表型变异。在53个关联区域预测到77个候选基因,包含SGR2、SGR4、SGR8、SGR9、LAZY1、TIR1、AFB5、TAR2和ARF10等拟南芥已报道基因的同源基因。
  (4)520份甘蓝型油菜株系在6个环境的株高表型变异范围广,从48.33cm到228.39cm,广义遗传力高达85.2%。利用GLM、MLM和A-D test三种模型,共检测到68个显著位点,联合解释42.3%的表型变异。在65个关联位点附近预测到95个候选基因,包含油菜已报道基因BnRGA和GA2ox8以及拟南芥GA20ox1、GA20ox2、GA2ox3、GA2ox4、GAMT1、DET、DWF、BRI、BAK1、CYP90C1、CYP90D1、UGT73C5、AB CB1和PAO5等已报道基因的同源基因。
  (5)利用QTL侧翼标记的引物序列,将已发表的7个连锁群体和2个关联群体的株高QTL锚定至油菜参考基因组。本研究的70.5%关联位点与已报道的QTL重叠,29.4%位点在至少2个定位群体中得到验证。78.3%GLM和71.4%A-D test的关联位点与已报道的QTL重叠。
  (6)以高杆组作为参照群,在矮杆组中进行XP-CLR分析,预测到107个受选择区域,长度从10kb到250kb,总长5.1Mb,占油菜已组装基因组的0.8%。本研究中的24关联位点与受选择区域重叠。
[博士论文] 李洪戈
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:油菜是世界上最重要的油料作物之一,中国油菜种植面积和菜籽产量均居世界前列。油菜株型对其产量具有重要影响,分枝角度是决定油菜株型的主要性状之一。此外,分枝角度还影响油菜的种植密度和机械化收获。茎秆倒伏是油菜的两种倒伏类型之一,其不仅与油菜株型密切相关,而且还会造成油菜产量损失和菜籽品质降低。鉴于分枝角度和茎秆倒伏性状对于油菜生产的重要影响,了解其分子作用机制和挖掘优良候选基因对于油菜的遗传改良显得尤为重要。本研究首先利用两个甘蓝型油菜分离群体对分枝角度和茎秆抗折力性状进行遗传分析研究,随后利用472份甘蓝型油菜构建的关联作图群体对分枝角度和茎秆倒伏相关性状(茎秆抗折力、茎秆直径、茎秆强度和倒伏系数)进行全基因组关联分析,最后对在分枝角度和茎秆抗折力性状上存在显著差异的甘蓝型油菜进行转录组测序分析。主要研究结果如下:
  1.分枝角度性状的遗传分析
  利用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型分析方法,对甘蓝型油菜2个分离群体F2和F2∶3的分枝角度性状分别进行遗传分析,结果显示F2代分枝角度性状的最适模型是1MG-AD模型,而F2∶3代是1MG-A模型,即分枝角度受到一对主基因控制,主基因间具有加性-显性效应或只具有加性效应。
  2.分枝角度的全基因组关联分析
  利用芸薹属60K SNP芯片对关联作图群体进行群体结构分析,结果显示472份甘蓝型油菜能够分配到3个亚群,分别包含64份、199份和209份材料。单倍型块分析表明,甘蓝型油菜基因组上存在2423个单倍型块,总长度为181.53Mb,覆盖28.28%的染色体区域。此外,大的单倍型块(≥1Mb)往往位于C基因组并且在着丝粒附近富集。油菜植株随着分枝部位的逐渐升高,分枝角度也逐渐增大,植株中部3个分枝的角度值最能够代表全株分枝的角度。分枝角度在作图群体中存在广泛的表型变异。利用MLM和MRMLM两种模型分别鉴定到46和38个与分枝角度显著关联的QTL,对表型变异的累计解释率分别为62.2%和66.2%。在这些QTL中,分别鉴定到73和64个候选基因,包括在油菜中第一次鉴定桷Bna.TAC1(BnaC04g00780D)、Bna.SGR1(BnaC08g25070D)、Bna.SGR3(BnaA06g35880D和BnaC09g19750D)和Bna.SGR5(BnaA06g34390D)。
