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[硕士论文] 支媛婷
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤疾病。银屑病患者皮疹一般全身泛发且通常伴随有瘙痒症状,对患病个体的生活质量可造成不小的影响。银屑病可分为多种类型,最常见的是斑块型银屑病,这种类型银屑病典型的皮肤损害表现为境界清楚的红色斑块,表面覆盖较厚的白色鳞屑。银屑病皮肤损害的病理学表现包括表皮棘层不规则增厚、真皮浅层血管扩张充血和炎症性细胞的浸润等。银屑病很多的治疗方案疗效不尽人意。
  G蛋白耦联受体(G-protein coupled receptors,GPCRs)超家族是目前最大的与信号转导相关的细胞表面分子家族。趋化因子受体是控制白细胞运输的一种G蛋白耦联受体,正如大多数G蛋白耦联受体一样,趋化因子是一种很好的潜在药物靶点。已有研究发现大量的趋化因子和趋化因子受体在银屑病皮损区的表达较无皮损区皮肤明显增多,但是G蛋白耦联受体是否在银屑病发病过程中发挥重要作用还不清楚。
  本研究利用基因芯片检测技术和实时定量PCR的方法找出3例斑块型银屑病患者受累皮肤组织和非受累皮肤组织中与G蛋白耦联受体相关的大于2倍差异基因。其中,实时定量PCR用于验证基因芯片的检测结果。
  我们的研究目的是从基因水平上探讨G蛋白耦联受体在银屑病发病机制中的作用以及讨论未来通过抑制G蛋白耦联受体的方法治疗银屑病的可能性,为后期寻找银屑病的新的治疗靶点提供依据。
[博士论文] 代涛
整形外科 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:背景:巨大黑色素痣(简称巨痣)分布面积巨大可累全身各个部位,其病因及发病机制尚不清楚。巨痣严重影响患者外貌,恶变风险为5%-10%。因此,完全去除儿童巨痣对降低恶变率和改善外貌具有重要意义。手术治疗是目前治疗巨痣的主要方法。但是尚未有大家普遍认同的一种治疗巨痣的手术方法。本文针对巨痣的皮损面积大小、深度、不同部位等因素,采取个体化治疗方案。
  目的:通过对儿童巨大黑色素痣(简称巨痣)不同手术方式的治疗,探讨巨痣切(削)除后继发创面的最佳修复方案。
  方法:分析2006年5月至2016年4月收治的6个月-12岁巨大黑色素痣1118例患儿,其中男性568例,女性550例,根据不同面积及部位选择巨痣切除+刃厚皮片移植术、巨痣切除+中厚皮片移植术、巨痣切除+全厚皮片游离移植术、巨痣切除+真皮下血管网移植术、巨痣切除+微粒皮植皮术、巨痣切除+Meek植皮术、分次切除术、分次切除巨痣+皮肤牵张闭合器应用、胸科钢丝内固定联合中厚皮片移植术、巨痣切除+自体表皮细胞修复术、巨痣削除+ReCell细胞再生技术的应用、巨痣切除+皮肤扩张术、巨痣切除+脱细胞真皮支架+刃厚皮片移植、巨痣削除+组织工程皮肤等14种手术方法治疗儿童巨大黑色素痣,所有患儿均进行术前术后病理检查。
  术后6个月通过门诊复诊、电话、微信对儿童巨痣患者的治疗效果、复发情况、满意度及并发症进行随访,留随访影像资料。术后6个月自然光下,距患儿50cm处目测,将评定疗效及美容效果分为4级标准:优良:色素完全祛除,受区创口边缘正常皮肤无复发色素痣,呈线状瘢痕或扁平瘢痕,皮肤外观接近正常,无瘢痕挛缩,关节活动无异常,供区轻度色沉或接近正常皮肤。良好:色素完全祛除,受区凹陷或瘢痕增生,正常皮肤边缘无复发色素痣,关节功能轻度受限或呈蹼状瘢痕增生,有瘢痕不适症状,供区仅有色素沉着,无瘢痕增生。较好:色素完全祛除,受区瘢痕增生明显,皮肤创口边缘无新发色素痣,瘢痕增生肥厚,关节部位功能受限,边缘皮肤受到牵拉,有瘢痕不适症状,供区轻度瘢痕增生。一般:色素痣祛除或受区有色素痣复发,瘢痕增生,瘢痕上可有色素痣复发,色沉较重,局部功能障碍,组织牵拉移位。
  结果:1118例患者均一期愈合出院。其中优良438例,良好367例,较好219例,一般94例。术前术后病检皮内痣482例,交界痣128例,混合痣508例。采用巨痣切除+刃厚皮片游离移植术101例,巨痣切除+中厚皮片游离移植术111例,巨痣切除+全厚皮片游离移植术118例,巨痣切除+真皮下血管游离移植术118例,巨痣切除+Meek植皮术54例,巨痣切除+微粒皮植皮术59例,分次巨痣切除术139例,分次切除巨痣+皮肤牵张闭合器应用84例,胸科钢丝内固定联合皮片移植术58例,巨痣切除+自体表皮细胞修复术36例,巨痣削除+ReCell细胞再生技术的应用57例,巨痣切除+皮肤扩张术129例,巨痣切除+脱细胞真皮支架+刃厚皮片移植26例,巨痣削除+组织工程皮28例。每次巨痣切(削)继发创面与供区创面之和不超过体表面积的15%。术后随访6~24个月10例患者复发,术后瘢痕明显的患者经点阵激光每月一次抗瘢痕治疗,67例患者瘢痕已经变软、变平,与正常皮肤基本平齐,其余16例患者仍继续抗瘢痕治疗中。所有患儿创面愈合后的外观、功能、复发、色素脱失、色素沉着、恶变、有无瘢痕增生、残余创面的疗效评定均较满意。
  结论:1.对于颜面部、关节功能部位巨痣,根据情况选择全厚皮片移植术、真皮下血管游离移植术或皮肤软组织扩张器。
  2.对于皮损位于隐蔽部位、美容要求不高的躯干部位巨痣,采用Meek微型皮片移植、微粒皮、胸科钢丝内固定联合中厚皮片移植术修复巨痣切除后继发创面,可有效节省自身皮源,缩短创面愈合时间,减少手术次数,花费低,但术后植皮区有少量、不均匀的疤痕存在。
  3.自体表皮细胞培养、ReCell细胞再生技术、脱细胞真皮支架+刃厚皮片移植、组织工程皮、皮肤牵张闭合器修复巨痣切除后继发创面,为临床治疗巨痣切除后创面提供了新的方法和思路。
[博士论文] 尚智伟
皮肤病与性病学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:本课题目的在于筛选出白癜风患者血清中差异miRNAs的表达谱,利用生物信息学分析预测差异miRNAs的功能分布,然后通过建立体外细胞模型研究差异表达的miRNAs(miRNA-202-3p)对黑素细胞生物学功能的影响,并探究其在发挥作用的分子机理。本研究试图探求miRNAs在白癜风发病中的作用,进一步在基因层面深入对白癜风发病机制的了解,为该病的早期诊断提供新的可能的分子标志物,同时也为治疗白癜风的新药开发提供可能的分子靶点。本课题包括以下三部分:
  第一部分:白癜风患者外周血miRNAs的表达及靶基因预测和功能分析
  方法:
  1.使用miRNeasy Mini Kit提取白癜风患者血清中的miRNA,然后利用NanoDrop ND-2000定量总RNA,并经Agilent Bioanalyzer2100检测RNA完整性。
  2.通过高通量测序和芯片杂交技术检测白癜风患者血清中的miRNAs,然后使用Feature Extraction软件处理原始图像提取原始数据,接着利用Genespring软件进行quantile标准化和后续处理,利用T检验的P值和倍数变化值进行差异miRNAs筛选。
  3.分别用TargetScan,PITA,microRNAorg数据库对差异miRNA进行靶基因预测,取共同的miRNAs进行后续的非监督层次聚类分析、GO富集分析和KEGG通路分析。
  4.使用Cytoscap软件绘制差异表达miRNAs靶基因调控网络图。
  5.使用qRT-PCR法验证白癜风皮损组织和正常皮肤组织中差异miRNAs的表达。
  6.Fontana-Masson银染法检测白癜风皮损组织和正常皮肤组织中黑素合成情况。
  7.免疫组化法检测Hippo信号通路中关键分子YAP1在白癜风皮损组织组中的表达。
  结果:
  1.所有样品的2100RIN值≥7.0,并且28s/18s≥0.7,结果表明实验所提取的样品合格,完整性好,没有发生降解。
  2.与对照相比,白癜风患者血清差异表达miRNAs共34个,其中显著上调表达有2个,显著下调有32个。
  3.差异miRNAs中,共有863个靶基因共同存在TargetScan,PITA,microRNAorg数据库中,差异表达miRNAs的生物功能主要集中于轴突导向、细胞黏附和细胞连接等相关的信号通路中,其中miRNA-202-3p上调最为显著并参与了Hippo信号通路。
  4.miRNA调控靶基因互作网络图显示hsa-miR-202-3p和hsa-miR-630调控共同靶基因数量最多包括YAP1,CCNJ,GNG2,CPEB4,TFAP2B,B4GALT4和FBXO30。
  5.与对照组相比,白癜风皮损组织中miRNA-202-3p表达显著上调,与高通量测序结果一致。
  6.Fontana-Masson银染法检测白癜风皮损组织和正常皮肤组织中黑素合成情况,结果显示白癜风皮损组织的表皮黑色素完全脱失。
