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[硕士论文] 庄纬
外科学(整形) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  先天性上睑下垂是一种严重的上睑运动障碍疾病,对患者的视野及容貌产生巨大的影响。近年来,联合筋膜鞘(CFS)悬吊法上睑下垂矫正术作为一种较新的上睑下垂手术方法在国内逐渐开始流行。许多国内研究者发表相关的手术研究,并在全国各地举行的会议上进行分享和推广,并有部分研究认为其可以完全取代传统的手术术式成为行业的新标准。然而对于CFS这一结构的认识以及CFS悬吊法上睑下垂矫正术的手术机制仍然存在争议。我们通过解剖研究进一步明确其组成及与眼周其他结构的相互关系,模拟其手术中的悬吊作用来解释手术机制,并以此为依据对该术式的应用和改进提供帮助与思考。
  方法:
  1、解剖学研究
  对7具中国成年人尸体标本共14只眼球(4具经福尔马林固定,3具新鲜)进行了大体解剖研究,采取逐层解剖的方法,首先明确CFS与上睑提肌、上直肌之间的关系,并通过进一步解剖明确其所属的眼外Check韧带系统与内外眦,眼部各直肌、斜肌、眶壁的解剖关系。
  2、组织学研究
  对3具中国成年人尸体标本共6只眼球进行了断层解剖并进行脱水、包埋和切片处理,进行组织学切片的制备,通过HE和Masson染色对眼外Check韧带系统在不同断面的分布及毗邻关系进行观察。对重点区域进行免疫组化的染色,明确Check韧带的组织学组成。
  3、CFS悬吊矫正上睑下垂的动力机制研究
  选取2具中国成年人新鲜尸体标本,截取上下眶缘之间部分,打开眶顶壁,并进行CFS悬吊法上睑下垂矫正术的模拟手术。手术前后对上直肌及上睑提肌进行相同距离的牵拉,测量不同情况下眼睑的提升数据,进而推断其手术后改善上睑下垂的力学机制。
  结果:
  1、解剖学研究
  在大体解剖过程中,我们发现了在上睑提肌与上直肌之间的上穹窿Check韧带(即联合筋膜鞘)不仅仅局限于眼球上方。其向两侧延伸至内外眦,与内外直肌各自的Check韧带存在强化的联系并固定于眶壁上,并继续向下延伸至眼球下方的下斜肌与下直肌之间,在眼球周围的组成了一个环行的筋膜系统。
  2、组织学研究
  对标本分别进行了冠状位、矢状位、水平位3个方向上的切片制备,通过对切片的观察进一步明确在完整情况下眼周各肌肉的Check韧带与肌肉、脂肪、结膜穹隆、内外眦之间的解剖关系,确认了这一筋膜系统的环形结构存在以及在内外眦处发出与眶壁紧密的联系。对切片进行了免疫组化的染色,α-SMA(+)、h-caldemon(+)的结果证实了部分Check韧带中含有平滑肌细胞。
  3、CFS悬吊矫正上睑下垂的动力机制研究
  截取需要的标本部分,分别模拟正常生理情况下、上睑下垂情况下以及做CFS悬吊上睑下垂矫正术后眼睑的提升运动。每种状态下分别对上睑提肌和上直肌做等距离的牵拉。发现CFS悬吊后主要提升眼睑的力量来源于上睑提肌的动态收缩运动,但同时上直肌的静态悬吊力量也对抬高眼睑位置有影响,术后上直肌的动态收缩对于抬高眼睑的作用也比术前有所增强。
  结论:
  我们将大体解剖过程中发现的这一包绕眼球的环形筋膜样结构命名为“眼外Check韧带系统”,根据其形态及组织学构成推测其在维持结膜穹窿及眼球位置、协调眼球及眼睑的生理运动等方面发挥重要作用。进而提出假设,并通过手术模拟方法,进一步对在CFS悬吊手术中力学机制做出了解释,对目前存在的上穹窿Check韧带悬吊法上睑下垂矫正术的手术原理中的争议提出了我们自己的看法,对其临床应用及术式可改进之处提供了解剖学依据和参考。
[硕士论文] 陈子瑜
眼科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)是眼眶疾病中最常见的一种类型。目前的研究认为其是一种自身免疫性疾病,与甲状腺功能紊乱有关,常伴发于毒性弥漫性甲状腺肿(Graves'disease,GD)。国外研究显示,每百万人群中Graves病发病率为210/年,男女比例为1∶3.9,高峰年龄为40-60岁,而TAO的发病率为42.2/百万/年,约为Graves甲亢发病率的20.1%。目前TAO的确切发病机制仍不明确,缺乏针对性的治疗措施,现有治疗方案多以控制病情为主。同时由于TAO治疗的前提是正确的临床分期,而目前临床普遍采用的CAS评分系统存在一定的主观性,尤其对于非专门从事TAO诊治的眼科和全科医生,很难做到准确分期。国外有研究发现,Toll样受体9(Toll-like receptor9,TLR9)激活可促进浆细胞样DC(pDC)分泌IFN-α,与SLE的疾病活动性和预后密切相关。而前期研究发现活动期TAO患者外周血单个核细胞中TLR9表达明显高于正常人群。因此推测TLR9是否同样参与了TAO的发病过程,为了验证这一设想,通过实验验证活动期TAO患者眼眶成纤维细胞(orbital fibroblasts,OFs)是否高表达TLR9,并与稳定期TAO进行对比,以期发现二者之间TLR9表达的差异。进一步探究TLR9与OFs增殖、炎症因子释放之间的联系,了解TLR9在TAO发病中的作用,为寻找TAO治疗靶点提供依据和方向。
  方法:
  本课题通过组织块培养法,分别从活动期TAO患者、稳定期TAO患者及排除免疫性疾病为改善外观而行眼眶减压手术的正常人眼眶脂肪结缔组织中分离纯化OFs。用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)方法分析各组TLR9mRNA表达水平的差异。用TLR9特异性配体——人工合成的含有CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)刺激各组细胞,分别于刺激后0h、6h、12h、24h用qRT-PCR方法检测白介素-6(interleukins-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)mRNA表达水平的变化趋势,并分别用不同浓度CpG ODN刺激各组OFs,作用不同时间,通过CCK8法测定各组细胞OD值的变化,计算细胞活力,了解TLR9与OFs增殖之间的联系。最后用特异性小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)下调TLR9mRNA的表达水平,再次用qRT-PCR法检测活动期TAO组TLR9、IL-6、IFN-γ、ICAM-1mRNA表达水平,验证TLR9与炎症因子IL-6、IFN-γ、ICAM-1合成和分泌之间的相关性。
  结果:
  1、经组织块培养法成功获得各组OFs,经形态学及免疫组化鉴定符合成纤维细胞特征。
  2、TLR9mRNA在活动期TAO组OFs中表达水平明显高于正常对照组,而在稳定期TAO组中表达下调。
  3、CpG-ODN刺激各组细胞后,活动期TAO组OFs活力明显升高,而稳定期TAO组和正常对照组无明显变化,这种作用在CpG-ODN作用48h后显现,并且存在剂量依赖,在200nM时最明显。
  4、CpG-ODN刺激各组细胞后,活动期TAO组OFs相关炎症因子(IL-6、TNF-α、ICAM-1、IFN-γ)mRNA的表达水平均不同程度升高,稳定期TAO组OFs升高幅度不明显,部分出现下调。
  5、用siRNA下调活动期TAO组OFs TLR9mRNA表达水平后,相关炎症因子(IL-6、IFN-γ、ICAM-1)mRNA的表达水平亦呈现下降趋势,呈正相关。
  结论:
  1、组织块培养法获取OFs是可靠而有效的。
  2、TAO活动期患者来源的OFs高表达TLR9,而稳定期患者来源的OFs相对低表达,提示TLR9可能参与TAO活动期炎症反应过程。
  3、用特异性配体激活TLR9后,OFs的细胞活力明显提高,提示TLR9被激活可能参与了TAO活动期眼外肌增生和眶脂肪增多的病理过程。
  4、TLR9激活后,可诱导活动期OFs合成和分泌IL-6、TNF-α、ICAM-1、IFN-γ等炎症因子,说明TLR9可能参与了TAO活动期眼眶炎症反应过程。
[硕士论文] 陈欣欣
眼科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)是一种自身免疫性疾病,发病机理尚未完全明了,目前临床和基础研究均发现氧化应激在TAO的发病过程中起到一定的作用,试验性的抗氧化剂治疗对于轻度、中度TAO也取得了比较理想的治疗效果。抗氧化剂氢水因其几乎无毒副作用,近年来被大量地研究,众多的医学和生物学方面的研究成果表明,氢水可以通过抗氧化、抗凋亡、抗炎作用,有效治疗因氧化应激导致的各器官损伤。
  本研究采用原代培养的眼眶脂肪结缔组织来源的眼眶成纤维细胞,研究氢水对于体外培养正常人和TAO患者眼眶成纤维细胞的影响,同时与地塞米松作对照研究,检测在过氧化氢(H2O2)氧化损伤眼眶成纤维细胞后,各种氧化应激指标:活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量的变化,并且检测眼眶成纤维细胞凋亡情况,增殖能力以及细胞内透明质酸(HA)的含量。
  方法:
  1、取TAO患者及正常人的眼眶脂肪结缔组织,进行原代培养,获得稳定传代的眼眶成纤维细胞,并用形态学和免疫组化的方法鉴定。
  2、选取不同浓度的H2O2作用于正常人及TAO患者眼眶成纤维细胞,CCK-8法检测细胞18h后的增殖能力,为后续实验选取合适的过氧化氢浓度。
  3、将正常人和TAO患者的眼眶成纤维细胞分为几下几组:空白组、氧化损伤模型组、氢水+模型组、地塞米松+模型组。CCK-8法分别检测各组眼眶成纤维细胞0、24h、48h、72h的增殖能力。
  4、流式细胞仪检测上述各组眼眶成纤维细胞72h后的早期凋亡率、晚期凋亡率和坏死率。
  5、分光光度计法检测上述各组眼眶成纤维细胞72h后MDA、GSH-PX的含量。
  6、酶标仪法检测上述各组眼眶成纤维细胞72h后SOD的含量。
  7、流式细胞仪检测上述各组眼眶成纤维细胞72h后ROS的含量。
  8、将TAO患者的眼眶成纤维细胞分成三组:空白组、氢水组、地塞米松组,ELISA法检测各组细胞72h后HA的含量。
  结果:
  1、本实验成功培养出眼眶脂肪结缔来源的成纤维细胞,经过形态学和免疫组化法鉴定其确为眼眶成纤维细胞,能够稳定传代,成功为后续实验建立细胞体系。
  2、不同浓度的H2O2作用于眼眶成纤维细胞18h后,根据其对细胞增殖能力的影响,最终选取100μmol/L的H2O2作为后续实验药物。
  3、氢水+模型组及地塞米松+模型组在24h、48h、72h所测的细胞增殖能力均显著高于氧化损伤模型组。
  4、与氧化损伤组相比,氢水及地塞米松在作用72h后均可以显著降低细胞晚期凋亡率和坏死率。
  5、氢水及地塞米松在作用72h后均可以显著降低氧化损伤后细胞的MDA含量,升高细胞GSH-PX含量。
  6、氢水及地塞米松在作用72h后均可以显著升高氧化损伤后细胞的SOD含量。
  7、氢水及地塞米松在作用72h后均可以显著降低氧化损伤后细胞的ROS含量。
  8、TAO患者眼眶成纤维细胞内HA含量显著高于正常人,氢水及地塞米松作用72h后均降低了TAO患者眼眶成纤维细胞的HA含量。
  结论:
  TAO患者眼眶成纤维细胞的增殖能力高于正常人,氢水及地塞米松均升高了H2O2氧化损伤后眼眶成纤维细胞的增殖能力;TAO患者和正常人眼眶成纤维细胞的凋亡率和坏死率并无明显差异,但加入氢水和地塞米松作用于氧化损伤后的眼眶成纤维细胞后,TAO患者细胞的晚期凋亡率和坏死率明显高于正常人;氢水及地塞米松均可以通过降低氧化损伤后细胞MDA和ROS含量,提高SOD和GSH-PX的含量,抑制氧化应激反应;最后氢水及地塞米松均可以减少TAO患者OFs内HA的含量。
[博士论文] 牟旆
眼科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)又名Graves眼病、甲状腺功能亢进突眼、内分泌眼病等,是graves病在甲状腺以外的表现,属于自身免疫性器官特异性疾病。大量研究认为,促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)和胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor1receptor,IGF-1R)是TAO的自身抗原,两者形成结构和功能的复合体,在TAO发病的分子机制中起至关重要的作用,但其余分子是否亦在TAO的病程中扮演重要角色,目前仍不清楚。本文第一部分采用第二代高通量测序中的转录组测序的方法,对甲状腺相关眼病患者和健康对照人群来源的眼眶脂肪结缔组织中的转录组信息进行提取和分析,探讨除TSHR和IGF-1R以外,其余可能参与TAO疾病发生发展的分子和信号通路。
  基于转录组测序分析结果,穿透素-3(Pentraxin-3,PTX3)在甲状腺相关眼病患者眼眶脂肪结缔组织中的表达高于健康对照组来源的眼眶脂肪结缔组织。PTX3属于长链穿透素家族,该家族还包括C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和血清P蛋白(serum amyloid P component,SAP)。在系统性红斑狼疮、多发性硬化等其他自身免疫性炎症性疾病中,PTX3在疾病极早期就有较高浓度表达,灵敏度高于CRP和SAP,且PTX3在血清中的表达值与疾病的严重程度呈正相关,对疾病的预后有重要的启示作用。本课题组在之前的研究中发现,甲状腺刺激激素(thyroid stimulating hormone,TSH)可以作用于纤维细胞(Fibrocytes,Fc),刺激其高表达PTX3,这种效应是通过增加PTX3的mRNA稳定性达到的,且可以被抗炎药物和抗IGF-1R药物所阻断。本文第二部分计划在转录组测序的基础上,取TAO患者和健康人来源的眼眶脂肪结缔组织和血清样本,比较不同来源的组织和血清中PTX3的表达差异,探讨PTX3作为TAO潜在生物学标志物的可能性。
  日前,一项多中心、双盲、平行随机对照的临床试验证实了抗IGF-1R抗体teprotumumab对于TAO治疗的有效性和安全性,改变了TAO目前治疗局限于对症治疗的窘境。但teprotumumab产生作用的分子机制仍在进一步探索中。本文第三部分计划采用teprotumumab处理共培养的纤维细胞和Th1细胞,并用PMA等抗原加以刺激,观察Ⅱ类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,classⅡ,MHCⅡ)和干扰素伽马(Interferon-γ,IFN-γ)的表达量变化等,了解teprotumumab对于纤维细胞抗原呈递作用和Th1细胞活化的影响及机制。
  方法:
  1.对纳入的对照组和病例组眼眶脂肪结缔组织进行mRNA质量检测;符合要求的样本各5例进一步采用RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)获得其转录组信息,得到原始数据Rawdata;
  2.对Rawdata进行基因表达定量和校正,得到两组间差异表达的基因Dif-gene;
  3.对Dif-gene进行基因本体分析(Gene Ontology Analysis,GO)和通路分析;
  4.根据得到的显著性GO条目,做功能树分析(GO-tree)。根据显著性信号通路做信号通路网络(Path-Act-Network)构建;
  5.选取表达丰度高、差异倍数有统计学意义的上调基因和下调基因各2个,在TAO患者和健康对照人群眼眶脂肪结缔组织上,通过Real-time PCR验证Dif-gene的差异表达。
  6.分别取TAO患者和健康对照人群眼眶脂肪结缔组织和其培养的成纤维细胞,通过Real-time PCR和免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)分别验证PTX3在细胞mRNA和蛋白层面的表达;
  7.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,通过酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测样本中PTX3蛋白的表达;
  8.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,在外周血纤维细胞培养环境中加/不加teprotumumab,通过Real-time PCR和流式细胞技术分别检测细胞表面MHCⅡ表达的变化;
  9.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,在外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)培养环境中加/不加teprotumumab,细胞成熟后用P/I抗体加以刺激,流式细胞技术检测Th1细胞内IFN-γ产量;
  10.收集上述样本培养过程中的培养液,ELISA检测加/不加teprotumumab时培养液中IFN-γ的表达量;
  11.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,在外周血单核细胞培养环境中加/不加teprotumumab,待细胞成熟后加入IFN-γ中和抗体,流式细胞技术检测纤维细胞表面MHCⅡ的表达。
  结果:
  1.TAO患者和健康对照人群来源的脂肪结缔组织,转录组测序得到的原始数据质量评分均大于20,mappedrate最低为0.895,最高为0.931。数据主要来源于外显子区域。转录组测序共得到784个差异表达基因;
