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[硕士论文] 高凡
生物物理 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:秀丽线虫作为一种常见的模式生物,通体透明,便于观察。其神经系统解剖结构简单,神经环路连接的物理图谱已被完全解析,是进行神经环路研究的理想模型之一。GCaMP是一种钙离子荧光指示剂,可将神经元细胞内钙离子浓度的变化转换为荧光蛋白荧光亮度的变化。现今对秀丽线虫神经环路的研究多以固定或半固定线虫为研究对象,但若能观察完全自由移动下神经环路的活动,则可得到更接近真实情况的结果。本课题的内容即研究如何组建一套硬件设施及配套的硬件控制、数据分析的软件系统,以达到实时观察秀丽线虫在自由移动的情况下头部神经元的钙荧光变化,进而得知各神经元与线虫活动状态的关系,以及这些神经元之间功能上的联系。
  为采集得到该钙荧光变化,使用压电陶瓷控制物镜上下周期性移动,扫描不同高度处的神经元活动,并通过共聚焦显微镜成像。同时,为实时跟踪线虫的自由移动,通过对红外成像或荧光成像进行分析,并将结果分析反馈给平台,平台可在水平方向移动,使线虫实时处于物镜的视野中心。
  采集得到图像后,使用基于光流法及高斯混合模型的算法,对图像中的神经元荧光进行半自动识别分析,得到线虫神经元的活动变化,配合对红外录像中线虫运动状态的分析,最终得到神经环路在线虫运动中的作用。
[博士论文] 夏文龙
遗传学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:在生命发育的过程中,中枢神经系统的正常有序的构建是形成高级生命所必须的。以小鼠为模型,在胚胎时期,位于大脑皮层内侧侧脑室周围区域的神经干细胞通过不断的增殖,分化,迁移等过程以“inside-to-outside”的方式形成了包含6层不同类型神经元结构的高度复杂的初级大脑结构。
  神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)被定义为能够生成神经组织或者是来源于神经系统中,可以自我更新的多能性干细胞,其在胚胎发育过程中产生多种类型的神经元和神经胶质细胞。一些神经干细胞在成年脊椎动物的大脑中持续存在,在整个生命进程中持续产生新生的神经元。干细胞区别于其他成体细胞的特征在于其分化成多种细胞类型的能力。干细胞经历对称或不对称细胞分裂成两个子细胞。在对称细胞分裂中,两个子细胞也是干细胞。在不对称分裂中,干细胞产生一个干细胞和一个走向分化方向的细胞。在发育的过程中,神经干细胞主要分化为神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。具体而言,在小鼠胚胎发育时期,神经干细胞主要位于皮层区域两个发生区域,侧脑室区域(Ventricular zone,VZ)和侧脑室下区域(Subventricular zone,SVZ),而且处于不同位置的神经干细胞的种类是不一样的。在侧脑室区域的放射状胶质细胞(Radial glial cells,RGs)通过对称分裂完成神经干细胞的自我更新,形成新的子代RGs,或者通过不对称分裂形成神经系统的中间祖细胞(Intermediate Progenitor cells,IPs)细胞;位于侧脑室下区域的IPs细胞通过对称分裂形成神经元,这些神经元沿着RG细胞的放射状突起不断地向上迁移成熟到达特定的区域形成完整的大脑皮层。在这一系列的变化过程中,不同的转录因子按照时间和空间的先后顺序不断地激活(Pax6-Tbr2-Tbr1-Cux1-Satb2),精确地调控神经干细胞的命运。大脑皮层构建过程中的任何一个步骤发生问题都会导致严重的发育疾病,比如精神分裂症,自闭症等。但是,目前对于神经干细胞增殖,分化,迁移的深入机制还不十分清楚,需要进一步地探究。
  在胚胎大脑皮层发育的过程中,各种形式的表观遗传调控发挥着重要的功能,比如组蛋白的甲基化,乙酰化,磷酸化;DNA的甲基化;microRNA等等。在这些表观遗传修饰中,组蛋白变异体是一个很大的家族,包含H2A.Z,H2A.X,macroH2A,H3.3等。在实验体系中,重点关注了H3.3这种非常关键的组蛋白变异体对神经发生过程的影响。真核生物的核小体由不同种类的组蛋白构成,包含H1,H2A,H2B,H3和H4。在基因转录激活或是抑制的过程中核小体中的组蛋白构成会发生变化,比如在转录活化时,H2A.Z和H3.3会替换到核小体内,形成一种染色体活化的标志物,影响蛋白和DNA在染色质水平的可接近性,从而促进转录的进行。组蛋白变异体在基因组中的特定区域发挥对基因的表达的调控功能。对这些复杂的有组蛋白变异体参与的转录调控的研究有助于更深入了解基因的表达过程。同时,将对组蛋白变异体的探索引入到胚胎早期神经干细胞相关的研究中,可以帮助人们从一个新的角度揭示它们在发育过程中的重要作用。以往的研究表明H3.3可以通过替换H3来调控基因的转录,这时染色体处于一种转录活性状态。H3.3上包含丰富的表观遗传修饰位点,可以发生不同的表观遗传修饰,进一步调控不同生命发育过程。研究结果表明H3.3在胚胎早期神经干细胞中有表达:在体内和体外,H3.3都会和神经干细胞的标志物共标,而且H3.3的表达在时间和位置上有一定的特异性。进一步体内胚胎电转的实验结果表明,H3.3敲降后会导致神经干细胞增殖的比例减少,分化的神经元的比例增加。通过进一步的探索,发现H3.3的减少会导致另一种组蛋白修饰H4K16ac的减少,而这是因为H3.3表达量的降低会减少其对H4K16位点特异性乙酰化转移酶的招募,从而降低了H4K16ac的水平并且影响了基因的转录活化。这提示在神经干细胞发育的过程中H3.3和H4K16ac这两种组蛋白密码相互协同,调控神经干细胞的命运。通过转录组测序,发现在H3.3敲降影响了大量神经发生相关的生物过程。进一步分析数据后发现,GLI(GLI-Kruppel)家族的所有基因都是降低的,而其中GLI1减少的最多。通过进一步的Western和小鼠体内胚胎电转的实验证明GLI1是H3.3的下游基因,其在神经干细胞增殖分化的过程中发挥重要的功能。
  在大脑皮层发育的过程中谷氨酸是一种必不可少的氨基酸,发挥着重要的生物学功能。在哺乳动物体内,谷氨酸的受体分为离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体。代谢型谷氨酸受体被报道与神经疾病相关,是一些神经疾病的靶点,可以调控神经递质的释放和神经元的兴奋性。不同的代谢型的谷氨酸受体主要因为其蛋白序列,功能,配体的不同被区分为3类。其中包括Ⅰ(GRM1and GRM5),Ⅱ(GRM2and GRM3),和Ⅲ(GRM4,GRM6,GRM7,and GRM8)。在分析了以往的报道后,发现代谢型谷氨酸受体7(GRM7)作为一种仅在神经元突触前膜上特异性表达的G蛋白偶联受体,在接收到谷氨酸的刺激时会产生抑制性的作用。而且有报道称GRM7可能与新生儿自闭症(Autism Spectrum,ASD)和注意力缺陷(Attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)相关。但是GRM7是否会影响胚胎时期大脑皮层的发育还是未知的。
  在实验中,通过在胎鼠大脑皮层内过表达和敲降GRM7的方法来研究GRM7在神经干细胞发育过程中的重要作用。结果发现,GRM7在神经干细胞中有表达:在体内或体外的染色结果都表明GRM7和神经干细胞的标志物共标,而且GRM7在不同发育时期的表达是动态的。进一步体内胚胎电转的实验结果表明,GRM7敲降会导致神经干细胞增殖的比例增加,而神经元分化的比例减少,而且神经元的形态发育也会受到影响。在机制上的研究表明,在GRM7的表达受到影响后会改变CREB(cAMP Responsive Element Binding Protein)蛋白的磷酸化水平,而p-CREB作为一种转录调控因子会影响下游基因的表达。后续的实验证明YAP(Yes Associated Protein)作为GRM7和p-CREB的下游发挥调控神经干细胞增殖和分化的功能。
[硕士论文] 吴生礅
