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[博士论文] 魏淑芳
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:细菌性角膜炎是由细菌感染导致的角膜炎症,可引起角膜上皮缺损和基质坏死,是一种严重危害视力的眼部疾病。其中尤以金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌感染最常见、最严重。其治疗目前主要依靠局部滴用抗生素滴眼液,但是因受到多种外界因素以及滥用抗生素的影响,部分细菌发生变异而产生一定的耐药性,导致治疗效果不佳,Chang VS回顾分析了20年里葡萄球菌感染的角膜炎,发现耐药率达30.7%。对于迁延不愈的角膜溃疡,有人尝试结膜瓣或羊膜覆盖,但这会降低滴眼液的渗透性,必须在感染控制后才能做此手术。感染严重致角膜溶解时,只能行角膜移植手术治疗,但是角膜材料有限,且术后常会出现排斥反应或炎症复发,以至于相当一部分患者最终不得不进行眼球摘除术来根治。
  角膜交联术(CXL)是通过合适的光源照射激发核黄素产生活性氧族,诱导角膜胶原纤维的氨基之间发生光化学交联反应,从而增加了胶原纤维的机械强度和抵抗角膜扩张的能力,已广泛应用于角膜扩张病变,疗效肯定。2000年,Scnitzler E首次报道了CXL用于治疗角膜溃疡有效,之后大量的临床报道证实CXL是一种新的、有效的治疗感染性角膜炎的方法。相对于大多数抗生素只能从杀灭病原体一方面治疗角膜炎,CXL可以从消除病原体、增加角膜的抗酶活性以及减轻相关炎症反应三方面来治疗角膜溃疡,给角膜溃疡的治疗带来了新的曙光。波长270nm左右的紫外光B、370nm左右的紫外光A、445nm左右的蓝光同为核黄索的吸收峰,均可以激发核黄素产生交联反应。光线的穿透能力与其波长呈正比,波长越长,穿透力越强,370nm紫外光A仅能穿透300um的角膜,440nm蓝光介导的交联深度应该较370nm紫外光更深,而细菌性角膜炎时角膜均会水肿变厚,溃疡深度往往会超过300um,据此,设想440nm蓝光介导的交联治疗严重角膜溃疡的效果应该优于370nm紫外光A。1998年,Spoerl E等人报道了465nm蓝光联合核黄素诱导的CXL可以起到加固离体猪角膜的作用,2008年Iseli报道蓝光CXL可以增加巩膜胶原纤维的机械强度。但440nm蓝光联合核黄素诱导角膜交联治疗角膜溃疡尚未见报道。本文第一部分应用440nm蓝光联合核黄素对金黄色葡萄球菌感染的兔角膜溃疡进行了交联治疗,旨在观察验证其对细菌性角膜溃疡的治疗效果,并与370nm紫外光A进行比较,观察其疗效是否优于后者。第二部分初步观察了440nm蓝光核黄素交联治疗金葡菌角膜溃疡,是否对角膜内皮、视网膜、脉络膜等眼部组织有损害。
  第一部分 440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜炎的疗效研究
  目的:
  通过动物实验观察440nm蓝光核黄素角膜交联治疗金黄色葡萄球菌角膜溃疡的疗效,与空白对照组对比,观察其治疗是否有效;与370nm紫外光A联合核黄素角膜交联治疗组对比,观察其治疗效果是否优于后者。
  方法:
  1.实验设计:选取60只健康新西兰大白兔,右眼为实验眼,全麻后中央角膜浅基质层内注入0.1ml浓度为5×107cfu/ml金黄色葡萄球菌菌液,制作金黄色葡萄球菌感染的较严重的角膜溃疡模型,将造模成功的54只纳入研究,随机分为三组,每组18只。其中18眼行440nm波长蓝光核黄素角膜交联,18眼行370nm紫外光A核黄素角膜交联,另外18眼作为空白对照组,仅在另外两组行交联治疗的同时,给予一次刮除溃疡表面疏松坏死组织治疗。于交联后第1天、3天、7天、14天分别观察比较各组疗效。
  2.角膜交联方法:10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉,角膜测厚,确保最薄点大于400um。去除角膜中央直径9mm疏松溃疡组织及残存上皮,1g·L-1核黄素溶液滴角膜每4-5min1次,共30min。440nm蓝光和370nm紫外光A照射能量均为3mw·cm-2,照射直径均为9mm,工作距离50mm,照射角膜时间均为30分钟。
  3.观察指标:交联后1天、3天、7天、14天,观察眼部分泌物、结膜充血、前房积脓及角膜浸润情况,给予炎症评分并行统计学分析;分别给予角膜照相并利用Image J软件对溃疡面积进行比较分析;同时蘸取所有实验眼溃疡表面坏死组织或分泌物进行细菌培养。交联后1天、7天、14天共焦显微镜观察炎症细胞变化,各组分别摘取两实验眼角膜,制作切片,HE染色,光学显微镜下观察其病理组织学改变。
  结果:
  1.三组实验眼眼部炎症评分比较:CXL治疗前,三组实验眼眼部炎症评分无统计学差异(P=0.814,P>0.05)。CXL治疗后第1天、3天、7天、14天,三组眼部炎症评分的差异均有统计学意义(P=0.000、0.000、0.000、0.000,P<0.05),440组与对照组比较,差异均有统计学意义(P=0.001、0.000、0.000、0.000,P<0.05),370组与对照组比较,差异均有统计学意义(P=0.000、0.000、0.000、0.000,P<0.05),440组和370组比较均无统计学差异(P=0.557、0.567、0.488、0.537,P>0.05)。至观察结束,对照组所有实验眼均角膜穿孔。
  2.每组眼部炎症评分变化:440组五个时间点评分有统计学差异(P=0.000,P<0.05),呈下降趋势。370组四个时间点评分有统计学差异(P=0.002,P<0.05),也呈下降趋势。对照组四个时间点眼部炎症评分有统计学差异(P=0.000,P<0.05),呈上升趋势。
  3.三组实验眼角膜溃疡面积比较:角膜交联治疗前及治疗后第1天、第3天,三组角膜溃疡面积均无统计学差异(P>0.05,P=0.881、0.845、0.066);治疗后第7天、第14天,对照组角膜溃疡面积显著大于440组和370组(P<0.05,q=5.895、5.571),而440组和370组角膜溃疡面积无统计学差异(P>0.05,q=0.323、0.582)。
  4.三组实验眼细菌培养结果:CXL前三组兔眼细菌培养均为阳性。CXL后第1天、3天、7天、14天,440组和370组细菌培养均转为阴性,而对照组均为阳性。
  5.三组实验眼病理结果:CXL后第1天,病理切片三组均可见角膜上皮缺失,大量炎性细胞聚集达深基质;第7天,对照组形成角膜全层脓肿,但后弹力膜尚完整,370组和440组可见角膜上皮多层愈合,溃疡组织内见新生血管、大量炎细胞及少量纤维母细胞增生;第14天,对照组溃疡加重,形成全角膜脓肿,后弹力膜仅部分可见,几近穿孔,370组和440组角膜上皮多层愈合,基质内新生血管、瘢痕组织及纤维母细胞增生,炎性细胞较前减少。
  6.三组实验眼共焦显微镜结果:CXL后第1天,三组实验眼溃疡处基质层内均见大量炎性细胞,CXL后第7天,440组和370组实验眼基质层内仍见大量炎性细胞,但少于对照组实验眼。CXL后第14天,440组和370组实验眼基质层内炎性细胞较前减少,对照组仍见大量炎性细胞。
  结论:
  1.440nm蓝光核黄素角膜交联能有效控制金黄色葡萄球菌感染的角膜溃疡。
  2.440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡疗效与370nm紫外光A比较无显著差异。
  3.440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡的安全性、远期疗效有待进一步研究。
  4.440nm蓝光核黄素角膜交联有望成为难治性角膜溃疡的治疗方法。
  第二部分 440nm蓝光联合核黄素角膜交联治疗兔细菌性角膜炎的安全性研究
  目的:
  观察440nm蓝光核黄素角膜交联治疗兔细菌性角膜炎,对角膜内皮、视网膜、脉络膜、巩膜及视神经的影响,初步探讨其治疗细菌性角膜炎的毒副作用。
  方法:
  选取8只健康新西兰大白兔,浅基质法制作金黄色葡萄球菌角膜溃疡模型,每眼注射菌液0.08ml,余步骤同第一部分。24小时后造模成功,全麻下进行440nm蓝光核黄素角膜交联,步骤同第一部分。于交联治疗后第1天、第7天分别气栓处死4只兔子,摘取实验眼眼球,其中各两只放入4%多聚甲醛溶液中固定做病理切片,另四只眼球分别立即取下整个角膜,用锥兰一茜素红联合染色法对角膜内皮进行染色观察。
  结果:
  角膜交联后第1天,角膜内皮染色未见异常,视网膜、脉络膜、巩膜及视神经病理组织切片未见异常。角膜交联后第7天,角膜内皮染色未见异常,视网膜、脉络膜、巩膜及视神经病理组织切片未见异常。
  结论:
  440nm蓝光联合核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡安全性较好,未发现对角膜内皮、视网膜、脉络膜、巩膜、视神经造成组织学危害。
[博士论文] 田明霞
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  圆锥角膜是最常见的角膜扩张性疾病,常发生于青少年,表现为进行性的角膜前突并变薄,视力下降,散光增大,最终导致角膜瘢痕以及视力丧失。现在有很多研究证实核黄素/紫外线角膜胶原交联(Corneal collagen crosslinking,CXL)可以阻止圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆的发展。CXL是目前唯一可以从根本上改变圆锥角膜的生物力学和基质结构的不稳定性的方法。核黄素吸收365nm的紫外线后可以作为一种光敏剂,并产生氧自由基或单线态氧激活自然的赖氨酰氧化酶通路,从而使角膜胶原发生物理性交联。角膜胶原交联产生的光氧化反应使角膜内的胶原纤维共价结合,增加角膜的生物力学强度,并且增加角膜基质对酶降解作用的抵抗力,减少角膜胶原降解,从而阻止圆锥角膜的进展。由于圆锥角膜根据不同的标准可以分为不同的类型,假设圆锥角膜的类型不同可能对CXL治疗的效果产生影响。本研究对CXL治疗不同类型圆锥角膜的效果进行对比研究,并分析影响CXL治疗效果的因素。
  方法:
  研究对象2012年7月至2014年6月进行CXL治疗的进行性圆锥角膜患者60例(88眼)纳入本研究,纳入标准为在过去的1年中至少满足以下条件之一者:(1)角膜地形图最大曲率值增加1D及以上,(2)验光散光增加1D及以上,或等效球镜度增加0.5D及以上,(3)随访时间2年及以上,(4)排除其他急、慢性眼病史,角膜移植手术史,角膜厚度小于350μm,或者随访观察期间怀孕、哺乳者。根据圆锥角膜的分类方法共分为2个亚组:(1)中央型圆锥角膜组(以下简称中央组)和周边型圆锥角膜组(以下简称周边组),(2)原发性圆锥角膜组(以下简称原发组)和准分子激光术后角膜膨隆组(以下简称膨隆组)。
  核黄素/紫外线角膜胶原交联使用去角膜上皮的标准CXL方法。
  观察指标分别对各组患者CXL术前和术后2年的裸眼视力(Uncorrected distant visual acuity,UDVA)、最佳矫正视力(Best-corrected distant visual acuity,BDVA)、裂隙灯检查、验光、眼压、pentacam角膜地形图中角膜最大曲率(Maximum keratometry,Kmax)、平均角膜曲率(mean keratometry,Km)、角膜散光等的变化情况进行对比分析。
  统计分析所有数据采用IBM SPSS19.0统计软件进行统计学分析。两组样本之间采用独立样本t检验进行分析;性别比例采用卡方分析进行比较;同组术前术后的变化采用配对样本t检验进行分析;相关性分析采用偏相关分析方法,计算偏相关系数r。对取得显著性相关的变量进一步进行回归分析,获得与CXL术后效果独立相关的因素。所有结果均以P<0.05为具有统计学意义。
  结果:
  1.术前情况
  60例88眼圆锥角膜患者,术前平均年龄为22.1±5.1岁,男女比例为39∶21,平均发病时间为23.4±22.4个月,Kmax距角膜中心的平均距离为2.7±1.5mm,平均角膜厚度为439.7±61.0μm。
  中央组共44例64眼,周边组共16例24眼;术前两组年龄、性别、发病时间及角膜厚度相比均无明显统计学差异(P>0.05),而Kmax距角膜中心的距离却有明显差异(P<0.01)。