  2.PTX3等445个基因在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中表达上调明显。CTHRC1等339个基因在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中表达下调明显。差异具有统计学意义;
  3.细胞因子和细胞因子受体相互作用、趋化因子等19条通路在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中上调明显;细胞粘附、细胞外基质受体等20条通路在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中下调明显;
  4.差异表达的基因和信号通路主要涉及以下功能:炎症反应、免疫反应、疤痕修复、T细胞调节等;PTX3基因主要参与炎症反应、免疫反应等生物学过程。
  5.在TAO患者来源的眼眶脂肪结缔组织中,PTX3在mRNA和蛋白水平表达均高于健康对照人群;
  6.PTX3在TAO患者来源的血液样本中,表达高于健康对照人群;但TAO活动期和稳定期表达无明显差异。
  7.无论是否有抗原刺激,teprotumumab均可降低外周血纤维细胞表面的MHCⅡ基因水平和蛋白水平的表达。且这种效应在TAO患者和健康对照人群来源的外周血纤维细胞中均可观测到;
  8.Teprotumumab可明显降低Th1细胞内的IFN-γ水平,无论细胞来源于TAO患者或健康对照人群;
  9.Teprotumumab可明显降低细胞培养液中IFN-γ的蛋白水平,无论细胞来源于TAO患者或健康对照人群;
  10.当加入IFN-γ中和抗体处理后,外周血纤维细胞表面MHCⅡ的表达明显降低,且这种效应在TAO患者和健康对照人群来源的外周血纤维细胞中均可观测到。
  结论:
  1.PTX3等基因可能与TAO的发生和进展过程相关。细胞因子和细胞因子受体相互作用、趋化因子通路可能参与了TAO的病理过程;TAO患者的炎症反应、免疫反应、疤痕修复、T细胞免疫活性等生物学过程增强。多种炎症相关基因和自身免疫相关基因在TAO患者来源的眼眶脂肪结缔组织中表达升高,再次证实TAO与自身免疫、炎症的相关性;
  2.炎性分子PTX3在TAO患者的眼眶脂肪结缔组织和血液中表达均增高,可能涉及了TAO的炎性进展过程,PTX3可能是TAO病程诊断和预后的潜在生物学标志;
  3.Th1细胞通过分泌IFN-γ,刺激纤维细胞表面MHCⅡ分子的表达,teprotumumab可减少Th1细胞分泌的IFN-γ并减弱纤维细胞表面MHCⅡ分子的表达;
  4.Teprotumumab可减弱抗原刺激时Th1细胞的活化效应,并减弱纤维细胞的抗原呈递作用,这种效应在TAO患者和健康对照人群来源的外周血纤维细胞中没有明显差异。说明teprotumumab有效治疗TAO的机制,一部分可能是通过减弱Th1细胞和纤维细胞对自身抗体的免疫效应来实现的。
[博士论文] 董一
眼科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  第一部分 年龄相关性黄斑变性患者与健康人基因表达谱差异分析
  目的:
  通过对年龄相关性黄斑变性患者与健康人基因表达谱的差异性分析,得出可能与AMD发病相关的基因,并进行功能学分析。
  方法:
  基于NCBI GEO数据库中已发表的基因表达谱芯片数据进行整合分析,原始芯片数据来源GEO数据库收录的GSE76237与GSE29801表达谱芯片数据。其中GSE76237包含14例年龄相关性黄斑变性病人与15例健康正常人的单核细胞,采用Affymetrix Gene1.0 ST芯片进行表达谱分析;GSE29801包含177例年龄相关性黄斑变性患者捐赠者视网膜-脉络膜组织样本与118例没有眼部疾病的捐赠者的视网膜-脉络膜组织样本,采用Agilent-014850 Whole Human GenomeMicroarray4x44K G4112F表达谱芯片进行检测。本次分析分别从全血单核细胞表达谱芯片与病变组织样本表达谱芯片两个角度进行数据整合分析,数据分析方法包括:1、芯片数据归一化分析:Bioconductor limma package;2、差异基因分析:Bioconductor limma package;3、GO与KEGG功能富集分析:WEB-basedGene Set Analysis Toolkit;4、绘图:R语言,得出差异性表达基因(Differentiallyexpressed genes,DEGs),并进行这些差异性表达基因的功能学分析。
  结果:
  1.通过对AMD患者与健康正常人全血单核细胞表达谱芯片进行生物信息学分析,按照差异倍数大于1.5以及矫正后的p值小于0.05进行差异性基因筛选,总共获得111个差异性表达基因,上调表达基因28个,下调表达基因83个。其中差异倍数大于2倍的差异性表达基因8个,上调表达2个,下调表达6个。
  2.AMD患者外周血单个核细胞差异表达基因基因本体学(Gene ontology,GO)功能富集分析结果显示,差异性表达基因参与的主要生物学功能包括白细胞活化、淋巴细胞活化、T细胞活化以及T细胞募集等。
  3.AMD患者外周血单个核细胞差异性表达基因KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes)富集分析结果显示,差异性表达的基因主要参与造血细胞、T细胞受体通路、Th1 and Th2细胞分化、Th17细胞分化以及原发性免疫缺陷等信号通路。
  结论:
  1.AMD患者和对照组之间外周血单个核细胞的基因表达谱具有显著差异,提示组织病变可能诱发机体的免疫反应,从而引起单个核细胞表达图谱的变化。但其变化呈现出渐进的趋势,提示衰老可能是参与AMD疾病发生发展的因素之一。
  2.AMD患者外周血单个核细胞差异性表达基因参与的主要生物学功能包括白细胞的活化、淋巴细胞的活化、T细胞的活化以及募集等,其主要参与的信号通路包括造血细胞、T细胞受体通路、Th1 and Th2细胞分化、Th17细胞分化以及原发性免疫缺陷等,这些均提示差异性表达基因可能与AMD患者的免疫反应密切相关。
  3.AMD患者其外周血单个核细胞基因表达谱特征的变化和组织基因表达谱特征的变化并不相同,这可能与AMD的发病激发了全身免疫系统,在单核细胞与病变组织上均有累及,但出现了不同的基因表达有关。
  第二部分 年龄相关性黄斑变性转录组研究
  目的:
  通过AMD患者与健康人转录组研究,发掘差异性表达基因对AMD发病和预后的影响机制,为寻找新的诊治靶点提供实验依据,为AMD诊断指标及预后指标的研究奠定实验基础。
  方法:
  根据本研究第一部分的结果,我们首先从应用生物信息学方法对GEO数据库来源的AMD外周血单个核细胞样本基因表达谱数据进行生信分析得出的差异性表达基因(DEGs)中筛选出8个差异性表达基因(包括TMEM176A、TMEM176B、ZEB2、LEF1、FCMR、MS4A1、CD3G和IL7R)。然后通过实时荧光定量PCR技术(Real-time qPCR),在包含有21例中国AMD患者外周血单个核细胞(PBMC)的实验组与15例中国健康人外周血单个核细胞(PBMC)的对照组样本中,对这些DEGs进行验证,得出差异性表达基因在中国AMD患者PBMC中的表达是否有差异,并进一步将实验组按照年龄、性别、治疗效果不同进行分组,分别进行实验验证及对比研究。
  结果:
  1.在这8个候选差异性表达基因中,共3个基因在验证样本中结果与数据挖掘结果相一致,TMEM176A、TMEM176B和ZEB2在AMD外周血单个核细胞(PBMCs)中显著上调表达(P=0.0000,0.0000,0.0000,P<0.001);另外5个候选DEGs在验证样本中的结果与数据挖掘结果并不一致,LEF1、MS4A1、CD3G、FCMR与IL7R在AMD患者PBMCs中表达显著上调(P=0.0000,0.0000,0.0000,0.0000,0.0000, P<0.001)。
  2.8个候选基因在AMD组不同性别病人PBMCs中的表达水平与健康正常人不同性别中的表达水平相比均存在显著差异,差异均具有统计学意义(P<0.01); TMEM176A、FCMR、CD3G、MS4A1、IL7R、ZEB2与LEF1基因表达水平在女性患者中高于男性患者,但两者之间比较差异无统计学意义(P>0.05); TMEM176B基因在男性患者中高于女性患者,两者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。这表明,与健康人相比较,8个候选基因表达水平在不同性别的患者外周血PBMCs中均存在显著差异,但与患者的性别无显著相关。
  结论:
  1.TMEM176A、TMEM176B、ZEB2、LEF1、FCMR、MS4A1、CD3G和IL7R在AMD患者外周血单个核细胞中存在显著差异性表达。这些差异表达基因其功能主要涉及膜受体及相关的信号传导,其编码的蛋白主要分布在细胞膜外侧,其参与的生物学过程主要涉及免疫反应及免疫细胞的分化。这些均提示AMD的发生发展与全身免疫反应密切相关。
  2.候选基因表达水平在不同性别的患者外周血PBMCs中与健康人比较均存在显著差异,但与患者的性别无显著相关。提示AMD的发生进展无明显性别差异。
  第三部分 抗VEGF药物玻璃体腔注射联合PDT治疗年龄相关性黄斑变性的疗效研究
  目的:
  寻找更加安全有效的AMD治疗方案,为新的AMD治疗方案的制定提供理论依据。
  方法:
  按照入选标准及排除标准选择2013年1月-2016年1月期间在郑州大学第一附属医院被诊断为年龄相关性黄斑变性的96例(192只眼睛)患者。按照治疗方案,患者被随机分成观察组和对照组,每组48例(96只眼睛)。对照组患者进行抗VEGF药物治疗,玻璃体腔注射0.5 mg/0.05 ml雷珠单抗,根据3+prn治疗方案,每月注射一次,连续注射3次后根据病情需要再追加注射。观察组患者进行抗VEGF药物联合PDT治疗方法,PDT治疗按照年龄相关性黄斑变性的多中心PDT治疗研究(Treatment of age-related macular degeneration withphotodynamic therapy,TAP)的方法进行,维替泊芬用量为TAP方法计算量6mg/m2,激波长689nm,光辐照度600 mw/ cm2,能量50 J/cm2,照射时间83 S。在PDT治疗后3天内行玻璃体腔注射0.5 mg/0.05 ml雷珠单抗。治疗前和治疗后1周-6月分别检测最佳矫正视力、眼部血流动力学改变、黄斑中心凹厚度(CFT)及视野参数。采用SPSS23.0统计软件分析本研究的数据。
  结果:
  1.治疗后两组患者最佳矫正视力均缓慢上升。术后1周-6个月内,观察组患者最佳矫正视力明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);观察组患者视力提高的比例高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
  2.治疗后6个月内彩色多普勒超声检查显示,观察组患者睫状后短动脉(PCA)的最大收缩期血流速度(PSV)和舒张末期血流速度(EDV)值高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组患者动脉阻力指数(RI)和脉动指数(PI)值低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  1.抗VEGF药物联合PDT疗法能够明显提高治疗后最佳矫正视力,治疗后提高视力的比率明显增高,治疗AMD效果明显。
  2.抗VEGF药物联合PDT疗法能够改善PCA血流动力学参数,血液供应改善能减轻黄斑中心的水肿,降低中心凹厚度(CFT)值,减少视野缺损,具有较高的临床应用价值。
  3.抗VEGF药物联合PDT疗法在抑制新血管形成和保护视力的前提下,玻璃体腔注射次数减少,眼部并发症的发生几率降低,但联合治疗方案是否能减少行再次雷珠单抗玻璃体腔注射治疗(IVR)的次数尚不能完全定论,有待于进一步的研究。
[硕士论文] 郭起峰
神经病学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  对比血清水通道蛋白4抗体阳性视神经炎(optic neuritis with aquaporin-4antibodies seropositive,AQP4ab+ON)、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)、血清水通道蛋白4抗体阴性视神经炎(optic neuritis with aquaporin-4antibodies seronegative,AQP4ab-ON)、血清髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体阳性视神经炎(optic neuritis with myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies seropositive,MOGab+ON)患者的视盘区平均、上、下、鼻、颞侧象限的视网膜神经纤维层厚度(peripapillary retinal nerve fibre layer thickness,pRNFLT)、黄斑容积体积(cube macular volume,CMV)、黄斑容积平均厚度(cube average macular thickness,CAMT)的改变特点,并探讨导致平均pRNFLT、CMV、CAMT改变的影响因素。
  研究方法:
  临床确诊的AQP4ab+ON组40例、NMO组40例、AQP4ab-ON组41例和同期与患者无血缘关系的性别、年龄相匹配的健康对照组(healthy controls,HCs)21例纳入研究。其中AQP4ab-ON组内有14例患者血清MOG抗体阳性,定义为MOGab+ON组,6例血清MOG抗体阴性,定义为MOGab-ON组(optic neuritis with myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies seronegative,MOGab-ON),并进行亚组分析。采用高清、频域光学相关断层扫描(optical coherence tomography,OCT)(Cirrus HD-OCT)行视盘及黄斑区扫描。收集所有受试者的平均、上、下、鼻、颞侧象限pRNFLT、CMV、CAMT数据并进行分析。
  研究结果:
  1、一般临床资料:
  ①一般人口学资料:AQP4ab+ON组、NMO组和AQP4ab-ON组均好发于中青年女性,首次发病年龄AQP4ab+ON组(40.48±15.13岁)较NMO组(33.45±16.50岁)和AQP4ab-ON组(33.29±16.24岁)晚,三组间差异无统计学意义(P=0.269)。
  ②达峰期和缓解期最佳矫正视力(best corrected visual acuity,BCVA)、达峰期和缓解期视觉状态评分NMO组均为最高,AQP4ab+ON组其次,AQP4ab-ON组最低,三组间差异有统计学意义(P<0.05)。
  ③NMO组ON发作次数最多,AQP4ab+ON组其次,AQP4ab-ON组最少,三组差异有统计学意义(P=0.02)。
  ④NMO组病程最长[平均50.50月(5.67-180.83月)],AQP4ab+ON组其次[平均14.03月(5.67-277.30月)],AQP4ab-ON组最短[平均7.80月(5.50-140.07月)],三组间差异有统计学意义(P=0.000)。
  2、血清AQP4抗体检测:AQP4ab+ON组阳性率100%(40/40),NMO组阳性率80%(32/40),AQP4ab-ON组阳性率0%(0/41)。
  3、血清MOG抗体检测:AQP4ab+ON组阳性率为0%(0/6),NMO组阳性率为0%(0/10),AQP4ab-ON组阳性率为70%(14/20)。
  4、其他自身免疫抗体检测:AQP4ab+ON组阳性率52.5%(21/40),NMO组50.0%(20/40),AQP4ab-ON组17.1%(7/41)。AQP4ab+ON组合并桥本氏甲状腺炎2例,合并干燥综合征3例;NMO组合并桥本氏甲状腺炎3例;AQP4ab-ON组合并抗心磷脂抗体综合征1例。与AQP4ab-ON组比较,AQP4ab+ON组与NMO组合并其他自身免疫抗体多,差异有统计学意义(P=0.001,0.002)。
  5、影像学检查:①视神经MRI长T2信号:AQP4ab+ON组阳性率90.0%(36/40),NMO组92.5%(37/40),AQP4ab-ON组78.0%(32/41),三组间差异无统计学意义(P=0.121);②视神经强化:AQP4ab+ON组阳性率45.0%(18/40),NMO组47.5%(19/40),AQP4ab-ON组43.9%(18/41),三组间差异无统计学意义(P=0.946)。
  6、AQP4ab+ON组、NMO组和AQP4ab-ON组患眼OCT对比:
  ①与HCs组比较,AQP4ab+ON组、NMO组和AQP4ab-ON组的平均、上、下、鼻、颞侧象限的pRNFLT、CMV、CAMT均显著减少,差异有统计学意义(P<0.0083)。
  ②与AQP4ab-ON组比较,AQP4ab+ON组和NMO组除颞侧象限外,平均、上、下、鼻侧象限的pRNFLT、CMV、CAMT均显著减少,差异有统计学意义(P<0.0083)。
