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[博士论文] 胡蕴绮
皮肤性病学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  皮肤鳞状上皮细胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC)是一种在中国高发的皮肤系统恶性肿瘤,一经确诊其首选治疗策略是手术切除,但因为它在患者身上发展缓慢、常无自觉症状,容易被忽视和发现不及时,导致增加疾病风险的同时,增大手术创面,影响患者美观。此外,SCC具有侵袭生长与转移等特性,若发现较晚,需结合辅助的化疗和放射治疗。但是长期的放疗与化疗会使患者产生各种相关并发症,同时化疗药物的使用也会使肿瘤细胞产生耐药性。因此,近几年来,研究者们致力于发现日常饮食中高效低毒的天然产物的抗癌潜力,希望预防皮肤鳞状上皮癌的发生和降低化放疗药物的使用。
  白藜芦醇(Resveratrol,RES)属于具有广泛的药理学作用的多酚类天然产物,其药理作用包括抗肿瘤、抗病毒、预防阿奇霉素引发的心脏毒性、预防心脑血管疾病、抗帕金森病等。同时,基于细胞系与实验动物的体内外肿瘤模型研究和基于不同人群的临床试验均发现白藜芦醇及其低聚物也是实体肿瘤与血液系统肿瘤的有效化学预防剂。虽然白藜芦醇被证明具有广谱的抗肿瘤作用,然而缺乏对白藜芦醇在皮肤肿瘤中的系统研究,尤其是基于动物模型的体内研究。因此,本研究首先在体外水平上利用两种SCC代表细胞系详尽研究白藜芦醇抗肿瘤效应的浓度梯度与时间梯度的关系,并初步探索其抗肿瘤效用的细胞机制和分子机制;然后构建皮肤SCC的化学诱导大鼠模型,在体内水平进一步验证白藜芦醇对SCC的抗肿瘤作用及其作用机理。
  论文将在白藜芦醇抗SCC的体内外系统研究中,探索其药理活性与作用剂量和作用时间的依赖性,并揭示白藜芦醇发挥抗SCC效应与周期及凋亡调节的关系,以期为白藜芦醇在SCC的预防与治疗研发中提供新的方向,为白藜芦醇在SCC预防与治疗的剂量选择上提供切实的数据基础。
  方法:
  1、基于鳞状细胞癌细胞系的白藜芦醇体外抗肿瘤活性研究
  Ⅰ:在SCC细胞系SCC1与Colo-16中,采用CCK-8法探索白藜芦醇抑制肿瘤细胞增殖活力的浓度依赖性与时间依赖性;
  Ⅱ:在对白藜芦醇给药更加敏感的细胞系SCC1中,采用Annexin-Ⅴ/PI双染联合流式细胞术的方式考察白藜芦醇是否具有诱导SCC细胞凋亡的能力;
  Ⅲ:在SCC细胞系中,通过Western blotting、半定量PCR与实时荧光定量PCR考察白藜芦醇对细胞凋亡与细胞周期通路关键基因mRNA与表达水平的影响,初步探索白藜芦醇发挥体外细胞杀伤活性的信号传导途径。
  2、基于DMBA/TPA刺激的大鼠皮肤SCC模型的白藜芦醇体内抗肿瘤活性研究
  Ⅰ:本研究中的大鼠皮肤SCC模型使用经典的二阶段DMBA/TPA化学诱导方法建立。将Wistar实验大鼠分为四组:丙酮空白对照组(Control)、化学诱导模型组(DMBA)、低剂量白藜芦醇处理组(DMBA+RES-1)与高剂量白藜芦醇处理组(DMBA+RES-2)。通过测量四组大鼠体重、肿瘤发生率、肿瘤抑制率、肿瘤体积与肿瘤重量等指标考察两个剂量的白藜芦醇的体内抗肿瘤活性;
  Ⅱ:通过流式细胞术周期分布分析、Ki-67免疫组化增殖染色、Annexin-Ⅴ/PI双染联合流式细胞术凋亡分析以及TUNEL凋亡组织化学染色共同考察白藜芦醇在SCC动物模型中是否具有周期阻滞与凋亡诱导的作用;
  Ⅲ:最后在该SCC动物模型中通过Western blotting检测白藜芦醇对细胞周期与凋亡通路关键基因的调节作用。与其在体外的信号通路调节作用相对应,在体内验证白藜芦醇抗SCC的信号传导通路,为白藜芦醇抗SCC分子机制的深入探索提供方向。
  结果:
  1、基于鳞状细胞癌细胞系的白藜芦醇体外抗肿瘤活性研究
  Ⅰ:白藜芦醇对SCC1细胞可以发挥明显的细胞毒作用。31.25μM的白藜芦醇孵育72h可以将SCC1的细胞活力抑制到20%。白藜芦醇在7.81μM-31.25μM的中等浓度范围内,其细胞活力抑制效果与作用浓度和作用时间呈明显正相关;而只有高浓度的白藜芦醇才对Colo-16具有较弱的抑制活性,仅能将Colo-16的细胞活力抑制到80%;
  Ⅱ:白藜芦醇能显著的促进SCC1细胞的凋亡,且具有明显的浓度依赖性;
  Ⅲ:白藜芦醇能显著的且不具浓度依赖性的上调SCC1细胞凋亡通路基因p53、p21、Bax与caspase-3的mRNA水平与蛋白水平,同时还能抑制SCC1细胞G2/M周期检查点基因cyclin B与cdc2的转录与表达水平。
  2、基于DMBA/TPA刺激的大鼠皮肤SCC模型的白藜芦醇体内抗肿瘤活性研究
  Ⅰ:与对照组相比,模型组大鼠均产生肉眼可见的肿瘤团块,且该团块中有明显角化异常细胞,说明DMBA/TPA诱导的二阶段皮肤SCC模型成功;
  Ⅱ:DMBA组荷瘤大鼠体重在实验周期内几乎持平没有增长,而Control组体重则是按照正常趋势增长。而与模型组相比,白藜芦醇处理组的荷瘤大鼠体重则保持增长,尤其是高剂量白藜芦醇处理组大鼠的体重增长趋势与对照组类似。同时,两个剂量的白藜芦醇均能减少肿瘤发生率、肿瘤体积与肿瘤重量;并且高剂量白藜芦醇处理组比低剂量组表现出更良好的肿瘤生长抑制效果;
  Ⅲ:与DMBA组相比,高剂量与低剂量白藜芦醇处理组细胞处于G1期的比例减少而处于G2/M期的比例明显增多;处于早期凋亡与晚期凋亡期的比例也显著升高,同时Ki-67阳性处于增殖周期的细胞比例减少,说明在DMBA/TPA刺激的皮肤SCC模型中白藜芦醇同时具有G2/M期阻滞与凋亡诱导的作用;
  Ⅳ:与Control相比,两个白藜芦醇处理组DMBA+RES-1与DMBA+RES-2的凋亡基因p53、p21、Bax与caspase-3表达被上调,凋亡抑制基因survivin表达被下调,G2/M细胞周期检查点基因cyclin B与cdc2表达被下调,说明白藜芦醇具有周期阻滞与凋亡诱导的体内活性。
  结论:
  1、基于鳞状细胞癌细胞系的白藜芦醇体外抗肿瘤活性研究
  Ⅰ:对比白藜芦醇对SCC1与Colo-16细胞系的细胞毒作用浓度与时间趋势图,发现白藜芦醇的细胞杀伤作用具有明显的选择性。白藜芦醇对Colo-16仅在高浓度表现出较弱的细胞抑制活性,也没有明显的浓度依赖性;而在7.81μM-31.25μM范围内的白藜芦醇对SCC1的细胞毒作用具有明显的时间梯度与浓度梯度依赖性;
  Ⅱ:白藜芦醇可以浓度依赖的诱导SCC1细胞进入凋亡程序,其对SCC1细胞展现出来的细胞毒作用可能依赖于诱导细胞凋亡;
  Ⅲ:白藜芦醇可能通过调控p53-p21-Bax-caspase-9途径的转录与表达水平诱导细胞凋亡发挥其细胞毒活性;另一方面,白藜芦醇也可以调节周期检查点中心调控蛋白cyclin B与cdc2的mRNA与蛋白水平,然而在该细胞系中白藜芦醇并没有对细胞周期分布产生影响,可能还有除G2/M期检查点之外的途径共同参与对细胞的周期调控。
  2、基于DMBA/TPA刺激的大鼠皮肤SCC模型的白藜芦醇体内抗肿瘤活性研究
  Ⅰ:低剂量(1mg/kg/qw)与高剂量(2mg/kg/qw)白藜芦醇处理均能够有效恢复荷瘤大鼠体重增长趋势;综合白藜芦醇对荷瘤大鼠体重、肿瘤发生率、肿瘤抑制率、肿瘤体积与肿瘤重量的影响,两个剂量的白藜芦醇均具有SCC肿瘤抑制作用,并且高剂量的白藜芦醇比低剂量抑制效果更加显著;
  Ⅱ:白藜芦醇可能通过抑制肿瘤细胞增殖、将肿瘤细胞周期阻滞在G2/M期及促进肿瘤细胞凋亡发挥上述抗肿瘤作用;
  Ⅲ:白藜芦醇可能通过p53-p21-Bax-caspase-9途径与survivin依赖的方式诱导细胞凋亡,并通过p53-cyclin B/cdc2途径将细胞周期阻滞在G2/M期。
  白藜芦醇具有良好的体内外抗SCC活性,进一步探索其体内剂量范围、作用机制乃至联合用药策略将会加速白藜芦醇在预防与治疗SCC中的应用。
[博士论文] 王守忠
皮肤性病学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:皮肤癌是最常见的恶性肿瘤之一,主要包括鳞状细胞癌(SCC)和基底细胞癌。SCC在组织病理学上表现为侵袭性生长,自表皮向下突破基底层侵入真皮,呈条索状和不规则团块状,由正常鳞状细胞和非典型鳞状细胞组成。前者分化好,可形成角质形成细胞,后者分化不好,即所谓癌细胞。
  SCC的标准治疗包括手术、放射治疗和化学药物治疗。然而经过上述治疗的患者在2年内仍然可能复发和远处转移。鉴于在肿瘤治疗过程中基因疗法的快速进展和单一基因治疗的低稳定性和有效性,以及先前研究所表明的携带有两个或者两个以上基因的重组腺病毒对多发性骨髓瘤以及喉癌等多个肿瘤具有细胞毒性,因而需要一个具有高的稳定性和有效性的联合基因治疗方法来进一步改善SCC患者的预后。在本课题中重点研究了与人类重组野生型p53基因相关的N-myc下游调节基因2(NDRG2)以及鼠双倍突变体2(MDM2)的单独以及联合应用对SCC的作用。
  p53是一个著名的抑癌基因,p53信号通路是肿瘤发生中最常见的突变通路。当发生DNA损伤和各种细胞毒性时,p53就会诱导受损细胞的细胞周期阻滞和细胞凋亡。p53不仅在肿瘤抑制中起着重要作用,它还是一个广泛的转录因子。它调节着2500多种基因,其中绝大部分的基因都与肿瘤的发生、发展和侵袭有关。治疗被引进,作为其引起凋亡的结果,在数个临床试验中表现出了对肿瘤细胞内在的致死性作用,这为控制肿瘤打开了一道新的大门NDRG2为p53基因的靶基因,且可不依赖p53基因单独起作用。