  3.分枝角度差异材料的转录组分析
  对2个分枝角度存在显著差异的油菜材料进行转录组测序分析,在两个材料分枝的背地侧和近地侧之间共同上调的基因中鉴定到49个与生长素反应相关的差异表达基因,其中包括Bna.YUCCA6(BnaC09g03930D)和Bna.IAA19(BnaC03g39170D);在共同下调的基因中鉴定到32个与生长素反应相关的差异表达基因,包括Bna.AXR3(BnaCnng41350D)和Bna.SGR5(BnaC07g48900D)。另外,5个TCP1基因(BnaA02g13010D、BnaA07g26270D、BnaA07g25110D、BnaC06g26860D、BnaC06g28330D)在2个材料的背地侧组织中共同上调表达,2个YABB Y2基因(BnaA06g04870D和BnaC08g13560D)共同下调表达,并且这些共同表达基因在分枝的背地侧和近地侧的差异表达倍数存在差异。联合GWAS和RNA-seq分析,共同鉴定到22个基因,包括1个Bna.TAC1(BnaA05g01220D)和2个Bna.LAZY1(BnaA10g19550D和BnaC03g06250D)。
  4.茎秆抗折力的遗传分析
  甘蓝型油菜两个分离群体6个世代(P1、P2、F1、B1∶2、B2∶2和F2∶3)茎秆抗折力的联合遗传分析显示,该性状的最适模型为MX2-ADI-ADI,即两对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因模型;该性状受两对主基因和微效多基因共同控制,以主基因遗传为主,两个群体的平均主基因遗传率分别为19.46%和69.93%。两对主基因的加性效应和显性效应在一个群体中作用方向相反,而在另一个群体中作用方向相同,同时还存在多种上位性效应。两个群体中环境变异占到表型变异的54.68%和13.23%,说明环境对茎秆强度的影响较大。
  5.茎秆倒伏性状的全基因组关联分析
  茎秆抗折力、茎秆直径、茎秆强度和倒伏系数4个茎秆倒伏相关性状在作图群体中存在广泛的表型变异。四个性状间存在显著相关。关联分析分别检测到与茎秆抗折力、茎秆直径、茎秆强度和倒伏系数显著关联的26、18、17和13个QTL,并在这些位点中鉴定到29、19、18和25个候选基因,包括茎秆抗折力的候选基因Bna.ESK1(BnaC08g26920D)和Bna.CESA6(BnaA09g06990D)、茎秆直径的候选基因Bna.EXPA16(BnaC08g26400D)和Bna.BRX(BnaA08g07050D)、茎秆强度的候选基因Bna.FRA2(BnaC02g23170D)和Bna.ARF2(BnaA05g14370D)以及倒伏系数的候选基因Bna.CEL5(BnaA07g10240D)和Bna.IRX14-L(BnaA07g12000D)。
  6.茎秆抗折力差异材料的转录组分析
  在花期和角果前期对高、低茎秆抗折力材料进行RNA-Seq分析,发现在花期上调表达的基因有1679个、下调表达的有2586个,在角果期上调表达的基因706个、下调表达的414个。在2个发育时期发现一个共同上调表达的基因Bna.TBL1(BnaC01g23560D)和一个共同下调表达的基因Bna.ARF2(BnaA05g14370D)。鉴定到7个差异表达的转录因子,包括MYB类的MYB26、MYB43、MYB61和MYB85,WRKY类的WRKY47以及KNAT7。权重基因共表达网络分析(WGCNA)和GO富集分析发现,‘绿色’模块内的基因或主要在花期参与茎秆强度的调控并且主要通过参与纤维素的合成与代谢途径来完成。联合RNA-Seq、GWAS和WGCNA鉴定到Bna.ARF2(BnaA05g14370D)、Bna.CESA6(BnaA09g06990D)和Bna.FRA8(BnaC04g39510D)3个重要的候选基因。