生物物理学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:在大脑皮层中,神经元放电在时间上具有高度不规则性。这种神经元的不规则放电与大脑的许多重要的认知相关功能如注意、感知觉、工作记忆等有着密切关系。展开神经元不规则放电调节方面的研究,有助于增加对神经信息加工机制的理解。在本文中,我们采用计算模型方法,探究了突触传输对神经元放电不规则性的调节作用。本文的主要内容和结论概述如下:
  1、我们详细探究了突触前轰击与神经元的不规则放电的关系。我们利用扩散近似方法,推导了在大量突触前神经脉冲轰击条件下,单个神经元接受到突触电流的解析表达式,发现突触电流呈现为Ornstein–Uhlenbeck(OU)噪声形式。并通过计算模型方法,我们发现突触前轰击具有非单调地调节神经元放电规则性的作用,并在最优的轰击强度下诱发神经元产生具有最优时间相干性的放电,即产生了相干共振现象。另外,通过与独立突触前输入相比,我们还发现具有相关性的突触前输入会降低神经元放电的规则性。我们的结果显示突触前输入在形成和调节神经元不规则放电方面,发挥着重要的作用。
  2、我们研究了自突触对神经元不规则放电的调控作用。通过计算仿真和进行数据的统计分析发现,自突触参与对神经元放电规则性的调控,主要是通过调节神经元产生簇放电的频率实现。其中,兴奋性自突触和电自突触能够提高神经元产生簇放电的频率,从而降低神经元放电的规则性;而抑制性自突触能抑制神经元簇放电的发放,从而改善神经元放电的规则性。随后,我们进行了放电触发平均和簇放电触发平均分析,发现正是由于自突触电流与神经元放电的时间关联性,使得自突触具有高效调节神经元簇放电的作用。另外,我们的结果不依赖于特定的神经元放电类型以及突触前输入相关。在相关输入条件下或者在其他放电类型的突触后神经元模型中,同样发现了类似的结果。我们的研究从计算神经科学角度为自突触调控神经元不规则放电提供了一种解释机制,并说明自突触在调节神经元放电动力学方面具有重要的功能性的作用。
  总之,我们的结果为突触传输参与形成和调控神经元的不规则放电提供了一种内在的理解机制。并且,因为神经元不规则放电在生物神经系统中的重要的功能作用,我们的工作也将有助于增加对神经系统的信息加工机制的理解。
[硕士论文] 徐莹
理论物理 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:神经系统是由神经元组成的,神经元之间通过各种耦合方式来实现信号传递。由于靶波和螺旋波可以像“节拍器”一样,调节神经系统电活动的集体行为,因此斑图动力学理论能够预测网络群体振荡行为的稳定性。当正常信号传播受到干扰或出现非自发的神经疾病时,网络中呈现混沌状态。本文基于Hindmarsh-Rose神经元网络模型构造了最近邻连接下的规则神经元网络,通过利用自适应控制、调节系统参数、改变边界条件以及实验条件等方法实现对神经元网络稳定性控制。针对该课题做了以下研究:
  1.通过三种不同的方法产生靶波,研究靶波在易激发介质中出现的潜在机制。并加入与结构有关的人工缺陷观察对靶波的影响。证实了缺陷对靶波的影响取决于靶波的内禀属性(产生靶波的方式)。
  2.神经系统缺陷可以发射连续波或脉冲,扰乱正常神经系统的信号传播。通过对外部激励产生波及其传播过程的研究,分析缺陷的形成机制。发现在外部激励下可以产生缺陷,且外部激励产生的波与缺陷诱发的波可以共存。
  3.网络边界上的结点选取随机初始值,通过观察神经元网络各结点膜电位的空间分布,来研究初始值对神经元放电模式的影响。发现适当的耦合强度下,网络中可以观察到螺旋波。
  4.研究规则神经元网络中同时施加局部周期激励和噪声时的动力学行为。发现螺旋波和平面波可以共存于神经元网络中,即使施加的噪声和外界周期激励位置不同,二维规则神经元网络中仍会出现随机共振行为。
  5.对网络少数结点的输出信号进行动态实时检测,利用非线性分析方法诊断网络细微涨落引发的相变行为,以及通过各个采样检测点的关联度,确定故障和崩溃的位置和范围。把该方法扩展到多体系统安全性检测和诊断,为消除故障、减少事故损害提供依据。
[博士论文] 龙治良
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:人类大脑是迄今最为复杂精细的系统之一。大脑的某项认知功能是由神经元活动同步的脑区共同协调完成。静息态功能核磁共振成像技术是一项探索脑功能静息活动强有力的分析工具。它可以描述脑区间低频功能活动特征的相似性,即静息态功能连接。弥散张量成像技术则是一项通过组织中水分子各向异性来探测脑微观组织结构的成像方法。它可以描述大脑神经突触连接,即白质纤维结构连接。静息态功能连接和白质纤维结构连接已分别应用于许多神经精神疾病的研究中。然而大脑的结构和功能并不是独立存在,而是相互依赖。因此,本论文将以静息功能连接和白质结构连接为基础,围绕多模态分析方法,利用神经影像的多维特征来探测情感障碍和运动障碍患者内在的脑异常连接。本文的工作主要有以下几部分内容。
  1.采用弥散张量成像以及白质纤维束追踪技术,通过图论分析方法分析创伤后应激障碍患者脑结构连接网络拓扑属性。结果发现患者保留了小世界拓扑组织结构。但是我们观察到患者显著降低的最短路径长度和标准化最短路径长度。另外,异常改变的节点中心性的脑区主要在显著性网络、前扣带回、苍白球和海马。该研究揭示了创伤后应激障碍是一种脑网络疾病,为理解该患者功能失常和临床症状提供了结构上的证据。
  2.利用白质纤维束追踪技术,构建未用药抑郁症患者结构连接网络,然后使用图论分析方法,探测抑郁症患者的结构网络拓扑属性是否异常。进一步采用基于网络的统计(NBS)方法来探究该患者是否有异常改变的子网络。我们发现未用药抑郁症患者结构网络的全局拓扑属性有异常变化,比如异常降低的最短路径长度和异常升高的聚类系数。除此之外,NBS方法揭示了抑郁患者在眶额叶与皮下结构、梭状回、颞下回以及枕叶部分脑区间有异常的结构连接。该研究揭示了眶额叶连接在抑郁症患者病理机制中的重要作用。同时为该患者的功能异常提供了结构上的基础。
  3.利用静息态功能连接分析方法,我们研究了处于抑郁期的抑郁症患者和双相障碍患者的丘脑皮层网络,进一步探测特定的丘脑皮层连接是否能够有效辨别这两种情感障碍疾病。结果发现抑郁症和双相障碍的丘脑-眶额叶功能连接都异常降低,丘脑-运动连接都异常升高。双相障碍患者特有的异常连接是丘脑-顶下小叶连接。而抑郁患者特有的异常连接是丘脑-颞叶、丘脑-躯体感觉皮层连接。并且丘脑枕下部和左侧顶下小叶间的功能连接能有效的区分抑郁症和双相障碍。本研究表明即使抑郁症和双相障碍的临床症状很相似,我们仍然发现了它们之间影像学的差异,为临床诊断提供了一种生物学标记。
  4.融合白质纤维结构连接和静息态功能连接技术,我们探究了阵发性运动源性运动障碍患者的丘脑皮层结构连接和功能连接。我们发现该患者在腹外/前侧丘脑核团与运动皮层的结构连接和功能连接异常升高。患者的功能连接值与病程呈显著的正相关关系,表明了该运动障碍患者是一种复杂的发展性疾病。另外,我们还发现PRRT2基因突变患者在背内侧核团与前额叶间的功能连接异常降低,表明了PRRT2基因突变降低了丘脑到前额叶的功能整合,阐明了丘脑皮层连接失常在该患者病理机制中的重要作用。最后,我们还探究了该患者基底节-皮层连接,发现PRRT2基因未突变患者在壳核/苍白球与运动皮层间功能连接异常升高,揭示了PRRT2基因突变和PRRT2基因未突变患者间不同的发病机制。
  5.采用静息态功能连接分析技术,我们探究了阵发性运动源性运动障碍患者异质性问题。首先我们利用主成分分析方法提取患者功能连接特征,然后使用基于密度的聚类算法对该患者进行亚组分类。结果发现该患者有两种疾病亚型。一种亚型在小脑-丘脑-基底节-运动皮层环路异常升高,而另一种亚型在小脑-顶上回连接环路异常降低。并且,第一种亚型的全脑功能连接网络的拓扑属性异常改变。而第二种亚型的网络拓扑属性则保持不变。该研究为神经精神疾病的亚型分类提供了一种基于影像数据驱动的分析方法。
[硕士论文] 王凤娟
系统理论 北京交通大学 2017(学位年度)
摘要:非线性动力学是研究非线性系统运动规律的一门学科.其主要研究内容包括系统中的结构的稳定性、轨道的稳定性、分岔、混沌等.对非线性动力系统的研究不仅在理论上具有重要的价值,而且在科研应用方面也具有广泛的应用前景.非线性系统几乎涉及自然科学和社会科学的各个领域.它的理论和方法已经被广泛地应用到物理、化学、生物、生态、医疗以及经济学等领域.本文主要考虑非线性系统理论在神经系统中的应用.