  NDRG2属于NDRG家族的一员。它与ABH超家族具有显著的结构相似性。它含有两个亚型。主要的氨基酸序列信息表明:这两种NDRG2蛋白都显示了与ABH超家族显著地结构相似性。NDRG2通过调节不同的细胞因子在细胞应急反应、细胞分化、增殖、凋亡等许多生物过程中扮演抗增殖、抗侵袭、促凋亡等多重角色。在多种肿瘤细胞中NDRG2的表达减少或缺失。另外,多种恶性肿瘤的预后与肿瘤表达NDRG2呈负相关。近些年来,许多体内和体外研究表明NDRG2在很多肿瘤细胞中引起细胞凋亡,具有抗增殖和防扩散作用。NDRG2是P53的一个新的靶基因,参与了细胞中的DNA损伤反应,并且在P53介导的细胞凋亡中发挥着重要作用,同时又是一个可以增强肿瘤细胞化疗敏感性的新基因。在本次研究中,在体外SCC-13细胞系以及SCC裸鼠模型中,探索了携带siMDM2和NDRG2基因的重组腺病毒对肿瘤体积退化的影响。
  鼠双倍突变体2(MDM2)是一个原癌基因,已在多种肿瘤中发现其突变与扩增,mdm2扩增与肿瘤转移密切相关。mdm2基因最初是从一个含有双微体(murine double minute,MDM)的自发转化的BALB/3T3DM细胞中克隆出来的一个高度扩增的基因,此基因位于小鼠的第10号染色体的CⅠ-C3区,1992年Momand等人首次分离和证明了大鼠的mdm2基因产物是一种分子为90000Da的蛋白质。野生型p53诱导MDM2的表达,反过来,MDM2通过促进野生型p53的降解以及抑制其转录活性来形成一个负反馈环。MDM2通过负调控p53的转录活性,介导细胞阻滞和细胞凋亡,促进肿瘤形成,从而参与了许多人类癌症的发生。MDM2的超表达对抗p53基因疗法对肿瘤的治疗。从而,对p53-MDM2反馈回路进行干扰,就为恢复p53肿瘤抑制活性,提供了一条新的抗肿瘤策略。MDM2是一种E3泛素连接酶,也是p53通路的重要调节者。它以两种方式负调节p53:一种是通过直接结合来抑制转录;另一种是通过它的E3连接酶活性来降解p53蛋白。ARF直接结合MDM2然后抑制E3泛素酶的活性来调节p53的转录活性。肿瘤细胞中,通过腺病毒介导的p53基因治疗来提高野生型p53表达的增加,是一种可能的克服p53基因突变的治疗方法。Lang等在临床试验中发现:瘤内注射含p53的腺病毒载体都导致了p53基因的转录和功能性外源性p53的表达。因此,通过特定小干扰RNA(siRNA)技术直接下调MDM2表达对治疗具有P53基因表达的皮肤癌或许是一个有效的方法。
  目的:研究不同重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2基因疗法对SCC细胞系及荷瘤小鼠模型的治疗作用,以期为临床找到更有效的治疗SCC的方法。
  方法:(1)委托汉恒生物科技构建重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2,利用293A细胞进行病毒繁殖、纯化,得到足够剂量和浓度的基因治疗试验用病毒。
  (2)对购买的SCC-13细胞系进行复苏、增殖、传代等体外培养,并进行重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2转染实验。
  (3)建立荷瘤小鼠模型,皮下注射0.9%NaCl、重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2治疗,观察各组小鼠肿瘤体积大小。
  (4)利用CCK-8试剂盒检测重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2感染SCC-13细胞系后SCC-13细胞的增殖潜力。
  (5)利用RT-PCR和Western blot从基因和蛋白质水平分别研究MDM2、NDRG2基因在重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2感染的SCC-13细胞系内的mRNA表达变化以及相应蛋白产物的变化,尤其是从SCC-13细胞caspase3蛋白表达水平进一步研究重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2基因治疗引起SCC-13细胞凋亡的机制。
  (6)AnnexinⅤ/PI双染色法和流式细胞仪检测分析评估荷瘤小鼠SCC-13细胞凋亡率。
  (7)利用MTT研究重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2转染SCC-13细胞后不同时间点SCC-13细胞的细胞毒效应。
  结果:(1)实验获得了足够剂量和浓度的试验用SCC-13细胞及重组腺病毒。
  (2)SCC-13细胞能够被重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2高度有效转染,在转染后48h检测到GFP的表达。且在MOI为100时感染效率最好。
  (3)皮下注射重组腺病毒0.9%NaCl、Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2各组小鼠肿瘤体积比较显示:0.9%NaCl和Ad-GFP组平均肿瘤体积最大,Ad-siMDM2、Ad-NDRG2组平均肿瘤体积相近,Ad-siMDM2-NDRG2组平均肿瘤体积最小。
  (4)在Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2转染的SCC-13细胞内,与Ad-GFP组才目比,Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2组对SCC-13细胞增殖具有明显的抑制。
  (5)在基因水平的RT-PCR研究结果显示:①与对照组相比,重组腺病毒Ad-siMDM2、Ad-siMDM2-NDRG2转染的SCC-13细胞内MDM2基因的mRNA表达显著减少;②SCC-13细胞内本身NDRG2基因表达水平较低,但在重组腺病毒Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2转染的SCC-13细胞内,NDRG2的超表达相应增加了其mRNA的表达。重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2基因治疗可促进SCC-13caspase3蛋白表达。在蛋白质水平的Western blot研究结果,验证了上述基因研究结果。
  (6)对荷瘤小鼠瘤细胞进行的AnnexinⅤ/PI双染色法和流式细胞仪检测分析结果显示:MDM2基因沉默和NDRG2基因超表达显著引起小鼠肿瘤细胞的凋亡。
  (7)MTT研究SCC-13细胞毒性效应结果显示:Ad-siMDM2-NDRG2组与Ad-GFP组相比较,P<0.05;同样Ad-siMDM2-NDRG2组与Ad-siMDM2组和Ad-NDRG2组相比较P<0.05。
  结论:重组腺病毒Ad-siMDM2-NDRG2联合基因治疗比单一Ad-siMDM2或Ad-NDRG2基因治疗能更有效的感染SCC,可为SCC的临床治疗提供一个潜在的有效手段。
[硕士论文] 刘蓉
生理学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase1, PGK1)在BRAFV600E突变型恶性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)细胞对Vemurafenib(Zelboraf)的敏感性中的作用及其机制。
  方法:
  1)使用基因沉默技术(Small interfering RNA, siRNA),处理5株黑色素瘤细胞株(A375m, A375mR,1205LU, UACC903, C8161-C9)72小时,将每株分为PGK1基因沉默组(siPGK1组)和非沉默组(si-Non-Target, siNT组), siPGK1组沉默PGK1基因,siNT组不沉默PGK1基因。
  2)使用MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, approx.98% TLC)实验方法分别检测5株黑色素瘤细胞株siPGK1组、 siNT组细胞的存活能力,各组分别给以不同浓度的BRAF突变抑制剂vemurafenib(0,0.01,0.1,1,10μM)处理后测定细胞的存活能力,以及siPGK1组、siNT组,联合vemurafenib处理后测定细胞的存活能力。
  3)使用Western Blot实验方法检测5株黑色素瘤细胞株PGK1基因的表达量, PGK1基因沉默效果,以及沉默PGK1基因后再给以vemurafenib(0,2μM)处理24小时后,PGK1的表达量变化和PARP蛋白表达量以及活性变化。
  4)使用克隆集落(Colongenic Assay)方法检测培养14天后5株黑色素瘤细胞株siPGK1组和 siNT组细胞形成集落个数、大小、增殖能力。以及联合给以vemurafenib(A375m:0,0.25,0.5,1μM;A375mR,1205LU, UACC903, C8161-C9:0,2.5,5,10μM)处理后各组细胞形成集落个数、大小、增殖能力。
  5)使用流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)检测 siPGK1组和 siNT组联合给以vemurafenib(A375m:0,0.25,0.5μM; A375mR,1205LU, UACC903, C8161-C9:0,2.5,5μM)处理24小时后5株黑色素瘤细胞株的凋亡情况,以及细胞早期凋亡和晚期凋亡的变化情况。
  结果:
  1) Western Blot结果显示PGK1在4株BRAF突变型(A375m, A375mR,1205LU, UACC903)黑色素瘤细胞株中呈高表达,在野生型(C8161-C9)黑色素瘤细胞株中呈低表达。其中A375m PGK1的表达量约为C8161-C9的2.26倍(P<0.01),A375mR PGK1的表达量约为C8161-C9的1.69倍(P<0.05),1205LU PGK1的表达量约为C8161-C9的1.20倍,UACC903 PGK1的表达量约为C8161-C9的2.04倍(P<0.01)。