  ③与AQP4ab+ON组比较,NMO组的平均、上、下、鼻、颞侧象限pRNFLT均减少,但差异无统计学意义(P>0.0083)。
  7、MOGab+ON组与MOGab-ON组患眼OCT对比:
  ①与HCs组比较,MOGab+ON组除鼻侧象限外,平均、上、下、颞侧象限pRNFLT、CMV、CAMT均显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。
  ②与MOGab+ON组比较,MOGab-ON组的上侧象限pRNFLT减少,差异有统计学意义(P<0.05),两组间性别、首次发病年龄、病程、ON发作次数比较无统计学差异(P>0.05)。
  8、AQP4ab+ON组与MOGab+ON组患眼OCT对比:
  与MOGab+ON组比较,AQP4ab+ON组除颞侧象限外,平均、上、下、鼻侧象限pRNFLT、CMV、CAMT均显著减少,差异有统计学意义(P<0.01),尽管两组间性别、ON发作次数无统计学差异(P>0.05)。
  9、单因素分析发现,血清AQP4抗体阳性、病程、ON发作次数分别对平均pRNFLT减少有显著影响,血清AQP4抗体阳性对CMV和CAMT减少有显著影响,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素分析发现:
  ①血清AQP4抗体阳性和ON发作次数是影响平均pRNFLT减少的独立危险因素,其中血清AQP4抗体阳性(OR=3.475>1)、ON发作次数(OR=1.584>1)与平均pRNFLT减少呈正相关。血清AQP4抗体阳性的ON导致平均pRNFLT减少的风险是血清AQP4抗体阴性的ON的3.475倍,差异有统计学意义(P<0.05)。
  ②血清AQP4抗体阳性是影响CMV减少的独立危险因素,血清AQP4抗体阳性(OR=3.704>1)与CMV减少呈正相关。血清AQP4抗体阳性的ON导致CMV减少的风险是血清AQP4抗体阴性的ON的3.704倍,差异有统计学意义(P<0.05)。
  ③血清AQP4抗体阳性是影响CAMT减少的独立危险因素,血清AQP4抗体阳性(OR=3.604>1)与CAMT减少呈正相关。血清AQP4抗体阳性的ON导致CAMT减少的风险是血清AQP4抗体阴性的ON的3.604倍,差异有统计学意义(P<0.05)。
  研究结论:
  1、AQP4ab+ON与NMO对视盘视网膜神经纤维层和黄斑结构损伤高度相似,均导致视盘区总的平均视网膜神经纤维厚度、黄斑容积体积、黄斑容积平均厚度显著减少,并且优先累及视盘上、下、鼻侧视网膜神经纤维层,这些特点可能与AQP4抗体的表达分布有关。
  2、MOGab+ON的视盘视网膜神经纤维层厚度、黄斑容积体积、黄斑容积平均厚度较正常健康人显著减少,与MOGab-ON比较变化不显著,但比AQP4ab+ON与NMO损伤程度轻,提示MOG抗体对视盘和黄斑结构损伤较AQP4抗体轻,这些特点可能进一步证实MOG抗体与AQP4抗体存在不同的病理生理和致病机制。
  3、多因素分析不同临床因素对视盘区总的平均视网膜神经纤维层厚度、黄斑容积体积、黄斑容积平均厚度的影响发现,血清AQP4抗体阳性、ON发作次数与视盘区总的平均视网膜神经纤维厚度减少呈正相关,血清AQP4抗体阳性与CMV和CAMT减少呈正相关,说明AQP4抗体对视盘区视网膜神经纤维层和黄斑结构损伤存在主要影响。
[博士论文] 王圣霞
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:年龄相关性白内障(age-related cataract,ARC)的数量及手术量将会继续大幅增加,在这样的背景下,我们在关注手术量的同时,也应该关注手术质量及手术后恢复,从而更好的提高患者术后视觉质量,进而提高患者的生活质量。
  手术摘除混浊的晶状体并植入人工晶体是对ARC唯一有效的治疗手段。
  除此之外,视力是目前我们最常用的手术指征和术后恢复的评价手段,然而视力表视力只是高对比敏感度下黄斑区视功能的体现,不能全面的反应患者日常活动需要的视功能。近年来,由患者报告效果(patient-reported outcome,PRO)的量表评估手段在临床上有越来越多的应用。由于患者报告自身状态改变比医生检查更敏感,因此PRO是对临床治疗效果的有效补充,在临床研究中愈受重视。尤其是近年来出现的经Rasch分析模型验证的量表是一种较好的评价方式。但是,面对目前国际上众多的此类白内障量表,如何选择一个适合我国北方病人、敏感高效的量表仍是一个值得关注的课题。在这一领域,Catquest-8SF中文版量表已被证明对我国南方白内障病人有较好的适用性,但对北方病人的适用性尚有待研究。
  综上所述,我国ARC患者数量众多,PHACO+SIOL植入术手术量巨大,若能通过关注其临床评价和患者报告的手术质量和手术效果,从而进一步提高ARC患者视觉质量和生活质量,会有较好的现实意义。
  研究目的:
  1.评估PHACO+SIOL植入术的临床效果,主要是通过客观观察视力恢复情况及手术并发症的发生率,评估视力恢复的影响因素,讨论手术并发症的危害及预防;2.应用Catquest-8SF量表研究PHACO+SIOL植入术的患者主观报告的效果,评估Catquest-8SF量表在中国北方白内障人群的适用性及其对白内障手术的敏感性;3.评估患者对PHACO+SIOL植入术的满意度及其影响因素。通过以上三个方面的研究,以期全面评价PHACO+SIOL植入术的手术质量和效果,对ARC患者的术后恢复做出更好的临床指导,提高ARC患者术后的视觉质量,进而提升其生活质量。
  研究方法:
  1.病例选择
  2.术前检查及处理
  3.手术方法
  术前30min散瞳3次。患者取平卧位,表面麻醉;常规消毒铺巾;开睑器撑开眼睑;2点位角膜缘行15°刀穿刺,前房注入玻璃酸钠;10点位角膜缘行3mm透明角膜主切口,5.5mm-6mm直径连续环形撕囊,水分离,水分层,拦截劈核并予以超声乳化吸除,灌注抽吸皮质;再次以玻璃酸钠形成前房,植入人工晶体;灌注抽吸玻璃酸钠,水密主切口及侧切口。术毕敷贴包扎术眼。
  4.术后处理及随访
  5.研究工具
  本研究主要采用中文版Catquest-8SF量表,首先评价该量表在我国北方ARC术前人群的适用性;其次考察该量表对北方ARC手术人群的敏感性。中文版Catquest-8SF量表包括总体评价子表和日常活动子表,共有8个条目。另外,本研究设计了相关的随访表,记录患者性别、年龄、伴随疾病、文化程度等基本资料;记录患者术前、术后恢复过程中是否存在眼部疼痛等主观症状以及术中眼痛程度;并在术后3个月随访时记录手术效果是否达到了患者预期和患者对手术整体的满意度。
  研究结果:
  1.第一部分研究病例的临床特点
  第一部分中完成1个月随访纳入研究的共840人1063例PHACO+SIOL植入术,平均年龄67.8(±10.5)岁,女性占56.9%。在这些病人中,分别有32.9%合并高血压,22.1%合并糖尿病,23.6%合并心脑血管疾病等其它全身疾病。23.2%术眼有眼部合并症,14.9%手术为复杂手术。
  2.手术后视力恢复情况
  1063例PHACO+SIOL植入术中,术后91.8%PVA≥0.3。93.3%术后视力提高,5.1%视力无变化,1.6%视力下降。术前logMAR视力平均1.12(±0.70),术后logMAR视力平均0.30(±0.35),两者相比术后视力显著提高(P<0.001)。其中男性94.0%PVA≥0.3,女性90.2%PVA≥0.3,两者比较差异有统计学意义(P<o.oo1)。无眼部合并症者98.5%PVA≥0.3,有眼部合并症者69.2%术后PVA≥0.3,两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。80岁以上高龄患者143例,其中83.2%的患者术后PVA≥0.3。
  3.手术并发症
  本研究中观察到的手术并发症有:术中后囊膜破裂共13例,其发生率占总手术量的1.22%;术中虹膜松弛综合征共14例,其发生率占总手术量的1.32%;术后角膜水肿,后弹力层皱褶明显,需加用高渗糖点眼的患者共49例,其发生率占总手术量的4.6%;术后当天及术后第一天眼压>30mmHg的患者共37例,其发生率占总手术量的3.5%;前房纤维素性渗出7例,其发生率占总手术量的0.66%;前房内晶状体皮质残余5例,发生率为0.47%;术后急性眼内炎仅1例,发生率为0.094%;门诊随访至1个月时发现术后出现的黄斑囊样水肿6例,占0.6%;随访2年半以上,因后发性白内障实施Nd:YAG激光后囊膜切开治疗的手术眼共166例,占总手术量的15.6%。
  4.术后低视力病因分析及其危险因素
  本研究纳入的1063例PHACO+SIOL植入术中,术后87例(8.2%)PVA<0.3。内有84例为眼部合并症导致,占总数的96.6%;有3例(3.4%)为手术并发症(后囊膜破裂)导致的低视力。本研究发现,低视力病因前三位的是糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)、老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,ARMD)和青光眼,三者占总数的71.2%。本研究对术后低视力危险因素进一步行logistic回归分析,结果显示:DR、ARMD、弱视、玻璃体切除术后、角膜中央斑翳、高度近视及青光眼这些眼部合并症,高龄和术后角膜水肿是术后低视力显著的危险因素(P<0.05);性别和后囊膜破裂也是可能的危险因素(P值分别为0.06和0.08)。
  5.中文版Catquest-8SF量表信度和效度分析
  中文版白内障视功能相关生活质量量表,简称为Catquest-8SF量表,各条目得分与总分呈正相关(r:0.482~0.733);总表、日常活动子表和总体评价子表的Cronbachα系数分别为0.861、0.853、0.748。删除C8之外任一项目后,Cronbach'sα系数均下降。
  6.中文版Catquest-8SF量表得分的影响因素
  术前Catquest-8SF量表得分与术前双眼加权logMAR视力及年龄呈显著负相关(P<0.05),即术前双眼加权视力越好、越年轻的患者量表得分越高。文化程度越高的患者术前量表得分越高(P<0.001),无全身合并症的患者量表得分高于有全身合并症的患者,差异有统计学意义(P<0.05),不同性别、有或无眼部合并症的患者量表得分差异无统计学意义(P>0.05)。
  7.术前、术后眼部不适及术中疼痛等级
  102名患者手术全部在表面麻醉下完成。16.7%患者术前有眼痛等不适症状;32.4%术后有眼痛等不适症状;术中出现眼痛的53例,其中轻度眼痛51例,占50.0%,中度眼痛2例,占1.96%,术中无难以忍受的剧烈眼痛出现。
  8.总体满意度
  总体满意度包括患者对白内障术前检查及沟通、手术过程以及术后护理和恢复整体上的满意度。按照术后“非常满意”和“满意”统计,满意度为92.2%。90.2%的患者认为“手术治疗效果达到预期”,其满意度均为“非常满意”或“满意”。
  研究结论:
  1.PHACO+SIOL植入术治疗ARC安全且临床效果好。患者术后视力显著提高,男性患者视力提高较女性明显。术后低视力危险因素包括DR、ARMD、青光眼等眼部合并症、术后角膜水肿和高龄,但眼部合并症及高龄并非手术的禁忌症。术中出现后囊膜破裂的患者术后低视力可能性较大,因此术中并发症及时妥善的处理尤为重要。Meta分析发现,PHACO+SIOL植入术可加速DR进展并增加DME发生率,因此临床上应加强术后随访,必要时给予适当的干预。
  2.中文版Catquest-8SF量表在我国北方ARC人群中适用性好,对白内障手术敏感,加之简短高效,可以作为白内障常规临床评估的一部分。研究发现量表得分提高值与视力的提高显著相关,但量表得分与视力并非总是一致;双眼手术能更好的提高患者的视功能,单眼手术对视功能相关生活质量的提升效果和双眼手术相似。这些提示我们,对日常活动较多的患者可以考虑尽早手术,而高龄或合并严重系统性疾病的患者单眼手术即可满足其生活需要,应针对其个体情况综合考虑,从而制定出更为合理的治疗方案。
  3.患者总体满意度比较高。患者满意度与术后量表总分提高值显著相关,而与术后视力提高值无显著相关,这提示我们量表研究对于临床工作的重要性,患者最看重的是术后视功能相关生活质量的提高;满意度还与患者对手术的预期有关,提示我们要重视术前与患者的沟通,如可借助多媒体等手段,并根据患者个体情况进行充分沟通,使患者对手术有足够的了解和恰当的预期,从而提高患者满意度。
[博士论文] 王佃科
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:青光眼由于眼压增高而引起视盘(曾称视乳头)凹陷、视野缺损,最终可以导致失明的严重眼病。microRNA在青光眼的发生发展的过程中发挥着重要调节作用,譬如miR-29家族,miR-204,miR-24,以及miR-184。miR-184最早由Lagos-Quintana等在小鼠心脏和小脑中发现,定位在9号染色体上, miR-184在局部缺血性疾病对血管新生具有显著的调节作用,通过与其靶标VEGF和IGF-2结合,抑制VEGF和IGF-2表达,从而减少新生血管的生成。miR-184在舌鳞状细胞癌、恶性胶质瘤等多种肿瘤的发生发展过程中也发挥着重要的作用。
  有研究表明miR-184能够通过调控Akt信号通路,TNF-α信号通路,以及VEGF实现对血管生成能力的调控。已经有学者发现在很多视力障碍的患者体内均存在miR-184表达水平降低的现象。圆锥角膜患者的角膜及小梁网组织相比于睫状体及视网膜组织中miR-184表达水平较高,这表明miR-184可能在预防视神经疾病的过程中发挥着重要作用。氧化应激损伤引发细胞凋亡进而诱导视觉神经组织的损伤,是青光眼、白内障、老年性黄斑变性等疾病的主要诱因之一。我们通过体外培养人小梁网细胞,并模拟氧化应激损伤,探究miR-184调控人小梁网细胞生长、凋亡及氧化应激所致细胞毒性的分子机制,为早日发现治疗青光眼的治疗靶点提供理论基础。
  第一部分 慢性氧化应激条件下人小梁网细胞中miR-184水平变化
  目的:
  探讨慢性氧化应激条件下人小梁网细胞中miR-184水平变化情况。
  方法:
  在体外分离培养人小梁网细胞,将人小梁网细胞在40%氧气,5%二氧化碳的环境中培养五天,在体外模拟慢性氧化应激环境。探究相比于正常培养条件下的人小梁网细胞,慢性氧化应激刺激的条件下miR-184的表达水平差异。
  结果:
  1.在正常培养条件下及慢性氧化应激条件下的人小梁网细胞的形态无明显差别。
  2.在慢性氧化应激条件下人小梁网细胞中miR-184水平相比于正常培养条件下人小梁网细胞中miR-184水平有十分显著的下降,且结果具有统计学差异(p<0.05)。
  3.慢性氧化应激条件下,转染miR-184的模拟剂,相比于阴性对照组,人小梁网细胞中的miR-184表达水平显著上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);转染miR-184的抑制剂,相比于抑制剂阴性对照组,人小梁网细胞中的miR-184表达水平显著下降,且结果具有统计学差异(p<0.05)。
  结论:
  在慢性氧化应激条件下,人小梁网细胞中miR-184水平显著下降,miR-184对人小梁网细胞具有重要的调控作用。
  第二部分 miR-184在氧化应激条件下对人源小梁细胞的生长、凋亡、细胞毒性的影响
  目的:
  探讨氧化应激条件下miR-184对人小梁网细胞生长、凋亡及细胞毒性的调控作用。
  方法:
  为了更好体现实验的重复性和科学性,在体外分离培养来源于两个不同个体的人小梁网细胞,将人小梁网细胞在40%氧气,5%二氧化碳的环境中培养五天,存体外模拟慢性氧化应激环境,探究在氧化应激条件下,人小梁网细胞的凋亡水平,细胞毒性及细胞外基质成分变化。使用miR-184的模拟剂及抑制剂探究miR-184对人小梁网细胞凋亡水平,细胞毒性及细胞外基质成分的影响。统计学分析:采用SPSS19.0统计学软件(SPSS Inc.,USA)进行统计学分析,所有数据采用平均值±SD值表示。两组间比较采用t检验,三组及以上采用单因素方差分析,检验水准设置为0.05,当P<0.05时两组间差异具有统计学意义。使用Graphpad Prism6.0(GraphPad Software Inc,La Jolla,CA)软件作图分析。
  结果:
  1.两株人小梁网细胞系在慢性氧化应激条件下,相比于正常条件下的人小梁网细胞,细胞毒性均有显著的上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在小梁网细胞中表达miR-184的模拟剂能够显著抑制由慢性氧化应激条件引起的细胞毒性上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在人小梁网细胞中表达miR-184的抑制剂,能够显著的提高人小梁网细胞的细胞毒性,且结果具有统计学差异(p<0.05)。
  2.两株人小梁网细胞系在慢性氧化应激条件下,相比于正常条件下的人小梁网细胞,细胞早期凋亡水平均有显著的上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在小梁网细胞中表达miR-184的模拟剂能够显著抑制由慢性氧化应激条件引起的早期凋亡水平上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在人小梁网细胞中表达miR-184的抑制剂,能够显著的提高人小梁网细胞的早期凋亡水平,且结果具有统计学差异(p<0.05).
