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[硕士论文] 苗帅
神经病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  神经系统副肿瘤综合征(PNS)是与肿瘤相关的、自身免疫性神经系统症候群。国外学者研究表明,PNS的发病与个体免疫差异、种群特征、遗传因素等相关。目前国内尚无大规模临床研究,有关汉族人群PNS临床特点的资料较少。本研究通过回顾性分析济南军区总医院PNS患者的临床资料,总结山东地区汉族人群PNS的临床特征,为进一步临床研究打下基础。
  研究方法:
  回顾性分析2011年1月至2014年12月于我院诊断的28例PNS患者临床资料,包括一般资料、临床表现、实验室检测、辅助检查、肿瘤筛查结果、治疗方案等,同时根据需要检测患者特征性抗神经元抗体(免疫印迹法)和抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体(免疫荧光法)。
  研究结果:
  28例PNS患者中,男性占71.4%,女性占28.6%,年龄分布在29-77岁,中位发病年龄为56(47,64)岁。4例(14.3%)患者为急性起病,24例(85.7%)为亚急性或慢性起病,最常见的临床症状为肌无力。经典临床综合征有21例,非经典临床综合征7例,其中感觉运动性周围神经病(7例,25.0%)、Lambert-Eaton综合征(6例,21.4%)和边缘叶脑炎(5例,17.9%)为最常见的三种临床综合征。7例感觉运动性周围神经病患者中,有6例感觉、运动神经同时受累,1例仅感觉神经受累。6例Lambert-Eaton综合征患者行重复神经电刺激(RNS),均出现低频(1-SHz)刺激时复合肌肉动作电位(CMAP)波幅递减,高频(>10Hz)刺激时波幅递增,且50Hz时递增大于100%。5例边缘叶脑炎患者脑脊液检测均见炎性改变,脑电图均为全头区弥漫性慢波,2例患者颅脑MRI出现异常信号,3例患者血清和脑脊液抗NMDA受体抗体阳性。血清肿瘤标志物阳性率为44.0%,CEA和NSE为阳性率最高的标志物,肿瘤标志物阳性组和阴性组的肿瘤发生率无统计学差异。血清特征性抗神经元抗体阳性率为40.7%,抗Hu抗体为阳性率最高的抗体,特征性抗体阳性组与阴性组的肿瘤发生率无统计学差异。25例(89.3%)患者神经系统症状出现在原发肿瘤之前,3例(10.7%)患者神经系统症状出现原发肿瘤之后。共有21患者发现肿瘤,其中最常见的为肺癌(10例,47.6%),其次为消化道肿瘤(3例,14.3%)。明确病理类型的肺癌患者中,小细胞肺癌最常见。经典临床综合征组肿瘤发生率为81.3%(13/16),非经典临床综合征组肿瘤发生率为75.0%(6/8),两组肿瘤发生率无明显统计学差异。17例接受肿瘤治疗和/或免疫治疗的患者,治疗前和治疗后1个月的mRS评分有统计学意义(P<0.001),患者短期生活质量改善,有效率为76.5%(13/17),特征性抗体阳性组和阴性组有效率无统计学意义。
  研究结论:
  大多数PNS患者呈亚急性或慢性起病,临床表现复杂多样,且神经系统症状往往出现在肿瘤之前。对于拟诊为PNS的患者,无论肿瘤标志物和/或抗神经元抗体阳性与否,应行肿瘤筛查。初次筛查未发现肿瘤的患者中,应长期随访、反复筛查。肿瘤治疗和/或免疫治疗能改善患者短期生活质量,抗神经元抗体阳性和阴性组有效率无差异。
[博士论文] 王洪祥
外科学(神经外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,其中恶性程度及发病率最高者为胶质母细胞瘤。由于胶质母细胞瘤恶性增殖、侵袭性生长及放化疗抵抗等特性,即使手术联合术后放疗及替莫唑胺化疗的标准方案也未能显著改善患者预后,肿瘤几乎百分之百复发,患者不可避免面临致死性病程,中位生存时间仅12-15个月。因此,寻找改善胶质母细胞瘤临床治疗效果的新方法是神经外科当前最迫切的研究方向。
  现有研究认为胶质母细胞瘤的发生发展与基因突变积累及信号通路功能失调密切相关,基于大数据组学的分析,参与其中的多种分子病理机制正被逐步发现,靶向这些异常作用的分子元件为胶质母细胞瘤的治疗提供了新思路。然而,当前大多分子靶向治疗的临床试验结果均表明胶质母细胞瘤患者总体预后未得到显著改善。因此,寻找胶质母细胞瘤恶性增殖、侵袭转移和放化疗抵抗等过程中具有核心作用的新分子靶点显得尤为重要。
  肌动蛋白互作蛋白WDR1参与调节肌动蛋白丝动力学和肌动蛋白依赖的细胞生物学过程,如细胞骨架和细胞间连接的结构与重塑等,在细胞分裂及迁移中具有重要作用。已有研究发现WDR1在乳腺癌、卵巢癌和甲状腺癌等恶性肿瘤中表达明显升高,并促进肿瘤侵袭和迁移,提示WDR1可能作为肿瘤特异性分子参与了肿瘤的发生发展。本研究通过多组学芯片数据筛选发现WDR1在胶质母细胞瘤中表达上调并与患者预后相关,并且利用分子生物学及细胞生物学手段研究了WDR1在胶质母细胞瘤中的功能及信号通路,最后借助流行病学数据分析了WDR1基因遗传变异与胶质母细胞瘤发病风险的相关性。
  第一部分:WDR1在胶质母细胞瘤中表达及与患者预后相关性研究
  目的:通过小样本筛选出胶质瘤中具有预后判断潜能的分子,在多数据库及大样本患者队列中验证目标基因在胶质母细胞瘤中的表达及其在患者预后判断中的作用价值。
  方法:收集14例新鲜胶质瘤样本,提取RNA后行基因芯片检测,根据生存期长短(以60个月为界)筛选出两组患者差异表达基因并行聚类分析。收集TCGA及CGGA数据库胶质瘤患者和正常脑组织基因表达谱数据及临床资料,采用Student-t检验分析筛选出的基因地表达水平在肿瘤和正常脑组织中的差异;Spearman相关性检验分析基因表达水平与胶质瘤病理级别的相关性;Kaplan-Meier曲线分析基因表达水平与胶质母细胞瘤患者预后的相关性。进一步收集100例胶质母细胞瘤和16例正常脑组织样本,构建组织芯片行免疫组化染色,利用Student-t检验、单因素及多因素Cox回归分别验证WDR1在胶质母细胞瘤中的表达及与患者预后的相关性。
  结果:在基因表达芯片数据中,经过p小于0.001并且表达差异大于2倍的筛选,共有83个差异表达基因被筛选出来,其中59个差异基因的表达量在预后较差组中显著上调。将筛选出的差异基因分别在TCGA和CGGA数据库中分析,TCGA数据库显示,与正常脑组织相比,WDR1在胶质母细胞瘤中上调2.2倍(p<0.001),并且高表达的WDR1与患者较短的总体生存期(p=0.017,中位生存时间=345天)和无进展生存期(p=0.044,中位无进展时间=186天)均密切相关;CGGA数据库显示,WDR1表达水平随着胶质瘤病理级别增加而升高(p<0.001),并且较高的WDR1表达水平与胶质母细胞瘤患者较短的总体生存期(p=0.024,中位生存时间=345天)和无进展生存期(p=0.046,中位无进展时间=240天)显著相关。进一步在自己收集的患者队列中对WDR1进行验证,结果同样发现WDR1在胶质母细胞瘤中较正常脑组织中表达显著升高(p<0.001),生存分析显示高表达WDR1与较短的患者总体生存期(p=0.001,中位生存时间=10个月)和无进展生存期(p=0.005,中位无进展时间=8个月)相关,并且是两者独立的危险判断因子(HR=2.147,p=0.001;HR=1.912,p=0.005)。
  结论:WDR1在胶质母细胞瘤中表达明显上调,表达水平与病理级别呈正相关,并且表达量高低是胶质母细胞瘤患者独立的预后判断因子。
  第二部分:WDR1在胶质母细胞瘤细胞中的功能和机制研究
  目的:通过细胞功能学实验明确WDR1在胶质母细胞瘤恶性增殖和侵袭性生长中的功能,探索WDR1表达调控的机制及下游潜在信号通路。
  方法:构建WDR1慢病毒过表达及干扰质粒,包装慢病毒感染胶质瘤细胞系T98G和U87,利用CCK-8和EdU染色检测细胞增殖能力以及Transwell实验检测细胞侵袭能力。构建转录因STAT3过表达载体转染T98G和U87细胞,在IL-6作用下,利用实时荧光定量PCR检测WDR1 mRNA表达变化。构建WDR1基因启动子荧光报告素酶载体及突变载体,与STAT3过表达载体共转293FT细胞,在IL-6作用下,利用双荧光素酶报告系统检测荧光值变化。最后,基于TCGA和CGGA数据库中胶质母细胞瘤表达谱数据进行生物信息学分析,筛选WDR1潜在的下游信号通路。
  结果:脑胶质瘤细胞中验证可见,过表达质粒使WDR1表达明显升高,两条shRNA干扰WDR1效果显著。功能实验结果显示,与对照组相比,过表达WDR1可以显著增加肿瘤细胞的增殖和侵袭能力,细胞增殖速率加快,EdU染色阳性细胞数明显增多,Transwell发生侵袭细胞数目明显增加;抑制WDR1表达后,细胞则增殖减慢,EdU染色阳性细胞数减少,Transwell发生侵袭细胞数目降低。荧光报告素酶检测结果显示,与突变型WDR1启动子相比,IL-6作用下STAT3可显著增加野生型WDR1启动子的荧光素酶的表达,并且在过表达STAT3的胶质瘤细胞中,WDR1的表达显著升高。生物信息学分析发现,WDR1可能参与调控了细胞粘附、细胞外基质与胞膜受体互作及PI3K-Akt信号通路,从而影响胶质母细胞瘤的恶性进程。
  结论:WDR1基因的表达可以显著影响胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,STAT3可在转录水平调控WDR1基因的表达;WDR1可能通过细胞粘附、细胞外基质与胞膜受体互作及PI3K-Akt信号通路参与调控胶质母细胞瘤的增殖和侵袭过程。
  第三部分:WDR1基因遗传多态与胶质瘤发病风险的相关性研究
  目的:通过分子流行病学分析WDR1基因遗传多态性与胶质瘤易感性之间的关系。
  方法:收集530例胶质瘤患者(胶质母细胞瘤208例)及524例正常健康人群的血样,记录基本流行病学信息(性别、年龄等),提取血样DNA,通过HapMap数据库分析,筛选标签SNP,并对标签SNP进行基因分型。采用Student-t检验比较连续性变量均值的差异,采用卡方检验比较分类变量的分布差异。非条件逻辑回归分析各位点基因型与胶质瘤发病风险的相关性。
  结果:在收集的530例胶质瘤患者和524例正常健康人群的平均年龄分布为50.83±10.54和46.09±13.18。病例组男性比例为58.7%,对照组中男性比例为60.3%。按照WHO病理级别划分,Ⅰ级患者占2.3%,Ⅱ级患者占37.9%,Ⅲ级患者占20.6%,Ⅳ级患者占39.2%。根据最小等位基因频率(MAF≥0.05)且r2≥0.8的筛选标准,在WDR1基因上下游各延伸2kb范围共发现12个标签SNP,其中rs9926位于基因3,UTR区,rs13441位于基因外显子编码区,可导致异亮氨酸错义突变为缬氨酸,其余位点均落在基因内含子或基因间区。卡方分析发现位点rs3756230、rs734122和rs13441等位基因型在胶质瘤病例组和对照组中分布具有显著差异,p值分别为0.03、0.02和0.02。单位点分析显示,在共显性模型下rs3756230位点GG基因型可以显著增加胶质瘤患病风险(p=0.04,校正后OR值为1.976),在显性模型下CG+GG基因型与野生型CC相比可显著增加胶质瘤的患病风险(p=0.045,校正后OR值为1.304),并且趋势分析发现随着G等位基因型的增大,发病风险显著增加(p=0.019,校正后OR=1.303);在共显性模型下rs13441位点TT基因型与野生型TT相比具有降低发病风险的保护作用(p=0.002,校正后OR值为0.541),趋势分析发现随着T等位型的增多,发病风险显著降低(p=0.007,校正后OR=0.779)。分层分析结果显示,共显性模型下rs13441位点的CT基因型(p=0.043,校正OR=0.615)和TT基因型(p=0.001,校正后OR=0.341)与野生型CC相比可显著降低女性患者胶质瘤的患病风险(p=0.001,校正后OR=0.589),显性模型下CT+TT基因型与野生型CC相比可显著降低胶质瘤的患病风险(p=0.006,校正后OR=0.534)。在病理类型分层分析中,rs13441位点的TT基因型与野生型CC相比可显著降低胶质母细胞瘤的患病风险(P=0.029,校正后OR=0.537),趋势分析发现随着T等位型的增多,胶质母细胞瘤的发病风险显著降低(p=0.027,校正后OR=0.768)。
  结论:WDR1基因遗传多态性与胶质瘤发病风险显著相关,提示了WDR1基因的遗传背景在胶质瘤发挥作用。
[硕士论文] 许蓓
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:体外构建源自iPS细胞的神经细胞恶性转化模型,以探讨恶性胶质瘤的细胞来源。
  方法:首先分离培养正常人皮肤成纤维细胞样本,提取细胞DNA,PCR扩增p53基因外显子5、6、7、8和NF1基因外显子22、32、33、38、47,测序鉴定突变热点位置有无突变。然后应用CytoTune(R)-iPS2.0Sendai试剂盒将皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞,定向分化为神经干细胞、神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,并应用免疫细胞化学方法鉴定,接着通过流式细胞仪技术筛选纯化同质的神经细胞群。最后,使用亚硝胺诱导星形胶质细胞恶性转化,并检测细胞生长速度、软琼脂克隆形成能力,初步评价其是否恶性转化。
  结果:正常人皮肤成纤维细胞体外分离培养后呈长梭形。抽提成纤维细胞DNA进行外显子测序发现,样本不携带NF1和p53突变体。重编程成纤维细胞培养14天后可在显微镜下可见小的干细胞克隆,提取其中四个细胞克隆,免疫荧光染色显示均表达Nanog、SSEA4、OCT4、TRA1-60、Sox2和TRA1-81这6个多能性标志分子,表明成功建立了iPS细胞系。iPS细胞定向神经分化后的免疫荧光染色结果显示细胞均表达特定的特异性标记物,表明神经干细胞、神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化成功。初步实验表明,亚硝胺处理星形胶质细胞后,细胞生长速度加快,软琼脂克隆形成能力增强。
  结论:成功重编程建立了iPS细胞,并在体外构建了源自iPS细胞的星形胶质细胞恶性转化模型,可为探讨恶性胶质瘤的细胞来源、特别是神经元能否恶变提供研究模型。
