绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
导航
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 31
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 603 条结果
[博士论文] 江莹
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:癌症独特的能量代谢方式是其恶性表型的标志性特征之一,发展针对癌症能量代谢的治疗手段将是实现癌症有效治疗的新方向。有多篇报道指出细胞小窝结构的成分蛋白:小窝蛋白1(caveolin-1, Cav-1)与细胞能量代谢密切相关,同时小窝结构也是细胞与外界环境进行信息交换的桥梁,其运动性是其功能发挥的基础。本文通过研究Cav-1/小窝结构内吞及运动性信号途径,以及Cav-1和线粒体之间的相互作用,揭示Cav-1在细胞能量代谢中所扮演的角色,以及Cav-1运动性的关键作用,取得的主要研究成果如下:
  1. RalA调节Cav-1/小窝依赖的内吞过程:(a)通过考察牛血清白蛋白(BSA,bovine serum albumin)诱导的内吞过程中RalA活化状态的变化,证明内吞过程可触发RalA活化。(b)通过检测RalA持续活化突变体和显性负突变体对内吞以及RalA,Cav-1结合水平的影响,说明内吞过程的实现以及RalA与Cav-1的结合都需要RalA活化。(c)利用siRNA的方法抑制RalA的表达,同时转染质粒恢复其表达,对比抑制前后以及恢复表达后内吞水平的变化,证明RalA是Cav-1/小窝内吞的重要调节分子。
  2. RalA通过活化下游效应分子PLD(Phospholipase D)调节Cav-1/小窝依赖的内吞:(a)通过研究PLD非特异性抑制剂对内吞的影响,证实PLD活化对内吞的促进作用。(b)采用PLD1和PLD2特异性抑制剂确定只有PLD2是内吞的调节分子。(c)PLD2抑制剂和突变体对Cav-1-RFP运动性的抑制再次证实PLD2在此过程中的重要作用。(d)通过PA感应器GFP-PASS(phosphatidic acid biosensor with superior sensitivity)观察内吞过程中PLD2下游产物PA(phosphatidic acid)在小窝生成并由此促进Cav-1/小窝依赖的内吞。
  3. Cav-1抑制引起线粒体形态学的改变:(a)采用siRNA的手段抑制Cav-1的表达,同时观察线粒体形态,发现线粒体呈现片段化和增长的双重改变。(b)利用PA-GFP(photoactive-GFP)在线粒体的扩散程度量化线粒体的基质融合程度,此结果亦可代表线粒体的动态水平。对比Cav-1抑制前后,发现抑制后细胞的线粒体有更高的动态水平。(c)通过FRAP(fluorescence recovery after photobleaching)方法测试基质蛋白的运动速率,进一步强化Cav-1抑制提升线粒体动态水平的结论。
  4. Cav-1通过抑制Mfn2和Drp1的线粒体定位改变线粒体动态:(a)线粒体组分分离发现抑制Cav-1,Mfn2和Drp1在线粒体的表达量增加。(b)通过免疫共沉淀和FRET(fluorescence resonance energy transfer)的方法证实Cav-1分别与Mfn2和Drp1二者结合。(c)免疫荧光染色同样检测到抑制Cav-1时Drp1在线粒体的定位增加。(d)引入ER和线粒体的人工链接分子OMM-ER-mRFP加强ER和线粒体交互,发现Mfn2在Cav-1抑制的情况下发生ER回流,说明Cav-1可能通过调节ER和线粒体交互来调整Mfn2在二者的表达水平。
  5. Cav-1的抑制是线粒体自噬的诱因:(a)对比Cav-1抑制前后线粒体比量的变化发现Cav-1抑制导致线粒体比量减少。(b)通过对比细胞自噬标志分子表达量,发现Cav-1抑制细胞的自噬水平升高。(c)引入mt-Keima检测线粒体自噬,证实Cav-1的低表达可诱导线粒体自噬的发生。
  6. RalA通过Cav-1影响线粒体功能和细胞能量代谢:(a)采用siRNA的手段实现RalA和Cav-1的单独和共同抑制。(b)检测MMP,ATP,H2O2和糖酵解产物L-lactate的生成,发现RalA和Cav-1抑制的细胞中出现MMP和ATP生成的降低以及H2O2和L-lactate的增加,并且RalA和Cav-1共同抑制时与单独抑制Cav-1结果无异,证明RalA的作用是借Cav-1发挥的。
  总之,本论文通过对Cav-1/小窝内吞途径的分析确立了RalA在此过程中的重要调节作用,并证实该作用是通过其下游效应分子PLD催化PA在小窝生成而实现的。通过研究Cav-1与线粒体的关系,发现Cav-1抑制Mfn2和Drp1的线粒体表达进而调节线粒体动态水平和线粒体自噬。最后将RalA和Cav-1联系起来,说明Cav-1的表达水平和运动性均能对线粒体功能和细胞能量代谢带来重大影响。
[硕士论文] 贾龙略
生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:miRNA的作用是通过同靶mRNA的3'端靶向结合降解或者是抑制其靶基因翻译,进而可以对靶基因的转录后进行调控。另miRNA可识别相应的靶基因且不是单一映射关系,同时存有多个不同miRNA调控同一靶基因,而miRNA也可以调控多个不同的靶基因。我们前期预测发现斑马鱼中nup4是miR-203的靶基因,并且在三唑磷,化学名称O,O-二乙基-O-(1-苯基-1,2,4-三唑-3-基)硫代磷酸酯的胁迫下nup43的表达受miR-203的调控。
  本研究利用MicrocosmTargets软件预测得出nup43为miR-203与miR-217共同调控靶基因,通过实验验证了这2个miRNAs分别与nup4之间的关系。评估了三唑磷暴露下斑马鱼中这2个miRNAs的表达,研究2种miRNAs能否调控nup43的表达,结果发现随着三唑磷处理浓度的升高,斑马鱼中miR-203基因的表达量显著上调,斑马鱼中miR-217基因的表达量显著下调。miRNA可作为环境化学物质或致癌基因得生物标记物。为了解释三唑磷处理后miRNA表达的变化,进一步验证生物信息学预测的结果。我们通过将nup433'-UTR中miR-203和miR-217结合位点分别敲除,成功构建了2个重组海肾荧光素酶载体,分别命名为pRL/S-K.O-203、pRL/S-K.O-217。通过双荧光素酶报告基因法验证了斑马鱼nup433'-UTR中存在miR-217的结合位点。通过对ZF4细胞转染miR-217 mimic后,检测细胞中nup43的表达量,发现nup43在mRNA水平及蛋白水平都显著下调,而转染miR-217 inhibitor后,nup4的mRNA水平及蛋白水平则显著上调,但对ZF4细胞转染miR-203mimic后,其nup43表达量为上调,但转染miR-203 inhibitor后,其nup43表达量为显著下调。依上述可得,nup43是miR-203和miR-217的靶基因,在三唑磷暴露下miR-203与miR-217的变化表明其可以作为暴露于三唑磷环境的生物标志物。
[硕士论文] 张俊有