  3.过表达miR-184模拟剂,凋亡相关蛋白Bax蛋白、剪切形式的Caspase-3的蛋白及mRNA表达水平均显著下降,且结果具有统计学差异(p<0.05);转染miR-184抑制剂,凋亡相关蛋白Bax蛋白、剪切形式的Caspase-3的蛋白及mRNA表达水平均显著上升,且结果具有统计学差异(p<0.05)。
  4.在人小梁网细胞中慢性氧化应激条件下,相比于正常条件下的人小梁网细胞,细胞外基质蛋白COL1A1蛋白,COL1A2蛋白,COL3A1蛋白,COL5A1蛋白,SPARC蛋白的mRNA及蛋白表达水平均显著上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在小梁网细胞中表达miR-184的模拟剂能够显著抑制由慢性氧化应激条件引起的细胞外基质蛋白(COL1A1蛋白,COL1A2蛋白,COL3A1蛋白,COL5A1蛋白,SPARC蛋白)表达水平上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在人小梁网细胞中表达miR-184的抑制剂,能够显著的提高人小梁网细胞的细胞外基质蛋白(COL1A1蛋白,COL1A2蛋白,COL3A1蛋白, COL5A1蛋白,SPARC蛋白)表达水平,且结果具有统计学差异(p<0.05).
  结论:
  氧化应激条件下miR-184对人小梁网细胞生长、凋亡及细胞毒性具有调控作用。
  第三部分 miR-184通过作用于HIF1α实现在氧化应激条件下对人源小梁细胞的生长、凋亡、细胞毒性的调控
  目的:
  研究在氧化应激条件下miR-184通过调控HIF-1a实现对人小梁网细胞的细胞凋亡、毒性及细胞外基质蛋白表达水平调控情况。
  方法:
  在体外分离培养人小梁网细胞,将人小梁网细胞在40%氧气,5%二氧化碳的环境中培养五天,在体外模拟慢性氧化应激环境。探究相比于正常培养条件下与慢性氧化应激刺激的条件下人小梁网细胞miR-184的表达水平差异。并探究在氧化应激条件下,人小梁网细胞的凋亡水平,细胞毒性及细胞外基质成分变化。使用miR-184的模拟物及抑制剂探究miR-184对人小梁网细胞凋亡水平,细胞毒性及细胞外基质成分的影响。我们接下来发现miR-184可以直接结合HIF1α的启动子区域实现对HIF1α的抑制,并通过HIF1α实现了对人小梁网细胞的凋亡水平,细胞毒性及细胞外基质成分改变的调控。
  结果:
  1.使用http://www.targetscan.org/vert_71/)对miR-184结合HIF1-a mRNA的3' UTR结合位点进行预测。
  2.转染miR-184的模拟剂后,能够显著地抑制HIF-1a3' UTR的荧光报告酶活力,且结果具有统计学差异(p<0.05)。这表明miR-184可以结合HIF-1a的3' UTR,并抑制HIF1a的表达。而突变掉预测结合位点后,转染miR-184的模拟剂后,对HIF-1a3' UTR的荧光报告酶活力无明显影响,这表明miR-184结合的HIF-1a3'UTR位点为之前预测的位点。
  3.在人小梁网细胞中转染miR-184模拟剂,能够显著地抑制HIF-1a mRNA表达水平及蛋白表达水平,且结果具有统计学差异(p<0.05)。在人小梁网细胞中转染miR-184抑制剂,能够显著地提高HIF-1a mRNA表达水平及蛋白表达水平,且结果具有统计学差异(p<0.05)。
  4.HIF-1a慢病毒knockdown质粒转染人小梁网细胞,免疫荧光及免疫分析化学检测结果显示:HIF-1a的表达水平显著降低。
  5.在氧化应激条件下,当转染miR-184的抑制剂,能够显著地促进由氧化应激引起的人小梁网细胞的细胞毒性的上升,当同时转染HIF-1a慢病毒knockdown质粒后,人小梁网细胞的细胞毒性有显著的下降。
  6.在氧化应激条件下,当转染miR-184的抑制剂,能够显著地促进由氧化应激引起的人小梁网细胞的细胞凋亡的上升,当同时转染HIF-1a慢病毒knockdown质粒后,人小梁网细胞的细胞凋亡有显著的下降。
  7.在氧化应激条件下,当转染miR-184的抑制剂,能够显著地促进由氧化应激引起的人小梁网细胞的细胞外基质蛋白表达水平的上升,当同时转染HIF-1a慢病毒knockdown质粒后,人小梁网细胞的细胞外基质蛋白表达水平有显著的下降。
  结论:
  氧化应激条件下miR-184能够通过抑制HIF-1α实现对人小梁网细胞生长、凋亡及细胞毒性的调控,miR-184可以作为治疗青光眼的潜在治疗靶点。
[博士论文] 魏淑芳
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:细菌性角膜炎是由细菌感染导致的角膜炎症,可引起角膜上皮缺损和基质坏死,是一种严重危害视力的眼部疾病。其中尤以金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌感染最常见、最严重。其治疗目前主要依靠局部滴用抗生素滴眼液,但是因受到多种外界因素以及滥用抗生素的影响,部分细菌发生变异而产生一定的耐药性,导致治疗效果不佳,Chang VS回顾分析了20年里葡萄球菌感染的角膜炎,发现耐药率达30.7%。对于迁延不愈的角膜溃疡,有人尝试结膜瓣或羊膜覆盖,但这会降低滴眼液的渗透性,必须在感染控制后才能做此手术。感染严重致角膜溶解时,只能行角膜移植手术治疗,但是角膜材料有限,且术后常会出现排斥反应或炎症复发,以至于相当一部分患者最终不得不进行眼球摘除术来根治。
  角膜交联术(CXL)是通过合适的光源照射激发核黄素产生活性氧族,诱导角膜胶原纤维的氨基之间发生光化学交联反应,从而增加了胶原纤维的机械强度和抵抗角膜扩张的能力,已广泛应用于角膜扩张病变,疗效肯定。2000年,Scnitzler E首次报道了CXL用于治疗角膜溃疡有效,之后大量的临床报道证实CXL是一种新的、有效的治疗感染性角膜炎的方法。相对于大多数抗生素只能从杀灭病原体一方面治疗角膜炎,CXL可以从消除病原体、增加角膜的抗酶活性以及减轻相关炎症反应三方面来治疗角膜溃疡,给角膜溃疡的治疗带来了新的曙光。波长270nm左右的紫外光B、370nm左右的紫外光A、445nm左右的蓝光同为核黄索的吸收峰,均可以激发核黄素产生交联反应。光线的穿透能力与其波长呈正比,波长越长,穿透力越强,370nm紫外光A仅能穿透300um的角膜,440nm蓝光介导的交联深度应该较370nm紫外光更深,而细菌性角膜炎时角膜均会水肿变厚,溃疡深度往往会超过300um,据此,设想440nm蓝光介导的交联治疗严重角膜溃疡的效果应该优于370nm紫外光A。1998年,Spoerl E等人报道了465nm蓝光联合核黄素诱导的CXL可以起到加固离体猪角膜的作用,2008年Iseli报道蓝光CXL可以增加巩膜胶原纤维的机械强度。但440nm蓝光联合核黄素诱导角膜交联治疗角膜溃疡尚未见报道。本文第一部分应用440nm蓝光联合核黄素对金黄色葡萄球菌感染的兔角膜溃疡进行了交联治疗,旨在观察验证其对细菌性角膜溃疡的治疗效果,并与370nm紫外光A进行比较,观察其疗效是否优于后者。第二部分初步观察了440nm蓝光核黄素交联治疗金葡菌角膜溃疡,是否对角膜内皮、视网膜、脉络膜等眼部组织有损害。
  第一部分 440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜炎的疗效研究
  目的:
  通过动物实验观察440nm蓝光核黄素角膜交联治疗金黄色葡萄球菌角膜溃疡的疗效,与空白对照组对比,观察其治疗是否有效;与370nm紫外光A联合核黄素角膜交联治疗组对比,观察其治疗效果是否优于后者。
  方法:
  1.实验设计:选取60只健康新西兰大白兔,右眼为实验眼,全麻后中央角膜浅基质层内注入0.1ml浓度为5×107cfu/ml金黄色葡萄球菌菌液,制作金黄色葡萄球菌感染的较严重的角膜溃疡模型,将造模成功的54只纳入研究,随机分为三组,每组18只。其中18眼行440nm波长蓝光核黄素角膜交联,18眼行370nm紫外光A核黄素角膜交联,另外18眼作为空白对照组,仅在另外两组行交联治疗的同时,给予一次刮除溃疡表面疏松坏死组织治疗。于交联后第1天、3天、7天、14天分别观察比较各组疗效。
  2.角膜交联方法:10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉,角膜测厚,确保最薄点大于400um。去除角膜中央直径9mm疏松溃疡组织及残存上皮,1g·L-1核黄素溶液滴角膜每4-5min1次,共30min。440nm蓝光和370nm紫外光A照射能量均为3mw·cm-2,照射直径均为9mm,工作距离50mm,照射角膜时间均为30分钟。
  3.观察指标:交联后1天、3天、7天、14天,观察眼部分泌物、结膜充血、前房积脓及角膜浸润情况,给予炎症评分并行统计学分析;分别给予角膜照相并利用Image J软件对溃疡面积进行比较分析;同时蘸取所有实验眼溃疡表面坏死组织或分泌物进行细菌培养。交联后1天、7天、14天共焦显微镜观察炎症细胞变化,各组分别摘取两实验眼角膜,制作切片,HE染色,光学显微镜下观察其病理组织学改变。
  结果:
  1.三组实验眼眼部炎症评分比较:CXL治疗前,三组实验眼眼部炎症评分无统计学差异(P=0.814,P>0.05)。CXL治疗后第1天、3天、7天、14天,三组眼部炎症评分的差异均有统计学意义(P=0.000、0.000、0.000、0.000,P<0.05),440组与对照组比较,差异均有统计学意义(P=0.001、0.000、0.000、0.000,P<0.05),370组与对照组比较,差异均有统计学意义(P=0.000、0.000、0.000、0.000,P<0.05),440组和370组比较均无统计学差异(P=0.557、0.567、0.488、0.537,P>0.05)。至观察结束,对照组所有实验眼均角膜穿孔。
  2.每组眼部炎症评分变化:440组五个时间点评分有统计学差异(P=0.000,P<0.05),呈下降趋势。370组四个时间点评分有统计学差异(P=0.002,P<0.05),也呈下降趋势。对照组四个时间点眼部炎症评分有统计学差异(P=0.000,P<0.05),呈上升趋势。
  3.三组实验眼角膜溃疡面积比较:角膜交联治疗前及治疗后第1天、第3天,三组角膜溃疡面积均无统计学差异(P>0.05,P=0.881、0.845、0.066);治疗后第7天、第14天,对照组角膜溃疡面积显著大于440组和370组(P<0.05,q=5.895、5.571),而440组和370组角膜溃疡面积无统计学差异(P>0.05,q=0.323、0.582)。
  4.三组实验眼细菌培养结果:CXL前三组兔眼细菌培养均为阳性。CXL后第1天、3天、7天、14天,440组和370组细菌培养均转为阴性,而对照组均为阳性。
  5.三组实验眼病理结果:CXL后第1天,病理切片三组均可见角膜上皮缺失,大量炎性细胞聚集达深基质;第7天,对照组形成角膜全层脓肿,但后弹力膜尚完整,370组和440组可见角膜上皮多层愈合,溃疡组织内见新生血管、大量炎细胞及少量纤维母细胞增生;第14天,对照组溃疡加重,形成全角膜脓肿,后弹力膜仅部分可见,几近穿孔,370组和440组角膜上皮多层愈合,基质内新生血管、瘢痕组织及纤维母细胞增生,炎性细胞较前减少。
  6.三组实验眼共焦显微镜结果:CXL后第1天,三组实验眼溃疡处基质层内均见大量炎性细胞,CXL后第7天,440组和370组实验眼基质层内仍见大量炎性细胞,但少于对照组实验眼。CXL后第14天,440组和370组实验眼基质层内炎性细胞较前减少,对照组仍见大量炎性细胞。
  结论:
  1.440nm蓝光核黄素角膜交联能有效控制金黄色葡萄球菌感染的角膜溃疡。
  2.440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡疗效与370nm紫外光A比较无显著差异。
  3.440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡的安全性、远期疗效有待进一步研究。
  4.440nm蓝光核黄素角膜交联有望成为难治性角膜溃疡的治疗方法。
  第二部分 440nm蓝光联合核黄素角膜交联治疗兔细菌性角膜炎的安全性研究
  目的:
  观察440nm蓝光核黄素角膜交联治疗兔细菌性角膜炎,对角膜内皮、视网膜、脉络膜、巩膜及视神经的影响,初步探讨其治疗细菌性角膜炎的毒副作用。
  方法:
  选取8只健康新西兰大白兔,浅基质法制作金黄色葡萄球菌角膜溃疡模型,每眼注射菌液0.08ml,余步骤同第一部分。24小时后造模成功,全麻下进行440nm蓝光核黄素角膜交联,步骤同第一部分。于交联治疗后第1天、第7天分别气栓处死4只兔子,摘取实验眼眼球,其中各两只放入4%多聚甲醛溶液中固定做病理切片,另四只眼球分别立即取下整个角膜,用锥兰一茜素红联合染色法对角膜内皮进行染色观察。
  结果:
  角膜交联后第1天,角膜内皮染色未见异常,视网膜、脉络膜、巩膜及视神经病理组织切片未见异常。角膜交联后第7天,角膜内皮染色未见异常,视网膜、脉络膜、巩膜及视神经病理组织切片未见异常。
  结论:
  440nm蓝光联合核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡安全性较好,未发现对角膜内皮、视网膜、脉络膜、巩膜、视神经造成组织学危害。
[硕士论文] 张鹏
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:婴儿眼球震颤综合征(INS),是一种病理性的眼球震颤症,常发于婴儿出生时或婴儿出生后的早期阶段,以往也被称先天性眼球震颤,其特点是眼球会发生往返性、节律性以及不自主性的共轭摆动现象,发病率在1/350-1/20000之间,常伴有弱视、斜视、侧视、斜颈等一系列的并发症。INS的治疗方法有多种,包括视光学治疗、药物疗法、生物反馈疗法和手术疗法。目前视光学治疗、药物疗法、生物反馈疗法已证实其安全有效,但研究也发现其疗效维持时间短暂,尤其是药物治疗需要长期重复用药,副作用较大,因此其应用也受到了一定的限制。目前研究发现手术治疗INS短期观察安全有效,但对其长期效果的观察报告较少,其有效性及安全性尚不明确。然而对于INS患者来讲,其长期效果更具有价值。本研究通过观察接受手术治疗并随访12个月以上的INS患者的有效性及安全性,为临床治疗INS提供临床指导。
  方法:回顾性病例研究。入选标准:经过筛选,30例符合标准的INS术后患者(自2013年1月至2015年12期间入住我院)被纳入研究,患者均行INS手术治疗且无术中并发症,并均随访观察12个月以上。其中男性患者18例,女性患者12例;伴有代偿头位患者20例,合并斜视患者17例,其中外斜视5例,共同性内斜视12例,平均斜视度22.3±6.8PD;年龄范围在4-7岁之间,平均5.2岁。所有患者均进行术前全而检查,检查内容包括:眼病史及其他疾病史、眼部的常规检查、代偿头位、眼位检查,头正位及代偿头位下单眼及双眼的最佳矫正视力、屈光状态检查、斜视角测量、头位扭转角测量、眼球震颤频率、眼球震颤幅度检查。本次研究所有患者的手术方式均采用Hertle总结归纳的九种手术方式,根据INS患者的不同情况,是否合并斜视、代偿头位、集合阻滞选择以下手术方式:反转运动代偿机制INS患者,主要治疗方式为矫正AHP。并存斜视的INS患者,联合斜视手术进行治疗;集合阻滞代偿机制INS患者,主要的治疗方法为人工眼位散开术(ADS);无代偿机制INS患者,主要治疗手段为双眼四条直肌断腱重缝术。对患者术后1月、2月、4月、6月、9月及12月进行随访观察。对患者完整的手术资判进行整理,观察指标主要包括:双眼最佳矫正视力、代偿头位、眼位、眼球震颤的频率及幅度。视力判断标准:术后视力增加2行视为有效;头位判断标准:代偿头位消失为治愈,标准代偿头位小于等于15°为改善,代偿头位大于15。为治疗无效;眼位判断标准:第一眼位的斜视度在10PD以内的视为眼位正位;并将术后眼球震颤情况(眼球震颤频率、眼球震颤幅度)与术前相比。
