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[硕士论文] 蒋蓉
人体解剖与组织胚胎学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:观察自噬水平改变对新生和成年小鼠神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)增殖和分化能力的影响,明确激活自噬对成体NSCs功能维持的保护作用,探讨维持干细胞活力的有效途径。
  方法:⑴分离培养新生(Postnatal day0,P0)小鼠室管膜下区(subventricularzone,SVZ) NSCs,应用自噬抑制剂Ly294002干预P0 NSCs,LC3免疫荧光染色观察细胞中自噬小体的变化,并且通过BrdU掺入实验检测抑制自噬对P0 NSCs增殖能力的影响。用分化培养基诱导P0 NSCs分化,western blot检测自噬相关蛋白LC3II和p62在NSCs分化过程中的表达变化。应用Ly294002作用于分化的P0 NSCs,Tuj1免疫荧光染色检测早期神经元标记物的表达变化。⑵分离培养成年(Postnatal days90,P90)小鼠SVZ区 NSCs,应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,采用LC3免疫荧光染色检测自噬水平。随后通过BrdU掺入实验和Tuj1免疫荧光染色分析激活自噬对P90 NSCs增殖和分化能力的影响。⑶成年小鼠腹腔注射自噬激活剂Rapamycin(4mg/kg),隔日一次,共14天,提取SVZ蛋白检测Rapamycin靶蛋白mTOR的磷酸化水平。同时制备脑片通过Ki67和DCX免疫荧光染色观察激活自噬对成年小鼠SVZ区NSCs增殖和分化能力的影响。
  结果:①应用自噬抑制剂Ly294002作用于P0 NSCs3d,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体明显减少,提示Ly294002能够抑制P0 NSCs自噬发生,但免疫荧光染色显示Ly294002组与DMSO组BrdU阳性率无显著差异。P0 NSCs分化后LC3II的蛋白含量较分化前升高1.0±0.4倍(p<0.05),p62的蛋白含量较未分化组降低了0.5±0.1倍(p<0.01),表明自噬参与调控 NSCs的分化过程。应用5μM和10μM Ly294002作用于P0 NSCs,降低细胞自噬水平后,则Ly294002组Tuj1的阳性率分别较对照组显著降低了0.6和0.7倍(p<0.01),提示降低自噬水平,抑制P0 NSCs向神经元方向分化。②应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体增加,提示Rapamycin提高P90 NSCs的自噬水平,并且免疫荧光染色显示Rapamycin组BrdU阳性率分别为25.4%±6.0%和26.2%±6.7%较对照组12.0%±0.8%明显升高(p<0.05),表明激活自噬可以促进P90 NSCs增殖。应用20nM和50nM Rapamycin作用于P90 NSCs,NSCs诱导分化3d后,则Rapamycin组Tuj1的阳性率分别较对照组升高了1.5倍和1.3倍,(p<0.01),提示提高自噬水平,促进P90 NSCs向神经元方向分化。③成年小鼠腹腔注射Rapamycin,Rapamycin组mTOR的磷酸化水平较对照组降低了34.0%±8.6%(p<0.01),表明腹腔注射Rapamycin后能够抑制mTOR激活自噬,免疫荧光染色显示,Rapamycin组Ki67阳性细胞数为98.9±8.1较DMSO组61.15±8.56明显升高(p<0.05),早期神经元标记物DCX阳性数是对照组的1.5倍(p<0.01),表明提高成年小鼠脑内SVZ区的自噬水平,可以提高NSCs增殖和分化潜能。
  结论:自噬参与小鼠NSCs功能维持,改变自噬水平能够影响NSCs的增殖和分化。应用自噬激活剂能够有效提高成年小鼠NSCs的活力,促进神经发生。
[硕士论文] 任婧
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:绵羊是非常重要的经济型家畜,为人们提供肉、奶、皮毛等产品。运用卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation,IVM)、体外受精(In Vitro Fertilization,IVF)和胚胎移植(Embryo Transfer, ET)技术对优质家畜进行良种扩繁,能有效提高家畜生产力。卵母细胞的发育与成熟是这些技术的基础,因此,卵母细胞成熟的品质好坏直接影响子代能否成活及存活后代的健康状况。从卵母细胞成熟到早期胚胎发育的过程中,除内源性基因的表达调控作用之外,培养环境中的信号分子作用也影响其能否正常发育。通过旁分泌因子发挥调控作用是这种调控最常见、最直接的方式之一。结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)、基质细胞衍生因子-1(Stromalcell-derived factor-1,SDF-1)、神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是卵巢旁分泌因子。研究发现CTGF能促进小鼠、大鼠卵泡发育,SDF-1能增加颗粒细胞存活和提高胚胎质量,NGF能以剂量依赖的方式增强山羊初级卵泡的体外生长,HGF能诱导牛的颗粒细胞增殖。但这四种旁分泌因子是否能够作用于绵羊卵母细胞,并提高卵母细胞体外成熟率、受精率和早期胚胎发育率,尚未做过充分研究。因此,我们利用绵羊卵母细胞作为实验材料,研究CTGF、SDF-1、NGF和HGF单独添加和组合添加对绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎发育的作用。
  本研究主要内容包括:⑴在绵羊卵母细胞成熟液中分别单独添加不同浓度梯度的CTGF、SDF-1、NGF和HGF因子,统计绵羊卵母细胞成熟率,找到单独添加CTGF、SDF-1、NGF和HGF因子的最佳浓度。接着将这四种因子组合添加到绵羊卵母细胞成熟液和早期胚胎发育液中,统计绵羊卵母细胞成熟率、卵子激活率和早期胚胎发育率。以卵丘扩散指数(cumulus expansion index,CEI)、细胞膜表面早期细胞凋亡信号和胚胎的囊胚细胞数作为评价卵母细胞成熟和早期胚胎发育潜能的指标,并且检测了凋亡基因Bax、Bcl-2、P53和PTGS2的基因表达量。⑵在四种旁分泌因子单独使用的实验中,添加30.0 ng/mLCTGF因子,10.0 ng/mL SDF-1因子,3.0 ng/mL NGF因子,100.0 ng/mL HGF因子能促进绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎发育;在四种旁分泌因子组合使用的实验中,添加30.0 ng/mL CTGF+10.0ng/mL SDF-1+3.0 ng/mL NGF+100.0 ng/mL HGF时,卵母细胞成熟率、激活率以及早期胚胎各个时期的发育率都优于单独添加单一因子组和不添加因子组;组合因子对CEI、抑制卵子凋亡率和提高囊胚细胞数有显著作用;组合因子的使用能降低卵丘细胞、卵母细胞和囊胚细胞中凋亡基因的表达量。⑶旁分泌因子CTGF、SDF-1、NGF和HGF能促进卵母细胞成熟;四种因子组合使用能促进绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎的发育。
[硕士论文] 卢晓
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:ATM(mutated in Ataxia-Telangiectasia)是一个重要的表达丝氨酸,苏氨酸蛋白激酶的基因,在DNA损伤与修复中发挥重要作用。DNA双链断裂会引起ATM的激活,从而引发下游一系列损伤修复反应。此外,染色体的高度动态变化也会激活ATM,iPS细胞诱导过程中染色体会发生巨大变化和高度修饰,但很少有研究报道ATM基因在重编程过程中的作用。
  本研究利用基因敲减技术分析了一些参与细胞代谢与生命活动的蛋白酶与蛋白激酶对于体细胞重编程的影响。结果显示,除chuk基因外,敲减其他磷酸化相关基因后iPS细胞的诱导效率均有所提高。其中,敲减ATM不但提高iPS诱导效率,同时获得的iPS克隆折光性很好,边界清楚,且形成的转分化细胞很少,iPS克隆非常均一。进一步分析显示,随着敲减ATM比例的增高,重编程的效率降低,且生成的克隆内源性Oct4未被激活,不能继续培养传代,而低敲减ATM的克隆经检测重编程完整,多能性基因表达正常。此外,敲减ATM后,抑制P53和H2AX的磷酸化,同时发现敲减ATM后,细胞自噬相关蛋白LC3被激活,自噬在重编程过程中也发挥着重要作用。最终我们得出结论,适当敲减ATM会通过降低P53-pi和γH2AX的水平而提高重编程的效率。