  7.在正常皮肤组织中,YAP1呈现高表达,而在白癜风皮损组织中,YAP1呈现弱表达,两组相比有显著性差异。
  第二部分:过表达或沉默miR-202-3p对黑素细胞生物学功能的影响
  方法:
  1.miRNA-202-3p过表达慢病毒载体构建:将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro载体和以HEK293细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增的miRNA-202-3p用EcoR1和NotⅠ进行双酶切,连接miRNA-202和过表达载体,构建miRNA-202-3p过表达慢病毒载体质粒Lenti-miR-202-3p,并进行转化和菌落PCR鉴定,送上海生工生物工程有限公司进行基因测序。
  2.miRNA-202-3p干扰慢病毒载体构建:设计和合成miR-202-3p干扰序列,将退火片段连接入pLenti-hU6-GFP-Puro慢病毒载体中,构建miRNA-202-3p干扰慢病毒载体质粒pLenti-si-miRNA-202-3p重组质粒,并进行转化和菌落PCR鉴定,送上海生工生物工程有限公司进行基因测序。
  3.慢病毒颗粒包装:将慢病毒表达载体质粒、pCMV-△8.2和pCMV-VSV-G质粒共转染至293T细胞中,48h后进行荧光观察,72h后收获携带目的基因的病毒,然后使用高速离心法纯化和浓缩慢病毒颗粒。
  4.目的慢病毒颗粒对人黑素细胞PIG1细胞感染效率的检测:通过荧光显微镜观察慢病毒感染PIG1细胞48h后GFP表达和qRT-PCR法检测细胞中miRNA-202-3p的表达。
  5.MTT法和流式细胞术分别检测miR-202-3p对人黑素细胞株PIG1细胞增殖和凋亡的影响。
  6.多巴氧化反应法和氢氧化钠裂解法分别检测人黑素细胞株PIG1细胞酪氨酸酶活性和细胞内黑素含量。
  7.使用纤维连接蛋白包被的培养板测定黑素细胞黏附率变化情况。
  结果:
  1.pLenti-miRNA-202-3p和pLenti-si-miRNA-202-3p慢病毒表达载体菌落PCR和基因测序结果显示,其分子大小及序列与NCBI中的参考序列一致,结果表明miRNA-202-3p过表达和干扰慢病毒载体质粒pLenti-miRNA-202-3p和pLenti-si-miRNA-202-3p构建成功。
  2.荧光观察发现,慢病毒载体质粒、pCMV-△8.2和pCMV-VSV-G质粒共转染至293T细胞的效率达到90%以上,可用于下一步实验。
  3.观察和测定PIG1细胞的感染效率,结果发现慢病毒感染目的细胞的效率达90%以上,qRT-PCR检测结果显示,pLent-miR-202-3p细胞中miR-202-3p表达显著增加,而pLent-si-miR-202-3p细胞中miR-202-3p表达显著减少,可以进行后续的实验。
  4.MTT实验结果显示与对照组相比,miR-202-3p过表达显著抑制黑素细胞的生长,而降低miR-202-3p表达对人黑素细胞的增殖能力无显著影响,流式细胞术检测结果发现与对照组相比,miR-202-3p表达上调后细胞早期凋亡比例明显上升,而miR-202-3p表达下调对细胞凋亡无明显影响。
  5.过表达miR-202-3p能够显著抑制细胞内酪氨酸酶活性和黑素合成,miR-202-3p表达下调显著增加细胞内酪氨酸酶的活性和黑素的合成。
  6.miR-202-3p表达上调显著抑制了黑素细胞黏附作用,而miR-202-3p表达下调对黑素细胞与纤维连接蛋白的黏附作用无明显影响。
  第三部分:miR-202-3p对黑素细胞生物学影响的分子机制研究
  方法:
  1.使用在线软件预测miR-202-3p的靶基因为YAP1,双荧光素酶报告实验验证YAP1是否是miR-202-3p的靶基因。
  2.qRT-PCR检测miR-202-3p对黑素细胞PIG1中YAP1,P73,PUMA mRNA水平表达的影响。
  3.Western blot检测miR-202-3p对黑素细胞PIG1中YAP1,P73,PUMA蛋白表达的影响。
  结果:
  1.双荧光素酶报告实验结果表明miR-202-3p直接靶向负调控YAP1基因的表达。
  2.在miR-202-3p过表达的PIG1细胞中YAP1和p73基因的表达显著减少,PUMA表达显著增加。而miR-202-3p表达下调的细胞中,YAP1和p73基因的表达显著增加,PUMA表达显著减少。
  3.PIG1细胞中miR-202-3p表达上调后,YAP1和p73蛋白表达明显下调,而PUMA蛋白表达显著增加;PIG1细胞中miR-202-3p表达下调后,YAP1和p73蛋白表达明显增加,而PUMA蛋白表达显著减少。
  结论:
  1.白癜风外周血清中有差异表达的miRNAs,包含2个显著上调表达miRNAs,32个显著下调miRNAs。差异表达miRNAs的生物功能主要集中于轴突导向、细胞黏附和细胞连接等相关信号通路中。差异表达最显著的miRNA-202-3p可能在白癜风的发生和发展中发挥重要作用。
  2.过表达miR-202-3p可显著抑制人黑素细胞的增殖和细胞黏附作用,抑制黑素合成,促进细胞凋亡。沉默miR-202-3p可促进黑素合成,但对细胞增殖、黏附和细胞凋亡作用无明显影响。
  3.YAP1是miR-202-3p直接靶向基因,miR-202-3p可能通过靶向调控YAP1的表达,影响细胞中增殖和凋亡相关蛋白p73和PUMA的表达,进而影响了正常人黑素细胞的生物学功能。
[博士论文] 胡永青
皮肤病与性病学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 竹红乙素介导的LED光动力对瘢痕疙瘩成纤维细胞活性和凋亡的影响
  目的:
  研究竹红乙素和LED对瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞毒性,探索两者作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞的合适剂量。研究HB-LED光动力对瘢痕疙瘩成纤维细胞活性和凋亡的影响。
  方法:
  1.以皮肤科门诊切除的瘢痕组织,通过组织块法培养得到原代瘢痕组织成纤维细胞。实验分为阴性对照组(negative controll,NC)、HB组、LED组、HB+LED组。阴性对照组只加DMEM培养液,HB组加入竹红乙素,LED组接受LED黄光照射,HB+LED组加入竹红乙素后接受LED黄光的照射。
  2.将瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于96孔板,加药后3h,将LED组、HB+LED组拿至孵育箱外,以LED治疗仪黄光照射各组细胞,不照光的各组如HB组、阴性对照组也以锡箔纸包裹,拿至孵育箱外放置同样的时间。用改良MTT法检测各组细胞的活力。
  3.将瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于6孔板,加入竹红乙素后,将LED组、HB+LED组拿至孵育箱外,以LED治疗仪黄光照射各组细胞、不照光的各组如HB组、阴性对照组也以锡箔纸包裹,拿至孵育箱外放置同样的时间。以不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶分别消化收集各组细胞,PBS洗涤,AnnexinV-FITC避光、室温孵育细胞15min。每管加PI5μL,5min后以流式细胞仪进行检测。以BD FACSDiva7.0软件分析结果。
  结果:
  1.1.以竹红乙素介导的LED光动力处理瘢痕疙瘩成纤维细胞时,3J/cm2是LED黄光的一个合适剂量。
  1.2.在联合3J/cm2的LED黄光的情况下,竹红乙素的半数致死量(IC50)是3.3252×10-7 mol/L。
  2.与阴性对照组(NC)相比,细胞接受处理12h后,在HB+LED组,瘢痕疙瘩成纤维细胞的活性下降50.23%(P<0.001)。单独的HB(1×10-7 mol/L)和单独的LED(3J/cm2)也能导致细胞活性的下降,分别是25.77%(P<0.001),16.57%(P<0.001)。
  3.1.瘢痕疙瘩成纤维细胞被处理后6小时,发生明显的凋亡,以晚期凋亡为主,但是也有明显的早期凋亡。HB-LED组最为明显,瘢痕疙瘩成纤维细胞总凋亡率达到57.3%(P<0.001)。单独HB引致总凋亡率达25.77%.单独LED也能引起凋亡,但作用较弱,与NC相比,P=0.042,<0.05.