[博士论文] 冯斌
外科学(神经外科) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:神经胶质瘤是一种恶性程度极高、侵袭性极强的肿瘤,多原发于颅内,因其发病机制复杂、发病部位特殊,早期诊断较为困难,多数患者在诊断时已发展至晚期。目前,临床上神经胶质瘤主要的治疗手段为手术和放化疗,但均难以取得理想的效果,临床预后极差,因此,胶质瘤的治疗目前仍是神经外科领域面临的巨大挑战之一。近年来,随着“精准医学”概念的提出,靶向治疗为神经胶质瘤患者提供了一种潜在的治疗手段,为改善神经胶质瘤患者的预后提供了新的可能。因此,目前寻找神经胶质瘤发生、发展过程中的关键分子是神经外科领域的研究热点,其有可能为神经胶质瘤患者的早期诊断和靶向治疗提供新的靶点。
  中介体复合物27(MED27)是MED中重要的一种,目前研究发现其广泛存在于人体的各个器官和组织中,而且没有组织特异性,在转录起始阶段中发挥着催化酶的作用。但是,就目前为止,MED27在人类疾病中的研究尚少,发挥的确切生物学功能尚不清楚。先前有研究通过敲低MED家族蛋白(包括MED27)发现人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的复制能力明显降低,但HIV-1感染细胞的存活能力无明显变化,进而推测:该家族蛋白(包括MED27)可能参与了HIV-1的转录过程。也有研究发现MED27可与甲状腺激素受体以及多种因子(包括转录因子和辅因子)相互作用,发挥甲状腺激素受体的作用。此外,在黑色素瘤中的研究发现:MED27可通过激活NF-κB/iNOS信号通路来促进黑色素瘤的生物学进展,因此,进一步推测:MED27有可能作为黑色素瘤早期诊断和术后治疗的生物学标记物。然而,到目前为止,MED27在人类神经胶质瘤中的生物学功能及其相关分子机制目前尚无报道。我们课题组已专注神经胶质瘤的分子研究多年,因此,我们拟在前期实验基础和现有文献的报道的基础之上,进一步探讨MED27在神经胶质瘤中的生物学功能及其潜在的分子机制。
  目的:
  1、探讨MED27对U87神经胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭生物学行为的影响;
  2、探讨NF-κB/iNOS信号轴是否参与了MED27对U87神经胶质瘤细胞生物学行为的调控过程。
  方法:
  第一部分:通过qRT-PCR检测MED27mRNA的表达水平来评价MED27敲低的U87胶质瘤细胞模型是否构建成功
  1、建立该实验所需的细胞模型
  1.1 在含10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的培养基中培养第2代到8代U87胶质瘤细胞系直至细胞生长状态良好,建立本实验所需的基础细胞模型。
  1.2 将处于以上生长状态的U87胶质瘤细胞系,随机分成三组,分别通过转染MED27小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)、MED27阴性对照siRNA和继续正常培养U87胶质瘤细胞,建立MED27敲低U87细胞模型、阴性对照U87细胞模型以及空白对照U87细胞模型(基础细胞模型)。
  2、RNA水平评价细胞模型是否建立成功
  1.3 qRT-PCR检测MED27敲低U87细胞模型、阴性对照细胞模型以及空白对照细胞模型中MED27mRNA的表达水平,评价模型是否建立成功。
  第二部分:通过Western blotting检测MED27蛋白的表达水平来评价MED27敲低的U87胶质瘤细胞模型构建成功
  1.1 在含10%胎牛血清的培养基中培养第2代到8代U87细胞系直至细胞生长状态良好,建立本实验所需的基础细胞模型。
  1.2 将处于以上生长状态的U87胶质瘤细胞系,随机分成三组,分别通过转染MED27siRNA、MED27阴性对照siRNA和继续正常培养U87胶质瘤细胞,建立MED27敲低U87细胞模型、阴性对照U87细胞模型以及空白对照U87细胞模型(基础细胞模型)。
  2、蛋白水平评价细胞模型是否建立成功
  1.3 Western blotting检测MED27敲低U87细胞模型、阴性对照细胞模型以及空白对照细胞模型中MED27蛋白的表达水平,评价模型是否建立成功。
  第三部分:检测MED27对U87胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭生物学行为的影响
  1、构建细胞模型
  通过上述siRNA转染技术,构建MED27敲低U87胶质瘤细胞模型、阴性对照U87胶质瘤细胞模型以及空白对照细胞模型。
  2、敲低MED27后,检测U87胶质瘤细胞增殖能力的变化
  在转染siRNA后,通过MTT实验比较MED27敲低U87胶质瘤细胞模型组和阴性对照U87胶质瘤细胞模型组之间U87胶质瘤细胞增殖能力的变化。
  3、敲低MED27后,检测U87胶质瘤细胞凋亡的变化
  在转染siRNA后,通过使用Caspase3活性检测试剂盒来检测和比较MED27敲低U87胶质瘤细胞模型组和阴性对照U87胶质瘤细胞模型组之间U87胶质瘤细胞凋亡的变化。
  4、敲低MED27后,检测U87胶质瘤细胞侵袭能力的变化
  在转染siRNA后,通过Transwell实验来观察和比较MED27敲低U87胶质瘤细胞模型组和阴性对照U87胶质瘤细胞模型组之间U87胶质瘤细胞侵袭能力的变化。
  第四部分:MED27影响U87胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭能力生物学行为的潜在机制
  1、敲低U87胶质瘤细胞的MED27后,转录因子NF-κB的表达变化
  在转染siRNA后,通过Western blotting检测和比较MED27敲低U87胶质瘤细胞模型组和阴性对照U87胶质瘤细胞模型组中转录因子NF-κB的变化。
  2、U87细胞中MED27的表达水平对iNOS的影响
  在转染siRNA后,通过Western blotting检测比较MED27敲低U87胶质瘤细胞模型组和阴性对照U87胶质瘤细胞模型组中转录因子iNOS的变化。
  结果:
  第一部分:MED27siRNA转染U87胶质瘤细胞后,MED27mRNA的表达水平明显降低
  在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,我们通过qRT-PCR实验发现:与阴性对照组相比,在U87胶质瘤细胞中转染MED27siRNA可显著降低其MED27mRNA的表达水平(P<0.05);同时,与空白对照组相比,阴性对照组对U87胶质瘤细胞中MED27mRNA的表达则无明显影响(P>0.05)。
  第二部分:MED27siRNA转染U87胶质瘤细胞后,MED27蛋白表达水平明显降低
  在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,我们通过Western blotting实验发现:与阴性对照组相比,在U87胶质瘤细胞中转染MED27siRNA可明显降低其MED27蛋白的表达水平(P<0.05);同时,与空白对照组相比,阴性对照组对U87胶质瘤细胞中MED27蛋白的则表达无明显影响(P>0.05)。
  第三部分:MED27siRNA转染U87胶质瘤细胞后可降低其增殖和侵袭能力,促进其凋亡
  1、siRNA敲低MED27后,U87胶质瘤细胞的增殖能力明显下降
  在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,通过MTT实验我们发现:与阴性对照组相比,U87胶质瘤细胞中转染MED27siRNA后,其增殖能力明显下降(P<0.05)。
  2、siRNA敲低MED27后,U87胶质瘤细胞Caspase3的生物学活性显著增强
  在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,通过使用Caspase3活性检测试剂盒我们分析发现:与阴性对照组相比,U87胶质瘤细胞中转染MED27siRNA后,可明显增加Caspase3的生物学活性(P<0.05)。
  3、siRNA敲低MED27后,U87胶质瘤细胞的侵袭能力明显增强
  在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,通过Transwell实验我们观察发现:与阴性对照组相比,U87胶质瘤细胞中转染MED27siRNA后,其侵袭能力明显下降(P<0.05)。
  第四部分:siRNA转染U87胶质瘤细胞后,NF-κB和iNOS的表达显著降低
  1、敲低MED27后,U87胶质瘤细胞中NF-κB的表达降低
  在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,通过Western blotting检测我们发现:与阴性对照组相比,U87胶质瘤细胞中转染MED27siRNA后,其NF-κB的表达明显降低。
  2、敲低MED27后,U87胶质瘤细胞中iNOS的表达降低
  在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,通过Western blotting检测我们发现:与阴性对照组相比,U87胶质瘤细胞中转染MED27siRNA后,其iNOS的表达明显降低。
  结论:
  1、通过功能实验,我们初步发现:MED27可抑制U87胶质瘤细胞的凋亡、促进其增殖和侵袭能力。
  2、通过机制实验,我们进一步推测:在U87胶质瘤细胞中,MED27发挥共抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和侵袭能力有可能是通过进一步激活NF-κB/iNOS信号通路来实现的。
  3、综合本研究所有实验结果,我们初步推测:MED27有可能是胶质瘤发生、发展过程中较关键的生物学标记物,发挥着癌基因的作用,有可能成为胶质瘤靶向治疗的新靶点。
[博士论文] 王朝艳
影像医学与核医学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.探讨超高场强磁共振及多模态影像融合新型技术在脑胶质诊断中的应用,总结经验、明确优势与不足。
  2.探讨常规MRI平扫+增强扫描联合DWI成像技术在脑胶质瘤诊断和病理间的相关性。
  3.探讨功能MRI ASL、DTI以及MRS成像技术在脑胶质瘤诊断和病理间的相关性。
  4.探讨MRI-ASL联合DTI和MRS成像技术在脑胶质瘤术前诊断和病理间的相关性。
  第一部分:常规MRI平扫及增强检查和DWI检查在脑胶质瘤中应用价值及病理相关性分析
  方法:
  1.收集我院2015年1月至2017年1月期间临床资料完整并经手术或穿刺病理证实为脑胶质瘤的患者55例,所有患者术前均未作放疗、化疗及其他抗肿瘤性治疗,所有患者术前均进行了常规MRI平扫、增强以及DWI检查。
  2.在常规MRI平扫和增强图像主要观察病变部位、数目、大小、形态、信号强度、瘤周水肿及强化程度等。ADC值的测量方法主要包括:首先根据病变的平扫及增强扫描图像,分别在ADC图上选择为强化的肿瘤区域、无强化的肿瘤区域、囊变坏死区、瘤周水肿区、非瘤周水肿区以及对侧相匹配的位置画感兴趣区(regions of interest,ROI),每个部位ROI的直径为0.2cm,每个信号位置重复测量三次,最后取平均值。
  结果:
  1.脑胶质细胞瘤在常规MRI图像表现为不均匀长T1长T2信号肿块或结节,病变的边界、瘤周水肿情况,多依赖于病变的分级,一般Ⅰ级脑胶质瘤,病变边界较清晰,瘤周可见轻度水肿或无水肿,占位征象也相对较轻;Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤边界欠清晰,病变周边可见明显的瘤周水肿,占位征象相对较严重,中线结构可出现明显的异位。另外,病变内信号欠均匀,可出现坏死、囊变、钙化,甚至出血等信号,增强扫描可见病变呈斑块状、线条状、花环样或结节样强化,坏死或出血区域无强化。
  2.肿瘤实性部分在DWI图像上信号表现多样,可以呈等信号、稍高或者高信号;而瘤周的水肿一般呈稍高或高信号,两者分界欠清,通过DWI图像分辨两者较困难。而不同组织类型的病变区,其ADC值间差异有较明显的差异(P<0.01),一般表现为肿瘤实性成分越致密,血供越丰富,则ADC值越低。经进一步统计学分析发现:不同成分的肿瘤组织与正常脑组织之间的ADC值差异有统计学意义(P<0.01);而不强化的肿瘤实质与瘤周水肿之间的ADC值差异无统计学意义(P>0.05);最后比较瘤周水肿与正常脑组织水肿间ADC值差异有统计学意义(P<0.01)。
  第二部分:功能MRI检查在脑胶质瘤中的应用价值及病理相关性分析
  方法:
  1.收集我院2015年1月至2017年1月期间临床资料完整并经手术或穿刺病理证实为脑胶质瘤的患者43例,其中行MRI-ASL检查的患者17例;行MRI-DTI检查的患者24例;而行MRI-MRS检查的患者11例。
  2.ASL数据处理后,接着根据常规和增强扫描结果,选取肿瘤实性部分最大层面作为分析层面,并在瘤体实性部分内绘制感兴趣区,得到正常白质的血流量(BFWM)值。TBF与BFWM值分别测量3次,计算其平均值。为了消除患者个体和年龄对脑血流值造成的影响,计算本组资料肿瘤的相对血流值(rTBF),rTBF—TBF/BFWM。DTI图像经处理后获得FA图、MD图、λ1图、λ2图、λ3图。并参照ADC值获得的方法,分别获得DTI相关脑功能图的数据,然后计算AD、RD值;接着通过相关公式确定出此区域的rADt、rRDt值、瘤周水肿的rFAe、rMDe、rADe、rRDe。对获得的MRS图像进行后处理,确定出对应的代谢物比率图和相应解剖图。而对应的素划定区域重点为肿瘤实性部分。接着时在健侧划体素,观察分析Cho、NAA、Cho/Cr相关结果。
  3.经手术或穿刺术后,取得相应胶质瘤的组织学标本,运用石蜡包埋法进行组织连续切片,层厚为5um,连续切片2张,最后使用HE染色法观察胶质瘤的病理分级。
  结果:
  1.低级别胶质瘤的肿瘤实性部分在ADC图上表现为高信号,而在FA图像上则主要表现为低信号,同样在rCBF及rCBV图上也表现为低信号区;而高级别胶质瘤的肿瘤实性部分在ADC图上主要表现为等或高信号,而在FA图像上则主要表现为低信号,但是在rCBF及rCBV图上却表现为高信号。在进一步针对各功能影像数据进行分析发现:低级别胶质瘤组肿瘤实性部分rFAt值要明显低于高级别胶质瘤组,但是两者之间的差异无统计学意义(P>0.05);同样,低级别胶质瘤组肿瘤实性部分的rMDt、rADt、λ3t值都明显的高于高级胶质瘤组,但结果不存在统计差异(P>0.05);在,低级别胶质瘤组瘤周水肿区的rFAe值要明显高于高级别胶质瘤组的瘤周水肿区,而rMDe、λ3e值等则低于高级别组的,二组的λ1e值差异很明显,存在统计差异。
  2.在MRS后处理的图像上可以发现:脑胶质瘤实性部分的NAA峰下降、Cho峰升高;但是高级别胶质瘤较低级别胶质瘤的NAA峰下降的更加明显;另外高级别胶质瘤还可能存在Cr峰下降,MI峰升高等表现,MRS的综合阳性诊断率约为72.73%(8/11)。二组的患侧/健侧及侧间Cho/NAA、Cho/Cr值都存在明显的统计差异(P<0.05)。研究结果还表明高级别胶组中MI峰显著升高,其较对侧正常脑组织比较两者差异有统计学意义(P<0.05),但是MI峰在高、低级别胶质瘤间的差异无统计学意义(P>0.05)。
  第三部分:多模态MRI检查在脑胶质瘤中的应用价值及病理相关性分析
  方法:
  1.收集我院2015年1月至2017年1月期间临床资料完整并经手术或穿刺病理证实为脑胶质瘤的患者27例,所有患者术前均进行了常规MRI平扫+增强检查以及ASL、DTI和MRS检查。
  2.对ASL数据进行处理,结合常规平扫及增强扫描图像,软件自动得出脑血流量值。DTI原始数据经工作站自带纤维束成像软件包处理后获得FA图、MD图。根据常规MRI图像共同确定感兴趣区,ROI范围为15~30像素,重复测量3次取平均值;计算肿瘤实质区、瘤周水肿区相对值,接着在此基础上对DTI图像进行处理得到扩散张量纤维束成像。并通过此图分析术前白质纤维束破坏情况。MRS原始数据处理后,可以确定出相应的代谢物比率图和解剖叠加图。对Cho、NAA、之类的代谢物进行观察分析。
  结果:
  1.高级别胶质瘤3D-ASL表现:将获得的3D-ASL图像经后处理后,高级别脑胶质瘤主要表现为灌注明显增高,肿瘤实性部分的CBF值约为(90.35±36.14)。MRS表现:研究对15例脑胶质瘤患者的肿瘤实性部分进行MRS成像,并分析后发现,高级别胶质瘤的实性部分的NAA峰明显降低,而Cho峰明显升高,Cr峰下降,MI峰升高。进一步分析各峰值间的比值,在高级别胶质瘤实性部分的Cho峰与NAA的比值约为5.3±2.2,Cho峰与Cr峰的比值约为3.5±1.5; NAA峰与Cr峰的比值约为0.7±0.4;其中MI峰在高级别胶质瘤中明显升高,和正常组之间存在明显的差异。DTI表现:研究发现17例胶质瘤周围出现了不同程度的纤维束的破坏,可以观察到多发纤维束的断裂及局部的推挤移位。在实验收集的17例胶质瘤患者中,9例患者胶质瘤侵犯了同侧的皮质脊髓束,3例患者的胶质瘤累及胼胝体部白质纤维束,5例患者的白质纤维束表现为推挤、移位,其纤维束相对完整,未见明显侵犯征象。
  2.在3D-ASL后处理后的图像中显示:低级别胶质瘤的肿瘤实性区域表现为灌注水平下降,其CBF值约为36.55±14.79,低级别胶质瘤的肿瘤实性区域与正常对侧脑实质的CBF比值约为0.91±0.35。在收集的低级别胶质瘤患者中,其中6例患者肿瘤实性部分的MRS表现为NAA峰下降,Cho峰升高,同时伴有Cr峰不同程度下降。Cho峰与NAA峰的比值约为1.6±0.3,Cho峰与Cr峰的比值约为1.8±0.5; NAA峰与Cr峰的比值约为1.1±0.3。DTI图像显示,其中有4例患者的患侧脑白质纤维束是完整的,仅表现为局部脑白质纤维束的推挤移位;另外有2例患者病变区的白质纤维束局部可见破坏中断。
  结论:
  1.脑胶质瘤实性部分的ADC值与胶质瘤病理级别间存在显著的相关性,即胶质瘤实性部分的ADC值能在一定程度上评估脑胶质瘤病理级别,为术前评估其生存质量奠定一定的基础。
  2.脑胶质瘤瘤周水肿区ADC值可评价肿瘤的侵袭性。
  3.ASL、DTI以及MRS检查技术在脑胶质瘤诊断中各具优势,在临床实践中应根据具体目的选择合适的检查方法;
  4.MRS可在术前更精准的判断脑胶质瘤的病理分级,其诊断效能要远高于ASL和DTI成像技术。
  5.联合运用三种不同的功能磁共振功能成像技术,可以在一定程度上互相填补各自的不足;因此可明显提高胶质瘤术前病理分级评估的准确性,同时更有利于指导临床治疗方案的制定。即磁共振多模态成像技术可显著提高脑胶质瘤术前病理分级诊断正确率,从而优化患者的治疗手段,在一定程度上改善患者的预后。
[博士论文] 史占华
外科学(神经外科) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。证据表明,癌症易于复发、难以根治的重要原因是肿瘤细胞不可控制的生长和高侵袭性。因此阐明神经胶质瘤过度增殖和高侵袭转移特性的分子机制,将有助于开发治疗胶质瘤的新靶点,从而改善胶质瘤患者的预后。
  蛋白酪氨酸磷酸酶H1(PTPH1),又被称为酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体类型3(PTPN3),是PTP家族的一员,由PTPN3基因编码,定位于第9号染色体,转录mRNA产物全长6599bp,编码868个氨基酸,含有一个C末端的PTP结构域、一个PDZ结构域和一个N末端结构域同源的细胞骨架相关蛋白超家族频带4.1结构。研究表明PTPH1在多种肿瘤的发生、发展中起到重要作用。例如,在胆管细胞癌中,外显子测序发现PTPH1基因存在突变,而且过表达PTPH1能够促进胆管细胞癌细胞增殖、克隆形成能力和侵袭迁移能力。在食管癌和乳腺癌临床样本中,PTPH1呈现高表达,而且其表达与乳腺癌患者肿瘤转移和预后相关。进一步研究发现,PTPH1通过作用于多种底物发挥其磷酸酶活性,从而在细胞行为中起到一定的作用,目前检测到的底物包括肿瘤坏死因子α转化酶,T细胞受体ら亚基,维生素D受体,雌激素受体等等。然而,PTPH1在神经胶质瘤组织中的表达和功能目前尚未报道,本课题旨在检测胶质瘤患者临床样本中PTPH1的表达水平,并分析PTPH1在胶质瘤细胞增殖和侵袭迁移中的作用及其分子机制,从而为胶质瘤治疗提供新的药物作用靶点。
  目的:
  1.检测神经胶质瘤临床组织样本PTPH1的表达情况。
  2.验证基因敲低PTPH1表达的效率。
  3.研究PTPH1对胶质瘤细胞增殖的影响。
  4.分析PTPH1对胶质瘤细胞周期分布的影响。
  5.探讨PTPH1对胶质瘤细胞周期相关蛋白表达的影响。
  6.研究PTPH1对胶质瘤细胞成瘤能力的影响。
  7.分析PTPH1对胶质瘤细胞侵袭及迁移能力的影响。
  8.探究PTPH1对胶质瘤细胞基质金属蛋白酶表达的影响。
  9.研究PTPH1影响胶质瘤细胞生长和迁移的分子机制。
  方法:
  1.神经胶质瘤组织标本中PTPH1表达
  本研究前期收集了15例神经胶质瘤患者配对的癌旁组织和神经胶质瘤组织,采用real time PCR技术检测PTPH1基因的表达情况。后期我们采集了2013-2015年在山东大学齐鲁医院进行胶质瘤切除术的患者肿瘤组织样品,并按WHO分级分别监测PTPH1表达情况,监测13例胶质瘤Ⅱ级、13例胶质瘤Ⅲ级、13例胶质瘤Ⅳ级、以及4例正常脑组织切片中的PTPH1的蛋白表达水平进行了免疫组化检测。
  2.PTPH1基因干扰效率
  设计并合成PTPH1特异性shRNA和scramble shRNA,构建慢病毒载体,并包被病毒质粒,病毒质粒用绿色荧光(GFP)标记,用以感染神经胶质瘤U87或U251细胞,用荧光显微镜观察感染情况,然后采用real time PCR检测空白对照组、scrambled shRNA组和PTPH1基因特异性shRNA组U87和U251细胞中PTPHlmRNA水平表达情况。最后再用Western blot测定空白对照组、scrambled shRNA组和PTPH1基因特异性shRNA组U87和U251细胞中PTPH1的蛋白表达水平。
  3.PTPH1对胶质瘤细胞增殖的影响
  将生长状态良好的神经胶质瘤U87或U251,按照1×106/孔的密度接种到96孔板中,每组设计3个复孔,采用CCK-8方法检测细胞活力;取生长状态良好的U87或者U251细胞接种到6孔板,每组设计3个复孔,调整细胞密度为100个/孔,用结晶紫染色液对形成的细胞克隆染色,并在光镜下观察细胞克隆数目。
  4.PTPH1对胶质瘤细胞周期分布的影响
  取对数生长期的U87或U251细胞,用预冷70%乙醇处理细胞,加PI试剂,采用流式细胞仪检测不同细胞周期细胞比例。
  5.PTPH1对胶质瘤细胞周期相关蛋白表达的影响
  取对数生长期的U87或U251细胞,收集并定量蛋白,采用western blot检测CDK2和cyclinB1蛋白表达强度。
  结果:
  1.神经胶质瘤组织标本中PTPH1表达
  我们首先检测了神经胶质瘤临床标本中PTPH1的表达情况。前期我们收集了15例神经胶质瘤患者配对的癌旁组织和神经胶质瘤组织,并采用荧光定量PCR技术检测PTPH1基因的转录水平。结果显示,PTPH1在15例神经胶质瘤患者癌旁组织和神经胶质瘤组织中均有所表达;和癌旁组织相比,PTPH1在胶质瘤组织中表达水平显著上升(约3.5倍),差异有统计学意义,(P<0.01)。后期我们按照WHO分级再次分别对13例胶质瘤Ⅱ级、13例胶质瘤Ⅲ级、13例胶质瘤Ⅳ级、以及4例正常脑组织切片中的PTPH1的蛋白表达水平进行了免疫组化检测。结果显示,在各个级别胶质瘤中都极易检测到PTPH1的表达,且随着级别升高,PTPH1表达显著升高,而在正常脑组织中,PTPH1表达则显著下降,差异有统计学意义,(P<0.01)。
  2.PTPH1基因干扰效率
  我们通过包被慢病毒的方法将PTPH1基因特异性shRNA(Lv-shPTPH1)转染进入U87和U251神经胶质瘤细胞系中,同时转染scrambled shRNA作为实验对照组(Lv-shCon),同时还设置了空白对照组。结果显示,95%以上的U87和U251胶质瘤细胞均成功感染携带Lv-shCon和Lv-shPTPH1的病毒质粒。和空白对照组相比,转染scrambled shRNA的U87和U251胶质瘤细胞中PTPH1的mRNA表达水平几乎没有变化;和scrambled shRNA对照组相比,转染Lv-shPTPH1的U87和U251细胞中PTPH1的mRNA表达水平显著下降(P<0.01)。此外,转染Lv-shPTPH1的U87和U251细胞中PTPH1蛋白表达水平明显降低。
  3.PTPH1对胶质瘤细胞周期和细胞增殖的影响
  3.1和空白对照组相比,转染scrambled shRNA的U87和U251胶质瘤细胞周期没有显著差别。然而,干扰PTPH1基因的U87胶质瘤细胞中G2/M期细胞数量占所有细胞数量的比例减少18%,S期细胞数量占所有细胞数量的比例增加9%。此外,干扰PTPH1基因表达同样引起U251细胞周期S期阻滞。
  3.2和空白对照组相比,转染scrambled shRNA的U87和U251胶质瘤细胞中CDK2和cyclinB1蛋白表达没有显著差别;PTPH1基因敲低后导致U87和U251胶质瘤细胞中CDK2和cyclinB1蛋白表达明显下调。
  3.3在细胞培养的前两天,空白对照组、scrambled shRNA组和Lv-shPTPH1组细胞活力没有明显差别;当细胞培养到第3天,干扰PTPH1导致U87和U251神经胶质瘤细胞活力分别下降46%和18%;并且从第3天开始,U87和U251神经胶质瘤细胞活力持续下降(P<0.01或者P<0.05);当培养到第5天,PTPH1干扰后的U87和U251细胞活力分别是对照组细胞活力的45%和76%。克隆形成实验显示,PTPH1干扰导致U87和U251细胞数量分别下降73.5%和80.7%。
  3.4当小鼠饲养至第16天时,两组小鼠在肿瘤大小方面没有明显区别(P>0.05)。当饲养至第20天时,注射干扰PTPH1表达的U87细胞的小鼠的肿瘤体积缩小14.3%,并且肿瘤缩小的趋势随着饲养时间的增加愈加明显。此外,干扰PTPH1表达导致肿瘤重量明显下降。
  4.PTPH1对胶质瘤细胞侵袭及迁移能力的影响
  Transwell侵袭及迁移实验表明,空白对照组和scrambled shRNA组中胶质瘤细胞的侵袭及迁移能力没有明显差别;和scrambled shRNA组相比,PTPH1基因敲低后U87和U251细胞侵袭及迁移能力分别下降60%和53%。Westernblot结果表明,空白对照组和scrambled shRNA组胶质瘤细胞MMP9的蛋白表达水平没有明显差别;然而,和对照组相比干扰PTPH1表达导致U87和U251细胞中MMP9蛋白表达水平显著降低。
  5.PTPH1影响胶质瘤细胞生长和迁移的分子机制
  Western blot结果显示,和空白对照组相比,scrambled shRNA组胶质瘤细胞MEK磷酸化水平没有显著变化;干扰PTPH1导致U87和U251细胞中MEK的磷酸化水平明显降低,但MEK总蛋白表达水平保持不变。此外,我们发现干扰PTPH1表达导致U87和U251细胞中MAPK的磷酸化水平显著下调,但MAPK总蛋白水平没有明显变化。
  结论:
  通过本研究,我们发现神经胶质瘤组织中PTPH1的表达水平明显上调;干扰PTPH1表达能够明显降低细胞周期蛋白的表达,引起胶质瘤细胞周期阻滞,从而抑制胶质瘤细胞增殖和成瘤能力;此外,我们发现干扰PTPH1表达能够影响细胞基质蛋白酶的表达,并能够降低MEK和MAPK的磷酸化水平,影响细胞信号通路传导信号,从而抑制胶质瘤细胞侵袭及迁移能力。
[硕士论文] 杨升吉
外科学(神经外科) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  EZH2是polycomb repressive complex2复合体中具有催化功能的亚基,主要功能为抑制催化组蛋白27位赖氨酸的三甲基转移。在多种人类肿瘤中已经证实了基因突变导致的EZH2高表达和调节功能失调,同时研究发现EZH2在人类肿瘤中与肿瘤细胞的恶性转化、增殖、侵袭和肿瘤干细胞化密切相关。然而在人类垂体腺瘤组织中EZH2的表达情况目前仍未见报道。本实验检测了EZH2蛋白质和mRNA在垂体腺瘤中的表达水平,同时比较其在侵袭性垂体瘤和非侵袭性垂体腺瘤中的表达差异,并探讨EZH2蛋白质与MT1-MMP蛋白质以及垂体腺瘤患者年龄、性别、肿瘤大小和激素类型等临床病理因子间的相互关系。