[硕士论文] 贺妍
免疫学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  作为着丝粒重要组件,Zwint-1参与招募动力蛋白激酶和动力蛋白,促进染色体运动或调控纺锤体检查点,在着丝粒组装和有丝分裂中期适当沉默 SAC起到关键作用,以此确保染色体正确分离。通过进一步实验,来考察Cdc20与 Zwint-1之间的关系,以及 D-box序列在这其中发挥的作用,为进一步理解控制染色体分离的分子机制打下基础。
  方法:
  经PCR、双酶切鉴定等一系列实验技术来构建重组质粒pCMV-myc-Cdc20、pcDNA3-flag-Zwint-1、pcDNA3-flag-Zwint-1ΔD-box、pEGFP-Zwint-1和 pEGFP-Zwint-1ΔD-box;采用胸腺嘧啶双阻断法将HEK293T细胞同步化在 G1/S期,用流式细胞术通过碘化丙啶染色来确定细胞时相,用Western blot检测Zwint-1蛋白在细胞周期的表达水平;使用放线菌酮和MG132处理细胞,经Western blot检测来观察Zwint-1蛋白在体内的降解情况;对HEK293T细胞转染了质粒 pCMV-myc-Cdc20,即过表达 hCdc20,做了Cdc20与 Zwint-1之间的免疫沉淀实验;过表达 hCdc20和 RNA干扰 Cdc20,用Western blot来检测内源性Zwint-1蛋白质水平;将分别编码Zwint-1-flag、 Cdc20-myc和 Ub-HA的质粒共转染 HEK293T细胞,做了体内泛素化分析;删除了 Zwint-1的两个D-box基序(128 RTQL131和203 RDKL206),将突变序列亚克隆进pcDNA3-flag,与质粒pCMV-myc-Cdc20共转染,用Western blot来检测D-box缺失的Zwint-1蛋白质水平。
  结果:
  Zwint-1蛋白水平随细胞周期时相变化而变化;Zwint-1蛋白水平在用放线菌酮孵育8 h和16 h后显著降低,在用MG132孵育6 h和12 h后蛋白水平迅速增加;免疫沉淀结果为阴性;过表达 hCdc20使 Zwint-1蛋白质含量显著减少;RNA干扰抑制Cdc20活性时Zwint-1蛋白和cyclin B显著积累;当过表达Cdc20-myc时,Zwint-1蛋白多泛素化水平显著上升;缺乏D-box基序的Zwint-1不能被Cdc20识别降解。
  结论:
  Zwint-1的蛋白水平随细胞周期出现周期性变化;Zwint-1通过 APC/C-Cdc20途径泛素化降解;其机制是Cdc20识别Zwint-1的D-box基序。
[硕士论文] 吴雪臣
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:从出生到青春期,作为雌性配子的卵母细胞一直停滞在第一次减数分裂的前期,又称生发泡(Germinal Vesicle,GV)期。只有在青春期后,受到激素刺激的卵母细胞才会发生生发泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown,GVBD),进而开始恢复减数分裂,而只有恢复减数分裂并发育成熟的卵母细胞,才有可能与精子结合形成受精卵。哺乳动物卵母细胞中,磷酸二酯酶(Phosphodiesterases,PDEs)水平的变化引起的环腺苷酸(cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)水平的下降被认为是引起GVBD的主要原因。cAMP相关抑制剂如PDEs抑制剂和cAMP激活剂等,能可逆地抑制GVBD。
  本研究选用PDEs抑制剂Milrinone(Mil)、3-Isobutyl-1-Methylxanthine(IBMX)和cAMP激活剂Forskolin、dibutyryl cAMP(dbcAMP)四种药物分别进行单独或组合使用,以便于我们摸索出一套对卵母细胞成熟抑制效果最佳、对卵母细胞毒性最小的抑制剂配方。结果表明,在单独使用每种抑制剂的实验中,Mil,IBMX,Forskolin和dbcAMP能够达到抑制GVBD的最小浓度分别为3.0μM、30.0μM、450.0μM和150.0μM。为了进一步验证将各类抑制剂组合使用,能否获得更佳的配方,我们将不同种类和浓度的抑制剂进行组合,结果发现50.0μM Forskolin+0.3μM Mil,50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX,50.0μM dbcAMP+0.3μM Mil,50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX四种组合能够获得更好的抑制GVBD效果。在此基础上,以不含任何抑制剂的培养液为对照组,含有不同种类抑制剂的培养液作为实验组,对卵母细胞的GVBD进程进行了检测,结果发现,含有抑制剂的实验组与对照组相比,GVBD进程不完全一致,但各组的最终GVBD率没有显著差异。比较了不同抑制剂对卵母细胞第一极体(First Polar Body, PB1)排放的影响,结果显示,三个实验组在PB1排放速率和最终排放率上与对照组没有显著差异,包括:30.0μM IBMX、50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μMdbcAMP+10.0μM IBMX;另有三个实验组只在最终PB1排放率上和对照组没有显著差异,包括:150.0μM dbcAMP、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+0.3μM Mil。此外,我们比较了各组之间排放的PB1体积,结果发现,经50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μMIBMX或50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX三组处理过的卵母细胞所排放的PB1体积较小,并且与对照组没有显著差异。检测了抑制剂对卵母细胞早期凋亡、DNA损伤和线粒体分布的影响,结果发现,经五种抑制剂处理卵母细胞后,其早期凋亡率与对照组没有显著差异,包括:30.0μM IBMX、150.0μM dbcAMP、50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX。经三种抑制剂处理卵母细胞后,其DNA损伤程度与对照组没有显著差异,包括:50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+10.0.μM IBMX。在线粒体分布指标方面,只有50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX组与对照组没有显著差异。研究表明:不同种类抑制剂经过浓度调整和组合使用,可以更好的将卵母细胞阻滞在GV期,并且对卵母细胞的毒性作用最小。由此,我们摸索出了新一代最佳抑制剂组合,即50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX。这一配方可为日后研究卵母细胞成熟机理提供有效帮助。
[硕士论文] 张晓枫
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:毛囊的生长发育过程受到一系列生长因子和信号通路的调控,成纤维细胞生长因子家族和骨形成蛋白家族就是其中两种参与调控的生长因子。FGF5在影响被毛长度方面的作用现已被广泛证实,Noggin主要通过抑制BMPs功能的发挥进而参与毛囊生长发育的调控。CRISPR/Cas系统作为一种新兴的第三代基因编辑技术,有简便易行、省时高效的优势,其应用对于畜牧育种而言可以大大提高育种的效率,缩短育种时间,减少育种成本,也可以实现许多之前难以完成的工作。本研究的出发点是希望利用CRISPR/Cas系统和原核显微注射技术构建FGF5、Noggin双基因编辑小鼠模型,通过研究这两个基因对毛囊发育的影响,为加快优良产绒性状绒山羊新品种培育工作提供参考。本实验通过脱毛实验观察小鼠的毛发生长速度;通过石蜡切片H&E染色的方法检测小鼠皮肤毛发的再生情况及毛囊分布和毛干数目的变化;通过实时定量PCR检测阳性小鼠皮肤组织中与毛囊发育相关基因的表达情况。