  原发组共45例67眼,膨隆组共15例21眼;术前两组年龄、性别、发病时间及角膜厚度相比均无明显统计学差异(P>0.05),而Kmax距角膜中心的距离亦有明显差异(P<0.01)。
  在44例中央型圆锥角膜组中,含5例角膜膨隆患者,占11.4%;在16例周边型圆锥角膜组中,含6例原发性圆锥角膜患者,占37.5%。
  2.CXL术后2年总体情况
  术前UDVA,BDVA分别是0.9±0.5和0.4±0.4logMAR,CXL术后2年提高至0.7±0.4和0.3±0.3logMAR,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  术前Kmax和角膜散光分别是61.5±14.7D和4.0±2.9D,CXL术后2年,Kmax和散光分别降低至57.0±10.4D和3.3±2.2D,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  3.CXL术后2年中央组与周边组疗效比较
  3.1两组UDVA与BDVA的比较
  中央组术前U DVA,BDVA分别是0.9±0.4和0.5±0.4logMAR,术后2年提高至0.8±0.4和0.4±0.3logMAR,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  周边组术前UDVA,BDVA分别是0.8±0.7和0.2±0.4logMAR,术后2年U DVA提高至0.4±0.4logMAR,与术前相比,差异具有统计学意义(P<0.01);BDVA提高至0.2±0.3logMAR,与术前相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
  中央组与周边组UDVA的变化值(术后-术前)分别是-0.1±0.2和-0.4±0.5logMAR,两者相比具有统计学差异(P<0.01)。而两组BDVA的变化值分别是-0.1±0.3和-0.04±0.2logMAR,两者相比无统计学差异(P=0.25)。
  3.2两组Kmax与角膜散光的比较
  中央组术前Kmax和散光分别是65.6±15.0D和4.6±3.0D,术后2年,Kmax和散光分别降低至60.1±10.3D和3.3±2.2D,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  周边组术前Kmax和散光分别是50.3±5.3D和2.4±1.7D,术后2年,Kmax下降至48.8±4.6D,与术前相比差异具有统计学意义(P<0.01),而散光值为2.2±1.8D,与术前相比差异无统计学意义(P>0.05)。
  中央组与周边组Kmax的变化值(术后-术前)分别是-5.6±8.3D和-1.6±2.1D,两者相比具有统计学差异(P=0.01);同样,散光的变化值分别是-1.3±2.2D和-0.3±0.8D,两者相比具有统计学差异(P=0.04)。
  4.CXL术后2年圆锥组与膨隆组疗效比较
  4.1两组UDVA与BDVA的比较
  圆锥组术前UDVA,BDVA分别是0.8±0.5和0.4±0.4logMAR,术后2年,UDVA,BDVA分别提高至0.7±0.4和0.3±0.3logMAR,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  膨隆组术前UDVA,BDVA分别是0.9±0.6和0.3±0.4logMAR,术后2年,UDVA,BDVA分别提高至0.6±0.4logMAR(P<0.01)和0.2±0.3logMAR(P>0.05)。
  圆锥组和膨隆组的UD VA的变化值(术后-术前)分别是-0.1±0.2和-0.2±0.3logMAR,BDVA的变化值分别是-0.1±0.2和-0.03±0.2logMAR,两组之间UDVA,BDVA的变化值相比均无明显统计学差异(P>0.05)。
  4.2两组Kmax与角膜散光的比较
  圆锥组术前Kmax,角膜散光分别是63.3±15.6D和4.5±3.0D,术后2年,Kmax,角膜散光分别降低至58.3±10.4D和3.3±2.2D,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  5.相关性分析
  5.1患者年龄,发病时间与UDVA,BDVA,Kmax,角膜散光的变化值均无相关关系(P>0.05)。
  5.2术前角膜地形图中Kmax距角膜中心的距离与UDVA的变化值(术后-术前)呈负相关(r=-0.295,P<0.01),与Kmax和角膜散光的变化值呈正相关(r=0.239,0.265,P<0.05)。
  5.4术前角膜厚度与Kmax的变化值呈正相关(r=0.266,P=0.012)。
  6.回归分析
  6.1CXL术后2年U DVA的变化值(ΔUDVA)与Kmax距角膜中心的距离的回归方程式为:ΔUDVA=-0.024-0.066×Kmax距角膜中心的距离。
  6.2CXL术后2年Kmax的变化(ΔKmax)与角膜厚度的回归方程式为:ΔKmax=-18.606+0.032×角膜厚度。
  6.3CXL术后2年角膜散光的变化值(Δ角膜散光)与Kmax距角膜中心的距离的回归方程式为:Δ角膜散光=-1.957+0.34×Kmax距角膜中心的距离。
  结论:
  1.CXL治疗2年后圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆可以得到明显控制;
  2.CXL对中央型圆锥角膜的控制效果优于周边型圆锥角膜;
  3.CXL对原发性圆锥角膜的控制效果优于准分子激光术后的角膜膨隆;更长期的效果还需进一步的观察和研究。
  4.CXL治疗2年后圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆视力的提高与角膜曲率的降低与术前Kmax距角膜中心的距离、圆锥角膜的病变程度以及角膜厚度有关。
  5.回归分析表明,CXL术后圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆的视力提高及角膜散光的降低与Kmax距角膜中心的距离相关,而Kmax的降低与角膜厚度相关。
[硕士论文] 赵玉婷
力学 太原理工大学 2017(学位年度)
摘要:角膜为生物软组织材料,在眼的屈光系统中占有重要的地位,其生物力学性能是维持角膜形态的基础,角膜的生物力学性能一旦发生变化,将会影响到眼球整体的屈光能力。同时,角膜的生物力学性能对角膜疾病如圆锥角膜、角膜外伤等的诊断与治疗及对屈光手术的设计、角膜接触镜的设计等都具有重要的参考价值。由于角膜的生物力学性能对角膜的特殊意义,研究人员需更加准确地测量角膜的生物力学性质及建立精准的角膜仿真计算模型。
  本文以猪角膜为研究对象,通过膨胀试验及有限元模拟的方法研究猪角膜的生物力学性能。
  1、主要研究工作如下:
  (1)搭建离体角膜膨胀试验系统,完善猪眼球整体膨胀试验方法,消除试验过程中巩膜位移对角膜位移的影响。采用眼球整体膨胀试验和角膜膨胀试验对猪角膜的力学性质进行离体测量,获得每种试验中角膜顶点位移—眼内压之间的关系。采用板壳理论,根据角膜顶点位移—眼内压之间的关系分别计算出两组试验中角膜的弹性模量及角膜的应变,并得到角膜的应力-应变曲线,将两组试验中得到的角膜弹性阶段的力学性质进行对比分析。
  (2)基于角膜微观结构,建立了考虑角膜胶原纤维分布的猪眼球整体膨胀试验的有限元计算模型。通过扫描电镜对猪角膜的板层结构进行观察并对角膜中的主要元素进行分析,通过透射电子显微镜观测不同眼内压作用下胶原纤维的形态。选用ABAQUS软件中与其结构相适用的 Holzapfel本构模型,对已有的 Holzapfel本构模型参数进行了合理调整,模拟了整体眼球试验中测得的角膜顶点位移-眼内压关系。得到眼内压在15.28-30.17mmHg时,与本文猪眼球整体膨胀试验更为匹配的 Holzapfel本构模型参数。以此为基础建立有限元模型,分析了猪角膜受到不同眼内压作用时所表现出来的力学性能,并讨论了 Holzapfel本构模型中三个主要参数其对角膜力学性能的影响。
  2、主要结论如下:
  (1)通过两组膨胀实验得出:在15.28-30.17mmHg时,猪眼球整体膨胀试验获得的弹性模量比角膜膨胀试验获得的数值小;猪眼球整体膨胀试验获得的应变比角膜膨胀试验获得的数值大;
  (2)通过扫描电子显微镜观测到角膜平行与角膜表面的板层之间为平行排列;通过透射电子扫描电镜观测:在0mmHg时,纤维呈弯曲形态;在30mmHg时,纤维被拉伸且局部有断裂。
  (3)在15.28-30.17mmHg时,模拟角膜受到不同眼内压时角膜的应力及位移状态。眼内压越高,角膜的应力及位移越大,但对应力及位移的分布影响较小。
  (4)计算 Holzapfel本构模型中三个主要参数其对角膜力学性能的影响,重点分析了沿纤维主方向,纤维的分散程度不同时对角膜的应力分布及位移的影响。胶原纤维沿角膜主方向的分散程度,影响角膜中应力的分布方向,但并不影响角膜位移分布的方向。当角膜眼内压相同时,纤维分散程度越大,角膜的应力分布越均匀,角膜顶点位移越小。
  以上通过猪整体眼球膨胀试验方法得到了角膜弹性阶段的力学性能、对角膜结构和主要化学元素的观测以及建立考虑角膜微观结构的有限元模型,为临床上角膜疾病的治疗及手术提供理论依据和技术指导。
[硕士论文] 欧阳慧玲
动物学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:角膜病是当前致盲的主要眼病之一,在我国是继白内障疾病之后的第二大致盲眼病,约占15.4%。目前绝大多数严重威胁人类健康的疾病如糖尿病、高血压、冠状动脉疾病和精神分裂症,还包括儿童先天性缺陷如唇裂、鄂裂及许多先天性心脏病也都受到多基因的调控。本实验室采用ENU化学诱变的方法获得一种角膜混浊表型的小鼠模型,将其主基因鉴定为RAX并将该小鼠命名为RAX突变小鼠。本文是对RAX突变小鼠角膜特点及其修饰基因进行研究,主要分为以下三个方面:
  1、RAX无义突变小鼠角膜特点的研究
  本文以RAX无义突变小鼠为研究对象,将该小鼠与正常B6小鼠繁殖,筛选具有角膜混浊表型的杂合子小鼠。对角膜混浊小鼠眼球进行组织学分析发现,突变小鼠角膜基质层及角膜层明显变薄,且角膜表层细胞呈水泡样。再采用免疫组织化学的方法对该8W以上小鼠进行蛋白分子分析,结果显示突变小鼠角膜蛋白Cytokeratin12(K12)、Cytokeratin14(K14)、Cytokeratin13(K13)及PAX6均发生了变化。
  2、角膜混浊修饰基因的定位
  采用将B6背景角膜混浊杂合子小鼠与D2小鼠配种获得F1代小鼠,F1代小鼠继续回交B6获得[(B6×D2) B6]N2代的方案获得角膜混浊杂合子。筛选突变杂合子N2代小鼠1782只,其中180只小鼠表现有角膜混浊表型,通过基因连锁分析结果修饰基因与微卫星D1Mit145连锁(LOD值5.97),初步将该基因定位于小鼠第1号染色体上。为对该修饰基因进行精确定位,在1号染色体上增加微卫星密度,最终将该修饰基因定位于1号染色体68.38cM-74.68cM之内。
  3、角膜混浊修饰基因的鉴定
  根据定位结果,通过MGI数据库查询该小鼠修饰基因定位区域附近相关基因,并对相关基因进行基因功能分析,最终初步将候选基因确定为:Pou2f1。继而对候选目的基因设计引物,分别PCR扩增候选目的基因,切胶回收后测序,将以上测序结果与本实验中心野生型B6小鼠、D2小鼠基因序列进行对比,筛查突变位点。Pou2f1启动子部分三段引物分别为Pou2f1717、Pou2f1736、Pou2f1703;Pou2f1编码区部分三段引物分别为Pou2f1910、Pou2f11029、Pou2f1556。双向测序结果显示突变小鼠Pou2f1在基因编码区未发现重叠峰而在启动子区域发现多个单核苷酸多态性。
[硕士论文] 高瑜鸿
电子与通信工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:2016年,Google AlphaGo击败了韩国围棋九段李世石,机器学习的成果给了人们巨大的冲击。机器学习在生活中的应用随处可见,小到我们平时听歌购物会有符合用户喜好的个性推荐,大到天气预报地震检测等对未知规律的预测,机器学习给传统行业带来了革新,医学领域也不例外。早期的机器学习在医学诊断的应用有肿瘤诊断、脑图像分析等。2016年11月,Google公司使用深度学习对糖尿病视网膜病变进行早期筛查,其表现远胜顶级专家。