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的恶性肿瘤,多发于成人,肝癌的发生、发展和转移是一个复杂的过程,受多个因子和基因的调节。微小核糖核酸RNA(MicroRNA,miRNA)是一类长度在19-24个核苷酸范围内的内源性非编码RNA,miRNA能够通过与靶基因mRNA3' UTR互补结合来抑制翻译或者促进mRNA降解,从而调控相关基因的表达。大量研究报道称miRNA在许多肿瘤细胞中都存在差异性表达,并且在肿瘤的发生发展中都可能发挥着重要的作用。实验室前期的研究发现一定浓度的脐带间充质干细胞(Umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)条件培养基能够抑制肝癌细胞HepG2的增殖,并且通过高通量测序技术,分析了UC-MSCs条件培养基共培养后HepG2 miRNAs的差异表达谱,找到了一些可能相关的miRNAs。其中miR-3065-5p和miR-1307-5p在UC-MSCs条件培养基处理HepG2后表达水平显著上调。
  本研究通过qRT-PCR检测了三种肝癌细胞系(HepG2、MHCC97-L、MHCC87-H)和正常肝细胞系L02中miR-3065-5p的表达是否存在差异;结果显示,相较正常肝细胞L02,miR-3065-5p在肝癌细胞系中的表达明显下调,接下来我们通过体外合成miR-3065-5p质粒转染三种肝癌细胞,结果发现过表达miR-3065-5p能够显著抑制三种肝癌细胞的增殖、侵袭、克隆形成能力。此外,我们通过生物信息学预测到SATB1可能是miR-3065-5p的相关靶基因,通过双荧光素酶报告基因实验进一步检测了预测的可靠性,实验结果显示SATB1与miR-3065-5p存在互补结合位点。qRT-PCR与Western blot结果显示过表达的miR-3065-5p能够显著抑制SATB1表达水平。最后通过体外合成siRNA干扰SATB1在肝癌细胞中的表达,结果显示,干扰SATB1后也能显著抑制肝癌细胞的增殖,其效果与miR-3065-5p类似。在miR-1307-5p的研究中,我们发现过表达的miR-1307-5p也能显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等生物学特性,而在靶基因的筛选验证中,我们通过生物信息学软件预测了PIM3可能是miR-1307-5p的靶基因,但是双荧光素酶报告基因实验效果并不明显,说明PIM3并不是miR-1307-5p的相关靶基因,其靶基因有待进一步筛选验证。
[硕士论文] 康文渊
生物工程 西南交通大学 2017(学位年度)
摘要:芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AhR)属于配体依赖性的碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子超家族中的PAS(Per-Arnt-Sim)亚家族,可通过与一些环境污染物结合激活下游多种基因表达,进而介导致癌、致畸和生物转化等作用。AhR配体可以分为合成配体与天然配体两类,合成配体包括有毒的卤代芳香烃类(HAHs),多环芳香烃类(PAHs)及其衍生物,如多氯代二苯并-对-二恶英(PCDDs),二苯并呋喃(PCDFs),四氯二苯并-p-二恶英(TCDD)等;在非环境污染物作为配体时AhR则扮演不同的生理学角色,如影响细胞生长、分化和凋亡,调控自身免疫,炎症以及癌症进程。
  本文通过对野生型(WT)和三个突变模型(Phe289Ala,Tyr316Ala,Ile319Ala)利用GROMACS软件包中的amber99sb力场进行分子动力学模拟,从蛋白稳定性,蛋白结构变化,蛋白结合腔变化,及蛋白和配体结合能力4个方面分析三个残基的门控作用。通过对AhR LBD与不同配体形成的复合物结构进行分子动力学模拟,从蛋白与配体结合模式,配体结合能量变化,蛋白结构变化和结合腔变化4个方面分析不同配体对AhRLBD结构域产生的影响。研究发现Phe289、Tyr316、Ile319三个疏水性氨基酸残基的突变将会降低AhR配体结合结构域(AhR LBD)环境的稳定性,并且通过疏水联系扮演一个“门控”残基的作用。整体的结构分析表明结合腔附近的突变会降低结合腔的稳定性,导致明显的柔性变化并且导致配体活性降低和逃逸。把AhR与不同类型的配体进行模拟,发现不同的配体在AhR LBD结构域中有不同的结合位点。然而一些关键的氨基酸残基,如Phe289,Phe318,Gln377等。这些氨基酸残基位点对于不同的配体可能有不同的构象以更加契合小分子从而牢牢结合小分子配体。我们同样发现氨基酸残基Phe289,Ile319和Met342对于不同配体具有较高的能量贡献。同时AhR在宏观上可以调整自己的构象与形状从而适应不同结构的配体,主要的柔性运动发生在A-B-loop以及E-alpha上。本研究结果为深入认识配体对AhR蛋白的作用机制,以及以AhR蛋白为靶点的药物设计、筛选和产品开发提供了重要理论依据。
[硕士论文] 强丽华
生物学;生物化学与分子生物学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:结核分枝杆菌是一种兼性胞内致病菌,以巨噬细胞为主要的宿主细胞,并在其中存活和生长。哺乳动物细胞入侵蛋白(mammalian cell entry,Mce)Mce是由mce基因编码的一组分泌或者膜表面粘附蛋白,已被证明具有促进分枝杆菌入侵宿主细胞的功能。其中mce2操纵子就与分枝杆菌的毒力和肉芽肿形成有关,但是,mce2操纵子编码的Mce2E蛋白的相关功能尚不清楚。脂多糖以及病原菌的感染会刺激巨噬细胞中核因子κ轻链B细胞活化因子(nuclear factor kappa-light-chain-enchancer of activated B cell,NF-κB)和丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,进而促进TNFα和IL-1β等炎症因子的释放,激活宿主固有免疫应答。结核分枝杆菌表面的LAM具有类似脂多糖的功能。
  本研究在HEK293T细胞中瞬时表达Mce2E蛋白,通过双荧光报告基因检测对NF-κB和MAPKs信号通路的影响。实验结果表明,Mce2E蛋白对TNFα激活的NF-κB信号通路没有明显的影响。但是能部分地抑制RacL61诱导的JNK/p38信号通路的激活。而对于RasV12、v-Raf、 MEK1-ED诱导的ERK(Extracellular regulated protein kinase)信号通路的活化有明显的抑制作用。于是,我们针对ERK信号通路做了相应的研究,按照Ras-Raf-MEK-ERK通路,我们推测Mce2E蛋白可能抑制节点在MEK1或ERK1/2上。随后,我们通过免疫共沉淀实验确定了Mce2E和ERK1/2的相互作用,而不是MEK1。在蛋白结构模序的预测中,我们发现Mce2E蛋白具有一种类似于真核细胞中特异地结合ERK1/2的模序,即D模序。我们构建了D模序的突变体Mce2E(AAA),研究表明Mce2E-AAA失去抑制ERK活化的功能。由此可见Mce2E蛋白主要通过D模序影响ERK信号通路的活化。此外,在CFU(Colony-Forming Units)、QRT-PCR(Quantitative Real-timePCR)、ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)等相关实验发现,Mce2E能促进结核分枝杆菌在巨噬细胞中的存活,并且能下调TNFα和IL-6炎症因子的表达,从而达到促进分枝杆菌胞内存活的目的。