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[博士论文] 牟旆
眼科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)又名Graves眼病、甲状腺功能亢进突眼、内分泌眼病等,是graves病在甲状腺以外的表现,属于自身免疫性器官特异性疾病。大量研究认为,促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)和胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor1receptor,IGF-1R)是TAO的自身抗原,两者形成结构和功能的复合体,在TAO发病的分子机制中起至关重要的作用,但其余分子是否亦在TAO的病程中扮演重要角色,目前仍不清楚。本文第一部分采用第二代高通量测序中的转录组测序的方法,对甲状腺相关眼病患者和健康对照人群来源的眼眶脂肪结缔组织中的转录组信息进行提取和分析,探讨除TSHR和IGF-1R以外,其余可能参与TAO疾病发生发展的分子和信号通路。
  基于转录组测序分析结果,穿透素-3(Pentraxin-3,PTX3)在甲状腺相关眼病患者眼眶脂肪结缔组织中的表达高于健康对照组来源的眼眶脂肪结缔组织。PTX3属于长链穿透素家族,该家族还包括C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和血清P蛋白(serum amyloid P component,SAP)。在系统性红斑狼疮、多发性硬化等其他自身免疫性炎症性疾病中,PTX3在疾病极早期就有较高浓度表达,灵敏度高于CRP和SAP,且PTX3在血清中的表达值与疾病的严重程度呈正相关,对疾病的预后有重要的启示作用。本课题组在之前的研究中发现,甲状腺刺激激素(thyroid stimulating hormone,TSH)可以作用于纤维细胞(Fibrocytes,Fc),刺激其高表达PTX3,这种效应是通过增加PTX3的mRNA稳定性达到的,且可以被抗炎药物和抗IGF-1R药物所阻断。本文第二部分计划在转录组测序的基础上,取TAO患者和健康人来源的眼眶脂肪结缔组织和血清样本,比较不同来源的组织和血清中PTX3的表达差异,探讨PTX3作为TAO潜在生物学标志物的可能性。
  日前,一项多中心、双盲、平行随机对照的临床试验证实了抗IGF-1R抗体teprotumumab对于TAO治疗的有效性和安全性,改变了TAO目前治疗局限于对症治疗的窘境。但teprotumumab产生作用的分子机制仍在进一步探索中。本文第三部分计划采用teprotumumab处理共培养的纤维细胞和Th1细胞,并用PMA等抗原加以刺激,观察Ⅱ类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,classⅡ,MHCⅡ)和干扰素伽马(Interferon-γ,IFN-γ)的表达量变化等,了解teprotumumab对于纤维细胞抗原呈递作用和Th1细胞活化的影响及机制。
  方法:
  1.对纳入的对照组和病例组眼眶脂肪结缔组织进行mRNA质量检测;符合要求的样本各5例进一步采用RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)获得其转录组信息,得到原始数据Rawdata;
  2.对Rawdata进行基因表达定量和校正,得到两组间差异表达的基因Dif-gene;
  3.对Dif-gene进行基因本体分析(Gene Ontology Analysis,GO)和通路分析;
  4.根据得到的显著性GO条目,做功能树分析(GO-tree)。根据显著性信号通路做信号通路网络(Path-Act-Network)构建;
  5.选取表达丰度高、差异倍数有统计学意义的上调基因和下调基因各2个,在TAO患者和健康对照人群眼眶脂肪结缔组织上,通过Real-time PCR验证Dif-gene的差异表达。
  6.分别取TAO患者和健康对照人群眼眶脂肪结缔组织和其培养的成纤维细胞,通过Real-time PCR和免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)分别验证PTX3在细胞mRNA和蛋白层面的表达;
  7.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,通过酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测样本中PTX3蛋白的表达;
  8.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,在外周血纤维细胞培养环境中加/不加teprotumumab,通过Real-time PCR和流式细胞技术分别检测细胞表面MHCⅡ表达的变化;
  9.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,在外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)培养环境中加/不加teprotumumab,细胞成熟后用P/I抗体加以刺激,流式细胞技术检测Th1细胞内IFN-γ产量;
  10.收集上述样本培养过程中的培养液,ELISA检测加/不加teprotumumab时培养液中IFN-γ的表达量;
  11.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,在外周血单核细胞培养环境中加/不加teprotumumab,待细胞成熟后加入IFN-γ中和抗体,流式细胞技术检测纤维细胞表面MHCⅡ的表达。
  结果:
  1.TAO患者和健康对照人群来源的脂肪结缔组织,转录组测序得到的原始数据质量评分均大于20,mappedrate最低为0.895,最高为0.931。数据主要来源于外显子区域。转录组测序共得到784个差异表达基因;
  2.PTX3等445个基因在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中表达上调明显。CTHRC1等339个基因在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中表达下调明显。差异具有统计学意义;
  3.细胞因子和细胞因子受体相互作用、趋化因子等19条通路在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中上调明显;细胞粘附、细胞外基质受体等20条通路在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中下调明显;
  4.差异表达的基因和信号通路主要涉及以下功能:炎症反应、免疫反应、疤痕修复、T细胞调节等;PTX3基因主要参与炎症反应、免疫反应等生物学过程。
  5.在TAO患者来源的眼眶脂肪结缔组织中,PTX3在mRNA和蛋白水平表达均高于健康对照人群;
  6.PTX3在TAO患者来源的血液样本中,表达高于健康对照人群;但TAO活动期和稳定期表达无明显差异。
  7.无论是否有抗原刺激,teprotumumab均可降低外周血纤维细胞表面的MHCⅡ基因水平和蛋白水平的表达。且这种效应在TAO患者和健康对照人群来源的外周血纤维细胞中均可观测到;
  8.Teprotumumab可明显降低Th1细胞内的IFN-γ水平,无论细胞来源于TAO患者或健康对照人群;
  9.Teprotumumab可明显降低细胞培养液中IFN-γ的蛋白水平,无论细胞来源于TAO患者或健康对照人群;
  10.当加入IFN-γ中和抗体处理后,外周血纤维细胞表面MHCⅡ的表达明显降低,且这种效应在TAO患者和健康对照人群来源的外周血纤维细胞中均可观测到。
  结论:
  1.PTX3等基因可能与TAO的发生和进展过程相关。细胞因子和细胞因子受体相互作用、趋化因子通路可能参与了TAO的病理过程;TAO患者的炎症反应、免疫反应、疤痕修复、T细胞免疫活性等生物学过程增强。多种炎症相关基因和自身免疫相关基因在TAO患者来源的眼眶脂肪结缔组织中表达升高,再次证实TAO与自身免疫、炎症的相关性;
  2.炎性分子PTX3在TAO患者的眼眶脂肪结缔组织和血液中表达均增高,可能涉及了TAO的炎性进展过程,PTX3可能是TAO病程诊断和预后的潜在生物学标志;
  3.Th1细胞通过分泌IFN-γ,刺激纤维细胞表面MHCⅡ分子的表达,teprotumumab可减少Th1细胞分泌的IFN-γ并减弱纤维细胞表面MHCⅡ分子的表达;
  4.Teprotumumab可减弱抗原刺激时Th1细胞的活化效应,并减弱纤维细胞的抗原呈递作用,这种效应在TAO患者和健康对照人群来源的外周血纤维细胞中没有明显差异。说明teprotumumab有效治疗TAO的机制,一部分可能是通过减弱Th1细胞和纤维细胞对自身抗体的免疫效应来实现的。
[硕士论文] 姜妍芳
内分泌与代谢病 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨2型糖尿病患者尿白蛋白/尿肌酐与糖尿病眼部病变的关系以及相关因素,为临床诊断提供依据。
  方法:
  回顾性分析2015年6月至2016年6月于安徽省立医院内分泌科病房住院,明确诊断为T2DM的所有患者总共472例患者的临床资料。按照尿白蛋白/尿肌酐(UALB/UCr∶ UACR)≥30mg/g为标准分为升高与否两组;再按照眼部情况分为3组:糖尿病视网膜病变(DR)组、白内障组、眼部正常组。统计UACR和眼部病变发生率;比较各组研究对象的一般资料、指标,包括年龄、性别、糖尿病病程、血压、体重指数(BMI)、糖化血红蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、UACR。统计学分析采用SPSS22.0进行处理。