  2)沉默PGK1基因后再给以BRAF突变型选择性抑制剂vemurafenib,黑色素瘤细胞株的存活率明显下降,并表现出一定的剂量依赖性。MTT Assay结果显示:对野生型C8161-C9的抑制作用不明显,A375mR在较低剂量浓度有一定的疗效,但是在较大剂量浓度(>1μM)时便出现耐药性。但是对另外的3株BRAF突变型黑色素瘤细胞的作用效果明显,对A375m的抑制作用效果最为明显,10μM的vemurafenib对A375m的抑制率达到了78%(P<0.05)。
  3) siPGK1增加黑色素瘤细胞对vemurafenib的敏感性,这一特征与激活细胞凋亡信号通路有关。以 A375mR、UACC903的凋亡信号通路活化效果最为明显,而C8161-C9的活化效果最差。
  4)1205LU、UACC903、C8161-C9细胞以早期凋亡为主,A375m、A375mR则以晚期凋亡为主。
  结论:
  沉默PGK1可能通过激活细胞凋亡通路增加黑色素瘤细胞对vemurafenib的敏感性,从而抑制黑色素瘤细胞的存活和增殖能力。
[硕士论文] 张融
基础医学;免疫学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一种全世界发病率越来越高的侵袭性肿瘤,占皮肤恶性肿瘤的7%~20%,其恶性程度高,易转移、复发及分泌转化生长因子(transforming growth factor-beta,TGF-β)等抑制性因子,因此一旦转移即难以根治。近年在卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、骨髓瘤及黑色素瘤等多种肿瘤的研究中证实有肿瘤干细胞(tumor stem cell,TSC)或癌干细胞(cancer stem cell,CSC)存在,并认为CSC是肿瘤拮抗放化疗、复发和转移的根源。因此,从理论上分析,消灭CSC即能控制肿瘤复发和转移,消除其耐药性和对化疗的拮抗。传统的手术治疗、放疗、化疗因不能靶向CSC而致使患者治疗后五年生存率不甚理想,由此可见寻找新的治疗策略非常重要。肿瘤免疫治疗是通过激活体内的免疫系统产生针对肿瘤有效遏制的临床治疗手段,因其能诱导靶向肿瘤细胞的多种免疫效应机制而发挥抗肿瘤效应。多种免疫治疗手段的有效性已在临床前期实验和临床治疗中得到证实,如淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、天然杀伤(NK)细胞、T细胞、树突状细胞、细胞因子治疗和抗体治疗等。其中肿瘤的治疗性疫苗也取得了可喜的进展,但由于肿瘤抗原免疫原性弱、肿瘤免疫逃逸、肿瘤的异质性等原因,疫苗的实际疗效与预期仍有差距,因而寻找肿瘤疫苗研制新的突破点尤为重要。目前有观点认为CSC可能富聚多种肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原,CSC疫苗可能会激发宿主免疫系统产生靶向CSC的免疫反应,所以黑色素瘤CSC疫苗是一个值得研究的免疫治疗策略。
  研究目的:探讨表达黑色素瘤B16F10CD133+CD44+CSCs瘤苗治疗黑色素瘤的效应及其机制。
  研究方法:利用免疫磁珠分选技术分离出B16F10CD133+CD44+CSCs,取5×105个细胞经MMC灭活后免疫C57BL/6小鼠,每次间隔10天,共免疫三次。末次免疫后10天,以1×105个B16F10野生株细胞攻击免疫鼠。同时设B16F10非癌干细胞组和B16F10野生株组为对照,以上述同样方法免疫和攻击小鼠。观察各组小鼠肿瘤生长情况、生存时间,并检测免疫小鼠血清细胞因子TGF-β、IFN-γ和IL-4的表达水平、脾细胞和NK细胞毒活性。同时以QPCR法和Western-Bolt法检测了分离的B16F10CD133+CD44+CSCs、B16F10非癌干细胞、B16F10野生株以及小鼠体内移植瘤组织中NY-ESO-1、PD-1和WISP-2等相关蛋白的表达水平。
  研究结果:1.B16F10CD133+CD44+CSCs瘤苗免疫组的小鼠成瘤率,肿瘤体积,肿瘤生长速度均较普通瘤苗组低,差异有统计学意义。
  2.B16F10CD133+CD44+CSCs瘤苗免疫组小鼠血清的IFN-γ和脾NK细胞毒和脾细胞毒活性均较对照组瘤苗高,同时TGF-β水平降低、IFN-γ水平上升并且IFN-γ/IL-4比值升高。
  3.QPCR分析相关蛋白的DNA水平显示,B16F10CD133+CD44+CSCs中NY-ESO-1和PD-1高表达,WISP-2低表达。
  4.Western-bolt分析B16F10CD133+CD44+CSCs瘤苗免疫组小鼠肿瘤组织中NY-ESO-1和PD-1均低表达,而WISP-2蛋白却是高表达。
  研究结论:本研究制备的B16F10CD133+CD44+CSCs瘤苗,能有效的诱导抗B16F10的特异性细胞免疫与体液免疫反应,显示出有效的抗肿瘤效应,其机制可能与通过表达肿瘤相关抗原蛋白而调控信号通路蛋白相关。本研究为CD133+CD44+CSCs瘤苗治疗黑色素瘤提供可供参考的实验和理论依据。
[硕士论文] 周瑶
病理学与病理生理学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  免疫球蛋白G(IgG)是一类具有抗体活性可与对应抗原特异性结合的一类球蛋白,而静脉注射免疫球蛋白G(IVIG)其生产来源自至少1000名以上健康献血志愿者,所得血浆进行混合,分离,再提纯而来的。所以说IVIG是一种具有抗体活性并且含有广谱抗菌和抗病毒作用的IgG总和。Margni RA等课题组在20世纪80年代发现在IgG分子中存在一种异常糖基化的IgG,这种免疫球蛋白在其Fab段的一端存在糖基,而另一端没有,使得IgG分子不对称,我们称之为非对称 IgG。这种非对称IgG只能与抗原单价结合,其结合能力比对称IgG弱百倍,并且不能引起下游有效的免疫效应发生,如CDC、ADCC等。黑色素瘤又被称为恶性黑色素瘤,其恶性性程度高,侵袭性强,远处转移发生早,是威胁患者生命健康的最主要因素。相关研究报道,IVIG在动物肿瘤转移模型中对肿瘤在体内的生长和转移起到了明显的抑制作用。但关于IVIG对肿瘤的预防是否有效及其在体内IgG如何产生作用尚无确切报道。在本次研究中,我们探索了IVIG和非对称IgG对于小鼠黑色素瘤肺转移的预防作用和对生存期的影响作用及其可能的作用机制。
  方法:
  ⑴成长至7到8周龄的C57BL/6雌鼠均订购于北京市维通利华实验动物公司,空运至汕头大学医学院并饲养于汕大医学院实验动物中心的SPF级实验动物房。⑵注射使用的小鼠黑色素瘤细胞B16F10均订购于武汉Procell生命科技有限公司,培养于培养基为胎牛血清浓度为10%的DMEM培养基中,置于CO2浓度为5%,温度为37℃的恒温培养箱中。⑶订购于北京索莱宝科技有限公司的小鼠干粉IgG,储存于-20℃冰箱内,用PBS溶液溶解,现用现配。人IVIG为上海莱士公司生产,储存于4℃冰箱内,用PBS稀释,调PH至7.4。⑷将用PBS溶解稀释后的IgG,反复经过装有rProteinG的亲和层析柱,结合在层析柱上的即为纯净的总IgG。⑸将提纯所得的总IgG热变性后,进行SDS-PAGE电泳,使用硝酸银染色显示电泳条带,用来鉴定目的蛋白条带的纯度。⑹将购买来的7到8周龄的C57BL/6雌鼠采用尾静脉注射的方法注射1.5×105,2.0×105个B16F10细胞,一般肿瘤在第15天会形成肺转移灶。利用该动物模型进行预防实验设计。⑺选取黑色素瘤的特异抗体ki67、gp100、mmp-2和mmp-9来对肺组织进行免疫组化染色,并对其阳性率进行统计学分析,来判断IVIG对小鼠黑色素瘤肺转移的预防作用。⑻采用R&D公司的Mouse Cytokine Array Kit小鼠细胞因子蛋白芯片试剂盒,对各组间分泌的炎性因子进行统计学分析。
  结果:
  ①按照上述建模方法,小鼠的黑色素瘤肺转移成瘤率为100%。②经银染鉴定,本实验中所用到的小鼠 IgG与人 IgG由两条带构成且无明显混杂蛋白条带。③IVIG预防性注射可以有效的抑制小鼠黑色素瘤的肺转移的发生。④对称IgG对小鼠黑色素瘤肺转移的抑制作用较好于非对称IgG对小鼠黑色素瘤肺转移的抑制作用。⑤未进行IVIG预防性注射的小鼠肺组织免疫组化显示 ki67和 gp100的阳性率明显高于预防组的小鼠。⑥预防性接种低剂量的IVIG可以有效抑制黑色素瘤细胞的增殖同时抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达。⑦经蛋白芯片检测小鼠血浆内的细胞因子,得出以下结论:IVIG可以刺激小鼠并促进机体产生 BLC,IL-1ra;IVIG可以抑制小鼠机体产生IP-10,JE,KC,MIP-2,TIMP-1,TNF-a。
  结论:
  预防性注射IVIG可以有效的抑制黑色素瘤在小鼠体内的肺转移,而IVIG起到预防和抑制作用的可能机制是通过影响小鼠体内各种炎性因子的分泌从而达到抑制肿瘤生长和转移的效果。分析蛋白芯片结果得出IVIG可以刺激小鼠并促进机体产生TNF-a, IL-1ra;IVIG则抑制小鼠机体产生以下可能对肿瘤生长有促进作用的炎性因子BLC,C5/C5a,G-CSF,IL-1β,IP-10,MIG,MIP-2,TIMP-1,TREM-1,IL-4,IL-7。
[硕士论文] 王同帅
公共卫生 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:黑色素瘤(Cutaneous Malignant Melanoma,CMM),又称恶性黑色素瘤,来源于黑素细胞,呈高侵袭性,易出现远端转移。紫外线是造成皮肤表层细胞DNA损伤的主要的物理因素之一,也是诱发黑色素瘤的明确病因之一。自噬(Autophagy)与凋亡(Apoptosis)是细胞内两种程序性死亡方式。细胞自噬性降解可维持生理状态下机体的稳态,过度自噬引起的自噬失调与肿瘤、感染、神经退行性变等疾病相关。凋亡是通过激活内源性DNA内切酶而诱导的细胞死亡过程。恶性黑色素瘤的发生、发展通常与细胞凋亡基因调控失常而导致凋亡障碍有关。自噬与凋亡作为两种调控方式共同存在于细胞内,二者共同的调控因子使二者可以发生相互转化,从而决定细胞的命运。MicroRNA通过降解靶基因参与自噬与凋亡的调控。因此深入研究UVB的辐射损伤机制及microRNA在其中的作用,能为预防和靶向治疗黑色素瘤提供重要依据。