[博士论文] 沈钰森
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜(Brassica napus L.,2n=38,AACC)是世界上重要的油料作物,为人类提供了食用油、为动物提供了蛋白饲料、也为工业发展提供了生物质能。理想株型的甘蓝型油菜品种可以提高植株对光能的利用、便于合理密植及适宜机械化收获,是我国当前油菜育种的重要目标。开展甘蓝型油菜株型相关性状的QTL定位及遗传调控机制解析,可为分子定向育种奠定基础。本研究利用甘蓝型油菜和荠菜(Capsella bursa-pastoris)杂交产生的分枝紧凑的异源渗入系为亲本之一,构建了DH群体和高密度的SNP遗传连锁图,进行了分枝角度的QTL定位及候选基因预测,发现控制株高、第一分枝高、茎秆直径与开花期的共定位QTL,主要结果如下:
  1.DH群体与高密度遗传连锁图谱的构建
  以紧凑分枝的渗入系Y689和甘蓝型油菜品种Westar为亲本、利用小孢子培养技术构建了包含208个株系的YW-DH群体,用60K SNP芯片进行基因分型,构建了一张包含3,073个SNP标记的高密度遗传连锁图谱,总长为2,242.14cM,平均标记密度为0.73cM。将SNP标记比对到甘蓝型油菜参考基因组上,发现A02和C02染色体上存在易位现象,而在A06,A08,C01和C07染色体上存在明显的染色体缺失,显示渗入系在培育过程中可能发生了较大的基因组变异。
  2.分枝角度性状的QTL定位
  2014-2016年将YW-DH群体在半冬性、冬性和春性的六个环境中种植并考察了分枝角度性状,结合群体的基因型数据,在全基因组范围内共检测到17个QTL,其中位于A03上的QTL(qBA.A03-2)能被重复检测到,解释10.21%-13.21%的表型变异;位于C03染色体上的两个相邻的QTL(qBA.C03-3和qBA.C03-4)也能被重复检测到,分别解释10.55%-21.73%和14.02%-17.21%的表型变异。与他人的结果对比表明,这三个都是新发现的主效QTL。候选基因预测生长素早期响应基因SAUR30(BnaC03g14890D)和SA UR55(BnaC03g16420D)可能参与调控油菜分枝角度大小。
  3.株高、第一分枝高、茎秆直径和开花期的主效QTL共定位
  对YW-DH群体中株高、第一分枝高、茎秆直径和开花期多年多点的表型考察发现,这四个性状相互间存在显著相关性。其中株高与第一分枝高、茎秆直径和开花期的相关系数分别为0.67、0.76和0.61;第一分枝高与茎秆直径和开花期的相关系数分别是0.53和0.68;茎秆直径与开花期的相关系数是0.54。
  对这四个性状进行QTL定位,检测到调控株高的主效QTL有5个,解释平均表型变异10.81%-22.97%;调控第一分枝高的主效QTL有5个,解释平均表型变异9.69%-21.99%;调控茎秆直径的主效QTL有5个,解释平均表型变异11.19%-16.58%;调控开花期的主效QTL有4个,解释平均表型变异11.76%-30.89%。在这19个主效的QTL中,有11个是新发现的QTL,包括调控株高的3个,调控第一分枝高的3个和调控茎秆直径的5个;并且这19个主效QTL都分布在A02和A07染色体的末端,在A02上1.4-24.6cM和A07上104.0-122.2cM处形成两个QTL簇。将这两个QTL簇内的QTL用元分析的方法进行区分和整合,分别得到3个和4个控制两个或以上性状的共定位QTL。为探究这几个性状的遗传基础(调控基因是紧密连锁或一因多效),我们进行了条件QTL分析。结果表明位于A02染色体上的QTL簇内控制四个性状的基因可能是一因多效;位于A07染色体上的QTL簇内控制四个性状的基因可能存在紧密连锁。这为主效QTL的进一步精细定位及其在分子育种中的合理利用提供了有价值的参考。