  结果:
  (1)472例患者中,UACR增高发生率为35.38%,DR的发生率为5.30%,白内障发生率为35.59%。
  (2) UACR正常患者均无视网膜病变,UACR增高组中DR的发生率14.07%。UACR正常组白内障发生率30.49%,UACR升高组白内障发生率44.91%,差异有统计学意义,P=0.028。
  (3)①病程:与UACR正常组比较,UACR增高组糖尿病病程明显延长,差异具有统计学意义,P=0.025<0.05。UACR升高患者中,与眼部正常组比较,白内障组和糖尿病视网膜病变组糖尿病病程明显延长,差异有显著统计学意义,P值分别为0.001和0.002(均<0.01);与UACR正常组相比,伴UACR增高的眼部正常组,糖尿病病程差异无统计学意义,P=0.699,提示可能部分患者UACR与糖尿病关系不密切。
  ②年龄:与UACR正常组比较,UACR增高组年龄差异无统计学意义,P=0.054。UACR升高患者中,眼部正常组和白内障组的年龄差异有显著统计学意义,P=0.001;白内障组和DR组的年龄差异有显著统计学意义,P=0.001;眼部正常组和DR组的年龄差异有统计学意义,P=0.044;白内障组的年龄明显大于DR组,DR组的又大于眼部正常组。
  ③血压:与UACR正常组比较,UACR增高组合并高血压差异具有显著统计学意义,P=0.002。而UACR升高患者中,眼部正常组、白内障组和糖尿病视网膜病变组间否合并高血压差异无统计学意义,P=0.477。
  ④血尿素氮(BUN):与UACR正常组比较,UACR增高组血尿素氮差异无统计学意义,P=0.08。UACR升高患者中,DR组与白内障组、眼部正常组之间的BUN差异存在显著统计学意义,P值分别为0.007和0.006;而白内障组与眼部正常组之间的BUN差异无统计学意义。提示糖尿病患者肾脏功能与视网膜病变有一定的关联性,而与白内障关系不大。
  ⑤性别、体重指数(BMI)、糖化血红蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、尿酸(UA): UACR正常组与UACR增高组之间、DR组与白内障组和眼部正常组3组间差异均无统计学意义。
  ⑥尿白蛋白/肌酐(UA1b/Cr):UACR增高患者中DR组与白内障组、眼部正常组3组间差异均无统计学意义,P=0.495。
  结论:
  (1)2型糖尿病患者糖尿病肾脏疾病的发生率远高于糖尿病视网膜病变发病率,二者均随病程延长而增高;与性别、BMI无明显相关。
  (2)糖尿病视网膜病变者均存在不同程度尿白蛋白排泄增加,提示尿白蛋白/尿肌酐升高可能可预测糖尿病视网膜病变的发生。
  (3)糖尿病患者白内障发生与病程长、增龄及肾功能变化有关。
  (4)高血压是肾脏损害的重要危险因素,与糖尿病眼部病变无关。
[硕士论文] 葛力铭
内科学 大连医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:甲状腺相关性眼病(Thyroid associated ophthalmopathy,TAO)为最常见的自身免疫性疾病的甲状腺外并发症,在Graves病(Graves’Disease,GD)患者中,发病率可高达25%[1],TAO的早期诊断可以使疾病得到有效的治疗,大剂量糖皮质激素静脉治疗是活动期的TAO的一线治疗方法[2],目前静脉激素治疗应用较为广泛的方案:前6周,每周应用500mg甲泼尼龙,后6周,每周应用250mg甲泼尼龙,共计12周,累积剂量达4.5mg[3]。本研究将探讨甲状腺相关性眼病大剂量激素冲击治疗前后疗效及安全性。
  方法:
  1、选取2013年1月至2017年1月在我院内分泌2科住院,符合TAO活动期诊断、入组标准及排除标准的患者共计17例为病例组,收集患者的姓名、年龄、性别、身高、体重、腹围、是否吸烟、既往主要病史、TAO病史及家族史。
  2、冲击前后行眼科检查,明确患者治疗期间眼部变化,包括:突眼度、双眼的视力、眼压,冲击前后对患者进行CAS评分,通过对以上几项的对比来观察治疗的有效性。
  3、检测患者冲击治疗前后血常规、尿常规、电解质、肝功能、OGTT实验、皮质醇节律以及骨量的变化,并持续观察患者有无反酸、烧心、嗳气、呃逆、腹胀、腹痛等消化道溃疡等症状;患者有无咳嗽咳痰等呼吸系统感染的症状;有无尿频、尿急等;泌尿系感染的症状;通过对以上几项的对比来评估治疗的安全性。
  4、所有数据使用SPSS17.0统计软件进行统计分析,符合正态分布的资料采用均数±标准差(X(-)±S)表示,组间比较采用T检验进行分析。不符合正态分布的数据,采用M(Q25-Q75)表示,组间比较采用Mann-Whitney秩和检验。采用Pearson相关分析进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:
  1、大剂量激素冲击治疗后与治疗前相比较,突眼度及CAS评分显著降低。左突眼度为[P<0.01;16(15-17) vs18(16.5-19.5)mm],右突眼度为[P<0.01;16(14-18) vs17(16-20)mm],CAS评分为[P<0.01;8(7.5-9) vs5(4-6)],另外,患者眼压明显降低,视力也有明显好转,差异具有统计学差异(P<0.05);右眼压[P<0.01;16(14.5-17) vs18(17-19)mmHg],左眼压为[P<0.01;16(14-18.5) vs18(17-21.5)mmHg],左眼视力[P<0.01;0.80(0.55-1.00) vs1.00(0.85-1.00)],右眼视力改变也有统计学差异[P<0.01;1.00(1.00-1.00) vs0.80(0.45-0.90)]。
  2、CAS评分的改善程度与TAO的病程呈正相关(r=0.840,P=0.000),而与GD的病程、BMI指数以及年龄无关;
  3、治疗后恢复情况所占在人数以及百分比:其中 CAS评分降低了1~2分的有4人,占了23.53%,CAS评分降低了3~4分的有12人,占了70.59%,,CAS评分降低了5分以及以上的有1人,占了5.88%。
  4、治疗前后对比,患者血压、BMI、肝功能、皮质醇(8点、16点、24点)、血糖、离子代谢、PTH的变化未见统计学差异。
  5、激素冲击引起不同副作用的人数以及所在百分数:结合患者实验室检查以及相关体征,经过治疗后,有1人出现骨量减低,占总人数5.88%,有2人出现了泌尿系统感染,占总人数11.76%,有2人出现了消化道的症状,占总人数11.76%,有2人出现了轻微库欣貌,占总人数11.76%,有4人出现了新发的糖代谢异常,占总人数的23.53%,其余呼吸道感染、新发糖尿病、肌痛以及肌无力、低钾血症以及抑郁症等副作用未有发生。
  结论:大剂量糖皮质激素冲击治疗甲状腺相关性眼病的有效性和安全性优于治疗前,尤其是在缓解眼部软组织炎症方面,对于提高视敏度、减少眼压、减低突眼度等方面均有较明显的作用。
[博士论文] 邱巧昀
整形外科 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 泪槽相关测量指标的探讨
  目的:利用计算机辅助照
  相测量法,对泪槽相关表面解剖结构的各项指标进行测量研究,在Barton分级系统的基础上,为泪槽畸形的严重程度提供可量化的数据评价参考系统。
  方法:按Barton分级(0-Ⅲ级)选取就诊于我科的求美者为研究对象。每级50例(伴眼袋组25例,无眼袋组25例),共200例,其中男12例,女188例,平均年龄27.6岁。使用数码相机拍摄标准数码照片,应用Image-Pro Plus7.0图像分析软件,处理分析拍摄合格的照片,测量泪槽区域表面结构之线性与角度测量指标的值,所得数据采用方差检验、独立样本T检验进行分析。
  结果:①无眼袋组与伴眼袋组之间的内眦间距、睑裂宽度、下睑缘长、睑裂倾斜度无显著差异(P>0.05),不同程度泪槽畸形(0-Ⅲ级)之间的内眦间距、睑裂宽度、下睑缘长、睑裂倾斜度也无显著差异。②BartonⅠ级泪槽长、泪槽高分别为14.74±1.73mm、14.51±1.47mm; BartonⅡ级泪槽长、泪槽高分别为20.98±2.23mm、18.38±0.85mm; BartonⅢ级泪槽长、泪槽高分别为23.68±2.70mm、19.18±0.87mm。③BartonⅢ级之泪槽长度,有眼袋组大于无眼袋组,其差异具有统计学意义(p<0.05)。
  结论:本研究测量了泪槽区域表面解剖结构的各线性与角度测量指标的值,结合Barton分级系统,将泪槽畸形的严重程度量化,为泪槽畸形的治疗提供了一组较系统的数据体系。
  第二部分 改良术式矫正泪槽畸形的临床应用与客观测量指标在术后效果评价中的意义
  背景与目的:现有文献报道关于泪槽畸形的手术治疗方法多种多样,从过去的手术去除眶隔脂肪,到眶隔膜的折叠、收紧加固,转变为以保留并重置眶隔脂肪为主的术式。然而,我们在临床工作中发现,部分患者术后仍存在泪槽畸形纠正不足的情况。本研究对现有术式进行改良,采用“改良经结膜入路眶脂释放并眶隔重置法”手术矫正泪槽畸形,并将泪槽相关测量指标应用于术后效果评估中,结合Barton分级系统及满意度调查,以全面客观探讨该方法之临床疗效。
  方法:针对存在眶隔脂肪突出,皮肤松弛不明显或仅有轻度皮肤松弛,下睑部皱纹、皱折不明显,以眶缘凹陷、眶睑沟明显为主要美容缺陷的年轻患者,采用“改良经结膜入路眶脂释放并眶隔重置法”手术矫正,并从Barton分级系统、泪槽相关表面解剖结构测量及满意度调查等方面对术后效果进行评价。