结核分枝杆菌不仅能进入巨噬细胞,还能入侵肺上皮细胞等一些非专职吞噬细胞。我们在转染Mce2E至上皮细胞中时注意到转染了Mce2E的细胞的增殖能力明显增强,这个现象提示Mce2E可能调控肿瘤细胞的增殖并因此而促进肿瘤的发展进程。在酵母双杂交实验中,我们发现筛选到的Mce2E互作蛋白中,许多与细胞增殖及迁移相关。相关文献也提示Mce家族蛋白确实具有促增殖,迁移的作用。于是我们用过表达Mce2E和沉默Mce2E的菌株分别去感染A549细胞,结果发现Mce2E能促进A549细胞的增殖。与此同时,我们还研究了Mce2E对A549细胞迁移、侵袭的影响,实验结果表明,Mce2E蛋白对A549细胞的迁移和侵袭能力同样具有促进作用。随后的裸鼠实验进一步证明,过表达Mce2E菌株感染的肿瘤体积明显比没有过表达Mce2E的大,沉默Mce2E的菌株的肿瘤体积比野生型菌株感染的小。在酵母双杂交的实验中,我们筛选到与增殖相关的蛋白eEF1A1。过表达Mce2E的菌株感染实验中发现CHX处理的情况下,eEF1A1蛋白并没有随着时间延长而降解,表明过表达Mce2E菌株能稳定eEF1A1蛋白。随后,通过体内泛素化实验表明Mce2E蛋白能减弱对eEF1A1的泛素化修饰,在分别共转HA-K48(only),HA-K63(only)质粒的体外泛素化实验中(除了48或63位以外所有的赖氨酸都突变为精氨酸的泛素突变体),我们发现Mce2E蛋白很明显地阻断K48对eEF1A1的泛素化修饰作用,而K63泛素链则不明显。该结果说明Mce2E阻断的是eEF1A1蛋白K48位的泛素化修饰。综上所述,我们的研究结果揭示了结核分枝杆菌Mce2E蛋白抑制宿主固有免疫和促进分枝杆菌胞内存活的分子机制;并进一步发现Mce2E蛋白可以促进肿瘤细胞A549的增殖、迁移以及侵袭能力。该成果为炎癌转化相关研究提供了一个新的视角,以便更好地攻克慢性感染和炎症所致的肿瘤这一世界难题。
[硕士论文] 赵卫明
生物学·细胞生物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:作为一种胰蛋白酶抑制剂,丝氨酸蛋白酶抑制剂Ⅰ(serine peptidase inhibitor, Kazaltype1,SPINK1)的空间结构与表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)的非常相似。研究表明,SPINK1的生物学功能也类似于EGF,能够促进正常细胞和癌细胞的增殖和分化。本实验室采用大鼠全基因组芯片Rat Genome2302.0检测2/3部分肝切除(partial hepatectomy, PH)后再生肝肝细胞的基因表达谱,发现Spink1在肝切除后的6、24和72 h表达显著上调。众所周知PH后6-72 h肝细胞增殖明显,表明Spink1与大鼠再生肝肝细胞的增殖密切相关。基因组芯片检测二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DENA)诱导的大鼠肝癌细胞的基因表达谱,发现Spink1在诱导后的12和16w表达显著上调,并且诱导后12-16w肝细胞增殖明显,表明Spink1与大鼠肝癌细胞的增殖密切相关。然而,目前对SPINK1调控肝再生中肝细胞,以及肝癌细胞增殖的机理还不完全清楚。研究表明,SPINK1能够与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)相结合,调控细胞的增殖、分化和迁移等多种生理活动。本文通过免疫共沉淀(immunoprecipitation assay, IP)的方法也发现SPINK1能够与EGFR相结合。最近的研究表明EGFR被生长因子等激活后,能够通过p38MAPK、ERK、JNK、PKC、JAK-STAT和AKT等多条信号通路促进细胞的增殖。本文通过IPA(Ingenuity Pathway Analysis9.0)软件,结合相关文献分析SPINK1与EGFR信号通路的互作网络,发现SPINK1可能与EGFR结合后通过上述6条信号通路调控细胞的增殖。
  本研究通过基因添加的方法处理BRL-3A细胞,并用重组蛋白处理BRL-3A细胞和RH-35细胞,通过MTT、EdU、流式细胞术等方法检测SPINK1上调表达对上述两种细胞活力、增殖和周期等的影响,通过免疫共沉淀、qRT-PCR和western blot等方法推测SPINK1调控两种细胞增殖的机理。结果表明,通过基因添加的方法上调BRL-3A细胞内源性Spink1的表达后,细胞的生长活力和增殖,S期和G2/M期的细胞数量,细胞增殖和抗凋亡相关基因/蛋白的表达都明显增加,然而,G1期的细胞数量和促凋亡相关基因/蛋白的表达都明显减少。通过qRT-PCR和western blot等方法检测SPINK1信号通路相关基因/蛋白的变化,发现p38,ERK和JNK信号通路相关基因/蛋白的表达发生显著的变化。当用外源性的重组大鼠SPINK1蛋白(rat recombinant SPINK1,rrSPINK1)处理BRL-3A细胞时,所得到的结果与上述结果相似。当用rrSPINK1处理RH-35细胞时,我们发现与处理BRL-3A细胞所得到的结果相似,RH-35细胞的生长活力和增殖,S期和G2/M期的细胞数量,细胞增殖和抗凋亡相关基因/蛋白的表达都明显提高,G1期的细胞数量和凋亡相关基因/蛋白的表达都明显减少。qRT-PCR和western blot检测结果表明,在RH-35细胞中,p38和JAK-STAT3信号通路相关基因/蛋白的表达发生显著的变化。本文用pEGFR抗体处理稳定表达内源性Spink1的阳性单克隆BRL-3A细胞发现,该细胞的生长活力受到明显的抑制,并且抑制效果随着抗体剂量的增加愈加明显,进一步验证了SPINK1与EGFR结合后发挥其相应的功能。
[硕士论文] 周理华
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:肿瘤严重威胁人民的健康和生命,而肿瘤的早期诊断与精确诊断是提高其治愈率及改善患者生存质量的关键所在。因此发展高、精、尖的诊断技术是现代医学的主要目标。而影像学尤其是分子影像学的飞速发展在疾病的早期诊断,活性药物筛选,甚至实时评价治疗效果等方面都发挥着越来越重要的作用。而纳米探针作为分子影像造影剂由于其组织穿透性、高分辨率、生物相容性、功能多样化等优点,近年来得到了大力发展。本文构建了2种新的分子影像造影剂并将其用于多模态成像和光学治疗。