  方法:
  本研究临床及病理资料取自山东省立医院神经外科在2006年7月至2015年9月接受手术治疗并术后病理学诊断为垂体腺瘤的62例患者(男性30例,女性32例),平均年龄为42.0±10.2岁。患者病历资料和影像学资料均保存齐全。该研究所有包含病例获得患者或家属的知情同意,并签订知情使用同意书。
  根据标准流程进行免疫组织化学检测EZH2、Ki-67和MT1-MMP的表达。免疫组织化学染色结果评价根据光镜高倍视野(400×)下计数肿瘤细胞及呈现棕黄色或者棕褐色颗粒的阳性肿瘤细胞,得出阳性细胞占肿瘤细胞总数的百分率,无阳性细胞记为表达阴性(-);<10%为弱阳性(+);10%~50%为中等阳性(++);≥50%为强阳性(+++)。一个标本的综合得分取该标本5个视野的染色得分均值。
  根据说明书分别进行总RNA提取、cDNA文库的制备和PCR反应,检测EZH2的mRNA表达量,并以β-actin作为内参,计算EZH2基因mRNA的相对表达量。利用student t test分析侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤中EZH2mRNA表达水平的差异。
  根据标准流程(湿转)进行western blot反应,检测EZH2蛋白质的相对表达量,内参蛋白采用β-actin。利用student t test分析侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤中EZH2蛋白质表达水平的差异。
  所有统计学图片处理通过Photoshop CC和Graphpad Prism6.0进行。统计学处理利用SPSS20.0软件进行。
  结果:
  1.免疫组织化学检测EZH2蛋白和MT1-MMP在垂体腺瘤组织病理石蜡切片中的表达及其与临床病理因素间的相关关系
  免疫组织化学检测显示EZH2蛋白在垂体腺瘤组织中主要为细胞核染色,并伴有部分细胞质着色。EZH2蛋白在垂体腺瘤组织中表达的总阳性率高达88.7%(55/62),其中侵袭性垂体腺瘤中阳性率为100%(30/30),非侵袭性垂体腺瘤为78.1%(25/32)。根据体积分类,大腺瘤中EZH2阳性率为93.6%(44/47),小腺瘤为73.3%(包括微腺瘤11/15)。Spearman rank correlation test结果显示EZH2蛋白在侵袭性垂体瘤中的表达强度显著高于非侵袭性垂体瘤(P=0.008),同时在大腺瘤中的表达强度显著高于小腺瘤(P=0.018)。但是,EZH2蛋白与垂体腺瘤患者的性别(P=0.439)、年龄(P=0.694)和分泌激素类型(P=0.416)之间未发现统计学意义。ANOVA分析结果显示,Ki-67在EZH2不同表达强度间其大小差异具有统计学意义(P<0.001)。Dunnet T3两两分析显示,Ki-67在EZH2阴性与所有阳性组别间均存在差异(P分别=0023,0.002和0.004),在阳性组别间,弱阳性组小于强阳性组(P=0.024),但是弱阳性组和中度阳性组间(P=0.293)以及中度阳性组和强阳性组间(P=0.238)无明显差异。
  MT1-MMP蛋白在垂体腺瘤组织中主要为细胞质和细胞膜着色。MT1-MMP蛋白在垂体腺瘤中的表达总阳性率为80.6%(50/62)。MT1-MMP蛋白质在侵袭性垂体腺瘤(86.7%,26/30)中的表达率高于非侵袭性垂体腺瘤75%(24/32)。MT1-MMP的表达强度与EZH2表达强度密切相关(P=0.002)。另外,MT1-MMP蛋白表达强度在侵袭性垂体腺瘤中大于非侵袭性垂体腺瘤(P=0.009)。但是,MT1-MMP与垂体腺瘤患者的性别(P=0.186)、年龄(P=0.652)、肿瘤体积(P=0.631)以及分泌激素类型(P=0.859)之间的相关性未发现统计学意义。另外,Ki-67在不同MT1-MMP分组间无明显表达差异(P>0.05)。
  2.PCR和western blot检测新鲜冰冻组织中EZH2mRNA和蛋白质的表达差异
  EZH2mRNA表达水平在侵袭性垂体腺瘤中高于非侵袭性垂体腺瘤(6.07倍,P<0.001);EZH2蛋白质表达水平在侵袭性垂体腺瘤中高于非侵袭性垂体腺瘤(3.61倍,P<0.001)。
  结论:
  1.EZH2和MT1-MMP在垂体腺瘤中高频率表达。
  2.EZH2和MT1-MMP与人类垂体腺瘤的侵袭性生物学行为密切相关,在侵袭性垂体腺瘤中的表达强度高于非侵袭性垂体腺瘤。EZH2同时与Ki-67的表达量密切相关,同时在垂体大腺瘤(≥1cm)中的表达强度高于小腺瘤(<1cm)。
  3.EZH2和MT1-MMP可能在垂体腺瘤侵袭性生物学行为的发病机制中起到重要作用。EZH2可能与垂体腺瘤的增殖性密切相关。EZH2可能成为将来治疗侵袭性垂体腺瘤的基因治疗靶点。
[博士论文] 车峰远
神经病学(神经肿瘤免疫) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文分为以下两个部分进行探讨:
  第一部分 脂多糖激活的Toll样受体4信号通路在胶质瘤CD133+肿瘤干细胞的发生发展及免疫逃逸中的作用及机制研究
  目的:
  胶质瘤恶性肿瘤组织内存在肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)。胶质瘤CSCs的肿瘤源性活性极强,并具有多种干细胞的特性,如多向分化、无限增殖及自我更新能力等。目前,大部分研究将CD133作为胶质瘤CSCs的常用标记。文献报道,胶质瘤CSCs在胶质瘤的生长、入侵、血管形成、放化疗耐药及免疫逃逸过程中发挥重要作用。Toll-样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)是目前研究最多的Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)。最近研究发现,多种肿瘤组织异常高表达TLR4,而且TLR4在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。但是,胶质瘤CD133+ CSCs是否表达TLR4及TLR4的具体功能如何?目前还不清楚。因此,该部分使用人胶质瘤细胞株及从患者肿瘤病理组织中分离得到的原代细胞,诱导生成胶质瘤CSCs,分离并获得胶质瘤CD133+ CSCs,以胶质瘤CD133+ CSCs作为研究对象。使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活TLR4信号传导通路,并建立胶质瘤CD133+ CSCs反应性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),研究TLR4信号传导通路在胶质瘤CD133+CSCs发生发展及免疫逃逸过程中的作用及可能机制。
  方法:
  使用人胶质瘤细胞株SF295、U251及从4例胶质瘤患者肿瘤组织中分离得到的肿瘤原代细胞(pT1-4),诱导生成胶质瘤CSCs。通过流式细胞学方法,检测胶质瘤CSCs常见分子标记的表达水平。通过CD133磁珠分选方法,从胶质瘤CSCs中分离并获得6种胶质瘤CD133+ CSCs。使用流式细胞学及Western Blot方法,检测胶质瘤CD133+ CSCs中TLR4的表达水平;通过免疫组织化学染色方法(immunohistochemistry, IHC),检测胶质瘤患者肿瘤病理组织标本中TLR4的表达水平。使用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、实时定量聚合酶链反应(real time quantity polymerase chain reaction,qRT-PCR)、流式细胞学、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)及Western Blot方法,检测LPS刺激后,胶质瘤CD133+ CSCs的增殖、分子标记表达、细胞因子分泌及相关信号传导通路分子表达情况。从健康供者外周血中分离获得的单个核细胞,使用磁珠分选方法,获得CD3+T细胞。胶质瘤CD133+ CSCs经过辐照,与CD3+T细胞共培养,建立胶质瘤CD133+ CSCs反应性CTL。通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验,检测胶质瘤CD133+ CSCs反应性CTL对其靶细胞的细胞毒性杀伤作用,并通过流式细胞学鉴定胶质瘤CD133+CSCs反应性CTL的表型。
  结果:
  胶质瘤CSCs表达CD133、Nanog、SSEA-1、Msil及Nestin。胶质瘤CD133+CSCs及患者组织标本表达TLR4蛋白。LPS促进胶质瘤CD133+ CSCs的增殖并保护其免遭阿霉素诱导的凋亡。LPS在基因及蛋白质水平上调胶质瘤CD133+CSCs标记CD133、Nanog及Nestin的表达。LPS促进胶质瘤CD133+ CSCs分泌细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、巨噬炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-仅)、白介素(interleukin, IL)-1β、IL-6及IL-10。LPS激活TLR4信号传导通路,诱导胶质瘤CD133+ CSC表达细胞周期蛋白酶4(cyclin-dependent kinase,CDK)、CDK6、Cyclin E、B细胞淋巴瘤-2(B-celllymphoma-2,bcl-2)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、p-p38、p-Jun氨基末端激酶(Jun amino-terminal kinase,JNK)、p-细胞外信号相关激酶(extracellularsignal related kinases,ERK)及p-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)。TLR4的表达抑制胶质瘤CD133+ CSCs反应性CTL的细胞毒性杀伤功能,而这种抑制作用在敲低TLR4表达的胶质瘤CD133+ CSCs中不明显。而且,记忆性效应T细胞在TLR4信号传导通路介导的胶质瘤CD133+CSCs免疫逃逸过程中发挥重要的作用。
  结论:
  胶质瘤CD133+ CSCs表达TLR4,LPS激活的TLR4信号传导通路促进胶质瘤CD133+ CSCs的增殖、化疗耐药、分子标记表达及细胞因子分泌,并保护其免遭胶质瘤CD133+ CSCs反应性CTL的细胞毒性杀伤作用。因此,TLR4信号传导通路是胶质瘤CD133+ CSCs发生发展及免疫逃逸的重要因素,阻断TLR4信号传导通路可能为胶质瘤患者提供治疗新策略。
  第二部分:B7-H6在胶质瘤发生发展中的作用及机制研究
  目的:
  近年来,尽管治疗策略方面的研究有了很大的进展,胶质瘤仍然是一种不可治愈的疾病,患者5年生存率较低。靶向一些调控肿瘤发生发展及免疫应答反应等分子方面的研究,可能为胶质瘤的治疗提供新的理论依据及策略。据报道,与正常组织不同,肿瘤组织及细胞特异性表达B7-H6。而且,B7-H6在肿瘤的发生发展及免疫应答反应过程中发挥重要的作用。但是,B7-H6在胶质瘤方面的研究较少。因此,本部分以胶质瘤肿瘤细胞株及患者原代细胞为研究对象,采用分子生物学及免疫学的研究方法,研究胶质瘤B7-H6的表达水平;研究细胞因子及炎症介质刺激后胶质瘤细胞B7-H6表达水平的变化,探索胶质瘤B7-H6表达的具体调控机制。研究胶质瘤患者肿瘤病理组织标本中B7-H6的表达水平。阐述B7-H6在胶质瘤发生发展过程中的作用及可能机制。旨在为胶质瘤的有效治疗方案的建立提供新的理论依据。
  方法:
  通过PCR方法,检测人胶质瘤肿瘤细胞株及患者原代肿瘤细胞B7-H6的表达水平。通过IHC方法,检测胶质瘤患者肿瘤病理组织标本中B7-H6的表达水平。使用LPS刺激人胶质瘤肿瘤细胞,通过qRT-PCR及Western Blot方法,检测不同时间的LPS作用后,人胶质瘤肿瘤细胞株B7-H6表达水平的变化。通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)方法敲低胶质瘤细胞B7-H6的表达水平。通过CCK-8、克隆形成实验及细胞计数等方法,检测人胶质瘤肿瘤细胞的增殖能力。通过划痕愈合实验、transwell迁移和侵袭实验,检测人胶质瘤肿瘤细胞的转移和侵袭能力。通过Western Blot方法,检测人胶质瘤肿瘤细胞相关蛋白分子的表达水平,分析B7-H6导致的胶质瘤发生发展过程中涉及到的信号传导通路及相关蛋白分子。
  结果:
  PCR方法检测显示,人胶质瘤肿瘤细胞株及从患者肿瘤病理组织中分离得到的原代细胞表达B7-H6。IHC方法检测显示,胶质瘤患者肿瘤病理组织标本表达B7-H6。使用LPS,在不同的时间点刺激人胶质瘤肿瘤细胞株后,胶质瘤细胞B7-H6的mRNA和蛋白水平表达增加。使用siRNA方法,敲低人胶质瘤肿瘤细胞株及患者原代细胞中B7-H6的表达水平。敲低肿瘤细胞B7-H6的表达水平后,人胶质瘤肿瘤细胞株及患者原代细胞的增殖、迁移及侵袭能力降低,其可能的机制是通过降低vimentin、N-cadherin、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2、MMP9及survivin的表达水平,并增加E-cadherin和bcl-2相关x蛋白(bcl-2 associated x Protein,Bax)的表达水平来介导。
  结论:
  人胶质瘤肿瘤细胞株、患者原代细胞及肿瘤病理组织标本中均可检测到B7-H6的表达。LPS诱导人胶质瘤肿瘤细胞株B7-H6的表达。B7-H6在人胶质瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用,通过调控相关蛋白分子的表达促进肿瘤的增殖、侵袭及转移的发生。因此,该研究将为靶向B7-H6的胶质瘤治疗方案的研究提供新的理论依据和靶点。