  结果:①术前评估34例BartonⅠ级中,术后0级为30例(88.2%)、无改善4例(11.8%);44例Ⅱ级中,术后0级为35例(79.5%)、Ⅰ级为9例(20.5%);24例Ⅲ级中,术后0级为20例(83.3%)、Ⅰ级为3例(12.5%)、Ⅱ级为1例(4.2%)。②各分级之睑裂宽度、下睑缘长及睑裂倾斜度,术后相对于术前无显著改变,差异无统计学意义(p>0.05)。③术后眼袋长、泪槽长、眼袋高、泪槽高、眼袋高/睑裂宽度、泪槽高/睑裂宽度等指标相对术前均明显减少,差异具统计学意义(p<0.05)。
  结论:改良经结膜入路眶脂释放并眶隔重置术式能有效矫正泪槽畸形及眼袋,术后无严重并发症,总体满意度高。泪槽表面解剖结构测量指标对术后效果评价有指导意义。
  第三部分 三种经结膜入路术式临床疗效的系统评估与对比分析
  背景与目的:目前泪槽畸形手术治疗方式包括两大类:眶脂释放转移法及眶隔重置法。两种术式皆能取得一定疗效,但现有文献中关于两者的对比分析较少。本研究将两种术式进行对比,并将我们的改良术式与之进一步比较,系统评估其治疗效果,以作为临床治疗选择的参考。
  方法:回访2010年8月至2015年9月间在本院接受过泪槽畸形手术治疗的有效随访1年以上之患者,共136位,8位男性,128位女性,年龄20-46岁(平均年龄31.1岁)。根据手术方式分为三组,组1采用经结膜入路单纯眶脂释放法,组2采用经结膜入路单纯眶隔重置法,组3采用改良经结膜入路眶隔释放并眶脂重置法。结合Barton分级系统、满意度调查及并发症发生率,全面评价术后效果,并使用T检验、秩和检验分析评价结果。
  结果:①术后评分比较:组1与组2相比,对BartonⅠ级无统计学差异(p>0.05),对BartonⅡ、Ⅲ级有统计学差异(p<0.05)。组2与组3相比,对BartonⅠ级无统计学差异(p>0.05),对BartonⅡ、Ⅲ级有统计学差异(p<0.05)。②术后总体疗效比较:组1与组2、组1与组3有统计学差异(p<0.05),组2与组3无统计学差异(p>0.05)。
  结论:三种经结膜入路保留并重置眶隔脂肪术式对轻度泪槽畸形疗效无明显差异,但对中、重度的泪槽畸形,改良眶隔释放并眶脂重置法治疗效果最显著。
  第四部分 泪槽畸形的注射充填与手术治疗之疗效分析
  目的:泪槽畸形的矫正在下睑区域在面部年轻化的治疗中极具挑战性,随着人们对治疗效果的要求不断提高,创伤的程度、恢复期的长短、疗效的持久性,都成为影响患者满意度的因素。故本研究分析了注射充填与手术疗效,为泪槽畸形的治疗提供参考。
  方法:回访2013年9月至2015年9月在本院接受过泪槽畸形治疗的有效随访患者,共144位,8位男性,136位女性,年龄20-45岁(平均29.6岁)。根据治疗方式将患者分为三组,组1采用透明质酸注射充填,组2给予自体脂肪移植充填,组3使用改良经结膜入路眶脂释放并眶隔重置术式。结合Barton分级系统、满意度调查,全面评价术后效果,并使用T检验、秩和检验分析评价结果。
  结果:①术后评分比较:组1与组2相比,对BartonⅠ级无统计学差异(p>0.05),术后6个月对BartonⅡ、Ⅲ级有统计学差异(p<0.05),术后1年对BartonⅢ级有统计学差异(p<0.05)。组1与组3相比,术后6个月对BartonⅠ、Ⅱ级无统计学差异(p>0.05),对BartonⅢ级有统计学差异(p<0.05)。术后1年各级差异均有统计学差异(p<0.05)。组2与组3相比,术后6个月及术后1年对BartonⅠ级均无统计学差异(p>0.05),对于BartonⅡ、Ⅲ级有统计学差异(p<0.05)。②术后总体疗效比较:组1、组2、组3术后6个月无统计学差异(P>0.05),术后1年组1与组2无统计学差异(P>0.05),组1与组3、组2与组3有统计学差异(p<0.05)。
  结论:注射充填治疗更适合用于轻、中度泪槽畸形。其中,透明质酸注射、自体脂肪移植两种注射填充方法对轻度泪槽畸形皆有良好效果,但对于中度或以上的泪槽畸形,透明质酸注射充填近期效果较好,而自体脂肪移植充填远期效果相对较佳。手术治疗对中、重度泪槽畸形均有较好的优势,其改善程度大、维持时间长。
[硕士论文] 娄恒
眼科学 第二军医大学 2016(学位年度)
摘要:目的:
  甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)是弥漫性毒性甲状腺肿(Graves' disease,GD)最常见的甲状腺外表现,是累及眼眶的一种自身免疫性炎症性疾病。TAO具体发病机制十分复杂,至今仍不十分清楚,目前仍缺乏有效性治疗手段。目前证据表明眼眶成纤维细胞(orbital fibroblasts,OFs)在TAO发病机制中起核心作用,参与TAO眼眶炎症、组织重塑和纤维化等多种病理过程。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种分泌型磷酸化糖蛋白,在一些自身免疫性疾病中发挥重要作用,具有多种生物学效应,可诱导成纤维细胞增殖,并且和组织纤维化有密切关系,最近研究发现,GD患者血清中OPN水平明显增高。为了探究OPN和TAO发病的关系,首先拟检测TAO眼眶脂肪结缔组织中OPN mRNA和蛋白表达情况,相关细胞因子mRNA表达情况以及和OPN mRNA表达量之间的关系。然后进行细胞实验,用OPN刺激TAO患者来源OFs,观察OPN对OFs增殖、移行以及对VEGF和CollagenⅠ mRNA表达量的影响并探究其相关机制。
  方法:
  1.OPN在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中的表达情况
  活动期或稳定期TAO患者行眼眶减压手术时,取眼眶脂肪结缔组织,用行眼整形手术患者的正常眼眶脂肪结缔组织作为对照组,每组6例。实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)法和Western blotting法分别检测OPN mRNA和蛋白表达情况。然后通过RT-PCR检测相关细胞因子包括CD40L、CollagenⅠ、HAS2、NF-κB、CCL20、CD44、IFN-α和IFN-γ mRNA表达情况,并和OPN mRNA表达量进行相关性分析。
  2.OPN对TAO患者OFs的影响及其作用机制探讨
  排除其它免疫性及炎症性疾病的TAO患者,行眼眶减压手术时,无菌条件下取眼眶脂肪结缔组织,组织块法培养OFs细胞。用OPN(5uM)进行预处理后,采用MTT法观察OFs增殖速率,并通过细胞划痕实验观察OPN对OFs移行的影响,再通过RT-PCR法检测OFs的VEGF和CollagenⅠ mRNA表达量。
  同法培养OFs细胞,用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002(20uM)、MAPK/ERK信号通路抑制剂PD98059(20uM)、LY294002和PD98059(20uM+20uM)以及OPN单克隆抗体1A12(20μg/ml)分别联合OPN对OFs进行预处理,通过MTT法、细胞划痕实验和RT-PCR法分别观察对OFs增殖、移行速率的影响,并检测OFs的VEGF和CollagenⅠ mRNA表达量的变化。
  结果:
  1.活动期TAO患者眼眶脂肪结缔组织OPN mRNA和蛋白表达量及相关细胞因子mRNA表达量升高
  活动期TAO患者组眼眶脂肪结缔组织中OPN mRNA比稳定期TAO患者组和正常对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);OPN蛋白表达量也明显增加,和稳定期TAO患者OPN蛋白表达量相比有统计学差异(P<0.05),但和正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
  活动期TAO患者组眼眶脂肪结缔组织中CD40L、CollagenⅠ mRNA表达量比稳定期TAO患者组和正常对照组高,存在统计学差异(P<0.05); HAS2 mRNA表达量也升高,但和稳定期TAO患者组和正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);活动期和稳定期TAO患者组CD44 mRNA表达量均低于正常对照(P<0.05)。TAO患者OPN mRNA表达量和CD40L、CD44、HAS2 mRNA表达量之间存在明显的线性相关关系(P<0.05)。
  2.OPN可促进OFs的增殖、移行速率,并增加VEGF和CollagenⅠ mRNA表达量。
  经过OPN处理后,OFs增殖和移行速率加快,加入1A12和LY294002后,OFs增殖和移行速率变慢,而加入PD98059后对这些效应无明显影响。
  经OPN预处理后,OFs的VEGF和CollagenⅠ mRNA表达量明显增加,加入1A12和LY294002后,VEGF和CollagenⅠ mRNA表达量降低,加入PD98059后对两种基因mRNA表达量无明显影响。
  结论:
  活动期TAO患者眼眶脂肪结缔组织OPN mRNA和蛋白表达水平明显升高,同时CD40L、CollagenⅠ和HAS2 mRNA表达量也增加,且CD40L、CD44、HAS2mRNA表达量和OPN mRNA表达量之间呈明显的线性相关关系。OPN可以通过PI3K/Akt信号通路促进OFs增殖和移行,刺激OFs高表达CollagenⅠ和VEGFmRNA,说明OPN可能在活动期TAO发病机制中发挥重要作用,通过PI3K/Akt信号通路,协同CD40L、HAS2活化OFs以促进眼眶炎症的发生发展以及眼眶组织重塑和纤维化。
[博士论文] 李三明
生理学 厦门大学 2016(学位年度)
摘要:文章从以下三部分进行论述:
  第一部分:睑板腺功能障碍诱导的小鼠干眼动物模型的建立
  目的:睑板腺功能障碍(MGD)是引起蒸发过强型干眼最常见的病因,但是MGD引起的眼表面病变的病理生理过程目前还知之甚少。本研究的主要目的是建立蒸发过强型干眼的动物模型,并观察该类型干眼的眼表病理变化过程。