  3.2. 在对瘢痕疙瘩成纤维细胞的光动力作用中,竹红乙素和LED之间有协同作用,不只是简单的叠加效应。
  结论:
  1.竹红乙素介导的LED光动力能够有效的降低体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的活性。
  2.竹红乙素介导的LED光动力能够有效诱导体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡。竹红乙素和LED之间有较好的协同作用。
  第二部分 竹红乙素介导的LED光动力对人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡信号通路的影响
  目的:
  研究竹红乙素介导的LED光动力对瘢痕疙瘩成纤维细胞中凋亡相关基因BAX和BCL-2 mRNA、蛋白质水平的影响,以及对细胞中的钙离子水平、caspase-3活性的影响。探讨HB-LED光动力诱发人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的可能信号途径。
  方法:
  1.实时定量PCR检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中凋亡相关基因BAX和BCL-2mRNA水平的变化
  1.1.用Trizol法提取总RNA,将RNA反转录为模板。
  1.2.扩增时,先95℃预变性8 min,然后45个循环,每个循环:95℃×15s,59℃×20s,72℃×30s。
  1.3.用△△Ct法分析结果。
  2.流式胞内染色法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中凋亡相关蛋白BAX和BCL-2水平的变化
  2.1.收集细胞,分组放入流式管内,离心,弃上清,PBS洗2次。
  2.2.加BioLegend固定液,室温避光孵育15min。离心,弃上清。
  2.3.加BioLegend破膜液重悬,离心,弃上清。
  2.4.然后细胞重悬于相应的破膜液中,加荧光标记的抗BAX抗体,抗BCL-2抗体,孵育45min。以FITC标记IgG1和PE标识IgG1做同型对照。
  2.5.以破膜液洗涤细胞2次。最后每管细胞用500μL破膜液重悬,上机检测。
  2.6.用FlowJo10.0.7软件分析目的蛋白质的量。
  3.竹红乙素介导的LED光动力对凋亡早期的瘢痕疙瘩成纤维细胞内钙离子水平的影响
  3.1.处理细胞后,吸除培养液,加入Fluo-3 AM,37℃孵育30min,PBS洗涤2次。
  3.2.将生长有细胞的盖玻片置于共聚焦显微镜上,选择激发波长为488nm,发射波长为530nm,扫描获取图像。钙离子水平用平均荧光强度(mean fluorescenceintensity,MFI)表示,平均荧光强度通过共聚焦显微镜自带的软件(ImagingSoftware for Microscopy)分析获得。
  4.caspase-3活性的测定
  4.1.收集处理过的细胞,PBS洗涤,弃上清,加入裂解缓冲液。
  4.2.将上清按组别小心加入96孔板,每孔再加入乙酰天冬氨缬氨酸对硝基苯胺(Ac-DEVD-pNA),37℃孵育2小时。用酶标仪在405 nm波长处检测样品的吸光度。
  结果:
  1.与阴性对照组相比,HB-LED组,HB组, LED组的BAX mRNA分别增加了72.67%,23.33%,6.61%(P=0.006,<0.05);相反,对比阴性对照组,在以上3组中BCL-2 mRNA的表达则分别下降了48.57%,26.77%和6.73%(P<0.001)。
  2.与阴性对照组相比,HB+LED组的BAX蛋白升高了3倍,而BCL-2蛋白则下降至阴性对照组的17.50%,BAX/BCL-2的比率由阴性对照组的0.1766升高至3.0238。HB组,LED也有相似的变化。
  3.HB+LED组显著增加了瘢痕疙瘩成纤维细胞内的游离钙水平,与阴性对照组相比,升高了2.77倍。
  4.竹红乙素介导的LED光动力可显著增加瘢痕疙瘩成纤维细胞中caspase-3的活性,HB+LED组的caspase-3活性是阴性对照组的5.37倍(P<0.001)。单独的HB和单独的LED也可增加caspase-3活性,分别是阴性对照组的2.37倍和1.15倍(P<0.001,P<0.001)。
  结论:
  竹红乙素联合LED光动力能明显上调瘢痕疙瘩成纤维细胞内BAXmRNA表达,而下调BCL-2 mRNA的表达,在蛋白水平也是如此。此种光动力也上调细胞内游离钙水平和caspase-3活性。线粒体凋亡路径很可能参与了竹红乙素联合LED光动力导致的细胞凋亡。
[硕士论文] 卡力木
皮肤病与性病学 中国医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:黄褐斑是一种临床常见的慢性色素代谢异常的损容性皮肤病,有色人种中的中青年女性多见,以颜面部对称性分布,大小不一、形态不定、无自觉症状的淡褐色斑片为临床特征。本病发病机制复杂且尚无理想治疗方法。氨甲环酸能够抑制黑色素形成,常被用于治疗色素增多性疾病,也是黄褐斑的临床指导用药,一般采用口服和静脉的全身性给药的方式,但药物的有效率较低,副作用也较为明显。本实验采用巴布贴的方式局部透皮给药,观察局部给药是否能增强药物的有效率、减少甚至避免药物副作用的发生,从而为临床治疗黄褐斑寻求更有效的方法。
  方法:将21名明确诊断为黄褐斑的女性受试者随机分成两组,实验组11人,使用含有氨甲环酸的巴布贴治疗黄褐斑,对照组10人,使用不含有氨甲环酸且其余成分与实验组一致的巴布贴治疗。嘱受试者每两天一片巴布贴过夜,治疗期为3个月。在实验开始前、实验开始后每两个星期及治疗结束后一个月时对受试者色斑改善情况进行检测和评估,采用数码照相机标准化照相、Visia图像分析、MCI值检测、MASI分值评估、志愿者问卷调查来比较治疗前后效果的改善。使用SPSS21.0进行数据统计分析处理。
  结果:共有18名受试者完成了治疗,其中实验组10人,对照组8人。经过3个月的治疗后,两组受试者的色斑情况均有所改善,其中实验组MASI的改善率为40.26%,对照组MASI的改善率为13.82%,实验组的色斑改善更为显著,两组的差异有统计学意义(p<0.05)。治疗后两组的MCI值都有所下降,其中实验组MCI值下降的更为明显。实验组MCI的改善率为14.49%,对照组MCI的改善率为6.94%。两组治疗前后的差异有统计学意义(p<0.05)。治疗结束后一个月,两组患者的黄褐斑均有复发趋势,但较治疗前相比,色斑情况仍有一定的改善。
  实验组中1名患者在治疗期间出现了胃肠不适的症状,未见其他副作用出现。
  结论:氨甲环酸巴布贴面膜治疗黄褐斑安全有效,治疗过程无创耐受且无副作用(p<0.05)。
[硕士论文] 杨俊峰
外科学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  原发性多汗症是一种身体汗液分泌过度超出机体正常需要量为特征的疾病,一般不存在器质性病因,出汗部位以手掌、足底、颅面部和腋窝多见。根据机体出汗增多部位可分为原发性手汗症、原发性头汗症、原发性腋汗症等。目前已有部分文献报告了原发性手汗症相关流行病学资料,在我国全国范围内已经进行了一项针对青少年原发性手汗症的流行病学调查。本次调查研究的目的旨在针对扬州地区青少年进行相关调查研究,以了解扬州地区青少年人群中原发性手汗症的患病率及相关因素。
  方法:
  1.调查研究前,确定调查对象,设计调查问卷,对所有参与调查的人员进行专门培训,明确相关手汗症诊断标准及注意事项。
  2.正式调查前,在小范围内抽取样本进行预调查,验证调查方法、调查问卷的可行性和可信度。