  圆锥角膜是一种进行性的角膜疾病,通常起源于青春期,其早期表现为快速增长的高度近视和不规则散光,视力严重下降,但仍可通过RGP矫正视力。中后期角膜后弹力层破裂,房水侵入,产生瘢痕,视力造成永久性损伤,无法矫正,只能进行角膜移植。较早发现并诊断圆锥角膜可控制病情,避免角膜移植。此外,广受欢迎的治疗近视的准分子激光手术也需排查圆锥角膜。然而,目前圆锥角膜的早期诊断较为困难,一种好的圆锥角膜和亚临床圆锥角膜的检测方法需求迫切。
  本文将机器学习的分类方法应用于圆锥角膜的诊断,致力于解决圆锥角膜诊断困难的问题。首先提出了一种系统地采集样本特征数据和标签数据的方法,在此基础上,进行了二分类实验分析和三分类实验分析,提出了具有较高敏感度的圆锥角膜和亚临床圆锥角膜的检测方法,验证了各类特征对圆锥角膜和亚临床圆锥角膜检测的敏感度。最后给出了圆锥角膜的诊断方法在实际中的两种应用场景。本文的主要贡献在以下四个方面:
  (1)给出了一种系统地采集样本数据的方法,这包括表征疾病特性的样本特征数据和作为样本标签的医生对样本的诊断。样本标签由医生的电子诊断系统获取,样本特征数据由眼前节分析仪Oculyzer获取。数据量较大的波前像差数据,则通过与数字模板的匹配自动从图片中提取。
  (2)提出了将样本分为正常眼和圆锥角膜的二分类方法。使用SVM作为模型,敏感度和特异性作为模型性能度量指标,十次十折交叉验证检验模型稳定性,最优可以达到敏感度99.20%和特异性98.26%。模型选用了线性核函数和RBF核函数分别对各类特征极其组合特征对圆锥角膜检测的敏感度做了研究。总体来说,RBF核函数表现出比线性核函数更好的敏感度。各类特征对检测圆锥角膜的敏感度均为80%以上,说明了这些特征都对检测圆锥角膜做出贡献。其中,角膜高度、角膜厚度和波前像差及其组合特征表现出最优异的性能。
  (3)提出了将样本分为三类,即正常眼、亚临床圆锥角膜和圆锥角膜,从而检测出亚临床圆锥角膜和圆锥角膜的方法。在基本模型中,首先训练三个One-vs-All的SVM二分类器,使其学习到每一类区别于其他类的特征,然后将这三个二分类器的分类结果由新的决策器整合,得到最终的三分类结果。此外,改进模型使用Adaboost对三个二分类器进行增强,最终能够以较好的敏感度检测早期患者和典型患者。各类特征中像差特征与角膜高度特征在检测亚临床圆锥角膜时有较高的敏感度,两个特征组合之后效果进一步得到了提升。
  (4)给出了两种圆锥角膜的辅助诊断的应用前景。其一是应用于个性化疾病管理系统,帮助患者了解自身病情及选择适合自己的治疗方式。其二是青少年圆锥角膜的大范围筛查,在为青少年检测亚临床圆锥角膜的同时,对圆锥角膜的辅助诊断方法起到反馈的作用。
[硕士论文] 徐艳云
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  观察核黄素/紫外线A诱导的角膜交联术治疗K值高于65D的晚期进展性圆锥角膜的安全性和有效性。
  方法:
  回顾性非随机性研究。选取在我院行核黄素/紫外线A诱导的角膜交联术的圆锥角膜患者47人(54眼)。纳入标准:1.角膜最大K值大于65D;2.最薄角膜厚度大于340μm;3.无明显角膜瘢痕;4.无其他眼部及全身系统系疾病。
  无菌条件下行表面麻醉,微型角膜刀去除角膜中央50μm厚度上皮,直径为9mm,点0.1%核黄素溶液,每3分钟一次,共30分钟,OCT测量角膜厚度,若厚度小于400μm,予0.1%低渗核黄素溶液点眼,每10秒1次,共2分钟,至角膜厚度达到400μm,裂隙灯下观察到前房内核黄素闪辉后进行紫外线A照射。照射参数:紫外线A波长为370nm,能量密度为3mW/cm2,照射光源距角膜顶点5cm,照射时间30分钟。照射期间,每3分钟点一次0.1%核黄素溶液,照射结束后给予绷带性角膜接触镜,并给予左氧氟沙星滴眼液、普拉洛芬滴眼液,qid,共1周。角膜上皮完全愈合后摘除接触镜,并加用氟米龙滴眼液,qid,共4周。
  术后定期随访,共12个月,配戴硬性角膜接触镜者随访前2周摘除。记录术前及每次随访患者角膜最大K值、平坦K值、陡峭K值、裸眼视力、最佳矫正视力、最薄角膜厚度及角膜内皮细胞计数等参数。
  结果:
  1.角膜最大K值术前平均值为73.5±7.2D,术后6个月降至70.9±6.0D(P<0.01),术后12个月降至70.2±5.6D(P<0.01),差异均有统计学意义;
  2.术后1年的随访期间,平坦K值、陡峭K值、平均K值均呈下降趋势,Kmean、Ks差异均有统计学意义(P<0.05),Kf差异无统计学意义(P>0.05);
  3.裸眼视力术前平均为1.04±0.29(logMAR),术后6个月提高到0.99±0.29(P=0.053),术后12个月提高到0.96±0.29(P<0.01),术后12个月较术前差异有统计学意义;
  4.最佳矫正视力术前、术后6月及1年分别为0.72±0.26、0.59±0.27(P<0.01)、0.55±0.27(P<0.01),差异均有统计学意义;
  5.最薄角膜厚度术前为408±36um,术后6月、1年分别为392±37μm(P<0.01)、391±35μm(P<0.01),差异均有统计学意义;
  6.角膜内皮细胞计数治疗前后差异无统计学意义(P>0.05);
  7.有2只眼(3.7%)交联术后12个月角膜最大K值增加,视力下降。
  结论:
  核黄素/紫外线A诱导的角膜交联术可有效控制高K值晚期进展性圆锥角膜的进展,延缓甚至避免了行角膜移植术。52只眼角膜K值明显降低,视力改善,均获得良好疗效,所以晚期圆锥角膜不应纳入角膜交联术的排除标准。
[硕士论文] 胡馨月
影像医学与核医学 中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  后巩膜炎(posterior scleritis,PS)是一种罕见的发生于眼球赤道后部及视神经周围的巩膜炎症[1],严重时可累及邻近脉络膜、视网膜和视神经,导致视觉功能损害[2]。由于该病变位置较深,临床表现多样,是眼科易误诊的可治疗疾病之一[3],当被误诊为眼底肿瘤如脉络膜黑色素瘤时,常引起不必要的眼球摘除术[4],造成不可逆的严重后果。
  目前PS的诊断主要通过超声表现和临床病史[5],然而超声的诊断稳定性和软组织分辨率欠佳,且部分PS患者的超声表现常常未发现异常,因此PS尚缺乏有效的诊断方法[6]。
  长期、递减、足量的糖皮质激素全身或局部应用可使多数PS患者炎症迅速减轻和控制[7-8]。但仍小部分PS患者糖皮质激素疗效不佳。而盲目使用糖皮质激素,会诱发或加重感染,引起物质代谢和水盐代谢紊乱、骨质疏松和胃肠道出血等[9]。因此,准确预测糖皮质激素对PS的疗效对于临床制定正确的治疗方案非常重要。目前针对PS的病理生理机制、临床诊治均有研究报道,但尚无有效的预后评估手段。
  近年来,磁共振成像(MRI)越来越多地应用于PS的研究中[10-12]。其中高分辨率扩散加权成像(Readout segmentation of long variable echo-train diffusion-weighted imaging,RESOLVE-DWI)是一项能检测活体组织内水分子扩散运动的无创性方法[13],与常规扩散加权成像(diffusion-weighted imaging,DWI)相比,RESOLVE序列可提高DWI图像质量,降低运动伪影、畸变伪影及模糊效应,目前已广泛应用于人体多个部位及其疾病的研究,包括乳腺肿瘤、肝脏肿瘤和脑卒中等[14-15]。RESOLVE-DWI通过表观扩散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)值可以反映病灶组织的水分子扩散运动。同时常规MRI及增强扫描可以直观地显示正常或病变组织解剖结构上的变化[16-17]。
  多参数磁共振成像(multi-parametric MRI,Mp-MRI[18])作为一种扫描参数多、成像序列多、软组织分辨率高且安全无辐射的检查技术,已广泛运用于各类疾病的病理机制、诊断、治疗及预后研究中。国内外关于PS的Mp-MRI表现报道较少。基于此,本研究中Mp-MRI结合了常规MRI、增强MRI和RESOLVE-DWI,本文研究目的:①比较分析Mp-MRI和超声对PS的诊断价值;②评价Mp-MRI在预测糖皮质激素治疗对后巩膜炎的疗效中的价值。
  材料与方法:
  1.病例资料
  本研究第一部分:招募本院2014年9月至2017年1月期间眼底占位病变患者共56名(83眼),男性24例,女性32例,年龄18~85岁,平均(52.8±19.3)岁,病程3d~2年。56例患者共检测到病灶85个,均为单发。经PS金标准或病理证实,其中PS30例(40眼),脉络膜黑色素瘤13例(22眼),脉络膜血管瘤5例(8眼)和眼眶炎性假瘤8例(13眼)。
  本研究第二部分:本研究第一部分中的30例PS患者中未经糖皮质激素治疗且在本院眼科门诊初次就诊的PS患者28例(38眼),其中男12例,女16例,年龄18~83岁,平均(48.0±19.9)岁,病程5d~1年。
  2.设备与方法
  本研究第一部分:磁共振检查采用Siemens Tim Trio3.0T磁共振仪,超声检查采用法国IneScan S型眼用超声仪。所有患者均行Mp-MRI和超声检查。由3名从事5年以上的诊断工作放射科医生和超声医生分别观察分析眼底病变的MRI结果(包括形态、边界、边缘及内部强化表现)和超声表现。用IBM SPSS Statistics Version19.0统计学软件依据PS金标准分别计算Mp-MRI和超声诊断PS的敏感度、特异度、准确率、阳性似然比、阴性似然比;用MedCalc16.0统计学软件绘制受试者操作特性(receiver operating characteristic,ROC)曲线,计算ROC曲线下面积(area under the curve,AUC),并用Z检验比较两组间AUC,P<0.05为差异有统计学意义。
  本研究第二部分:磁共振检查采用Siemens Tim Trio3.0T磁共振仪。本研究第一部分中的30例PS患者中未经糖皮质激素治疗且在本院眼科门诊初次就诊的PS患者28例(38眼)于糖皮质激素治疗(口服泼尼松片1mg/kg,每2周减10mg,直至10mg维持至治疗结束)前1天、治疗后2周、治疗后4周、治疗后12周及治疗结束后4周行Mp-MRI检查。由3名从事5年以上的诊断工作放射科医生于前1天、治疗后2周、治疗后4周、治疗后12周及治疗结束后4周,在不知道患者分组的情况下于ADC图避开囊变、坏死出血区,手工勾画出病灶感兴趣区(region of interest,ROI),测3次ADC值,结果取平均值。病灶边界参考常规MRI和增强MRI图像,手动勾画出病灶边界。测量糖皮质激素治疗前1天、治疗后2周、治疗4周、治疗后12周和治疗结束后4周测量PS病灶的轴位最大径,测3次求平均值,计算最大径退缩率,公式为:最大径减少率=[(治疗前最大径-治疗后最大径)/治疗前最大径]×100%。计算糖皮质激素治疗前后ADC值的变化率(ΔADC),公式为:ΔADC=[(治疗后ADC值-治疗前ADC值)/治疗前ADC值]×100%。采用IBM SPSS Statistics Version19.0软件进行统计学分析,计量资料以“均数±标准差”((x)±s)形式表示,P<0.05为差异有统计学意义。对糖皮质激素治疗前、后有效组和无效组的PS病灶最大径、ADC值的组间比较采用两独立样本t检验;对糖皮质激素治疗前、后有效组和无效组的PS病灶最大径、ADC值的组内比较采用配对样本t检验;对糖皮质激素治疗前PS病灶ADC值与治疗前最大径、治疗前PS病灶ADC值与最大径退缩率、治疗后PS病灶ADC值与治疗后最大径及治疗后ΔADC与最大径退缩率采用Spearman相关性分析;用MedCalc16.0统计学软件绘制ROC曲线分析糖皮质激素治疗前ADC值预测糖皮质激素疗效的价值,确定其阈值,P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:
  本研究第一部分:MP-MRI检查结果显示,PS病灶呈结节型(13例18眼)和弥漫型(10例15眼)。31个PS病灶T1WI呈等信号,T2WI呈低信号,RESOLVE-DWI扩散稍受限,ADC呈等信号,增强时明显均匀强化;其余2个PS病灶T1WI呈等信号,T2WI呈高信号,RESOLVE-DWI扩散稍受限,ADC呈低信号,增强时明显均匀强化。“T”形征(由于视神经和后巩膜周围的筋膜囊炎性水肿形成T形)可见于15例(24眼),占72.7%。超声检查结果显示,PS病灶呈结节型(6例7眼)和弥漫型(10例12眼),所有病灶成均匀中等或强回声,血流信号少,声衰减不明显。“T”形征见于9例(12眼),占70.6%。Mp-MRI与超声检查结果差异有统计学意义(x2=4.364,P=0.037)。Mp-MRI和超声诊断PS的敏感度、特异度、准确率、阳性似然比、阴性似然比分别为82.5%、90.7%、83.1%、8.87、0.19和47.5%,88.4%,35.9%,4.08,0.59,两者AUC分别为0.883、0.726,差异具有显著的统计学意义(Z=2.542,P=0.011)。