  方法:用裂隙灯显微镜观察外异蛋白基因(EctodysplasinA,EDA)突变鼠(Tabby鼠)的眼表病变过程,用荧光素钠染色方法检测Tabby鼠的角膜上皮缺损状况,用酚红棉线检测小鼠的水性泪液分泌,对角膜和眼睑进行H&E染色和油红染色。用扫描电镜观察眼表面上皮细胞的微绒毛变化。用蛋白质电泳(Western blot)和/或实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测眼表上皮K12、K10、SPRR1B、MUC5AC、MUC1、MUC4、MUC13和MUC15等基因或蛋白的表达情况。
  结果:8周龄至16周龄Tabby鼠的眼表相继出现角膜上皮缺损,角膜基质混浊,角膜新生血管长入以及角膜血管翳形成等病变。Tabby鼠的水性泪液分泌没有减少,但体外泪液蒸发时间显著变短。Tabby鼠角膜上皮细胞表面微绒毛明显减少、缩短。Tabby鼠的结膜杯状细胞分布密度没有变化,但其MUC5AC和MUC5B表达显著增加。Tabby鼠角膜上皮K10和SPRR1B的表达于出生后第4周开始上升,并随时间逐渐增强,这说明Tabby鼠角膜出现鳞状上皮化生。
  结论:Tabby鼠的眼表病变与蒸发过强型干眼的眼表病变相似,可以作为睑板腺功能障碍诱导的干眼小鼠动物模型。对Tabby鼠眼表病变的研究将有助于我们更深入地了解睑板腺在维持眼表健康中的作用,为今后开发筛选新药物治疗这类疾病提供帮助。
  第二部分:外异蛋白(Eda)促进角膜上皮细胞增殖
  目的:EDA基因编码Ectodysplasin A(Eda)蛋白,该基因突变会导致X染色体连锁外胚层发育不良综合征(X-linked anhidrotic-hypohidrotic ectodermal dysplasia,XLHED)。XLHED患者可出现睑板腺发育障碍,但Eda蛋白在眼表的作用并不清楚。
  方法:裂隙灯显微镜下观察EDA基因突变鼠(Tabby鼠)的眼表病变。采用ELISA方法检测人泪液、血浆中的Eda浓度。用蛋白质电泳(Western blot)和/或免疫荧光(IF)以及实时定量PCR(qRT-PCR)检测Eda、Eda受体Edar、Ki67、EGFR、磷酸化EGF(p-EGFR)、磷酸化ERK1/2(p-ERK)的表达。用划痕实验检测Eda蛋白对人角膜上皮细胞系HCE细胞的迁移作用,用CCK8试剂检测Eda蛋白对HCE细胞的促增殖作用。
  结果:Eda蛋白高表达于小鼠睑板腺腺泡上,人泪液中含有Eda蛋白,但血浆中未检测出Eda蛋白。在4-8周龄Tabby鼠,角膜上皮存在缺损,角膜上皮厚度较薄。Tabby鼠角膜上皮的增殖细胞较少,角膜上皮损伤愈合速度较慢,在体外培养眼球中发现Eda蛋白促进角膜上皮损伤愈合。Tabby鼠角膜上皮EGFR、p-EGFR、p-ERK1/2的表达水平较同龄野生型小鼠低,体外细胞培养显示Eda蛋白促进HCE细胞Ki67、EGFR、p-EGFR和p-ERK1/2的表达,且变化趋势与Eda蛋白浓度正相关。
  结论:睑板腺分泌Eda蛋白进入泪液,并促进角膜上皮细胞增殖。Eda重组蛋白有望在临床上用于治疗角膜上皮损伤。
  第三部分:外异蛋白(Eda)通过激活SHH信号通路调控上皮屏障
  目的:探讨Eda蛋白对角膜和皮肤上皮屏障功能的作用。
  方法:裂隙灯显微镜下用荧光素钠染色观察Tabby鼠的眼表病变。用羧基荧光素(carboxy fluorescein)做角膜渗透性实验,用蛋白质电泳(Western blot)和/或实时定量PCR(qRT-PCR),以及免疫荧光(IF)方法检测角膜、皮肤,以及人角膜上皮细胞系HCE细胞的ZO-1、Claudin-1、Gli-1、Shh的表达。用LB固体培养基进行角膜组织匀浆的细菌培养。
  结果:饲养在普通级环境的Tabby鼠的角膜血管翳形成和尾部皮肤溃疡的发病率高于SPF级饲养环境。Tabby鼠的角膜和皮肤上皮紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1表达水平明显低于同龄野生型小鼠。Eda蛋白可以显著改善Tabby鼠的角膜上皮屏障破坏。体外皮肤培养以及HCE细胞培养实验证实Eda蛋白可以通过激活Shh信号通路来调节ZO-1和Claudin-1的表达。
  结论:Eda蛋白调控表皮细胞间紧密连接的形成,对表皮屏障至关重要。我们的发现不仅揭示了EDA基因新的功能,也对XLHED相关疾病的发病机制提供新的视角。
[硕士论文] 崔欣
临床医学 天津医科大学 2016(学位年度)
摘要:目的:探讨生后早期双眼形觉剥夺对大鼠视觉传导通路电生理学特性的影响。
  方法:选取50只8d龄健康SPF级Wistar大鼠,雌雄不限,随机分为双眼形觉剥夺组与正常对照组。其中,双眼形觉剥夺组在出生后睁眼前缝合双侧眼睑制作双眼形觉剥夺模型。另一组作为正常对照组不做任何处理。将两组在同一昼夜交替环境下饲养(12h白天/黑夜)。于视觉发育关键期后期(生后38-44d)利用图形视觉诱发电位(pattern visual evoke potential,PVEP)观察比较两组大鼠图形视觉诱发电位P100波潜时值与振幅的差异,并利用全细胞膜片钳记录技术观察两组大鼠视皮层单个椎体神经元细胞固有膜特性值并分析其差异。
  结果:双眼形觉剥夺组PVEP中P100波的潜时值为(95.67±14.67)ms,大于正常对照组的(83.66±10.82)ms,差异有统计学意义(t=-3.338,P=0.002);双眼形觉剥夺组PVEP中P100波的振幅峰值为(3.02±1.02)μV,低于正常对照组的(7.42±1.65)μV,差异有统计学意义(t=11.275,P=0.000)。正常对照组的视皮层神经元细胞的膜电容值(45.18±19.09)pF、膜电阻值(55.84±12.03)MΩ、时间常数值(37.52±10.84)ms与双眼形觉剥夺组视皮层神经元细胞的膜电容值(50.01±15.86)pF、膜电阻值(58.85±14.15)MΩ、时间常数值(43.60±12.09)ms之间分别比较,差异无统计学意义( P>0.05,t=-1.534),( P>0.05,t=0.688),(P>0.05,t=-1.103)。
  结论:1.生后早期双眼形觉刺激不足可以使大鼠PVEP的P100波振幅降低及潜时值较正常组延长,表明异常视觉环境使视觉传导通路信号传递延迟。
  2.生后早期进行双眼形觉剥夺对视皮层单个神经元细胞的固有膜电生理特性的影响较小,单个神经元细胞电学特性的成熟并不依赖于视觉环境。
[硕士论文] 汪鹏
眼科学 第二军医大学 2016(学位年度)
摘要:研究目的:
  1、探讨经结膜入路Müller's肌切除术对TAO上睑退缩患者的眼表及眼睑位置的影响;2、分析实验组和对照组Müller's肌间的病理组织学差异,试图阐述TAO发生上睑退缩的可能机制。
  研究方法:
  1、前瞻性收集2015年4月至2015年7月至上海长征医院就诊的轻中度上睑退缩的TAO患者20例(22只眼),所有患者均在表面麻醉+局部浸润麻醉下行结膜入路Müller's肌切除术。于术前1天、术后1天、术后2周、术后45天、术后3月对相关数据进行采集,采用相机拍摄外观照、直尺法和Image J软件法测量眼睑指标(MRD1、实际重睑宽度、SFH、中央睑裂高度、上睑肌力、眼睑闭合不全程度等)、采集眼表指标(BUT、SIT、FL)、计算眼表面积,统计OSDI量表和TAO生活质量量表问卷评分。2、11例(13只眼)TAO患者的Müller's肌作为实验组标本,4例(4眼)行先天性上睑下垂矫正术患者的Müller's肌作为对照组标本,福尔马林固定所有标本,石蜡做组织包埋,继而切片、HE染色,光镜下观察病理组织切片的脂肪浸润和纤维化情况。
  研究结果:
  1、(1)直尺法、Image J软件法均可以对眼睑指标进行有效测量。
  (2)经结膜入路Müller's肌切除术术后3月TAO患者实际上睑重睑宽度平均增加2.00mm、SFH平均增加2.02mm。
  (3)经结膜入路Müller's肌切除术术后3月上睑肌力与术前无明显差异。
  (4)经结膜入路Müller's肌切除术术后3月TAO患者仍有上睑迟落和眼睑闭合不全。
  (5)经结膜入路Müller's肌切除术术后2周中央睑裂高度、OSA与术后3月差异不明显。
  (6)局部麻醉药剂量与MRD1、实际重睑宽度、SFH、OSA等无相关性。
  (7)经结膜入路Müller's肌切除术矫正TAO上睑退缩后3月,BUT减小、OSDI问卷评分降低、TAO生活质量量表评分增高;
  2、实验组Müller's肌纤维化与对照组之间有统计学差异(P<0.001),Müller's肌脂肪浸润状态与对照组之间无统计学差异(P=0.188)。
  研究结论:
  1、经结膜入路Müller's肌切除术是无疤痕、愈合快、并发症少的矫正轻中度TAO上睑退缩的手术方式,术后重睑宽度平均增加2.0mm,该术式可以减轻上睑迟落和眼睑闭合不全程度。虽然术后BUT减小,但FL、SIT手术前后无变化,OSDI问卷评分显示患者自我感觉良好,生活质量有提高。
  2、Müller's肌发生纤维化可能是部分TAO患者发生上睑退缩的原因之一。
[博士论文] 陈禾君
眼科学 上海交通大学 2016(学位年度)
摘要:目的:
  探究慢性肾衰患者血透前后眼部变化,不同原发病因肾衰及血透过程对眼部变化的影响,寻找影响这些改变的基础因素,为肾功能不全患者血透前后眼部防护提供科学的建议。
  方法:
  将2014年2月至2014年10月上海交通大学医学院附属瑞金医院终末期肾病的血液透析治疗患者45例,共90眼纳入研究,对照组47例,共94眼,血透组于单次血透前后一小时行全面眼科检查,包括电脑验光、最佳矫正视力、干眼评估、眼压、前房、角膜、晶状体、视网膜和脉络膜的相关生物数据测量,对照组行相同检查一次,再将血透组按病因分为原发性肾病、高血压肾病、和糖尿病肾病亚组,收集所有患者的血压、肾功能指标、血电解质等资料。采用独立样本t检验、配对t检验、单因素方差分析、最小显著差检验、多元线性回归分析等方法对数据进行统计学分析。