  本文首先基于Chialvo神经元模型,研究系统在不同参数组合下的二维参数平面图的分岔结构,给出Neimark-Sacker分岔曲线的表达式,讨论系统吸引子的最终状态,包括周期吸引子、无界吸引子、拟周期和混沌吸引子,并且详细分析嵌入拟周期或混沌中的周期吸引子的分岔规律和动力学特征.
  其次,建立由混沌峰放电(chaotic spiking)的Chialvo神经元构成的网络模型,定性分析和数值模拟当数目众多的无规则的个体通过线性耦合方式紧密联系在一起形成的高维数的神经网络表现出的动力学行为,验证了随着耦合强度的改变,形成的网络系统有可能会表现为稳定的同步不动点,并且达到完全相同步.
  最后,总结本文的工作,为全面分析单个离散神经元模型以及神经元网络系统的动力学行为奠定基础.
[硕士论文] 张云翔
神经生物学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:癫痫是一种大脑神经元异常放电导致的突发性疾病。失神癫痫是癫痫中的常见类型,在失神癫痫发作过程中常常伴有2~4 Hz棘慢波(Spike and wave discharges, SWDs)的发放,并伴随短暂的意识丧失。研究表明大脑基底节(Basal ganglia,BG)神经环路在调控失神癫痫发作的过程中发挥重要作用,其中黑质网状部(Substantia nigra pars reticulate,SNr)作为重要的信息中转站,通过丘脑间接与大脑皮层相连接,进而调控大脑皮层的兴奋性。解剖学上,BG神经环路中外侧苍白球(Globus pallidus externa,GPe)可以通过两种不同的神经通路调节SNr兴奋性,即GPe-SNr神经通路和GPe-底丘脑核-SNr通路,这些神经通路使得GPe能够参与皮层神经元兴奋性的调控。新近研究发现从GPe到前额叶皮层运动区还存在一条直接的伽马氨基丁酸(GABA)能神经通路,本课题组基于计算仿真模型的研究发现这条苍白球-前额叶皮层通路也对前额叶皮层区的失神癫痫发作具有调控作用。但是,苍白球-前额叶皮层通路对失神癫痫调控作用目前尚缺乏足够的动物或临床实验证据。
  本论文中,我们通过腹腔注射伽马丁内酯(?-Butyroladone,GBL)建立失神癫痫模型,通过GPe注射GABA受体阻断剂Gabazine,以及电损毁SNr,采集不同干预条件下失神癫痫发作的脑电数据,并用时频分析、大尺度方差识别统计算法、信息熵以及功率谱对失神癫痫发作时的 SWDs进行分析,以期从实验角度为理解苍白球-前额叶皮层通路对失神癫痫调控提供依据。主要研究结果如下:
  1、通过在GPe注射Gabazine增强GPe神经元的活性,可以有效抑制前额叶皮层失神癫痫SWDs发放,表明GPe与前额叶皮层区之间存在直接或间接的通路,从而对前额叶皮层区域失神癫痫的发作具有重要的调控作用。
  2、通过电毁损黑质网状部或同时药物干预GPe增强神经元的活性,均可有效抑制前额叶皮层区的失神癫痫发作。表明除了经典的GPe-SNr-皮层间接神经通路外,GPe-前额叶皮层的直接通路是另一条控制大脑皮层区失神癫痫发作的重要神经通路。
  3、通过对失神癫痫大鼠在不同时间段SWDs发作次数和平均每次发作时间进行对比分析,发现在不同干预条件下,SWDs发作次数可能存在明显变化,而每次SWDs的平均发作时间没有明显变化,提示不同干预条件下,SWDs总的发作减少是由于干预导致SWDs的发放次数减少所致。
  4、在GBL诱发的失神癫痫大鼠模型中,药物干预GPe或电毁损SNr均可有效抑制前额叶皮层区的失神癫痫SWDs发放时间。在失神癫痫发作的15~35 min内,GPe和SNr对抑制皮层运动区失神癫痫SWDs贡献度分别平均为47.2%和34.6%。因此,相比SNr,GPe对前额叶运动皮层区失神癫痫发作具有更强的调控能力。
  5、通过对GBL诱发的失神癫痫大鼠在不同实验干预条件下,SWDs在不同时间段EEG信号的信息熵进行分析,发现当SWDs发放减少时,对应EEG信号的信息熵会降低;SWDs发放增加时,对应EEG信号的信息熵也会增加,提示信息熵可以表征失神癫痫SWDs的发放过程。
  6、通过对不同实验干预条件下,与SWDs相关的低频EEG信号的功率谱和同步性分析发现,失神癫痫发作后1-8 Hz频段EEG功率谱与同步性显著增加,干预 GPe或损毁 SN后,可以降低由于癫痫发作所致的脑电功率谱和同步性,并且同时干预对EEG功率谱与同步性影响更明显。
  通过以上的研究,我们从电生理实验角度证明了外侧苍白球-前额叶皮层直接通路是一条重要的抑制性神经通路,而且在调控前额叶皮层运动区失神癫痫发作的过程中GPe可能比SNr发挥更重要的作用。研究结果有助于增加对皮层失神癫痫发作和调控机制的理解,同时也验证了计算仿真模型的结果。
[硕士论文] 苏秀婷
应用数学 浙江师范大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,耦合神经元系统的同步动力学已经成为各国学者研究的一个中心问题.通过构建符合实际生物神经系统的神经元网络,研究神经元网络的同步具有重要的生理意义.本文以随机的Hodgkin-Huxley方程为基础,构建不同的神经元网络模型.通过计算机仿真实验,探讨了网络拓扑结构、突触延迟、突触类型等对神经元网络同步产生的影响.
  首先,在没有突触延迟时,耦合抑制性神经元网络的同步性很差,随着连接概率的增加神经元发放率减少.此外,随着膜面积增加,耦合抑制性神经元网络越来越不同步,且神经元发放率减少.若进一步加入适当的突触延迟会促进耦合抑制性神经元网络的同步.
  其次,在没有突触延迟时,耦合兴奋性神经元网络与耦合抑制性神经元网络相比同步性较好,随着连接概率的增加,神经元发放率增加.若进一步加入适当的突触延迟也会促进耦合兴奋性神经元网络的同步.
  再次,我们考虑了由抑制性和兴奋性两个神经元集群相互耦合组成的神经元网络.在无突触延迟时,耦合抑制性和兴奋性神经元网络的相干发放性较好.随着膜面积增加,耦合抑制性和兴奋性神经元网络越来越同步且发放率减少.另外,兴奋性突触有助于促进耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步,而抑制性突触会抑制耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步,但随着膜面积的增加,抑制性突触对耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步影响逐渐变小.若进一步加入突触延迟,当膜面积较小时,突触延迟对耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步影响较小;当膜面积适中时,突触延迟会引起耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步振荡;当膜面积较大时,随着突触延迟的增大耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步性越来越好,最后趋于稳定.
  最后,我们进一步考察了兴奋性神经元集群E1、E2以及抑制性神经元集群I所组成的神经元网络,并研究了网络拓扑结构对这种神经元网络动力学的影响.在兴奋性神经元集群E1和兴奋性神经元集群E2不构成回路的连接方式下,当膜面积适当大且E2集群有抑制性输入时,三个神经元集群之间不会出现同步发放.若在兴奋性神经元集群E1和兴奋性神经元集群E2构成回路的连接方式下,三个神经元集群之间就会出现同步发放.