  本研究第二部分:依据糖皮质激素疗效评价标准,将28例(38眼)患者分为有效组17例(24眼)和无效组11例(14眼)。有效组与无效组的PS患者在性别、年龄及病程差异无统计学意义(P>0.05)。糖皮质激素治疗前PS病灶有效组ADC值(1.36±0.11)×10-3mm2/s明显高于无效组(1.12±0.41)×10-3mm2/s,差异有统计学意义(P=0.036);治疗后2周,有效组ADC值(1.45±0.14)×10-3mm2/s,比治疗前ADC值明显升高(P<0.01)。此时无效组ADC值(1.14±0.37)×10-3mm2/s,比治疗前稍升高,差异无统计学意义(P=0.285);治疗后4周、12周及结束后4周,PS病灶有效组ADC值分别为(1.53±0.13)×10-3mm2/s,(1.60±0.13)×10-3mm2/s和(2.01±0.14)×10-3mm2/s较治疗前明显增高,差异均有统计学意义(P<0.01),而无效组未见明显变化。糖皮质激素治疗前ADC值的ROC曲线的AUC为0.747,ADC值=1.33×10-3mm2/s作为糖皮质激素治疗有效的阈值,预测治疗有效的敏感性和特异性分别为87.5%和75.0%。
  结论:
  本研究第一部分,通过比较分析Mp-MRI与超声对PS的诊断价值得出:Mp-MRI对PS的诊断价值高于超声,Mp-MRI不仅可以早期明确诊断,还能准确判断炎症渗出累及范围。当临床高度怀疑PS时,Mp-MRI可以作为重要的检查手段。
  本研究第二部分,通过评价Mp-MRI在预测糖皮质激素治疗对PS患者的疗效中的价值得出:糖皮质激素治疗中PS病灶ADC值变化早于最大径的改变。MP-MRI通过监测糖皮质激素治疗前PS病灶ADC值和治疗后2周ADC值,有助于早期预测糖皮质激素治疗的疗效。
[硕士论文] 蔡友欢
眼科学 遵义医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨核黄素联合紫外光A(Ultraviolet-A,UVA)诱导兔眼角膜穿通伤胶原交联(corneal collagen crosslinking,CXL)后对角膜瘢痕的生物力学的影响,为预防外伤性角膜葡萄肿的形成探索新方法。
  方法:
  选86只健康家兔。80只随机分为正常对照组(A组)和实验组(B、C、D3组,均制作角膜全层穿通伤模型),B组(单纯缝合组)、C组(缝合+术后即刻CXL)、D组(缝合+第7天CXL),B、C、D每组又根据不同处死时间(4周、6周、8周)分为a、b、c3组,即Ba、Bb、Bc;Ca、Cb、Cc;Da、Db、Dc组,每组8只。在相应的时间统一取4mm×10mm角膜试件在生物力学实验机上进行角膜拉伸,记录每个角膜瘢痕试件所拉伸的应力、应变,然后计算在10%应变时的杨氏模量(Young's modulus,E),绘制应力-应变曲线。根据所测出的CXL组及单纯缝合组中生物力学特性最强组,按相应的处理方法再次建模,每组3只,通过蛋白免疫印迹(Western Boltting,WB)检测α-平滑肌肌动蛋白(Alpha smooth muscle action,α-SMA)表达情况。
  结果:
  (1)角膜瘢痕最大的应力:A组为5.71±1.29MPa, B组:Ba、Bb、Bc组分别为1.37±0.62MPa,2.21±0.30MPa,3.14±0.74MPa;C组:Ca、Cb、Cc组分别为1.87±0.56MPa,2.83±0.54MPa,3.26±0.83MPa;D组:Da、Db、Dc组分别为2.17±0.52MPa,2.92±0.63MPa,4.21±0.68MPa。与A组比较,各组均有统计学差异(P=0.00),即穿通伤后所形成的瘢痕的应力较正常角膜明显降低。杨氏模量:A组为:16.37±4.06MPa;B组:Ba、Bb、Bc组分别为4.64±1.69MPa,7.75±0.82MPa,9.02±0.87MPa;C组:Ca、Cb、Cc组分别为9.67±2.42MPa,10.67±2.07MPa,11.08±1.61MPa;D组:Da、Db、Dc组分别为10.94±1.57MPa,11.16±2.50MPa,13.36±2.10MPa。除了Dc组与A组织比较(P=0.007),其余与A组比较,均有统计学差异(P=0.00),即穿通伤后所形成的瘢痕的杨氏模量明显降低。
  (2)组内最大应力比较:随时间推移,应力明显增加。Ba与Bb相比,具有统计学差异(P=0.026),Bb与Bc3组相比,有统计学差异(P=0.015);Ca与Cb相比有统计学差异(P=0.010),而Cb与Cc组无明显差异(P=0.235);Da与Db相比具有统计学差异(P=0.042),Db与Dc相比有统计学差异(P=0.01)。
  (3)组内杨氏模量比较:随时间推移,单纯缝合组杨氏模量在增加,在第6周后增加缓慢,缝合后第7天CXL在第8周最强,而缝合后即刻CXL虽呈增加趋势,但变化较为缓慢。Ba、Bb、Bc3组相比,Ba与Bb有统计学差异(P=0.008), Bb相比Bc相比无统计学差异(P=0.264);Ca、Cb、Cc3组相比,Ca与Cb相比,无统计学差异(P=0.364),Cb与Cc相比无统计学差异(P=0.707);Da与Db相比无统计学差异(P=0.842),Db与Dc相比有统计学差异(P=0.047)。
  (4)组间最大应力比较:总体上看,单纯缝合后形成的瘢痕的应力低于缝合后第7天CXL后的应力。Ba、Ca、Da3组相比,Ba与Ca比较无统计学差异(P=0.181), Ca与Da相比无统计学差异(P=0.405),Ba与Da相比有统计学差异(P=0.034);Bb、Cb、Db3组相比,Bb与Cb相比,无统计学差异(P=0.094),Cb与Db相比无统计学差异(P=0.805);Bc、Cc、Dc3组相比,除Bc与Cc组对比无统计学差异(P=0.764),Cc与Dc相比,有统计学差异(P=0.010),Bc与Dc相比有统计学差异(P=0.005)。
  (5)组间杨氏模量比较:总体上看,单纯缝合后所形成的瘢痕的抗变形能力低于缝合后第7天CXL的。Ba、Ca、Da3组相比,Ba与Ca及Da相比有统计学差异(P值均=0.000),Ca与Da组对比无统计学差异(P=0.249);Bb、Cb、Db3组相比, Bb与Cb及Da对比均有统计学差异(P分别为0.009、0.003),Cb与Db对比无统计学差异(P=0.654);Bc、Cc、Dc3组相比,Bc与Cc组对比无明显统计学差异(P=0.072),Cc及Dc相比有统计学差异(P=0.040)。
  (6)WB的结果显示:兔角膜穿通伤单纯缝合组与缝合+第7天CXL的α-SMA的表达比率分别为0.28±0.11和0.65±0.20,差异有统计学意义(P=0.048)。
  结论:
  (1)兔角膜穿通伤缝合术后所形成的瘢痕的生物力学特性随时间延长而增强,本次实验在第8周最强。
  (2)CXL可以增强兔角膜穿通伤形成瘢痕的生物力学特性,随时间推移抗生物力学特性逐渐增强,在兔角膜穿通伤缝合后第7天进行CXL要好于即刻CXL,可能可以预防角膜葡萄肿发生。
  (3)在角膜穿通伤后CXL可以增加α-SMA的分泌。
[硕士论文] 王璇
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:核黄素/紫外线A角膜胶原交联术作为一种可以有效控制圆锥角膜病情进展的治疗方式,正逐渐被广泛应用于圆锥角膜的临床管理中。其中紫外线A存在潜在的角膜内皮损伤作用,在标准核黄素交联术中,超过400um的角膜厚度可以保证到达角膜内皮细胞层的紫外线能量密度低于其损伤阈值;对于圆锥角膜晚期薄角膜低于400um的患者,采用低渗核黄素交联术的方法,使紫外线照射前的角膜厚度在低渗核黄素溶液的作用下膨胀达400um以上,以保证治疗的安全性。角膜内皮细胞层是角膜的重要选择透过屏障,其结构与功能的完整是角膜透明性的生理基础。且内皮细胞不可再生,只能通过细胞体积的增大和细胞移行来填补缺损部位。故而本研究旨在通过对等渗和低渗核黄素角膜胶原治疗前后角膜内皮细胞情况的观察比较,进一步探讨角膜胶原交联术治疗对角膜内皮细胞的影响。
  方法:选取我院2014-2015年接收的进行核黄素/紫外线A角膜胶原交联术治疗的圆锥角膜患者49眼,32人,按照交联术治疗前的角膜厚度进行分组:正常厚度角膜组(≥400um)和薄角膜组<400um)2组。正常厚度角膜组行标准核黄素交联术,薄角膜组行低渗核黄素交联术。
  术前准备充分、麻醉良好后,去除中央角膜上皮。以每3分钟1次的频率向去上皮角膜点核黄素溶液30分钟。经裂隙灯及OCT检查确保裂隙灯下可见角膜全层及前房内黄染,角膜中央厚度不低于400um。以370nm、3.0mW/cm2的紫外线对术眼角膜进行照射,照射距离为5cm,照射时间为30分钟。期间继续以每3分钟1次的频率向术眼角膜点核黄素溶液(正常厚度角膜组点0.1%等渗核黄素溶液,薄角膜组点0.1%低渗核黄素溶液)。术后佩戴软性接触镜,滴眼液及凝胶点眼。
  观察记录术前患眼视力(裸眼视力、最佳矫正视力)、最大K值、角膜中央厚度、角膜内皮细胞计数、角膜内皮细胞面积变异系数和角膜内皮六边形细胞百分比,并在术后3月、6月、1年对以上数据进行跟踪随访。其中最大K值通过前表面角膜地形图检查获得,角膜中央厚度通过前节OCT检查获得。并将以上各类结果进行统计学分析,比较两组圆锥角膜患者术前和术后的不同。
  结果:
  (1)在选取的49只接受角膜胶原交联术治疗的圆锥角膜患眼中,接受等渗核黄素角膜胶原交联术的患眼18眼,接受低渗核黄素角膜胶原交联术的患眼31眼。
  (2)术后裂隙灯下可见术眼结膜充血、角膜水肿、角膜中央上皮缺损及一过性Haze出现。
  (3)薄角膜组患者术前角膜内皮细胞计数为3047.38±341.71/mm2,术后1年角膜内皮细胞计数为2924.03±474.08/mm2,治疗前后差异无统计学意义;正常厚度角膜组角膜内皮细胞计数为3056.53±387.26/mm2,术后1年角膜内皮细胞计数为2967.34±389.53/mm2,治疗前后差异无统计学意义。
  (4)薄角膜组患者术前角膜内皮细胞面积变异系数为36.76±4.95%,术后1年角膜内皮细胞面积变异系数为35.56士5.30%,治疗前后差异无统计学意义;正常厚度角膜组角膜内皮细胞面积变异系数为35.26±6.18%,术后1年角膜内皮细胞面积变异系数为36.31±5.52%,治疗前后差异无统计学意义。
  (5)薄角膜组患者术前角膜内皮六边形细胞百分比为51.17±3.32%,术后1年角膜内皮六边形细胞百分比为50.39±2.72%,治疗前后差异无统计学意义;正常厚度角膜组角膜内皮六边形细胞百分比为58.90士3.08%,术后1年角膜内皮六边形细胞百分比为55.61±3.05%,治疗前后差异无统计学意义。
  (6)中裸眼视力和最佳矫正视力均有统计学意义提高,Kmax较术前较低,差异有统计学意义,角膜中央厚度较术前有所降低,差异有统计学意义。
  结论:角膜胶原交联术治疗对角膜内皮细胞无明显不良影响,治疗前后角膜内皮细胞相关指标无明显差异,其安全性和有效性均可得到证实。提示角膜胶原交联术治疗是治疗圆锥角膜的良好方式。
[硕士论文] 张露
眼科学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:背景:转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)在角膜损伤修复过程中发挥重要作用,其浓度变化对角膜细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成具有不同影响。既往研究多集中于高浓度(2ng/ml-10ng/ml) TGF-β1对二维培养的角膜基质细胞的影响,我们前期的研究不仅成功建立了牛角膜基质细胞体外三维培养模型,并且用0.5ng/ml-1ng/ml的TGF-β1刺激牛角膜基质细胞,观察到了其对ECM合成的影响。而低浓度TGF-β1对角膜基质细胞体外三维培养模型中ECM合成的影响还有待研究。