  研究目的:
  探讨中波紫外线(UVB)和模拟日光紫外线对A375细胞自噬、凋亡的影响,以及自噬与凋亡相互调控来分析紫外线对黑色素瘤A375细胞的生存能力等生物学功能改变,并初步探讨microRNA-664在相互调控中的作用机制。
  研究方法:
  用不同剂量的UVB(功率密度:165μW/cm2)照射A375细胞,在照后不同时间点双荧光自噬慢病毒监测10、30、50mJ/cm2UVB照后A375细胞自噬情况的变化;CCK-8法检测增殖变化;流氏细胞术分析细胞凋亡及周期变化;qPCR检测miR-664的表达;Western Blot分析自噬、凋亡、周期、DNA损伤等生物学功能标志蛋白变化。模拟不同剂量日光照射(UVA∶UVB=95∶5,UVA功率密度为118μW/cm2),观察照后不同时间点A375细胞自噬、凋亡变化,并分析相应的生物学功能标志蛋白变化。
  研究结果:
  (1)UVB照射:
  1)0~50mJ/cm2的UVB照射,对A375细胞自噬诱导的能力呈先增高后降低的抛物线趋势,30mJ/cm2最强。10、30mJ/cm2照射后,自噬体数量在0~6h内逐渐增多,9h开始减少。相应地,LC3、Beclin1在0~50mJ/cm2UVB照后表达先增加后减少,10、30mJ/cm2组蛋白表达在0~6h逐渐增加,9h表达减少;
  2)UVB照射时,10、30mJ/cm2照后均有凋亡高峰(9h)延迟于自噬高峰出现(6h),且在自噬最强时有凋亡标志蛋白表达被抑制;
  3)10、30mJ/cm2的UVB照射A375细胞后,细胞增殖能力均有照后0~6h逐渐增强,9h开始减弱的趋势,但两个剂量增减幅度不同。10mJ/cm2照射后,在0~9h内,S期细胞比例增多,对应的CDK4的表达也呈逐渐增加,且9h达最大值。30mJ/cm2照射组,未见细胞周期的明显改变。在照后24h后细胞均表现为存活。
  (2)模拟日光紫外照射:
  1)不同剂量(10、30、50mJ/cm2)照后均可诱导A375细胞产生自噬,10、30mJ/cm2照射,自噬体在0~6h内逐渐增多,9h开始下降,50mJ/cm2模拟日光照射后自噬体在3h即可形成,在观察时间内均维持较高自噬水平。与之对应的,10、30mJ/cm2组LC3、Beclin1表达在6h才出现显著增加,而50mJ/cm2组在3h已显著增加,6~12h持续高表达;
  2)单纯UVA、单纯UVB及模拟日光紫外照射方式分别照射A375细胞后,三者对自噬诱导能力的由强到弱依次为:模拟照射>单独UVB照射>单独UVA照射;
  3)30mJ/cm2模拟日光紫外照射A375细胞后,凋亡高峰(照后9h)延迟于自噬高峰(照后6h)出现,且自噬高峰有凋亡蛋白Caspase3/9的表达降低。抑制自噬后,6h、9h凋亡蛋白Caspase3/9表达增加。
  (3)较于黑素原代细胞,miR-664在A375细胞中呈低表达,上调miR-664后,UVRAG、Beclin-1表达降低,Atg5、Atg12表达量上升,BAX及Bcl-2无明显变化。
  研究结论:
  1.10、30mJ/cm2的UVB照射,诱导A375细胞产生的自噬促进细胞增殖,对细胞呈保护作用,10mJ/cm2的UVB照射,可诱导细胞发生S期阻滞;
  2.UVB或模拟日光紫外照射可诱导A375细胞产生自噬,UVB是主要贡献者;
  3.紫外照射诱导产生的自噬可以延迟凋亡的发生,促进细胞存活;
  4.A375细胞中miR-664的表达低于黑色素原代细胞,miR-664可能参与紫外诱导A375细胞自噬与凋亡相互调控。
[硕士论文] 曾蓁
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:恶性黑素瘤(malignant melanoma, MM)是一种高度恶性肿瘤,其恶性特性在很大程度上与肿瘤生长的相关的血管生成被促进密切相关。脂氧素A4(Lipoxin A4)可通过下调多种血管生成相关因子表达,进而对肿瘤生长相关的血管生成产生某种抑制作用,从而对多种肿瘤发挥抗肿瘤作用。因此,本研究构建小鼠恶性黑色素瘤模型,在体观察研究脂氧素A4对恶性黑色素瘤的作用,初步探讨其可能的作用机制。
  裸鼠腋下接种人恶性黑色素瘤细胞A375,构建恶性黑色素瘤动物模型,造模成功后随机分为PBS组和BML-111组进行干预治疗,观察并记录小鼠的生活状态和肿瘤生长状况;给药结束后,测量小鼠的肿瘤体积并制作肿瘤生长曲线,剥取肿瘤,称重并计算小鼠肿瘤生长抑制率(tumor growth inhibition rate,IR),HE染色后进行病理组织学检查,免疫组织化学法测定血管生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达水平,收集小鼠血清,用免疫酶方法(ELISA)检测血清中血管生成因子的表达,探讨脂氧素A4在小鼠体内对恶性黑色素瘤的作用。
  在整体实验过程中,两组裸鼠的体重、饮食、行为等生长状况均未见明显异常,表明脂氧素(1mg/kg)在该剂量下对小鼠尚无明显药物毒性。小鼠给药结束后的肿瘤体积的实验结果表明,与 PBS组比较, BML-111组小鼠肿瘤体积(171.86±37.22mm3)明显小于PBS组(348.54±64.26mm3)(P<0.01),其肿瘤生长曲线平缓。BML-111组小鼠肿瘤的瘤重(0.15±0.03g)明显小于PBS组(0.34±0.18g)(P<0.01),抑瘤率明显大于PBS组(IR=57.12%),可显著抑制小鼠肿瘤的生长。HE染色结果显示,在光镜下,与BML-111组相比,PBS组小鼠肿瘤组织的肿瘤细胞呈恶性增殖,细胞大小不一,且其细胞形状不规则,呈条索状排列,有纤维隔分离。肿瘤细胞胞核明显较大,着色较深,并且可见不规则的核分裂相。BML-111组小鼠肿瘤组织的肿瘤细胞胞核体固缩,与PBS组肿瘤细胞相比,其细胞间隙明显增大,出现了多处片状坏死灶,大部分的细胞溶解、破碎。免疫组织化学结果表明,与PBS组比较,BML-111组小鼠肿瘤组织中血管生成因子表达明显减弱,其IOD值(20.01±4.21)较PBS组(91.12±8.60)低(P<0.01)。ELISA法检测结果表明,与PBS组比较,BML-111组裸鼠血清中血管生成因子的表达明显减少,其VEGF浓度(C=7.87±0.28ng/ml)明显少于PBS组浓度(C=20.57±0.41ng/ml)(P<0.01),表明脂氧素有抑制肿瘤血管生成的趋势。
  脂氧素A4在裸鼠体内可显著抑制恶性黑素瘤生长,其可能是通过抑制与肿瘤生长相关的血管生成,在体内对恶性黑色素瘤发挥抗瘤效应。
[硕士论文] 王睿
肿瘤学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  从蛋白、基因水平研究时钟基因Per1、Per2、Per3在头颈部鳞癌及正常组织中的表达与临床特征、分期和生存之间的联系,望为临床评估患者疗效及预后提供参考依据。
  方法:
  收集头颈部鳞癌组织标本20例,头颈部正常组织标本7例,采用实时荧光定量PCR法检测Per1、Per2、Per3基因的表达水平,通过相对定量法分析Per1、Per2、Per3基因在头颈部鳞癌组织及头颈部正常组织中的表达是否有差异,及头颈部鳞癌组织中Per1、Per2、Per3基因表达水平与早期、晚期患者之间的关系。同时采用免疫组化法检测60例头颈部鳞癌标本及20例头颈部正常组织标本中Per1、Per2、Per3蛋白表达情况,运用染色程度分级与染色细胞百分比相乘结果测定Per1、Per2、Per3蛋白表达水平,分析头颈部鳞癌组织及头颈部正常组织中Per1、Per2、Per3蛋白之间的关系,并从蛋白水平分析其与患者临床特征、肿瘤临床分期、即刻疗效和生存之间的关系。
  结果:
  实时荧光定量PCR法检测显示Per1、Per2、Per3基因在头颈部鳞癌组织中及头颈部正常组织中均有表达,但头颈部鳞癌组织中Per1、Per2、Per3基因的表达较正常组织明显下降(P<0.01),晚期患者中 Per1、Per2、Per3基因下调水平均高于早期患者,且Per2、Per3基因下调程度明显高于早期患者,差异有统计学意义(P<0.01)。运用免疫组化法检测表明头颈部鳞癌组织中Per1、Per2、Per3蛋白阳性表达率明显低于正常组织中的阳性表达率,差异有统计学意义(P<0.05),且头颈部鳞癌组织中Per1、Per2、Per3蛋白阳性表达与肿瘤临床分期有明显相关性(P<0.05),但其与患者年龄、性别无关。即刻疗效方面,Per1、Per2、Per3蛋白阳性组患者其治疗有效率高于阴性组患者,其结果具有统计学意义(P<0.05)。头颈部鳞癌患者中 Per1、Per2、Per3蛋白阳性组患者的1、2、3年OS明显高于阴性组,差异有统计学意义(P<0.05);Per1、Per2、Per3蛋白阳性组患者的1、2、3年PFS、RFS均明显高于阴性组,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  Per家族基因表达的降低可能与头颈部鳞癌的发生具有相关性,且在晚期患者中其Per2、Per3基因的下调程度高于早期头颈部鳞癌患者;Per家族蛋白表达阳性的头颈部鳞癌患者较阴性患者其可能具有更长的OS及PFS,RFS,而这也提示Per家族基因与头颈部鳞癌的预后中具有重要作用。
[硕士论文] 魏云
生物学 武汉科技大学 2017(学位年度)