  本研究主要内容包括:⑴首先筛选到具有肿瘤靶向的花菁类染料Cy5,然后将这种具有靶向的Cy5分子通过化学修饰偶联到四氧化三铁纳米颗粒表面形成新型的Cy5功能化氧化铁纳米探针(Cy5-Fe3O4),并应用于双模态活体荧光成像和磁共振成像。体外细胞实验研究结果表明Cy5分子能通过细胞膜上阴离子转运蛋白OATPs跨膜运输进入细胞内并定位到线粒体上,由于肿瘤细胞阴离子转运蛋白OATPs过表达,所以Cy5分子具有很好的肿瘤细胞靶向性。双模态活体成像实验表明,Cy5功能化的四氧化三铁纳米探针有很好地靶向肿瘤效果,能对动物进行活体荧光成像和磁共振成像。本研究为新型分子影像纳米探针的设计以及肿瘤的靶向成像提供了新思路。⑵构建了一种近红外七甲川花菁小分子衍生物IR808功能化的MnO磁性纳米探针并将其用于肿瘤靶向多模态成像。该纳米探针是通过共价交联的方式将IR808染料组装到两亲性聚合物包裹的磁性MnO纳米颗粒表面而形成。细胞实验结果表明该探针通过IR808的介导靶向肿瘤细胞并且进入细胞线粒体。动物成像实验结果表明,IR808-MnO纳米探针作为一种高效的、稳定的靶向多模态成像纳米探针能够对动物肿瘤进行特异的荧光/磁共振/光声三模成像。而且该探针相比于游离的IR808有更好的靶向效果,且解决了游离的IR808小分子易代谢、不稳定的缺点。本研究为临床应用提供一种潜在的有吸引力的肿瘤诊断手段。⑶利用构建的IR808-MnO纳米探针其本身所具有的对肿瘤微环境H+/H2O2产生特异性响应并催化产氧的特征将其应用于肿瘤的靶向光热/光动力治疗。体外实验结果表明,IR808-MnO纳米光敏剂材料在激光的照射下能产生ROS,并且能产生更高的局部温度。在体外模拟肿瘤微环境进行细胞治疗的研究结果表明,IR808-MnO纳米光敏剂表现出良好的PTT/PDT的体外细胞治疗效果。活体动物实验表明,IR808-MnO纳米光敏剂在动物活体内有非常好的肿瘤光学治疗效果。本研究表明IR808-MnO纳米光敏剂能高效的特异性靶向肿瘤,缓解肿瘤微酸环境,改善肿瘤缺氧环境,通过产生ROS杀死肿瘤细胞,并且同时具有光热和光动力治疗效果。这种IR808-MnO纳米光敏剂解决传统光敏剂缺乏靶向、光毒性、治疗效果不足的问题。本研究在第二个研究工作的基础上不仅实现了癌症的高效、高选择性光热/光动力治疗,而且实现了疗效的监测。
[硕士论文] 白静
生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:继手术,放疗,化疗后,肿瘤的免疫疗法已成为第四种行之有效的治疗手段,近期因发展迅速,而广受关注。其中,嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptors-T cell,CAR-T)是一种新兴的过继细胞疗法(Adoptive cell transfer therapy,ACT),该技术将患者的T细胞在体外修饰,活化和增殖后回输到患者体内,通过T细胞表达的特异性受体,靶向性的识别肿瘤细胞,并显示较强的杀伤活性和持久性。PD-L1(Programmed deathligand-1)是程序性死亡分子1(Programmed death-1,PD-1)的配体,主要诱导性的表达在上皮细胞(如肿瘤细胞)和免疫细胞(如肿瘤浸润淋巴细胞)等,在免疫应答负调控中发挥重要作用,PD-1/PD-L1信号通路的激活,有利于形成肿瘤微环境,使肿瘤细胞逃避免疫系统的免疫监视和免疫杀伤,而阻断该信号通路,在一定程度上,促进可识别肿瘤抗原并产生特异性反应的T细胞增殖,发挥其杀伤肿瘤细胞的作用。故本课题设计了PD-L1抗原特异CAR-T细胞,既可以阻断PD-1/PD-L1信号通路,提高T细胞介导的肿瘤免疫治疗,又可以特异性的杀死肿瘤细胞,并且构建的第三代CAR基因,可以增强杀伤的活性和持久性。
  本研究构建了PD-L1(73-739)基因的原核表达载体,分离纯化His-PD-L1融合蛋白,免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术和有限稀释法,筛选获得2株能够稳定分泌PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,杂交瘤细胞腹腔接种BALB/c雌性小鼠,通过收集腹水制备并纯化抗体,进行Westem Boltting验证,利用ELISA法检测,优选其中一株杂交瘤细胞株,提取杂交瘤细胞总RNA,逆转录合成第一链cDNA,PCR扩增单克隆抗体单链可变区片段,克隆片段经人源化替换与共刺激信号分子CD28、CD137和胞内信号分子CD3-ζ链的基因组合,构建并合成第三代CAR基因,将合成的CAR基因构建于慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP上,慢病毒载体与包膜载体pLP1、pLP2以及包被载体pLP-VSVG按照优化比例,利用脂质体3000共转染到293T细胞完成慢病毒包装,使用PEG浓缩法,获得有活性的抗PD-L1慢病毒,使用CD8+磁珠分离外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cell,PBMC)中的CD8+T细胞,经过体外刺激,慢病毒感染CD8+T细胞,待其扩增5d左右,进行CAR表达的测定,扩增20倍左右,利用非放射性细胞毒性杀伤CytoTox96和ELISA法检测IFN-γ的分泌来测定CAR-T细胞的体外活性。
[硕士论文] 李欧阳
生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:巨噬细胞(Macrophages,Mψ)是造血系统中最具可塑性的细胞,存在于所有的组织中,在细胞正常发育、体内平衡、组织修复和对病原体的免疫反应中扮演了许多不同的角色。结核(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的人兽共患慢性传染病,是严重威胁人类健康的三大感染性疾病之一。在抗MTB感染的免疫应答中,巨噬细胞是其主要的宿主细胞,所以研究巨噬细胞与MTB的相互作用对结核病的发生和发展起着非常重要的作用。目前实验研究用人类巨噬细胞多来源于肿瘤细胞系和外周血单核细胞。肿瘤细胞系来源的巨噬细胞容易发生遗传结构改变,造成功能缺失,外周血来源的巨噬细胞则获取困难且数量较少,如何获取大量有功能活性的巨噬细胞是研究的关键,诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS)技术的出现为体外获得大量巨噬细胞提供了新思路。iPS是通过体外导入特定的转录因子基因将终末分化的体细胞重编程为具有胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)特性的多能细胞,即能够自我更新并可分化为3个胚层来源所有细胞的能力。iPS避免伦理道德和免疫排斥反应等局限而备受青睐。研究已证实iPS在体外特定诱导条件下,能够定向分化为巨噬细胞。iPS诱导分化为巨噬细胞的方法大致可以分为三类:通过iPS形成类胚体(Embryonic body,EB);与小鼠骨髓基质细胞OP9,S17等共培养;在基质胶上添加不同细胞因子直接诱导分化。目前,iPS来源巨噬细胞的研究大都集中在肿瘤免疫等方面,尚缺乏iPS来源的巨噬细胞在抗结核免疫机理方面的研究。