[硕士论文] 袁蓉蓉
神经生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:一、研究目的及背景
  肌球蛋白(Myosin)家族属于马达蛋白超家族,可以将细胞内的机械能转化为化学能,进而参与生物体内一系列生理生化反应。目前已发现超过20种肌球蛋白分子,在结构和功能上具有差异,但都可以通过头部结合ATP酶水解ATP沿actin进行移动。目前研究最多是MyosinⅡ,即肌球蛋白Ⅱ。MyosinⅡ最早在肌肉中被发现,通过水解ATP产生的能量介导肌肉收缩。随着研究的深入,发现在非肌肉组织,如神经元中也存在MyosinⅡ的表达,称为非肌肉型MyosinⅡ(non-muscle myosinⅡ,NMⅡ)。MyosinⅡ是一个六聚体,包含一对高分子量的重链(MHC)及结合在重链颈部的两对小分子量的轻链(MLC),其中包含两条调节型轻链和两条必要型轻链。中枢神经系统中MyosinⅡ有较高的表达,并起着重要的调控作用,主要参与神经元的迁移、突起的生长及导向、微管在神经元生长锥内的状态与转运、肌动蛋白(actin)的动态变化、树突棘spines的形成等过程。NMⅡ的活性主要受其轻链MLC2的激活调控,参与的激酶主要有肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase,MLCK)及Rho亚家族(RhoA)激酶。NMⅡ作为细胞内基础的马达蛋白也参与到脑的高级功能中。文献报道MyosinⅡ在早期长时程增强(Long Term Potentiation,LTP)的维持过程发挥作用;并且通过不同信号激活,分别参与到长时程条件性恐惧记忆的整合阶段,及缘下回(infralimbic cortex,IL)脑区味觉厌恶记忆的消退中。目前的报道多以直接干扰重链的形成从而影响MyosinⅡ功能为主,但是MyosinⅡ活性上游受到哪些因素调控,并没有详细的报道。
  脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是脑中广泛存在的神经营养因子,通过与膜上两种不同亲和力的受体-高亲和力酪氨酸激酶受体B(Tropomyosin receptor kinase B,Trk)和低亲和力神经营养因子受体(The Low-Affinity Nerve Growth Factor Receptor,P75NTR)结合,激活下游信号通路。BDNF除了能够促进神经元的存活及分化、突起的生长,还在突触可塑性的调节中发挥重要功能。突触的可塑性也被广泛认为是学习记忆的分子基础,调控神经元之间的信息传递。在体外培养的海马神经元中,BDNF能够诱导LTP的产生并维持LTP的稳定。BDNF还可以通过调控肌动蛋白(actin)的动态变化促进树突棘的形成。BDNF是否对MyosinⅡ的活性存在调控作用,具体的信号通路又是什么?
  本文采用分子生物学及细胞生物学的多种方法,证实BDNF/TrkB信号通路可以上调调节型轻链MLC2的磷酸化水平,从而上调MyosinⅡ活性。进一步证明这一过程并不依赖TrkB下游经典的三条信号通路,而是通过SRC家族的LYN激酶实现的。本研究可更好的帮助我们了解MyosinⅡ的功能及作用机制。
  二、实验方法
  1、构建各种小干扰片段。
  2、特异性MLCK短肽
  3、海马神经元的培养及其转染。
  4、Western Bolt及CO-IP
  三、实验结果
  1、BDNF通过高亲和性受体TrkB调节MLC2磷酸化。
  首先通过蛋白免疫印迹的方法发现,给予体外培养的海马神经元BDNF刺激30min时,p-MLC2灰度值较con组明显增加(p<0.05,而且随时间增加(2h时)灰度值持续增加(p≤0.01)。在给予BDNF刺激前加入抑制P75NTR功能的短肽(TAT-Pep5)、Trk激酶抑制剂(K252a)预处理30min,与对照组相比较,K252a+BDNF组p-MLC2灰度值并无明显增加。同样的给予老鼠海马脑区注射BDNF、K252a结果发现,BDNF组p-MLC2明显增加(p<0.05)。
  2、BDNF通过激活MLCK调控MLC2磷酸化
  我们发现分别给予体外培养的海马神经元磷酸酶抑制剂(CalA)、ROCK激酶抑制剂(Y27623)、MLCK激酶抑制剂(ML-7)预处理30min后,BDNF刺激2h,ML-7+BDNF组p-MLC2没有明显升高。在体外培养的海马神经元中加入特异性短肽抑制MLCK与MLC2结合后,BDNF刺激2h,TAT MLCK+BDNF组p-MLC2并无明显变化。
  3、SRC通路参与BDNF调控MLC2磷酸化水平变化
  之前发现BDNF对p-MLC2的调控依赖TrkB的激活,我们分别给予体外培养的海马神经元TrkB下游三条经典信号通路抑制剂U0126(MAPK信号通路抑制剂),U73122(PLCY信号通路抑制剂),LY294002(PI3K信号通路抑制剂)30min预处理后,BDNF刺激2h,与BDNF组相比较,U0126+BDNF、U73122+BDNF、LY294002+BDNF组p-MLC2灰度值无明显变化(p>0.05),这提示我们BDNF对p-MLC2的调控不是通过三条经典信号通路发挥作用。接下来给予TrkB下游SRC信号通路抑制剂PP130min后,BDNF刺激2h,与BDNF组相比较,PP1+BDNF组p-MLC2灰度值显著降低(p≤0.05)。分别干扰SRC家族成员,发现干扰掉LYN激酶后加BDNF刺激时p-MLC2无明显升高。
  4、LYN作为上游蛋白调节MLCK磷酸化水平
  我们通过免疫共沉淀的方法,检测LYN-Myc与MLCK-HA是否存在结合,结果发现LYN与MLCK存在相互作用。接下来干扰捧LYN的表达,BDNF刺激2h,p-MLCK的灰度值显著下降(p<0.05),同时过表达LYN后p-MLCK显著增加(p<0.05)。
  结论:
  通过一系列的细胞及分子生物相关实验,我们证明了BDNF通过激活SRC信号通路上调MLCK磷酸化水平从而增加MLC2的磷酸化水平。
[硕士论文] 陈雪美
控制理论与控制工程 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:海马区是大脑中参与学习和记忆等功能的重要脑区,在情景记忆和空间导航中起着至关重要的作用。针对鸟类的空间认知神经机制,本文对鸽子海马区位置细胞进行识别并分析位置野分布的特性,有助于深化对不同物种动物空间认知机制的理解,同时为进一步解析鸽子的三维空间认知和导航机制奠定基础,并为记忆受损的神经康复提供机理支持。
  本文利用圆形迷宫和十字迷宫两种实验装置,设计了四种不同的空间认知任务。其中包括圆形迷宫环境中3种任务,分别为不设置标志物圆形迷宫自由觅食任务(Task1)、设置有标志物圆形迷宫自主活动任务(Task2)、设置有标志物圆形迷宫自由觅食任务( Task3);十字迷宫设置有标志物自由觅食任务(Task4)。在鸽子执行上述任务时同步记录海马区神经信号及鸽子运动轨迹,并利用电极间相关法对检测出的Spike信号去除大幅值干扰。然后,对任务空间的二维平面进行划分网格,分析海马区神经元响应。根据检测到的Spike序列和运动轨迹构建Spike发放率密度矩阵,设定阈值获得响应网格和响应区,进而识别位置细胞及其对应的位置野。
  本文在四种不同的空间认知任务中共记录到239个神经元,识别出151个位置细胞,430个位置野,位置细胞所占比例为63%,位置野多分布于食物和窝附近。其中圆形迷宫位置细胞占所记录神经元的94.49%,十字迷宫位置细胞占27.68%。圆形迷宫3个不同任务相比较,任务3位置细胞的概率为100%,任务1为93.75%,而任务2仅为68.75%,这与自主活动中鸽子并未遍历整个空间有关。在位置野的分布中,具有1个位置野的位置细胞占31.13%,比重最大。任务1和3中一个位置细胞对应的位置野个数高达6个或7个位置野,出现一个位置细胞对应多个位置野。而任务2和4位置野主要分布在1个或2个。整体上一个位置细胞平均对应2.85个位置野。上述结果说明圆形迷宫识别出的位置细胞概率远大于十字迷宫。设置有标志物的环境诱发更多的神经元放电,且自由觅食运动状态诱发的位置细胞和位置野整体上均多于自主活动。多数位置细胞在同一空间环境中存在不同的位置野。
[硕士论文] 黄胜李
统计学 浙江师范大学 2017(学位年度)
摘要:神经元在一个具有噪声的环境下活动,其中主要的噪声有两类:突触噪声和通道噪声,并且突触噪声还可进一步分为外部突触噪声和内部突触噪声.通常用独立的随机过程族来表示外部突触噪声,这样的处理显然忽略了其更复杂的统计性质,如相关性.因此,有必要考虑外部突触噪声相关性的影响.