  结果:
  血透组血透前除部分(A4、A5区)视网膜厚度及角结膜钙盐沉积情况外,其余眼科指标均与对照组无显著性差异。血透后,泪膜破裂时间由(7.603±6.502)秒降至(5.852±5.681)秒,P=0.003;Schirmer's I实验结果由(12.056±8.762)毫米降至(10.006±7.721)毫米,P=0.010;眼压由(12.77±2.67mmHg)降至(12.21±2.41)mmHg,P=0.034;前房深度由(2.630±0.458)毫米降至(2.601±0.516),P=0.034;晶状体厚度血透前(4.153±0.413)毫米,血透后(4.056±0.389)毫米,P小于0.001;PNS分级由(0.6067±0.7009)升至(0.7079±0.7262),P=0.019;A3、A4、A6、A7区平均视网膜厚度上升,P均小于0.05;视网膜神经纤维层厚度血透前后(94.20±14.00)微米vs(96.54±14.78)微米,P=0.003;脉络膜厚度由血透前(276.26±76.84)微米下降至血透后(240.84±69.38)微米,P小于0.001;其余眼科指标血透前后无显著性差异。不同病因在血透过程中各项参数的改变情况趋势相同。经验证,眼压、泪膜破裂时间、Schirmer’sI实验、视网膜厚度与容积、脉络膜厚度预测方程较为准确。
  结论:
  ESRD患者血透可全方位影响眼部情况,以干眼、角结膜钙盐沉积、眼压改变、视网膜及脉络膜厚度变化最为明显;不同原发病因患者在血透过程中眼部参数改变情况趋势一致。患者血透前IOP等参数可以用于预测其血透过程中部分关键眼部参数变化,对指导血透后眼部防护有着重要的临床意义。
[博士论文] 陈静
外科学(整形) 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2016(学位年度)
摘要:目的:1.初步建立关于国人正常眶骨形态学三维数字化测量数据库,为眼眶畸形手术,尤其为本研究课题后续涉及到的创伤后眼球内陷畸形矫正的诊断分析、术前设计及评估预后提供参考依据。
  2.基于三维数字化技术,探索一种相对简便易行的方法对Medpor植入体矫正陈旧性创伤后眼球内陷的手术治疗进行术前设计和术中指导,以达到个性化矫正,提高手术的精确性和安全性。
  3.构建关于Medpor修复眶底缺损的三维有限元模型,分析生物力学性质,探究Medpor材料植入眶底后的位移及应力情况。
  方法:1.收集2011.8~2015.12之间就诊我院的正常汉族成年求美者中的102例三维CT数据,通过数据采集、三维重建、选点测量、计算归纳等步骤,统计学软件分析所测量到的眶骨形态学参数并对男女性之间的差异进行比较。
  2.收集2013.8~2015.12之间就诊我院并已接受手术的陈旧性创伤后眼球内陷患者15例。采用回顾性对照研究设计。分为个性化Medpor植入组(A组)及非个性化Medpor植入组(B组)两组别,分别评估A、B两组患者一般资料及预后指标的差异。
  3.构建Medpor修复眶底缺损三维有限元模型,利用有限元方法分析Medpor材料在不同固定条件下位移及应力情况。
  结果:1.通过三维重建测量得到正常国人眶骨一系列形态学参数的平均值:男女性参数分别为眶宽39.91mm和38.87 mm、眶高33.72mm和33.58 mm、眶内侧壁长46.15mm和45.50 mm、眶外侧壁长47.89 mm和47.73 mm、眶底长47.79 mm和46.77mm、眶顶长52.65 mm和51.77 mm、眶内间距27.04 mm和25.33 mm、眶外间距96.95 mm和93.37 mm、眶周长127.05 mm和122.07 mm和骨性眶容积26.06ml和24.33ml。男女性之间参数比较:其中70%(7/10)男性参数显著大于女性;男女性眶骨参数左右之间比较部分有统计学意义,差异度均小于0.5mm,可以认为这种差异性尚不能影响双侧眼眶对称性外观。
  2.A组的患侧眼球突度变量及眼眶容积变量均高于B组,具有统计学差异,表明A组方法矫正眼球内陷的效果有优势。眼眶容积变量和眼球突度变量之间成正相关(r=0.583)。线性回归方程为:眼球突度变量=0.379+0.880×眶容积改变量。
  3.最终构建了Medpor修复眶底缺损的三维有限元模型;无固定螺钉情况下,Medpor材料位移较大,几乎无应力;在有固定螺钉情况下,一枚固定螺钉的应力值与两枚固定螺钉应力值接近。
  结论:1.初步建立了一个有关正常眶骨形态学参数的三维数字化测量数据库。所测数据为眼眶区域手术的术前设计及术后效果评估提供参考。
  2.三维数字化重建技术可以应用于陈旧性创伤后眼球内陷的个性化治疗,个性化Medpor植入体组的治疗效果优于传统的非个性化Medpor植入体组;该技术为创伤后眼球内陷的术后评估提供了可以量化的数字化评价指标;眶内填充材料体积与眼球突度之间存在正相关。
  3.首次建立了关于Medpor修复眶底缺损的三维有限元模型;利用有限元方法发现,螺钉的植入能够对Medpor材料起到良好的固定作用,其中一枚螺钉与两枚螺钉的固定作用相似;而当Medpor材料无固定螺钉作用时,其位移较大,基本处于无约束的状态;手术操作者可根据术中情况及个人经验做出选择。
[硕士论文] 王天佐
临床医学 石河子大学 2015(学位年度)
摘要:目的:对我院1854例住院盲目患者的病因进行分析,根据不同致盲眼病的治疗效果,探讨防盲治盲的策略和方向,并针对1854只盲眼进行治疗后仍未脱盲的410只盲眼进行病因分析,探讨其发生的原因。
  方法:选取2010年9月至2013年8月在我院眼科住院病人5473例,其中盲目患者共计1854例,占住院患者的33.88%,按照国际WHO制定的最佳矫正视力<0.05或视野半径小于10度者为盲,并排除小于3岁不能配合视力检查的患儿为纳入标准,对盲目患者的眼别、年龄、性别、职业和致盲病因进行分析,统计各年龄段的主要致盲眼病,记录各盲目患者经过治疗后的视力;并计算出各致盲眼病的脱盲率,对各致盲眼病经过治疗后未脱盲的病因进行分析,对治疗后仍未脱盲的410只眼进行分析及讨论。
  结果:盲目患者中,右眼盲728人,左眼盲767人,双眼盲359人,共计盲眼2213只,盲目患者年龄以60~80岁居多,男性盲眼1068只,女性盲眼1145只,患者职业多为退休及离休人员,在2213只盲眼中,进行治疗有2172只眼,其中1762眼(81.12%)脱盲,410眼(18.88%)未脱盲,致盲眼病的前3位依次为:白内障、糖尿病性视网膜病变和青光眼,在所有未脱盲眼病中,前3位依次为:糖尿病视网膜病、青光眼和视网膜脱离。410只未脱盲眼中,<40岁组(93只眼)与>40岁组(317只眼)病因均为13种,其中<40岁组均值为7.1538,标准差为8.18379,均值标准误为2.26977,≥40岁组均值为24.3846,标准差为30.75315,均值的标准误为8.52939;对于不同年龄组来说,F值为5.435,相伴概率为0.028,小于显著水平0.05,拒绝方差相等的假设,可以认为<40岁和≥40岁的未脱盲患者有显著差异。
  结论:近年来,致盲眼病的病因构成已发生了变化。白内障,糖尿病视网膜病及青光眼仍是致盲眼病的高发病因,虽然白内障的脱盲成功率较高,由于其致盲率较高,所以白内障、糖尿病视网膜病、青光眼及视网膜脱离等疾病的治疗是今后防盲治盲的重点。经过治疗后未脱盲患者的主要致盲原因与年龄、自身的眼部解剖因素、合并其他眼部疾病及社会和医疗等多种因素相关。
[硕士论文] 耿滕
动物学 扬州大学 2015(学位年度)
摘要:乙烷基亚硝基脲(Ethylnitrosourea,ENU)是一种人工合成的能导致多种生物体发生随机、单碱基突变的化合物。ENU能不依赖于任何代谢过程,而通过烷化反应将其乙烷基加入DNA碱基的部分基团,从而引起碱基配对错误,在较短时间内诱导小鼠产生大量随机突变表型。采用ENU诱变手段,本实验室得一种常染色体显性小眼畸形小鼠,该突变小鼠表现为一侧或双侧小眼畸形,且严重程度不一,该小鼠突变纯合子表现为出生时无眼且很快死亡。本研究以该突变系小鼠为研究对象,从以下三个部分开展研究工作:
  1、ENU诱变获得一例小眼小鼠
  通过ENU诱变,在G1代小鼠中筛查发现了小眼表型的小鼠,将其中一例小眼畸形C57BL/6(B6)雄性小鼠与正常B6雌鼠合笼,获得B6背景的杂合子小鼠,观察并记录100只后代中,其中23只小鼠具有小眼表型。将B6背景杂合子小鼠与DBA(D2)小鼠配种获得F1代小鼠,F1代小鼠回交B6得到N2代小鼠,记录的561只N2代小鼠中有21只表现为小眼表型。
  2、小眼突变基因的定位及鉴定
  为了定位该突变基因,将(B6×D2) F1突变杂合子小鼠回交B6获得N2代小鼠,提取N2代小鼠的鼠尾DNA,利用微卫星对突变小鼠的染色体进行全基因组扫描。定位结果表明在44个样品中突变基因与微卫星D18mit124与D18mit184之间未发生一例交换,最终将突变基因定位于微卫星D18mit124与D18mit184之间。通过对局部区域基因功能分析,初步判定RAX基因为本突变候选基因。
  设计扩增针对RAX基因编码区引物,对野生型及小眼小鼠DNA进行PCR扩增。产物回收后进行测序比对,结果显示突变小鼠RAX基因编码第559位碱处发生C到T的转换,导致编码区第187位密码子CGA(编码精氨酸)变为终止密码子TGA,引起蛋白编码提前终止。
  3、R187X无义突变对RAX蛋白功能影响分析
  RT-PCR扩增野生型及突变纯合子小鼠RAX基因,将其克隆到pMD19-T载体上,然后再亚克隆到pCMV-tag2B真核表达载体,分别命名为pCMV-tag2B-wRAX、pCMV-tag2B-mRAX。用脂质体2000将以上重组载体转染于COS-7细胞,分别用于后续的间接免疫荧光、PI染色以及EMSA实验。间接免疫荧光及PI染色结果显示正常及突变RAX蛋白都定位于细胞核,故排除R187X突变对RAX蛋白核定位的影响。EMSA实验结果显示R187X无义突变影响RAX蛋白与相关DNA序列结合,从而导致小鼠小眼表型。