  本研究以人iPS(human iPS,hiPS)为靶细胞,体外诱导分化为巨噬细胞,并探讨了该巨噬细胞对卡介苗(BacillusCalmette-Guérin,BCG)的免疫功能。首先通过碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP),反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR),免疫细胞化学(immunocytochemistry),EB分化实验等方法对hiPS进行多能性的检测,在此基础上,通过EB形成无饲养层法和OP9共培养两种方法诱导人iPS分化为巨噬细胞(iPS-Mψ),并对无饲养层法来源的iPS-Mψ进行了细胞形态学观察、吉姆萨染色、非特异性酯酶染色(α-NAE)、吞噬功能和细胞表面特异性抗原表达检测等一系列鉴定。最后,利用BCG感染体外培养iPS-Mψ,并分析BCG对iPS-Mψ一氧化氮(nitric oxide,NO)的产生、肿瘤坏死因子-alpha(tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达情况,同时以人单核细胞系THP-1来源的巨噬细胞(THP-1-Mψ)为对照。结果表明,hiPS经AKP染色呈阳性,表达Oct-4和Nanog;所形成的类胚体表达内胚层标记基因AFP,中胚层标记基因Gata-1和外胚层标记基因Nestin,表明靶细胞hiPS具有多能干细胞特性,能够用于后续分化实验;无饲养层类胚体形成的方法和以OP9为饲养层两种方法得到的iPS-Mψ具有巨噬细胞所特有的形态特征(圆形、椭圆形、梭形及不规则形等,部分细胞可见伪足和凸起);进一步对iPS-Mψ进行特性和功能鉴定发现,iPS-Mψ吉姆萨染色和非特异性酯酶染色(α-NAE)染色阳性,并具有较强的吞噬能力,同时可检测到特异性的表面抗原白细胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)CD14、CD11b、CD40、CD68和组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)MHC-Ⅱ的表达。与未感染的对照组相比,BCG感染24 h后iPS-Mψ产生的NO和TNF-α的表达显著增加(P<0.01),细胞的凋亡率显著升高(P<0.01),Caspase-3的表达显著增加(P<0.01),而抑制了Bcl-2的表达显著减低(P<0.01)。
[硕士论文] 周玲
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本文对胃癌细胞中蛋白酶体介导的小G蛋白Rif降解及lncRNA表达谱进行了研究。Rif是Rho小G蛋白家族成员,可以调控细胞骨架的结构,其活性通过结合GDP或GTP进行调控。近年来研究发现Rho小G蛋白的活性也可以通过泛素化介导的蛋白酶体降解来调控,然而,Rif的活性是否可以通过蛋白酶体降解进行调节至今还没有相关的研究。本研究发现Rif与泛素化连接酶SCF复合物的支架蛋白Cullin1存在相互作用关系,并可以改变SCF复合物调控蛋白NEDD8的细胞内定位,可能是一个SCF复合物的底物。同时,实验结果证实Rif是一个半衰期短的蛋白,其表达水平受到Cullin1表达的负调控。通过体内体外蛋白酶体降解实验,进一步证实Cullin1可以介导Rif在蛋白酶体中降解。在胃癌细胞中,抑制Rif蛋白表达会导致细胞周期抑制蛋白p27的表达上调,表明蛋白酶体介导的Rif降解可能有助于抑制胃癌细胞增殖。通过基因芯片检测手段,对胃癌细胞DNA复制期(S期)特异mRNA+lncRNA的表达谱进行分析,找出了胃癌细胞相对于正常胃上皮细胞在S期表达谱的差异。我们的研究结果首次揭示了蛋白酶体介导的Rif蛋白降解对胃癌的可能调控作用机制,筛选出了胃癌细胞DNA复制期特异的lncRNA及mRNA组合,为后续详细研究胃癌细胞的DNA复制调控奠定了基础。
[硕士论文] 杨佩佩
生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase,IDH)是一类在三羧酸循环中发挥关键作用的酶家族。人类基因组有5种IDH基因,可编码生成三种异柠檬酸脱氢酶(IDH1、IDH2及IDH3),其中IDH2位于线粒体,催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-KG)和NADPH。已有研究表明在不同肿瘤中存在各种IDH突变体,包括急性髓细胞白血病(AML)、脑肿瘤、神经胶质瘤等,其最为常见的突变碱基位于R132(IDH1)、R140与R172(IDH2)。IDH突变体将α-KG转化生成肿瘤代谢物2-羟戊二酸(2-HG),从而紊乱了一系列α-KG依赖性双加氧酶反应。具体表现为:促进组蛋白赖氨酸甲基化;抑制10-11易位酶家族(TET)羟甲基化,进而激活CpG岛的DNA甲基化;稳定缺氧诱导因子(HIF-1α)的表达,上调血管内皮生长因子(VEGF)。
  本研究通过分析不同突变体的IDH2结构、功能与稳定性,将对深入理解IDH2突变导致肿瘤发生、增殖的分子机制及其诊疗提供一些线索和参考。本研究选用哺乳细胞表达载体pCMV6-AC-Myc-His,通过基因克隆、重叠PCR、双酶切鉴定与测序成功构建11个IDH2重组表达载体:WT、R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P。在此基础上,在293T与小鼠小胶质细胞BV2中瞬时转染过表达IDH2野生型与不同突变体,检测蛋白表达与相关信号通路(Western)、细胞代谢(检测酶活力、葡萄糖及乳酸、ROS变化)、蛋白降解(Western)、蛋白质与热激蛋白90相互作用(免疫共沉淀)等实验,通过生物信息学同源模型构建,分析突变对IDH2结构的影响,并与药物导致蛋白降解的结果进行相互验证与比对,探究IDH2野生型和突变体之间结构、功能与稳定性的差异。结果表明:野生型与突变体R140/R172在293T和BV2细胞中表达水平具有明显差异;突变体IDH2酶活力显著低于野生型;在293T细胞中,与野生型IDH2相比较,R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突变体过表达降低细胞乳酸含量,R172S、R172K、R172W、R172G突变体过表达导致葡萄糖含量升高,R140G、 R140Q、 R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C突变体ROS含量均显著降低;不同突变体的过表达对细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路影响不同,其中多个突变体过表达抑制pAKT和pS6的表达,并导致Cyclin D1表达下调;这些结果表明突变体IDH2过表达减缓了细胞代谢与生长。而在BV2细胞中,过表达R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突变体增加了TNF-α表达;其中R172S、R172M、R172W、R172G突变体过表达诱导IL-6表达,推测这些突变体的过表达可能与炎症反应的发生有一定的关联;泛素化蛋白连接酶抑制剂Bortezomib对野生型IDH2表达无影响,而对突变体R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K表达敏感,促使其蛋白降解;对过表达的突变体R172M、R172W、R172G、R172C、R172P具有耐药性,药物处理过后的表达水平并没有发生明显变化。同源模建结构分析表明相应的点突变影响了蛋白质的结构。HSP90抑制剂17-AAG对突变体IDH2过表达并无影响,免疫共沉淀结果表明HSP90与IDH2无相互作用。
[硕士论文] 张婷
内科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:⑴检测恶性实体瘤(malignant solid tumors)患者血浆中组织因子阳性微粒(tissue factor positive microparticles,TF+MP)的表达水平,初步探讨其在恶性实体瘤中的表达;⑵比较在恶性实体瘤不同分期中TF+MP的表达水平,探讨其是否与肿瘤进展相关;⑶比较恶性实体瘤合并血栓形成中TF+MP的表达水平,探讨TF+MP在肿瘤合并血栓形成中的作用;⑷检测恶性实体瘤在麻醉前后TF+MP表达水平,探讨麻醉因素对肿瘤患者中TF+MP的影响;⑸检测恶性实体瘤患者在手术前后中TF+MP表达水平,探讨恶性实体瘤患者手术后易发血栓形成的可能原因。