  本文考虑的模型便是一个由外部突触噪声,内部突触噪声和通道噪声共同作用下的Hodgkin-Huxely神经元网络.其中,外部突触噪声是一种具有两两相关性的随机过程族一单交互Poisson过程(Single interaction Poisson processes,SIP);内部突触噪声是由网络中神经元随机的突触连接产生;而通道噪声被近似为一个扩散过程.
  对这样一个复杂的系统,本文采用Euler-Maruyama算法进行数值模拟,而模拟所得的数据用于对神经元网络进行发放统计.首先,不考虑网络内部突触的随机连接,得出SIP输入的噪声强度与两两相关系数对无耦合网络发放行为的影响.进而,考虑网络内部突触的随机连接,讨论随机连接的概率,SIP输入的噪声强度及其两两相关系数这三者对神经元网络的共同作用.
[硕士论文] 丁慧芳
生物学、发育生物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过阻断交感神经以及补给递质去甲肾上腺素后检测小鼠子宫CD80、CD86,NF-κB表达的变化,探讨交感神经对小鼠子宫CD80、CD86表达的影响以及交感神经对小鼠子宫局部免疫的作用
  方法:⑴将50只昆明种雌性小鼠随机分为两组:对照组25只(A组,注射生理盐水)、实验组25只(B组,注射6-OHDA)。A组小鼠于每天早上9:00腹腔注射0.2 ml含0.01%抗坏血酸的灭菌生理盐水,B组小鼠于每天早上9:00腹腔注射0.2 ml溶于含0.01%抗坏血酸的灭菌生理盐水中的6-OHDA,连续注射五天,将第五天标记为D1、随后依次在D1、D3、D5、D7、D9的15:00时取小鼠子宫。⑵将20只小鼠分为阻断交感神经的对照组、注射低NE组,注射中NE组和注射高NE组,分别标记为C,L,M,H。连续5天早上9:00给全部小鼠腹腔注射6-OHDA,损毁交感神经。从注射6-OHDA的最后一次开始,C组小鼠在每天早上9:00和晚上21:00分别腹腔注射0.2 ml的灭菌生理盐水,同一时间L组、M组和H组分别腹腔注射0.02μgNE、0.2μg NE、2μg NE,连续注射五天,在第五天15:00时取小鼠子宫。
  结果:①与A组相比,B组小鼠在D1时CD86蛋白和CD86 mRNA都达到了极显著水平(P<0.01),D5时有下降趋势,D9时恢复至对照组水平;子宫组织三部位中内膜在D1时表达最多,外膜最少,到D9时恢复正常水平;B组NF-κB含量在D1和D3时极显著增多(P<0.01),D5时显著增多(P<0.05),D7与D9时恢复至对照组水平。②与C组相比,L组和M组的CD80蛋白和CD80mRNA均极显著减少(P<0.01),并且L组减少的幅度最大,而L组和M组的CD86蛋白和CD86 mRNA均极显著增多(P<0.01),其中M组增多的幅度最大;与C组相比,L组与M组的NF-κB含量均极显著减少(P<0.01),其中L组减少的幅度最大。
  结论:⑴交感神经可能抑制CD80和CD86的表达。⑵交感神经可能是通过cAMP--PKA--NF-κB途径调节CD80和CD86的表达。⑶NE对CD80和CD86的作用是有差异的,并且浓度的不同表达的效应也有差异。
[硕士论文] 李国红
基础兽医学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:神经元的增殖、分化以及神经元迁移到达皮层正确位置,最终形成大脑皮层高度有序的六层结构。神经元的迁移需要细胞骨架的重塑调节以及细胞间粘附作用,神经元迁移异常会引起大脑发育畸形并可导致各种神经性疾病,如:老年性痴呆症、癫痫、自闭症等。参与细胞骨架重塑过程的肌动蛋白纤维(actin filaments,F-actin),能够维持细胞骨架的稳定性。而作为肌动蛋白解聚因子家族成员之一的Cotl1(Coactosin-likeprotein-1),主要与丝切蛋白竞争性结合肌动蛋白纤维。新的研究表明,丝切蛋白能够切割肌动蛋白纤维产生新的纤维末端,从而使肌动蛋白纤维可以延伸。因此,丝切蛋白参与维持细胞骨架的动态重构,指导细胞迁移,对大脑皮层的发育起着重要作用。但目前对Cotl1在维持细胞骨架稳定性以及细胞运动方面的研究较少,更没有关于Cotl1对大脑发育过程中神经元的迁移的研究。因此,为了探究Cotl1对大脑皮层发育的影响,本实验通过构建Cotl1超表达载体、功能位点突变载体,借助子宫内电击转染及免疫荧光染色技术研究了Cotl1在神经元的迁移、迁移过程中单个神经元形态的变化以及细胞的增殖分化方面的作用。主要结果如下:
  1.本实验成功克隆了Cotl1基因,在mRNA水平检测到该基因能够在胚胎小鼠大脑皮层表达;
  2.成功构建了Cotl1超表达载体:pCAG-Cotl1-myc,运用子宫内电击转染技术研究了该基因对大脑皮层神经元迁移的影响。发现在胚胎发育的早期,超表达Cotl1能以剂量依赖的方式抑制神经元的迁移;在胚胎发育的晚期,超表达Cotl1神经元的顶突起显著增长,神经元的迁移速度受到抑制;
  3.利用子宫内电击转染技术和BrdU标记技术,研究超表达Cotl1对神经元增殖及分化的影响,发现超表达Cotl1对神经元的增殖及最终分化为神经元的能力并没有显著的变化;
  4.本实验成功构建了Cotl1的功能突变载体pCAG-Cotl1-ABM-myc,结合子宫内电击转染技术研究突变载体对神经元迁移的影响,发现超表达Cotl-ABM,神经元的迁移及神经元的形态都恢复到正常状态,证明该位点即是Cotl1的功能性位点。
  以上结果表明,超表达Cotl1抑制神经元的迁移速度但对大脑皮层神经元的增殖及分化并没有显著影响,73位赖氨酸及75位精氨酸在神经元迁移过程中起重要作用。为研究神经系统疾病提供一定的理论依据。
[硕士论文] 金霞
发育生物学 杭州师范大学 2017(学位年度)
摘要:神经系统是以神经元为单位构建起来的复杂而又精密的网络。神经系统由初期状态向成熟状态发育的过程中,具有广泛的重塑现象,其中包括神经元轴突的修剪,新的突触的产生,旧的突触的消除等。这有别于成体的神经可塑性,发育中的神经可塑性给神经连接带来的变化是不可逆的。目前我们对于神经发育可塑性的调控机制并不清楚。
  线虫DD神经元在发育过程中存在着一个有趣的突触重塑现象,即DD神经元的轴突和树突在功能分支上会发生彻底的反转,但是神经元分支形态没有明显的变化。这就提供了一个有力的遗传学模型去深入探究突触重塑的机理。
  本课题组前期工作鉴别出一个myrf-1的突变体ju1121,该突变体的DD神经元突触重塑受到阻断。详细分析MYRF-1蛋白发现,它全长定位于内质网上,被剪切后其氮端入核,行使调控突触重塑的功能。过表达氮端MYRF-1可以有效促进DD神经元突触重塑提前。但是前期工作又表明,myrf-1的基因缺失突变体的突触重塑能够正常发生。这样myrf-1(ju1121)是否是一个功能缺失突变体,而对于突触重塑起了一个怎样的作用是个未解决的重要问题。
  我们用CRISPR基因编辑方法构建了myrf-1无效突变体,发现在这样的突变体中突触重塑没有出现大的缺陷。我们设想,可能有对于myrf-1功能冗余的基因也能够推动突触重塑。myrf-1有一个横向同源基因myrf-2,他们有很高的序列相似性。我们用CRISPR技术构建了myrf-2无效突变体,发现myf-2功能缺失也不影响突触重塑。但是,在myrf-1和myrf-2的双突变体中突触重塑被阻断,这暗示了myrf-1和myrf-是位于同一条遗传途径中,两者共同促进突触重塑的发生。为了进一步探究myrf-2(ju1121)的机制,我们在DD神经元中过表达MYRF-1(G274R即ju1121)能够抑制突触重塑,并且抑制表型依赖于野生型MYRF-1的表达量。当MYRF-1和MYRF-2共同表达在细胞系中,MYRF-1和MYRF-2可以互相免疫共沉淀,意味着二者共同存在于一个蛋白复合体中。myrf-1和myrf-2是首次发现的能够促进线虫DD神经元突触重塑发生的基因,对于进一步研究突触重塑提供了遗传学通路的框架。