  本研究主要内容包括:⑴通过原核显微注射法将基于CRISPR/Cas9系统作用机理构建的FGF5-gRNA、pKI-Noggin载体以及Cas9质粒注入小鼠受精卵原核中,最终移植268枚注射后胚胎,获得36只新生小鼠,经鉴定,共获得6只不同类型阳性小鼠,分别是3只FGF5基因敲除小鼠、2只Noggin基因过表达小鼠和一只FGF5基因敲除且Noggin基因过表达的小鼠,总阳性率为16.7%。⑵通过脱毛实验、石蜡切片、实时定量PCR技术检测阳性小鼠和野生型小鼠。结果表明,与野生型小鼠相比,FGF5基因敲除小鼠毛发生长速度相对较慢,毛囊独立生长,但分布较为杂乱,毛囊直径基本不变,毛囊数量增多;Noggin基因过表达小鼠毛发生长速度次之,毛囊成簇集聚生长,分布较为整齐,毛囊直径变大,毛囊数量减少;FGF5基因敲除同时Noggin基因过表达的小鼠毛发生长速度最慢,毛囊成簇集聚生长,分布较为整齐,毛囊直径变大,毛囊数量减少。实时定量PCR检测结果显示,92号、601号Noggin基因过表达小鼠,633号FGF5基因敲除同时Noggin基因过表达小鼠皮肤组织中Noggin基因的mRNA水平的相对表达量分别是野生型小鼠的2.67、8.36、35.35倍,三只阳性小鼠在mRNA水平都表达了Noggin基因。另外,三种不同类型小鼠的β-catenin、VEGF、Tβ4三个基因的mRNA的相对表达量较野生型小鼠也有不同程度的上调。
[硕士论文] 金连丰
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:每个miRNA都具有多个靶基因,因此对miRNA下游作用的靶基因进行寻找及功能研究仍是临床及科研的重要方向。而哺乳动物乳腺组织是动物体中少数的随着年龄、发情周期和繁殖状态而发生相应周期性变化器官之一。因此对人乳腺中miR-139-5p靶基因的鉴定及验证至关重要。
  研究发现miR-139与其靶基因共同作用可影响众多生物学功能,如蛋白定位、细胞周期调控以及抑制肿瘤侵袭等。众所周知,细胞周期的有序进行是生物体生长、发育及繁殖的基础,而细胞周期加快或阻滞会影响细胞增殖及迁移能力,进而至使肿瘤、癌症以及基因突变的发生。为充分研究miR-139-5p的作用和功能,其靶基因的挖掘和鉴定及初步的功能验证成为急需解决的问题。
  本研究将RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)与新一代测序技术相结合,以MCF-10A细胞系为研究对象,鉴定与验证miR-139-5p在乳腺上皮细胞中的靶基因。先运用针对目标蛋白Ago2的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化,对结合在复合物上的RNA进行测序分析,找出成对样品中的差异峰,进而确认miR-139-5p在MCF-10A中的靶基因,并对靶基因进行KEGG和GO分析;最后运用qPCR等技术对miR-139-5p的靶基因及miR-139-5p部分功能进行验证。这些结果将为miR-139-5p在人乳腺中的功能研究提供新的参考。
  研究结果如下:
  (1) RIP-seq测序数据处理及生物信息学分析:
  RIP-seq测序后我们将由Negative Control组与miR-139-5p mimic组获得的peak进行比较,得到差异基因484个,这些差异基因就是miR-139-5p在MCF-10A细胞中的靶基因,这些靶基因可能是乳腺发育或乳腺进化过程中重要的基因。利用KEGG对靶基因进行通路分析,我们得到204种Pathway,其中显著性通路有21条(P<0.05),涉及到120个靶基因;在GO分析中发现,显著性GO条目448个(P<0.05),主要涉及蛋白定位(proteinlocalization)、细胞周期调控(regulation of cell cycle)、细胞器组成(organdle part)、结合RNA(RNA binding)和结合核酸(nucleic acid binding)等;
  (2) miR-139-5p靶基因的验证
  选取的18个靶基因在mRNA水平被miR-139-5p显著下调,表明其表达受miR-139-5p调节。选择细胞周期信号通路对miR-139-5p的靶基因进行功能验证,表明miR-139-5p能显著抑制G1/S细胞周期转变,进而抑制细胞增殖,这种调节是信号通路中多个靶基因共同作用的结果。
[硕士论文] 翁雷
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:X染色体失活是雌性哺乳动物早期胚胎发育的重要事件,而非编码基因Xist是X染色体失活的关键调控因子。Xist RNA通过包被即将失活的X染色体并使其发生沉默。而在分化细胞的重编程过程中,失活的X染色体伴随着Xist的下调而发生重活化,在ESC中,多能性因子(如NANOG,SOX2和OCT4等)结合到Xist基因的第一内含子区,以稳定ESC的多能性状态。但有研究报道,Xist的表达不会因为敲除第一内含子而受到影响,也不能提高诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)的制备效率。而结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物的抑制性体外转录因子(Transcriptional-activator-likeeffectors based designer Transcription Factors, Tale-dTFs)Repressor6(以下称R6)显著提高了小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)向iPSC的诱导效率。本研究利用Xist抑制性Tale-dTF R6成功制备了R6-MEF细胞系,并通过细胞生长曲线制备、免疫荧光染色、实时定量PCR及流式细胞仪筛选分析等技术手段,证明了该R6-MEF细胞系具有不同于野生型MEF细胞系的特点。
  本研究主要内容包括:⑴利用脂质体转染法制备的R6-MEF细胞形态类似于低代次的野生型MEF细胞系,呈短梭状,而生长速率明显高于野生型MEF细胞系;R6-MEF细胞系可传至50代以上,且未见明显异常。⑵实时定量PCR结果显示,R6-MEF中的多能性基因Nanog、Sox2、Oct4及生殖相关基因Prdm14均有不同程度的上调;但R6-MEF中NANOG的免疫荧光染色结果呈阴性;而雌性R6-MEF中H3K27me3的免疫荧光染色结果显示,R6在一定程度上降低了该表观遗传修饰的印迹水平。⑶流式细胞分选结果显示,野生型MEF细胞系中的GOF-GFP呈阴性,而R6-MEF细胞系中的GOF-GFP呈弱阳性。⑷核型分析结果显示,R6-MEF细胞与野生型小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)的染色体均为40条,未见明显异常。
[硕士论文] 代洋
生物学 武汉科技大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究KLF15对VEGF的调控作用和对血管生成的影响,揭示KLF15调控VEGF所介导的的血管生成新功能机制。
  方法:提取糖尿病患者基因组DNA,构建DNA池,测序获知VEGF启动子的突变位点并分析不同单倍型和发病相关性;之后分别构建带有不同VEGF启动子区的pGL3-Basic质粒,利用双荧光素酶报告系统检测VEGF不同单倍型对启动子活性的影响;再利用MatInspector软件,对不同启动子序列进行生物信息学分析;通过ELISA和Western Blot技术检测过表达或干扰KLF15后VEGF的蛋白表达;最后利用增殖和迁移实验阐明KLF15对VEGF介导的血管生成产生的影响。
  结果:通过DNA池测序检测,在VEGF基因启动子区-460位和-634位分别检测到T>C和C>G的单碱基突变,且关联分析发现这两个位点的突变均能显著影响微量白蛋白尿水平。双荧光酶系统检测启动子活性实验显示不同单倍型对启动子活性有明显影响。依靠生物软件分析发现-460位突变能够改变转录因子KLF15的结合情况。ELISA及Western Blot结果证明KLF15可影响VEGF的表达,最后实验表明KLF15能影响HUVEC细胞增殖和迁移,进而影响血管生成过程。
  结论:KLF15能抑制VEGF介导的血管生成过程。
[硕士论文] 牛晓洁
人体解剖与组织胚胎学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探究自噬相关基因Atg7对NSCs增殖及分化潜能的影响,旨在寻找影响NSCs增殖活力及分化能力的关键靶点,为治疗神经退行性疾病提供新的可行性策略。
  方法:⑴设计合成靶向Atg7的siRNA序列及其对照siRNA,电穿孔法分别转染NSCs,转染48h后提取NSCs总的RNA,72h后提取NSCs全蛋白,运用Real-time PCR及Western blot分别从mRNA水平和蛋白水平测定Atg7基因的敲减效率。⑵应用Western blot比较siRNA组与对照组siRNA的LC3II以及P62的表达变化,检测敲减Atg7对NSCs自噬水平的影响。⑶测量神经球的数量和平均直径,运用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入实验检测Atg7基因沉默对NSCs增殖能力的影响。⑷利用Tuj1和GFAP免疫荧光染色分析Atg7基因敲减对NSCs分化能力的影响。⑸应用SA-β-gal染色检测siRNA组与对照组siRNA衰老细胞阳性率,qPCR分析P16、P21、P27和P53衰老相关基因的转录情况。