  目的:以牛角膜基质细胞体外三维培养模型为基础,研究低浓度TGF-β1对体外三维培养模型中的角膜基质细胞生长状况及ECM合成的影响。
  方法:利用Pellet体外三维培养模型培养原代牛角膜基质细胞,实验分为0.25ng/ml TGF-β1+5% FBS组和0.50ng/ml TGF-β1+5% FBS组,在一定时间点对培养物进行检测。应用钙黄绿素-AM/碘化丙啶法(Calcein-AM/PI法)测定角膜基质细胞的活性;行HE染色观察细胞结构;应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维链接蛋白(Fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原蛋白(typeⅠ collagen,ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(typeⅢ collagen,ColⅢ)在mRNA水平的表达,并检测角膜蛋白(Keratocan,KERA)与基膜聚糖(Lumican,LUM)两基因在Pellet培养不同时间时的表达情况;应用免疫荧光细胞化学法及蛋白质印迹法(Western Blot)检测蛋白水平上α-SMA、FN、ColⅠ、ColⅢ的表达情况。
  结果:Pellet细胞在48h、1周、2周、3周时均成团生长,细胞死亡率随培养时间延长而逐渐增长,两组间细胞死亡率无明显差异(P=0.887)。HE染色显示Pellet球内均有大量红染的胶原纤维,大部分结构完整的细胞。0.25ng/ml TGF-β1+5% FBS组ColⅢ/ColⅠ比值分别在转录水平和蛋白表达水平均低于0.50ng/ml TGF-β1+5% FBS组(PmRNA=0.038,Pprotein=0.032)。KERA与LUM基因在48h、1周、2周时均有表达。LUM基因表达在0.25ng/mlTGF-β1+5% FBS组随培养时间延长而逐渐增加(P=0.006);而在0.50ng/mlTGF-β1+5% FBS组中,LUM基因表达在1周时达到峰值,2周时下降(P<0.001)。KERA基因表达在两个实验组中均在培养1周时达到峰值,2周时表达下降(P0.25ng/ml TGF-β1组=0.004; P0.50ng/ml TGF-β1=0.020)。0.25ng/mlTGF-β1+5% FBS组的α-SMA、FN、ColⅢ蛋白表达量均低于0.50ng/mlTGF-β1+5% FBS组(Pα-sMA=0.010,PFN=0.040,PColⅢ<0.001),但0.25ng/mlTGF-β1+5% FBS组ColⅠ的蛋白表达量却显著高于0.50ng/ml TGF-β1+5%FBS组(PColⅠ=0.016)。
  结论:在Pellet体外三维培养模型中,经低浓度TGF-β1刺激培养后,角膜基质细胞能维持正常生长,并且能够合成ECM。低浓度TGF-β1刺激合成的ECM成分比例较高浓度的TGF-β1刺激合成的ECM成分比例有所不同,但TGF-β1浓度降低使ECM成分合成偏向于正常状态,有无瘢痕化修复的趋势。
[博士论文] 张彦
中药学 广州中医药大学 2017(学位年度)
摘要:近年来用眼过度、人口老龄化、环境恶化等因素,使眼科疾病的发病趋势愈来愈高。青光眼、角膜炎、结膜炎等许多眼内疾病,如不能得到及时和有效的治疗最终会导致反复发作甚至失明的严重后果。延长滞留时间,改善眼部生物利用度给药系统的研究,具有广阔的应用前景。眼部与机体其他部位相隔离,眼前段滴入式给药和后段侵入性给药是眼部疾患最常见的给药方式。眼睛的生理结构屏障及药物的理化性质限制了药物的透角膜吸收,使得角膜前半衰期短,生物利用度低。如何延长药物在角膜的滞留时间,提高给药后的有效生物利用度是眼部给药研究的热点和难点。
  黄芩苷眼用制剂临床多用于结膜炎、角膜炎、沙眼的治疗,对临床眼科常见病原菌有很强的抑菌杀菌作用。为满足药效需求,传统的黄芩苷眼用制剂临床治疗眼表或眼前段疾病时,多通过增加其药物浓度或给药频率等方式改善,但仍存在药物吸收量少的问题,大大地限制了药物临床的应用。脂肪乳载体具有降低血管刺激性和炎症反应,延长药物作用时间的优势。在体内脂肪乳具有一定的被动靶向性,能够增强药物的治疗效果成为难溶性药物优选载体。本课题将难溶性、不稳定的中药单体黄芩苷包载于脂肪乳的油相中,以达到增加制剂中难溶性药物载药量、改善物理稳定性的目的。磷脂作为脂肪乳的关键性辅料,其对产品的质量可产生显著影响。研究中选择生物相溶性好的磷脂为载体制备黄芩苷脂肪乳滴眼液,给药后在眼表形成“药物-泪液”膜,保障了脂质乳滴中药物不断向角膜细胞内传递的动力,延长药效起到缓释作用,使得眼科局部用药的优势得以发挥。
  本研究在对黄芩苷溶解性、稳定性研究的基础上,制备了以脂肪乳为载体的黄芩苷滴眼液,以不含脂质材料的亚微乳为对照,对比了不同载体黄芩苷的离体角膜透过性、眼内组织分布、眼前段消除动力学和房水内药物动力学等内容,同时对Labrasol和TranscutolP新型促渗剂对黄芩苷在不同载体中离体角膜透过性的影响、微透析探针在眼部应用可行性进行有益的探索,主要内容如下:
  1.黄芩苷理化性质研究
  ①溶解性研究
  采用饱和溶解度法对34℃下黄芩苷溶解性及脂水分配系数进行测定,黄芩苷在水中的平衡溶解度为138±2.8μg·mL-1,在pH2.0~7.4范围内,黄芩苷溶解度随着pH的增加而增大,呈弱碱性时溶解度最大。在水中加入不同类型乳化剂均可提高药物的溶解度,其中以Cremophor EL增溶效果最为明显,较水溶液提高约3倍,对于不同类型之间的乳化剂增加药物溶解度的作用不明显。脂水分配系数是影响黄芩苷转运速率和转运量的主要因素之一,而不同pH缓冲液中黄芩苷的lg P均<1,pH的改变并不能改变其亲脂性。
  ②稳定性研究
  采用作图法,测定黄芩苷在不同温度、光照强度及Linger溶液中水解反应级数、反应速率常数、反应活化能,结果表明黄芩苷在4500lx、直接光照和避光条件下,随着光照的增加,其降解速率也增加。不同温度下的反应呈一级降解速率,随着温度的升高,降解的趋势越明显,根据阿伦尼乌斯(Arrhenius)方程,外推直线至25℃,可知黄芩苷损失10%所需要的时间(t0.9)为13.3 h。在Linger溶液中黄芩苷的降解不符合零级、一级、二级和三级反应模型。在此基础上,对黄芩苷酸性、弱碱性和碱性条件下的降解机制经行探究,结果表明,黄芩苷稳定性差,当pH大于3时即开始降解,因此在不考虑其它因素影响的前提下,制剂制备过程中需控制pH为3.0~4.0之间才能保证黄芩苷的稳定性。
  溶解性或稳定性中黄芩苷含量测定采用UV-Vis分光光度法或HPLC分析方法,所建立的方法简便、准确、灵敏度高,可作为黄芩苷含量测定的常用方法之一。
  2.以脂肪乳为载体制备黄芩苷滴眼液
  ①脂肪乳滴眼液的制备
  采用单因素考察了影响体系稳定性、粒度分布、载药量和包封率的处方因素。最终确定以注射用大豆油、Poloxamer188、丙三醇等生物相容性好、刺激性低的辅料制备黄芩苷脂肪乳滴眼液。所制备的滴眼液中黄芩苷的含量为1.31±0.01 mg·mL-1,粒径、PDI和ζ电位分别为107.3±4.39 nm、PDI为0.089±0.044和-(26.29±1.65) mV。
  ②脂肪乳滴眼液的表征
  黄芩苷脂肪乳滴眼液为新型制剂,为了对处方中脂质材料的加入进行研究,实验中制备了不含脂质材料的O/W亚微乳剂作为参照,对二者进行表征。以外观、性状、载药能力、粒径分布范围和稳定性等为指标,采用透射电镜、纳米粒度/ζ电位分析仪等手段对两种制剂进行表征。结果表明按上述制备方法项下制得的脂肪乳滴眼液外观呈淡黄色、表面无油花、放置未出现黏壁现象;以适量水稀释后滴眼液呈淡蓝色乳光。采用透射电镜对二者整体形貌、乳滴的分布及聚集情况进行观察,结果表明,颗粒分布较为均匀,无明显黏连现象,脂肪乳为载体制备的滴眼液乳滴有类似于壳状结构将黄芩苷药物包载。采用强光、高温等破坏条件对黄芩苷不同制剂的稳定性进行考察,结果表明经4℃留样9个月,结果表明O/W亚微乳对黄芩苷稳定性的改变意义不大,而脂肪乳滴眼液中黄芩苷含量、粒径等均无明显变化。
  3.角膜透过性评价
  磷脂的双亲性能够通过角膜中水溶性物质屏障和脂溶性物质屏障,增加药物的角膜透过性。但影响药物角膜透过与处方及制备因素有关,角膜可供吸收的面积、厚度以及药物经膜孔道作用等生理因素有关,还与处方中促渗剂的种类及用量相关。本研究在脂肪乳的基础上,考察促渗剂加入对角膜透过性的影响。
  ①新型促渗剂对角膜透过性的影响
  采用立式Franz扩散池法,以黄芩苷水溶液为对照考察了Labrasol和TranscutolP两种促渗剂对不同制剂角膜透过性的机制进行研究。结果表明,黄芩苷在Transcutol P中的溶解度较Labrasol好,且在水溶液中直接加入Labrasol,水化值超过83%,表明实验过程中Labrasol已对角膜上皮细胞和内皮细胞造成损伤。黄芩苷的表观渗透系数随着Transcutol P浓度增加,水溶液中呈现升高的趋势,而亚微乳中并未呈升高的趋势。
  ②离体角膜透过性评价
  采用离体角膜法对不同制剂透过性及体外释放模型进行拟合。结果表明:Transcutol P对黄芩苷O/W亚微乳滴眼液及黄芩苷脂肪乳滴眼液的表观渗透系数的改善作用不明显。当Labrasol的浓度较低时,黄芩苷的表观渗透系数随Labrasol浓度增加而增加,当Labrasol过量存在时,黄芩苷的表观渗透系数随Labrasol浓度的增加而不再增加,达到平衡。体外释放拟合结果显示,黄芩苷在O/W型亚微乳滴眼液中较接近一级释放模型方程,而在脂肪乳滴眼液中黄芩苷的释放更接近Higuchi和Riger-Peppas方程。近一步说明黄芩苷在亚微乳中不同相分布可改变其释放模型。
  4.眼内分布及刺激性评价
  ①不同黄芩苷制剂在眼内的分布
  以家兔为实验对象,摘取眼球分离各组织。对黄芩苷在眼内不同组织中的药物分布进行研究。结果表明,黄芩苷O/W亚微乳滴眼液和黄芩苷脂肪乳滴眼液可以显著延长黄芩苷在眼内的循环时间,提高除晶状体之外眼部组织中的药物浓度,脂肪乳组滴眼液和亚微乳组滴眼液的浓度分别为水溶液滴眼液的26.2倍和7.8倍,在0.5h时角膜中的药物分布分别为16.67倍和7.37倍。在8h时脂肪乳滴眼液组在巩膜中的药物滞留量为(1.365±0.102)μg·g-1,与亚微乳组相比提高了8.32倍,相当于水溶液滴眼液最高浓度的77%。在眼后段玻璃体组织中,脂肪乳组中药物最高滞留量浓度由水溶液组中的0.5h(0.412±0.021)μg·g-1延迟出现至2h(2.337±0.238)μg·g-1,但在脂肪乳组中并未能延长释放时间。实验结果也表明,无论是亚微乳组还是脂肪乳组对于眼后段晶状体中药物的分布改善作用不明显。
  ②在体刺激性评价
  以乳酸林格溶液为对照,采用同体对照法对不同制剂的眼部刺激性进行评价。结果表明,亚微乳组或脂肪乳组经滴眼给药后眼部刺激性实验,按照Draize眼部刺激性评价标准,均未产生刺激性,其角膜、结膜和虹膜睫状体均无变化,所制备的制剂眼部无刺激性。
  5.药物动力学评价
  ①泪液消除动力学
  采用泪液采集法对黄芩苷眼前段消除动力学进行评价,黄芩苷不同制剂在眼部各组织中的药物浓度随时间变化情况结果表明:与不含乳化剂的水溶液滴眼液组相比,乳化剂的存在能使药物以较快速度浓集于组织部位,而脂质材料的存在能够明显改善角膜对药物的吸收能力。将药物在角膜中的药物浓度由不含乳化剂水溶液组中的滞留量由(0.135±0.017)μg·g-1增加到含乳化剂O/W亚微乳滴眼液组的(0.995±0.045)μg·g-1,而脂肪乳中可达(2.251±0.020)μg·g-1。可见,给药体系中处方的组成决定了药物的吸收,制备成亚微乳剂增加了黄芩苷的角膜吸收,但载体材料中含有脂质材料可使药物释放的速率减慢,延长药效起到缓释作用。结合巩膜中药物的滞留量,可证实O/W亚微乳组和脂肪乳组的释放在0~2h前呈突释效应,药物浓度随着时间的变化呈现缓慢下降的趋势。原因与脂肪乳中跨细胞的转运方式有关,而体系中含脂质材料时主要依靠网格蛋白介导的内吞作用完成转运,而以乳化剂存在的O/W亚微乳剂则以被动扩散转运的方式有关。脂肪乳中与O/W亚微乳剂所含成分主要差别在磷脂,该成分是组成生物膜的主要成分,滴眼后既能较好的与泪液相融合,并能减少亚微乳中表面活性剂的使用量,增加了角膜透过量减少了眼部刺激性的发生,但其毒性反应仍待进一步研究。
  ②房水内动力学