[博士论文] MUHAMMAD MAHMOOD AHMED
CROP BIOTECHNOLOGY 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:随着世界人口的增长,人们对棉花的需求也越来越大,导致棉花育种工作的主要目标是保障棉花纤维产量的稳定。由于单铃籽棉重是由多重产量性状决定,因此提高棉花的产量是一个巨大的挑战。产量和纤维品质共同调控棉铃发育。解析调控棉铃大小农艺性状的遗传和生物学机制,对棉花研究者来说仍是一个巨大的挑战。为了解析其遗传机制,一个通过种间杂交获得的小棉铃突变体BS41,在调控单铃籽棉重,皮棉重,百粒重等性状表现出杂种衰败。通过多重标记的检测,在12染色体上鉴定到了一个稳定的调控位点,qSCW-c12。在后代BC2F4群体中,这个位点qSCW-c12在AD-A12_07和AD-FM_44标记之间,大小为0.89cM。
  一个主效的杂交衰败多效性位点(qSCW-c12),其在多个连续的群体中被证实调控棉铃的大小和产量性状。通过连续的精细定位,在12号染色体上将其缩小到0.89cM遗传区间,与之相对应是包含11个基因的180Kb的物理区段。同源比对也测到了一个40个碱基插入缺失位点在AD-FM_44克隆序列,在与SCW紧密连锁的GhBRH1_A12基因的上游341的位置。通过在BS41中超表达GhBRH1_A12和Li1的转录组分析显示,其在棉铃发育早期调控棉花纤维的发育。忽略其生长抑制,BS41表现出油菜素甾醇平衡在棉铃发育过程中,即BR信号受抑制,导致在BS41中GhBRH1_A12下调表达。
  本研究表明GhBRH1_A12在调控BR平衡中发挥了重要的作用,其可能通过在棉花中影响棉铃的大小调控植株的生长发育和棉铃的发育。GhBRH1_A12作为一个决定棉铃重,皮棉重和百粒重的候选基因,通过调控BR信号路径影响衣分,纤维密度和单铃种子数。总的来讲,通过精细定位和图位克隆的SCW调控位点qSCW-c12,鉴定到了GhBRH1_A12候选基因,一个BR响应的RING结构域包含E3连接酶。
  在具有完整注释信息的四种棉花基因组中我们预测了BRH1基因。BRH1基因的遗传多样性,结构和功能变异被强调,在AtBRH1多肽中发现两个结构域,一个是推测的具有信号传导作用的跨膜螺旋(TMH)结构域,一个是具有E3连接酶活性的RING锌指结构域。四种棉花基因组中完整的注释信息有利于BRH1候选基因的预测。在陆地棉、海岛棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉中分别预测到16、4、7、8个BRH1基因。利用转录组数据测定棉花基因组中BRH1基因在根,叶,茎,花瓣,花药,柱头,胚珠,10天,20天纤维和种子的组织表达模式。在第1天和第3天,野生型比Li1中观察到更高的GhBRH1_A12转录本丰度。这些发现表明GhBRH1_A12可能在棉铃发育早期通过调控纤维发育来参与调控SCW。
  细胞中的分子过程可以通过一种重复的DNA序列,既微卫星定位,由于其长度变异和基序的不完整性。这种遗传变异的机制在不同的有机体中得到了广泛的研究。然而,基因组内容复制的进化过程主要被植物所占据,关于非编码的DNA还了解的很少。本研究第一次详细在植物界的5个分类学家族的13个植物物种中,研究了在基因组合的基序的不完整模式。
  我们研究了不同种类植物的基因组范围内的基序不完整模式,并利用各种分析工具,研究了微卫星重复密度、不完整程度和长度等特征关系。此外,比较基因组学方法有助于探索在棉花进化中微卫星的保守性。根据我们的研究结果,在棉花中,长基序重复的较慢衰减导致第二高频率的5nt基序占主导。此外,2nt的重复在四倍体棉花中有一个较快的衰减速率。与可可相比较发现,“AT”重复变得越来越少在分化过程中,因为棉花这一分之在现在的棉花驯化过程中经历了全基因组复制和多倍体化的过程。