摘要:细丝蛋白A(Filamin A-FLNA)是一种肌动蛋白结合的蛋白,由X染色体上的基因编码,分子量为280 KD,参与细胞内多种生理生化活动,包括基因转录和细胞增殖等。最近的研究表明,FLNA能够差异性地调节转化细胞中RNA聚合酶Ⅲ所指导的基因转录,包括5S rRNA,tRNA等的基因转录。由于5S rRNA是细胞核糖体重要组成分;因此,FLNA是否能够调节细胞中核糖体蛋白基因的表达还不清楚。在这项研究中,通过转染FLNAshRNA慢病毒表达载体敲低Hel a,SaOS2等细胞中FLNA的表达,利用RT-qPCR、Western blot和免疫荧光染色实验检测发现,这些细胞中的一部分核糖体蛋白基因表达明显增高.在HEK293T,Hela细胞中,当过表达FLNA时,显著降低一部分核糖体蛋白基因的mRNA和蛋白质表达水平。这些结果提示,FLNA至少能够抑制细胞中一部分核糖体蛋白基因的表达。为进一步确定这一研究结果,我们分析了黑色素瘤细胞M2(天然缺失FLNA)和A7(稳定表达FLNA)中核糖体蛋白基因的表达;结果表明,M2细胞中绝大多数核糖体蛋白基因的表达量显著高于A7细胞。此外,在A7细胞系中再次敲低FLNA的表达(A7△FLNA),与A7相比,一些核糖体蛋白基因的表达水平明显升高。这些结果证明FLNA能够抑制细胞中核糖体蛋白基因的表达,而且这种抑制表现出基因和细胞的特异性。为了明白FLNA如何调节核糖体蛋白基因的表达,我们选择RPS6,RPL3这两个核糖体蛋白基因为代表,将其启动子克隆在报告基因载体上并转染细胞。数据表明,当细胞的FLNA表达量低时,报告基因表达水平则增加;而当FLNA表达量升高时,报告基因表达水平则降低。说明FLNA抑制核糖体蛋白基因的表达是通过抑制核糖体蛋白基因转录来实现的。这项发现不仅拓展对细胞中FLNA功能的了解,也为FLNA抑制细胞增殖的机制提供全新的解释。
[硕士论文] 刘静
药学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的
  黑色素瘤因其恶性程度极高而成为皮肤恶性肿瘤致死的主要原因之一,高发的侵袭和转移是其最为显著的特征和影响患者生存的首要因素。黑色素瘤的发病主要与紫外线的过度照射、环境因素、遗传因素、外界刺激等因素相关,目前治疗的主要方式包括手术、化疗、放疗和药物治疗,但预后较差,复发率高,病死率高。肿瘤细胞的无限生长和机体抗肿瘤免疫应答之间的相互作用是影响肿瘤发生发展的主要原因,为了有效激活机体抗肿瘤免疫应答,肿瘤免疫治疗得到了广泛的关注和迅速发展。研究发现,黑色素瘤免疫原性高,通过对其进行免疫治疗,增强机体抗肿瘤免疫应答,能有效的抑制肿瘤的生长,这也使得黑色素瘤的免疫治疗得到迅速的发展。Pim-3作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶,在多种癌症中异常表达增加,主要通过磷酸化特异性底物使其失去活性,导致细胞凋亡减少、增殖增多,最终调控肿瘤的发生发展,因此Pim-3可能成为抗肿瘤治疗的一个新靶点。基于以上背景,我们尝试一方面利用具有免疫刺激作用的单链RNA(ssRNA)序列激活机体TLR-7受体,进而诱导细胞因子的产生,活化免疫效应细胞,最终刺激机体抗肿瘤免疫应答,引起机体免疫系统对癌细胞的自主杀伤及清除;另一方面我们通过RNA干扰技术特异性沉默原癌基因Pim-3的表达,进而诱导肿瘤细胞凋亡,从肿瘤细胞本身出发抑制肿瘤的生长。结合以上两方面的设想,我们构建了靶向沉默Pim-3的双功能shRNA表达载体,该载体既能通过其包含的ssRNA片段活化TLR7受体激发机体抗肿瘤免疫应答,又能通过shRNA特异性沉默原癌基因Pim-3的表达,促进肿瘤细胞的凋亡。本研究旨在观察此双功能表达载体对小鼠黑色素瘤的治疗作用,并探讨其可能的分子机制。
  方法
  1.以小鼠的黑色素瘤细胞系B16为主要研究对象,首先通过Western-blot检测Pim-3在B16细胞、黑色素瘤组织及正常小鼠皮肤组织中的表达。
  2.用脂质体将pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA质粒转染到B16细胞中,通过qPCR和Western-blot等方法检测双功能载体对Pim-3的沉默效果;通过ELISA检测转染后B16细胞中Ⅰ型干扰素的分泌,以确定TLR信号通路的活化。
  3.用脂质体转染pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA质粒到B16细胞中,24h后,通过AnnexinⅤ/PI染色和TUNEL免疫荧光技术检测B16细胞的凋亡;通过Western-blot等方法检测Bad、p-Bad、BCL-2、BCL-XL等凋亡相关分子的表达。
  4.通过划痕、transwell实验检测B16细胞转移和侵袭的变化;通过qPCR和Western-blot技术检测EMT相关指标的变化。
  5.通过Western-blot检测STAT3、MAPK及NF-κB信号通路的活化情况,通过免疫共沉淀技术(Co-IP)检测Pim-3与STAT3之间的结合,以探讨Pim-3调控B16细胞侵袭转移的机制。
  6.对C57BL/6小鼠进行B16细胞皮下荷瘤,待肿瘤长出后给予双功能载体治疗,观察肿瘤生长情况,脾脏和肿瘤组织中各淋巴细胞的比例和活化情况。
  7.给B16细胞转染pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA质粒后,通过尾静脉注射转染不同质粒的B16细胞,建立黑色素瘤肺转移模型,观察不同载体治疗对B16黑色素瘤细胞肺转移的影响。
  8.用清除抗体分别对C57BL/6小鼠NK、CD8+T和pDC细胞进行清除,再对小鼠进行B16细胞皮下荷瘤,观察在双功能载体介导的抗肿瘤作用中,这三种细胞所发挥的作用。
  9.进一步观察pDC细胞清除后,双功能载体的抗肿瘤作用及NK、CD8+T细胞的活化情况。
  结果
  1.Pim-3在正常小鼠皮肤中的表达极低,而在黑色素瘤细胞系中明显高表达。
  2.双功能载体能有效沉默黑色素瘤细胞中Pim-3的表达,刺激Ⅰ型干扰素的分泌,引起TLR信号通路的活化。
  3.用Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA载体转染B16细胞后,B16细胞的凋亡明显增加。凋亡相关分子p-Bad、Bcl-2、Bcl-xl的表达明显下调。
  4.Pim-3-shRNA,尤其是ssRNA-Pim-3-shRNA表达质粒,能明显的抑制B16的转移侵袭;进一步研究发现Pim-3的沉默主要通过抑制肿瘤细胞EMT过程的发生进而抑制肿瘤细胞的转移侵袭过程。
  5.ssRNA和ssRNA-Pim-3-shRNA促进NF-κB信号通路的活化,而Pim-3-shRNA和ssRNA-Pim-3-shRNA沉默Pim-3抑制STAT3的磷酸化,且Co-IP结果显示Pim-3和STAT3之间有明显的结合。进一步研究发现沉默Pim-3可抑制STAT3的磷酸化,进而减弱EMT过程,抑制肿瘤的转移侵袭。
  6.双功能载体可以显著抑制B16皮下肿瘤的生长,同时能够增加脾脏和肿瘤局部淋巴细胞中NK细胞和CD8+T细胞的比例和活化,并且增加pDC的比例。
  7.清除NK和CD8+T细胞均可明显削弱双功能载体治疗对黑色素瘤生长的抑制作用。
  8.清除pDC细胞明显削弱双功能载体对黑色素瘤的治疗作用,NK、CD8+T细胞的比例和活化也减弱。
  9.Pim-3-shRNA,尤其是ssRNA-Pim-3-shRNA表达质粒,能明显抑制黑色素瘤的肺转移过程。
  结论
  1.靶向Pim-3的双功能载体可以明显促进黑色素瘤细胞的凋亡、抑制黑色素瘤细胞的增殖,并引起pDC的活化,分泌大量Ⅰ型干扰素,增强NK细胞和CD8+T细胞杀伤的敏感性,最终有效抑制肿瘤生长。
  2.Pim-3能够通过增强STAT3的磷酸化而促进黑色素瘤的EMT进程,最终促进黑色素瘤细胞侵袭转移。
  3.这种兼具靶基因沉默作用和免疫激活作用的双功能载体,具有在沉默Pim-3的同时提高机体免疫应答能力,进而抑制肿瘤的生长、转移侵袭,有望成为用于黑色素瘤等肿瘤治疗的新手段,将为黑色素瘤的治疗提供新的策略和思路。
[硕士论文] 荣冬芸
皮肤病与性病学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:近年研究报道显示,姜黄挥发油对多种肿瘤细胞具有抑制作用,能显著减少肿瘤数目,缩小瘤体体积,其主要作用于肿瘤早期,还能预防肿瘤形成。本文研究姜黄挥发油(turmeric volatile oil,TVO)对人表皮黑色素瘤A375(以下简称A375)细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其作用机制。
  方法:不同浓度TVO在体外对A375细胞的作用。细胞增殖-毒性检测(CCK8)法测不同浓度TVO(0~160mg/L)在不同时间段(24h、48h、72h)对A375细胞的增殖抑制率;根据CCK8结果选取有效最低药物浓度进行实验:吉姆萨染色,倒置显微镜观察细胞凋亡形态;DNA片段化检测细胞凋亡;流式细胞术测细胞凋亡率;Western blot检测Caspase-3及BIRC7蛋白表达。