  采用角膜穿刺法对不同剂型在房水中的药物动力学进行研究。结果表明,黄芩苷亚微乳、脂肪乳均可提高角膜滞留量,降低眼前段泪液对药物的稀释,与水溶液相比,亚微乳AUC提高了5.89倍,脂肪乳AUC较亚微乳提高了2.92倍。MRT与水溶液相比,亚微乳提高了近1.05倍,脂肪乳较亚微乳提高了1.18倍,黄芩苷脂肪乳的制备,改善了药物在角膜前的生物黏附性,同时,脂质乳滴也为药物向角膜内有效传递提供了动力。房水内药动学结果表明,亚微乳及脂肪乳改变了水溶液滴眼液的眼内药物动力学,t1/2亚微乳与脂肪乳分别较水溶液提高了近3倍。
  ③微透析取样技术在眼部应用的探索
  探索研究了微透析取样技术在眼部药物浓度测定中的可行性,通过对影响探针回收率的针类型、灌流液组分、灌流液速度、周围液浓度、温度等因素进行考察。不同因素的改变虽然对方法回收率均未得到改善,但该结果可为黄芩苷等低渗透性成分的体内回收率测定及体内药动学研究提供实验基础,同时也可为其它性质的药物的回收率的改善提供参考。
  通过对黄芩苷亚微乳的处方因素考察、制备工艺筛选、制剂表征、稳定性、眼部刺激性考察、眼球组织分布、眼前段泪液消除、房水内药物动力学的研究,表明以脂肪乳为载体的黄芩苷滴眼液更适合眼部用药。
  脂肪乳作为眼部给药载体具有以下优点:
  (1)能增加难溶性药物溶解度,可提高油水均不溶性药物的载药量;
  (2)使用生物相容性好的辅料,制剂安全性好,无刺激性;
  (3)以脂肪乳作为模型药物黄芩苷的载体,可增加药物的物理稳定性;
  (4)能延长药物在眼部的滞留时间,改变药物在体内的组织分布和药物动力学性质,有可能进一步开发成靶向制剂,为难溶性药物眼用给药系统的研发提供新思路。
[硕士论文] 章颖
眼科学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  人角膜由上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层及内皮层五部分组成,角膜各层结构完整,功能和代谢正常,共同维持着角膜的整体透明性。角膜上皮细胞层处于角膜的最外层,对于维持角膜正常形态结构及功能,抵抗外力侵袭起着十分重要的作用。这归功于上皮细胞之间,上皮细胞与基底膜之间的连接,以及上皮细胞的持续自我更新。上皮细胞受到损害、消亡,进而影响细胞之间,及细胞与基底膜之间的连接,导致上皮层结构功能的不稳定性,使角膜组织容易受到外界致病因子的侵害。世界卫生组织声明,角膜损伤仅次于角膜感染,成为第二大潜在致盲原因。某些药物长期全身、局部使用,外伤,感染,手术等均可引起角膜上皮的损伤。不完全、不及时的角膜上皮修复容易引起角膜感染、角膜新生血管长入、溃疡、穿孔、角膜白斑、斑翳甚至失明。
  通常情况下,角膜上皮缺损,特别是小范围损伤,一般自我修复较快,但某些损伤,可导致持续性角膜上皮缺损,而相对严重的角膜上皮损伤需要尽快得到治疗,以促进角膜上皮的再生修复及避免角膜感染及斑翳。角膜上皮细胞之间紧密连接的形成,在角膜上皮修复过程中是非常重要的一步,可以促进上皮屏障的完整形成,抵御病原微生物的入侵,防止角膜溃疡甚至穿孔。
  近几年,促进角膜上皮快速修复得到临床越来越多的重视,尽管有很多滴眼液被认为可以促进角膜上皮修复,但由于角膜上皮细胞具有较强的自我修复能力,故很难明确不同眼药水在角膜上皮修复中的差别。临床上,人工泪液被广泛应用于促进角膜上皮修复,可是选择何种人工泪液一直没有相应的共识。搜索文献发现,关于人工泪液对角膜上皮修复是否存在促进作用的相关临床报道及研究较少。人工泪液能够缓解眼部干涩,改善泪膜功能,延长泪膜破裂时间,学者们已经研究透彻,但是,人工泪液除了能改善泪膜功能,对于角膜损伤修复,究竟有没有作用尚不得而知。
  本研究拟探讨不同人工泪液对角膜上皮修复的影响,首先建立兔角膜损伤模型,模拟人类角膜损伤,观察不同人工泪液对兔角膜上皮再生修复是否存在促进作用,同时比较不同人工泪液时间是否存在差异,并在角膜上皮修复不同阶段行病理学及扫描电镜检查,以期增加对人工泪液影响角膜上皮修复的认识,从而为临床用药提供依据。
  研究目的:
  观察不同人工泪液对兔角膜上皮的修复过程,评估人工泪液是否存在促进角膜上皮修复作用,及不同人工泪液之间是否存在差异。
  研究方法:
  选取相同年龄的35只(35眼)新西兰长耳兔,建立角膜上皮损伤模型(6mm直径圆形中央上皮缺损),随机将动物模型分为7组,分别为实验组:0.1%玻璃酸钠滴眼液组,0.3%玻璃酸钠滴眼液组,羟糖苷滴眼液组,聚乙二醇滴眼液组,0.5%羧甲基纤维素钠滴眼液组,生理盐水组及空白对照组。实验组均给予相应滴眼液,使用频率为1滴/次,4次/日。并且在损伤模型建立之后0小时,24小时,36小时,48小时,60小时及72小时,进行裂隙灯观察,拍照,并在不同时期,进行病理学检查上皮细胞与基质连接及上皮细胞排列情况,并扫描电镜观察角膜上皮超微结构。比较不同实验组之间的差异,及实验组与对照组之间的差异。所有数据均采用SPSS17.0软件包进行统计学处理,采用Tamhane's T2进行实验组间两两对比分析,运用独立样本T检验进行实验组与对照组对比分析。P<0.05为差异有统计学意义。(以a=0.05为检验水准)。
  结果:
  1.所有损伤角膜上皮(包括实验组及对照组)均在72小时以内修复完全(形态学上),大部分损伤眼角膜上皮在60小时以内修复完全(形态学上),少部分在48小时左右修复完全。
  2.72小时,对实验组兔眼角膜做病理组织学检查发现:所有再生的角膜上皮细胞层数完整,排列整齐,与基底部贴合紧密。扫面电镜观察超微结构时发现,24小时,0.3%玻璃酸钠滴眼液组角膜上皮缺损区仍有基底膜暴露,生理盐水滴眼液组基底膜已被再生角膜上皮覆盖,72小时,生理盐水组角膜上皮细胞基质内含有大量液泡,而0.3%玻璃酸钠滴眼液组中几乎没有,与正常角膜上皮形态无异。
  3.空白对照组角膜上皮再生修复所需时间明显比实验组长,对比有统计学意义。实验组之间两两比较,差异无统计学意义。玻璃酸钠对角膜上皮的修复作用于浓度有关。
  结论:
  1.人工泪液对兔角膜上皮损伤均有修复作用。
  2.玻璃酸钠滴眼液对兔角膜上皮的修复能力与其浓度有关。
  3.生理盐水可促进兔角膜上皮细胞较快的再生、移行及定植,但72小时修复再生的上皮细胞与正常角膜上皮细胞内微观结构有差异。
[硕士论文] 董莉莉
临床医学;眼科学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:构建单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)DNA疫苗pRSC-gD.gC-IL-21,探讨其是否能诱导动物免疫应答及抵抗眼角膜HSV-1的感染。
  方法:提取HSV-1基因组DNA,PCR扩增获得包膜糖蛋白C(gC)基因。以pRSC-gD-IL-21质粒为模板(本实验室2011年构建成功),将gC与包膜糖蛋白D(gD)进行基因融合,构建重组质粒pRSC-gD.gC-IL-21并进行相关鉴定,用纳米材料壳聚糖(chitosan)包裹,并进行质粒DNA的包封率检测及DpnⅠ保护实验,最后采用粘膜接种的方式分别以pRSC-gD.gC-IL-21+chitosan、pRSC-gD-IL-21+chitosan、pRSC+chitosan及chitosan四组免疫小鼠3次,每次间隔2周,末次免疫2周后进行各组小鼠血清中特异性中和抗体、脾淋巴细胞特异性靶细胞杀伤活性、泪液中特异性sIgA分泌水平的检测并进行比较,同时评价各组小鼠对病毒攻击角膜的免疫保护作用。
  结果:经测序、酶切、PCR、Western Blot鉴定后表明,重组质粒pRSC-gD.gC-IL-21构建成功,目的基因插入正确,在真核细胞内有目的蛋白表达。壳聚糖包裹率高,与对照组相比,该疫苗在小鼠体内产生了更强的特异性中和抗体、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)及自然杀伤细胞(NK)杀伤活性增强、泪液中特异性sIgA水平增高,同时使小鼠产生了更强的针对眼角膜HSV-1感染的免疫保护作用。
  结论:DNA疫苗pRSC-gD.gC-IL-21构建成功,壳聚糖包裹率高,与疫苗pRSC-gD-IL-21相比,加入免疫原gC后,能诱导小鼠产生更强的免疫应答及针对HSV-1眼部感染的免疫保护作用,能够更好的预防单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)的发生、发展,为下一步最终应用于复发性HSK鼠眼模型打下了基础。
[硕士论文] 汤如
临床医学;眼科学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:构建靶向树突状细胞(DC)的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21,针对抵抗鼠眼角膜单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的感染,探讨其是否能产生更强的免疫应答反应。
  方法:通过经典基因克隆方法,首先经过限制性内切酶酶切,切除了原先PRSC-gD-IL-21(现存质粒)中gD基因,再通过酶切及连接反应使NLDC145与gD相连克隆至原来gD的克隆位点上,保留原先另一克隆位点IL-21的免疫佐剂的作用,构建靶向DC的重组质粒pRSC-NLDC145·gD-IL-21,对其进行相关鉴定,并和壳聚糖(chitosan)包裹组成纳米HSV DNA疫苗,分别以靶向组pRSC-NLDC145·gD-IL-21+chitosan、非靶向组pRSC-gD-IL-21+chitosan、pRSC+chitosan和chitosan免疫小鼠3次,间隔2周,从而检测各疫苗对小鼠免疫应答的水平及对HSV-1眼部感染的免疫保护反应。
  结果:靶向DC的重组质粒pRSC-NLDC145·gD-IL-21,经基因测序、酶切鉴定后,序列完全正确;此重组质粒经蛋白印迹方法鉴定,其目的蛋白能在真核细胞内成功表达;且和纳米壳聚糖包裹形成包封率较高的靶向DNA疫苗组,与非靶向组比较,血清中HSV-1病毒中和抗体水平、小鼠泪液中特异性sIgA分泌水平以及CTL、NK细胞杀伤活性程度均明显增高,同时针对HSV-1眼部感染产生了更强的免疫保护反应。
  结论:成功研制的靶向DC的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21,经小鼠眼表粘膜接种后诱导了更强的免疫应答保护反应,同时也间接证明了其目的抗原可最终靶向于DC,为今后该疫苗应用于治疗复发性单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)奠定了坚实的基础。
[博士论文] 辛萌
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:术前评估角膜皮样瘤和评价角膜移植术治疗皮样瘤的临床疗效。
  方法:回顾性分析2004年7月至2014年9月于山东省眼科医院住院行角膜移植术治疗的角膜皮样瘤患者85例85眼。其中,82例行部分板层角巩膜移植术(Lamellar Sclerokeratoplasty, LSKP),3例行穿透性角膜移植术(PenetratingKeratoplasty,PKP)。明确诊断为角膜皮样瘤的患者依据肿瘤周边角膜基质内有无新生血管分为两组,无新生血管组64例64眼,有新生血管组21例21眼。
  手术方法:常规麻醉,外直肌牵引缝线后剪开肿物周围的球结膜,以保证肿物的充分暴露。环钻的选择一般原则是环钻直径比肿物直径大0.25mm,钻切深度为角巩膜厚度的1/4~1/3,若术中发现钻切深度不够,可用环钻或板层刀继续加深切口。术中应彻底切除肿物及植床混浊区,使角膜植床透明,暴露出巩膜。供体大部分为眼库低温甘油保存的眼球或含巩膜的角膜片,少数为新鲜的DX液(眼库配置的角膜保存液)保存的含巩膜的角膜片。选用合适的环钻自供体相应部分钻取植片,其中包括2/3角膜和1/3巩膜,深度由植床厚度决定。将植片置于植床,使植片的角巩膜缘与植床的角巩膜缘对齐吻合,10-0缝线(日本MANI)将两侧角巩膜缘缝合,以固定植片,然后间断缝合8~16针。埋藏线头,将球结膜复位于角膜缘。所有手术均由同一医师主刀完成。
  术后药物治疗:常规给予全身静滴糖皮质激素和抗生素3天,局部给予妥布霉素地塞米松眼膏和重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶包眼促进角膜植片上皮修复,待角膜植片上皮修复后给予0.02%氟米龙眼水4次/天,普拉洛芬眼水4次/天,环孢素眼水2次/天,妥布霉素地塞米松眼膏睡前1次治疗。用药过程中监测眼压变化情况。