  3.采用随机抽样,以班级为单位随机抽取扬州地区大中学校各两所部分班级全部学生进行现场问卷调查。并且向每个学生交代调查目的、意义、及问卷填写方式,取得其知情同意。调查人员将问卷分发给在校学生,现场指导其填写问卷,填写完整后问卷由调查人员统一收回。录入调查数据,根据诊断标准筛选出其中可疑手汗症患者,再由专门人员对疑似患者进行问诊,以排除其他疾病继发手掌出汗增多,并作出诊断和严重程度分级。
  4.结合问卷调查资料及诊断,汇总调查资料,对其进行统计整理,分析原发性手汗症患病率及相关因素,得出实验结论。
  结果:
  本次调查研究共随机抽取扬州地区青少年3504例,其中男性1577例,女性1927例,根据诊断标准筛选出手汗症患者共107例,原发性手汗症的患病率为3.05%。男性患病率为3.87%(61例/1577例),女性患病率为2.39%(46例/1927例),男性患病率高于女性。初中生905例,患病率3.00%;高中生785例,患病率2.97%;大学生1927例,患病率3.12%,各就学阶段手汗症患病率差异无统计学意义。首次发病年龄主要集中于10-20岁(73.56%)。男性手汗症患病率高于女性,但严重手汗症患者中女性数量多于男性。原发性手汗症患者常常伴随足底、腋窝等部位出汗增多,且女性更容易存在除手掌以外身体其他部位多汗。36.45%的患者有家族史,病变严重者其家族遗传倾向更加明显。
  结论:
  扬州地区青少年手汗症患病率为3.05%,男性患病率高于女性,患者常于青少年时期发病,存在一定程度的性别差异,常合并身体其他部位多汗症状,且具有较为明显的遗传倾向。
[硕士论文] 卞晓锐
病原生物学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:淋病是全球发病率最高的性传播疾病之一,淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae,Ng)是淋病的病原体。淋病奈瑟菌感染可导致不孕不育,还可促进人类免疫缺陷病毒(HIV)的传播。随着抗生素使用种类的更新,淋病奈瑟菌耐药性范围也不断扩增,给淋病治疗带来极大难度。为此亟需全面了解淋病奈瑟菌的生物学特性,以利于从根本上控制淋病。
  近年发现约90%古细菌和40%真细菌基因组中存在CRISPR系统,由CRISPR簇、前导序列(Leader)以及一系列CRISPR相关蛋白(Cas)基因构成,为细菌防御噬菌体和外源基因的侵袭发挥重要作用,是细菌的获得性免疫系统。课题组前期分析淋病奈瑟菌WHO-A株基因组信息发现6个CRISPR簇和2个分别属于CT1133家族和TM1801家族的Cas基因(下文分别称CT和TM),本研究检测了淋病奈瑟菌WHO-A株Cas基因的表达,并对其功能进行了初步探究。研究内容分为以下四个部分:
  一、淋病奈瑟菌Cas基因的类型分析与原核表达载体构建
  目前至少报道了45个Cas基因家族,为了分析淋病奈瑟菌WHO-A株Cas基因的类型,对WHO-A株的两个Cas基因进行BLAST分析,与已公布的相关基因进行同源性比较。为研究淋病奈瑟菌中CRISPR系统中Cas蛋白的结构和功能,根据前期WHO-A株基因组序列测定结果确定其Cas基因的具体位置并设计引物。为将CT或TM基因均分别插入pCold-TF和pGEX-6p-1中,上下游引物两端分别添加有PstⅠ和KpnⅠ以及BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。提取淋病奈瑟菌WHO-A株总DNA为模板,PCR扩增Cas基因。扩增产物和载体使用相同双酶切处理,酶切产物分别纯化回收后用T4连接酶连接,构建Cas基因原核表达载体。
  二、重组Cas蛋白的原核表达和多克隆抗体制备
  将原核表达载体pCold-CT(TM)和pGEX-CT(TM)分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3),得到的重组菌用IPTG作可溶性表达的小量诱导,经SDS-PAGE检测到分子量与预期大小一致的表达产物后,用同样方法进行大量诱导,取pCold-CT(TM)-BL21和pGEX-CT(TM)-BL21的上清分别通过镍亲和层析柱和谷胱甘肽树脂柱,纯化产物CT(TM)-His和CT(TM)-GST用SDS-PAGE作分子量分析,并用BCA试剂盒检测目的蛋白的含量。用纯化的CT(TM)-His融合蛋白免疫BALB/c小鼠,4w后收集血清,以CT(TM)-GST融合蛋白为抗原检测免疫血清中特异性抗体的效价。结果表明,获得了符合预期大小的CT和TM重组蛋白,间接ELISA检测表明小鼠免疫血清中的CT和TM抗体的效价分别为1∶25600和1∶12800。制备的特异性抗体为检测淋病奈瑟菌WHO-A株细胞内相应Cas蛋白的表达和研究蛋白功能提供了实验材料。
  三、淋病奈瑟菌WHO-A株Cas基因的表达分析
  为检测淋病奈瑟菌WHO-A株中Cas基因的转录和表达情况,我们用RT-PCR法、ELISA法和免疫荧光法3种方法分别检测了细菌细胞内的Cas-mRNA和Cas蛋白。
  (1)提取该菌总RNA为模板,通过RT-PCR法转录获得cDNA,用Cas基因引物对cDNA进行PCR扩增,产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析;
  (2)对WHO-A株细菌作超声裂解处理,取裂解液为抗原,以制备的Cas抗体为第一抗体,棋盘滴定法检测裂解菌液中Cas蛋白的存在情况;
  (3)将WHO-A株细胞用4%多聚甲醛固定于载玻片上,以CT(TM)血清抗体作为一抗,以FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行免疫荧光实验,荧光显微镜下检测样品的发光情况。结果表明,从WHO-A株总RNA中用RT-PCR可扩增出与CT或TM基因大小一致的DNA条带;WHO-A株细菌超声裂解液包被量为200μg/ml时,以1∶12800的CT多抗和1∶800的TM多抗可以检测到相应Cas蛋白表达的明显信号;WHO-A株细菌细胞固定后用CT或TM抗体可检测到特异性荧光。以上结果提示Cas基因在淋病奈瑟菌WHO-A株细胞中可进行有效转录与表达,淋病奈瑟菌的CRISPR系统可能是一个具有活性的完整系统,为此需进一步研究Cas蛋白的结构与功能。
  四、淋病奈瑟菌WHO-A株Cas蛋白功能的初步研究
  实验室前期已构建pCas9-KRn重组载体,即一种靶向卡那霉素抗性基因的CRISPR简化系统,可作为Cas蛋白核酸酶活性的研究工具。为探究CT或TM蛋白是否发挥核酸酶活性,将pCas9-KRn中的Cas9基因替换为CT或TM基因。以pCas9-KRn中Cas9以外的部分为模板设计引物并进行PCR扩增,扩增产物两端分别添加了PstⅠ、KpnⅠ酶切位点,双酶切并纯化后与相同酶切处理的CT或TM基因连接,获得重组质粒pCT(TM)-KRn,转化宿主大肠埃希菌后分别用RT-PCR和ELISA两种方法检测到WHO-Cas基因的表达。pCT(TM)-KRn转化至含pET-30a的DH5α大肠埃希菌,用LB培养液对重组菌进行传代。每代菌液分别在卡那霉素和氯霉素LB平板上的活菌计数结果表明,二者的CFU值没有明显差异,提示未发现WHO-Cas蛋白的核酸酶活性,其作用机制可能与Cas9蛋白的核酸酶活性具有较大差别。
[硕士论文] 张丽