  结果:①RT-PCR结果显示 siRNA组 Atg7 mRNA水平亦较对照组显著降低54%(P<0.001),但Atg3,Atg5,Beclin1自噬其他相关基因的mRNA水平无显著变化;Western blot显示, Atg7敲减组的蛋白表达水平较对照组降低35%(P<0.01),提示siRNA干扰能够显著降低NSCs Atg7的表达水平。②Western blot结果显示, siRNA组LC3II蛋白水平较对照组降低27.5%(P<0.05),P62蛋白水平为对照组的1.5倍(P<0.001),提示敲减Atg7基因后,能够降低NSCs的自噬水平。③siRNA组神经球的数目较对照组降低20%(P<0.01)而且平均直径下降30%(P<0.01);BrdU免疫荧光染色实验结果显示siRNA组BrdU阳性率较对照组显著下降29.8%(P<0.001),提示Atg7基因敲减可以抑制NSCs的增殖的能力。④Tuj1和GFAP免疫荧光染色显示,Atg7-siRNA实验组Tuj1阳性细胞率较对照组显著降低38.3%(P<0.05),而其GFAP阳性细胞率为对照组的1.8倍(P<0.01)。提示Atg7基因沉默可以抑制NSCs向神经元方向分化的能力。⑤SA-β-gal染色结果显示siRNA组中衰老阳性细胞数是对照组的2.8倍(P<0.001),P16、P21、P53的mRNA表达水平分别为对照组的1.5(P<0.05)、1.6(P<0.05)、1.6(P<0.001)倍,而P27的mRNA表达水平无明显变化,提示下调Atg7表达水平可能激活衰老相关基因转录,导致NSCs活力降低。
  结论:⑴Atg7敲减能够显著抑制NSCs增殖与分化能力。⑵Atg7敲减能够下调NSCs自噬水平,降低NSCs活力,提示自噬在维持NSCs功能中发挥重要作用。
[博士论文] 李永波
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景及存在的科学问题:
  程序性细胞死亡(PCD)主要包括有自噬和凋亡。自噬是指当细胞受到压力或营养缺乏时,细胞将自身的一些损伤蛋白或细胞器降解掉从而产生能量让自己存活下来的过程。凋亡是指机体通过自身基因及其产物主动而有序的调控机体死亡的过程,称为Ⅰ型PCD。对于自噬的功能目前主要存在两种观点:一种是自噬导致细胞存活,在众多的哺乳动物细胞中,如在人类的成纤维和T细胞中,自噬是一种存活过程。另一种是自噬是一种死亡过程,既Ⅱ型PCD,如在果蝇中肠的降解。因此,自噬究竟是存活还是死亡、自噬与凋亡之间究竟存在着一种什么关系以及自噬转向凋亡的分子机制是当今亟待解决的科学问题。
  昆虫在经历幼虫到蛹的转变过程中,旧的中肠会发生PCD降解,包括自噬与凋亡,因此昆虫中肠PCD为研究自噬和凋亡以及二者的关系提供了理想模型。双翅目昆虫果蝇中肠PCD是一种自噬性死亡,没有凋亡性死亡,而鳞翅目昆虫家蚕中肠PCD中却是先发生自噬,然后发生凋亡,但家蚕中肠PCD自噬转化成凋亡的机制尚不清楚。因此,不同昆虫中肠的PCD的机制有所不同。昆虫PCD的发生依赖于蜕皮激素(20-Hydroxyecdysone,20E),在家蚕脂肪体中,20E可以通过上调自噬相关基因和凋亡相关基因的表达来促进脂肪体PCD。在家蚕丝腺中,20E可以引起胞内Ca2+水平的升高最终活化下游的Caspase-3导致PCD。
  钙离子的变化和平衡对细胞行使多种功能有着重要的作用,胞质中的钙离子水平相对较低,而胞外可以维持较高的钙离子水平。在一些细胞中,胞内钙离子的增加可以促进自噬。另外还有一些细胞中,胞内钙离子的增加可以活化钙依赖蛋白酶Calpain,Calpain一旦活化后,就会引起自噬相关蛋白5(ATG5)切割成氨基端ATG5(NtATG5),这样自噬的过程就会受阻,凋亡就会增强。因此,我们推测20E增加的细胞内Ca2+在自噬与凋亡的转化中发挥重要作用。为了验证我们的假设以及解决自噬研究领域存在的科学问题,我们以鳞翅目昆虫棉铃虫的中肠PCD作为模型,并以棉铃虫的表皮细胞系(HaEpi)作为平台开展研究,以回答自噬的功能究竟是一种存活还是死亡,自噬与凋亡究竟是一种什么关系以及自噬转向凋亡的分子机制等科学问题。
  研究结果:
  在鳞翅目昆虫棉铃虫中,自噬相关基因(ATGs)和凋亡相关基因(Caspases)都在变态期高表达,而且都响应20E的诱导。大部分自噬相关基因的表达要先于凋亡相关基因。20E可以诱导微管轻链3蛋白-磷脂酰乙醇胺(LC3-Ⅱ,又名ATG8)的形成,表明自噬受20E的诱导,但是转染pIEx-RFP-GFP-LC3-His荧光双标签质粒进一步检测自噬发现,20E诱导的自噬不能持续下去,这表明自噬在20E诱导的晚期呈现出下降趋势,而凋亡却显著增加,说明20E诱导的自噬最终转向了凋亡。在鳞翅目昆虫棉铃虫中肠程序性细胞死亡过程中(PCD),既存在自噬也存在凋亡而且自噬发生在前凋亡的发生在后。LC3-Ⅱ形成的增加预示自噬的水平的增加;活化的Caspase-3和流式细胞仪用于检测凋亡的水平。凋亡发生时Caspase-3被活化同时自噬相关蛋白ATG5被切割产生氨基端ATG5(NtATG5)。在棉铃虫的表皮细胞系(HaEpi)中,相对较低浓度20E情况下,LC3-Ⅱ的形成增多预示着自噬会逐渐增强,在相对较高浓度的20E情况下,ATG5被切割成为NtATG5,Caspase-3的活性逐渐增强,预示着自噬转向了凋亡。当干扰ATG5或施加自噬的抑制剂3-甲基嘌呤(3-MA)时,20E诱导的自噬和凋亡会受到抑制。但是,当施加凋亡的抑制剂Ac-DEVD-CHO时,可以抑制20E诱导的凋亡,但没有阻止20E诱导的自噬。这暗示了自噬控制并决定凋亡。另外,高浓度20E可以诱导胞内Ca2+水平升高促进ATG5的切割成NtATG5,Caspase-3的活化,进而将自噬转向凋亡。阻止20E诱导的胞内Ca2+的升高将会导致NtATG5以及活化的Caspase-3下降,细胞会维持自噬存活。在人类乳腺癌细胞中,20E可诱导自噬的发生,但是当施加高浓度的Ca2+时,自噬会转化成凋亡。这些结果表明胞内高浓度的Ca2+将细胞自噬性存活转为凋亡性死亡,而且20E诱导了胞内高浓度的Ca2+促进了自噬向凋亡的转化。
  结论:
  1.自噬是一种存活过程,凋亡是一种细胞死亡过程。当凋亡受到抑制时,细胞将处于自噬的存活状态。这与果蝇中肠的自噬死亡不一样,可能是物种间调控机制的差异。
  2.20E诱导中肠自噬和凋亡先后发生并促使自噬向凋亡转化。自噬是凋亡的前提,凋亡终结自噬。阐明了中肠中自噬与凋亡的关系不是简单的拮抗关系。
  3.20E通过增加细胞内钙离子浓度促进自噬向凋亡转化。高浓度的20E诱导胞内Ca2+增加,高水平的Ca2+使ATG5被切割成NtATG5进而活化Caspase-3引起凋亡。抑制Ca2+通道可以阻止自噬向凋亡的转化。在没有钙离子时自噬不能被转化成凋亡。该结果在人乳腺癌细胞中可以得到验证。确定了自噬转向凋亡的关键因子是钙离子。
  科学意义:
  阐明了20E调控钙离子增加,介导自噬转化为凋亡是中肠PCD的分子机制;自噬是一种存活过程而凋亡是一种细胞死亡过程;Ca2+离子的浓度决定了自噬向凋亡的转化。丰富了昆虫中肠PCD的理论,为防治病虫害提供了新的靶标。为自噬的功能及在细胞存活与死亡中的机制提供了新的理论依据。
[硕士论文] 张晨
遗传学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:[研究背景]:
  p21蛋白是细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子(CDKI),可以与多种通路的不同信号分子相互作用,在整个细胞调控系统起到重要作用,同时p21作为一种重要的癌症相关基因,在肿瘤的发生发展中也有重要作用。
  活性氧(ROS)是细胞内化学性质活泼、氧化能力强的各种含氧离子或分子的总称,主要包括超氧阴离子自由基、单线激发态氧、羟自由基、过氧化氢和过氧化物等物质。近年来大量的研究数据都能表明,活性氧作为一种重要的信号分子,可以参与细胞中多种生命活动的调控,包括细胞分裂、分化、肿瘤等生理和病理变化。在正常生命活动的氧化代谢过程中产生的ROS,可以由组织内的防御机制来维持平衡。但在一些损伤因素的作用下,细胞内的氧化代谢物增加,超过细胞自我修复能力,使活性氧堆积并对细胞产生毒害作用。