[硕士论文] 张猛
临床医学(耳鼻咽喉科学) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  探讨岩骨胆脂瘤的临床表现、分型、诊断方法、治疗策略和影响疗效的相关因素,总结该病的治疗经验,提高该病的诊疗效果。
  研究方法:
  山东省耳鼻喉医院2005年6月-2016年9月收治的54例岩骨胆腊瘤,均经病理证实,其中47例临床资料和随访信息完整,进行回顾性分析。分析内容包括临床表现、Sanna类型、手术前后面神经及听觉功能、治疗方案、术后并发症及复发等。采用Fisher精确检验的方法分析不同分型与手术前后听觉功能的保留有无相关,使用非参数秩和检验分析不同分型和术前面神经功能的相关性以及对术后面神经功能的影响,利用单因素和多因素logistic回归模型分析其他因素与术后面神经功能保留的相关性,选用的因素包括年龄、性别、面瘫病程以及面神经损伤程度等。
  研究结果:
  47例岩骨胆脂瘤中,先天性岩骨胆脂瘤有13例(27.7%),后天性岩骨胆脂瘤有34例(72.3%)。首发症状中最为常见的是耳流脓、听力下降以及面瘫。按术前影像学检查以及术中所见对所有患者行Sanna分型,以迷路上型最为多见,共31例,占66.0%;巨大迷路型和岩尖型各有6例,各占12.8%;迷路下-岩尖型及迷路下型各有2例,分别占4.3%。选用的手术方式包括经迷路/耳蜗入路(34例,72.3%)、扩大乳突切除术(7例,14.9%)、经颅中窝入路(4例,8.5%),经颅中窝联合经乳突入路(1例,2.1%)和颞下窝入路B联合经耳蜗入路(1例,2.1%)。术后感音神经性耳聋有42例,占89.4%,传导性聋有2例,占4.3%,混合性耳聋有3例,占6.4%。统计学分析示术后听力的保留与分型无关。术后面神经功能为Ⅰ级者有6例,占12.8%;Ⅱ级者有4例,占8.5%;Ⅲ级有4例,占8.5%;术后Ⅳ级者占17.0%,共8例;Ⅴ级者占21.3%,共10例;Ⅵ级者占31.9%,共15例。统计分析示,术后面神经功能的保留与否与Sanna分型并无相关,其他纳入研究的因素中仅面神经的损伤程度为面神经功能预后的独立影响因素。随访中共发现4例复发,复发率为8.5%,其中3例为封闭式术腔处理,1例为开放式术腔处理。
  研究结论:
  1、岩骨胆脂瘤较为罕见,因病变位置较深且症状不典型不利于早期诊断,但疾病进展可引起严重的并发症,因此耳科医师和患者均应保持警惕意识,早期诊断早期治疗;
  2、Sanna分型是一种科学有效的分型手段,对于指导手术方式的选择具有非常重要的意义,但其对术后面神经及听觉功能即预后的预测意义并不确切;
  3、术前听觉功能与迷路侵及与否密切相关,而听力在胆脂瘤术后一般较难保留。面神经的损伤程度是术后面神经功能保留与否的独立影响因素,而与年龄、性别及面瘫病程等因素无关;
  4、原则上依据Sanna分型及术前听觉功能选择合适的手术入路。术者需优先考虑胆脂瘤的清除,其次才是保留听力以及面神经功能。术中推荐使用脂肪或颞肌瓣封闭术腔,可以有效的减少脑脊液漏等并发症,避免术后需长期换药,术腔感染及不干耳的可能。
[博士论文] 张帅
临床医学(外科学·神经外科) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  研究的主要目的是探讨柚皮素查尔酮对U87MG胶质瘤细胞和异种移植小鼠模型的体外和体内抗胶质瘤作用。
  方法:
  首先进行柚皮素查尔酮对U87MG胶质瘤细胞的体外抗肿瘤作用试验。将U87MG胶质瘤细胞中加入不同浓度(0,2.5,5,10,50,75和100μM)柚皮素查尔酮,培养不同的时间(24,48,72h),分别用MTT比色法检测细胞增殖。将U87MG胶质瘤细胞中加入不同浓度(0,10,50和100μM)柚皮素查尔酮培养48小时后,分别用吖啶橙/溴化乙锭和Hoechst33342染色后在荧光显微镜下评估细胞凋亡。将U87MG胶质瘤细胞中加入不同浓度(0,10,50和100μM)柚皮素查尔酮培养48小时后,在透射电子显微镜下观察细胞中自噬空泡的数量和大小。将U87MG胶质瘤细胞中加入不同浓度(0,10,75和100μM)柚皮素查尔酮培养48小时后,AnnexinⅤ-FITC和PI染色处理后,使用流式细胞仪检测柚皮素查尔酮对U87MG人胶质瘤细胞的早期凋亡和晚期凋亡作用。将U87MG胶质瘤细胞首先于无血清培养基中进行饥饿处理4小时,然后加入不同浓度(0,10,50和100μM)柚皮素查尔酮培养40分钟和48小时后用Western blot方法对柚皮素查尔酮对PI3K/Akt信号转导蛋白的作用进行评价。
  使用异种移植小鼠模型进行柚皮素查尔酮对U87MG胶质瘤细胞的体内抗肿瘤作用试验。将U87MG细胞皮下注射于裸鼠右后肢处建立异种移植小鼠模型。将建模成功小鼠分为5组,分别给予不同剂量柚皮素查尔酮注射(5,20,40 and80mg/kg)。24天后,处死小鼠,测量肿瘤的重量、长度和宽度,计算肿瘤的体积。
  结果:
  柚皮素查尔酮对U87MG细胞的增殖有抑制作用,其细胞毒性作用随着浓度的增加而增强,同时随着作用时间的增加而增强。也就是说,柚皮素查尔酮对U87MG细胞的细胞毒性作用同时具有剂量依赖性和时间依赖性。加入柚皮素查尔酮的U87MG细胞经过吖啶橙/溴化乙锭染色后,通过荧光显微镜可观察到细胞收缩与细胞凋亡体的形成。经hoechst33342染色后,在荧光显微镜下可见染色质浓缩,DNA碎片,胞膜空泡。这些都是细胞凋亡的形态学表现特征。透射电子显微镜观察表明,柚皮素查尔酮能够诱导自噬空泡的形成,而且自噬空泡的数量和体积随柚皮素查尔酮剂量的增加而增加。流式细胞仪检测证明,柚皮素查尔酮能够诱导U87MG人胶质瘤细胞早期凋亡和晚期凋亡。柚皮素查尔酮同时能够抑制磷酸化和非磷酸化的PI3K和Akt蛋白,抑制NF-к B、Bcl-2,激活Caspase-3。体内实验结果显示,不同剂量柚皮素查尔酮干预组的肿瘤生长体积和重量均小于空白对照组。
  结论:
  柚皮素查尔酮在U87MG人胶质母细胞瘤细胞和异种移植瘤小鼠模型中通过诱导凋亡、自噬作用和PI3K/Akt信号通路调控抗胶质瘤作用。
[博士论文] 马衍刚
临床医学(外科学·神经外科) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:在真核核细胞内主要启动两条途径来诱导蛋白的降解:其一,溶酶体途径,内化膜蛋白及被吞入胞内的外来蛋白的降解主要经此途径;其二,非溶酶体途径,此途径主要指导将一些被泛素结合修饰后的胞内蛋白进行降解。泛素为76个氨基酸所构建的蛋白,典型的蛋白泛素化过程需要先后经过泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3的作用进行顺序催化反应,研究发现E3决定了催化底物的特异性。在直接能源物质ATP参与下,泛素-蛋白酶体经泛素的修饰和引导,先后通过E1、E2、E3多步骤复杂的酶促反应,最终使底物蛋白质的特异性氨基酸残基被泛素所标记,从而完成了目标底物蛋白的泛素化。
  研究表明,大量的蛋白转录后的修饰过程均是通过泛素来进行的。泛素发挥作用机制主要是经三步酶促反应后使其与靶向蛋白上的特定氨基酸残基以共价键相联接。具体来讲,泛素激活酶E1使泛素活化,之后传递给泛素结合酶E2,最后通过泛素连接酶E3的连接作用实现泛素同底物蛋白的赖氨酸残基结合,从而实现了底物蛋白的整体泛素化过程。其中,E2决定泛素修饰反应类型,而E3具有底物特异性。基因工程科学的进展使泛素化精细机制进一步展现,被确定的E1酶有2种,E2酶50余种而E3酶的种类已经多达600余种。E3酶系家族成员可被分为RING-finger家族及HECT(homologous to E6AP C terminus)家族,RING-finger家族的成员最多,其分子结构中所含的E2结合结构域均极其相似,也均发挥将活化泛素转移、连接至靶蛋白氨基酸残基的桥梁作用,该家族E3自身不直接同泛素起作用。HECT家族成员E3具有HECT催化结构域,这使的该类E3不仅直接同E2相结合,更会通过其分子结构中保守Cys残基同活化后的泛素经硫酯键相联接,整体上看,E2将泛素活化后传递给E3,最后由E3将之呈递给底物蛋白,使底物蛋白实现泛素化。随着基因科学、分子生物学技术的飞速发展,越来越多的泛素连接酶被不断发现,泛素化机制及其重要的生物学作用愈加引起相关学者的高度重视。
  泛素水解蛋白系统是调节蛋白质降解的一个重要途径,由于降解异常导致癌蛋白的积累往往会促进肿瘤的发生和发展。因此,泛素连接酶被人们认为是分子靶向治疗的一个重要靶点。截至目前,已经有多个针对泛素连接酶抑制剂被报道具有较好的抗肿瘤作用,如Mdm2(Mouse double minute2)和NEDD8-Activating Enzyme(NAE)的抑制剂等。
  RNF126是环指泛素连接酶家族的一员,在其N末端包含一个锌指结构域,在C末端包含一个环指结构域。已有研究表明RNF126可能与肿瘤的发生密切相关,比如乳腺癌。我们的预实验结果显示RNF126在胶质瘤组织和正常脑组织表达存在较大差异,提示RNF126可能是调控胶质瘤发生的一个潜在蛋白。因此,RNF126在胶质瘤中的生物学作用和机制值得进一步研究。
  第一部分 RNF126与p27在胶质瘤中的蛋白表达以及相关性研究
  目的:观察RNF126与p27于人正常脑组织及不同恶性级别的脑胶质瘤组织中表达情况,探究此两种基因之间的表达相关性。
  方法:该部分的研究分成正常脑组织组、Ⅲ级脑胶质瘤组和Ⅳ级脑胶质瘤组共三个研究组,其中,正常脑组织标本均取自严重颅脑损伤后接受颅内减压手术患者的正常脑组织。采用Western Blot法检测人脑胶质瘤及正常脑组织内RNF126与p27的蛋白水平,其中胶质瘤和正常脑组织各7例,并进行统计学分析;并分析两种基因表达的相关性。另外,应用Western Blot方法检测了RNF26在不同恶性程度的胶质瘤细胞中的表达情况。
  结果:1.我们通过免疫印迹法分析了RNF26和p27在非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中的表达情况,结果发现:非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中均有RNF126蛋白的表达,而与非瘤脑组织相比,脑胶质瘤中RNF126蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。而p27的表达则与RNF26呈现一定的负相关关系,相关系数r=-0.71。2.我们分析了RNF126在不同恶性程度的胶质瘤细胞系中的表达情况,结果显示RNF26在不同恶性程度的胶质瘤细胞中存在差异,恶性程度越高,RNF26的表达越高。
  结论:1、RNF126和p27在非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中均有表达。RNF126在脑胶质瘤中表达较非瘤组织中表达明显增加,且与细胞周期负调控因子p27呈现负相关性。2、RNF26在恶性程度越高的胶质瘤细胞系表达越高。
  第二部分 RNF126对脑胶质瘤细胞增殖的作用及其分子机制研究
  目的:观察RNF126对胶质瘤细胞增殖能力的影响,探索其中存在的分子作用机制,为胶质瘤分子靶向治疗寻找潜在新作用靶点。
  方法:1.分子克隆技术构建LV-shRNF126和LV-GFP-RNF126质粒,并包装慢病毒侵染胶质瘤细胞,构建稳定沉默和过表达RNF126的细胞系。2.在构建的稳定细胞系中,进行EdU渗入实验、集落形成实验和MTT实验检测沉默和过表达RNF126的脑胶质瘤细胞增殖能力。3.运用免疫共沉淀技术和免疫印迹实验检测RNF126和p27的相互作用,以及p27的蛋白水平和泛素化水平的变化。
  结果:(1)通过免疫印迹实验检测RNF126沉默效率,免疫印迹实验显示转染pLV-shRNF126#1组细胞中RNF126沉默效果达80%以上。随后应用LV-shRNF126和LV-GFP-RNF126质粒包装慢病毒侵染胶质瘤细胞U251,免疫荧光观察示侵染效率在90%以上且沉默效果良好,提示U251-shRNF126沉默细胞系构建成功。(2)为了验证RNF126对脑胶质瘤细胞增殖的重要性,我们用U251-shRNF126及U251-control细胞系进行了EdU实验,EdU实验结果显示:U251-shRNF126增殖率较U251-control增殖率低57%。同时,利用U251-shRNF126及U251-control细胞系进行细胞集落形成实验,其统计结果显示:U251-shRNF126细胞较U251-control克隆形成能力明显降低。另外,我们用U251-shRNF126及U251-control细胞系进行了MTT实验,MTT实验结果同EdU及集落形成实验研究结果一致,显示沉默RNF126后细胞增殖能力明显减弱。以上结果表明沉默RNF126后细胞增殖能力减弱,那么过表达RNF126后脑胶质瘤细胞增殖能力有何变化?为了进一步探讨RNF126对细胞增殖的影响,我们包装了GFP-RNF126和GFP慢病毒,并用慢病毒侵染U251细胞,构建U251-GFP-RNF126和U251-GFP细胞系。免疫荧光实验显示侵染效率在90%以上。为了检测U251-GFP-RNF126细胞系中外源性RNF126表达情况,我们提取U251-GFP-RNF126和U251-GFP细胞蛋白,通过Western Blot实验检测示RNF126在U251细胞中能稳定表达,说明U251-GFP-RNF126和U251-GFP细胞系构建成功。为了进一步验证RNF126促进胶质瘤细胞增殖的作用,我们通过对U251-GFP-RNF126及U251-GFP细胞系中进行EdU实验。EdU检测结果显示U251-GFP-RNF126细胞增殖率较U251-GFP细胞增高110%。通过对U251-GFP-RNF126及U251-GFP细胞系检测细胞集落形成能力,其统计结果显示:U251-GFP-RNF126细胞较U251-GFP细胞克隆形成能力明显提高。MTT实验也显示U251-GFP-RNF126及U251-GFP较对照组增殖能力明显增强。以上实验结果表明RNF126可能在人脑胶质瘤细胞增殖中起着重要作用,沉默RNF126明显抑制胶质瘤细胞增殖,过表达RNF126则明显促进胶质瘤细胞增殖。(3)为进一步探讨RNF126究竟是通过何种分子机制来促进胶质瘤细胞增殖,我们首先在U251细胞中转染FLAG-RNF126后,通过免疫共沉淀技术验证了p27与RNF126的相互作用。实验结果显示在U251细胞中过表达RNF126可以与p27相互结合。进一步内源蛋白Co-IP证明细胞内源的RNF26同样可以与p27相互作用。(4)然后我们又发现,沉默RNF126明显上调p27的蛋白水平,而过表达RNF26则明显下调p27的蛋白水平。相应地,沉默RNF126明显减弱p27的泛素化,而过表达RNF26则明显增加p27的泛素化。最后我们证明RNF126介导的p27降解可以被蛋白酶体抑制剂MG132阻断。我们也试图做了体外泛素化实验,然而我们没有检测到p27的体外泛素化反应。这说明可能有其他一些因素参与到RNF126介导的p27泛素化过程中,比如p27的修饰,或者其他一些接头蛋白等。总之,我们的研究阐明了RNF26在胶质瘤增殖中高表达,并且可以通过负调控细胞周期抑制子p27促进胶质瘤细胞的增殖。