皮肤病与性病学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  瘢痕是临床上常见的疾病之一,可分为病理性瘢痕和生理性瘢痕两类。瘢痕常形成于创伤后,适度的瘢痕形成是一种生理性和自卫性的表现,但瘢痕过度增生则属于病理性的表现。病理性瘢痕一般可分为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,常常对患者的外观形象以及瘢痕部位的活动功能等产生不良影响,同时也会造成患者的心理负担,严重者可导致抑郁症等疾病发生。现代社会随着经济的发展和人们生活水平的提高,患者对于生活质量的要求以及美容方面的要求越来越高,因此对于病理性瘢痕的病因探索、诊断治疗新技术等的需求也更为强烈。
  病理性瘢痕的两大特征为成纤维细胞的过度增殖与瘢痕的类肿瘤性特征。目前研究表明成纤维细胞是创伤后创面愈合的主要修复细胞,在创面修复的过程中活化、增殖、合成胶原,其过度增殖是病理性瘢痕的一个主要特征。病理性瘢痕在病因、病理机制、临床表现、诊断和治疗等方面与肿瘤均具有相似的生物学特性,即病理性瘢痕的类肿瘤性特性。病理性瘢痕的类肿瘤性特性一方面能够较好、较全面地概述病理性瘢痕的生物学特性,另一方面强调了病理性瘢痕防治的复杂性和艰巨性,因此对于病理性瘢痕发生机制研究可借鉴肿瘤学的研究思路和成果。
  2005年,有学者首次在果蝇中发现Hippo信号通路传递从细胞质到细胞核的细胞信号,该通路能够调节下游基因的表达,从而调节细胞的生长、增殖和凋亡,参与调控器官大小和组织再生,在胚胎发育和组织器官形成等过程中具有重要作用。研究表明Hippo信号通路参与调解多种成纤维细胞的形态功能,同时也与肿瘤的发生、发展有直接的关系。综上所述,我们猜测Hippo信号通路在病理性瘢痕形成过程中发挥一定的作用。目前已知YAP/TAZ的表达在Hippo信号通路中发挥关键作用,因此本研究拟通过实验阐述Hippo信号通路关键性作用分子YAP/TAZ在病理性瘢痕中表达情况,探索Hippo信号通路在病理性瘢痕发生机制中的作用。
  目的:
  研究人真皮成纤维细胞及人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞中Hippo信号通路关键作用分子YAP/TAZ表达情况,并初步建立增生性瘢痕兔耳模型,检测兔耳增生性瘢痕中YAP/TAZ表达情况。
  方法:
  (1)流式细胞术检测人真皮成纤维细胞及人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞凋亡情况,免疫印迹试验(Western Blot)、逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcriotion-polymerase chainreaction,RT-PCR)、定量实时聚合酶链反应(Quantitative real time polymerase chainreaction,Q-PCR)方法检测人真皮成纤维细胞及人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞中Hippo信号通路主要作用分子YAP/TAZ表达情况。
  (2)兔耳瘢痕模型建立:用环钻在每只兔耳腹侧面各做6个直径6mm的圆形全层皮肤缺损创面,每个创面间隔2cm以上,去除软骨膜,创伤后约21天时取瘢痕组织做苏木素一伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色检测瘢痕形成情况,用Western Blot方法检测YAP/TAZ蛋白表达情况。
  结果:
  (1)人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞凋亡弱于人真皮成纤维细胞,YAP/TAZ表达人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞高于人真皮成纤维细胞。
  (2)兔耳创伤后约21天左右形成增生性瘢痕,HE染色显示胶原增生,成纤维细胞增生,瘢痕组织YAP/TAZ表达高于正常兔耳组织。
  结论:
  Hippo信号通路特别是其关键作用分子YAP/TAZ在病理性瘢痕发生过程中起到一定的作用。
[硕士论文] 徐桐桐
病原生物学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)俗称淋球菌(gonococcus),是淋病的病原菌,主要通过性传播,只感染人类,在男性常引起急性尿道炎,女性则一般表现为无症状感染,但病菌可向深部组织播散导致宫颈炎或不孕等严重后果。目前淋病没有可用疫苗进行预防,而治疗又因淋病奈瑟菌耐药性的日趋严重而越来越困难。全面理解淋病奈瑟菌的生物学特性可为淋病防治带来新的靶点。
  成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat,CRISPR)是近年发现的细菌获得性免疫系统,可使细菌防御外源DNA的再次入侵,为细菌抵抗不利环境因素提供了保障。该系统由CRISPR簇、Leader序列和Cas蛋白编码基因等3部分组成,其中CRISPR簇由交替排列的保守性重复序列和特异性间隔序列组成。约90%古细菌和40%真细菌基因组中发现有CRISPR系统,但淋病奈瑟菌的CRISPR系统尚未见报道。我们前期用生物信息学技术分析显示在淋病奈瑟菌WHO-A株中存在CRISPR簇和Cas蛋白,并且发现CRISPR簇的间隔序列部分靶向自身基因,可能对细菌的生长活动具有某种调控作用。本研究旨在研究WHO-A株CRISPR簇与自身靶基因间的相互作用,为研究淋病奈瑟CRISPR系统的结构与功能积累资料。
  一、淋病奈瑟菌WHO-A株CRISPR簇自身靶基因的筛选与克隆
  运用CRISPRs Finder在线系统从前期测序获得的WHO-A株基因组DNA序列中筛查CRISPR系统,获得P1~P6和CL等7个CRISPR簇,同时用重复区比对法进行人工分析获得1个CRISPR簇FAl。对这8个CRISPR簇的所有间隔序列进行BLAST分析,发现这些间隔序列与多个淋病奈瑟菌自身基因具有同源性。进一步按照间隔序列-靶基因间存在≧18 bp匹配序列的原则在已公布基因组序列的所有淋病奈瑟菌株中查找靶基因,再将所筛选的候选靶基因与WHO-A株基因组信息进行同源性比较,从WHO-A株自身基因组中初筛出自身间隔序列所靶向的基因。考虑到靶基因中上游受到干扰时对其表达的影响更显著,从上述靶基因中按照匹配位点位于中上游且至少有连续18 bp以上序列完全匹配的原则作进一步筛查,最终获得3个自身靶基因,即前噬菌体蛋白基因NGFG_01062、假定蛋白基因NGK_0072和菌毛相关蛋白基因NGK_2578。多个CRISPR簇中存在靶向NGK_2578基因的间隔序列,且CRISPR簇CL中存在多个间隔序列前后靶向该基因,提示淋病奈瑟菌CRISPR系统对菌毛可能发挥着重要的调控作用。运用PCR技术分别扩增了3个自身靶基因,插入到pET-GFP质粒中,重组载体pET-Targets-GFP导入到大肠埃希菌BL21中诱导表达,通过SDS-PAGE和荧光显微镜检测到靶蛋白-GFP的融合表达。
  二、利用重组大肠埃希菌分析淋病奈瑟菌CRISPR簇对自身靶基因的作用
  淋病奈瑟菌WHO-A株CRISPR系统的Leader与Cas蛋白的作用机制也不明确。但目前CRISPR/Cas9系统的结构与功能研究非常深入,Addgene提供的成熟载体pCas9中Leader与Cas9的作用方式非常明确,可作为研究未知CRISPR簇功能的理想工具。为在大肠埃希菌中借助pCas9系统研究淋病奈瑟菌WHO-A株CRISPR簇与靶基因间的相互作用,我们合成了筛选的CRISPR簇间隔序列并插入到pCas9中的克隆位点,构建重组质粒pCas9-S,导入含有靶基因表达载体pET-Targets-GFP的大肠埃希菌。重组菌用LB培养液传代,每代细菌分别在氯霉素和卡那霉素LB平板上活菌计数以分析间隔序列是否引导Cas9对靶基因发挥核酸酶的切割作用。结果表明,在pCas9-S导入的最初并没有发现其对靶基因产生明显作用。随着传代的进行,间隔序列P1S对靶基因NGFG_01062、CLS4对靶基因NGK_0072、CLS4和CLS5对NGK_2578基因都表现出了抑制效果,受体菌在含有卡那霉素平板上的CFU明显减少;qRT-PCR和SDS-PAGE分析显示靶基因的转录和蛋白表达水平明显下降。质粒提取提示,间隔序列对靶基因产生作用的过程中可能造成了含靶基因重组质粒的降解。间隔序列FAS1尽管不能降解靶基因NGK_2578但可抑制靶基因的转录从而降低目的蛋白的表达量。