[硕士论文] 唐霞
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:神经递质释放的调节涉及多种蛋白质及蛋白质之间的相互作用,因此,主要通过研究蛋白质间相互作用的分子机制来揭示神经递质释放过程。尽管许多蛋白都参与调节神经递质的释放,但有研究证实Rab3蛋白和突触结合蛋白在调节中起关键作用。虽然人们对Rab3A和突触结合蛋白的研究已经取得了一定进展,但到目前为止,关于它们的相互关系和如何协同调控实现突触囊泡的胞吐作用的分子机制一直没有研究清楚。突触结合蛋白Ⅰ是突触结合蛋白家族中含量最丰富的亚型,在突触囊泡膜融合和胞吐过程中起着Ca2+感受器的作用。突触结合蛋白Ⅰ通过C2结构域与其他分子相互作用从而调节细胞活动和神经递质释放过程。Rab3A属于小G蛋白超家族中Rab家族中的一种亚型蛋白,位于大脑神经元细胞的突触小泡上,由220个氨基酸组成,对神经递质释放和膜转运过程起着关键作用。我们的前期研究证明,Rab3A在没有Ca2+存在时能与突触结合蛋白Ⅰ的C2A和C2B结构域结合。C2B结构域中的KKKK模体是与Rab3A结合的关键位点,Rab3A可能和t-SNARE复合体中的syntaxin竞争性与C2B结合,从而调节Ca2+依赖型的神经递质释放,但Rab3A与C2A结构域相互作用的分子机制尚不清楚。
  为了寻找到突触结合蛋白Ⅰ中的C2A结构域与Rab3A相互作用的功能位点和调控机制。在本研究中,通过分子克隆技术将突触结合蛋白Ⅰ C2A结构域及其两个截短突变体C2A(143-206)、C2A(207-244)和三个双点突变体C2A(R199Q/K200Q)、C2A((R233Q/K236Q)、 C2A(M173Q/F234Q)分别构建在表达载体pGEX4T-1上,得到带GST标签的融合蛋白,另将Rab3A构建到pET28a载体上,获得His标签的融合蛋白。通过GST pull down实验,结果显示截短突变体C2A(143-206)与C2A(207-244)相比,C2A(143-206)结合Rab3A能力较强,表明Rab3A与C2A的结合位点可能位于C2A的N端。进一步实验结果证明,突变体C2A(R199Q/K200Q)和野生型C2A相比,其与Rab3A相互作用明显减弱,而突变体C2A(R233Q/K236Q)和C2A(M173Q/F234Q)与Rab3A结合能力不变。综合分析,Rab3A与C2A相互作用的关键结合位点位于C2A结构域突环2中的R199K200,该位点与已知的大多数其他功能位点不相重叠。例如,C2A结构域中钙离子结合位点是由天冬氨酸残基簇决定的;YVK模体是突触结合蛋白Ⅰ与突触融合蛋白及磷脂相互作用的关键位点;疏水性氨基酸M173/F234是C2A定位在细胞膜表面的关键位点。我们推测,突触结合蛋白Ⅰ-C2A结构域和Rab3A的互作并不完全基于静电作用,有报道C2A结构域中第199位是C2A与磷脂结合的关键位点。Rab3A可能通过影响C2A与磷脂的结合从而调控C2A介导的突触囊泡膜融合过程。本论文为阐明Rab3与突触结合蛋白的相互作用及其调节神经递质释放的分子机制积累了新的实验数据。
[硕士论文] 袁红瑾
药理学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:皮层与海马的信息处理依赖于谷氨酸能兴奋性投射神经元与γ-氨基丁酸(GABA)能抑制性神经元之间复杂的相互作用。两种神经元之间协调的相互作用对于维持大脑兴奋与抑制信号之间微妙的平衡关系至关重要,这种平衡受到很多神经调节物质如不同的神经肽、一氧化氮(NO)等的动态调节。平衡的破坏会导致很多病理性的障碍如癫痫、自闭症、精神分裂症等。
  NO参与了神经传递、突触可塑性、血管舒张、炎症等很多生理过程,是一个非常重要的信号分子,NO产生或释放功能的缺陷会导致神经元死亡以及癫痫等疾病。NO由一氧化氮合酶(NOS)合成,根据最初被发现时所在的部位,NOS又可分为内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)以及可诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。在神经元中NO主要由nNOS合成,在幼稚和成熟的海马与皮层中nNOS主要表达在GABA能中间神经元上。GABA能中间神经元主要来源于三个不同部位:中间神经节隆起(MGE)、外侧/尾部神经节隆起(LGE/CGE)以及视前区(POA),每个神经上皮前体细胞部位都会产生不同的中间神经元亚型。通过在转基因鼠上运用遗传谱系追踪技术发现,皮层Ⅰ型nNOS主要来源于MGE,Ⅱ型nNOS则是MGE、LGE/CGE以及POA的混合来源,也就意味着皮层大部分的nNOS来源于MGE。
  MGE细胞移植到成年鼠的脑内可以扩散、迁移并且分化成GABA—主要的抑制性神经递质。很多假说认为移植MGE的前体细胞可以增加局部的抑制,运用于临床治疗具有非常重要的意义。近几年来分离、移植MGE来源的中间神经元前体细胞方面研究有很多,皮质中间神经元的前体细胞移植到一系列的中枢神经系统组织后可以广泛的迁移并且与宿主神经元网络形成突触联系。MGE细胞移植后可以进行整合的能力被广泛运用到细胞疗法上,从而治疗一系列中枢神经系统疾病:癫痫、神经性疼痛、帕金森以及阿尔兹海默病等。因此运用MGE前体细胞进行的细胞移植在治疗神经和精神疾病中是一个非常有潜能的临床途径。
  恐惧是一种与适应能力相关的基本情绪,是面对外界可知或不可知的威胁时激发的学习能力。适度的恐惧反应能警示动物面对类似于先前经历的有害环境,及时评估潜在的危险并做出保护反应,而病理性恐惧记忆的产生将会导致创伤后应激综合征(posttraumatic stress disorder,PTSD)、惊恐障碍(panicdisorder)、恐惧症(phobia)等恐惧相关疾病。基于巴甫洛夫条件反射原理建立的经典的条件性恐惧(Cued-fear conditioning)以及在此基础上发展出的背景关联恐惧(Contextual fear conditioning)是最常见研究恐惧相关疾病的动物模型,广泛应用于恐惧学习和记忆的神经、分子机制研究。
  海马是大脑边缘系统结构之一,在情感和认知功能中具有重要作用。既往研究表明,海马与PTSD发生、发展及治疗密切相关,海马DG区是认知功能和情绪调控的神经基础,包含DG区的海马三突触通路对于背景关联型恐惧记忆至关重要。
  由于目前对于nNOS前体细胞来源鲜有报道,且大部分研究着眼于皮层nNOS细胞。因此,我们希望能通过培养MGE细胞来研究nNOS。本课题设计研究三部分内容:1)通过培养不同部位前体细胞来确证nNOS细胞最主要的胚胎来源是MGE,并改进获取MGE的方法,从而获得状态较好的nNOS细胞;2)对nNOS细胞进行体外培养与鉴定,并尝试多种方法来提高其中nNOS细胞的比例;3)将较高nNOS比例的MGE前体细胞体外培养成神经球,并移植到海马DG区,研究nNOS细胞以及GABA能中间神经元在小鼠恐惧记忆获得中发挥的作用。