  结果:(1)30例INS患者中,术后1月双眼最佳矫正视力增加了2行及以上的患者有23例(76.7%),并在随后的随访期间,均处于稳定状态;(2)17例存在斜视的患者中,术后1月平均斜视度3.4±2.7PD;正位者17例(100%)。在12个月的随访期间,患者的斜视度处于稳定状态,未出现复发现象;(3)20例存在头位代偿机制的患者中,代偿头位消失的患者有14例(70.0%),术后得到显著改善的患者(代偿头位小于等于15°)的患者有6例(30.0%),且术后患者的头位代偿情况于良好的稳定状态,远期疗效显著且稳定;(4)所有患者术后的眼球震颤情况(眼球震颤频率、眼球震颤幅度)均发生了显著减弱。12个月的随访期间的疗效显著且稳定,具有较好的远期治疗效果。无一例出现严重并发症。
  结论:手术治疗INS不仅能够显著提高患者的视力,显著改善患者的斜视度和AHP,显著减弱患者的眼球震颤频率、眼球震颤幅度,还具有稳定的远期疗效,且安全性较好。
[博士论文] 李秀云
内科学(内分泌与代谢病) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨玻璃体腔注射康柏西普及术中应用低分子肝素辅助玻璃体切割手术治疗增殖性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)的长期疗效。
  方法:回顾性研究分析2013年12月至2017年10月在我科住院并确诊为PDR的患者295例(310眼),均由2型糖尿病引起,根据患者意愿随机分为单纯玻璃体切割组(A组,对照组,101例,109眼)、康柏西普注射联合玻璃体切割组(B组,115例,117眼)和康柏西普注射+低分子肝素灌注联合玻璃体切割组(C组,79例,84眼)。A组单纯行玻璃体切割手术,B组和C组玻璃体腔内注射康柏西普注射液0.5mg,注射后5~7d行玻璃体切割术手术,C组行玻璃体切割手术时在灌注液内加入低分子肝素钠(1000IU/L)。比较三组患者一般资料情况、术后长期最佳矫正视力(best corrected visual acuity,BCVA)、玻璃体切割手术时间、术中出血情况、医源性裂孔数目、硅油填充率、术后并发症情况(玻璃体再出血、视网膜前膜、高眼压和新生血管性青光眼)及注射康柏西普后玻璃体内VEGF含量变化。
  结果:1.A、B、C三组患者入院检查的一般资料比较:性别、年龄、糖尿病病史、入院BCVA、入院眼压比较差异均无统计学意义,具有可比性。
  2.B、C组患者能看清眼底者130眼,玻璃体腔注射康柏西普后第1天视网膜新生血管均明显萎缩变细,第3天视网膜新生血管均明显消退,较粗大的新生血管变细,萎缩变白线,未牵拉部位视网膜水肿明显减轻,第5~7天,视网膜新生血管变的不明显,较粗大的新生血管萎缩变白,较薄的纤维增殖膜出现收缩;不能看清眼底者71眼,15眼(21.1%)从第3天开始玻璃体积血开始吸收,明显减少、变淡。注射的主要并发症为注射部位局部结膜下出血(B组患者23眼,19.7%;C组患者12眼,14.3%),均在一个月内完全吸收,无需特殊治疗;其次为眼压升高,分别有2.56%(3/117眼)和2.38%(2/84眼),眼压在30mmHg以内,降眼压药物控制好;4.6%(6眼/130眼)患者检查发现增殖膜牵拉较注射前加重,但未发现明显的牵拉性视网膜裂孔及出血、视网膜脱离加重现象,无其它局部及全身并发症。
  3.BCVA比较:(1)组内比较:A组患者术前logMAR BCVA为(1.48±0.49),术后3m、6m、1y、2y分别为(0.71±0.25)、(0.53±0.21)、(0.55±0.39)和(0.53±0.28),B组患者术前logMAR BCVA为(1.51±0.44),术后3m、6m、1y、2y、3y分别为(0.60±0.23)、(0.55±0.27)、(0.54±0.22)和(0.55±0.31),C组患者术前logMAR BCVA为(1.46±0.41),术后3m、6m、1y、2y、3y分别为(0.58±0.27)、(0.54±0.28)、(0.53±0.24)和(0.54±0.28),三组患者术后各时间段的平均BCVA与术前相比较,差异均有统计学意义,较术前均明显提高。(2)组间比较:三组患者相同时间段视力比较,术后3m时B、C组患者的BCVA优于A组,其它各时间段三组患者之间视力均无明显差异。
  4.术中观察指标:(1)玻璃体切割手术时间:三组患者的平均玻璃体切割手术时间分别为(138.17±41.22)min,(129.64±47.45)min和(122.77±45.77)。三组患者手术时间相比差异均有统计学意义。(2)医源性视网膜裂孔:三组患者发生医源性裂孔分别有35眼(32.1%)、21眼(17.9%)和11眼(13.1%),三组患者之间相互比较差异均有统计学意义。(3)术中视网膜出血情况:三组患者术中视网膜出血分别有79眼(72.5%)、21眼(17.9%)和16眼(19.1%)。B组和C组术中视网膜出血率与A组相比差异均有统计学意义,术中出血几率明显降低,而B组和C组比较差异无统计学意义。(4)眼内硅油填充率:三组患者眼内硅油填充率分别为:70眼(64.2%);54眼(46.2%)和35眼(41.7%)。B组、C组患者的硅油使用率与A组患者相比较差异均有统计学意义,B组和C组患者的硅油使用率比较差异无统计学意义。
  5.术后并发症:(1)玻璃体切割术后短期出血:三组患者术后短期出血分别有:65眼(59.6%)、30眼(25.6%)和19眼(22.6%),B组和C组与A组比较差异均有统计学意义,B组和C组相比较差异无统计学意义。(2)玻璃体切割术后长期出血:术中患者术后长期随访出血情况分别为:11眼(10.1%)、8眼(6.8%),和6眼(7.1%)。三组比较差异均无统计学意义。(3)术后高眼压及新生血管性青光眼:三组患者术后发生高眼压分别有:11眼(10.1%)、9眼(7.7%)和9眼(10.7%),三组之间相互比较差异均无统计学意义;发生新生血管性青光眼的患者分别有4眼(3.7%),4眼(3.4%)和2眼(2.4%),三组之间相互之间比较差异均无统计学意义。(4)术后视网膜前膜:三组患者术后发生视网膜前膜分别有:34眼(31.9%),21眼(17.9%)和12眼(14.3%)。B组、C组和A组相比较差异均有显著性意义,B组和C组比较差异无统计学意义。
  6.VEGF含量测定:三组患者于玻璃体切割手术时取的玻璃体液VEGF平均浓度分别为(765.43±142.29)pg/ml、(326.74±115.20)pg/ml和(298.14±121.25)pg/ml,B组、C组的VEGF平均浓度和A组比较,差异均有统计学意义,B组和C组之间比较差异无统计学意义。
  结论:1.对于PDR患者,术前注射康柏西普安全有效,能明显减少术中出血、缩短手术时间、医源性裂孔及术中硅油填充率、减少术后短期玻璃体再次出血、视网膜前膜的发生率,但对患者术后长期BCVA、高眼压及新生血管性青光眼发生率、长期出血率无影响。
  2.PDR患者术中应用低分子肝素安全有效,可以通过抑制血凝块和纤维膜形成进一步减少医源性视网膜裂孔的发生,缩短手术时间,但对术中出血、术后视力、高眼压、视网膜前膜等指标无影响。
  3.康柏西普玻璃体腔注射主要通过降低玻璃体内VEGF的含量发挥减少新生血管的作用。
[博士论文] 段练
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  一、对比分析飞秒激光辅助的白内障手术与常规超声乳化白内障吸除术在白内障Ⅱ、Ⅲ级核(Emery分级法)应用的的有效性、安全性及术后视觉质量。
  二、对比分析常规超声乳化白内障吸出术联合不同球差设计的非球面人工晶状体植入的术后视觉质量。
  方法:
  一、对比分析飞秒激光辅助的白内障手术与常规超声乳化白内障吸除术在白内障Ⅱ、Ⅲ级核(Emery分级法)应用的有效性、安全性及术后视觉质量。
  1.同顾性分析2016年1月至12月行白内障手术患者145人(148眼),其中行飞秒激光辅助白内障超声乳化吸除术的患者73人(74眼),行常规白内障超声乳化吸除术的患者72人(74眼)的临床资料,术前检查排除角膜内皮细胞计数<2000/mm2、严重眼部疾病和全身疾病、术中发生手术并发症以及不能配合随访的患者,选取IOL-Master可以获得生物测量结果的眼轴长度为22mm-24mm间的Ⅱ、Ⅲ级白内障核硬度患者,均植入折叠型、非球面、蓝光滤过型人工晶状体SN60WF(美国Alcon公司)。
  2.所有手术均由同一经验丰富的医生完成。手术设备采用Infinity白内障超声乳化仪(美国Alcon公司)和Lensx飞秒激光辅助白内障超声乳化手术系统(美国Alcon公司)。常规超声乳化手术组采用颞上方角巩膜缘2.2mm三平面隧道切口,顺时针间隔120度做透明角膜辅助切口。采用“软壳技术”术中保护角膜内皮细胞,连续环形撕囊,应用stop-chop劈核技术超声乳化吸除晶状体核,人工晶状体植入于囊袋内,位置正中,水密切口。飞秒激光辅助白内障手术组设定主切口宽度2.2mm,长度1.2mm,环形撕囊直径5.0mm,预劈核设计格栅状,水平径5.0mm,垂直径2.0mm。后续步骤同常规超声乳化组。分别记录术中超声累计释放能量(Cumulative Dissipated Energy,CDE)。
  3.术后常规应用左氧氟沙星滴眼液、醋酸泼尼松龙滴眼液、妥布霉素地塞米松眼膏点眼,分别于术后第1天、1周、1个月、3个月随访,检查裸眼及最佳矫正视力;术后3个月随访时进行iTrace像差分析仪、角膜内皮细胞计数、角膜曲率测量;并采用视功能调查问卷(National Eye Institute Visual Function Questionaire-25,NEI VFQ-25)进行评分。
  4.有效性与安全性评价:飞秒激光辅助白内障手术组和常规超声乳化手术组分别分为Ⅱ级核核Ⅲ级核组,对组间及组内术中的CDE值进行比较;对组间及组内术前与术后3个月角膜内皮细胞计数进行比较;术前与术后1天、1周、1月及3月裸眼及最佳矫正视力;应用Doctor-Hill软件分别计算两组手术源性散光并进行比较分析。
  5.评价飞秒激光辅助白内障手术组术后视觉质量:术后3个月全眼球差、调制传递函数、视功能调查问卷评分,观察术后人工晶状体位置及后囊膜混浊情况。
  二、对比分析常规超声乳化白内障吸出术联合不同球差设计的非球面人工晶状体植入术后的视觉质量。
  1.入选2014年3月至10月行年龄相关性白内障手术患者50人(61眼),进行前瞻性连续性临床病例对照研究。入选患者术前检查完整,手术顺利,无术中术后并发症,术后能及时随访。根据术前iTrace像差分析仪检查角膜球差结果,设定术后全眼球差为最接近于0,个体化植入不同设计的4种非球面人工晶状体(均可通过2.2mm手术切口植入,避免因切口大小不同引起散光偏倚):Acrysof IQ(球差为-0.2um),Akreos AO(球差为0um),ZCB00(球差为-0.27um),PY60-AD(球差为-0.18um)。
  2.所有手术均由同一经验丰富的医生完成。做角巩膜缘三平面隧道主切口宽2.2mm,均位于颞上方,辅助切口间隔120度,采用“软壳技术”术中保护角膜内皮细胞,连续环形手撕囊,应用stop-chop劈核技术超声乳化吸除晶状体核,人工晶状体植入于囊袋内,位置正中,水密切口。所有手术患者术中及术后无严重并发症。
  3.术后常规应用左氧氟沙星滴眼液、醋酸泼尼松龙滴眼液、妥布霉素/地塞米松眼膏点眼,分别于术后第1天、1周、1个月、3个月随访,检查裸眼及最佳矫正视力;术后3个月随访时进行iTrace像差分析仪检查;并采用视功能调查问卷(National Eye Institute Visual Function Questionaire-25,NEI VFQ-25)进行评分。
  4.评价个体化植入非球面人工晶状体术后3个月主观及客观视觉质量:两组患者术后3个月全眼球差、调制传递函数、视功能调查问卷评分。
  结果:
  1.飞秒激光辅助白内障手术组Ⅱ级核CDE为6.41±3.12,Ⅲ级核CDE为17.48±4.72;常规超声乳化组Ⅱ级核CDE为8.54±5.21,Ⅲ级核CDE为22.61±4.97,两组Ⅱ级核CDE的差异有统计学意义(P<0.001),FLACS组比TP组CDE降低28.42%;两组Ⅲ级核CDE的差异亦有统计学意义(P<0.005),FLACS组比TP组CDE降低22.61%。
  2.飞秒激光辅助白内障手术组和常规白内障超声乳化手术组两组术后3个月角膜内皮细胞计数均较术前明显减少(P<0.001),且飞秒激光辅助白内障手术组角膜内皮细胞丢失率明显低于常规白内障超声乳化手术组(P<0.05)。
  3.飞秒激光辅助白内障手术组和常规白内障超声乳化组术后视力的差异无明显统计学意义。
  4.飞秒激光辅助白内障手术组和常规白内障超声乳化组术后3个月全眼球差、调制传递函数、视功能调查问卷评分、后囊膜混浊发生率差异均无统计学意义,但飞秒激光辅助白内障手术组手术源性散光较常规白内障超声乳化组小,差异有统计学意义(P<0.001)。
  5.术后3个月植入不同球差设计的非球面人工晶状体组(实验组)与随机植入非球面人工晶状体组(对照组)两组比较,实验组的全眼球(0.015±0.028um)明显小于对照组的全眼球差(0.043±0.109um)(P<0.001)。在3mm瞳孔直径下,实验组与对照组全眼球差和调制传递函数无显著性差异(P>0.05);在5mm瞳孔直径下,实验组全眼球差和调制传递函数均优于对照组(P<0.001)。视功能调查问卷评分两组比较无显著性差异(P>0.05)。
  结论:
  飞秒激光辅助白内障超声乳化组与常规白内障超声乳化组相比,可显著降低超声乳化术中的累计超声能量,因此提高了白内障超声乳化手术的效率;可显著降低术后的角膜内皮细胞丢失率,因此提高了白内障超声乳化手术的安全性。飞秒激光辅助白内障超声乳化组的手术源性散光小于常规超声乳化手术组,表明飞秒激光手术切口制作更为精准。飞秒激光辅助白内障超声乳化组与常规白内障超声乳化组比较,术后视力、全眼像差不同空间频率的MTF、全眼总球差无明显差异;两组术后主观视觉质量VFQ评分无明显差异。
  根据患者手术前的角膜球差,相对个体化的植入不同球差设计的非球面人工晶状体,可显著减少手术后的全眼球面像差,明显提高手术后暗环境下的视觉质量。但对手术后视力、明亮环境下的视觉质量和主观视功能无明显影响。
[博士论文] 王华君
眼科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:本研究共分为三部分:
  第一部分 Smac与内质网应激相关蛋白在白内障及正常人晶状体上皮细胞内表达的差异
  目的:
  观察白内障患者晶状体前囊片和正常的透明晶状体前囊片Smac及ERS相关标志蛋白和下游蛋白的表达差异。
  方法:
  白内障晶状体前囊片及上皮细胞均来源于2014年1月至2014年12月来我院眼科中心行Phaco+IOL植入术的单纯老年性白内障患者33例(50眼),手术均由同一位手术经验丰富的教授完成。30例透明晶状体前囊片及上皮细胞均来源于2014年1月至2014年12月于我院及外院行角膜移植捐献者。免疫组化半定量分级检测两组间Smac、Cyt-c、JNK、Caspase-9、GRP78、GRP94、Caspase-12、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4表达差异。
  结果:
  免疫组化结果显示:正常人晶状体上皮细胞除Cyt-c、GRP94表达为强阳性至阳性;Caspase-9、Caspase-12表达为弱阳性之外,余蛋白完全没有阳性着色,均不表达。白内障患者晶状体上皮细胞中,Smac、JNK、GRP78、CHOP、ATF4、Cyt-c、GRP94表达从阳性至强阳性不等,Caspase-9、Caspase-12表达为阳性,XBP1、GADD34表达从弱阳性至阳性不等。对比后可以发现,Smac、JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4这几种蛋白在白内障患者LECs中表达,在正常入LECs中不表达,这一结果表明Smac及ERS相关蛋白的表达与白内障的发生和发展具有相关性。
  结论:
  1.Smac、JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4在白内障患者LECs中表达,在正常入LECs中不表达。