[硕士论文] 林艳
眼科学 福建医科大学 2015(学位年度)
摘要:目的:
  探讨Stevens-Johnson综合征(SJS)并眼表损害的临床特征和诊治。
  方法:
  对2010年3月到2015年3月在福建医科大学附属第一医院确诊的11例Stevens-Johnson综合征(SJS)并眼表损害进行回顾性临床分析,研究其一般特征、病因、潜伏期、首发症状、就诊过程、治疗及结局。
  结果:
  本研究中11个SJS病人中,男性7例,女性4例,中位年龄为34岁,9例均有明确的药物过敏史,其中4例对别嘌呤醇过敏;4例对抗生素过敏;1例对碘造影剂过敏;2例病因不明。发病的中位潜伏期为20天,最早可于2天发病。6例以全身皮肤病损作为首发症状,如红斑、皮疹、水疱;3例以全身多处粘膜损害作为首发症状,如口腔、生殖器、眼部粘膜损害等;2例以发热为首发症状。9例在病程的初期出现发热,其中8例最高体温高于38℃,余下1例为37.3℃,1例不详。6例在疾病早期诊断明确,2例在发病4个月和13年后明确诊断,3例分别于外院误诊为水痘、带状疱疹、荨麻疹。在急性期,仅给予全身激素(甲强龙1.2mg/kg/d静滴)治疗2例,最后表现均为重度眼表损害,同时接受局部和全身激素治疗6例,其中3例表现为轻度眼表损害,3例为中度眼表损害;1例在急性期仅使用局部激素的病人,眼表损害表现为中度;1例未予激素干预的病人眼表损害为重度;余1例病人用药不详。8例病人急性期病情未能得到控制,病情迁延不愈,进入后遗症期且伴有中至重度的眼表损害。4例中度眼表损害的病人,采用人工泪液+激素仍未取得良好效果,症状严重时加用自体血清点眼,佩戴绷带镜避免角膜上皮的进一步损害,促进角膜上皮修复。4例重度眼表损害的病人,1例于外院行羊膜移植术,术后角膜混浊更甚,2例因角膜穿孔于我院行结膜瓣遮盖术,1例行结膜瓣遮盖+睑裂缝合术,术后眼表炎症静止。
  结论:
  Stevens-Johnson综合征(SJS)发病年龄跨度大,病因多以药物过敏为主,首发症状多样,容易在早期误诊。急性期局部激素可以改善预后,SJS合并眼表损害程度差异大,选择合适的治疗方法和时机很重要。
[硕士论文] 林滨榕
眼科学 福建医科大学 2015(学位年度)
摘要:目的:
  分析脑性瘫痪儿童视觉障碍的临床特点,讨论脑性瘫痪的围产期高危因素、不同类型、严重度及影像学表现等与视觉障碍的关系。
  方法:
  收集2014年7月至2014年12月期间确诊的125例脑性瘫痪儿童的临床资料,对其眼位、眼运动功能、眼底、屈光度及视敏度等视觉功能进行观察和分析。所有统计分析都采用统计学软件SPSS11.5进行;α=0.05为显著性检验标准。
  结果:
  1.125例患儿中,存在视觉障碍的53例,视觉障碍发生率为42.40%;合并的视觉障碍中以斜视与屈光不正发生率最高,分别为34.40%和31.20%。
  2.痉挛型组视觉障碍发生率为60.94%,比其他型别组增高(P<0.05)。
  3.双瘫组斜视发生率为44.64%,明显高于其他瘫痪类型组(P<0.05)。
  4.37例能够配合视敏度检查的儿童中,20例患儿存在视敏度低下,占54.05%;其中痉挛型脑瘫低视敏度的发生率为55.17%,高于其他型别组(P<0.05)。
  5.正常胎龄组视觉障碍发生率为39.34%,低于早产儿组(P<0.05)。
  6.出生体重<2.5kg组视觉障碍发生率为57.14%,明显高于其他组(P<0.05)。
  7.脑性瘫痪儿童不同MRI扫描结果分组中,脑室周围白质软化和枕叶皮层损害伴发视觉障碍的发生率分别为59.7%和50.0%,较其他组明显增高(P<0.05)。
  结论:
  1.脑性瘫痪儿童的视觉障碍在临床常见,以斜视与屈光不正发生率最高。
  2.痉挛型脑瘫患者视觉障碍发生率高;痉挛型脑瘫组的斜视率、屈光不正、低视敏度的发生率也高于其他组。
  3.双瘫组斜视发生率高。
  4.存在出生低体重、未足月分娩等围生期高危因素以及MRI有脑室周围白质软化和枕叶皮层损害表现的脑性瘫痪儿童中,合并视觉障碍的发生率高,应及早随访予以早期干预。
[硕士论文] 丁鲁娜
眼科学 温州医科大学 2015(学位年度)
摘要:目的:
  用I-131灌胃大鼠制造甲状腺功能低下状态后用含左旋T4的药物混悬液(优甲乐,左甲状腺素钠片)灌胃间断补充甲状腺激素,建立甲状腺激素异常波动状态的大鼠动物模型,观察制备甲状腺相关眼病模型(thyroid associatedophthalmopathy,TAO)的可行性。
  方法:
  将6周的雄性SD大鼠30只随机分为两组(正常组和波动组),第一周用浓度为2mCi/gI-131灌胃波动组大鼠,以破坏其甲状腺,制造甲状腺功能低下状态;第二周起对波动组大鼠以200ug/ml的优甲乐混悬液2ml灌胃,以后每隔一周以相同剂量优甲乐混悬液灌胃波动组大鼠,间断补充甲状腺激素,对正常组大鼠以等量生理盐水灌胃。定期记录大鼠的体重、眼压,光镜和电镜下检查大鼠眼外肌及眼眶组织,定期测定大鼠血清TRAB浓度,测定大鼠血清T3、T4、TSH。对两组大鼠的实验结果进行比较。
  结果:
  各项检查结果比较:
  1、外观、体重、眼压:在4只波动组大鼠中观察到眼周红肿,正常组大鼠眼周均无此表现。正常组体重355.22±48.95g,波动组279.14±22.56 g,波动组体重明显低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。正常组眼压14.24±2.42mmhg,波动组15.14±3.96mmhg,波动组眼压高于正常组,差异无统计学意义(P>0.05)。
  2、取大鼠眼外肌及眼眶组织的病理结果:正常组:HE染色大鼠眼外肌间未见明显淋巴细胞及其他炎症细胞浸润。电镜下大鼠眼眶组织无明显形态学异常。波动组:HE染色大鼠眼外肌见淋巴细胞,肥大细胞呈局部灶状浸润,血管增多。电镜下眼眶组织内质网扩张明显,线粒体肿胀及空泡化,细胞核淡染,可见巨噬细胞及其内的吞噬泡。
  3、TRAB:正常组:0.204±0.089IU/L;波动组:0.635±0.325IU/L;波动组血清TRAB水平高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
  4、血清T3、T4、TSH浓度:血清T3浓度:正常组:0.809±0.106nmol/L;波动组:1.398±0.8nmol/L,波动组甲状腺激素水平高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.05)。血清T4浓度:正常组:12.79±1.64nmol/L;波动组:115.24±147.9nmol/L,波动组甲状腺激素水平明显高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.05)。血清TSH浓度:正常组:0.157±0.058mIU/L;波动组:0.042±0.015mIU/L,波动组促甲状腺激素水平低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。
  结论:
  用I-131处理大鼠后甲状腺激素异常波动构建的TAO动物模型,与人类疾病的表现及特征很接近,是建模的一种有效方法。
[硕士论文] 王华丽
肿瘤放射治疗学 山西医科大学 2015(学位年度)
摘要:目的:
  1、探讨眼眶 CT测量球后容积在中重度活动期甲状腺相关性眼病(TAO)球后放疗中的应用价值;
  2、核素眼眶显像在TAO球后放疗应用研究。
  方法:
  选择2010年10月~2013年12月在山西医科大学第一医院就诊的中重度活动期TAO患者37例,均以双眼突出为主要症状,其中行三维适形放疗、既往球后注射曲安奈德疗效欠佳的TAO患者22例为放疗组,另回顾性选择单独行球后注射曲安奈德、炎性反应较重的TAO患者15例为球后注射组,入选患者均为CAS评分≧3分、突眼度≧18 mm,眼眶ECT(+),均无糖尿病、高血压及眼眶手术史。放疗组采用美国Varian直线加速器,三维适形放疗及CT定位,患者采用B枕、小头膜固定,双手放于身体两侧,选用6 Mv-X射线,两野对穿,相同权重,处方剂量DT2400 cGy/12 Fx/200 cGy,使95%计划靶区(plan target volume,PTV)所有剂量达到2400 cGy,放射治疗期间18例使用泼尼松,用法:30 mg,p.j., Po, Qd,放疗结束2周之后逐周减量1片至停药;4例使用氢化可的松,用法:120 mg,p.j., ivgtt,Qd,放疗结束后转用泼尼松,用法:30 mg,p.j.,Po, Qd,2周之后逐周减量1片至停药。全部患者放疗前后均测量矫正视力、突眼度,并行外眼照相、99mTc-DTPA眼眶ECT显像,随诊行眼眶SPECT/CT检查,将图像导入Eclips放疗计划系统,勾画球后组织,得出球后容积。所有入选患者随访1~3年。
  结果:
  1、放射治疗前矫正视力0.04~1.50,放射治疗后矫正视力0.10~1.50,矫正视力平均提高0.10±0.20;放射治疗前突眼度18 mm~29 mm,放疗后随访期间突眼度16 mm~25 mm,平均降低2.5±2.0 mm;放射治疗前CAS评分3~6分,放疗后随访期间CAS评分0~5分,平均降低3.00±1.195分;
  2、CT示放疗后球后体积随访期间减少,减少程度与CAS评分下降程度呈正相关(r=0.589,P=0.021<0.05);
  3、本研究中球后注射组感兴趣区OR/Bi下降程度与CASi下降程度有相关性(r=0.533,P=0.041<0.05),放疗后ECT感兴趣区OR/B较放疗前下降,且与CAS下降程度呈正相关(r=0.664,P=0.007<0.05),较球后注射组有更好的相关性,因例数较少,此结果有待验证;