  方法:收集住院并行手术治疗的恶性实体瘤患者36例为实验组及健康体检者29例为对照组。检测恶性实体瘤患者体内TF+MP的表达水平并比较肿瘤不同分期、合并血栓形成以及麻醉前后和手术前后中TF+MP的变化情况:对照组抽取清晨空腹静脉血,实验组分别于麻醉前、麻醉后和手术后抽取空腹静脉血,两次离心处理后得到乏血小板血浆(platelet poor plasma,PPP),采取免疫荧光技术用FITC-Annexin-Ⅴ抗体和 PE-TF抗体标记目的颗粒TF+MP,然后采用流式细胞仪进行检测并分析目的颗粒TF+MP:直径0.1-1.0um、FITC-Annexin-Ⅴ抗体和 PE-TF抗体双标阳性。最后比较各组中TF+MP的表达情况。
  结果:①TF+MP在恶性实体肿瘤患者与健康对照组之间的整体表达水平:TF+MP在恶性实体瘤患者体内的表达比健康组中的表达升高:(25.45±16.04)%vs(11.31±6.22)%,t=3.934,P<0.001,提示在恶性实体瘤患者中TF+MP高表达。②TF+MP在肿瘤各分期中的表达水平:在Ⅰ期肿瘤患者体内的TF+MP水平与健康组无明显差异:(15.22±12.93)%vs(11.31±6.22)%,t=1.147,P=0.261;Ⅱ-Ⅳ期肿瘤患者的TF+MP表达明显比Ⅰ期升高(P<0.05),而Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期肿瘤患者之间表达的TF+MP无明显变化(P>0.05):(15.22±12.93)%vs(28.89±8.24)%vs(28.03±19.38)%vs(33.60±7.85)%。提示进展期的恶性实体瘤表达的TF+MP明显增高。③TF+MP在恶性实体瘤合并VTE患者中的表达水平: TF+MP在恶性实体瘤合并VTE的患者的表达比未合并VTE的患者有显著升高趋势:33.0%,提示TF+MP增高在恶性实体瘤合并血栓形成患者中可能发挥了重要作用。④TF+MP在恶性实体瘤患者麻醉前后的表达水平:在恶性实体瘤患者麻醉前后体内TF+MP表达水平无明显变化:(25.45±16.04)%vs(24.68±15.05)%, t=0.206,P=0.838,提示麻醉因素对患者术后TF+MP的表达无显著影响。⑤TF+MP在恶性实体瘤患者手术前后的表达水平:恶性实体瘤患者手术前后比较,TF+MP的表达在术后有所增高:(24.68±15.05)%vs(32.99±17.92)%, t=2.074,P=0.042,提示手术可促进肿瘤患者体内TF+MP的释放或表达。
  结论:⑴TF+MP在恶性实体瘤患者中的表达高于健康对照组,且II、III、IV期明显高于I期,提示恶性实体瘤TF+MP高表达,而且随着肿瘤进展其表达水平提高,故而TF+MP高表达可能提示恶性实体瘤的发生并且反映肿瘤的进展;⑵TF+MP可能与恶性实体瘤易发血栓形成密切相关;⑶恶性实体瘤患者术后易发血栓形成可能与手术促进TF+MP的高表达有关,而麻醉因素不影响TF+MP表达,与恶性实体瘤患者术后血栓形成无关。
[硕士论文] 袁龙
肿瘤学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:在哺乳动物细胞中验证 NgAgo-gDNA系统是否具有基因编辑和调控基因表达的功能;对利用NgAgo-gDNA系统靶向致癌突变基因杀灭肿瘤细胞进行初步探索研究。
  方法:提取肿瘤细胞基因组DNA,通过PCR的方式扩增基因突变序列。将扩增片段克隆入T载体中,测序突变序列,鉴定肿瘤细胞系突变位点。构建致癌突变基因与EGFP共表达载体,将共表达载体、NgAgo载体以及靶向突变部位或 EGFP的 gDNA通过Lipofectamine2000瞬时转染到293FT细胞中,流式检测EGFP的表达。以EGFP荧光表达率为指标判断基因编辑的效果。之后,探究在不同血清浓度(10%、5%、2.5%)及不同效靶比(EGFP:NgAgo-gDNA=1:3、1:6、1:12、1:24)条件下的基因编辑效果。随后,我们对实验条件进行优化。在进行基因编辑时,我们常使用EGFP作为报告分子。但由于EGFP蛋白相对稳定,降低了其对微弱基因编辑效果的报告敏感性。为此,我们的研究尝试构建EGFP-PEST融合蛋白表达载体,利用PEST序列可通过泛素蛋白酶体途径降解蛋白的功能,加快EGFP的降解,从而使得EGFP能够更为灵敏的指示基因编辑效果,为实现基因编辑的可视化筛选奠定基础。因此,以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES为模板,PCR扩增EGFP-PEST序列,克隆入逆转录病毒载体pQCXIP-EGFP-N1构建pQCXIP-EGFP-PEST-N1,病毒包装后感染293FT细胞获得稳定细胞系。用蛋白酶体抑制剂(MG-132)处理细胞,Western Blot检测 EGFP的表达变化。成功建立稳定表达pQCXIP-EGFP-PEST-N1的293FT后,将NgAgo的表达载体以及靶向EGFP的gDNA通过Lipofectamine2000瞬时转染到293FT细胞中,流式检测EGFP的表达,分选出俩群差异表达EGFP的细胞,分别提取基因组DNA和RNA, PCR扩增基因突变部位,测序突变序列,逆转录RNA,利用qPCR检测RNA水平的表达。最后,利用脂质体Lipofectamine2000将NgAgo以及靶向突变序列的gDNA转入到肿瘤细胞中,连续72小时监测肿瘤细胞增殖。
  结果:⑴所选择的肿瘤细胞系中,大部分细胞系均与文献报道的突变位点相符,仅H820细胞系并没有发现文献报道的T790M的突变。⑵在不同血清浓度及不同效靶比条件下,NgAgo-gDNA系统靶向突变部位或EGFP后,EGFP的荧光表达率未见明显降低。⑶瞬转靶向EGFP的NgAgo-gDNA到稳定表达EGFP-PEST的293FT细胞系中,通过流式分析发现EGFP的荧光表达强度有所降低,但基因序列分析未见DNA序列改变。⑷NgAgo-gDNA系统可以靶向致癌突变抑制肿瘤细胞的增殖。
  结论:在哺乳动物细胞中,NgAgo-gDNA系统可以敲低基因表达,但基因编辑能力在本研究中未得到证实;基于NgAgo-gDNA系统治疗肿瘤值得进一步研究。
[硕士论文] 钟华
应用数学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:为了模拟和刻画生物学中肿瘤细胞再生、增长和侵入过程,许多由偏微分方程组构成的相关的趋化模型或者趋触模型已被许多学者提出和研究。本文主要考虑一类同时具有趋化项和趋触项的趋化-趋触模型解的适定性问题,包括解的局部存在性、解的整体有界性、稳态解和解的大时间行为。由于该模型能够很好地刻画内皮细胞和由肿瘤细胞产生的肿瘤血管生长因子、其他蛋白物质的相互作用,即肿瘤细胞分别对肿瘤血管生长因子的吸引趋化现象,与对基质中的纤连蛋白的趋触行为,所以对该模型的研究就具有理论和现实的双重意义。
  本文主要分为下面四个章节:
  第一章,绪论。主要描述趋化模型和趋触模型的实际生物背景,总结国内外的最新研究进展和研究状况。同时,简单总结该论文的主要研究结果。