  三、淋病奈瑟菌WHO-A株CRISPR簇的转录分析及基因敲除载体的构建
  提取淋病奈瑟菌WHO-A株总RNA进行RT-PCR检测发现,以针对CRISPR簇CL的特异性引物可以扩增出明显条带;对总RNA进行转录组测序,发现存在与CRISPR簇CL部分序列完全匹配的转录产物,提示CRISPR簇CL可转录形成前体crRNA。为构建CRISPR簇CL基因敲除的淋病奈瑟菌突变株,设计了6组针对CRISPR簇CL的sgRNA,插入pCas9的克隆位点获得打靶载体pCas9-sgRNA;同时克隆了淋病奈瑟菌CRISPR簇CL基因片段作为待敲除的靶基因。大肠埃希菌中证明特异性pCas9-sgRNA降解CL基因,pCas9-sgRNA转化淋病奈瑟菌WHO-A株构建突变株的实验正在进行中。另外还计划应用基于自杀载体的基因编辑技术对CRISPR簇CL进行突变,利用卡那霉素抗性基因kan替换了CL基因的中间部分,获得的携带kan抗性筛选标记的CL上下游同源臂插入自杀载体pGMB152,构建了重组载体pGMB152△CL∷Kan,为后期突变WHO-A株中CRISPR簇CL奠定了基础。
[博士论文] 曲燕
皮肤性病学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:比较10600nm CO2点阵激光照射和外用维A酸制剂对Wistar大鼠皮肤的组织学和超微结构改变。初步探讨10600nm CO2点阵激光和维A酸治疗效果的长效性和时效性,为临床实践提供参考。
  方法:选取45只雌性Wistar大鼠,随机分为9组,将背部皮肤作为实验观察区,进行脱毛后用十字形标记线将观察区分为四部分:近头端左侧为正常对照组(A区),近尾端左侧为维A酸组(B区),近尾端右侧为联合治疗组(C区),近头端右侧为点阵激光组(D区)。C区和D区于实验开始时照射10600CO2点阵激光1次,参数设置:能量15mJ,能量密度5%,频率300Hz,图形为方形,10mm×10mm;激光照射完毕后B区和C区开始每日外擦0.025%维A酸乳膏,持续3周。分别在第3天、第1-8周分批处死9组大鼠,每组大鼠取背部4区皮肤组织,在组织切片镜下检测真皮厚度,采用羟脯氨酸试剂盒检测组织中羟脯氨酸含量,Real-time PCR法检测Ⅲ型前胶原mRNA的表达。3周时在透射电镜下观察大鼠皮肤的超微结构改变。
  结果:①自3周至8周,各治疗组(B、C、D)Wistar大鼠真皮厚度较正常对照组(A)增加(P<0.05);2~4周点阵激光组(D)与维A酸组(B)比较真皮厚度明显增加,差别有统计学意义(P<0.05);2~6周联合治疗组(C)比维A酸组(B)真皮厚度明显增加(P<0.05)。②第3天各治疗组(B、C、D)羟脯氨酸含量较正常组下调,1周时各治疗组(B、C、D)羟脯氨酸含量较正常组(A)升高并持续上调,联合治疗组(C)和点阵激光组(D)于第5周达最大值,维A酸组(B)于第6周达最大值;8周时联合治疗组(C)羟脯氨酸含量仍明显高于其他各组(P<0.05);点阵激光组(D)和维A酸组(B)羟脯氨酸含量于照射后1~4周差别有统计学意义(P<0.05);③3天~1周时点阵激光组(D)Ⅲ前胶原mRNA的表达较正常对照组(A)下调;1周后各治疗组(B、C、D)的Ⅲ前胶原mRNA的表达均较前上升,联合治疗组(C)上升最为明显,并且达峰值最快(3周达峰值,5.61±0.7);④.3周时观察各分区大鼠的皮肤超微结构改变,透射电镜下显示单位面积内各治疗组(B、C、D)胶原数量比正常对照组(A)明显增多,胶原纤维排列方式更加紧致密集。
  结论:维A酸制剂和10600nm CO2点阵激光均具有促进Wistar大鼠皮肤胶原增生和重构的作用,可维持起效至少8周;与维A酸制剂相比,10600nm CO2点阵激光的嫩肤作用起效迅速,维持时间较短;联合应用CO2点阵激光和维A酸制剂能够产生良好的协同作用。
[硕士论文] 杨璐
皮肤病与性病学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:⑴了解本地VVC患者念珠菌感染的菌种分布情况及其对FCA的敏感性;⑵探讨VVC患者临床分离白念珠菌Mrr2突变与FCA耐药的关系;⑶探讨VVC患者临床分离白念珠菌Mrr2、CDR1的mRNA表达水平与FCA耐药的关系,并进一步分析Mrr2与CDR1表达水平在FCA耐药中的相互调控作用;⑷探讨VVC患者临床分离白念珠菌Mrr2基因突变与Mrr2的mRNA表达水平是否对FCA耐药具有相互作用。
  方法:采集2015年11月至2016年5月山西医科大学第二医院皮肤性病科就诊的可疑VVC患者阴道分泌物标本155份,并经过真菌镜检、CHROMagar念珠菌显色培养基及API20C AUX念珠菌鉴定系统进行菌种鉴定,获得102株念珠菌。对其中的80株白念珠菌应用M27-A3微量肉汤稀释方法进行FCA药物敏感性试验。对80株白念珠菌分别提取DNA、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增Mrr2基因片段、测序,寻找突变位点。对白念珠菌FCA耐药组和敏感组菌株分别提取总 RNA,逆转录合成 cDNA,实时荧光定量 PCR(Real-time Fluorescence Quantitative PCR,FQ-RT-PCR)检测Mrr2、CDR1的mRNA表达量,并做相关统计学分析。
  结果:①从155份阴道分泌物标本中,共获得念珠菌菌株102株。其中白念珠菌80株(78.4%),光滑念珠菌15株(14.7%),热带念珠菌4株(3.9%),近平滑念珠菌2株(2.0%),克柔念珠菌1株(1.0%)。②对80株白念珠菌接种活化,并使用M27-A3微量肉汤稀释法进行FCA药物敏感性试验,结果显示:80株白念珠菌中有40株对FCA敏感,10株对FCA呈剂量依赖性敏感,30株对FCA耐药,耐药率为37.5%。③对80株白念珠菌的Mrr2基因进行测序,其中FCA耐药组Mrr2基因突变率为56.67%;FCA敏感组Mrr2基因突变率为26.08%。对白念珠菌Mrr2基因突变与FCA耐药的关系采用四格表卡方检验,得出P值<0.05,差异具有统计学意义。耐药组Mrr2基因突变率高于敏感组Mrr2的突变率。④检测白念珠菌FCA敏感组和耐药组的Mrr2及CDR1的mRNA表达水平,经统计学分析:白念珠菌FCA耐药组Mrr2的mRNA表达水平高于敏感组Mrr2的mRNA表达水平(1.10±0.50 VS0.52±0.45),P<0.05,差异具有统计学意义;白念珠菌FCA耐药组CDR1的mRNA表达水平高于敏感组CDR1的mRNA表达水平(0.42±0.294 VS0.25±0.289),P<0.05,差异具有统计学意义;CDR1与Mrr2呈正相关,r=37.6%;Mrr2突变与 Mrr2表达的交互作用分析,发现Mrr2基因发生突变且高表达组的耐药性是基因未发生突变且基因低表达组的耐药性的47.50倍,说明Mrr2基因突变与高表达对FCA耐药性的产生存在协同作用。