  4、所有放疗组患者在本研究中均不同程度受益,近期疗效(1~3年)好,放疗组在治疗后核素眼眶显像摄取比(P=0.004)、CAS评分(P=0.001)、突眼度(P=0.000)指标的改善程度均好于单纯球后注射组;随访期间放疗组患者均无严重不良反应发生,因随访时间较短,远期不良反应有待继续追踪。
  结论:
  1、球后放射治疗联合激素治疗对中重度活动期TAO有较好的疗效,在严格把握好放疗适应证的前提下,选择三维适形球后放射治疗DT2400 cGy/12 Fx/200 cGy,并同时联合糖皮质激素治疗,是安全的,可增加疗效,并减少副反应,值得推荐;
  2、球后放疗联合糖皮质激素治疗优于单纯球后曲安奈德注射;
  3、CAS评分、核素眼眶显像OBI比值及球后容积变化是评价TAO疗效的有效指标。如将主观性临床评分与有关功能性影像图像相融合,对准确判断眼症炎性活动程度,指导后期治疗方法的正确选择,及时控制疾病发生发展相当有益。本研究发现,活动期TAO以眼眶ECT的OBI比值下降程度来评判近期(1~3年)疗效:球后放疗组稍好于单纯球后注射曲安奈德组,但因例数少,此结果有待验证。
[硕士论文] 李志伟
临床医学(眼科学) 山东大学 2015(学位年度)
摘要:研究背景:
  弓形虫病是全球分布的人兽共患的疾病,是弓形虫引起的全身性感染性寄生虫病。弓形虫病具体是由刚地弓形虫引起的,刚地弓形虫是一种能够感染人和温血动物的细胞内寄生虫,在大自然中作为一个人兽共患病原菌广泛的存在。据统计,全世界大约有三分之一的人类慢性感染弓形虫病。疾病的患病率和感染的来源在不同的地理区域各不相同,与不同的气候、饮食习惯和卫生状况等有关。弓形虫眼病是弓形虫对眼组织的损害所引发的疾病,国内目前对该病认识较少,弓形虫感染导致的弓形虫眼病的发病机制尚不十分清楚,相关的基础研究更是罕见。国外对该病的研究,大多集中在对本病急性感染的研究,而对于慢性感染研究较少。慢性感染弓形虫眼病后,眼底改变如何发展和演变,临床医师对于本病的了解有限,所以,找到一个良好的方法建立弓形虫眼病慢性感染模型,能够很好的观察眼底变化,从而为弓形虫眼病的诊断与治疗提供一定的依据,研究拟通过口服感染的方法建立弓形虫眼病的小鼠模型,模拟小鼠弓形虫慢性感染过程,并观察其眼和病理改变,为进一步研究提供一定的依据。
  研究目的:
  建立弓形虫眼病的小鼠模型并观察其眼底改变和病理特征,为进一步研究弓形虫眼病的发病机制,制定弓形虫眼病的早期干预措施提供一定依据。
  研究方法:
  将20只BALB/C小鼠随机分为对照组10只和实验组10只,实验组小鼠经口给予Ⅱ型弓形虫PRU虫株(弱毒株)包囊,模拟弓形虫慢性感染过程,每天观察小鼠眼底情况,在1个月后,2个月后,3个月后分别给两组小鼠做眼底照相以及眼底荧光素血管造影,观察小鼠眼底改变,3个月后ELISA法检测小鼠血清IgG,然后处死小鼠取眼球做石蜡切片,HE染色和免疫组化染色后观察视网膜及脉络膜损害情况。
  研究结果
  实验组小鼠两周后即可观察到眼底出现明显炎症表现,视盘边界不清,视网膜血管充盈,视网膜水肿、出血,由视盘区开始逐渐向周边血管扩展,并随时间延长逐渐加重。眼底荧光素血管造影显示实验组小鼠视网膜静脉充盈扩张荧光素着色,毛细血管网破坏,荧光素渗漏,并见血管无灌注区,并随时间延长,逐渐加重,血清IgG出现明显高滴度变化,显著高于对照组(p<0.001),视网膜及脉络膜组织切片,可见视网膜及脉络膜明显出现水肿改变,组织间间隙明显疏松,有腔隙形成,视网膜及脉络膜组织可见炎症细胞浸润,在实验组小鼠的视网膜组织切片中,发现了特异性染色的弓形虫包囊。
  研究结论:
  通过经口给予Ⅱ型弓形虫PRU虫株可以建立小鼠弓形虫眼病模型,证明了获得性弓形虫病也可以引起视网膜血管充盈,视网膜水肿、出血等视网膜及脉络膜炎症表现。实验组小鼠血清IgG产生了体液免疫应答。为弓形虫眼病的深入研究奠定了基础。
[博士论文] 简天明
临床医学 天津医科大学 2015(学位年度)
摘要:第一部分:眼外肌来源成纤维细胞的原代培养、鉴定及诱导分化
  目的:研究TAO眼外肌来源的成纤维细胞,在TGF-β1作用下的细胞生长分化状态。
  方法:通过组织块培养法收集TAO眼外肌来源的成纤维细胞,进行细胞形态及免疫标记物鉴定为成纤维细胞;通过MTT法观察成纤维细胞在不同浓度TGF-β1(1μg/L、5μg/L、10μg/L)诱导后的增殖效应;通过免疫细胞化学法检测成纤维细胞表达α-SMA;通过Western检测不同浓度(1μg/L、5μg/L、10μg/L)和时间(24h、48h、72h)效应下,TGF-β1诱导成纤维细胞表达α-SMA水平。
  结果:⑴原代和传代培养的细胞呈长梭形,胞浆丰满,核呈圆形或椭圆形,核仁清晰,细胞融合后呈放射状、漩涡状排列紧密;免疫细胞化学染色显示:vimentin阳性表达,Desmin、Kerati、S-100、第Ⅷ因子呈阴性反应,可以鉴定TAO组和正常对照组眼外肌标本培养的细胞为成纤维细胞。⑵MTT法检测TGF-β1诱导72h后的成纤维细胞增殖率具有剂量效应,10μg/L TGF-β1组细胞增殖率最高,为107.35%(P﹤0.05);TAO组和正常对照组的成纤维细胞MTT光密度值比较,差别不具有统计学意义(P﹥0.05)。⑶10μg/L TGF-β1处理24h,成纤维细胞胞浆丰满,体型增大,细胞足突增多;免疫细胞化学染色显示胞浆内大量α-SMA表达,强阳性染色;阴性处理组细胞内表达α-SMA量少。⑷Western-blot检测TGF-β1诱导成纤维细胞表达α-SMA蛋白具有剂量和时间效应,10μg/L TGF-β1处理48h具有最大表达量(P﹤0.05);TAO组和正常对照组的成纤维细胞α-SMA蛋白表达量相互比较,差别不具有统计学意义(P﹥0.05)。
  结论:利用组织块贴壁法培养的成纤维细胞的形态学和免疫学特征明显,可用于甲状腺相关眼病的体外研究对象。TGF-β1具有促进成纤维细胞增殖和向肌纤维母细胞分化作用,其诱导的α-SMA表达水平增高在一定范围内具有浓度和时间依赖性。
  第二部分:吡非尼酮抑制成纤维细胞增殖、分化、迁移及收缩功能的实验研究
  目的:研究吡非尼酮对TAO眼外肌成纤维细胞的增殖、分化、迁移和收缩胶原作用的影响。
  方法:在不同浓度TGF-β1、吡非尼酮、地塞米松作用下,通过MTT法检测成纤维细胞增殖作用,台盼蓝染色法检测细胞存活状态。在10μg/L TGF-β1、1.0mg/ml吡非尼酮、1000nM地塞米松作用下,利用划痕实验检测细胞迁移作用,免疫细胞化学法检测细胞表达α-SMA、fibronectin的作用,以及凝胶收缩实验检测细胞收缩胶原的作用。
  结果:⑴MTT法检测吡非尼酮抑制成纤维细胞增殖率具有剂量效应,0.5mg/ml、1.0mg/ml吡非尼酮的72h细胞增殖率,分别为-24.82%、-41.84%,二者MTT值与空白对照组比较,P﹤0.05;吡非尼酮较地塞米松具有更强的抑制 TGF-β1诱导的细胞增殖作用(P﹤0.05)。⑵台盼蓝染色法观察不同浓度吡非尼酮作用72h后,成纤维细胞活性良好,未见明显细胞毒性作用。⑶细胞划痕实验显示,TGF-β1具有促进细胞迁移和融合效应;吡非尼酮抑制细胞迁移作用明显(P﹤0.05)。⑷免疫细胞化学染色显示,吡非尼酮作用72h后成纤维细胞内无明显α-SMA表达;地塞米松组成纤维细胞内正常表达α-SMA。空白对照组、TGF-β1组、地塞米松组72h后均可见fibronectin在成纤维细胞内外高表达,并聚合成互相连接的纤维网状结构;吡非尼酮组、吡非尼酮联合TGF-β1组72h后fibronectin表达被抑制。⑸凝胶收缩实验显示,连续观察6天后,TGF-β1组的收缩指数为59.38%,与空白对照组比较,显示强大的促进成纤维细胞介导的胶原收缩作用(P﹤0.05);吡非尼酮组、吡非尼酮联合TGF-β1组的收缩指数分别为6.70%和8.02%,具有明显抑制成纤维细胞介导的胶原收缩作用(P﹤0.05);地塞米松组收缩指数25.48%,与空白对照组比较无统计学意义(P﹥0.05)。
  结论:吡非尼酮可抑制体外培养眼眶成纤维细胞的增殖和向肌纤维母细胞表型分化;抑制成纤维细胞/肌纤维母细胞的迁移和胶原收缩作用;并且对fibronectin的表达也有明显的下调作用。吡非尼酮较地塞米松具有更强的抑制TGF-β1介导的成纤维细胞增殖、分化、迁移和胶原收缩作用。
  第三部分:吡非尼酮抑制眼眶成纤维细胞应力纤维重构及粘着斑成熟作用的实验研究
  目的:研究吡非尼酮对TGF-β1诱导下的TAO眼外肌成纤维细胞的肌动蛋白应力纤维构建和粘着斑成熟分化的作用,以及相关信号通路的影响。
  方法:在10μg/L TGF-β1、1.0mg/ml吡非尼酮作用下,利用免疫荧光技术和共聚焦激光扫描显微镜观察肌动蛋白应力纤维、粘着斑蛋白和Ⅰ型胶原形态及细胞定位,Western-blot检测Akt、Phospho-Akt、FAK、Phospho-FAK蛋白的表达,以及通过MaxGelTM检测成纤维细胞在细胞外基质中的粘附作用。
  结果:⑴共聚焦显微镜下观察,吡非尼酮抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌纤维母细胞分化,降低α-SMA阳性应力纤维构建;抑制paxillin、tensin蛋白表达,抑制粘着斑分化成熟,相应粘着斑面积和数量较空白对照组减小(P﹤0.05)。⑵Western Blot结果显示,吡非尼酮单独作用或联合TGF-β1均可抑制Akt与磷酸化Akt,FAK与磷酸化FAK表达(P﹤0.05);吡非尼酮对Akt磷酸化抑制作用更明显(P﹤0.05)。⑶细胞粘附实验表明,吡非尼酮作用24h后极少细胞粘附生长,明显抑制成纤维细胞对细胞外基质的粘附作用(P﹤0.05)。