  2.Caspase-12与Caspase-9在白内障患者LECs细胞浆内高表达,在正常人LECs细胞浆内仅少量表达。
  3.Smac及JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4、Caspase-12、Caspase-9的表达与白内障的发生和发展具有相关性。
  第二部分 Smac基因过表达及干扰慢病毒载体构建及体外转染HLE-B3的实验研究
  目的:
  构建Smac基因过表达及下调表达载体,进行慢病毒包装,体外转染HLE-B3进行表达,观察Smac的过表达及下调对HLE-B3增殖的影响,根据Smac表达情况及细胞增殖情况,筛选出稳定表达的Smac基因过表达及下调表达细胞系。
  CCK-8检测载体的细胞毒性;Western blot检测转染后各组中及传代后细胞中Smac及ERS相关蛋白的表达水平。嘌呤霉素筛选转染阳性细胞。
  方法:
  1.慢病毒介导的Smac基因过表达载体的构建以cDNA-Smac为模板,设计含NheⅠ和NotⅠ酶切位点的上下游引物, PCR扩增。载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro双酶切后和扩增的目的基因以无缝克隆重组。转化感受态细菌后挑选正确的克隆酶切、PCR及测序鉴定。共同转染HEK293TF细胞,包装慢病毒,72h后收获病毒原液,离心过滤,超速离心后将沉淀重悬得到病毒储存液,梯度法测定病毒滴度。
  2.慢病毒介导的Smac基因干扰表达载体的构建以cDNA-Smac为模板,设计含Age1和EcoR1酶切位点的上下游引物,PCR扩增。载体pLenti-hU6-Puro双酶切后和扩增的目的基因以无缝克隆重组。转化感受态细菌后挑选正确的克隆酶切、PCR及测序鉴定。共同转染HEK293TF细胞,包装慢病毒,72h后收获病毒原液,离心过滤,超速离心后将沉淀重悬得到病毒储存液,梯度法测定病毒滴度。
  3.配制浓度分别为2.0μg/ml、4.0μg/ml、6.0μg/ml、8.0μg/ml和10.0μg/ml的嘌呤霉素筛选转染细胞。
  结果:
  1.经酶切和测序鉴定Smac慢病毒表达载体序列正确。HEK293TF细胞包装后获得了病毒储存液,GTP-SMAC过表达载体病毒的滴度为4×108TU/ml:PM7.1-SMAC-sh1、PM7.1-SMAC-sh2、PM7.1-SMAC-sh3病毒的滴度分别为3×108TU/ml、2×108TU/ml、2×108TU/ml。
  2.筛选2天后,8μg/ml嘌呤霉素组未转染成功的细胞刚好全部死亡,为最佳筛选浓度。
  结论:
  1.成功构建Smac过表达和干扰慢病毒表达载体。
  2.慢病毒转染对HLE-B3无细胞毒性。
  第三部分 Smac基因过表达及干扰对HLE-B3内质网应激及其介导的细胞凋亡的影响及作用机制
  目的:
  以稳定的Smac过表达及下调晶状体上皮细胞系为模型,筛选合适的H2O2浓度构建氧化应激模型,探讨Smac基因过表达及干扰对HLE-B3增殖、内质网应激及其介导的细胞凋亡的影响,并根据相关蛋白表达的差异,利用免疫共沉淀及质谱分析,寻找其中可能存在的桥梁蛋白及其可能的作用途径和作用机制。
  方法:
  1.加入H2O2后以CCK-8检测各组细胞的存活率,根据实验结果,选择200μM的H2O2作为实验浓度。
  2.细胞根据处理因素的不同分为两个大组:第一大组为无H2O2处理组,分为:空白对照细胞组HLE-B3、Smac过表达空载质粒组GTP、Smac过表达细胞组GTP-SMAC、Smac干扰空载质粒组PM7.1、Smac干扰细胞组PM7.1-SMAC-sh3组;第二大组为H2O2处理组,分为:H2O2处理空白对照细胞组HLE-B3、H2O2处理Smac过表达空载质粒组GTP、H2O2处理Smac过表达细胞组GTP-SMAC、H2O2处理Smac干扰空载质粒组PM7.1、H2O2处理Smac干扰细胞组PM7.1-SMAC-sh3组。
  结果:
  1.MTT结果显示:不同浓度的H2O2对HLE-B3细胞有不同程度的抑制作用,呈剂量依赖关系,半数抑制浓度(IC50)为270μM,高浓度(1000pM)H2O2处理24h时见细胞几乎全部死亡,不同浓度的H2O2对HLE-B3细胞有不同程度的抑制作用,并呈剂量依赖关系。由于外源H2O2改变了细胞原有的大小和形态,且本实验同时对Smac进行过表达和下调,因此将浓度为200μM的H2O2作为推荐剂量构建体外氧化损伤模型。
  2.CCK-8结果显示:无H2O2作用时,HLE-B3组、GTP组、GTP-SMAC组、PM7.1组、PM7.1-SMAC-sh3组的存活率分别为(99.56±5.12)%、(98.61±4.22)%、(93.96±2.75)%、(97.86±3.97)%、(104.56±5.12)%,统计学结果与第二部分相同;加入200μM的H2O2后,5组存活率分别为(59.339±4.895)%、(63.943±5.125)%、(39.960±3.683)%、(61.193±33.065)%、(90.560±3.574)%。组间比较,差异有统计学意义(F=57.06,P<0.001);200μM H2O2+GTP-SMAC组细胞存活率低于正常细胞组,差异有统计学意义(P=0.001);200μM H2O2+PM7.1-SMAC-sh3组细胞存活率高于正常细胞组和GTP-SMAC组,差异均有统计学意义(P=0.001);200μMH2O2+HLE-B3组、200μM H2O2+GTP组、200μM H2O2+PM7.1组之间比较无统计学差异(P>0.05)。
  结论:
  1.Smac过表达或下调,对正常状态下的HLE-B3增殖率无影响;Smac过表达会加剧氧化应激下的HLE-B3凋亡,Smac下调对氧化应激下的HLE-B3凋亡起保护作用。
  2.正常状态下的HLE-B3,Smac过表达后能通过上调内质网应激相关蛋白的表达,加剧内质网应激,加重HLE-B3凋亡;而Smac下调后能够抑制内质网应激相关蛋白,对细胞的氧化损伤具有一定的保护作用,减少HLE-B3的凋亡。
  3.HLE-B3氧化损伤后,Smac过表达能通过上调内质网应激途径的效应蛋白来加剧内质网介导的细胞凋亡;Smac下调能通过下调内质网应激途径的凋亡相关蛋白,来抑制内质网途径介导的细胞凋亡。
  4.PDE1C、IGFBP5可能是Smac与ERS间的桥梁蛋白。
[硕士论文] 王磊
麻醉学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  斜视是眼科最为常见的疾病,是小儿多发的眼病之一。小儿斜视矫正手术多在全身麻醉下进行,但是小儿眼科手术却又是全麻苏醒期躁动的高危因素。小儿全麻苏醒期躁动虽持续时间较短,且呈良性进展,但其仍可引起不小的危害,患儿无意识的体动可引起导管脱落,伤口渗血或开裂,及坠床等危害。本研究目的在于观察纳布啡在手术结束前20min静脉注射用于预防小儿全麻下行眼科斜视手术苏醒期躁动的效果及安全性。
  材料与方法:
  择期行斜视矫正术的患儿60例,性别不限,年龄在2~7周岁,体重10.0~26.0kg,ASA分级Ⅰ或Ⅱ级。采用随机数字表法将其分为2组(n=30):对照组(C组)和纳布啡组(N组),2组均采用舒芬太尼0.3~0.5μg/kg,丙泊酚1.5~2mg/kg,顺苯磺酸阿曲库铵0.1mg/kg静脉诱导气管插管全麻;插管成功后机械通气,调节参数使PETCO2维持在35~45mmHg。静脉泵注丙泊酚6~12mg/(kg.h),瑞芬太尼0.1~0.2μg/(kg.min)维持麻醉。在手术结束前20min C组静脉注射5ml生理盐水,N组静脉注射纳布啡0.1mg/kg。记录患儿术中HR,MAP,SpO2,拔管时间和出室时间;评估患儿苏醒期躁动评分和躁动发生率以及术后患儿家属对麻醉和患儿苏醒质量的满意度;并记录患儿术后呼吸抑制、拔管呛咳、恶心呕吐等不良反应的发生情况。
  结果:
  1.2组患儿年龄,体重,手术时间,麻醉时间等一般情况比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
  2.2组患儿术中各个时间点HR,MAP,SpO2比较差异无统计学意义(P>0.05)。
  3.与C组相比,N组PAED评分明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与C组比较,N组家属对患儿本次麻醉和苏醒期的满意度评分增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与C组(26.7%)比较,N组患儿苏醒期躁动发生率(3.3%)明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。
  4.N组患儿发生拔管时呛咳4例(13.3%)少于C组8例(26.7%),差异无统计学意义(P>0.05);恶心呕吐和呼吸抑制发生率比较差异无统计学意义(P>0.05);两组患儿均未发生喉或支气管痉挛。
  结论:
  小儿全麻斜视手术结束前20min静脉注射纳布啡0.1mg/kg,可降低苏醒期躁动评分,减少苏醒期躁动的发生率,增加患儿家属对麻醉和苏醒期质量的满意度,并不增加拔管时间,无明显不良反应。
[博士论文] 王媛
眼科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:本实验重点来研究青少年高度近视早期阶段的临床治疗,用1周龄豚鼠透镜诱导性近视来做模型,模拟球周注射巩膜加固术来观察手术效果,以便后期基础和临床研究的开展。实验分为三部分:第一部分,从猪眼巩膜中提取胶原蛋白,制备猪巩膜胶原蛋白眼用注射凝胶并观察其安全性;第二部分,观察球周注射凝胶聚合物在豚鼠透镜诱导性近视中的疗效;第三部分,探讨球周注射凝胶聚合物在治疗青少年高度近视中的作用。
  第一部分 猪巩膜胶原蛋白眼用注射凝胶的制备及安全性观察
  目的:
  提供一种提取、制备猪巩膜胶原蛋白眼用注射凝胶的方法并观察其安全性。
  方法:
  利用酶水解-盐提取法,从猪巩膜中提取胶原蛋白,并将胶原蛋白作为主要成分制作为猪巩膜胶原蛋白眼用注射凝胶。在豚鼠眼球后部结膜下腔进行注射,观察猪巩膜胶原蛋白眼用注射凝胶的组织相容性及并发症。采用SPSS22.0统计软件,组间比较采用Mann-Whitney U检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:
  利用酶水解-盐提取法成功从猪巩膜中提取、制备了猪巩膜胶原蛋白眼用注射凝胶,并观察该眼用注射凝胶易溶于水,pH值稳定在7.2左右,无病毒隐患,与眼组织的渗透压相近,组织相容性好,并发症少(P<0.05),安全性可靠。
  结论:
  利用猪眼巩膜提取胶原蛋白,制备猪巩膜胶原蛋白眼用注射凝胶,其组织相溶性好、并发症少,安全性高,可应用于动物实验研究。
  第二部分 球周注射凝胶聚合物在豚鼠诱导性近视中的疗效
  目的:
  建立透镜诱导性近视的豚鼠模型,探讨球周注射俄罗斯进口凝胶聚合物在抑制透镜诱导性豚鼠近视模型中的疗效。
  方法:
  按随机数字表法,将1周龄的SPF级花色雄性豚鼠105只,随机分为空白对照组和实验组。空白对照A组:15只豚鼠共30眼,双眼均不作任何处理。实验组:将90只豚鼠的右眼作为实验眼,均在右眼前制作-10.0D球面透镜,6周后摘除,成功建立透镜诱导性近视(Lens-induced myopia,LIM)的豚鼠模型。再按照随机数字表法,将这90只豚鼠平均分为三组,即:B组30只豚鼠的右眼未进行任何手术操作,C组30只豚鼠的右眼行生理盐水球周注射,D组30只豚鼠的右眼进行俄罗斯进口凝胶聚合物球周注射。在球周注射凝胶聚合物术后的3天、20天、40天,分别观察四组豚鼠右眼眼轴长度和屈光度的指标变化,并进行记录。每组中随机选出10只豚鼠,摘除眼球后,行HE染色,用光学显微镜察看巩膜的组织形态学改变,免疫组化法观察巩膜基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)含量,盐酸水解法定量观察后极部的巩膜中羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)的变化。应用SPSS22.0统计软件,计量资料以均数±标准差((x)±s)表示,重复测量的观察指标采用重复测量方差分析,定量资料多组间的比较采用方差分析,组间的两两比较采用Bonferroni法。所有数据以P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:
  105只豚鼠均健康的完成实验过程。术后观察期内俄罗斯进口凝胶聚合物生物相容性好,仅有轻度的结膜充血及出血不良事件发生,经过正规治疗均能恢复,未发生严重的刺激反应。眼轴检查结果:透镜诱导性近视的豚鼠模型中B、C、D三组眼轴长度明显较空白对照A组延长(P<0.05);球周注射凝胶聚合物手术后的第3天、20天、40天,D组右眼眼轴较B、C组比较明显变短(P<0.05)。屈光度检查结果:透镜诱导性豚鼠模型中B、C、D三组屈光度明显较空白对照A组升高(P<0.05);球周注射凝胶聚合物手术后的第3天、20天、40天D组豚鼠右眼屈光度较B、C组比较明显降低(P<0.05)。形态学变化:HE染色光学显微镜下观察B、C、D三组成功造模后,右眼视网膜、脉络膜及巩膜厚度均较空白对照A组变薄,巩膜的胶原纤维明显变薄、排列稀疏、杂乱无序,视网膜细胞稀疏、层次变少。球周注射凝胶聚合物手术后D组HE染色光学,在显微镜下观察到粉红色的胶原成分较B、C组有所增加。用盐酸水解法测定羟脯氨酸(Hyp)的含量:B、C、D三组豚鼠右眼巩膜中Hyp的含量均低于A组(P<0.05)。其中,D组术后各时间点巩膜球周注射区域的Hyp的含量均高于B、C组(P<0.05)。免疫组化染色测定(MMP-2)的含量:A组巩膜组织中MMP-2轻度着染呈淡黄色,而B、C、D三组成功建模后,巩膜组织中MMP-2着色呈棕黄色,均较A组明显增强(P<0.05)。其中,D组分别在术后的第20天、40天巩膜组织中MMP-2含量均较B、C组低,平均光密度值差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  豚鼠透镜诱导性近视眼轴延长,屈光度增高,巩膜中羟脯氨酸含量降低,MMP-2含量增高。球周注射俄罗斯进口凝胶聚合物能有效抑制豚鼠透镜诱导性近视的眼轴进一步增长,使屈光度保持相对稳定,后巩膜胶原重建,MMP-2含量降低,胶原中羟脯胺酸含量升高,抗拉伸力增强,抑制透镜诱导性近视进一步发展。
  第三部分 球周注射凝胶聚合物加固术治疗青少年高度近视
  目的:
  探讨球周注射凝胶聚合物加固术在治疗青少年高度近视中的疗效。
  方法:
  前瞻性临床对照研究,观察2013年6月至2014年5月来我院就诊的青少年高度近视患者56例(56眼),采用简单随机分为治疗组25例(25眼)行球周注射凝胶聚合物加固术、对照组31例(31眼)同期未行任何治疗。观察球周注射凝胶聚合物术前和术后1月、3月和6月不同时间点的裸眼视力、最佳矫正视力、屈光度、眼轴长度和眼压的变化及术后早期并发症。应用SPSS22.0统计软件分析,对计数资料进行卡方检验,对计量资料以均数±标准差((x)±s)表示,两样本t检验对术前年龄及观察指标进行比较,应用重复测量资料的方差分析对术前、后两组观察数据进行分析。所有数据均采用P<0.05具有统计学意义。
  结果:
  56例高度近视患者均顺利完成随访。球周注射凝胶聚合物加固术早期并发症:最常见的是结膜反应性充血5例,术后眼压短暂性升高者3例,结膜下出血者2例,所有并发症经过正规治疗均能恢复。观察术前两组患者年龄、性别、裸眼视力、矫正视力、眼轴和屈光度均相匹配,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组术后各个时间点裸眼视力、最佳矫正视力和眼轴长度均较对照组有明显改善,差异有统计学意义(P<0.05),而两组间屈光度、眼压在术后各时间点没有显著性变化,差异无统计学意义(P>0.05)。术后随访中对照组在不同时间点裸眼视力和最佳矫正视力均呈下降趋势,而屈光度和眼轴长度仍有继续增长趋势。
  结论:
  球周注射凝胶聚合物加固术能有效改善视力,延缓眼轴增长,抑制高度近视的发展,可用于青少年高度近视的治疗。
[博士论文] 刘超
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:1、体外培养人晶状体上皮细胞株HLE B-3,观察TGF-β2对晶状体上皮细胞的移行和转分化的影响。
  2、观察不同浓度的NF-κB p65ASODN和不同剂量的转染剂HiPerFect对晶状体上皮细胞的影响。
  3、通过应用NF-κB p65ASODN在体外转染人晶状体上皮细胞,检测其对由TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞的移行和转分化的影响,研究NF-κB p65ASODN在体外对晶状体上皮细胞的影响。
  4、采用眼前房内注射法转移NF-κB p65ASODN至新西兰大白兔后发性白内障模型眼内,观察其对后发性白内障的作用,探讨后发性白内障的基因治疗方法。
  方法:1、体外培养人晶状体上皮细胞株HLE B-3,用不同浓度的TGF-β2处理后,在不同的时间点用细胞划痕法观察细胞的移行能力,ELISA法处理细胞爬片后,检测细胞爬片中的阳性细胞数和吸光度值,检测α-SMA蛋白的变化。
  2、将NF-κB p65ASODN行全程硫代磷酸化修饰,不同浓度的NF-κB p65ASODN和不同剂量的转染剂HiPerFect两两混合,探讨细胞活性不受明显影响的情况下,最佳的转染效率时所需的NF-κB p65ASODN的浓度和转染剂的剂量。
  3、细胞同步培养后分五组:(1)空白对照组(单纯FSM培养),(2)阴性对照组(HiPerFect转染试加入到FSM中共同培养),(3)TGF-β2组(T组)(10ng/ml TGF-β2),(4)TGF-β2加ASODN组(T+A组)(TGF-β2、HiPerFect转染试和ASODN加入到FSM中共同培养),(5)TGF-β2加MSODN组(T+M组)(TGF-β2、HiPerFect转染试和MSODN加入到FSM中共同培养)。不同组细胞继续培养,6h、12h、24h、48h四个不同时间点收集上清液检测α-SMA的含量,采用RT-PCR检测细胞NF-κB mRNA的表达情况。
  4、将16只新西兰大白兔进行晶状体囊外摘除术制作后发障活体眼动物模型,手术后随即分为四组,每组4只。A组:空白对照组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射BSS液100ul;B组:阴性对照组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect的BSS液100ul;C组:ASODN一次注射组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul;D组:ASODN两次注射组4只白兔8眼:术毕和术后第2天分别经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul。术后第7、14、21、28天用超声角膜测厚仪测量中央角膜厚度,用裂隙灯显微镜观察前房炎症反应和后囊膜的混浊情况,并于实验结束时行HE染色观察后囊膜的病理变化、检测α-SMA的表达和进行RT-PCR检测晶状体上皮细胞中NF-κB p65mRNA的表达。
  结果:1、TGF-β2是晶状体上皮细胞重要的促移行和转分化生长因子,其作用呈现明显的浓度和时间依赖性。不同浓度的TGF-β2作用48h后,移行距离随着TGF-β2浓度的增加而增加,当浓度为10ng/ml时作用最强;晶状体上皮细胞在10ng/ml TGF-β2作用下,其移行距离随着作用时间的延长而增加,在48h达到高峰。晶状体上皮细胞在TGF-β2作用下由单层立方形变为长梭形,伸出伪足,逐渐呈现纤维细胞样形态。不同浓度的TGF-β2作用48h后,细胞爬片中α-SMA的阳性细胞数和吸光度值随着TGF-β2浓度的增加而增加,当浓度为10ng/ml时数值最大;晶状体上皮细胞在10ng/ml TGF-β2作用下,细胞爬片中α-SMA的阳性细胞数和吸光度值随着作用时间的延长而增加,在48h达到最大值。
  2、NF-κB p65ASODN对HLE B-3细胞的导入率随时间的延长而增加,48h导入率可达60%以上,并且细胞的活性不受影响;随着浓度增加,NF-κB p65ASODN对HLE B-3细胞的导入率增加,10μg/ml的转染率最高,再增加浓度转染率增加不明显,对细胞活性影响不明显;当剂量≤3ul时,随着转染剂HiPerFect的增加,对细胞的转染率增加,无明显细胞毒性,当剂量增加为4u时,对细胞的转染率增加不明显,并且表现出细胞毒性。HiPerFect的剂量为3ul,ASODN的浓度为10nmol/L对细胞存活率影响小(80.4%),同时细胞的转染率可高达70.8%,为最理想转染条件。
  3、在6h、12h、24h、48h四个不同时间点与空白对照组相比,阴性对照组、T组、T+A组、T+M组上清液α-SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T组、T+M组上清液α-SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T+A组上清液α-SMA的浓度增加不明显,差异无统计学意义(P>0.05);与T+A组相比,T组、T+M组上清液α-SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);T组与T+M组上清液α-SMA的浓度之间的差异不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。NF-κB p65mRNA出现在364bp处。6h、12h、24h、48h四个不同时间点与空白对照组相比,阴性对照组、T组、T+A组、T+M组NF-κB p65mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T组、T+M组NF-κB p65mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T+A组NF-κB p65mRNA的含量增加不明显,差异无统计学意义(P>0.05);与T+A组相比,T组、T+M组NF-κB p65mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);T组与T+M组NF-κB p65mRNA的含量之间的差异不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。
  4、眼前节炎症反应均在一周内消失,组间无统计学差异。术后1周左右,A、B组开始出现后囊膜混浊,随时间延长而逐渐加重,C、D组后囊混浊发生时间均迟于A、B组,混浊程度也较A、B组为轻,差异有显著统计学意义(P<0.05)。C、D组之间差异无统计学意义。HE染色后观察到A、B组后囊表面可见多层成纤维细胞生长,细胞排列较为紧密,囊袋周边部皮质增生,同时可见明显纤维素样物质沉积,C、D组后囊表面相对干净,仅有少量细胞增殖,细胞排列较为疏松。A、B组后囊膜α-SMA的表达量较C、D组明显增加,差异有显著统计学意义;A组和B组之间,C组和D组之间差异不明显,无统计学意义。RT-PCR分析结果发现A、B组NF-κB p65mRNA的表达量较C、D组明显增加,差异有显著统计学意义;A组和B组之间,C组和D组之间差异不明显,无统计学意义。
  结论:1、TGF-β2可促进晶状体上皮细胞的移行,同时反应细胞间质转分化的α-SMA蛋白的表达增加,应用TGF-β2刺激体外培养的晶状体上皮细胞可成功建立后发障的细胞模型。
  2、HiPerFect的剂量为3ul,ASODN的浓度为10nmol/L对细胞存活率影响小(80.4%),同时细胞的转染率可高达70.8%,为最理想转染条件。
  3、NF-κB p65ASODN可特异性阻断NF-κB p65mRNA的表达,抑制TGF-β2诱导的α-SMA的表达和晶状体上皮细胞出现移行和间质转分化。
  4、采用眼前房内注射法转移NF-κB p65ASODN可抑制新西兰大白兔后发性白内障模型眼内后囊膜上α-SMA的表达和NF-κB p65mRNA的表达,抑制后囊膜的混浊,并且不增加炎症反应和对角膜的影响。
[硕士论文] 张铭
眼科学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分:阿帕替尼对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管的抑制作用
  目的:观察阿帕替尼对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管形成的抑制作用。
  方法:60只6-8周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为4组,每组15只,即正常对照组及实验组(生理盐水组、低剂量阿帕替尼组和高剂量阿帕替尼组)。实验组构建激光诱导的小鼠CNV模型,均为右眼。建模后即采用灌胃的方式,实验组分别给予生理盐水、低、高剂量的阿帕替尼治疗7d;建模后第7d分别采用荧光素眼底血管造影(FFA)观察各组脉络膜新生血管区面积及渗漏变化;行脉络膜铺片进一步测量新生血管区面积的大小并作组织病理学检查。
  结果:
  (1) FFA结果显示:与正常对照组比较,生理盐水组可见大面积脉络膜新生血管区形成,证明造模成功。对每组各只小鼠激光点的渗漏等级进行评分,组间总体差异有统计学意义(F=51.76; P=0.000);其中,生理盐水组的渗漏评分为(8.43±0.50)分,低剂量阿帕替尼组的渗漏评分为(7.84±0.50)分,高剂量阿帕替尼组的渗漏评分为(6.13±0.90)分。与对照组比较,低剂量阿帕替尼组及高剂量阿帕替尼组渗漏评分显著降低(P=0.020;P=0.000),且高剂量阿帕替尼组较低剂量阿帕替尼组荧光渗漏评分低(P=0.000)。
  (2)脉络膜铺片结果显示:正常小鼠脉络膜铺片中视网膜色素上皮细胞被F-actin染色呈现规则的六边形结构;脉络膜铺片新生血管面积组间总体差异有统计学意义(F=143.72; P=0.001);生理盐水组被激光破坏掉的视网膜色素上皮层区域可见IB4标记的呈辐射状脉络膜新生血管区域,其脉络膜新生血管区的面积为(100.00±6.00)μm2;阿帕替尼干预组中可见IB4标记的脉络膜新生血管区面积明显减小,其中高剂量阿帕替尼组新生血管区面积为(28.00±4.00)μm2,低剂量阿帕替尼组新生血管区面积(66.88±8.41)μm2,两组新生血管区面积与生理盐水组比较差异具有统计学意义(P=0.001),高剂量组小于低剂量组新生血管区面积,差异具有统计学意义(P=0.000)。
  (3)对新生血管区域行HE染色,结果显示:组间总体差异有统计学意义(F=1899;P=0.000);与正常对照组比较,生理盐水组有明显的新生血管形成,且长度和厚度分别为(392.86±3.54)μm和(96.05±6.58)μm,差异有统计学意义(P=0.000);而与生理盐水组比较阿帕替尼组损伤区新生血管的长度和厚度明显减少,其中低剂量阿帕替尼组长度为(164.99±8.24)μm、厚度为(62.68±3.81)μm,高剂量阿帕替尼组长度为(81.16±6.53)μm、为厚度(25.58±4.02)μm,与生理盐水组比较差异均具有统计学意义(P=0.000);且高剂量阿帕替尼组与低剂量阿帕替尼组比较差异有统计学意义(P=0.000)。
  结论:阿帕替尼对激光诱导的小鼠CNV具有一定的抑制作用。
  第二部分:阿帕替尼对HRMEC增殖、迁移、管腔形成的影响及其分子机制的研究
  目的:探讨阿帕替尼对HRMEC的增殖、迁移、管腔形成的影响及其分子机制。
  方法:体外培养HRMEC,实验分组:对照组、rhVEGF诱导组、rhVEGF+5μM阿帕替尼组和rhVEGF+1μM阿帕替尼组。分别予以上述不同的干预后,检测各组细胞的增殖、迁移及管腔形成情况;Western blotting检测阿帕替尼对细胞p-VEGFR2、VEGFR2、ZO-1以及Occludin表达水平的影响。
  结果:
  (1)阿帕替尼抑制rhVEGF诱导的HRMEC增殖活性:CCK-8实验表明,与对照组比较,随着阿帕替尼浓度的增加,细胞增殖活性逐渐降低,分别为0.05μM(96.8%)、0.1μM(84.5%)、0.2μM(74.2%)、0.4μM(63.5%)、0.8μM(56.0%)、1.6μM(45.5%)、3.2μM(42.0%)、6.4μM(35.6%),因此,阿帕替尼可以一定程度上抑制rhVEGF诱导的HRMEC增殖活性,并呈剂量依赖性(P<0.05)。
  (2)迁移实验显示,迁移细胞数量组间总体差异有统计学意义(F=119.30; P=0.000);与对照组细胞迁移数量(64.00±5.57个)相比,rhVEGF组细胞迁移数量(97.00±4.35个)显著增加(P=0.000);在rhVEGF诱导的同时加入高低剂量的阿帕替尼后,在rhVEGF+5μM阿帕替尼组细胞迁移数量为(32.00±4.00个),rhVEGF+1μM阿帕替尼组细胞迁移数量为(44.67±3.51个),其中与rhVEGF组比较,rhVEGF+1μM阿帕替尼组细胞迁移数量显著减少(P=0.000),且rhVEGF+5μM阿帕替尼组比rhVEGF+1μM阿帕替尼组抑制细胞迁移的数量更明显(P=0.035)。
  (3)阿帕替尼抑制HRMEC闭合管腔的形成:管腔形成实验结果显示,各组间总体比较差异有统计学意义(F=112.10; P=0.000);与对照组中闭合的管腔数量(10.33±0.58)个/孔相比,rhVEGF诱导组的管腔形成数量(17.00±1.00个/孔)明显增加,差异有统计学意义(P=0.000);在加入rhVEGF诱导的同时加入阿帕替尼干预后,在rhVEGF+5μM阿帕替尼组管腔形成数量为(4.00±1.00)个/孔,rhVEGF+1μM阿帕替尼组管腔形成数量为(7.00±1.00)个/孔,与rhVEGF组比较rhVEGF+可帕替尼组两组管腔形成数量均显著减少(P=0.000),其中rhVEGF+5μM阿帕替尼组比rhVEGF+1μM阿帕替尼组抑制管腔形成的数量更明显(P=0.016)。
  (4)阿帕替尼抑制HRMEC中VEGFR2和p-VEGFR2的表达,促进紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达:Western blot结果显示,对照组VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分别为0.29±0.02、0.28±0.02、0.29±0.02、0.23±0.01;rhVEGF刺激组VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分别为:0.52±0.04、0.56±0.04、0.11±0.003和0.08±0.002;低剂量阿帕替尼处理组VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分别为:0.26±0.02、0.20±0.002、0.54±0.02、0.41±0.02;高剂量阿帕替尼处理组VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分别为:0.17±0.01、0.06±0.004、0.54±0.02、0.61±0.04。四种蛋白间总体比较结果显示:VEGFR2(F=110.35;P=0.001)、p-VEGFR(F=274.98;P=0.000)、ZO-1(F=556.74; P=0.000)和Occludin(F=338.49; P=0.000);与对照组相比,rhVEGF刺激后的细胞组VEGFR2(P=0.001)和p-VEGFR2(P=0.000)增加;而紧密连接蛋白ZO-1(P=0.000)和Occludin(P=0.000)表达水平均降低;而加阿帕替尼干预后,与rhVEGF组比较,VEGFR2(P=0.000)和p-VEGFR2(P=0.000)表达均下降;而紧密连接蛋白ZO-1(P=0.000)和Occludin(P=0.000)表达水平均增加。