  结论:⑴本地区VVC患者最主要的致病菌种是白念珠菌,对FCA耐药率较高,临床治疗VVC应依据药敏试验结果,选用敏感抗真菌药物进行精准治疗。⑵VVC患者临床分离白念珠菌FCA耐药性可能与Mrr2突变有关。⑶CDR1高表达可能直接导致白念珠菌对FCA耐药;Mrr2高表达可能直接导致白念珠菌对FCA耐药,且Mrr2高表达还可促进CDR1高表达进而介导白念珠菌对FCA耐药。⑷Mrr2基因突变与高表达对FCA耐药性的产生可能存在协同作用。
[硕士论文] 李雯
皮肤病与性病学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:细胞的极性生长是指从细胞的某一区域非对称性的生长出另一种特定的结构或形状。这种独特的结构对细胞的功能至关重要,并协助细胞间的相互作用。烟曲霉等曲霉菌属是典型的极性生长生物体,主要表现为其菌丝尖端的不断生长。本文将构建烟曲霉Bem46基因敲除株,并在配制含不同抗真菌药物的培养基上,观察烟曲霉Bem46基因缺陷株与对照株的生长差异,以期发现新的药物靶点;以及构建烟曲霉Bem46基因荧光定位株,观察其在烟曲霉菌丝中的定位情况;对比对照株及敲除株发芽状况并检测部分Bem46极性生长传导通路中的相关基因表达量情况来探索Bem46基因在烟曲霉极性生长过程中的作用。
  方法:生物信息学方法查找烟曲霉中Bem46基因,设计引物,并以pyrG作为筛选标记构建烟曲霉Bem46基因敲除株(ΔBem46)。在基础培养基接种相同数量的对照株与缺陷株孢子,观察二者生长有无差异。配制五种药物(两性霉素B、卡泊芬净、伊曲康唑、伏立康唑、他克莫司)不同浓度的平皿,浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0mg/L,点种相同数量的对照株及敲除株的孢子,37℃培养72h,测量并记录直径,实验重复三次。将Bem46基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及潮霉素筛选转化子相连,转入烟曲霉,潮霉素筛选后得到 Bem46荧光定位株,在共聚焦显微镜下观察 Bem46在烟曲霉极性生长过程中的定位情况。在倒置显微镜下对比敲除株与对照株的出芽差异,然后分别提取二者的RNA,使用实时荧光定量PCR方法检测极性生长相关基因Bem1、Bud5在对照株及敲除株中的表达差异。
  结果:通过序列比对在烟曲霉基因组中找到了Bem46基因,其编号为Afu7g04660,由1116bp碱基组成,编码311个氨基酸。经PCR和Southernblot验证得到Bem46基因敲除株。在五种药物不同浓度平皿上,对照株与敲除株生长直径经重复测量方差分析并无明显差异。经原生质体转化法及PCR验证成功得到Bem46基因荧光定位株,在共聚焦显微镜下观察,荧光在菌丝内呈弥散分布,并没有观察到特异性的定位区域,但在分支处有聚集现象。敲除株与定位株的出芽率经重复测量方差分析,可见敲除株出芽明显滞后于对照株。极性生长相关基因Bem1、Bud5经实时荧光定量PCR检测,在敲除株中的表达量均低于对照株。
  结论:烟曲霉Bem46基因并不能作为两性霉素B、卡泊芬净、伊曲康唑、伏立康唑、他克莫司五种药物的药物靶点;Bem46基因并不能直接构成极性生长的相关结构,如菌丝隔膜或菌丝尖端等;但 Bem46基因确实参与烟曲霉的极性生长过程,该基因可能有促进孢子发芽的作用,并且它的缺失导致极性生长相关基因表达下调,极有可能影响了极性生长传导通路,为研究烟曲霉生长机制提供了新思路。
[硕士论文] 祝欣
皮肤病与性病学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:⑴了解本地VVC患者念珠菌菌种分布情况及对唑类药物的敏感性。⑵探讨VVC临床分离白念珠菌ERG3、Efg1突变及表达水平与唑类药物耐药的关系。⑶探讨VVC中白念珠菌Efg1与ERG3在唑类药物耐药中的相互关系。
  方法:收集2015年11月至2016年5月就诊于山西省妇幼保健院妇科门诊的VVC患者阴道分泌物标本184例,通过培养传代、CHRO Magar念珠菌显色培养、API20C AUX鉴定系统进行分离鉴定,共获得146株白念珠菌。采用M27-A3微量肉汤稀释法对其中50株白念珠菌行药敏试验,将其分为敏感组和耐药组。分别提取2组菌株的基因组DNA,进行ERG3、Efg1特异性引物扩增后测序,通过与genbank中的标准序列进行比对,寻找其突变位点,探讨基因突变与耐药的关系;分别提取2组菌株的总 mRNA,逆转录为 cDNA,通过荧光定量 PCR(RT-PCR)测其相对表达量,分析其表达水平与耐药的关系,并探讨 Efg1与 ERG3在唑类药物耐药中的相互关系。
  结果:⑴共收集 VVC患者阴道分泌物标本184例,菌种分布显示:白念珠菌146株(79.35%),光滑念珠菌22株(12.0%),热带念珠菌6株(3.62%),近平滑念珠菌5株(2.72%),克柔念珠菌2株(1.01%),其它3株(1.63%)。⑵体外药敏试验显示:50株白念珠菌对氟康唑(FCA)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VRC)的耐药率分别为44%、56%和50%,且存在交叉耐药现象。⑶基因测序显示:ERG3测序结果:1株出现R352H、2株出现W219C,此3株菌均对FCA、ITR、VRC交叉耐药;Efg1测序结果:6株出现了V86I,其中1株对ITR单独耐药,余5株均为敏感菌株。⑷耐药组(分别耐FCA、ITR、VRC及交叉耐药)和相应敏感组的ERG3、Efg1 mRNA相对表达量统计学分析显示:ERG3 mRNA表达量分析:8组数据均符合正态分布,采用t检验,结果用均数±标准差(x±s)表示。 FCA敏感组(2.01±0.60)高于耐药组(0.59±0.36),t=10.29,P<0.001,差异具有统计学意义;ITR敏感组(2.21±0.52)高于耐药组(0.73±0.43),t=10.97,P<0.001,差异具有统计学意义;VRC敏感组(2.10±0.57)高于耐药组(0.66±0.40),t=10.42,P<0.001,差异具有统计学意义;全敏感组(2.54±0.39)高于交叉耐药组(0.31±0.22),t=17.99, P<0.001,差异具有统计学意义。Efg1 mRNA表达量分析:4组耐药组均不服从正态分布,采用秩和检验,结果用中位数±四分位数间距(M±QR)表示。FCA耐药组(2.02±2.78)高于敏感组(0.55±0.65),平均秩为39.5和14.5,P<0.001,差异具有统计学意义;ITR耐药组(1.74±1.75)高于敏感组(0.45±0.34),平均秩为36.48和11.52,P<0.001,差异具有统计学意义;VRC耐药组(1.88±2.22)高于敏感组(0.48±0.50),平均秩为38和13,P<0.001,差异具有统计学意义;交叉耐药组(3.68±5.88)高于敏感组(0.34±0.11),平均秩为19.5和7.0,P<0.001,差异具有统计学意义。ERG3与Efg1相关性分析,采用Spearman相关分析,结果显示相关系数r=-0.614,P<0.001,二者呈负相关。
  结论:②本地区白念珠菌感染仍在VVC中占主导地位,且对唑类药物存在不同程度耐药,故治疗VVC时应该以菌种鉴定和药敏分析为指导。②ERG3高表达可能增加白念珠菌对唑类药物的敏感性;ERG3突变可使白念珠菌对唑类药物耐药,W219C、R352H是否参与唑类药物耐药仍需进一步的去证实。③Efg1高表达可能增加唑类药物的耐药性,但 Efg1突变与耐药的关系仍需进一步的研究。④白念珠菌Efg1和ERG3在唑类药物耐药中呈负相关,Efg1负性调控ERG3。
[硕士论文] 顾星逸
临床医学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.总结住院带状疱疹患者临床资料,分析带状疱疹发病特点。