  结论:(1)在胶质瘤细胞中沉默RNF126细胞增殖能力明显减弱,而过表达RNF126细胞增殖能力明显增强。(2) RNF126可通过增强细胞周期负调控因子p27的泛素化和降解而促进脑胶质瘤细胞增殖。
[博士论文] 田立强
外科学(神经外科) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  本研究先检测miR-197及GAB2在胶质瘤组织中的表达水平,在人胶质瘤细胞系A172细胞中分别验证miR-197与GAB2的细胞功能,并探讨miR-197与GAB2是否具有相关性及相互作用,进一步检测两者可能的相互作用位点。
  1、本研究选取人胶质瘤标本及对应扩大切除后脑组织,分别检测miR-197及GAB2的表达水平,进一步验证在胶质瘤中miR-197及GAB2表达水平。
  2、培养胶质瘤A172细胞并传代,分别以pre-miR-197(miR-197前体)及GAB2质粒转染,并设相应对照,分别检测miR-197与GAB2在A172中的细胞功能,探讨在胶质瘤细胞中miR-197表达水平与GAB2的表达是否具有相关性及相互作用,阐明miR-197与GAB2的表达之间的调控与胶质瘤发生、发展等的关系。
  3、预测并检测miR-197与GAB2可能的相互作用位点,探讨胶质瘤靶向治疗的新靶点的可行性,为胶质瘤治疗提供可能的新的治疗方法。
  方法:
  1、选取胶质瘤标本及对应扩大切除后脑组织;培养并传代A172细胞,分别以pre-miR-197及GAB2质粒转染;分别设对照miR转染及空载体质粒转染A172细胞作为对照。RT-qPCR验证pre-miR-197转染的效率,Western blot分析验证GAB2质粒转染效率。
  2、以原位杂交法检测miR-197在胶质细胞瘤组织及其对应扩大切除后脑组织样本之间的表达差异。
  3、pre-miR-197转染及对照miR转染的A172细胞,分别采用细胞计数分析、集落形成实验验证miR-197对A172细胞增殖及细胞集落形成的影响;细胞周期分析检测两组细胞之间细胞分期差异;BrdU掺入实验验证miR-197对A172细胞中DNA合成的影响;Western blot进一步验证A172细胞中,miR-197对增殖标记物的蛋白表达水平的影响。
  4、随机选取部分胶质细胞瘤组织及扩大切除后脑组织,以Western blot法检测GAB2在两者之间的表达差异,免疫组化法检测GAB2在胶质瘤组织切片中的蛋白表达水平,并探讨与胶质瘤级别的相关性。以不同剂量(1nM、10nM、40nM)的表达GAB2质粒转染A172细胞,MTT法在不同时间点测定A172相对数量,推测GAB2与细胞增殖的相关性,以及是否与剂量相关。
  结果:
  1、RT-qPCR证实:与对照组中以对照miR转染相比,pre-miR-197转染的A172细胞中miR-197表达水平显著升高(P<0.01),说明pre-miR-197能高效转染A172细胞;Westem blot证明,与空载体质粒转染相比,表达GAB2的质粒显著提高了A172细胞中GAB2蛋白表达水平,表达GAB2的质粒能高效转染A172细胞。
  2、原位杂交法分析显示,与对应扩大切除后脑组织样本相比,miR-197在胶质细胞瘤组织本标中表达水平被显著下调(p<0.05)。
  3、细胞计数实验显示,与未处理组或对照miR处理的对照组相比,在被pre-miR-197转染的A172细胞中,细胞活性比率在每一个时间点明显低于另外两组(P<0.01)。细胞周期分析显示被pre-miR-197转染的A172细胞表现出较低的S期比例(p<0.05);集落形成实验表明,在被pre-miR-197或对照miR转染的A172细胞中,大于50细胞的集落计数,两组之间存在显著差异(P<0.01),miR-197在A172细胞显著抑制集落形成;BrdU掺入实验显示pre-miR-197转染组与对照组中细胞中DNA的合成水平在24小时和48小时均存在显著差异(P<0.05),pre-miR-197转染组明显低于对照组。与对照miR转染组相比,Western blot显示miR-197显著下调了PCNA,Rb,Ki67,CDK2,CDK4和E2F1的表达水平(p<0.05)。
  4、Western blot证实与对应扩大切除脑组织标本相比,GAB2在胶质细胞瘤组织及邻近对应扩大切除脑组织标本之间的表达存在明显差异(p<0.05),GAB2的表达水平在大多数胶质细胞瘤标本中较高。免疫组化法中检测到:胶质瘤级别分别为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ级中的GAB2蛋白表达水平(++/+++)占百分比分别为23.68%、38.46%、59.09%和75.0%。GAB2在各级别胶质瘤中的表达水平差异有统计学意义(x2=24.053,P<0.001),胶质瘤分级越高,GAB2的表达水平越高:Ⅰ级vs.Ⅱ级(P<0.05);Ⅱ级vs.Ⅱ级(P<0.05);Ⅱ级vs.Ⅳ级(P<0.05)。MTT法检测以不同剂量(1nM、10nM、40nM)的表达GAB2质粒转染的A172细胞数量存在明显差异,GAB2质粒剂量越大,A172细胞相对数量越多。
  5、miR-197与GAB2的相互作用
  (1)在被pre-miR-197和对照miR转染的A172两组细胞中,Western blot检测到GAB2蛋白表达水平在pre-miR-197转染组中显著下调(p<0.05)。免疫荧光分析测定表明,GAB2抗体免疫荧光染色强度在两组之间存在显著差异(P<0.01),pre-miR-197转染组GAB2水平明显低于对照组。RT-qPCR证实在两组细胞中,GAB2mRNA表达水平无明显差异(P>0.05)。
  (2)以表达GAB2质粒和空载体质粒转染的A172两组细胞中,Northern blot分析显示miR-197表达水平在两组间存在明显差异(p<0.05),在GAB2质粒转染组明显低于空载质粒转染组,RT-qPCR证实miR-197表达水平在两组间有显著差异(P<0.01),在GAB2质粒转染组中明显下调。microRNA微阵列分析显示,miR-197表达水平在GAB2质粒转染组中表达水平明显减低。
  (3)MTT法及BrdU分析结果共同证实:GAB2/Pre-miR-197及empty-Vector/Pre-miR-197组两组细胞中,A172细胞增殖活性有显著差异(P<0.01),GAB2/Pre-miR-197组明显高于empty-Vector/Pre-miR-197组;Pre-miR-197/GAB2及control-miR/GAB2两组A172细胞之间无显著差异(P>0.05)。
  6、miR-197在GAB2的靶向位点
  (1)TargetScan程序预测miR-197靶向GAB2mRNA的3'-UTR共3个可能位点,分别位3885-3891、1151-1158、2044-2050。
  (2)荧光素酶报告基因分析结果证实,荧光素酶报告以三个位点定向序列实施,构建Wild-type-GAB2-WT-luc-1(包含3885-3891位点)、GAB2-WT-luc-2(包含1151-1158位点)和GAB2-WT-luc-3(包含2044-2050位点)三种荧光素酶质粒。三种荧光素酶质粒分别引入pre-miR-197与对照miR分别转染的两组A172细胞细胞后,GAB2-WT-luc-1及GAB2-WT-luc-3荧光素酶活性在两组细胞中无显著差异差别(P>0.05);而GAB2-WT-luc-2质粒荧光素酶活性在两组细胞中有明显差异(p<0.05),pre-miR-197转染组明显低于对照miR转染组。在使1151-1158位点中四个碱基突变后,构建GAB2-MUT-luc-2(突变型)质粒,GAB2-MUT-luc-2质粒引入两组细胞后,荧光素酶活性在两组中无明显差别(P>0.05)。
  (3)缺少预测的3'-UTR的GAB2质粒分别转染pre-miR-197与对照miR转染的两组A172细胞,Western blot分析检测两组细胞中,GAB2表达无明显差异(p>0.05)。
  结论:
  1.miR-197的表达在胶质瘤细胞中被下调,miR-197在A172细胞中抑制了细胞的增殖。
  2.在胶质瘤细胞中,GAB2表达被上调并且与胶质瘤级别呈正相关,在A172细胞中GAB2促进了细胞的增殖。
  3.miR-197在胶质瘤组织细胞中的表达被GAB2显著抑制,在A172细胞中,pre-miR-197转染后造成的miR-197的过度表达下调了GAB2的表达;GAB2质粒转染后造成的GAB2的过度表达抑制了miR-197的表达,并进一步促进了细胞的增殖。
  4.在A172细胞中,miR-197通过靶向GAB2mRNA的3'-UTR1151-1158位点,抑制GAB2蛋白表达,但GAB2rnRNA表达水平未受影响。
  5.在胶质瘤治疗中,GAB2作为miR-197的靶蛋白,通过恢复或增加miR-197的表达,从而下调GAB2的表达,抑制肿瘤细胞的增殖,降低胶质瘤细胞的侵袭性,代表着大有前景的胶质瘤新的靶向治疗的方法。
[硕士论文] Ahsan Ali Khan(肯阿里)
临床医学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:方法:两位患有髓内肿瘤(颈髓)的患者在唤醒麻醉及神经电生理监测的情况下施行了肿瘤切除术。并对他们两位术后运动功能的缺失状况进行了随访。这两位患者在术前均同意了本项研究且进行了相关训练
  结果:两位在唤醒麻醉及术中神经电生理检测下行肿瘤切除术的患者术后都没有运动功能缺失。为了避免对脊髓的损伤,在麻醉的清醒周期中对患者进行了精确并即时的电生理应答。
  结论:髓内肿瘤并不常见,但是只有通过全切术才能使得症状得到完全缓解,使得患者生存期内病情不再进一步进展。然而,全切术有时候会导致术后的运动功能缺失,尤其是在颈髓部位也受累及的时候。不仅如此,如果手术在全麻加神经电生理状态下进行,由于体感诱发电位和运动诱发电位反馈会有延迟,这种并发症会更严重。本研究中的两例患者是在术中唤醒麻醉及神经电生理监测的基础上进行的颈髓内肿瘤全切术,在术后随访的六个月期间并未发现相关的运动功能缺损。
[博士论文] 韩立平
神经病学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 胶质瘤细胞对BRD4抑制剂的敏感性与HEXIM1表达水平相关
  目的:
  (1)体外实验论证胶质瘤细胞中HEXIM1表达水平与JQ1敏感性的关系。
  (2)初步验证乌苯美司在胶质瘤中是否具有协同BRD4抑制剂的作用,这种作用是否与HEXIM1表达水平相关。
  方法:
  (1)采用WST-1法鉴定JQ1在胶质瘤细胞系中的作用。选取3种胶质瘤细胞系进行测试(U87、T98G及U251),将3种细胞株用不同浓度的JQ1(从10nm到5um)处理72小时,72小时后进行细胞增殖实验,检测各株细胞对JQ1敏感性的差异。(2)用Western Blot检测HEXIM1在3种细胞系中的表达,论证HEXIM1表达与JQ1敏感性的相关性;(3)用HEXIMl SiRNA下调HEXIM1在U87M及T98G细胞中的表达(HEXIM1在U251细胞中的基础表达量非常低,无法对其进行下调实验)。经Western Blot验证HEXIM1表达下调后(图2A),对HEXIM1下调组(Si-HEXIM1)、空载体组(Si-control)及对照组细胞用JQ1处理后进行WST-1分析,论证干预HEXIM1对胶质瘤细胞株JQ1敏感性的影响。(4)用WST-1法鉴定乌苯美司在胶质瘤细胞对JQ1敏感性中的作用。在加JQ1前先用乌苯美司(0.5mg/ml)预处理胶质瘤细胞48小时,对比乌苯美司预处理组与单用JQ1组的增殖抑制效率。(5)用HEXIMl SiRNA下调HEXIM1在U87M及T98G细胞中的表达,将HEXIM1 siRNA组,空载体及对照组3组胶质瘤细胞均用乌苯美(0.5mg/ml,48小时)进行预处理,然后再用不同浓度JQ1(10nm~5um)处理72小时,用WST-1法检测以上细胞的增殖活性。(6)用JQ1或JQ1联合乌苯美司处理U87M空白对照及HEXIM1下调后的U87M细胞,用AnnexinⅤ-PI染色及流式细胞仪评估上述细胞的凋亡率。
  结果:
  (1)JQ1处理后3种胶质瘤细胞株的增值均受到抑制,而且显示出明显的计量依赖性,U87M、T98G和U251细胞株的的IC50值分别是65nM、480nM及3010nM。提示:3种胶质瘤细胞系对JQ1显示出不同的敏感性。(2)HEXIM1在U87M细胞系中表达量最高,而在U251细胞系中表达量最低,提示HEXIM1与胶质瘤对JQ1的敏感性密切相关。(3)U87M、T98G2组胶质瘤细胞系中HEXIM1下调组与对照组相比胶质瘤细胞对JQ1的敏感性均明显下降,HEXIM1siRNA处理后的U87M及T98G细胞IC50值分别升至110 nM及750nM。(4)单用乌苯美司预处理对3种胶质瘤细胞均无毒性作用,但是乌苯美司可增强胶质瘤细胞对JQ1的敏感性,U87M、T98G及U251的IC50值分别降低至50nM、235nM及830nM。(5)下调HEXIM1能使乌苯美司增强后的JQ1敏感性降低。与乌苯美司预处理的细胞相比,HEXIM1下调后的U87M及T98G细胞株JQ1IC50值分别由原来的50nM、235nM增高至70 nM及380 nM。乌苯美司对空白对照组及HEXIM1下调组细胞的JQ1敏感性均有增强作用。(6)JQ1可诱导U87M细胞凋亡,下调HEXIM1可以使JQ1的促凋亡作用减弱。(7)乌苯美司无论在空白对照组还是HEXIM1下调组细胞中都能够增强JQ1诱导凋亡的作用。