  结论:通过下调 TGF-β1介导的Akt/FAK信号通路活化,吡非尼酮明显抑制α-SMA应力纤维构建和粘着斑分化成熟,降低细胞与细胞外基质粘附,阻碍成纤维细胞发挥促纤维化作用,因此可用于对抗甲状腺相关眼病纤维化发展和改善临床症状。
[博士论文] 魏丽娟
眼科学 郑州大学 2015(学位年度)
摘要:眼外伤、内眼手术是感染性眼内炎的主要原因,多为细菌进入眼内导致感染所致,如凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、革兰氏阴性细菌等。细菌性眼内炎是严重威胁视力的眼科急症,细菌性眼内炎预后受细菌数量、毒力、患者年龄及免疫状态等多种因素影响。虽然及时采取抗生素药物治疗、玻璃体切除术等治疗,但是视力预后仍不理想,常导致严重的视功能损害。细菌在增殖、破裂的过程中释放的毒性物质(内毒素、外毒素)可诱发严重的炎症反应及细胞坏死[1,2,3]。其中细菌的裂解产物是诱发眼内炎症的重要因素之一。脂多糖是革兰阴性杆菌细胞壁的主要成分,也是其主要毒性致病因子,可用于玻璃体腔注射,诱导感染性眼内炎症反应[4]。炎症反应导致血眼屏障破坏,炎性细胞向组织间隙迁移浸润,蛋白渗漏,精密的视网膜结构被破坏,最终导致功能不同程度的丧失。如何消除眼内炎中眼内组织破坏、改善最终视力预后一直是我们面临的难题和挑战。在积极抗菌治疗的同时,能否有效并及时地控制眼内炎症反应是治疗的关键,也是预后的决定性因素。
  利鲁唑(Riluzole)属于苯并噻唑类衍生物,1996年开始作为一种新型谷氨酸释放抑制剂被批准应用于肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)的治疗,其稳定细胞内外离子浓度的作用使其在神经保护、抗惊厥、抗抑郁等方面具有广泛的作用,提示其在更多疾病中的临床应用价值。根据其药理机制,我们推测其可能在眼内炎症控制中起到积极作用。本研究拟观察利鲁唑对脂多糖诱导大鼠眼内炎症的干预作用,并对其机制进行初步研究。
  目的:
  通过玻璃体腔注射大肠杆菌脂多糖(LPS,lipopolysaccharide from Escherichia coli)建立大鼠眼内炎模型,观察其炎症表现、组织病理学特征以及利鲁唑的干预作用,然后对其作用机制进行研究,为眼内炎的治疗提供新线索。
  材料与方法:
  将Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为3组,1组:生理盐水对照组;2组:眼内炎组;3组:眼内炎利鲁唑干预组。生理盐水组大鼠右眼注入5μl无菌生理盐水。2、3组大鼠右眼玻璃体腔内注入LPS(2μg,5μl),建立LPS诱导的眼内炎模型。左眼为正常对照眼。利鲁唑干预组在LPS注射前12 h和术中及术后连续3 d腹腔内注射利鲁唑注射液(0.1%,10mg/kg)。
  第一部分:造模后6h、12h、24h、48h、3d、5d、7d进行眼部炎症评分,病理组织学检查观察炎症细胞浸润,行免疫组化测定谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)在视网膜组织的表达变化及分布,采用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测视网膜组织中GS的表达情况,观察利鲁唑的干预作用。第二部分:对利鲁唑的干预机制进行初步探讨,分光光度计法测定玻璃体中谷氨酸(glutamate,Glu)含量,采用TUNEL法检测视网膜组织细胞凋亡。
  所有数据均用(x±s)表示,应用SPSS21.0统计软件包进行统计学处理,采用单因素方差分析进行组间比较,采用LSD检验进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:
  1.临床炎症评分
  玻璃体腔内注射LPS诱导出典型眼内炎临床表现,造模后干预组炎症反应明显较2组轻,造模后24 h、48h、3d时间点两组临床炎症评分间差异均有统计学意义(P<0.05)。1组未见明显炎症反应。
  2.病理组织学检查
  常规HE染色后显微镜下观察白细胞浸润,对切片中以锯齿缘为前界的玻璃体腔中的中性粒细胞、淋巴细胞、单核-巨噬细胞等炎症细胞进行计数分析。2组、3组在造模后均可观察到大量外周血白细胞眼内的浸润。HE染色显示各时间点3组玻璃体内炎症细胞计数低于2组,差异有统计学意义(P<0.05)。而Ⅰ组造模后玻璃体腔、视网膜大部分未见、或散在少量的炎症细胞浸润,视网膜形态基本正常,结构清晰。
  与1组相比,GS在眼内炎组的表达升高,主要表达于内颗粒层、神经节细胞层Müller细胞胞浆中。2组、3组在6h、12h、24h、48h、3dGS的表达具有显著性差异(P<0.05),3组GS的表达明显低于2组,但仍高于对照组。
  3.实时荧光定量PCR方法检测视网膜组织GS的表达
  48h时,对照组视网膜中检测到低水平表达,眼内炎组GSmRNA表达较对照组明显增强(P<0.05),利鲁唑干预组GSmRNA表达较眼内炎组降低(P<0.05),但仍高于对照组。
  4.谷氨酸浓度
  2组和3组大鼠玻璃体中谷氨酸含量在炎症初期就开始升高,48h时达到高峰,分别为324.01±2.47μmol/l、253.95±10.76μmol/l。2组在5d时谷氨酸浓度较之前出现小幅回升(298.04±4.83μmol/l),然后逐渐下降。6h后各时间点,3组造模眼玻璃体谷氨酸浓度明显低于2组,差异均有统计学意义(P<0.05),但仍明显高于1组。
  5. LPS诱导眼内炎后,TUNEL染色阳性细胞散在分布于视网膜神经节细胞层、内颗粒层,3d时出现凋亡细胞数量明显增多。2组细胞凋亡数目明显多于3组。生理盐水对照组视网膜未见明显细胞凋亡,6h,12h,24h时眼内炎组与干预组相比细胞凋亡程度无明显差异,其后各时间点3组凋亡细胞指数均低于同期眼内炎组,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  利鲁唑可以抑制内毒素诱导的眼内炎中炎症细胞的眼内浸润,减少组织损害,其机制可能是通过减少视网膜组织细胞凋亡,使玻璃体谷氨酸含量降低,抑制 Müller细胞活化。该研究结果提示利鲁唑在细菌性眼内炎中的保护作用,为眼内炎的辅助治疗提供依据。
[博士论文] 闫瑞嘉
眼科学 华中科技大学 2015(学位年度)
摘要:研究背景和目的:
  甲状腺相关性眼病是与Graves病密切相关的眼眶组织炎症,发病率居成年人眼眶疾病之首,大量细胞因子参与疾病过程,引起组织重构,但确切的发病机制尚不清楚。细胞因子信号转导抑制分子-3(suppressor of cytokine signaling-3,SOCS3)作为细胞因子重要的负调控因子,在多种炎症性疾病发生、发展过程中起到重要的作用。本研究探讨SOCS3蛋白与甲状腺相关性眼病的关系。
  方法:
  1.取甲状腺相关性眼病患者和正常人的眶脂肪组织,检测眶脂肪组织中是否表达SOCS3蛋白。使用免疫荧光法。
  2.分别由甲状腺相关性眼病患者和正常人眼眶结缔组织分离培养成纤维细胞,检测两组眼眶成纤维细胞中SOCS3 mRNA和蛋白质的表达差异。使用real-time PCR和Western blot法。
  3.收集270例Graves病患者病例资料及外周静脉血。将所有患者根据有无眼病分为Graves病伴有眼病组(114例)和Graves病不伴眼病组(156例)。分别取两组患者外周血单核细胞(PBMC),建立EB病毒转化的类淋巴母细胞系(Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines,EBV-LCLs)。检测两组患者EBV-LCLs中 SOCS3 mRNA和蛋白质的表达差异。使用 real-time PCR和Western blot方法。对所有患者SOCS3基因5个位点(rs12952093,rs4969170,rs4969168,rs4969169 and rs2280148)进行测序分型,采用连接酶检测反应-PCR(LDR-PCR)基因测序分型技术。多因素Logistic回归分析SOCS3基因各位点基因型与甲状腺相关性眼病间的关系。为进一步验证与眼病有关的基因型是否影响基因功能,研究继续观察该基因型是否影响SOCS3表达。使用real-time PCR和Western blot法。
  结果:
  1.甲状腺相关性眼病患者眶脂肪组织表达SOCS3蛋白非常明显,正常人组织中微量表达。
  2.甲状腺相关性眼病患者眶成纤维细胞中SOCS3mRNA和蛋白质的水平较正常人显著增高(p<0.05)。
  3.Graves病伴眼病患者EBV-LCLs中SOCS3 mRNA和蛋白的表达水平较Graves病无眼病患者显著增高(p<0.05)。
  4.校正年龄、性别、BMI,吸烟,甲状腺肿,甲状腺结节,黏液性水肿,Graves病治疗(药物,放射性治疗,甲状腺切除术)以及高血压这些因素后,经多因素Logistic回归分析,SOCS3 rs4969170 AA基因型与甲状腺相关性眼病风险增高有关(OR=3.5,95%CI1.6 to7.5,p=0.001)。而SOCS3 rs12952093,rs4969168,rs4969169及rs2280148与甲状腺相关性眼病的关联均没有达到统计学显著性水平。SOCS3rs4969170 AA基因型甲状腺相关性眼病患者EBV-LCLs中SOCS3 mRNA和蛋白表达水平较GG型眼病患者显著增高。
  结论:
  SOCS3蛋白与甲状腺相关性眼病有关。甲状腺相关性眼病患者中SOCS3 rs4969170可能是功能性单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP),该位点AA基因型可能通过增加SOCS3表达,与甲状腺相关性眼病风险增加有关。
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