  目前对p21在ROS水平调控中的作用存在争议,p21对ROS的调节机制也有不同报道:有文献报道p21具有抗氧化作用,这种功能主要是由转录因子Nrf2介导的。Nrf2是抗氧化基因,其下游也有一系列的抗氧化基因。Keap1驱动Nrf2的泛素化降解,而p21可以和Keap1结合,与Nrf2形成竞争关系,使Nrf2更稳定,可以更好地发挥抗氧化的作用,在这种情况下敲除p21的细胞的ROS会比正常细胞要高,在受刺激的时候更为明显。而另有文献报道p21可以起到促氧化的效果,当敲除p21后,敲除细胞的ROS在压力刺激下明显减少,之后用了生物信息学的分析软件找到了一个最为可能的p21调控ROS的通路:DNA损伤-p53-p21-GADD45A-MAPK14-GRB2-TGFβ-线粒体功能障碍-DNA损伤,这证明存在于一个引发ROS升高的正反馈环上,敲除p21相当于阻碍了环的运行,可以降低ROS,p21起到促氧化作用的。
  我们推测,p21在ROS水平调控中的作用及其机制可能是细胞类型特异的。我们以多种细胞包括NHF(人成纤维细胞)、MSF(小鼠耳朵成纤维细胞)、MRC5(人成纤维细胞)、FTE187(人输卵管上皮永生化细胞)为研究对象,通过敲除或干扰p21后测定ROS水平,之后还检测了NHF和MSF细胞的增殖与衰老情况。
  [研究目的]:
  1.探讨p21对ROS的调控是否有细胞类型特异性;
  2.探讨p21介导的ROS调节对细胞命运的影响。
  [研究方法]
  3.通过RNA干扰敲低NHF等人类细胞p21的表达。
  4.通过小鼠耳朵成纤维细胞原代培养获得MSF细胞。
  5.利用流式细胞术检测敲除或干扰p21后各细胞的ROS水平在本底及IR处理后ROS的水平。
  6.利用Real-time PCR方法技术MSF细胞在p21缺失后,与p21作用的相关基因Nrf2及其靶基因NQO-1、HO-1等的表达。
  7.利用Western blotting检测敲除或干扰p21后各细胞中Nrf2与p-p38的变化。
  8.利用SA-β-gal染色技术检测NHF、MSF细胞在p21缺失或下调后的衰老情况。
  9.利用EdU插入法检测NHF、MSF细胞在p21缺失或下调后的增殖情况。
  [实验结果]:
  1.MSF细胞在p21缺失后的ROS水平在本底及用IR处理后都有所降低,p38磷酸化下降,Nrf2及其靶基因基本不变,细胞衰老减少,增殖加快。
  2.NHF细胞在p21下调后短期内ROS水平在本底及IR处理后都有所升高,p38磷酸化升高,Nrf2下调。而细胞在长期低表达p21后,ROS水平在本底及IR处理后均出现降低,p38磷酸化降低,Nrf2上调,更长期的筛选后,p21低表达细胞Nrf2水平明显降低,细胞在p21下调后都出现衰老减少,增殖加快的现象。
  3.在MRC5和FTE187在p21下调后的ROS水平分别各有上调和下降,其中MRC5细胞中Nrf2与p38磷酸化的变化与MSF细胞相似,而在FTE187细胞中Nrf2与p38磷酸化的变化与我们实验所用另几种细胞都不一致。
  [结论]:
  1.p21短期下调对细胞ROS的影响具有细胞特异性(在MSF、MRC5中p21缺失或下调ROS下降,在NHF、FTE187中p21下调ROS上升)。
  2.p21长期缺失或下调导致细胞ROS下降(NHF、MRC5、MSF)。
  3.p21缺失或下调引起的ROS上升经由Nrf2途径介导(NHF),p21缺失或下调引起的ROS下调经由p38途径介导(MSF)。
  4.p21缺失或下调导致的细胞衰老减少,增殖加快不依赖ROS(MSF、NHF)。
[硕士论文] 张国艳
流行病与卫生统计学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:①通过对HEK239细胞进行不同浓度、不同时间CdCl2染毒,研究不同浓度、不同时间CdCl2对细胞氧化损伤、细胞凋亡和miR-21表达的影响。②通过对HEK239细胞进行CdCl2染毒、miR-21 mimic、miR-21 inhibitor转染和转染后CdCl2染毒,研究miR-21在镉致HEK293细胞氧化损伤中的作用。③通过对HEK239细胞进行CdCl2染毒、miR-21 mimic、miR-21 inhibitor转染和转染后CdCl2染毒,研究miR-21在镉致HEK293细胞凋亡中的作用。
  方法:⑴不同浓度的CdCl2作用不同时间,细胞贴壁性减弱,细胞变圆,伪足消失。随着CdCl2浓度的增高,作用时间延长,细胞的生长受到抑制,在CdCl2浓度为120μmol/L,染毒时间为12h时抑制作用达到最大。与0μmol/L CdCl2比较,细胞凋亡率增加(P<0.05);随着作用时间的延长,30μmol/L和60μmol/L CdCl2染毒组细胞凋亡率逐渐增加(Ptrend=0.001,Ptrend=0.009);当作用时间分别为1、3、6h,随着CdCl2浓度的增加,凋亡率逐渐增加(Ptrend=0.003或Ptrend=0.001)。与0μmol/L CdCl2组比较,细胞内MDA、ROS含量随着CdCl2浓度的升高而增高(Ptrend<0.001或Ptrend=0.001);当CdCl2浓度分别为30、60、120μmol/L时,随着染毒作用时间的延长,MDA和ROS含量逐渐增高(Ptrend均<0.05)。与0μmol/L CdCl2组比较,30、60、120μmol/L组细胞中SOD和GSH-PX活力均降低(P<0.05),且随着CdCl2浓度的增加细胞中SOD和GSH-PX活力呈下降趋势(Ptrend<0.001);当染毒浓度分别为30、60、120μmol/L时,细胞SOD和GSH-PX活力随着作用时间的延长而降低(Ptrend均<0.01)。当作用时间分别为1、3、6、12h时,不同浓度的CdCl2对细胞中miR-21的表达作用有差别,差别有统计学意义(P<0.001或P=0.006),且miR-21的表达随着CdCl2染毒浓度的增加而增加(Ptrend=0.002或Ptrend=0.004);当CdCl2浓度分别为30、60、120μmol/L时,作用不同时间,细胞中miR-21表达差别有统计学意义(P<0.001或P=0.042),在CdCl2浓度为30μmol/L和120μmol/L时,miR-21表达随 CdCl2作用时间的延长而增高(Ptrend=0.030,Ptrend=0.011),在 CdCl2浓度为120μmol/L时,染毒时间为12 h时,miR-21表达达到最大。⑵miR-21 mimic转染后,细胞中MDA和ROS含量与对照组和miR-21 mimic Negative Control相比,MDA和ROS含量增加(P<0.05);细胞中SOD和GSH-PX与对照组相比,SOD和GSH-PX的活性降低(P<0.05),与miR-21 mimic Negative Control相比,细胞中SOD活性降低(P<0.05);miR-21 inhibitor转染后,细胞中MDA和ROS含量与对照组相比,MDA和ROS含量降低(P<0.05),与miR-21 inhibitor Negative Control相比,ROS含量降低(P<0.05);细胞中SOD和GSH-PX与对照组和miR-21 inhibitor Negative Control相比,SOD和GSH-PX的活性增加(P<0.05)。miR-21 mimic转染后CdCl2染毒,细胞中MDA和ROS含量与对照组和CdCl2组相比,含量增加(P<0.05);细胞中SOD和GSH-PX与对照组和CdCl2组相比,活性降低(P<0.05)。⑶miR-21 mimic转染后,与对照组相比,细胞凋亡率增加(P<0.001),miR-21表达增加(P<0.05);miR-21 inhibitor转染后,与对照组相比,细胞凋亡率降低(P<0.001)。miR-21 mimic转染后CdCl2染毒,与对照组和CdCl2组相比,细胞凋亡率增加(P<0.05),miR-21表达增加(P<0.05);miR-21 inhibitor转染CdCl2染毒,与对照组和CdCl2组相比,细胞凋亡率降低(P<0.05),miR-21表达下降(P<0.05)。且细胞凋亡率与miR-21含量有相关关系(P<0.001),相关系数为0.732。
  结论:①镉可以导致HEK293细胞氧化损伤、细胞凋亡和miR-21表达改变。②miR-21在镉致HEK293细胞氧化损伤中起促进作用。③miR-21在镉致HEK293细胞凋亡中起促进作用。
[博士论文] 季丙元
发育生物学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:κ型阿片受体(κ-opioid receptor,KOR)和缓激肽2型受体(bradykinin B2 receptor, B2R)都属于 G蛋白偶联受体家族成员,二者及其配体强啡肽(dynorphin,DYN)和缓激肽(bradykinin,BK)广泛分布于心血管系统和中枢神经系统。目前,有关 KOR和 B2R两种受体相互作用的研究未见报道。本课题运用生物物理方法研究二者间的异源二聚化作用,以及形成异源二聚体后对细胞内信号转导途径的影响,探讨 KOR/B2R异源二聚体在细胞内的信号转导机制及其在神经保护作用中的分子机制,为神经损伤等神经系统疾病的治疗和药物研发提供新的思路和实验依据。