  结论:
  (1)胶质瘤细胞对JQ1敏感性的差异与HEXIM1的表达水平密切相关,通过调节HEXIM1表达,可以影响胶质瘤细胞对JQ1的敏感性。
  (2)乌苯美司可增加胶质瘤细胞对JQ1的敏感性,其作用可能与上调HEXIM1表达相关。
  (3)HEXIM1在JQ1诱导的肿瘤细胞凋亡中发挥着重要作用,乌苯美司可以增强JQ1的促凋亡作用。
  第二部分 乌苯美司通过调节自噬水平、上调HEXIM1的表达增加胶质瘤细胞对JQ1治疗敏感性
  目的:
  通过体外实验及体内实验论证调节HEXIM1自噬性降解对胶质瘤细胞JQ1敏感性的影响,探索乌苯美司增加胶质瘤细胞对JQ1敏感性的作用机制。
  方法:
  (1)使用乌苯美司预处理U87M、T98G和U251三组胶质瘤细胞株,应用western blot的方法检测乌苯美司处理前后HEXIM1表达的变化,同时测定自噬相关指标P62和LC3B的表达;(2)用电镜检测乌苯美司预处理的胶质瘤细胞内自噬小体的变化,进一步验证自噬;(3)用JQ1及JQ1结合乌苯美司处理U87M胶质瘤细胞,应用免疫组化的方式检测HEXIM1的表达;(4)使用自噬激活剂雷帕霉素(10nm,与乌苯美司同时应用)激活自噬,应用western blot的方法检测HEXMI的表达水平的变化;(5)应用对JQ1敏感性较低的T98G和U251细胞株构建荷瘤小鼠模型,分别给予JQ1或JQ1联合乌苯美司灌胃,处死后称量肿瘤重量,测量肿瘤体积,体内论证乌苯美司对JQ1抑瘤作用的辅助作用。(6)获取肿瘤组织后行IHC免疫组化染色,检测HEXIM1的表达,论证HEXIM1在乌苯美司增敏JQ1治疗中的作用。(7)在U251移植小鼠死亡后,对其尸体进行解剖,以观察肺、肝脏及骨骼是否存在转移灶,论证乌苯美司对胶质瘤转移的抑制作用。
  结果:
  (1)使用乌苯美司预处理的三组胶质瘤细胞株均表现出显著的HEXIM1表达上调,同时P62表达上调,LC3B表达降低,提示自噬水平下调。(2)电镜结果显示使用乌苯美司预处理的胶质瘤细胞内自噬小体明显减少。(3)单用JQ1处理不能影响HEXIM1的表达,然而乌苯美司结合JQ1处理胶质瘤细胞导致HEXIM1的表达显著增加。(4)使用雷帕霉素激活自噬后胶质瘤细胞内HEXMI的表达水平明显降低。(5)体内实验表明,经灌胃途径应用JQ1可以显著缩小小鼠体内的的肿瘤体积,T98G移植瘤模型对JQ1的敏感性高于U251,与体外研究一致。(6)JQ1联合乌苯美司口服治疗可以使体内肿瘤生长延缓或萎缩速度加快,提示乌苯美司可以增强JQ1控制体内胶质瘤体积的作用。(7)乌苯美司处理后的肿瘤组织HEXIM1的表达增高,与体外实验结果一致。(8)与单用JQ1相比,联合乌苯美司口服治疗可显著降低胶质瘤的转移率(0/20 VS3/20),而JQ1治疗组与对照组(DMSO组)之间无显著差异(4/20 VS3/20)。
  结论:
  (1)乌苯美司抑制胶质瘤细胞内自噬水平,下调HEXIM1自噬性降解,使HEXIM1表达上调。
  (2)上调胶质瘤细胞自噬水平,可导致HEXIM1自噬性降解水平上调,进而导致HEXIM1表达下调,使胶质瘤细胞株对JQ1敏感性下调。
  (3)体内试验进一步证实,乌苯美司可以上调HEXIM1的表达,增强JQ1的抑瘤作用(延缓肿瘤生长、抑制肿瘤转移)。
  第三部分 Akt信号通路在乌苯美司增强JQ1敏感性及抑制胶质瘤细胞侵袭性中的作用
  目的:
  探讨Akt信号通路在乌苯美司增强JQ1敏感性及抑制胶质瘤细胞侵袭性中的作用
  方法:
  (1)用Weston Blot检测乌苯美司处理对胶质瘤细胞Akt信号通路的磷酸化水平的影响。(2)用WST—1细胞增殖及活力实验论证Akt信号通路在乌苯美司增加胶质瘤JQ1敏感性中的作用。使用Akt激动剂调节胶质瘤细胞内Akt信号通水平后,观察乌苯美司对JQ1增敏作用的变化,论证抑制Akt信号通路在乌苯美司增加胶质瘤JQ1敏感性中的作用。(3)使用Transwell实验论证乌苯美司对胶质瘤细胞侵袭能力的影响,同时使用Akt激动剂调节胶质瘤细胞内Akt信号通水平后,观察乌苯美司抑制胶质瘤细胞侵袭能力作用的变化,论证抑制Akt信号通路在乌苯美司抑制胶质瘤侵袭转移能力中的作用。
  结果:
  (1)乌苯美司处理胶质瘤细胞时Akt信号通路的磷酸化水平明显降低(p-Akt-ser437)。(2)使用Akt激动剂(10nM)后,乌苯美司增加胶质瘤细胞JQ1的敏感性的作用减弱(P<0.05),提示抑制Akt信号通路可能是乌苯美司增敏JQ1治疗的重要机制之一。(3)Transwell实验并未发现JQ1对胶质瘤细胞侵袭能力有显著促进作用,但是联合应用JQ1和乌苯美司后可显著抑制胶质瘤细胞侵袭能力。(4)使用Akt激动剂上调胶质瘤细胞内Akt信号通水平后,乌苯美司抑制胶质瘤细胞侵袭能力的作用被削弱,提示抑制Akt信号通路在乌苯美司抑制胶质瘤侵袭转移能力中扮演重要角色。
  结论:
  (1)抑制Akt信号通路是乌苯美司增强胶质瘤细胞JQ1敏感性的作用机制之一。
  (2)乌苯美司联合JQ1可抑制胶质瘤细胞侵袭性,其作用机制与抑制Akt信号通路有关。
[博士论文] 姜彬
外科学(神经外科) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,肿瘤表现为浸润性生长,目前无论手术治疗还是其他治疗,均无法彻底治愈胶质瘤,即使联合术后的放化疗,肿瘤仍会复发,导致病人预后不良。因此,寻找新的治疗方法,有效的杀伤胶质瘤细胞成为了一个新的重要的研究课题。近年来,脑胶质瘤干细胞的发现对胶质瘤的治疗有重要的意义,因为脑胶质瘤干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,是脑胶质瘤术后复发和对放化疗抵抗的根源。因此,脑胶质瘤干细胞已经成为治疗脑胶质瘤潜在的新靶点。虽然替莫唑胺已经被证实有抗肿瘤的作用,但由于部分病人出现耐药性,导致其治疗效果不好,不能阻止肿瘤的进一步生长和复发,因此也需要新的治疗方式来治疗胶质瘤。本实验中我们从手术病人中获取新鲜的脑胶质瘤组织,从新鲜的标本中分离并用培养干细胞的方法培养出胶质瘤干细胞,并研究建立脑胶质瘤浸润动物模型的可行性。溶瘤病毒为治疗胶质瘤提供了一种新的治疗方法,之前的体外实验我们已经证实了重组型水泡口炎病毒(VSV△M51)和重组双删除痘病毒(vvDD)能够感染并杀死胶质瘤细胞系,动物实验也证实了其能够延长动物模型的生存期。本实验中,我们将进一步证实重组型水泡口炎病毒(VSV△M51)和痘苗病毒(vvDD)在体外治疗胶质瘤干细胞的有效性。
  方法:1.我们对12例手术切除的新鲜的脑胶质瘤组织进行胶质瘤干细胞的培养,对形成细胞球的胶质瘤干细胞进行增殖以及分化实验,并检测形成细胞球的胶质瘤干细胞的表面标志物,确定其干细胞属性。2.应用逆转录病毒转染将增强绿色荧光蛋白(EGFR)转染入胶质瘤干细胞,用转染增强型绿色荧光蛋白的干细胞进行动物模型体内成瘤实验,从而建立脑胶质瘤浸润动物模型。3.检测我们培养出的胶质瘤干细胞在体外对替莫唑胺的敏感性,然后用不同剂量的重组型水泡口炎病毒(VSV△M51)和痘苗病毒(vvDD)感染这些胶质瘤干细胞,特别是对替莫唑胺耐药的干细胞,观察其在体外对胶质瘤干细胞的杀伤作用。
  结果:1.12例手术切除的胶质瘤标本中,有9例能够成功培养出胶质瘤干细胞球体。经实验检测,这些培养出的胶质瘤干细胞球体均具有自我增殖和分化的能力,所有的胶质瘤干细胞球体均表达神经干细胞特异性的标志物巢蛋白(Nestin),9例中有7例能够表达神经干细胞标志物CD133。胶质瘤干细胞球体经分化后可以形成贴壁的胶质瘤细胞,这些胶质瘤细胞表达成熟神经细胞的标志物:抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和抗人微管相关蛋白-2(MAP-2)。2.胶质瘤干细胞可以转染增强绿色荧光蛋白(EGFR),转染EGFR后的胶质瘤干细胞在免疫缺陷小鼠颅内形成与人脑胶质瘤相类似,具有浸润性生长特征的肿瘤。3.溶瘤病毒VSV△M51和vvDD能够感染对替莫唑胺耐药的胶质瘤干细胞,并可以造成细胞的病变效应,破坏了胶质瘤干细胞的自我更新能力,并有效的杀伤胶质瘤干细胞及其分化形成的胶质瘤细胞。
  结论:1.采用神经干细胞培养方法可以成功的培养出胶质瘤干细胞,这些胶质瘤干细胞且具有干细胞自我更新,多向分化以及成瘤能力。2.经转染后的胶质瘤干细胞在动物模型体内能够形成肿瘤,形成的肿瘤具有与人胶质瘤相似的浸润性生长的特征,可以更好的代表人类的胶质瘤,在未来胶质瘤治疗的研究中将具有非常广泛的应用前景。3.实验证实溶瘤病毒VSV△M51和vvDD能够成功感染并有效杀伤替莫唑胺耐药的胶质瘤干细胞,这可能为治疗对替莫唑胺耐药的胶质瘤患者提供一种新的治疗方法。
[博士论文] 郭建曼
药理学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:恶性外周神经鞘瘤(Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors,MPNST)是一种相对罕见的软组织肉瘤,总发病率大约为十万分之一。MPNST分为原发型和NF1继发型,也有小部分发生于其他肿瘤的放射性治疗过程中,其中NF1继发型约占MPNST总数的50%。虽然,MPNST的发病率较低,但是其转移性强,恶性程度高;发病早期,治疗后复发率高;发病晚期,对化疗药物应答性差,且病程进展迅速,死亡率较高,5年存活率为35-50%。目前,手术切除是临床治疗MPNST的主要方法。但是,由于MPNST形态呈弥散性,边缘模糊,且侵袭和转移性强,给手术造成了极大困难。因此,迫切需要对MPNST进行靶向治疗药物的研究。
  论文首次对MPNST进行了广泛的、综合性的药物活性分析,筛选出对MPNST具有较高活性的化学药物,以及潜在的药物作用靶点。其次,根据药物分析结果,对MPNST中两种重要的激酶,也即重要的药物作用靶点:p21活化激酶(PAK)和Polo样激酶1(PLK1)进行了功能和作用机制研究。
  第一部分 MPNST的高通量药物活性分析
  本部分研究首先建立高通量法对一种MPNST细胞(ST8814)进行了药物活性分析,随后以高通量药物活性结果为基础,选用一个对MPNST更具有针对性的高通量药物集,包括与MPNST更加相关的小分子药物,如MEK,RAF,RAS,FTI,PAK,ERK抑制剂,以及Wnt,Hedgehog,p53,EGF,HDAC通路中的一系列小分子抑制剂,对MPNST细胞进行了药物活性分析。同时,采用Spearman等级相关系数对分析方法和结果进行了一致性评价。最后,利用化学试剂诱导法和以上高通量药物活性分析法进一步研究了MPNST产生MEK抑制剂耐药性后,对抗肿瘤药物的活性情况,具体研究结果如下:
  (1)高通量药物活性分析结果表明,MEK抑制剂、Pak抑制剂以及一些蛋白酶体抑制剂等对MPNST具有较高活性,同时发现一些尚未在MPNST中研究的药物作用靶点,如Polo样激酶,Aurora激酶,烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)等。
  (2)对于数据库间的一致性评价,我们测试了两种来自其他大型数据库的细胞株;对同种绌胞株,采用不同检测方法:包括ATPLite法,氧化还原法或细胞核计数法测得的IC50进行了一致性评价。研究结果表明,影响一致性的因素有很多,包括细胞的培养条件,细胞存活率检测方法,药物的浓度范围,药物的储存及统计方法等,其中运用不同的计算方法是一致性的最大影响因素。
  (3)成功诱导一株MPNST形成MEK耐药性,且初步确认了一些在MEK抑制剂出现耐药性情况下,仍具有较高活性的药物,如Pak抑制剂,Brodomain抑制剂以及PI3K/mTOR抑制剂等。
  通过以上研究,我们建立了MPNST的高通量药物活性分析平台,对MPNST细胞进行了综合性的药物活性分析,得到了对MPNST活性较高的药物,如MEK抑制剂,Pak抑制剂,PLK1抑制剂和蛋白酶体抑制剂等。利用化学诱导法成功获得MEK抑制剂耐药MPNST细胞株,并进行了药物活性分析。
  第二部分 Pak1/2/3在MPNST中的作用及机制研究
  超过50%的MPNST与肿瘤抑制基因NF1的突变有关。NF1基因表达缺失导致Ras及其下游通路的激活,包括Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR信号通路,以及Wnt/β-catenin等通路。由于Pak可以调节Ras驱动的肿瘤的发生,因此,我们Pak激酶可能也参与MPNST的信号通路。
  本研究中我们利用免疫组化,Western Blot等方法检测了Pak1/2/3在恶性外周神经鞘瘤组织及细胞中的表达水平,并且通过抑制Pak1/2/3对其在MPNST中的作用机制进行了研究,结果表明,Pak1/2/3与人类恶性周围神经鞘瘤间具有很强的相关性,具体研究结果如下:
  (1)免疫组化,Western Blot实验结果显示,Pak1/2/3在MPNST中的表达量显著高于正常神经细胞,且高于神经纤维瘤,说明Pak1/2/3的表达水平与MPNST的恶性程度具有相关性;
  (2)MTS细胞增殖实验,伤口愈合、普通Transwell小室实验以及基质胶侵袭实验结果显示,Pak抑制剂能够降低MPNST细胞的增殖、迁移和侵袭能力;对Pak在MPNST中的作用机制研究表明,Pak主要通过Raf/Mek/Erk信号通路抑制MPNST的增殖,可能通过cadherin表达调控MPNST细胞的迁移和侵袭;
  (3)通过转录因子分析我们发现,小分子Pak抑制剂IPA-3能够下调p53的表达,RT-PCR和荧光素酶实验结果证明,Pak可能通过调控翻译水平下调MPNST中的p53的表达;