  病例的临床特征及手术资料被详细记录,包括肿瘤的直径大小及位置、眼部及全身合并症、术中见肿瘤侵及角膜的深度、角膜移植前后患者的最佳矫正视力(Best-corrected Visual Acuity, BCVA)、外观美容、应用前节光学相干断层扫描(AnteriorSegment Optical Coherence Tomography,AS-OCT)观察植床与植片愈合情况以及手术相关并发症。视力检查中,所有病例用Snellen表测试,换算为Log MAR(最小分辨角的对数,Logarithm of Minimal Angle of Resolution)进行统计分析。16名婴幼儿病例无法配合检查视力。根据术后角膜植片的透明程度分为5级,从0到4+:0=完全透明、1+=轻度混浊、2+=中度混浊、3+=重度混浊,虹膜细节不能完全看到、4+=完全混浊,眼内结构不能窥入。
  本研究中的数据采用SPSS17.0统计学软件进行分析处理。组间比较和计量资料采用t检验,当P<0.05时认为有统计学意义。
  结果:病例平均年龄为5.3岁(范围:3个月~36岁),男性49例,女性36例,右眼41例,左眼44例。随访时间平均为17.95月(范围:1月~6年)。1例1眼有2个连续的皮样瘤;复发性皮样瘤4例,其中1例在外院行皮样瘤切除联合板层角膜移植术后4年复发,3例于外院行单纯切除术后复发。平均直径大小为6.1±1.6 mm。37眼皮样瘤表面有毛发生长,48眼无毛发生长。62眼皮样瘤位于角膜颞下象限,23眼位于其他象限。全身及眼部合并症:29例合并弱视,8例合并脂膜瘤,18例有附耳和Godenha综合征。无新生血管组64例行肿瘤切除联合部分角巩膜移植术治疗,其中6例合并脂膜瘤,同时行脂膜瘤切除术。有新生血管组中18例行肿瘤切除联合部分角巩膜移植术治疗,其中有2例合并脂膜瘤,同时行脂膜瘤切除术;3例因术中发现皮样瘤累及角膜全层,故行穿透性角膜移植术。
  皮样瘤病灶侵及角膜深度:无新生血管组中16例(25%)侵及角膜浅层基质,48例(75%)侵及角膜深层基质但未到达后弹力层;新生血管组中3例(14.3%)侵及角膜深基质层但未到达后弹力层,15例(71.4%)侵及角膜后弹力层,3例(14.3%)侵及角膜全层。两组患者侵及角膜深度比较有明显统计学差异(p<0.05)。
  患者术前BCVA范围为数指(Counting Fingers,CF)~20/20,术后1年81.1%病例(56/69) BCVA≥20/800,43.4%病例(30/69) BCVA≥20/40,14.4%病例(10/69)BCVA>20/25。在无新生血管组中,术前BCVA为20/200~20/20(0.41±0.32LogMAR),术后1年BCVA为20/400~20/20(0.31±0.22LogMAR),其中,32眼BCVA较术前视力有所提高,8眼无变化,10眼下降。在新生血管组中,术前BCVA为20/200~20/20(0.75±0.41LogMAR),术后1年BCVA为20/400~20/20(0.66±0.43LogMAR),其中12眼BCVA较术前视力有所提高,4眼无变化,3眼下降。两组患者术后1年BCVA无明显统计学差异(t=1.584,p>0.05)。
  84例较术前明显改善了眼表外观,仅1例患者由于术后层间混浊及层间新生血管严重,眼表外观改善较差。术后角膜植片70.5%为1+混浊,21.1%为2+混浊,8.2%为3+混浊,未出现4+混浊。无新生血管组中,50眼为1+混浊,12眼为2+混浊,2眼为3+混浊,未出现4+混浊;有新生血管组中,10眼为1+混浊,6眼为2+混浊,5眼为3+混浊,未出现4+混浊。前节光学相干断层扫描图像(AS-OCT)显示植床与植片层间愈合良好。
  3眼行穿透性角膜移植术,在随访期间均发生不同程度的免疫排斥反应,经过抗排斥药物治疗后好转,而其余行板层角巩膜移植术的眼均未发生免疫排斥反应。术后患者均未复发。一例术中出现植床微穿孔,给予穿孔修补后行板层角巩膜移植术。术后4例出现角膜植片上皮愈合时间延长,给予药物治疗后角膜上皮修复;2例出现激素性青光眼,给予降眼压药物治疗恢复正常眼压;1例出现层间新生血管;1例术后7天出现层间积血,给予层间冲洗。
  结论:肿瘤切除联合板层角巩膜移植术是治疗角膜皮样瘤的一种有效治疗方法,术后并发症少,明显改善了患者眼表外观。肿瘤周边角膜基质内有新生血管的皮样瘤比无新生血管的皮样瘤侵入角膜病灶更深,掌握这一临床特征,对于术前评估肿瘤侵入角膜深度,制定手术方案,有效避免并发症的发生,具有一定指导意义。
[硕士论文] 杨萌萌
眼科学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:干眼是由于泪液的量或质或流体动力学异常引起泪膜不稳定和(或)眼表损害,而导致不适感和视功能受损的一类疾病,我国临床出现的各种各样的名称(如干眼症,干眼病及干眼综合征等)均统一称为干眼,随着电脑、手机等设备的广泛使用,由于双眼长时间的注视荧光屏及在视频终端前操作,干眼的发病率日益升高,现在临床上常使用的诊断干眼的检查主要有:泪液分泌试验,泪膜破裂时间等方法,但这些方法准确性差,易引起患者不适,因此寻找快捷、无创、准确的诊断干眼方法愈加急切,睑缘炎相关角结膜病变(blepharokeratoconjunctivitis,BKC)是指与睑缘炎相关的一组角结膜病变,表现为反复发作的结膜、角膜病变,包括角膜上皮糜烂,点状角膜炎,边缘性角膜炎和角膜溃疡,临床易被误诊为病毒性角膜炎,反复发作可导致视功能受损,因此对于BKC的治疗仍需要深入的研究。
  第一部分眼表综合分析仪评价干眼患者相关指标的临床分析
  目的:
  探讨oculus眼表综合分析仪与传统干眼检查方法(BUT、SchirmerⅠ等)在干眼诊断中的差异。
  方法:
  观察自2016年1月1日至2017年2月1日就诊于河北医科大学第二医院眼科门诊的干眼患者100例,其中男性36例,女性64例,年龄范围为13-80岁,所有受检者均使用传统干眼检查(BUT、SchirmerⅠ等)与Oculus眼表综合分析仪二种方法进行检查,二种检查至少间隔时间为30分钟,为避免同一个体双眼的关联性,所有受检者均只纳入右眼数据进行统计,对Oculus眼表综合分析仪与传统干眼检查方法(BUT、SchirmerⅠ)之间的各项指标进行比较讨论。
  结果:
  传统干眼诊断方法与眼表综合分析仪各项指标的对比
  1传统干眼诊断方法与眼表综合分析仪检出率的比较:用传统干眼检查方法确诊的这100只眼睛,用Oculus眼表综合分析仪诊出干眼80例,可疑干眼14例,正常6例。
  2传统干眼诊断方法与眼表综合分析仪各项指标的相关性:Spearman秩相关分析结果提示,TBUT检测结果与NITBUTav、NITBUTf检测结果间呈正相关(rs=0.712、0.424,P=0.000),SchirmerⅠ试验结果与NITBUTav、NITBUTf呈正相关(rs=0.566,P=0.000;rs=0.336,P=0.001)。
  3传统睑板腺阻塞程度的评分与眼表综合分析仪睑板腺缺失评分相关性:Spearman秩相关分析结果提示,睑板腺阻塞程度的评分与睑板腺缺失评分结果间呈正相关(rs=0.528,P=0.000)。
  结论:
  Oculus眼表综合分析仪是一种非侵入性、无创性、可操作性强的检查手段。对于干眼患者的诊断、以及临床用药指导具有重要的应用价值。
  第二部分睑缘炎相关角结膜病变患者2种口服抗菌素的疗效分析
  目的:
  观察多西环素和阿奇霉素治疗成人中、重度睑缘炎相关角结膜病变的临床疗效的差异,以期为睑缘炎相关角结膜病变的临床治疗提供依据。
  方法:
  观察自2016年1月1日至2016年12月31日就诊于河北医科大学第二医院眼科门诊的中、重度睑缘炎相关角结膜病变(BKC)患者,共选入中度BKC患者31人,其中男性14人,女性17人,年龄范围为15-75岁,重度BKC患者33人,其中男性13人,女性20人,年龄范围为13-76岁,对两组患者分别进行分组治疗,所有的睑缘炎相关角结膜病变患者除均采用局部用药、热敷、按摩等常规治疗外,两组患者分别根据随机数字表再分为两组,一组口服多西环素100mg,每日2次,使用2周后,减量为100mg,每日1次,口服2周(共一个月);另一组患者口服阿奇霉素500mg,每日1次,口服3天后,停药7天,共口服3个周期(即1个月),分别于治疗1个月、3个月后观察使用不同药物的临床疗效,对睑缘炎相关角结膜病患者的治疗效果进行统计分析。
  结果:
  1中度睑缘炎相关角结膜病变患者2种口服抗菌素的疗效分析
  1.1治疗1个月后多西环素组和阿奇霉素组疗效的比较:治疗1个月后观察疗效,多西环素组15人,其中治愈10人(66.67%),病情好转5人(33.33%),无效0人,阿奇霉素组16人,其中治愈10人(62.5%),病情好转6人(37.5%),无效0人,采用Mann-Whitney U检验来判断二组药效的区别,结果显示治疗1个月后多西环素和阿奇霉素在治疗成人中度BKC的疗效上无显著性差异(P=0.812)。
  1.2治疗3个月后多西环素组和阿奇霉素组疗效的比较:治疗3个月后,没有发现患者病情复发,多西环素组15人,其中治愈12人(80%),病情好转3人(20%),无效0人,阿奇霉素组16人,其中治愈13人(81.25%),病情好转3人(18.75%),无效0人,采用Mann-Whitney U检验来判断二组药效的区别,结果显示治疗3个月后多西环素和阿奇霉素在治疗成人中度BKC的疗效上无显著性差异(P=0.931)。
  2重度睑缘炎相关角结膜病变患者2种口服抗菌素的疗效分析
  2.1治疗1个月后多西环素组和阿奇霉素组疗效的比较:治疗1个月后观察疗效,多西环素组17人,其中治愈9人(52.94%),病情好转7人(41.18%),无效1人(5.88%),阿奇霉素组16人,其中治愈7人(43.75%),病情好转9人(56.25%),无效0人,采用Mann-Whitney U检验来判断二组药效的区别,结果显示治疗1个月后多西环素和阿奇霉素在治疗成人重度BKC的疗效上无显著性差异(P=0.743)。
  2.2治疗3个月后多西环素组和阿奇霉素组疗效的比较:治疗3个月后,没有发现患者病情复发,多西环素组17人,其中治愈12人(70.59%),病情好转4人(23.53%),无效1人(5.88%),阿奇霉素组16人,其中治愈11人(68.75%),病情好转5人(31.25%),无效0人,采用Mann-Whitney U检验来判断二组药效的区别,结果显示治疗3个月后多西环素和阿奇霉素在治疗成人重度 BKC的疗效上无显著性差异(P=1.000)。
  结论:
  多西环素和阿奇霉素在治疗成人中、重度睑缘炎相关角结膜病变有效,但二者在疗效上无显著性差异。
[硕士论文] 金鑫
眼科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨MMP-8、MMP-9对角膜混浊度的影响;比较MMP-8及MMP-9对角膜基质胶原的破坏作用。
  方法:
  选取角膜正常的C57BL/6J小鼠8只,共16只角膜,经腹腔麻醉后脱颈椎法处死,2 mm角膜环钻取中央角膜,用于体外实验。将角膜随机分4组,MMP-8组、MMP-9组为实验组,Assay Buffer组为阴性对照组,生理盐水组为空白对照组,分别加入到含100μL的20 ng/μL MMP-8、20 ng/μL MMP-9、Assay Buffer、生理盐水的96孔板中,36.5℃孵育24 h后取出,测定各个角膜的羟脯氨酸浓度;选取角膜正常的C57BL/6J小鼠30只,共60只角膜,用于体内实验。将小鼠分3组,MMP-8组、MMP-9组为实验组,生理盐水组为对照组,分别给予角膜基质内注射约10μL的20 ng/μL MMP-8、20 ng/μL MMP-9及生理盐水,分别于注射前(0 h)及注射后4、8、12、20、24 h进行混浊度评分、二次谐波扫描角膜基质信号强度,并于8 h、24 h分别经腹腔麻醉后脱颈椎法处死,取角膜进行羟脯氨酸浓度测定。
  结果:
  体外实验中,实验组角膜羟脯氨酸浓度明显低于阴性对照组(F=451.492, P=0.000)及空白对照组(F=252.403,P=0.000),差异有统计学意义,MMP-8组角膜羟脯氨酸浓度明显低于MMP-9组(F=55.184,P=0.002),差异有统计学意义。体内实验中,0 h实验组与对照组角膜混浊度无明显差异(χ2=0.000, P=1.000)。4、8、12、20、24 h实验组角膜较对照组角膜明显混浊,结果有统计学差异(P<0.05),MMP-8组较MMP-9组角膜混浊度无明显差异(P>0.05)。0 h二次谐波扫描实验组与对照组角膜基质信号强度无明显差异(P>0.05)。4、8、12、20、24 h,实验组角膜基质信号强度均明显低于对照组,结果有统计学差异(P<0.05),MMP-8组与MMP-9组相比较,结果无明显统计学差异(P>0.05)。8 h对小鼠角膜取材进行羟脯氨酸浓度测定,实验组角膜羟脯氨酸浓度明显低于对照组,差异有统计学意义(F=17.877,P<0.001),MMP-8组与MMP-9组相比较,结果无明显统计学差异(P>0.05)。24 h对小鼠角膜取材进行羟脯氨酸浓度测定,实验组角膜羟脯氨酸浓度明显低于对照组,差异有统计学意义(F=41.400,P<0.001),MMP-8组与MMP-9组相比较,结果无明显统计学差异(P>0.05)。MMP-8组SHG角膜基质信号强度与角膜混浊度临床评分之间呈明显负相关(rs=-0.511,P<0.001),MMP-9组SHG角膜基质信号强度与角膜混浊度临床评分之间呈明显负相关(rs=-0.613,P<0.001)。
  结论:
  MMP-8及MMP-9可降解角膜基质中的胶原纤维,导致角膜基质胶原纤维排列紊乱,角膜混浊度升高;体外实验中,同一质量浓度的MMP-9较MMP-8有更强的降解角膜基质胶原的能力;在体实验中,角膜基质注射条件下,同一质量浓度MMP-9与MMP-8降解胶原的能力无明显差异。
[硕士论文] 曹楠珏
眼科学 中国医科大学 2017(学位年度)
摘要:背景:单纯疱疹性角膜炎(HSK)是一种缺乏有效治疗方法的致盲性眼病,多种免疫炎症相关细胞因子都能影响其发生、发展及转归。本课题组前期研究发现在小鼠HSK模型中IL-12A、IL-1β等细胞因子增多,同时有研究表明IL-12A、IL-1β、IL-6、CXCL-10、CCL-20、VEGF-A、MMP-2、MMP-9等细胞因子都可以加重HSK的严重程度。microRNA(miRNA)作为重要的转录后调控因子,一种miRNA可以调控其下游的多种靶基因的蛋白翻译,使其靶基因表达下调。
  目的:寻找一种可同时调控以上IL-12A等多个HSK相关细胞因子的miRNA,验证其与细胞因子IL-12A的靶标关系,分析microRNA-21(miR-21)的生物信息学功能及其在HSK中可能的作用机制。
  研究方法:运用TargetScan v7.1、miRanda v2010、miRBase v2014及miRTarBasev6.0数据库进行以上多个细胞因子的miRNA预测,寻找共同的miRNA;运用miRBase数据库对各物种miR-21序列进行对比;通过RGator v3.0数据库分析人(hsa)miR-21在各组织中的表达情况;通过数据库检索,找出尚未验证的且与HSK相关的hsa-miR-21候选靶基因进行靶标验证,通过构建IL-12A的3'-非翻译区(UTR)野生型及突变型载体质粒,将相应的质粒与hsa-miR-21模拟物转染到293T细胞中;通过双荧光素酶报告系统检测萤光素酶活性,初步验证两者的靶标关系;运用以上数据库进行hsa-miR-21的候选靶基因筛选,得出候选靶基因集合;对候选靶基因集合进行基因功能富集分析、信号转导通路富集分析和蛋白互作网络分析;通过以上结果分析hsa-miR-21在HSK中可能的作用机制。
  结果:通过以上数据库检索分析发现hsa-miR-21是可以同时调控以上多个HSK相关细胞因子的miRNA;各物种miR-21的序列基本一致。hsa-miR-21在人体各组织中均见表达,程度不一。研究发现IL-12A是尚未验证的且与HSK相关的候选靶基因。双荧光素酶报告系统分析表明hsa-miR-21能够靶向作用于IL-12A的3'-UTR(t=-24.43,P<0.05),初步证明两者具有靶标关系。筛选hsa-miR-21的候选靶基因共609个,其基因功能主要富集于调节细胞过程、细胞大分子代谢过程、负调控细胞过程、蛋白质修饰过程、细胞蛋白质代谢过程、细胞内、细胞质、细胞核、细胞器、蛋白质结合、酶结合、激酶结合、蛋白激酶活性、序列特异性DNA结合(P<0.05),并涉及到丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路、单纯疱疹感染通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、NF-κB信号通路、转化生长因子(TGF)-β信号通路、Toll样受体信号转导通路、细胞周期及凋亡信号通路及多种癌症通路(P<0.05)。通过以上结果分析hsa-miR-21可能通过MAPK信号转导通路中的27个靶基因、单纯疱疹感染通路中19个靶基因、TNF信号通路中15个靶基因、NF-κB信号通路中的10个靶基因来调控HSK的发生和发展。
  结论:hsa-miR-21可以结合于IL-12A的3'-UTR区,hsa-miR-21和IL-12A具有靶标关系;hsa-miR-21的靶基因参与多个生物学过程,与癌症和免疫炎症密切相关,其中MAPK信号转导通路、单纯疱疹感染通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路可能是其参与HSK免疫调节中主要的作用机制。
[博士论文] 张兆强
生理学 厦门大学 2016(学位年度)
摘要:角膜(cornea)是眼睛前端的一层透明组织,角膜上皮(cornealepithelium)位于角膜的最外层,传统观点上认为角膜上皮的自我更新能力主要依赖于角膜缘干细胞,角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency,LSCD)可导致角膜混浊、结膜化、血管化和视力下降。多种因素可导致角膜缘干细胞缺乏,但目前角膜缘干细胞缺乏的发病机制尚未明确。脂类代谢(lipidmetabolism)是机体的重要的三大代谢之一,过氧化物酶体增殖物激活受体alpha(peroxisome proliferators-activated receptor alpha,PPARα)在脂代谢中发挥着重要作用,非诺贝特(fenofibrate,Fen)是PPARα的激动剂,可以促进脂肪酸β氧化。脂类代谢异常可导致脂质过氧化(lipid peroxidation),对机体造成损伤。
  目的:利用新生大鼠强行开睑(forcing-eye-open-at-birth,FEOB)角膜缘干细胞缺乏模型,研究脂类代谢和脂质过氧化在LSCD病变中的变化和影响,探讨脂类代谢和角膜缘干细胞缺乏的关系。
  方法:本课题实验分为两个部分,第一部分为研究角膜脂类代谢和脂质过氧化在角膜缘干细胞缺乏病变过程中的变化,其实验大鼠随机分为正常对照组和FEOB实验组两个组,每组按出生天数分为P0、P1、P5、P10、P15、P30,每组15只;第二部分实验采用非诺贝特处理FEOB大鼠角膜10天,观察其对FEOB角膜缘干细胞缺乏是否有治疗作用,本实验共分为3组:Normal组、(FEOB+PBS)组和(FEOB+Fen)组,每组大鼠15只。实验采用裂隙灯检查,HE染色和PAS染色观察其组织病理学形态;采用油红O染色检测角膜表面的中性游离脂肪酸;实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(Real-timefluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting)检测LSC的标志物(P63、ABCG2)、脂类代谢相关因子[PPARα、肉碱棕榈酰基转移酶(carnitine palmitoyltransferase1alpha,Cpt1)、脂酰辅酶A合酶(long chain acyl-CoA synthetase,Acsl)、脂酰辅酶A脱氢酶(medium chain acyl-CoA dehydrogenase,Acadm)、烯酰辅酶A水合酶(short chain enoyl-CoA hydratase,Ech)]、脂质过氧化相关因子5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,ALOX5);采用原位杂交(in situ hybridization,ISH)检测PPARα在角膜的定位,采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)的方法检测炎症细胞的标记物(ED1、PMN);采用试剂盒检测丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量和超氧岐化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性。
  结果:第一部分:与正常大鼠相比,在发育过程中,FEOB大鼠角膜角膜透明性降低,出现新生血管,角膜上皮细胞病理性增生、细胞排列紊乱,PAS染色阳性,LSC标志物P63、ABCG2表达下调,角膜特异性角蛋白K12表达下降,K10、K13表达上调,角膜上皮基底层PCNA阳性细胞数显著下降,符合角膜缘干细胞缺乏诊断标准;FEOB大鼠角膜表面油红O染色阳性,说明角膜表面出现脂类沉积,与此同时调控脂类代谢的核受体PPARα表达下调,脂质代谢相关酶类Cpt1α、Acsl、Acadm和Ech的表达也下调;脂质过氧化酶ALOX5表达上调,脂质过氧化产物MDA增多,表明脂类代谢异常,脂质发生过氧化;
  第二部分:与FEOB+PBS组对照,Fenofibrate处理FEOB大鼠后,角膜未见溃疡,新生血管数量减少,PCNA阳性细胞增多,角蛋白K12表达上调,K10、K13表达下调,说明Fenofibrate可以减轻LSCD病症;处理后油红O染色转为阴性,Fenofibrate作为PPARα的激动剂,可以激活PPARα表达,上调Cpt1α、Acsl、Acadm和Ech的表达,促进脂类β氧化;角膜中的ALOX5和ALOX5ap均表达下调,脂质过氧化的产物MDA含量下降。
  结论:新生大鼠开睑之后,角膜微环境发生改变,角膜表面出现脂类沉积,同时脂类代谢相关调控因子PPARα下调,脂类β氧化被抑制,脂类代谢异常,脂质发生过氧化导致损伤,是引起角膜缘干细胞缺乏的可能关键因素;Fenofibrate通过激活PPARα,促进脂类代谢,降低脂质过氧化,是病理状态下角膜缘干细胞的新型保护剂。
[硕士论文] 孙玎
眼科学 青岛大学 2016(学位年度)
摘要:目的:探讨NLRP3(Nod-like receptor protein-3,NLRP3)炎症复合体在烟曲霉菌感染的人角膜上皮细胞中的作用,及其激活方式。
  方法:将研究对象设为体外培养的人永生化角膜细胞(HCECs)。本实验分为2部分。(1)以未加任何刺激的HCECs为空白对照组,以烟曲霉菌菌丝刺激的HCECs为实验组,在4、6、8、12、16h、24h用Real-time PCR法检测NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA,在8,16、24、36h时间点用Western Blot法检测NLRP3蛋白表达;(2)以体外培养的未加真菌刺激的HCECs为空白对照组,实验组细胞先加入不同浓度的格列本脲(Glyburide)预刺激两小时,然后加入烟曲霉菌菌丝刺激,在12小时时间点用real-time PCR法检测NLRP3 mRNA,在24小时时间点用Western Blot法检测NLRP3蛋白表达,在24小时时间点用ELISA法检测IL-1β蛋白表达。
  结果:(1)烟曲霉菌菌丝抗原刺激后可引起NLRP3、ASC、caspase-1基因水平表达量相对增高,时间依赖性,12h达到峰值;烟曲霉菌菌丝抗原刺激后可引起NLRP3蛋白水平表达量相对增高,呈时间依赖性,24h达到峰值;(2)在不同浓度的格列本脲抑制炎症小体的情况下,NLRP3基因表达量降低,并呈剂量依赖性,400mM为最佳刺激浓度;并且400mM格列本脲可使NLRP3和IL-1β蛋白表达量降低。其表达变化差异均有统计学意义。
  结论:在人类正常角膜上皮细胞中,存在NLRP3炎症小体,并且在烟曲霉菌菌丝刺激下,组成NLRP3炎症小体的各因子表达上升;在NLRP3炎症小体特异性抑制剂格列本脲(Glyburide)的抑制下,NLRP3和IL-1β基因和蛋白表达量降低,可以推测该小体在人角膜上皮细胞固有免疫中发挥重要作用。
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