  本课题利用pcDNA3.1-KOR和pcDNA3.1-B2R质粒建立了稳定表达KOR、B2R或KOR/B2R的HEK293细胞。pcDNA3.1-KOR和EGFP-B2R共转染HEK293细胞,进行免疫荧光染色,共聚焦扫描显微镜结果显示KOR与B2R在细胞中的分布高度一致,且主要定位于细胞膜。RT-PCR结果显示KOR和B2R均内源性表达于SH-SY5Y细胞,这些结果为下一步进行二聚体的研究奠定了基础。
  本研究构建了KOR-Rluc和B2R-mVenus两种重组质粒,共同或单独转染HEK293细胞。生物发光检测和荧光检测确保各组受体表达水平一致,BRET检测结果显示, KOR-Rluc与B2R-mVenus共转染组的BRET值与其它阴性对照组相比差异显著,表明KOR和B2R之间能够发生相互作用。
  在饱和实验中,固定供体KOR-Rluc的量不变,受体B2R-mVenus的量逐渐增加,结果显示,KOR-Rluc和B2R-mVenus共转染组的BRET值呈现双曲线形式增加,最终达到平台期,对照组pcDNA3.1-Rluc和B2R-mVenus共转染组以及mVenus和KOR-Rluc共转染组BRET值没有明显增加,是一种非特异性的线性关系。竞争性结合实验显示,随着未标记受体转染量的增加,两受体间的BRET值逐渐降低。BRET饱和实验和竞争性结合实验说明,KOR和B2R间的相互作用是特异的,而不是由受体过表达导致的分子间的随机碰撞引起的,排除了受体过表达引起的假阳性。FRET技术进一步证实了细胞中KOR和B2R间的相互作用。在共转染KOR-CFP和B2R-mVenus的细胞中,FRET信号明显强于受体单转组和阴性对照组。KOR-CFP和B2R-mVenus间的 FRET现象可发生在CHO等不同类型的细胞中,表明二者的相互作用不受细胞类型的限制,没有细胞类型的偏向性。邻位连接分析技术(proximity ligation assay,PLA)更直观地证实, KOR和B2R可发生相互作用形成异源二聚体。
  本课题对cAMP、cAMP应答元件(cAMP response element,CRE)、血清反应元件( serum response element, SRE)和 cAMP应答元件结合蛋白( cAMP-response element-binding protein, CREB)等信号分子进行了检测。与 HEK293-KOR和HEK293-B2R细胞相比,Dyn A(1-13)显著提高了HEK293-KOR/B2R细胞中cAMP的表达水平,而BK不能通过KOR/B2R二聚体影响cAMP的表达。cAMP作为细胞内第二信使,通常是Gαs蛋白下游信号中间分子,受Gαs活化程度的影响。为研究二聚体和G蛋白间的偶联关系,实验采用Gαs-Rluc8、Gαi2-Rluc8或Gαq-Rluc8与KOR-mVenus、B2R-mVenus或KOR-mVenus和B2R共同转染HEK293细胞,同时转染未标记的Gβ1和Gγ2蛋白亚基,进行BRET分析。在Dyn A(1-13)刺激后,与单独表达KOR或B2R的细胞相比,KOR-mVenus和Rluc8-Gαs共转染组的BRET信号显著增强,提示激动剂刺激后KOR/B2R二聚体倾向于结合并激活Gαs蛋白亚基。
  为检测KOR和B2R二聚体对下游信号的影响,本研究运用双报告基因检测系统检测了细胞中CRE和SRE的活性。共转染组细胞中CRE-Luc的活性要显著高于KOR或B2R单转染组,SRE的活性显著低于KOR单转染组,和对照组HEK293细胞相比没有明显变化。实验显示,当激动剂Dyn A(1-13)刺激HEK293-KOR/B2R细胞时,KOR和B2R间的异源二聚化作用增强了CRE的活性,而CRE的活性依赖于PKA的激活。本实验进一步阐明了,KOR/B2R异源二聚体能够和Gαs结合进而增强CRE的活性。通常, GPCR与 Gαs结合可激活腺苷酸环化酶,进而增强 CREB的磷酸化水平。为确定KOR/B2R二聚体能否影响CREB的磷酸化,在用激动剂Dyn A(1-13)处理后,Western blot对CREB的活化水平进行了浓度依赖和时间依赖性检测。用浓度为10-7M的Dyn A(1-13)处理各组细胞0-60分钟,5分钟时,HEK293-KOR/B2R细胞中CREB的活化水平有明显的增强,并随时间逐渐降低。在浓度依赖性实验中,当 Dyn A(1-13)的浓度增强时, HEK293-KOR/B2R细胞中CREB的磷酸化水平随着激动剂Dyn A(1-13)浓度的增加而逐渐增强。在 SH-SY5Y细胞中,CREB的磷酸化水平同样表现出浓度依赖性增强。分别用PKA抑制剂H89和 PLC抑制剂U73122对细胞进行预处理,只有 HEK293-KOR/B2R细胞中磷酸化 CREB的表达要水平明显受到 H89的抑制,而其它单转组未受到明显的影响。U73122未对共转染组 CREB的活性产生较为明显的影响。这充分说明, HEK293-KOR/B2R细胞中KOR/B2R二聚体对CREB的激活是通过Gαs/cAMP/PKA信号途径介导的,而非PLC/PKC信号途径。
  为更有力地证实KOR/B2R二聚体对CREB磷酸化的影响,我们用shRNA-KOR或shRNA-B2R对SH-SY5Y细胞中KOR和B2R受体进行干扰。蛋白免疫印迹结果显示, KOR-shRNA和B2R-shRNA显著降低了SH-SY5Y细胞中KOR和B2R的表达,同时Dyn A(1-13)诱导的CREB的磷酸化水平明显降低。有趣的是,B2R的沉默同样降低了Dyn A(1-13)诱导的CREB磷酸化水平,这说明在SH-SY5Y细胞中,KOR和B2R是作为一个复合物发挥作用,在Dyn A(1-13)的刺激下可增强CREB磷酸化的表达。
  本实验通过多种方法证实,KOR和B2R能够在细胞内发生相互作用形成异源二聚体,并显著影响细胞内信号转导途径。为检测二聚体特异的信号转导对细胞功能的影响,我们利用CCK-8细胞活性分析系统对细胞增殖活性进行了分析。结果显示,Dyn A(1-13)能显著增强HEK293-KOR/B2R细胞的增殖,并呈现出剂量依赖效应,而HEK293-KOR和 HEK293-B2R细胞的活性没有发生改变。如前所述, Dyn A(1-13)能显著增强人SH-SY5Y细胞中CREB的磷酸化,与此相对应,Dyn A(1-13)同样能显著促进SH-SY5Y细胞的增殖。
  本课题首次证明了KOR和B2R两种GPCR能组成性的相互作用形成异源二聚体,并能诱导产生新的细胞内信号转导途径。KOR/B2R异源二聚体介导的 Gαs/cAMP/PKA信号通路的活化增强了CREB的磷酸化水平,促进了SH-SY5Y细胞的增殖。本研究初步阐明了KOR/B2R异源二聚体的信号转导机制及其在神经保护过程中的分子机制,为神经损伤等神经疾病的治疗和相关药物的设计提供了有价值的参考依据。
[硕士论文] 芮丹丹
生理学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:1.研究背景与目的:
  JPH2基因编码的Junctophilin-2是心脏Junctophilins(JPs,JPHs)家族中参与形成膜耦联复合体的蛋白成员,是与心肌细胞内Ca2+信号操纵相关的蛋白分子。已有研究表明,小鼠JPH2敲除会导致其胚胎期致死,心脏出现不规则钙信号,以及与SR钙释放分离的异常收缩。表明JPH2在促进SR钙释放和心肌收缩中起着关键作用。在心肌肥大模型中,JPH2表达的下调与 L-型 Ca2+通道和RyR2之间的耦联缺陷有关。提示JPH2可能与细胞膜上电压门控钙离子通道和肌浆网膜ryanodine受体之间的功能耦联有关。
  小电导-Ca2+-激活K+通道(small-conductance calcium-activated potassium channel SK,Kca2)属于非电压依赖性,几乎可表达在所有可兴奋细胞。根据对特异性阻断剂apamin敏感性的不同, SK通道可以被分为SK1,SK2,SK3和SK4四种亚型。SK1一般存在于神经组织中,SK2和SK3既存在于神经组织也存在于外周组织。作为钙激活的钾通道,心肌细胞上的 SK2通道对胞浆中的钙离子具有高度敏感性,可通过细胞内低钙离子浓度而被激活,从而整合Ca2+浓度和膜电位的变化。细胞内 Ca2+来源主要包括两条途径:通过电压门控 Ca2+通道(voltage-gated Ca2+channels,VGCCs)激活从细胞外进入细胞内的Ca2+及通过心肌肌质网(sarcoplasmic,SR)膜上的兰尼碱受体(ryanodine receptors,RyRs)激活释放储存的Ca2+。之前,我们实验室已经论证了心肌RyR2敏感的Ca2+释放通道可以调控心肌 SK2通道介导的 Ca2+激活 K+(Ik,Ca)电流,但对 RyR2和SK2通道之间功能耦合的具体分子机制并不清楚。JPH2是否是心肌SK2通道与RyR2之间膜耦联的关键分子,目前尚不清楚。