  第一部分为了探究nNOS的胚胎来源,结合已有的文献报导以及对不同时间点nNOS阳性率的研究,我们选取了E12.5的胎仔,在体视显微镜下取其整脑,并于多聚甲醛中固定24h,随后蔗糖梯度脱水6天后进行冠状冰冻切片,并于载玻片上贴片免疫组化,用免疫标记物PAX6、FOXG-1、Meis-2、Nkx2.1分别标记皮层、前脑、LGE和MGE,对E12.5天胚胎各个部位的形态及范围有个确切的认识。此后,我们就进行E12.5天胎仔的原代培养,在体视显微镜下,分离出同一只胎仔的皮层、POA、CGE、LGE和MGE,体外培养10天后,通过细胞免疫组化鉴定其中nNOS细胞的比例,发现MGE部位nNOS细胞比例最高,即确证了MGE是nNOS细胞主要的胚胎来源。
  由于MGE细胞获取方法以及分离的时间长短均会影响原代培养后细胞的状态,因此我们希望能够通过改进现有的MGE获取方法,使得原代培养后的细胞状态更好。综合对比多种方法后,我们尝试了琼脂糖凝胶包埋整脑后Chopper冠状切片、缓冲液中分离MGE的方法以及体视显微镜下于缓冲液中直接分离MGE的方法,后者无论是操作时长、细胞状态以及nNOS细胞阳性率均优于前者。因此第一部分的实验,我们确定了MGE是nNOS细胞主要的胚胎来源,并通过对比改进了MGE获取的方法,便于之后的研究。
  第二部分为了了解MGE来源的nNOS细胞的形态和性质,我们进行了E12.5天胎仔的原代培养,10天后通过免疫组化进行了nNOS细胞鉴定。发现培养的MGE细胞中90%为GAD67+细胞,99.97%为Tuj-1+细胞,大部分的nNOS细胞可以与GAD67共标,但也有部分nNOS细胞是GAD67阴性的。由于MGE细胞大部分是GABA能中间神经元,且在体能分化形成各种亚型,鉴于体外培养,因此我们也进行了其它亚型的鉴定,发现体外培养的MGE细胞中确实有表达生长抑素(somatostatin,SST)、小清蛋白(parvalbumin,PV)、钙结合蛋白(Calbindin,CB)、鈣网膜蛋白(Calretinin,CR)等其它亚型的中间神经元。体外培养的nNOS细胞形态多样,大小不一,且同一玻片上免疫组化的荧光强度也有所差别。
  由于体外培养的nNOS细胞阳性率较低,因此我们尝试了多种方法来提高其中nNOS的比例。结果表明选取MGE不同部位以及神经营养因子(NGF)的诱导并不能提高nNOS细胞的阳性率。而在不同胚胎期(E11.5-E14)分离MGE,胚胎以及MGE的大小和形态有很大的差别。其中nNOS比例确有差异,E12.5天阳性率最高,其次是E13天。结果表明MGE来源的nNOS经过体外培养,其细胞形态以及性质与体内培养差异不大,且E12.5天获取的MGE细胞nNOS比例最高。
  第三部分为了进一步探索MGE来源的nNOS在小鼠背景关联型近期恐惧记忆获得中所扮演的角色,我们首先将体外培养3天成神经球的GFP鼠的MGE细胞浓缩,并通过玻璃导管注射到野生型鼠海马DG区,移植2个月后与注射GFP鼠的MGE死细胞相比较,发现野生型鼠中移植MGE细胞并没有恐惧记忆获得值的改变。接下来,我们又将GFP鼠MGE神经球移植到nNOS-/-鼠海马DG区,与注射死细胞相比,发现nNOS-/-鼠移植GFP+MGE细胞后,其背景关联型近期恐惧记忆获得显著提高,且nNOS-/-鼠不论雌雄。以上结果表明,野生型鼠海马DG区移植MGE细胞,背景关联型近期恐惧记忆造模后,其恐惧获得的学习能力无改善,而nNOS-/-鼠海马DG区移植MGE细胞,造模后,不论雌雄,其获得恐惧记忆的学习能力提高。
  为了进一步探究MGE细胞对nNOS-/-鼠行为学的改善作用是否由MGE来源的nNOS细胞主导。我们取B6或nNOS-/-鼠的MGE细胞,体外培养3天成球后浓缩液转染GFP病毒1.5小时,然后悬瓶培养4-6天后,将神经球移植到nNOS-/-鼠海马DG区。2个月后,发现移植B6和nNOS-/-鼠的MGE对比,nNOS-/-鼠恐惧记忆获得值没有改变,且与宿主的性别无关。为了确证,我们又选取了雌性nNOS-/-鼠进行分析,结果表明nNOS-/-鼠移植B6鼠的MGE与移植死细胞相比,获得值增加,nNOS-/-鼠移植nNOS-/-鼠的MGE与移植死细胞相比,获得值也增加,但nNOS-/-鼠移植B6或nNOS-/-鼠的MGE细胞之间无差异。以上结果表明nNOS-/-鼠移植MGE后恐惧记忆学习能力的提高源于MGE细胞中非nNOS的其它GABA能中间神经元。
  结论:(1) MGE是nNOS细胞主要的胚胎来源,并通过对比改进了MGE获取的方法,便于之后的研究(2) MGE来源的nNOS经过体外培养,其细胞形态以及性质与体内细胞差异不大,且E12.5天获取的MGE细胞nNOS比例最高。(3)野生型鼠海马DG区移植MGE细胞,背景关联型近期恐惧记忆造模后,其恐惧获得的学习能力无改善,而nNOS-/-鼠海马DG区移植MGE细胞,造模后,不论雌雄,其获得恐惧记忆的学习能力提高。nNOS-/-鼠移植MGE后恐惧记忆学习能力的提高源于MGE细胞中非nNOS的其它GABA能中间神经元。
[硕士论文] 李珊
控制理论与控制工程 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:脑网络是自然界最复杂的网络之一。大脑中数以亿计的神经元构成了庞大而复杂的脑结构网络,结构网络上不同神经元、神经元集群或脑区之间动态活动的同步化在时空尺度上的连接形成了脑功能网络。从网络的角度解析大脑神经信息处理机制是目前神经科学和控制科学等交叉学科研究的前沿热点之一。目前脑功能网络的研究主要是通过脑电图、脑磁图和磁共振成像等大尺度的信息采集技术解析不同脑区之间的功能连接关系,基于微电极阵列信息采集技术,以神经元为基本单元,空间精度更高,对于脑机制研究具有重要价值,但研究相对较少,许多问题尚待阐明。针对神经元锋电位( spike)发放序列,本文研究了神经元功能网络的构建方法,分析了其拓扑特性,并利用神经元功能网络解码了鸽子运动转向行为,验证了神经元功能网络在大脑神经信息处理机制解析中的有效性。主要研究内容和取得的成果如下:
  1)利用归一化互信息算法度量了spike序列之间的功能连接关系,构建了神经元功能网络,并结合Izhikevich神经元发放模型,验证了网络构建算法的性能。结果表明,基于互信息算法构建的神经元功能网络与真实网络之间的连接关系具有较高一致性,其性能优于传统的相关系数算法。
  2)分析了随机网络、规则网络和小世界网络等三种典型网络在不同节点连接概率、节点度和节点数量时的拓扑连接特性,并在此基础上分别研究了神经元spike发放率及神经元个数对网络拓扑特性的影响。结果表明,在一定范围内,随着spike发放率的增加,网络拓扑特性整体趋势呈抛物线形状;随着神经元数量的增加,网络拓扑特性整体呈现下降趋势。
  3)利用神经元功能网络特征,采用支持向量机神经解码算法,解码了十字迷宫目标导向任务中鸽子运动转向行为,并与基于spike发放率特征的解码算法进行了对比。结果表明,神经元功能网络具有较好的解码性能,无论是全局效率还是聚类系数特征,其解码正确率都优于神经元集群spike发放率特征的解码正确率。
[博士论文] 张丽