  这项研究的结果可能对探索简单的非编码遗传元素的相对进化足迹,如重复,通过对棉花基因组特异性特征的进化,提供了参考。类似地,短的基序重复出现了快速的减少,伴随棉花进化的过程2nt重复急剧减少,“AT”在四倍体棉花中减少的最为激烈。然而,如果对目前的研究结果加以考虑,对“AT”基序的衰减热点全面分析,以及四个基因组的不完整性,可以揭示其对基因调控要素的影响,是进一步了解其基础机制的必要条件。
[博士论文] AYAZ ALI KEERIO
CROP GENETICS AND BREEDING 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:世界对棉花的需求正在快速的增长,其远远大于世界人口的增长速率。因此,全球的棉花育种一直以来主要集中于在增加棉花的产量的基础上改良棉花的纤维品质。棉花的纤维品质和产量性状是复杂的数量性状。由于不同的群体类型和亲本,导致纤维和产量性状之间存在着复杂的遗传相关性。因此,同时对棉花纤维品质和产量进行遗传改良,是棉花育种工作者的一个长期目标。陆地棉是世界范围内广泛种植的栽培种,产量高,纤维品质适中,但是其遗传基础狭窄。而棉花野生种的遗传基础广泛,具有优异的农艺性状,因此可以利用棉花野生种增加陆地棉的遗传多样性。
  在本研究中,以陆地棉4105为轮回亲本,毛棉为供体亲本构建了一个包含107个家系的棉花导入系群体。本研究的目的1)在多环境中对这个导入系群体的表型进行评估;2)鉴定纤维品质和产量性状的QTL;3)发掘染色体上的QTL簇。这个导入系群体在两年三环境中被评估。总的来说,这个导入系群体是非常丰富的遗传材料,具有很大的遗传多样性。At亚组的导入片段的覆盖度高于Dt亚组。导入片段覆盖了棉花基因组的35.54%。A13染色体的覆盖度,这个遗传区域在未来的育种中可以重点关注。表型分析表明,毛棉的导入片段显著地影响的棉花的纤维品质和产量。大约有一半的家系的纤维品质和产量都得到了提高。
  本研究利用高通量测序技术总共产生265.20兆的数据,并鉴定SNP标记。预实验确保了标记的密度,一致性及有效性,并过滤低深度的SLAF标签,最终3157个高质量的SNP被鉴定。这些SNP的分布是不均匀的,在At亚组上有1816个SNPs,在Dt亚组上有1341个SNPs。
  总共鉴定了74个QTLs,其中包含30个纤维品质的QTLs,44个产量QTLs。47个QTLs在At亚组,27个QTLs在Dt亚组。总的来说,有69个标记与74个QTLs相关联,其中40个标记与产量相关,29个与纤维品质相关。分析加性效应发现,44个QTLs的加性效应为正。此外,一些QTLs簇也被鉴定,主要分布在A01,A09,A13,D02和D10染色体上。这些QTL簇至少包含2个或2个以上的不同性状的QTLs。其中,在染色体A01和A13上的QTLs簇中分别包含5个QTLs,主要涉及的性状为纤维长度,衣分,铃数,百粒重,株高和籽指。
  结果表明,SLAF测序方法在基因分型和开发标记方面是非常高效。此外,这个陆地棉与毛棉的导入系群体在解析纤维品质和产量性状方面非常有效。这些鉴定的QTLs将会对陆地棉的遗传改良起到极大的促进作用。
[博士论文] BASIR UL HAQ
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:独脚金内酯(Strigolactones,SLs)是一种重要的植物次生代谢物,它在调节植物根的生长、根毛发育、芽枝产生、植物共生菌的互作等生理过程中都发挥着重要作用。通过对拟南芥、豌豆、水稻和矮牵牛的芽枝突变体研究已经鉴定出多个参与独脚金内酯合成和信号传导的关键基因,然而,其在大豆中是如何合成以及信号是如何传导等却仍然并不清楚。