  (4)化学合成非ATP竞争性小分子Pak抑制剂IPA-3及其结构类似物,并且在多种细胞中进行了活性分析,其中类似物Bis(2-naphthyl)disulfide活性明显高于IPA-3,但是需要进一步对其进行结构与功能的研究。
  通过以上研究,我们发现Pak1/2/3在MPNST的增殖,迁移和浸润过程具有重要作用,且其表达量可以作为MPNST恶性程度的标志。
  第三部分 PLK1在MPNST中的作用及机制研究
  PLK1在细胞中有很多作用:控制有丝分裂起始点和G2/M期的检查点,协调中心体与细胞周期,调节纺锤体组装和染色体分离,在纺锤体中央区和脱落过程中发挥多种功能,以及促进DNA复制,参与细胞分裂和减数分裂等。研究证明,PLK1在人类的很多肿瘤中都具有高表达,通过抗体、干扰RNA或者激酶抑制剂阻断PLK1的表达,能够抑制肿瘤细胞的增殖以及诱导细胞凋亡。目前,PLK1在MPNST中的表达以及抑制PLK1对MPNST细胞的影响尚未有人研究。因此,论文首次对PLK1在MPNST中的作用及机制进行了研究。
  本研究首先通过基因芯片和Western Blot等方法检测了PLK1在人和小鼠恶性外周神经鞘瘤组织以及细胞中的表达。其次,利用MTS细胞增殖实验,划痕实验,以及siRNA瞬时转染等体外细胞学实验,研究了PLK1在MPNST细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。最后,我们采用移植瘤小鼠,对PLK1在体内的作用机制进行了研究,具体研究结果如下:
  (1)高通量药物活性分析中,PLK1抑制剂是对MPNST具有较高活性的药物之一;
  (2)我们通过人和小鼠的基因芯片分析发现,PLK1在MPNST中表达量显著高于神经纤维瘤和正常神经细胞;
  (3)MTS和伤口愈合等体外实验证明,PLK1抑制剂BI6727能够降低MPNST的增殖和迁移能力,且与Aurora激酶抑制剂MLN8237有明显的协同作用;
  (4)体内实验证明,PLK1抑制剂能够降低小鼠MPNST移植瘤的增长速度。由于PLK1是细胞周期激酶,因此我们通过免疫组化实验对移植瘤小鼠经过BI6727治疗后的肿瘤组织切片中的细胞周期标志物进行了分析。结果显示,BI6727处理组肿瘤切片Ki67的染色细胞数明显低于对照组,说明移植瘤小鼠经过PLK1抑制剂处理后,肿瘤中活性细胞数降低;但是Cleaved Caspase3的水平无变化,说明没有BI6727并没有诱导肿瘤细胞凋亡;BI6727对phospho-histone-3无影响,说明细胞可能发生G2-M期捕获,同时CyclinB1(G2-M期的标志)水平升高,进一步证明BI6727能够诱导细胞发生G2-M期捕获,从而抑制细胞分裂。
  以上研究表明,人和小鼠MPNST中PLK1表达量显著升高,通过抑制细胞周期激酶PLK1能够使细胞发生G2-M期阻断,抑制细胞有些分裂,从而降低MPNST细胞的增殖和迁移,降低移植瘤小鼠的肿瘤增长速度。因此,PLK1可能成为MPNST治疗的新靶点。
[硕士论文] 刘修贤
生物医学工程 东南大学 2017(学位年度)
摘要:颅内动脉瘤破裂是引起蛛网膜下腔破裂出血的首要原因,具有非常高的致残率和病死率。因此对动脉瘤的病因及治疗机制的研究非常重要。普遍认为,血流动力学因素在动脉瘤的病理发展过程中起了重要的作用。我们对颅内动脉瘤进行血流动力学数值模拟并获取血流动力学参数,分析血流动力学因素在颅内动脉瘤夹闭手术和栓塞手术中的作用,判断引起动脉瘤夹闭手术和栓塞手术后复发的特定血流动力学因素,为动脉瘤的临床预防、治疗提供理论依据。
  为探讨夹闭手术对颅内动脉瘤的血流动力学因素的影响,我们建立了10组进行过夹闭手术患者的真实病例模型,并以人工手动切除动脉瘤的方法模拟其夹闭手术后的状态。选取了六个具有代表性的血流动力学参数进行分析,分别是血液压强(Pressure),平均壁面切应力(AWSS),震荡剪切系数(OSI),平均壁面切应力梯度(AWSSG),梯度震荡数值(GON)和动脉瘤发生指数(AFI)。结果显示,夹闭手术后的模型有着较高的AWSS和AWSSG以及AFI,这与临床上健康血管血流动力学参数分布一致,同时夹闭手术能够有效的降低动脉瘤的OSI,减少动脉瘤破裂危险。通过配对样本T检验,我们发现夹闭手术前后AWSS和AWSSG这两个参数呈线性相关,且夹闭手术对这两个参数数值的增大有显著影响。
  为了探究不同栓塞程度对颅内动脉瘤血流动力学的影响因素,我们建立了一组特异性模型,根据真实病例数值模拟了同一位病人栓塞手术前、不完全栓塞和完全栓塞手术的三种状态,同时建立了两个不同栓塞率的理想模型,比较这五种情况下的血流动力学参数的变化。我们发现,完全栓塞的动脉瘤模型有着较高的AWSS和AWSSG,并且能够一定程度的降低动脉瘤内的OSI,这个结果和夹闭手术前后对比一致。但是对于不完全栓塞的动脉瘤模型,其相比于手术之前的状态,在不完全栓塞的动脉瘤瘤顶部,有着更大的OSI和血液压强,这提示不完全的栓塞手术可能会进一步导致动脉瘤的恶化,促使动脉瘤生长、破裂。
[博士论文] 聂玲辉
中西医结合临床 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  恶性肿瘤给人类健康和社会发展带来了沉重的伤害。由于肿瘤呈侵袭性生长,手术难以完全根除,加之放疗、化疗的毒副作用大,因此,寻找最佳的是肿瘤综合治疗的手段迫在眉睫。随着材料学、生物医学及纳米科学的交叉融合,纳米靶向制剂逐渐引起科学家的重视。纳米靶向给药系统是目前研究的热点,它具有可靶向性,提高药物稳定性及缓释性等特点。
  聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)被广泛用于载药系统的研究,主要是由于具有生物相容性、低毒性和可降解性等良好的特性。盐酸多柔比星(又称阿霉素,DOX),对多种肿瘤均具有显著的抑制作用,它但它的骨髓抑制、心脏损伤等不良反应成为DOX治疗肿瘤的瓶颈。核酸适配体(AS1411)具有特异性强的靶标结合能力、易于穿透肿瘤组织、易于体外修饰等优点,并特异性结合于核仁蛋白(C23),以发挥其抗肿瘤的重要作用。C23是细胞凋亡相关蛋白,它可调控细胞增殖生长过程,其中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)在细胞凋亡的过程所起的重要作用越来越来引起广大科学研究者的重视。
  目的:
  本课题以DOX为抗脑胶质瘤药物,以PLGA为纳米载体,AS1411偶联于PLGA纳米微球,以构成纳米靶向递药系统AS1411-PLGA-DOX,以发挥其特异性靶向抗脑胶质瘤的作用,并进一步明确其抗脑胶质瘤作用的分子机制。
  方法:
  采用复乳乳化溶剂挥发法及碳二亚胺两步缩合反应法进行AS1411-PLGA-DOX的制备;并对其进行表征;再从体内外两方面明确AS1411-PLGA-DOX抗脑胶质瘤的作用;最后从分子生物学方面,以肿瘤凋亡的分子机制为着眼点,深入研究AS1411-PLGA-DOX抗脑胶质瘤的内在分子机制。
  结果:
  1.AS1411-PLGA-DOX为球形的纳米粒,大小(245±42.6nm)分布较规整,表面较光滑;多分散系数0.212±0.023,电位-36.2±1.8mV,LC%为1.72±0.06%、EE%为88.1±4.7%;体外释放性为47.7±3.9.%(pH=7.4),57.0±4.6%(pH=5),其结果展现出具有pH响应性释放的特性;溶血率为0.244%以展现出良好的生物形容性。同时,AS1411-PLGA-DOX的荧光强度显著高于PLGA-DOX,且被细胞摄入内部并释药,细胞定量定位的结果表明其具有一定的靶向性。
  2.体外实验表明,AS1411-PLGA-DOX对U87细胞生长抑制率的变化呈现浓度依赖性,并可将细胞阻滞于G2/M,S期,其抑制肿瘤的机制可能与AS1411-PLGA-DOX激活p38MAPK通道,上调p38的表达,下调C23、Bcl-2、Bcl-XL的表达有关。
  3.体内实验表明,AS1411-PLGA-DOX可抑制皮下荷瘤裸鼠的瘤体生长,延长荷瘤裸鼠的生存时间,其进一步的分子生物学机制与细胞实验相一致。
  结论:
  本课题已成功构建具有靶向作用的纳米递药系统AS1411-PLGA-DOX,同时其体内外实验结果表明,AS1411-PLGA-DOX是一种有潜在开发价值的抑制脑胶质瘤的纳米制剂,其作用机制可能激活p38凋亡信号通路,造成p38蛋白的上调表达及C23、Bcl-2、Bcl-XL蛋白的下调表达。
[硕士论文] 刘静
外科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  脑胶质瘤(Glioma)是成人最常见的原发性恶性中枢神经系统肿瘤。尽管目前常规综合治疗(手术、放疗、化疗)的方法在不断改善,但疗效仍未得到显著提高。目前研究证实,在脑胶质瘤中存在一些胶质瘤干细胞。它是一种具有无限增殖、自我更新、多向分化等干细胞特性的肿瘤原始细胞,它可能是诱导胶质瘤发生、复发,导致预后较差的原因,因此靶向治疗胶质瘤干细胞将成为研究脑胶质瘤的一大热点。在脑胶质瘤中,作为一条高度保守的信号通路,Wnt/β-catenin信号转导通路是通过调控胚胎生长、发育、能量代谢和干细胞维持等多种生物学过程,在神经系统的发生和形态发育中起重要作用。近年有研究表明FRAT1作为Wnt/β-catenin信号转导通路的重要成员,在多种恶性肿瘤包括神经胶质瘤中过度表达,并且在神经干细胞增殖过程中有重要的调控作用。但目前国内外尚未报道关于该基因与胶质瘤干细胞的相关性研究。本论文旨在研究 FRAT1对胶质瘤干细胞体外、体内增殖能力的影响以及探讨其作用机制。
  方法:
  通过慢病毒转染技术敲低FRAT1的表达,构建出低表达FRAT1的胶质瘤干细胞模型。采用细胞增殖CCK-8实验,研究FRAT1低表达对胶质瘤干细胞体外增殖能力的影响。采用小动物立体定向仪构建荷瘤鼠模型,并用小动物磁共振和小动物活体成像观察 FRAT1低表达对胶质瘤干细胞体内增殖能力的影响。采用 Realtime PCR,Western blot和免疫组化的方法检测荷瘤鼠脑胶质瘤组织中FRAT1/β-catenin的mRNA和蛋白表达情况,并研究其相关性。
  结果:(1)通过慢病毒转染和嘌呤霉素筛选出低表达FRAT1基因的胶质瘤干细胞。
  (2)CCK-8实验研究证实,敲低FRAT1基因的表达能够下调胶质瘤干细胞的体外增殖能力。
  (3)小动物磁共振和小动物活体成像研究发现,敲低FRAT1基因的表达能够下调胶质瘤干细胞体内增殖能力。
  (4)Realtime PCR,Western blot和免疫组化的方法检测发现,随着荷瘤鼠脑胶质瘤组织中FRAT1的mRNA和蛋白水平的下调,β-catenin mRNA和蛋白的水平也相应下降,并且FRAT1与β-catenin表达水平呈正相关。
  结论:
  研究表明,在Wnt/β-catenin信号通路中,低表达的FRAT1基因可能通过抑制β-catenin的活性,从而下调胶质瘤干细胞的增殖能力。在靶向治疗胶质瘤干细胞的研究中,分子靶点FRAT1基因将来可能成为一大研究热点。
  本课题为国家自然科学基金“国家自然科学基金(81201991);中国博士后科学基金(2015M571068;2016T90115);北京市博士后工作经费资助项目(2015ZZ-56;2016ZZ-43);山西省自然科学基金(201601D011127);山西省高等学校创新人才支持计划([2013]8号);山西省卫生厅科研课题(201301066)”。
  
[硕士论文] 张瑶
生物学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探究let-7a在脑胶质瘤细胞和脑胶质瘤干细胞(GSCs)中的功能及相关机制。
  方法:
  首先通过向细胞转染人工合成的let-7a(let-7a mimics)上调let-7a表达量,检测过表达let-7a对脑胶质瘤细胞系U251和U87增殖、迁移、侵袭及GSCs增殖和自我更新的影响。采用无血清培养技术诱导和培养GSCs,并通过免疫荧光染色进行干细胞鉴定。运用q-PCR检测细胞中let-7a的表达水平,通过CCK-8实验检测let-7a对U251,U87和GSCs增殖的影响。划痕实验和Transwell分别用来检测let-7a对细胞迁移和侵袭能力的影响。运用干细胞成球实验分析let-7a对GSCs自我更新的影响。随后,我们通过生物信息学和双荧光素酶报告基因实验对let-7a靶基因进行鉴定。Western blot用于检测转染后细胞内E2F2和IMP2的蛋白表达。紧接着通过siRNA-E2F2下调U251U87和GSCs中E2F2的表达水平,CCK-8实验和干细胞成球实验检测E2F2下调对细胞增殖和GSCs自我更新能力的影响。
  结果:
  1、在转染后48h,q-PCR检测U251和U87及GSCs中let-7a表达情况,与miR-NC组相比,let-7amimics组let-7a表达量被明显上调。
  2、过表达let-7a抑制U251和U87细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
  3、过表达let-7a抑制U251-GSC和U87-GSC的增殖和自我更新。
  4、生物信息学软件预测,E2F2和IMP2为let-7a的候选靶基因,q-PCR和westernblot分析表明:过表达let-7a,在U251,U87,U251-GSC和U87-GSC中E2F2的mRNA和蛋白水平均下调,而IMP2的mRNA和蛋白水平在U251和U87中下调,在U251-GSC和U87-GSC中没有明显变化。
  5、双荧光素酶报告基因实验显示,过表达let-7a能够降低含有野生型E2F23'UTR序列的载体荧光素酶活性,表明E2F2为let-7a的直接靶点。
  6、通过转染siRNA-E2F2下调U251和U87及GSCs中E2F2的蛋白表达,E2F2下调抑制U251和U87的增殖及U251-GSC和U87-GSC的自我更新能力。
  结论:
  过表达let-7a能够降低U251和U87细胞的增殖、迁移和侵袭能力,同时过表达let-7a可以抑制GSCs的增殖和自我更新,E2F2作为let-7a的直接靶基因,E2F2的下调也能够抑制U251和U87的增殖以及GSCs的自我更新能力。
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