  结论:阿帕替尼可以抑制HRMEC的增殖、迁移及管腔形成,并抑制VEGFR2、p-VEGFR2的表达,但促进ZO-1和Occludin表达。
[硕士论文] 冯悦
内科学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:背景/目的:
  糖尿病微血管病变涉及糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)和糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN),其中DR与成人非创伤性致盲密切相关,是糖尿病最常见的并发症之一。DR为不可逆转改变,对其进行早发现、早诊断、早治疗极其重要。目前对于DR诊断主要有彩色眼底照相、眼底荧光素血管造影、光相干断层扫描等,尚无有效的早期诊断DR的生物学指标。国内外已有大量研究显示神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)作为DPN的独立危险因素,可能成为诊断早期DPN的生物学指标。国外也有研究报道NSE水平与糖尿病患者视网膜病变密切相关,但国内尚无此报道。为此,本研究探讨血清NSE水平与DR的相关性,试图为早期临床诊断提供参考依据。
  方法:
  选取2015年9月~2016年6月在扬州大学临床医院内分泌科和眼科住院的1型和2型糖尿病患者137例,其中男性87例,女性50例。所有患者均进行彩色眼底照相检查,根据检查结果分为两组:1、糖尿病视网膜病变组(DR组),共110例,其中男性74例,女性36例,平均年龄(55.18±13.73)岁;2、无糖尿病视网膜病变糖尿病组(NDR组),共27例,其中男性13例,女性14例,平均年龄(56.70±10.07)岁。分别收集研究对象的基本信息:性别、年龄、病程、体重指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP),采集静脉血标本,测定NSE、糖化血红蛋白(HBA1c)、尿微量白蛋白(UMA)、空腹血糖(FBG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)指标。所得数据应用SPSS21.0和Medcalc(v15.6)统计软件处理。
  结果:
  DR组(n=110例)与NDR组(n=27例)在性别、年龄、病程、 BMI、HBA1c、UMA、FBG、BUN、Scr、TG、TC、HDL-C、LDL-C无显著差异(P>0.05)。NDR组与DR组比较:血清NSE水平显著升高,舒张压水平下降,均有统计学差异(P>0.05)。排除性别、年龄、病程、糖代谢指标等混杂因素影响后,二分类Logistic回归分析显示NSE水平仍与DR密切相关(OR=1.248,95%CI:1.070~1.457,P=0.005)。以血清NSE水平区分糖尿病患者是否有DR的Cutoff值是12.31μ mol/L,其诊断灵敏度为69.09%,特异性为59.26%。
  结论:
  DR患者NSE水平显著升高,可能是DR的独立预测因子,且可能是DR潜在生物学标志,血清NSE水平检测可作为DR预测、早期诊断的方法之一。
[博士论文] 田明霞
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  圆锥角膜是最常见的角膜扩张性疾病,常发生于青少年,表现为进行性的角膜前突并变薄,视力下降,散光增大,最终导致角膜瘢痕以及视力丧失。现在有很多研究证实核黄素/紫外线角膜胶原交联(Corneal collagen crosslinking,CXL)可以阻止圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆的发展。CXL是目前唯一可以从根本上改变圆锥角膜的生物力学和基质结构的不稳定性的方法。核黄素吸收365nm的紫外线后可以作为一种光敏剂,并产生氧自由基或单线态氧激活自然的赖氨酰氧化酶通路,从而使角膜胶原发生物理性交联。角膜胶原交联产生的光氧化反应使角膜内的胶原纤维共价结合,增加角膜的生物力学强度,并且增加角膜基质对酶降解作用的抵抗力,减少角膜胶原降解,从而阻止圆锥角膜的进展。由于圆锥角膜根据不同的标准可以分为不同的类型,假设圆锥角膜的类型不同可能对CXL治疗的效果产生影响。本研究对CXL治疗不同类型圆锥角膜的效果进行对比研究,并分析影响CXL治疗效果的因素。
  方法:
  研究对象2012年7月至2014年6月进行CXL治疗的进行性圆锥角膜患者60例(88眼)纳入本研究,纳入标准为在过去的1年中至少满足以下条件之一者:(1)角膜地形图最大曲率值增加1D及以上,(2)验光散光增加1D及以上,或等效球镜度增加0.5D及以上,(3)随访时间2年及以上,(4)排除其他急、慢性眼病史,角膜移植手术史,角膜厚度小于350μm,或者随访观察期间怀孕、哺乳者。根据圆锥角膜的分类方法共分为2个亚组:(1)中央型圆锥角膜组(以下简称中央组)和周边型圆锥角膜组(以下简称周边组),(2)原发性圆锥角膜组(以下简称原发组)和准分子激光术后角膜膨隆组(以下简称膨隆组)。
  核黄素/紫外线角膜胶原交联使用去角膜上皮的标准CXL方法。
  观察指标分别对各组患者CXL术前和术后2年的裸眼视力(Uncorrected distant visual acuity,UDVA)、最佳矫正视力(Best-corrected distant visual acuity,BDVA)、裂隙灯检查、验光、眼压、pentacam角膜地形图中角膜最大曲率(Maximum keratometry,Kmax)、平均角膜曲率(mean keratometry,Km)、角膜散光等的变化情况进行对比分析。
  统计分析所有数据采用IBM SPSS19.0统计软件进行统计学分析。两组样本之间采用独立样本t检验进行分析;性别比例采用卡方分析进行比较;同组术前术后的变化采用配对样本t检验进行分析;相关性分析采用偏相关分析方法,计算偏相关系数r。对取得显著性相关的变量进一步进行回归分析,获得与CXL术后效果独立相关的因素。所有结果均以P<0.05为具有统计学意义。
  结果:
  1.术前情况
  60例88眼圆锥角膜患者,术前平均年龄为22.1±5.1岁,男女比例为39∶21,平均发病时间为23.4±22.4个月,Kmax距角膜中心的平均距离为2.7±1.5mm,平均角膜厚度为439.7±61.0μm。
  中央组共44例64眼,周边组共16例24眼;术前两组年龄、性别、发病时间及角膜厚度相比均无明显统计学差异(P>0.05),而Kmax距角膜中心的距离却有明显差异(P<0.01)。
  原发组共45例67眼,膨隆组共15例21眼;术前两组年龄、性别、发病时间及角膜厚度相比均无明显统计学差异(P>0.05),而Kmax距角膜中心的距离亦有明显差异(P<0.01)。
  在44例中央型圆锥角膜组中,含5例角膜膨隆患者,占11.4%;在16例周边型圆锥角膜组中,含6例原发性圆锥角膜患者,占37.5%。
  2.CXL术后2年总体情况
  术前UDVA,BDVA分别是0.9±0.5和0.4±0.4logMAR,CXL术后2年提高至0.7±0.4和0.3±0.3logMAR,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  术前Kmax和角膜散光分别是61.5±14.7D和4.0±2.9D,CXL术后2年,Kmax和散光分别降低至57.0±10.4D和3.3±2.2D,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  3.CXL术后2年中央组与周边组疗效比较
  3.1两组UDVA与BDVA的比较
  中央组术前U DVA,BDVA分别是0.9±0.4和0.5±0.4logMAR,术后2年提高至0.8±0.4和0.4±0.3logMAR,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  周边组术前UDVA,BDVA分别是0.8±0.7和0.2±0.4logMAR,术后2年U DVA提高至0.4±0.4logMAR,与术前相比,差异具有统计学意义(P<0.01);BDVA提高至0.2±0.3logMAR,与术前相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
  中央组与周边组UDVA的变化值(术后-术前)分别是-0.1±0.2和-0.4±0.5logMAR,两者相比具有统计学差异(P<0.01)。而两组BDVA的变化值分别是-0.1±0.3和-0.04±0.2logMAR,两者相比无统计学差异(P=0.25)。
  3.2两组Kmax与角膜散光的比较
  中央组术前Kmax和散光分别是65.6±15.0D和4.6±3.0D,术后2年,Kmax和散光分别降低至60.1±10.3D和3.3±2.2D,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  周边组术前Kmax和散光分别是50.3±5.3D和2.4±1.7D,术后2年,Kmax下降至48.8±4.6D,与术前相比差异具有统计学意义(P<0.01),而散光值为2.2±1.8D,与术前相比差异无统计学意义(P>0.05)。
  中央组与周边组Kmax的变化值(术后-术前)分别是-5.6±8.3D和-1.6±2.1D,两者相比具有统计学差异(P=0.01);同样,散光的变化值分别是-1.3±2.2D和-0.3±0.8D,两者相比具有统计学差异(P=0.04)。
  4.CXL术后2年圆锥组与膨隆组疗效比较
  4.1两组UDVA与BDVA的比较
  圆锥组术前UDVA,BDVA分别是0.8±0.5和0.4±0.4logMAR,术后2年,UDVA,BDVA分别提高至0.7±0.4和0.3±0.3logMAR,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  膨隆组术前UDVA,BDVA分别是0.9±0.6和0.3±0.4logMAR,术后2年,UDVA,BDVA分别提高至0.6±0.4logMAR(P<0.01)和0.2±0.3logMAR(P>0.05)。
  圆锥组和膨隆组的UD VA的变化值(术后-术前)分别是-0.1±0.2和-0.2±0.3logMAR,BDVA的变化值分别是-0.1±0.2和-0.03±0.2logMAR,两组之间UDVA,BDVA的变化值相比均无明显统计学差异(P>0.05)。
  4.2两组Kmax与角膜散光的比较
  圆锥组术前Kmax,角膜散光分别是63.3±15.6D和4.5±3.0D,术后2年,Kmax,角膜散光分别降低至58.3±10.4D和3.3±2.2D,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  5.相关性分析
  5.1患者年龄,发病时间与UDVA,BDVA,Kmax,角膜散光的变化值均无相关关系(P>0.05)。
  5.2术前角膜地形图中Kmax距角膜中心的距离与UDVA的变化值(术后-术前)呈负相关(r=-0.295,P<0.01),与Kmax和角膜散光的变化值呈正相关(r=0.239,0.265,P<0.05)。
  5.4术前角膜厚度与Kmax的变化值呈正相关(r=0.266,P=0.012)。
  6.回归分析
  6.1CXL术后2年U DVA的变化值(ΔUDVA)与Kmax距角膜中心的距离的回归方程式为:ΔUDVA=-0.024-0.066×Kmax距角膜中心的距离。
  6.2CXL术后2年Kmax的变化(ΔKmax)与角膜厚度的回归方程式为:ΔKmax=-18.606+0.032×角膜厚度。
  6.3CXL术后2年角膜散光的变化值(Δ角膜散光)与Kmax距角膜中心的距离的回归方程式为:Δ角膜散光=-1.957+0.34×Kmax距角膜中心的距离。
  结论:
  1.CXL治疗2年后圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆可以得到明显控制;
  2.CXL对中央型圆锥角膜的控制效果优于周边型圆锥角膜;
  3.CXL对原发性圆锥角膜的控制效果优于准分子激光术后的角膜膨隆;更长期的效果还需进一步的观察和研究。
  4.CXL治疗2年后圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆视力的提高与角膜曲率的降低与术前Kmax距角膜中心的距离、圆锥角膜的病变程度以及角膜厚度有关。
  5.回归分析表明,CXL术后圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆的视力提高及角膜散光的降低与Kmax距角膜中心的距离相关,而Kmax的降低与角膜厚度相关。
[硕士论文] 李芳
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:近视是目前认为发病率最高的眼科疾病之一,可引起视力和视觉质量的下降,虽可通过配镜,如框架眼镜、硬性或软性角膜接触镜,以及各种屈光手术进行矫正,但高度近视眼轴的进行性增长,近视度数的不断加深可严重损害视功能,甚至还可能引起各种严重的眼部并发症,如视网膜脱离、脉络膜新生血管、黄斑病变、白内障、青光眼等,因此,高度近视成为了致盲的主要原因之一,并在全世界范围内都被认为是严重的公共卫生问题。目前认为,近视的发病是遗传因素和环境因素交互作用的结果,而对高度近视的研究表明,遗传因素对近视的发病起着更加密切的作用。2013年的一篇全基因组关联分析(Genome-wide Association Study, GWAS)发现有七个单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphism, SNP),包括rs1656404, rs7829127, rs7084402, rs17648524, rs1254319, rs12205363和rs3138144,在白种人中与高度近视发病具有相关性。本研究的目的在于探索这些SNP位点在中国汉族人群中与高度近视发病的关系。
  本实验选择了830例中国汉族高度近视患者作为病例组,1140例中国汉族正常健康人作为对照组,进行病例-对照关联分析,收集外周血后进行全基因组DNA的提取,针对7个SNP位点采用单碱基延伸法进行基因分型。
  7个SNP位点的基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.001)。rs17648524(C/G)和rs7084402(A/G)的等位基因频率在病例组和对照组之间的差异具有统计学意义(P=3.0×10-3, OR=0.43;P=3.7×10-2, OR=1.25),rs17648524的杂合子频率(CG VS. GG)和显性模式频率(CC+CG VS. GG)在病例组和对照组之间的差异具有统计学意义(P=7.0×10-3, OR=0.43;P=4.0×10-3,OR=0.42),rs7084402的基因型频率(GG VS. AA)和显性模式频率(GG+AG VS. AA)在病例组和对照组之间的差异具有统计学意义(P=4.0×10-2,OR=1.56;P=3.8×10-3,OR=1.41)。另外,rs7829127(A/G)的基因型频率(AG VS. AA)在病例组和对照组之间的差异具有统计学意义(P=4.6×10-2,OR=0.67)。此外,rs17648524和rs7084402的等位基因频率存在性别特异性,且均只在女性人群中有意义。其余四个SNP位点,在各模型下两组差异均无统计学意义。
  研究表明rs17648524(intronic RBFOX1)和rs7084402(7.5kb5, of the BICC1 gene)在中国汉族人群中与高度近视发病具有相关性,值得一提的是,这种相关性存在性别特异性,且只在女性人群中有意义。
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