  鉴于独脚金内酯如此重要而它们的生物合成底物(类胡萝卜素)又是普遍存在的,因此在本研究中,我们主要对大豆基因组中控制独脚金内酯合成和信号传导相关的基因进行了鉴定。我们首先在大豆基因组中找到MORE MAXILLARY BRANCHING(MAX)的同源基因:GmMAX1s,GmMAX2s,GmMAX3s,GmMAX4;然后根据表达水平对这些基因进一步筛选,最后挑选出四个基因在根中表达量相对较高,且与根中独脚金内酯合成相关。为了进一步研究GmMAX的基因功能,我们挑选GmMAX1a,GmMAX2a,GmMAX3b和GmMAX4a作为候选基因并借助相关突变体材料进行了深入研究。在拟南芥中,通过突变体、突变体互补以及超表达株系对这四个基因进行了功能鉴定,并鉴定了它们在芽枝、株高、叶形、主根长度、毛状发根、表皮毛数目和长度等表型中的作用。我们发现在互补材料中不仅外在表型得到了恢复,而且突变体植株中被破坏的激素平衡比如所有突变体中JA和ABA的含量显著降低,生长素在atmax1,atmax3,atmax4中显著偏高等变化也恢复到正常水平。而在超表达转基因株系中,相比于野生型其激素含量及平衡又被打破。
  非生物逆境对许多作物的产量产生不利的影响,因此我们也在转基因拟南芥和大豆根毛中检测独脚金内酯合成和信号转导相关基因的功能。在独脚金内酯合成和信号转导相关基因的拟南芥突变体atmax1,atmax2,atmax3,atmax4中,发现在干旱条件下突变体的存活率比野生型有显著降低,同时发现超表达独脚金内酯合成和信号转导途径的GmMAXs基因同对照超表达GUS基因相比,可以显著提高根毛的抗旱性。表型分析发现突变体也表现出对干旱胁迫更为敏感的表型。这些结果表明独脚金内酯合成途径和信号转导途径在干旱胁迫中起着重要作用。
  GmMAXs的材料根毛形态的变化,发现转基因阳性株系的根毛显著长于对照组。转录组分析发现这些基因超表达后许多激素相关基因的表达也都发生显著变化。与之对应,GmMAX1a,GmMAX3b和GmMAX4a超表达材料根毛中ABA含量减少,JA含量增加;GmMAX1a和GmMAX4a超表达株系根毛中生长素含量增加,而GmMAX3b超表达株系的根毛中生长素含量并未检测到明显差异。GmMAX2a超表达株系与GUS对照材料相比ABA和JA含量都显著增加,IAA含量降低,而在抑制株系GmMAX3b-KD则观察到完全相反的表型。
  同时,我们也在大豆的超表达和抑制株系中检测了这些基因对结瘤的影响。超表达GmMAX1a,GmMAX2a,GmMAX3b和GmMAX4a的株系(GmMAX1a-OE,GmMAX2a-OE,GmMAX3b-OE和GmMAX4a-OE)中结瘤数目增多,而在GmMAX3b的抑制株系(GmMAX3b-KD)中结瘤数目减少。GmMAXs转基因发根中几个关键结瘤基因的表达水平也发生了改变。说明独脚金内酯相关的GmMAXs系列基因正调控结瘤。另外,我们也发现在B.japonicaUSDA110菌株处理48h后,超表达株系中的结瘤早期基因如GmNSP1a,GmNSP1β表达量显著高于GUS对照组。
  另外,亚细胞定位显示独脚金内酯合成相关的GmMAX1a-GFP,GmMAX3b-GFP,GmMAX4a-GFP融合蛋白定位在叶绿体,信号传导相关的GmMAX2a定位于细胞核。该研究不仅揭示了独脚金内酯合成和信号转导途径在大豆中的保守性,还表明独脚金内酯跟其他激素之间的互作可能在控制植物发育及大豆结瘤中发挥重要的作用。GmMAX1a,GmMAX2a,GmMAX3b和GmMAX4a参与的独脚金内酯合成和信号传导可能通过影响根毛形成及与根瘤菌互作来调控大豆的结瘤。
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