  第二章,考虑一类抛物-抛物-常微分的吸引趋化-趋触模型解的全局有界性。给定任意一个二维空间中的有界光滑凸区域和任意光滑的初值,当扩散系数适当大时,即肿瘤细胞扩散速度比较快时,通过提高正则性和经典的Moser迭代法证明了该模型具有一个唯一的全局有界的光滑解。
  第三章,研究上述趋化-趋触模型全局有界解的大时间行为。首先,利用相关技巧性探讨了该模型的稳态解。其次,基于关于时间衰减的能量泛函,得到了当时间趋于无穷大时,该模型的光滑解将趋近于上述稳态解。
  第四章,总结该论文的主要结论,并对今后的研究进展进行展望。
[博士论文] 王法有
基础数学 上海师范大学 2017(学位年度)
摘要:癌症是一类由于细胞分裂和凋亡机制失常而导致的疾病,经常表现为恶性肿瘤。肿瘤异质性是恶性肿瘤的特征之一,由于无法全面解析它的亚克隆结构,加上治疗后容易产生抗药性和发生转移,给治疗提出极大的挑战。DNA甲基化作为DNA分子的表观遗传修饰,被认为是肿瘤和其它人类疾病发生的原因。通过DNA甲基化估计肿瘤内部各个亚群的比例有助于了解肿瘤的发展过程,并能提出合理的个体化用药和治疗方案。
  本研究介绍了肿瘤纯度估计和差异甲基化分析的若干计算方法。分别利用TCGA数据库中不同类型的分子数据建立了基于非负矩阵分解和二次规划的肿瘤异质性分解的如下几个计算模型:基于DNA甲基化的肿瘤异质性分解模型;基于基因表达的肿瘤异质性分解模型;联合DNA甲基化基因表达的肿瘤异质性分解模型。数据模拟发现,我们的方法可以成功地估计出肿瘤内部各个亚群的比例,并且基于多数据整合的模型相对于单个数据类型具有更高的准确度。作为一个特例,我们的方法对于肿瘤纯度(设定肿瘤亚群落数量为2)的估计也与InfiniumPurify,ABSOLUTE,ESTIMATE等方法具有非常好的一致性。
[硕士论文] 李晓苗
生物化学与分子生物学 新疆医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究Survivin对肿瘤细胞自噬溶酶体形成过程相关基因的表达调控。
  方法:在实验室建立自噬诱导模型,使用IKKβ的抑制剂TPCA-1以及Survivin的过表达载体质粒对自噬模型进行干预。通过透射电镜,激光共聚焦显微镜观察自噬体和自噬进展状态,qPCR和Western blot等分子生物学方法对自噬溶酶体形成阶段相关基因的表达变化进行检测,使用流式细胞仪技术检测细胞凋亡情况。
  结果:通过雷帕霉素诱导ECA109细胞和KYSE450细胞后,透射电镜下可见更多的自噬体,激光共聚焦显微镜下可见细胞表达LC3增加,Western blot检测显示RAPA诱导后,LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达量有逐渐升高的趋势;激光共聚焦显微镜采图并对相应结果计数,过表达Survivin后KYSE450细胞自噬模型中显示红色荧光的细胞数目降低(P<0.05),含有红色荧光颗粒的细胞数目降低(P<0.05);加入TPCA-1干预后,ECA109细胞自噬模型中红色、绿色荧光颗粒数和含有红色荧光颗粒的细胞数目减少(P<0.05),KYSE450细胞自噬模型中显示红色荧光的细胞数目、含有红色荧光颗粒的细胞数目均减少(P<0.05);qPCR检测自噬溶酶体形成过程相关基因发现,Survivin过表达载体质粒转染后,可以在基因转录和蛋白水平检测到Survivin表达量升高(P<0.05);过表达Survivin时,Rab7、TAK1、LAMP1 mRNA表达量减少(P<0.05);TPCA-1干预后,在ECA109细胞中Rab7 mRNA的表达量升高(P<0.05),LAMP1 mRNA的表达量降低(P<0.05);在KYSE450细胞中IKKβmRNA的表达量降低(P<0.05),Rab7mRNA的表达量降低(P<0.05),TAK1 mRNA的表达量降低(P<0.05);在蛋白水平,过表达Survivin时自噬体形成过程相关蛋白的表达没有显著变化;流式细胞仪检测凋亡,显示TPCA-1干预后,ECA109细胞48h的凋亡增加。
  结论:雷帕霉素诱导可成功建立自噬模型;Survivin和TPCA-1对细胞自噬有抑制作用;在自噬溶酶体形成过程中, Survivin的过表达在基因转录水平可能对Rab7、TAK1、LAMP1 mRNA的表达有抑制作用;TPCA-1可促进ECA109细胞自噬模型的48h凋亡。
[博士论文] 张伟伟
基础数学 上海师范大学 2017(学位年度)
摘要:肿瘤与正常细胞的差异基因表达分析、肿瘤的亚型识别都对癌症的早期诊断和临床治疗具有非常重要的意义。然而,临床上获得的肿瘤组织往往包含一定数量的其它细胞,如正常细胞、免疫细胞、基质细胞、血管细胞等。其中,正常细胞的混入会对差异基因表达分析和肿瘤亚型分类产生不利影响。因此,建立合适的统计模型修正肿瘤纯度信息对差异基因表达分析、肿瘤聚类的影响是亟待解决的工作。
  本文针对以上两个问题展开系统研究。首先,研究了肿瘤纯度信息对差异表达基因分析的影响。通过模拟分析发现,肿瘤纯度与基因表达量差异之间的关系是乘性而非原来认为的线性关系。忽略肿瘤纯度,或者将肿瘤纯度作为协变量加入回归模型都会使得差异表达基因分析的结果出现偏差。为了解决这个问题,我们提出了一种广义的最小二乘模型和Wald方法来检验每个基因在肿瘤和正常细胞之间的差异性。通过对TCGA肿瘤数据的分析表明,无论是在差异表达基因个数、肿瘤间统计量一致性等指标上还是在对应癌症类型功能关联性上,该方法都优于传统的t-test和limma。其次,研究了肿瘤纯度信息对肿瘤样本进行无监督聚类的影响。通过对TCGA乳腺癌450K甲基化芯片数据聚类结果分析发现,利用传统的k-means和NMF进行聚类,肿瘤纯度将会使得聚类结果出现偏差,具有相类似纯度的肿瘤样本极易聚在同一类,并且肿瘤纯度较低的样本极容易聚错。基于此,我们针对DNA甲基化芯片数据,提出了一个基于模型的聚类算法。我们将肿瘤样本在每一个位点的甲基化水平假设成了一个高斯混合分布,利用EM算法进行参数估计和肿瘤样本聚类。数据模拟分析表明,相比较于k-means,我们的算法具有更高的精度。通过对 TCGA的23种癌症的分析发现,我们的方法得到了相对于k-means和NMF的偏差较小的聚类结果。
[硕士论文] 周维
遗传学 华中科技大学 2016(学位年度)
摘要:UBIAD1(UbiA prenyltransferase domain containing1)也称为TERE1(transitional epithelial response gene),由McGarvey等人于2001年首先发现。UBIAD1蛋白在生理学和病理学上起着非常重要的作用,包括维生素K2和CoQ10的生物合成,也包括由脂质异常代谢引起的SCCD疾病,帕金森病和膀胱癌。研究发现UBIAD1蛋白可以通过H-Ras-MAPK信号通路抑制膀胱癌细胞的生长。人体中Ras蛋白主要有四种形式,分别为H-Ras,N-Ras,Ki4A-Ras和 Ki4B-Ras。其中N-Ras和K-Ras的186位点半胱氨酸既可以发生法尼基化修饰也可以发生香叶基香叶基化修饰,而H-Ras的186位点的半胱氨酸目前只发现可以发生法尼基化修饰。