  结果:随TVO浓度的增加对A375细胞生长具有显著的抑制增殖作用,CCK-8结果示浓度为(0、2.5、5、10、20、40、80、160mg/L)TVO,24h抑制率分别为(0、2.5、5、10、20、40、80、160mg/L)TVO,24h抑制率分别为(0.00±0.00、0.015±0.02、0.084±0.02、0.087±0.01、0.096±0、0.087±0.01、0.122±0.03、0.209±0.01);48h(0.00±0.00、0.005±0.00、0.139±0.02、0.160±0.01、0.217±0.03、0.225±0.02、0.246±0.01、0.355±0.01);72h(0.00±0.00、0.323±0.00、0.446±0.01、0.470±0.02、0.479±0.02、0.352±0.01、0.385±0.02、0.441±0.01),与0mg/L相比P<0.05;TVO诱导A375细胞凋亡,药物诱导后细胞增殖变慢,贴壁性降低,形态变得不规则,见核固缩、核碎裂及核溶解,提取DNA凝胶电泳药物作48h后,可见凋亡典型的DNA梯状条带,并随药物浓度增加越明显细胞核碎裂;流式测细胞凋亡率,浓度为0、2.5、5、10mg/L的TVO,A375凋亡率分别为0、12.7、13.6、15.4%,死亡率仅为0.1%;Western blot测浓度为(0、2.5、5、10mg/L)TVO作用48h后,随药物浓度增高,凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-1、TNR-α的表达量逐渐增多,凋亡抑制相关蛋白BIRC7、TAK1、JNK1、TAB1表达量逐渐减少,与0mg/L相比P<0.05。
  结论:TVO对人恶性黑色素瘤细胞株A375细胞有抑制增殖作用,同时有促其凋亡作用,具有抗肿瘤细胞功效。其机制之一是通过下调细胞凋亡抑制蛋白BIRC7表达,激活细胞凋亡途径关键酶Caspase-3,进而抑制肿瘤细胞分化、增殖与促进凋亡。
[硕士论文] 昝雪娟
皮肤病与性病学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究姜黄挥发油对人皮肤鳞癌(CSCC)A431(以下简称A431)细胞增殖与凋亡的影响,并探究其凋亡机制。
  方法:应用不同浓度的姜黄挥发油分别作用于皮肤鳞癌A431细胞24h、36h、48h,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测增殖抑制率;倒置显微镜观察细胞形态学变化;吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)双染色荧光显微镜观察A431细胞凋亡情况;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)表达量。
  结果:本实验通过CCK-8检测不同浓度(0、5、10、20、40、80μmol/L)姜黄挥发油作用人皮肤鳞癌A431细胞24h、36h、48h后,表现出不同大小的抑制作用,药物浓度从低浓度至高浓度,抑制率呈增高趋势,且其作用方式呈现剂量依赖性.作用24h后,当药物浓度达到10 mg/L,倒置显微镜下观察到当加入药物后,表现为细胞形态不规则,细胞增殖速度明显变慢,AO/EB染色后可见部分早期凋亡细胞,核染色质着黄绿色或黄色;当药物浓度达到20 mg/L,细胞核固缩,部分肿瘤细胞膜开始破裂,可见部分细胞内容物释放,AO/EB染色后可见部分黄色荧光的早期凋亡细胞和呈橘红色荧光的晚期凋亡细胞;当药物浓度达到40 mg/L,肿瘤细胞明显减少,部分细胞裂解成细胞碎片,并有大量漂浮细胞,AO/EB染色后可见大量细胞核染色质呈橘红色,并可见橘红色坏死细胞及碎片;流式细胞仪检测表明姜黄挥发油对皮肤鳞癌A431细胞具有促进凋亡作用,且随着药物浓度的增加,呈药物浓度-凋亡率正相关性;Western blot法检测结果半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)表达量随着药物浓度增加而增加,呈一定范围范围内浓度依赖性,且同一药物浓度作用下,Caspase-3蛋白表达量均多于Caspase-9。
  结论:姜黄挥发油对皮肤鳞癌A431细胞具有增殖抑制及促进其凋亡的作用,其凋亡的机制可能与上调Caspase-3、Caspase-9的表达有关。
[博士论文] 邱海江
眼科学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  确定黑色素瘤中miR-769表达是否异常并筛选其靶基因,研究其具体发病机制及验证沉默miR-769能否抑制黑色素瘤细胞增殖。
  方法:
  1、实验对象与分组
  ①黑色素瘤患者的病理标本,按病理分期命名为原位组(10例)和转移组(14例);24例正常色素痣病理标本命名为色素痣组。7种黑色素瘤细胞株命名为MM组,人表皮黑色素细胞系命名为PEM组。
  ②黑色素瘤A375细胞株命名为A375组;黑色素瘤细胞株A375分三组分别转染miR-769 mimics、miR-769-inhibitor和随机RNA序列,命名为mimics组,inhibitor组和NC组。
  ③GSK3β野生型质粒和突变型质粒分别转染A375细胞株,命名为WT组和MUT组。
  ④inhibitor组分别再转染干扰RNA GSK3β-siRNA#1和GSK3β-siRNA#2,命名为RNA干扰组。
  2、病理标本和黑色素瘤细胞中miR-769表达
  黑色素瘤(原位组、转移组)与色素痣组的病理标本; PEM组与MM组细胞株分别进行QRT-PCR试验,测定miR-769表达量并对比。
  3.miR-769作用机制研究
  Western Blot检测MM组、inhibitor组和PEM组细胞中GSK3β的表达量;双荧光素酶试验测定mimics组、inhibitor组、MUT组荧光素酶的活性;Western Blot检测inhibitor组和NC组的cyclin D1和c-myc的表达量。
  4、沉默miR-769研究
  mimics组,inhibitor组和 NC组分别进行QRT-PCR实验、MTT试验、平板细胞克隆实验和BrdU细胞增殖实验。
  RNA干扰组分别进行Western Blot实验、平板细胞克隆形成实验、锚定非依赖生长分析实验、BrdU细胞增殖实验。
  5.统计分析
  采用SPSS21.0统计软件,对数据进行方差分析、t检验、卡方检验。以P<0.05作为差异有统计学意义。
  结果:
  1.QRT-PCR检测miR-769表达
  黑色素瘤病理标本转移组中miR-769的平均表达水平最高,其次是原位组,色素痣组最低;MM组中miR-769的平均表达水平较PEM组高。
  2.miR-769作用机制
  Western Blot: inhibitor组GSK3β的表达量最高,其次是NC组,A375组几乎没有。双荧光素酶报告:mimics组的细胞荧光素酶活性降低,inhibitor组升高,MUT组的不变。Western Blot: A375组中cyclin D1和c-myc表达明显提高;inhibitor组表达下降。
  3.沉默miR-769
  QRT-PCR: mimics组miR-769表达最高,其次是NC组,inhibitor组最低;MTT试验:mimics组OD值最高,NC组其次,inhibitor组最低;平板细胞克隆实验中mimics组细胞克隆形成率最高,NC组其次,inhibitor组最低;BrdU细胞增殖实验中mimics组S期细胞比例最高,NC组其次,inhibitor组最低。
  Western Blot:RNA干扰组GSK3β的蛋白条带几乎没有;平板细胞克隆结果:RNA干扰组中细胞克隆形成率显著升高;锚定非依赖生长分析实验:RNA干扰组中直径大于0.1mm集落数目显著高于NC组;BrdU细胞增殖实验:RNA干扰组中S期细胞比例明显高于NC组。
  结论:
  1、miR-769过表达与黑色素瘤发病密切相关。
  2.黑色素瘤细胞中miR-769下调靶向基因GSK3β表达,激活cycin D1和c-myc,从而促进黑色素瘤细胞的增殖。
  3.沉默miR-769表达可上调GSK3β表达,进而抑制黑色素瘤细胞的增殖。小干扰RNA可下调GSK3β的表达,抑制这一过程。
[硕士论文] 郑春玲
生物工程 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:背景:黑色素瘤起源于恶性黑色素细胞,恶性程度极高,死亡率高。发病率约占人体全身恶性肿瘤的2.0%,每年因为患此病而去世的人非常多。近十年的调查显示,恶性黑色素瘤的发病率呈连续上升的趋势。目前手术切除是临床上最常见的治疗手段,此外,也有很多黑色素瘤患者采用细胞免疫治疗,它的治疗效果相对更显著且持久。但是,大部分黑色素瘤患者对常规治疗会产生抗性,因此寻找治疗黑色素瘤更有效的方法迫在眉睫。结合肿瘤研究的现状发现,机体内存在着多种与黑色素瘤生长密切相关的基因,其中血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是近年作为研究的明星分子之一,被广泛当做肿瘤中的靶基因来研究,其主要功能是降解血红素使其释放胆绿素、CO和Fe2+。参与维持细胞稳态、降低机体的氧化损伤、减轻炎症反应以及调控细胞凋亡和细胞增殖等。已有文献证实,HO-1在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种人体恶性肿瘤中呈现出高表达现象,HO-1在肿瘤中的异常表达会受到信号通路网络作用,进而调控细胞的增殖与凋亡。由于HO-1在黑色素瘤中的功能还鲜有报道,我试图采用 CRISPR/Cas9技术进一步探究 HO-1在黑色素瘤中的作用机制。CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术,其特点是能够定向改造和修饰基因,因此可以作为肿瘤的基因治疗的一种新策略和途径。我通过构建HO-1干扰、过表达和敲除载体,转染至人恶性黑色素瘤细胞A375中,探究HO-1的生物学效应及其调控的PI3K/AKT信号通路。
  目的:通过构建HO-1干扰、过表达和敲除载体,将其转染到A375细胞中,并建立稳定细胞系,检测A375细胞的增殖、凋亡及转移的变化。结合PI3K/AKT信号通路,探究敲除HO-1所产生的生物学效应的机制。
  方法:测序检测A375细胞中的HO-1是否敲除成功,Western blotting检测HO-1及相关信号通路分子蛋白表达,Q-PCR检测信号通路相关的表达,细胞免疫荧光实验检测HO-1基因的表达分布,CCK8及克隆形成实验检测三种不同稳定细胞系的增殖能力,划痕实验检测三种不同稳定细胞系的迁移距离,流式细胞技术检测细胞的周期及凋亡情况,裸鼠成瘤实验检测HO-1对肿瘤生长的影响。