神经生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:颗粒细胞是嗅球中最为常见的一种中间神经元,它富含树突并且树突上密布点状的树突棘。在神经系统的发育过程中,嗅球颗粒细胞的树突棘经历着形态的重构。然而,关于嗅觉经验对活体状态下颗粒细胞树突棘形态可塑性和钙信号的动态变化的调节作用,目前仍然知之甚少。首先,我们用单细胞电转技术标记上非洲爪蛙幼虫蝌蚪嗅球中的单个颗粒细胞,活体观察到颗粒细胞的四种树突棘(filopodia,thin,stubby,mushroom)结构,并具有突触小结的结构;然后,利用激光共聚焦显微镜对颗粒细胞树突棘的形态变化进行在位活体时间序列成像。借助于长时程(以周为间隔)活体成像,我们对颗粒细胞总树突棘的密度、四种树突棘的动态变化和稳定性进行了详细的数据统计和分析,结果发现嗅质丰富环境可以促进总树突棘密度的增加和mushroom稳定性的提高。借助于短时程(以小时为间隔)活体成像,我们对不同树突棘之间的形态转变进行了分析。形态学结果发现小树突棘(filopodia与thin)之间的形态转变更容易受到嗅质刺激或者嗅觉剥夺的影响。最后,我们利用钙成像实验证实了嗅觉感觉操作可以调节嗅球颗粒细胞的活动性。以上结果证明,不同的嗅觉经验可以调节嗅球颗粒细胞不同类型树突棘的形态可塑性。
[硕士论文] 张文雅
儿科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目的
  原代培养胎鼠海马神经元,并转染包装了沉默衔接蛋白复合物-4μ亚基(adaptor-related protein complex4, mu1 subunit;AP4M1)基因的慢病毒后,观察细胞 AP4M1、GluR1及 GluR2(AMPA受体)的表达变化,以探究 AP4M1可能介导的AMPA受体运输变化的分子机制。
  材料及方法
  本课题将原代培养海马神经作为实验对象,应用免疫荧光来标记神经元特异性烯醇化酶(neuron-specifice nolase,NSE),来鉴定所培养细胞中神经元的纯度。细胞培养中进行慢病毒(沉默 AP4M1基因)转染,并进行荧光检测,以鉴定转染效率,实验分组:阴性慢病毒转染组及阳性慢病毒转染组(AP4M1基因表达沉默)。
  分别应用 Real-time PCR和 Western blotting方法研究 AP4M1、GluR1及GluR2的mRNA及蛋白水平的表达变化。
  结果
  1、海马神经元的培养、鉴定及转染
  原代培养的 SD大鼠胎鼠的海马神经细胞生长良好,在种植后第7天神经元基本发育成熟,神经元免疫荧光染色检测结果显示所培养细胞中的神经元纯度大于95%。在培养第2天可行慢病毒的转染,在转染8-12小时后换液,并于72小时后重复转染1次,再转染8-12h,72小时后进行荧光检测,转染率大于85%。
  2、海马神经元转染慢病毒后AP4M1、GluR1及GluR2的表达变化
  1)Real-time PCR检测:阳性病毒组 AP4M1 mRNA表达量较阴性病毒组显著下调(t=68.193,P<0.01,n=8);转染后 GluR1、GluR2 mRNA表达量较阴性病毒组也明显下降(t=8.060,P<0.01,n=8);(t=8.154,P<0.01,n=8)。
  2)Western blot检测:转染阳性病毒后AP4M1、GluR1及GluR2蛋白表达量较阴性病毒组显著下调(F=7.566,t′=15.966,P<0.01,n=8),(F=0.408, t′=8.690,P<0.01,n=8)(F=5.560,t′=13.770,P<0.01,n=8)。
  结论
  海马神经元在转染了包埋沉默 AP4M1基因的慢病毒后, AP4M1的mRNA和蛋白表达明显下调,说明转染有效,进而海马神经元的 GluR1、2的mRNA和蛋白表达也明显下调;
  AP4M1可能直接或间接调控海马神经元中的GluR1、2的转运。
[博士论文] 刘新玉
控制科学与工程 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:空间位置感知和运动导航是大脑的基本功能,对于动物的生存至关重要。自然界中生物大部分空间导航行为都是目标导向的,比如觅食、归巢、求偶、迁徙等等。目标导向行为神经机制的研究已成为神经科学和控制科学等交叉学科的前沿研究热点。近年来,一系列神经电生理实验发现大脑海马(Hp)区在目标导向行为中起到了关键作用,Hp区的位置细胞被认为是空间导航信息表达的基本单元,编码了动物的位置信息。不同位置细胞的特定放电序列从一定程度上反映了动物的行进路线。但是目标导向行为中位置细胞之间如何进行功能互连,协同实现目标、路由等关键导航信息的编码,目前尚不清楚。因此,深入研究位置细胞之间功能连接关系,阐明位置细胞网络对目标导向行为相关信息的编码机制,是解析生物空间导航神经机制的关键。同时,该研究对于仿生导航和机器人领域也具有重要参考价值。
  针对位置细胞功能网络如何编码目标导向行为这一问题,本文以具有卓越空间认知和导航能力的鸽子为模式动物,首先采用微电极阵列神经电活动记录技术在体记录了Hp区神经信号,对比有、无目标环境中位置细胞空间响应特性和稳定性,构造了位置细胞空间认知地图;其次,利用复杂网络理论与方法,构建了位置细胞功能网络,分析了位置细胞在目标导向空间认知任务中的拓扑关系;在此基础上,研究了目标导向抉择任务中位置细胞功能网络对目标信息和路由信息的编码机制,分析了位置细胞功能网络对路由信息的预测性能;最后,建立了位置细胞功能网络状态空间编码模型,并结合运动轨迹神经信息编码和解码实验验证了模型有效性。本文已完成的工作和取得的创新性研究成果概括如下:
  1)研制了鸽子脑立体定位装置和微电极植入深度动态可调装置,解决了微电极阵列的精准定位问题,为在体神经信号可靠检测和长期稳定记录提供了保障。针对鸟类头部独特解剖学结构,采用四点定位方法,独创了一种专用于鸽子的脑立体定位装置,实现了微电极阵列植入的精确定位;针对微电极阵列慢性植入方式,采用模块化设计,制作了一种微电极植入深度动态可调装置,提高了电极植入的成功率,延长了神经信号有效采集时间。
  2)鸽子空间认知实验结果分析,发现在有目标导向的空间认知任务中位置细胞更易形成稳定的位置野。从锋电位特性、空间特性和稳定性三个方面对比分析了有、无目标环境中位置细胞位置野特性,发现确定性目标能可靠诱发出稳定的位置野;鸽子与哺乳动物不同,位置细胞一般具有多位置野特性。这表明位置野的激活强烈依赖于目标导向信息的调制。
  3)利用锋电位发放率与局部场电位节律特征分别构建了位置细胞功能网络,通过分析网络拓扑特性发现:在目标导向空间认知任务中,不同位置细胞的位置野呈现出高度集聚特点,即位置野集聚区网络的聚类系数和全局效率显著高于非位置野集聚区,但其小世界特性却显著低于非位置野集聚区。这表明在鸽子主动的目标导向行为中,位置细胞间的连接会变得更加紧密,有助于增强目标导向的稳定性。
  4)通过对上述位置细胞功能网络的性能分析,发现在目标导向抉择任务中Hp区和NCL区神经元对目标信息和路由信息编码分别起到了关键作用:Hp区位置细胞功能网络主要编码了当前位置和目标位置信息,对路由信息并不敏感;NCL区神经元功能网络则侧重于对路由信息的编码。这一结论初步揭示了 Hp区和NCL区在鸟类目标导向行为中作用及其分工。
  5)依据位置细胞之间的功能连接关系,结合一阶随机游走模型和二次指数泊松方程,构建了位置细胞功能网络状态空间编码模型。运用该模型开展了运动轨迹的神经信息编码和解码实验,模型预测结果均与实测结果一致,验证了模型的有效性。在神经信息解码实验中将粒子滤波算法引入到了运动轨迹预测中,提高了轨迹预测的准确性。
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