  本实验通过RNA干扰JPH2基因,并利用腺病毒介导构建Ad-JPH2-RNAi重组载体,转染新生小鼠心肌细胞,采用全细胞膜片钳研究了JPH2对SK2通道介导的 Ik,Ca电流的影响。通过给予 RyR2激动剂-Caffeine, RyR2抑制剂-Ryanodine,以及SR Ca2+ATP酶抑制剂-Thapsigargin,观察JPH2对心肌RyR2钙释放通道与SK2通道功能性耦联的影响。从而为揭示心脏SK通道分子调控、心脏疾病的预防策略提供可靠的实验依据。
  2.材料方法:
  1)本实验采用出生1-3天的 C57BL/6小鼠(合格证号为 SCXX(京)2012-0001),购于北京维通利华实验动物技术有限公司,雌雄不限。
  2)用实验室已成功制备的JPH2-shRNA重组腺病毒表达载体转染原代培养的小鼠心肌细胞,将细胞分为3组:正常未转染病毒的对照组(Ctrl-NC);转染无关序列腺病毒(Ad-scramble siRNA)对照组;转染 JPH2siRNA序列腺病毒(Ad-JPH2-siRNA)组。
  3)采用Real-time PCR检测各组细胞提取的cDNA样本中JPH2mRNA相对量。
  4)采用全细胞膜片钳记录感染心肌细胞SK2通道介导的Ca2+-激活K+电流(calcium-activated potassium current,Ik,Ca)的变化。将细胞分为3组:Ctrl-NC, Ad-scramble siRNA和Ad-JPH2-siRNA组。为探讨JPH2在SK通道与RyR2功能耦联中的作用,又将细胞分为4组:Ad-scramble siRNA,Ad-JPH2-siRNA, Ad-JPH2-siRNA+Ryanodine+TG以及Ad-JPH2-siRNA+Caffeine组。
  5)统计学分析:利用统计软件SPSS17.0进行实验数据的统计和处理。采用单因素方差分析比较各组间的显著性差异。以α=0.05为检验水准,n表示样本例数。
  3.结果:
  1)采用Real-time PCR检测各组心肌细胞JPH2mRNA相对表达量。结果显示:与Ctrl-NC组细胞相比较,Ad-scramble siRNA组心肌细胞JPH2 mRNA水平无显著性差异;Ad-JPH2-siRNA组JPH2 mRNA的相对表达水平与对照组细胞相比较,显著降低,其干扰效率达到80-90%。
  2)用全细胞膜片钳法记录 Ik,Ca电流结果显示:与 Ctrl-NC和 Ad-scramble siRNA组相比,Ad-JPH2-siRNA组心肌细胞膜SK2通道Ik,Ca电流显著减小;预先给予RyR2受体抑制剂Ryanodine+ TG,与Ad-scramble siRNA组相比较,SK2通道介导的 Ik,Ca电流被明显抑制;与 Ad-JPH2-siRNA组比较,Ik,Ca电流有减小的趋势,但组间差异无显著性。给予RyR2受体激动剂Caffeine,与Ad-scramble siRNA组相比较,Ik,Ca电流显著减小,与Ad-JPH2-siRNA组比较,Ik,Ca电流增大。
  4.小结:
  siRNA敲减小鼠心肌细胞JPH2可显著抑制心肌细胞JPH2 mRNA的表达,抑制SK2通道Ik,Ca电流;JPH2可通过RyR2 Ca2+释放通道调节SK2通道介导的Ik,Ca。提示JPH2介导了心肌SK2通道和RyR2之间的功能耦联。
[硕士论文] 李丽岑
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:目的:不健康的生活方式,是导致非酒精性脂肪肝的重要原因。现有研究表明,急性饥饿容易诱导肝细胞脂肪变性,而间歇性饥饿可以减轻体重,延长寿命。因此,本文旨在探讨间歇性饥饿是否可以改善急性饥饿诱导的肝细胞脂肪变性。
  方法:以小鼠为研究对象,首先对小鼠进行一段时间的间歇性饥饿训练,然后进行急性饥饿处理,最后分离肝脏组织进行生物化学分析和分子生物学分析,探索间歇性饥饿对脂肪代谢的调控和相关机制。
  结果:⑴小鼠在间歇性饥饿处理期间,其累积进食量与自由进食对照组基本一致。间歇性饥饿训练17个循环后,相对于自由进食对照组,间歇性饥饿小鼠体重显著下降(P<0.05)。两组小鼠的肝指数未见显著差异,且肝脏切片染色也未见明显空泡。急性饥饿24小时后,两组小鼠肝指数均下降,而自由进食饥饿24小时组小鼠血清中谷丙转氨酶含量显著上升。肝脏切片染色观察发现自由进食饥饿24小时组中存在许多小泡状脂滴,而间歇性饥饿训练后的小鼠肝脏中未见明显空泡。⑵分离各组间小鼠肝脏组织进行生化和基因分析,间歇性饥饿组小鼠胰岛素水平显著上升,随之小鼠肝脏内糖原含量也明显提高,而肝脏中甘油三酯含量则显著降低。进一步测定小鼠肝脏中与能量代谢相关基因表达情况发现,间歇性饥饿组小鼠Pparα和Glut4表达显著下调。急性饥饿24小时后,间歇性饥饿训练后的小鼠肝脏中与脂代谢相关基因Ppara、Fgf21、Cpt1a和Hmgcs2的表达都显著下调,而与糖代谢相关基因Glut4、Pgc1a和Pygl的表达则显著上调。⑶检测各组间小鼠肝脏中氧化应激反应程度,间歇性饥饿组小鼠血清中丙二醛含量显著下降,总抗氧化能力显著提高,而总巯基含量和抗氧化物酶活力均未见明显差异。急性饥饿24小时后,丙二醛含量显著上升,且自由进食饥饿24小时组小鼠显著高于间歇性饥饿训练小鼠。而抗氧化物酶活力显著下降,且自由进食饥饿24小时组下降更为显著。
  结论:①相比于自由进食对照组小鼠,间歇性饥饿训练可以减缓小鼠体重上升,上调胰岛素水平,促进肝糖原的合成并减少脂肪动员。②间歇性饥饿训练后的小鼠能够减少体内脂质过氧化产物丙二醛含量,提高抗氧化物酶活性,降低肝细胞中氧化应激水平,减少肝损伤。③因此,间歇性饥饿训练可能通过促进糖代谢,抑制脂代谢,改善氧化应激,减少肝损伤,从而抑制非酒精性脂肪肝的发生。
[硕士论文] 沈巧艳
动物胚胎工程 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)具有多向分化能力,在临床疾病的治疗,药物筛选等方面具有巨大的应用价值。猪,不仅是重要的经济动物,而且是极好的生物模型动物,因此继小鼠和人诱导型多能性干细的建立,猪iPSCs的建立一直是干细胞领域研究的重点。在近年的研究中,猪iPSCs的建系虽然已有报道,但是并没有获得一株真正意义上的猪iPSCs。目前所得的猪iPSCs存在着质量低,细胞系间差异大,特征不一致的问题。同时,关于猪胚胎干细胞的研究进展缓慢,目前为止,尚没有建系的猪胚胎干细胞系。这些问题的存在给猪iPSCs的建立带来了多重阻碍,同时影响了人们对猪iPSCs重编程过程中分子机理的研究。
  近年研究发现,成纤维细胞在诱导成为iPSCs的过程中会经历一个向上皮样细胞转变的过程,而上皮样细胞则可直接越过,加速并提高了诱导效率。精原干细胞是位于睾丸曲细精管生精上皮上的一群上皮样成体干细胞,具有高度的自我更新和分化潜能。此前人们在运用经典四因子使小鼠精原干细胞产生iPSCs,发现其形成时间要比成纤维细胞诱导产生的iPSCs缩短一半,还发现由精原干细胞诱导产生的iPSCs在小鼠嵌合体后代较其它细胞来源上致瘤率大大降低。
  本研究通过四种转录因子Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc并结合相关小分子复合物对关中黑猪精原干细进行诱导,获得了多潜能性的类iPSCs。
  本研究的主要内容如下:
  猪精原干细胞的分离培养及相关鉴定:小鼠精原干细胞分离与鉴定研究较多,但猪精原干细胞分离培养的方法研究还较少。我们参考了本实验室建立的精原干细胞分离方法。通过酶联合消化再利用差速贴壁的方法对分离得到的细胞进行纯化,并进行了鉴定。
  猪精原干细胞向多能性干细胞的诱导:原代分离猪精原干细胞,采用慢病毒体系,将鼠Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc四因子导入猪精原干细胞,通过特定的培养条件将其诱导为iPSCs,并对重编程的细胞进行了细胞和分子生物学特性鉴定。获得的iPSCs具有多能性基因表达的能力,同时还具有向三胚层分化的潜能。
[硕士论文] 刘观女
动物营养与饲料科学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:Collagen XV(Col XV)是胶原家族的成员之一,分布在细胞基底膜表面,在动物生理和病理过程中发挥重要作用。Col XV与Col XVⅢ组成MULTIPLEXINs/内皮抑素产生的胶原蛋白亚类,它们结构上高度保守,在血管生成、炎症发生、肿瘤形成和脂肪代谢等方面具有类似功能。研究发现Col XVⅢ促进脂肪细胞分化,增加内脏脂肪的堆积,增加组织重构,维持能量稳态。Col XV在成脂分化过程中表达上调,参与组织再生、能量稳态和肥胖相关疾病的调节,然而Col XV对脂肪细胞分化的调节及其分子机制还有待研究。本研究为了明确Col XV调控脂肪细胞分化的作用机制,在脂肪细胞中超表达和干扰Col XV,得到以下结果:
  1.Col XV促进脂肪细胞分化和抑制脂质分解。Col XV在腹股沟白色脂肪、附睾白色脂肪的表达丰度较高,而在肩胛棕色脂肪、肝脏、肌肉和心脏等组织中的表达丰度较低,其中白色脂肪组织中Col XV的表达极显著高于棕色脂肪中的表达(P<0.01)。在高脂饮食(HFD)诱导下,Col XV在腹股沟白脂、附睾白脂和棕脂中的表达均极显著提高(P<0.01)。在脂肪细胞中,随着C/EBPβ、PPARγ和FABP4的表达上调,Col XV的表达极显著上升(P<0.01),而CREB的表达显著下降(P<0.05)。油红O和Bodipy染色发现,Col XV促进脂肪细胞分化,加速脂肪细胞内脂滴的积累。超表达Col XV在0d、4d和8d显著促进脂肪细胞分化标志基因C/EBPβ、PPARγ和FABP4的表达,干扰Col XV后作用相反(P<0.05)。超表达Col XV促进脂合成基因ACCα和FASN的表达,抑制脂分解基因HSL、LPL和ATGL的表达(P<0.05),干扰Col XV后上述基因表达相反。超表达Col XV降低细胞中cAMP和p-PKAThr197的水平,Forskolin逆转这种抑制作用,H89则加强这种抑制作用,干扰Col XV后则激活了cAMP/PKA信号通路。表明Col XV通过抑制cAMP/PKA信号通路促进脂肪细胞分化和抑制脂解。
  2.Col XV通过CREB负转录调控脂肪细胞分化和脂代谢。通过构建长度递减的ColXV启动子荧光素酶报告载体和CREB结合位点(CRE)定点突变的荧光素酶报告载体,双荧光素酶活性分析发现CREB结合在Col XV启动子上-354bp~-334bp处,抑制ColXV的转录活性。油红O染色发现超表达Col XV促进脂肪细胞脂质积累,干扰Col XV降低了脂质生成,CREB激动剂Forskolin处理后使脂滴消融。超表达Col XV促进C/EBPβ、PPARγ和FABP4等的基因表达,干扰Col XV抑制脂分化基因的表达,而Forskolin处理进一步降低了它们的表达。超表达Col XV促进FASN和ACCα的表达,抑制HSL的表达,Forskolin逆转了超表达Col XV对脂代谢的作用。干扰Col XV降低FASN和ACCα的表达,提高HSL的表达,Forskolin增强了干扰Col XV后的作用。表明Col XV通过CREB负转录调节它的启动子活性,进而影响脂肪细胞分化和脂代谢。
  3.Col XV通过DNA甲基化调节脂肪细胞分化和脂代谢。采用亚硫酸氢盐测序法发现在脂肪细胞分化后Col XV的DNA甲基化水平降低,Col XV的表达水平升高,甲基化转移酶(Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b)和CpG结合蛋白3(Mbd3)的mRNA表达显著降低。在脂肪细胞分化第0d和4d,Col XV超表达后抑制了Dnmt1的表达,甲基转移酶抑制剂5-azacytidine(5-Aza-dC)加剧了这一作用,对Dnmt3a和Dnmt3b的作用不显著。5-Aza-dC抑制Col XV的DNA甲基化水平,促进它的mRNA表达。在脂肪细胞分化第0d,Col XV超表达促进C/EBPβ、PPARγ的表达,5-Aza-dC显著降低C/EBPβ、PPARγ的表达;而第4d在Col XV甲基化被抑制后Col XV上调的C/EBPβ和PPARγ的表达被进一步增强。在脂肪细胞分化第0d和第4d,超表达Col XV抑制HSL的mRNA表达,在Col XV甲基化水平降低后加剧了这种抑制作用。油红O结果一致,在分化的脂肪细胞中超表达Col XV促进脂沉积,干扰Col XV抑制脂沉积,Col XV甲基化被抑制后加速了脂肪细胞内脂滴形成。表明Col XV通过DNA甲基化下调来促进脂肪细胞分化和抑制脂肪细胞的分解代谢。
  综上所述,本试验表明Col XV通过抑制cAMP/PKA信号通路来促进脂肪细胞分化和抑制脂质分解,并证实Col XV通过CREB的负转录调控和DNA甲基化抑制来促进脂肪细胞分化和抑制脂肪细胞分解代谢。
[硕士论文] 丁若凡
生物化学与分子生物学 西南交通大学 2017(学位年度)
摘要:增强子可以作为顺式调节元件(Cis-Regulatory Elements,CREs)通过组织特异性/非组织特异性的方式调节基因表达来调控细胞发育和细胞功能。先前研究表明活性增强子通过招募转录因子与RNA聚合酶Ⅱ从而生成增强子RNA(enhancer RNA,eRNA)。然而,各个组织中的不同类型的增强子(例如转录的/非转录的增强子,组织特异性/非组织特异性增强子)的调控网络和特征目前仍不清楚。
  本研究通过整合蛋白修饰(H3K4me1,H3K27ac和H3K4me3)和DNaseⅠ高敏感位点(DNaseⅠ hypersensitive site,DHS)数据,在肾上腺,脑,乳腺,心脏,肝脏,肺,卵巢,胎盘,骨骼肌和肾10个组织中共识别了53924个活性增强子和10307个增强子RNA。我们发现增强子在所有组织中表现出显著的组织特异性,其中绝大多数增强子(83.4%)没有产生转录本。我们还发现增强子更倾向于表达1D-eRNA(增强子的单向转录本)而不是2D-eRNA(增强子的双向转录本),大多数增强子RNA属于长非编码RNA(longnon-conding RNA,lncRNA)(69.8%)和假基因(22.19%)。此外,增强子在所有组织中表现出高保守性,高GC含量和大量的基因组突变,并且这些特征在EnhTS(组织特异性增强子)和EnhUE(非组织特异性增强子),EnheRNA(转录增强子)和Enhno-eRNA(非转录增强子),Enh2D-eRNA(双向转录增强子)和Enh1D-eRNA(单向转录增强子)之间存在显著差异。我们还发现转录因子结合位点(TFBS)显著富集在增强子中心±500bp内,EnheRNA和EnhUE的TFs的富集程度显著高于Enhno-eRNA和EnhTS。此外,我们还发现增强子能显著调控与组织功能相关的临近靶基因的表达。为了探明正常与肿瘤组织中增强子调控特性,我们还通过对肺癌上皮细胞系A549特有的增强子上调的靶基因的功能注释,发现A549特有增强子上调的靶基因显著参与细胞分裂、上调细胞增殖和负调控细胞凋亡等生物进程,并在泛素介导的蛋白水解、肌动蛋白细胞骨架调节和cGMP-PKG信号通路等通路中发挥作用。最后,我们建立了一个免费且界面友好的组织特异性增强子数据库TiED(http://lcbb.swjtu.edu.cn/TiED)来存储这10个组织的增强子的所有数据。
[硕士论文] 朱家明
药物分析学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:细胞是生物体基本结构和功能的单位,细胞研究是征服疾病和揭示生命奥秘的基础环节之一。本文针对体外培养的细胞,利用压电传感技术和电化学方法等,开展了在不同的界面上对细胞的粘附、生长、增殖、损伤等细胞行为和形态变化的研究。
  本研究主要内容包括:⑴将半胱氨酸与甲硫氨酸分别修饰在QCM金电极上,构建两种不同的电极表面:亲水性电极表面和疏水性电极表面。以修饰电极为工作电极,利用循环伏安法(CV)和交流阻抗技术(EIS),结合显微镜观察结果和MTT实验分别对不同电极表面人脐静脉血管内皮细胞HUVEC-C的粘附生长及H2O2诱导的氧化损伤结果进行了研究。结果表明:亲水性电极表面有利于促进细胞的粘附和增殖,而疏水性电极表面对细胞的粘附生长有一定的抑制作用。过氧化氢的强氧化性导致贴壁细胞发生严重的氧化损伤。相对于亲水性电极表面,疏水性电极表面的细胞的损伤程度更大,这与甲硫氨酸修饰电极表面细胞的粘附生长状况较差有关。⑵通过电化学聚合赖氨酸和滴干石墨烯量子点(GQDs)制备了聚赖氨酸(PLL)和GQDs修饰的玻碳电极GCE/PLL/GQDs,利用循环伏安法研究了槲皮素在该修饰电极上的电化学行为。实验结果表明,赖氨酸聚合圈数为100圈、静置时间为200 s、B-R缓冲液pH值为6.0时峰电流最大。利用差分脉冲伏安法(DPV)对不同浓度的槲皮素开展了电化学检测,DPV氧化峰峰电流与槲皮素的浓度在0.05μM~5.0μM范围内呈良好的线性关系。该修饰电极成功用于银杏达莫注射液中槲皮素含量的分析,回收率较高。⑶使用石英晶体微天平(QCM)实时监测人脐带静脉内皮细胞(HUVEC-C)在金电极上的粘附、铺展和增殖过程。细胞的正常粘附行为引起的粘密度效应导致谐振频率的降低和动态电阻的增加。加入H2O2后HUVEC-C细胞的氧化损伤引发细胞铺展面积和电极表面细胞覆盖度的下降,导致QCM响应信号的逆转。研究表明,细胞的损伤程度与H2O2的浓度有关,预先在培养基中加入的0.05 mM槲皮素可以完全消除1.0 mM H2O2氧化作用的影响。当2.5 mM H2O2诱导氧化损伤HUVEC-C细胞时,增加槲皮素的浓度对HUVEC-C细胞有一定的保护作用。显微镜观察、电化学测量和MTT实验均验证了QCM测定结果,表明槲皮素能作为一种有效的黄酮类抗氧化剂用于预防和治疗血管内皮细胞的氧化损伤。
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