  结果:⑴Western blotting结果显示,与对照组相比,A375细胞中的HO-1过表达组其蛋白水平明显上升,HO-1干扰组蛋白水平降低,且细胞免疫荧光实验显示的荧光强度也得到了类似的结果。测序结果显示HO-1发生了移码突变且敲除成功。⑵HO-1过表达有促进A375细胞增殖的作用,HO-1干扰对A375细胞增殖无明显影响,HO-1敲除显著降低A375细胞增殖CCK8结果表明,在96小时内HO-1过表达和干扰的细胞增殖能力与对照组相比无明显差异,HO-1敲除的稳定细胞系的细胞增殖与对照组细胞相比受到了明显的抑制。结晶紫染色结果显示,HO-1过表达细胞增殖数量跟对照组相比有一定的增加, HO-1干扰组细胞增殖数量较对照组无明显差异,但是HO-1敲除的稳定细胞系的细胞数量明显比对照组少很多。裸鼠成瘤实验结果一致显示,HO-1过表达有促进肿瘤生长的作用,HO-1干扰对A375细胞的增殖影响并不大,但HO-1敲除能显著抑制A375细胞的增殖。⑶细胞划痕实验结果显示,三种不同的稳定细胞系在12、24、36、48小时期间,同一时间段内的细胞迁移的距离均无明显差异,并且没有有效抑制A375细胞的迁移,说明HO-1对A375细胞的迁移能力影响不大。⑷流式细胞术的检测结果表明,过表达HO-1有促进A375细胞增殖,抑制细胞凋亡的作用,HO-1干扰对A375细胞的周期凋亡均影响不大,但是HO-1敲除能够显著促进A375细胞的凋亡以及S期细胞周期阻滞,说明敲除HO-1后抑制了细胞的增殖。⑸通过Western blotting和Q-PCR检测了PI3K、AKT、Bax、P21、等信号分子,结果显示 HO-1敲除的稳定细胞系中 PI3K、AKT等基因表达明显降低,Bax、CyclinD1等基因表达显著上升,因此我推测HO-1主要是通过PI3K/AKT这条信号通路引起A375细胞发生周期阻滞,诱导细胞凋亡。
  结论:通过众多实验结果发现,过表达HO-1有促进A375细胞增殖并抑制其凋亡的作用,干扰HO-1不能有效抑制A375细胞的增殖和促进凋亡,但敲除HO-1能够显著抑制黑色素瘤细胞的增殖同时促进凋亡;其主要通过 PI3K/AKT信号通路来调控。此外,未发现HO-1对A375细胞的迁移能力有影响。
[硕士论文] 杨瑶
皮肤病与性病学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:近年来的研究发现,SHARPIN参与肝癌、肾癌、骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的发生发展,提示SHARPIN是一个新的肿瘤相关基因。SHARPIN表达于多种组织和器官,参与调控NF-κB、JNK信号通路、角质形成细胞凋亡等,具有调节炎症、细胞增殖与凋亡等多种生物学功能。目前尚无SHARPIN与皮肤肿瘤发病关系的研究。皮肤基底细胞癌(Basal cell carcinoma,BCC)是人类最常见的皮肤肿瘤,其发病与Hedgehog信号通路有很大关联,Hedgehog信号通路下游分子GLI1和GLI2可以直接调控c-JUN,有研究证实c-JUN在BCC组织中高表达,JUN是JNK信号通路下游信号分子。因此我们提出疑问,SHARPIN是否通过调控经典的JNK信号通路参与BCC的发生发展?本课题拟研究SHARPIN在BCC中所起的功能及其相关的信号通路。
  研究目的:
  1.明确SHARPIN基因在BCC中的突变情况;
  2.明确SHARPIN蛋白在BCC组织和细胞株中的表达情况;
  3.研究SHARPIN表达变化对BCC细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响;
  4.研究SHARPIN表达变化通过哪些信号通路和分子影响BCC细胞功能。
  研究内容和方法:
  1.SHARPIN基因突变及表达变化与BCC的相关性研究
  1)SHARPIN基因在BCC石蜡组织中的突变情况
  采用PCR对SHARPIN外显子进行扩增,Sanger测序后分析SHARPIN基因的突变情况。
  2)SHARPIN蛋白在BCC组织中的表达情况
  采用免疫组化技术,检测SHARPIN蛋白在BCC和正常皮肤中的表达情况;采用Western Blot检测BCC细胞株TE354.T和人永生化角质形成细胞HaCaT中SHARPIN蛋白表达差异;采用免疫荧光检测SHARPIN在BCC组织中的定位。
  2.SHARPIN对BCC细胞株TE354.T细胞功能的影响
  1)构建SHARPIN过表达和沉默慢病毒载体,转染TE354.T细胞,采用WB和qRT-PCR检测转染效率;
  2)利用EdU、CCK-8检测SHARPIN表达变化对细胞增殖的影响;
  3)利用TUNEL和AnnexinⅤ检测SHARPIN表达变化对细胞凋亡的影响;
  4)利用Transwell检测SHARPIN表达变化对细胞侵袭和迁移的影响。
  3.SHARPIN表达变化影响细胞功能的分子机制研究
  1)根据第2部分结果利用WB检测SHARPIN表达变化对细胞功能相关蛋白表达的影响;
  2)利用WB检测SHARPIN表达变化对JUN和GLI蛋白表达的影响。
  研究结果:
  1.BCC中SHARPIN基因存在高频突变,突变率达28.1%; SHARPIN蛋白在BCC癌组织中表达降低或丧失;
  2.SHARPIN低表达可以促进TE354.T细胞的增殖;
  3.SHARPIN低表达使Cyclin D1和CDK4表达升高;c-JUN表达降低,磷酸化c-JUN表达升高;GLI1表达无明显变化,GLI2表达升高。
  研究结论:
  1.SHARPIN在BCC组织中表达显著降低甚至丧失,且存在高频突变,提示SHARPIN在BCC发病中具有肿瘤抑制基因的特征,可作为基底细胞癌鉴别诊断的分子标记;
  2.SHARPIN低表达可以促进TE354.T细胞的增殖,提示SHARPIN表达下降加快细胞增殖可能是调控BCC发生发展的主要机制;
  3.SHARPIN低表达促进JUN磷酸化,激活GLI2,从而高表达Cyclin D1和CDK4,导致BCC细胞周期的S期细胞比例增多,促进细胞增殖。
[硕士论文] 孔令卓
皮肤病与性病学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨反射式共聚焦显微镜辅助界定乳房外paget病肿瘤边界在手术治疗中的作用。
  方法:对入院前已行病理组织检查确诊为EMPD的13位患者实施RCM诊断及皮损边界判定。检查前对皮损表面严重糜烂、渗出、结痂的患者,采取硼酸洗液湿敷、乳酸依沙吖啶糊剂外用、醋酸泼尼松片口服对症处理,减少渗出,减小分泌物对成像准确性的影响。检查前对皮损及皮损周围毛发备皮处理。患者平卧,屈髋屈膝位。规定RCM镜头的两侧分别为内侧、外侧缘。根据RCM下肿瘤组织具有异型性以及paget细胞体积大、胞浆暗、细胞核亮的特点,沿肿瘤肉眼边缘进行四点定位,记录RCM下肿瘤边界。在RCM边界基础上,参考传统手术方法,对EMPD患者进行切除,切缘行四点检测。RCM边界定位点取材行病理学检查。搜集既往6年我院初诊为EMPD并行扩大切除术者的四点监测结果。对比分析13例EMPD患者的扩大切除与对照组常规扩大切除组织病理的吻合率,并进行统计学分析。分析不同解剖部位对RCM准确性影响。
  结果:试验组的13例EMPD患者中,3例患者四点检测病理至少1点存在肿瘤残余,病理检测阳性率23.1%;10例患者四点监测病理全部阴性,病理检测阴性率76.9%。对照组50例患者中23例患者四点监病理至少1点存在肿瘤残余,病理检测阳性率46%;27例患者四点监测病理全部阴性,病理检查阴性率54%。阴囊处RCM准确性最低。
  结论:在本次临床观察中,试验组与对照组有统计学差异。与传统扩大切除相比,术前对EMPD皮损进行边界定位可以提高EMPD精准切除率。
[硕士论文] 刘嘉
生物技术 大连医科大学 2017(学位年度)
摘要:背景:黑色素瘤是一种皮肤恶性肿瘤,其早期不易发现,晚期极易转移,并且具有极高的化疗耐药性。目前,癌症治疗最有效的手段是手术、放疗、化疗和免疫治疗。化疗是一种全身治疗的手段,通过静脉给药途径,化学药物会随着血液循环遍布全身的绝大部分器官和组织。因此,高转移性的恶性黑色素瘤的主要治疗手段是化疗。顺铂是一种治疗癌症常用的铂类化疗药物,能够造成细胞DNA损伤,诱导细胞凋亡,抑制细胞生长增殖,从而杀伤癌细胞。但是肿瘤细胞通过抑制药物的摄取以及增强DNA损伤修复功能,产生化疗耐药。针对化疗耐药的DNA损伤修复机制尚不明确,发现新型有效的作用靶点对增强肿瘤细胞化疗敏感性具有重要意义。GADD45A(Growth Arrest and DNA damage-inducible45 A)是DNA损伤修复的关键基因,在细胞凋亡和细胞周期调控中发挥重要的作用。通常在损伤因子作用后,GADD45A随着DNA损伤修复通路的诱导而产生。因此,GADD45A基因在肿瘤细胞耐药中起着重要的作用。
  目的:该研究主要通过下调DNA损伤修复基因GADD45A的表达,研究其在黑色素瘤化疗耐药中的作用机制,能够作为新的作用靶点增强黑色素瘤化疗敏感性,从而达到治愈的效果。
  方法:1.利用qPCR array检测在顺铂作用下的黑色素瘤A375细胞中的84种DNA损伤修复基因的mRNA表达情况。2.根据目的基因GADD45A的碱基序列,设计特异的siRNA及无关(negative control)干扰序列。利用小RNA干扰技术,通过lipofectamin2000脂质体法瞬时转染A375细胞,获得GADD45A表达下调的细胞模型。3.qPCR和Western Blot方法检测细胞中目的基因的mRNA及蛋白质水平的表达情况。4.采用MTT法和克隆形成实验检测体外培养的A375细胞的生长和增殖情况。5.细胞流式法检测细胞的周期和凋亡变化情况。6.利用彗星实验和细胞免疫荧光检测A375细胞在顺铂作用下,细胞DNA损伤和DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达情况。