  本研究通过运用液相联用质谱技术LC-MS/MS在人体的胚肾细胞HEK293细胞和膀胱癌细胞T24细胞中发现了UBIAD1蛋白会催化H-Ras蛋白在186位点会产生香叶基香叶基修饰,并且发现了在HEK293和T24细胞中,在UBIAD1蛋白存在的情况下,法尼基化修饰的H-Ras蛋白可能会转化为香叶基香叶基修饰的H-Ras蛋白,研究结果为我们更加深入的了解UBIAD1蛋白和H-Ras蛋白在人类疾病中的作用奠定了基础。
[博士论文] 张林群
化学工程与技术;应用化学 东南大学 2016(学位年度)
摘要:DNA是机体生命活动最重要的遗传物质,DNA损伤则是生物体内经常发生的事件,损伤的类型主要包括DNA氧化和碱基修饰。DNA甲基化归属于DNA碱基修饰这一大类,它对DNA造成的损伤虽然不改变DNA序列,但能导致DNA中共价键的改变,使可遗传的基因表达发生改变,从而影响基因的正常转录和翻译,影响储存遗传信息的载体。DNA甲基化是发现最早的、最基本的,也是研究最多的表观遗传学机制。正常细胞功能的行使有赖于表观遗传的稳态的维持,而大量研究证明DNA不正常的甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达,影响基因的活性和功能,而这些表观遗传的稳态的打乱是与多种复杂疾病以及各类癌症的发病密切相关的。特别是癌症,其发生过程中癌细胞基因组局部区域的超甲基化和整体的欠甲基化是其典型的特征。超甲基化体现在抑癌基因的启动子区被异常甲基化;而重复序列以及癌基因的启动子区的甲基化程度减小、基因组遗传不稳定性的增加会直接导致整体的欠甲基化。因此,建立快速、灵敏、低成本的检测方法来检测DNA甲基化和甲基转移酶活性,对各类疾病尤其癌症进行早期诊断和治疗,对于提高疾病患者的生存率,具有十分重要的意义。
  本研究主要内容包括:⑴富含胞嘧啶(G)碱基的DNA与捕获DNA和靶向DNA在金电极上形成特异性探针,通过G4联体和血红素构建的HRP模拟酶来催化诱导苯胺聚合生成聚苯胺,从而产生较强的电化学信号。但加入核酸酶后,探针中含有特异序列的双链DNA就会被识别、切割,并进一步被消化,富含G碱基的DNA从电极上脱落。则无法通过G4联体来构建HRP模拟酶,没有酶的催化作用,后续苯胺的聚合不能进行,从而导致电化学信号消失。当双链DNA中的CG位点被甲基化后,会有效抑制核酸酶的识别、切割和消化,则HRP模拟酶催化生成聚苯胺,从而保留了电化学信号。采集到的电化学信号与DNA甲基化程度和甲基转移酶活性直接相关,以此为基础构建的生物传感器对M.SssI甲基转移酶活性的检测限为0.12 UmL-1,能对DNA甲基化进行特异性检测,还可用于DNA甲基化抑制剂的相关检测。⑵通过与含有5'-CCGG-3'特定序列的DNA杂交,将探针DNA修饰的金纳米粒子组装在金电极表面,探针DNA可以引发两个发夹DNA交替进行模拟-杂交链反应,从而在电极上形成众多的超长双链DNA,促使电化学指示剂六铵合钌的大量嵌插,从而产生强烈的电化学信号。但未经甲基化的5'-CCGG-3'序列会被特定的核酸酶识别和剪切,从电极上脱落,模拟-杂交链反应就不会被引发,故没有电化学响应;反之,DNA的甲基化会保护该序列不被核酸酶切割,则依然可以采集到强烈的电化学信号。由于金纳米粒子和模拟-杂交链反应的协同作用,使得杂交链反应继续进行,从而电化学信号大大增强,所以本法对M.SssI甲基转移酶的检测限降至0.03 U mL-1,显著提升了传感器的灵敏度,并且方法的特异性和重复性都很好,能用于甲基化抑制剂的检测。⑶利用石墨烯材料表面丰富的亲水基团和独特的二维结构,合成了还原型石墨烯和壳聚糖的纳米复合物,并用其在电极上共价结合乙酰胆碱酯酶构建了纳米生物探针。该探针中酶的生物活性会被有机磷农药所抑制,其抑制作用与农药的浓度相关,由此构建了检测有机磷农药的生物电化学传感器。本方法对亚胺硫磷检测的线性范围为1×10-2μg L-1~5×102μg L-1,检出限为8.2×10-3μg L-1,方法准确度、灵敏度高,并且成本低,便于操作。
[博士论文] 曹小卫
生物医学工程 东南大学 2016(学位年度)
摘要:拉曼光谱是一种无损光谱技术,具有指纹识别的特征,能在分子水平获得物质的结构信息。表面增强拉曼散射(SERS)主要是纳米尺度的粗糙表面所具有的异常光学增强现象,它可以将吸附在材料表面分子的拉曼信号放大102~106倍,与常规拉曼散射相比具有更高的检测灵敏度。SERS还具有稳定、不易猝灭、不受生物样品自身荧光及水的干扰等特点,非常适于生物样品的检测。金纳米星是一种由金属核和多个枝角构成的新型纳米材料,不仅在近红外区具有可调制的局域电磁场,而且尖锐枝角的“热点”(Hot Spots)极大地增强了周围电磁场的强度。本文基于金纳米星构筑了标记SERS探针(SERS tags)和无标记SERS探针(label-free SERS probes),开展了细胞的SERS检测研究。
  本研究主要内容包括:⑴采用种子介导生长法制备金纳米星,通过调节反应体系中氯金酸、对苯二酚以及金种子的比例,调控金纳米星的枝角长度和粒径。利用扫描电子显微镜(SEM)、紫外-可见-近红外(UV-vis-NIR)分光光度计和共聚焦拉曼光谱仪对金纳米星的形貌、光学性质和SERS效应进行了表征,优化反应条件,制得了形貌均一、单分散性好和SERS效应强的金纳米星。⑵以尼罗兰(NBA)和牛血清白蛋白(BSA)分别作为拉曼信号分子和保护层,制备了一种用于细胞成像的标记SERS探针。聚集实验和CCK-8细胞毒性分析验证了标记SERS探针具有很好稳定性及生物相容性。将标记SERS探针用于人肺腺癌细胞(A549)和人肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)的成像。结果表明标记SERS探针主要分布在细胞质,少量进入细胞核,负载标记SERS探针的细胞产生的拉曼信号强度远高于未负载的细胞。通过细胞的暗场成像、TEM验证了SERS成像的结果。⑶以对巯基苯甲酸(4-MBA)作为拉曼信号分子和表皮生长因子受体抗体(anti-EGFR)与金纳米星之间的偶联剂,构筑了一种具有细胞膜靶向功能的标记SERS探针。将标记SERS探针用于人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)和人肺癌细胞(A549、H1229)的成像研究。A549细胞和H1229细胞产生SERS信号的强度明显强于BEAS-2B细胞,靶向到肺癌细胞上的SERS探针数量明显多于正常细胞。暗场成像与X射线能谱(EDS)分析验证了anti-EGFR偶联金纳米星成功富集到肺癌细胞表面。⑷将细胞膜穿透肽(TAT)连接到金纳米星表面,构筑了一种无标记SERS探针用于区分肺干细胞(LR-MSCs)的分化。评价了无标记SERS探针的稳定性、生物相容性及探针与细胞的相互作用。测得了LR-MSCs定向分化为肺泡上皮细胞(ATⅡ)或间质细胞(3T3)的平均SERS光谱。主成分分析(PCA)基于细胞SERS光谱很好地识别和区分了LR-MSCs的不同分化亚型。⑸基于TAT功能化无标记SERS探针,通过SERS表征了肺泡上皮细胞-间质转化(EMT)过程。免疫荧光和蛋白免疫印迹检测了EMT过程中上皮标志物和间质标志物的表达,验证了博来霉素(BLM)能够诱导ATⅡ细胞转化为3T3细胞。检测了EMT不同阶段细胞的SERS光谱,在EMT过程中,许多细胞组分的特征峰发生了明显的变化。PCA散点图表明EMT不同阶段的细胞被划分在四个不同的区域中,不同类型的细胞区分明显。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部