  结果:1. PCR array结果表明,顺铂作用于A375细胞后,84种DNA损伤修复基因中有12种基因表达水平升高两倍以上,其中GADD45A基因mRNA表达水平升高5倍以上。2. qPCR和Western Blot结果验证了GADD45A基因的表达水平受顺铂的诱导作用明显升高,并且具有浓度和时间依赖性。3.利用小RNA干扰技术,成功获得GADD45A表达下调的细胞模型。4. MTT法和克隆形成实验结果表明,GADD45A表达下调组细胞受顺铂药物的生长和增殖抑制作用明显高于对照组细胞。5.细胞流式结果表明,GADD45A表达下调组细胞受顺铂药物的凋亡诱导作用明显高于对照组细胞,并且与细胞周期的调节有关。6.彗星实验和细胞免疫荧光结果表明,GADD45A表达下调组细胞受顺铂药物的DNA损伤诱导作用明显高于对照组细胞,说明GADD45A基因表达下调能够增强黑色素瘤细胞的化疗敏感性。7. Western Blot结果显示MEK抑制剂影响GADD45A的表达,说明MAPK信号通路参与调节GADD45A的表达。
  结论:GADD45A基因表达下调能够明显增强黑色素瘤细胞的化疗敏感性,说明该基因在诱导黑色素瘤细胞产生化疗耐药性中起着至关重要的作用,并且GADD45A基因有望成为新的分子作用靶点,成为降低恶性黑色素瘤耐药性的有效作用靶点。
[硕士论文] 姜彬
皮肤病与性病学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)是一种常见的非黑素瘤皮肤癌(nonmelanoma skin cancer,NMSC),近年来发病率有明显上升趋势,传统的治疗主要是外科手术切除、激光和冷冻治疗等,近年来发现ALA-PDT及阿维A在治疗非黑素瘤皮肤癌取得了一定的疗效。目前,尚无ALA-PDT联合阿维A治疗皮肤肿瘤的临床尝试或基础研究。本研究拟探讨ALA-PDT不同处理参数,阿维A不同浓度及处理时间对鳞状细胞癌细胞活性的影响,并进一步研究两者联合处理鳞状细胞癌细胞时是否具有更强的叠加作用,以初步明确ALA-PDT联合阿维A对细胞的影响,为临床上探索皮肤鳞状细胞癌新的治疗方案提供理论依据。
  方法:
  首先在96孔板上培养SCL-1细胞,配置不同浓度的ALA培养液、孵育不同时间,设定不同参数的功率密度以及光照时间,对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞进行ALA-PDT处理(633±5 nm的红光),处理后用CCK-8法测定活细胞数量。应用不同浓度的阿维A及作用时间对SCL-1细胞进行处理后,CCK-8法测定细胞增殖,分析不同的阿维A浓度及作用时间对SCL-1细胞的影响。选取合适的ALA-PDT参数及阿维A浓度对SCL-1联合处理,流式细胞仪检测细胞凋亡率。
  结果:
  ⑴在孵育时间固定在2h,ALA浓度范围为1.56×10-2~5×10-1mg/ml时,ALA-PDT处理后SCL-1活细胞数量随着浓度的增加而降低,当ALA浓度达2.5×10-1mg/ml时SCL-1活细胞数量降低不明显。⑵在ALA浓度为6.25×10-2mg/ml,孵育30~180min,ALA-PDT处理后SCL-1活细胞数量随着孵育时间的增加而降低,当孵育时间达150min时SCL-1活细胞数量降低不明显。⑶光照时间固定为16min,光照功率密度为20~80mw/cm2,随着功率密度增大 ALA-PDT处理后SCL-1活细胞数量降低,当功率密度达60mw/cm2趋于稳定。⑷功率密度固定为20mw/cm2,光照2~32min,ALA-PDT处理后SCL-1活细胞数量随着光照时间的延长而降低。⑸阿维A浓度为1.6×10-4~1.6×10-1mg/ml,作用时间1~3d时,作用相同时间时阿维A浓度越高,SCL-1活细胞数量越低;而在相同浓度作用时,作用时间越长SCL-1活细胞数量增长越小。⑹ALA-PDT联合阿维A作用SCL-1细胞的凋亡率高于ALA-PDT和阿维A单独作用的凋亡率。
  结论:
  ①合适参数的ALA-PDT处理对SCL-1细胞具有杀伤作用,其杀伤作用与ALA浓度、孵育时间、光照剂量有关。②阿维A对SCL-1细胞增殖的抑制作用在阿维A浓度为1.6×10-4~1.6×10-1mg/ml,作用1~3d时,与药物浓度和作用时间成正比。③ALA-PDT联合阿维A能提高SCL-1细胞对阿维A的敏感性,增强诱导SCL-1细胞凋亡的作用。
[硕士论文] 王柯英
环境工程 广东工业大学 2017(学位年度)
摘要:环隣酸胺(Cyclophosphamide,CP)作为常用的氣芥类抗肿瘤药物,在抑制肿偷细胞免疫应答的同时,对心脏、骨髄、肾脏、肝脏、神经系统、粘膜上皮和生殖系统等均有很强的毐副作用,严蜇影响化疗的正常进行。因此,寻找对环磷酰胺具有增效减毒作用的药物与其联合使用,提高环磷酰胺的药用价值成为当务之急。IL-33(Interleukin-33)是近年来发现的一种具有多种生物学功能活性的细胞因子,在炎症、感染等多种疾病中发挥重要的调节作用。本课题拟建立黑色素瘤小鼠模型,探讨IL-33和CP联合后的抗肿瘤作用,并探讨其相关的免疫学机制。
  建立C57BL/6小鼠黑色素瘤模型。将小鼠随机分为PBS对照组、CP组、IL-33组、CP+IL-33联合组。观察抑瘤率,肿瘤块的生长和存活率;测定脾脏指数、胸腺指数;检测CD8+T细胞和NK细胞中穿孔素、颗粒酶的表达;收集肿瘤石蜡包埋固定,组织病理学检测肿瘤异型性;流式细胞术、免疫荧光和PCR检测IL-33联合CP后的抗肿瘤效果增强的机制。结果如下:
  (1)IL-33联合CP后对荷瘤鼠肿瘤的抑制作用
  荷瘤鼠经IL-33和CP联合治疗后,和其他组相比,抑瘤率增加,肿瘤生长曲线缓慢,小鼠存活时间延长;组织病理学检查发现,IL-33联合CP治疗后,肿瘤组织中肿瘤细胞坏死,肿痛相关基因TNF-α、IFN-γ、Perforin、Granzyme B和凋亡基因Caspase3的表达增加,有效抑制肿瘤生长,同时肿瘤组织中CD8+T细胞和NK细胞中的颗粒酶数量增加,有效抑制肿瘤生长。
  (2)IL-33联合CP后对荷瘤鼠免疫功能的影响
  流式细胞检测发现IL-33联合CP治疗后:荷瘤鼠脏器指数和CP组相比增加;NK细胞杀伤活性增强:脾脏中CD8+T细胞和NK细胞中Perforin和Granzyme B的比例上升;CD8+T细胞和CD4+T细胞中IFN-γ比例增加。IL-33+CP组荷瘤鼠脾脏中T淋巴细胞过继到未经药物处理的荷瘤鼠体内后,抑瘤率增加,存活时间延长。
[博士论文] 胡小慧
细胞生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:环磷腺苷应答元件结合蛋白CREB是真核细胞重要的转录因子,是最早被发现通过磷酸化水平来调节其转录活性的调节蛋白。CREB通过与环磷腺苷应答元件CRE结合来启动下游基因的表达。CRE是一段保守的回文结构序列TGACGTCA,在cAMP的刺激下能够启动下游基因的表达。CREB家族包括CREB、CREM和ATF-1,CREB家族各成员都有相类似的分子结构,在激酶诱导结构域KID区有各自关键的磷酸化位点,其中CREB的关键磷酸化位点是丝氨酸133(S133)。CREB的磷酸化水平主要受cAMP信号通路、MAPK信号通路、Ras/Erk/RSK2信号通路、PLC~PKC信号通路、PI3激酶/Akt信号通路和Ca2+-CaMK-CREB等信号通路的调节。
  在本论文中,本人研究了CREB-S133的磷酸化/去磷酸化以及与致癌性的关系。研究发现在模拟小鼠皮肤癌上皮细胞JB6细胞系中,在TPA的刺激下,PKC通过激活PKA信号通路,MAPK激酶信号通路的ERK1/2和p38两个途径来磷酸化CREB-S133位点。其中,PKC,PKA,ERK1/2是磷酸化CREB-S133位点的主要蛋白激酶。p38也参与到CREB-S133的磷酸化,但不是直接作用的蛋白激酶。实验还发现,蛋白激酶JNKs和AKT没有直接参与对CREB-S133位点的磷酸化。
  通过体外抑制剂处理,直接去磷酸化分析,细胞内敲除特异PP1或PP2A催化亚基和利用Tet-On系统表达PP1或PP2A特异亚基等方法,本论文首次证明PP-1β和PP-2Acα直接参与对CREB-S133位点的去磷酸亿。在此基础上利用JB6细胞建立表达野生型和突变体CREB的稳定细胞系,比较生长分析表明模拟持续去磷酸化突变体S133A-CREB转化的细胞生长最快,而模拟持续磷酸化的S133D-CREB转化的细胞则生长较慢。应激因子冈田酸处理和其后的Hoechst染色分析表明S133D-CREB转化的细胞凋亡水平最高,而S133A-CREB转化的细胞凋亡水平相对较低。通过蛋白质印迹法分析表明,S133D-CREB转化的细胞对肿瘤因子p53表达显著上调,而对抗凋亡因子Mcl-1的表达则显出下调的功能。软琼脂集落形成实验表明S133A-CREB转化的细胞形成的转化细胞群无论在数目上还是在大小方面都是最为突出的。相反,S133D-CREB转化的细胞则明显下降。此外,抑制蛋白激酶的活性增强JB6细胞转化能力。反之,抑制蛋白磷酸酶活性则弱化JB6细胞的转化能力。这些结果首次阐明CREB磷酸化状态与其细胞转化能力之间的关系。
  通过进一步裸鼠成瘤实验分析,本论文证明去磷酸化的CREB显著增强JB6细胞的致瘤性。综上所述,本论文首次阐明了在JB6细胞中对CREB特异性去磷酸化的蛋白磷酸酶,首次证明了CREB去磷酸化状态与其致瘤性有密切关系。这些结果为皮肤癌的发生机制带来新的信息,为皮肤癌的诊断带来新的切入点。
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