  2.比较膦甲酸钠、更昔洛韦、伐昔洛韦这三种抗病毒治疗方案治疗带状疱疹的疗效。
  3.探讨带状疱疹后神经痛的影响因素,为临床诊疗提供参考。
  4.分析2例初诊为带状疱疹的病例,总结临床诊治经验。
  方法:
  本研究对2015年9月-2017年1月期间在东南大学附属中大医院住院治疗的112例带状疱疹患者进行回顾性分析。
  1.常规登记、记录患者的性别、年龄、皮损特点、疼痛程度等一般情况,抽血检查患者生化、电解质、血清肌钙蛋白Ⅰ。
  2.所有患者随机分为三组,分别用膦甲酸钠、更昔洛韦、伐昔洛韦治疗,比较疗效。
  3.多因素分析方法,分析带状疱疹后神经痛的影响因素。
  4.两例初诊为带状疱疹的病例,回顾其诊治过程。
  结果:
  1.临床资料112名研究对象中,男性略多于女性,74%的患者年龄大于60岁;皮损主要位于三叉神经分布区、肋间神经分布区、腰骶神经分布区,左右侧比例为1∶1;皮损严重程度以中等程度为主;大部分患者为先出现疼痛,后出现红斑、水疱;急性期疼痛程度的平均疼痛评分为4.96分;有29.5%的患者出现并发症,且大部分年龄≥60岁,带状疱疹后神经痛为发生最多的并发症;共出现6例特殊类型带状疱疹;平均抗病毒治疗天数为8.25天;28.6%的患者甘油三酯升高;大部分患者钙离子浓度在2.20-2.29mmol/L间;3.6%患者cTnⅠ升高。
  2.膦甲酸钠、更昔洛韦、伐昔洛韦三种药物治疗带状疱疹,其疗效无明显差异(F=0.239,P=0.788>0.05)。
  3.带状疱疹后神经痛的影响因素单因素统计分析显示:部位、体侧、血清肌钙蛋白Ⅰ差异不具有统计学意义,疼痛至抗病毒开始时间、年龄、皮损严重程度、疼痛评分、电解质钙离子浓度差异具有统计学意义;多因素Logistic回归分析显示:年龄、性别、皮损严重程度、抗病毒天数及血清肌钙蛋白Ⅰ差异不具有统计学意义;疼痛评分(P=0.015)和电解质钙离子浓度(P=0.003)差异有统计学意义,其中疼痛评分是带状疱疹后神经痛的危险因素,电解质钙离子值是带状疱疹后神经痛的保护因素。
  4.两例初诊为带状疱疹的患者,结合查体及辅助检查结果,一例确诊为肾周脓肿,另一例为带状疱疹合并肺部感染。
  结论:
  1.在疼痛早期接受足量抗病毒治疗,可以减小发生带状疱疹后神经痛的风险,而血清钙离子可能是带状疱疹后神经痛的重要影响因素。
  2.膦甲酸钠、更昔洛韦、伐昔洛韦均可有效治疗带状疱疹,其疗效无明显差异。
  3.对于临床上不典型的带状疱疹病例,应重视全面查体及辅助检查。
[硕士论文] 张晓宇
中医外科学 南京中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:观察当归消疕汤治疗血虚风燥型银屑病的临床疗效。
  方法:将纳入的41例患者使用随机数字表法分为治疗组(当归消疕汤组)和对照组(消银颗粒组),其中当归消疕汤组21例,消银颗粒组20例,两组均配合玉泽皮肤屏障修护身体乳外涂,疗程8周。分别于治疗前、第4周、第8周对患者的银屑病面积与严重性指数(PASI)及皮损瘙痒程度进行评分,使用SPSS20.0软件包进行统计处理并对疗效进行评价。
  结果:①当归消疕汤治疗血虚风燥型银屑病皮损,根据治疗前后PASI评分,临床显愈率76.19%,总有效率90.48%;消银颗粒组临床显愈率45.00%,总有效率85.00%。当归消疕汤的显愈率明显高于消银颗粒(P<0.05),两者总有效率无明显差别。②当归消疕汤治疗血虚风燥型银屑病瘙痒症状,临床显愈率81.82%,总有效率95.24%;消银颗粒组临床显愈率50.00%,总有效率85.00%,当归消疕汤的显愈率高于消银颗粒(P<0.05),两者总有效率无明显差别。③应用当归消疕汤治疗期间患者无明显不良反应。
  结论:当归消疕汤能有效改善血虚风燥型银屑病患者的皮损,减轻患者瘙痒,疗效优于消银颗粒,且无明显副作用。
[硕士论文] 吴嘉龄
中医学(中西医结合) 南京中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:观察穴位贴敷治疗哮喘患者后诱发的接触性皮炎情况对支气管哮喘患者哮喘复发情况及生活质量改善的差异性,及通过对穴位贴敷治疗后出现与未出现接触性皮炎的哮喘患者外周血中T-bet mRNA、GATA-3 mRNA含量的变化探讨有无接触性皮炎对T-bet mRNA、GATA-3 mRNA表达及其平衡的影响。
  方法:按纳入排除标准收集2016年6月至2016年8月期间于南京中医药大学附属医院针灸康复科穴位贴敷门诊行穴位贴敷治疗的支气管哮喘患者为观察研究对象,按治疗后皮肤反应情况分为有接触性皮炎组及无接触性皮炎组,通过对穴位贴敷治疗支气管哮喘患者治疗后3个月(2016年11月)、6个月后(2017年2月)及前一年同期(2015年11月及2016年2月)的ACT评分及AQLQ评分进行评估,探讨穴位贴敷治疗时有无接触性皮炎对哮喘患者的哮喘复发及生活质量改善情况是否具有影响。并用实时荧光定量RT-PCR法检测比较有接触性皮炎组及无接触性皮炎组哮喘患者治疗前后的外周血中T-bet mRNA、GATA-3 mRNA的表达情况,探讨T-bet、GATA-3 mRNA含量与有无接触性皮炎的相关性。
  结果:(1) ACT及AQLQ评分结果:①有接触性皮炎组2016年11月、2017年2月与治疗前去年同期(2015年11月及2016年2月)均显著增高(P<0.01)。无接触性皮炎组2016年11月较去年同期有所增高(P<0.05)。②AQLQ总分比较:哮喘患者AQLQ总评分有接触性皮炎组与无接触性皮炎组2016年11月、2017年2月与同组治疗前去年同期均有显著增高(P<0.01)。AQLQ各单元评分比较:AQLQ中的活动受限单元:有接触性皮炎组与无接触性皮炎组2016年11月较同组去年同期均显著增高(P<0.01)。有接触性皮炎组与无接触性皮炎组2017年2月较去年同期均有所增高(P<0.05)。哮喘症状评分比较:有接触性皮炎组2016年11月、2017年2月较其去年同期以及无接触性皮炎组2016年11月较其去年同期均显著增高(P<0.01)。无接触性皮炎组2017年2月较去年同期有所增高(P<0.05)。心理情绪评分比较:有接触性皮炎组2016年11月、2017年2月与其去年同期及无接触性皮炎组2017年2月较去年同期均显著增高(P<0.01)。无接触性皮炎组2016年11月较其去年同期有一定增高(P<0.05)。对刺激原反应评分比较:有接触性皮炎组2016年11月、2017年2月较去年同期均显著增高(P<0.01)。对自身疾病健康状况的担心:有接触性皮炎组及无接触性皮炎组2016年11月、2017年2月与治疗前的去年同期均有所增高(P<0.05)。
  (2) T-bet、GATA-3 mRNA Realtime RT-PCR结果:①有接触性皮炎组及无接触性皮炎组治疗后T-bet mRNA的2-Δct值较治疗前显著增高(P<0.01)。②有接触性皮炎组T-bet/GATA-3(2Δct)比值治疗后较治疗前有所增高,具有统计学意义(P<0.05)。③经过治疗后有接触性皮炎组T-bet的2-ΔΔct较无接触性皮炎组更高而GATA-3的2-ΔΔct值更低,但均无明显差异性(P>0.05)。有接触性皮炎组T-bet/GATA-3(2-ΔΔct)值较无接触性皮炎组显著增高(P<0.01)。
  结论:穴位贴敷治疗哮喘后对患者哮喘复发的控制情况及生存质量均有所提高,且发生接触性皮炎的患者比未发生接触性皮炎的患者复发控制效果更好,并具有相对更好的远期疗效。哮喘患者经穴位贴敷治疗后血中T-bet mRNA表达水平均较治疗前显著增高;发生接触性皮炎的哮喘患者较未发生接触性皮炎的患者经治疗后血中T-bet/GATA-3比值更高,可能预示着发生皮炎与穴位贴敷中Th1/Th2全身免疫调节向Th1方向偏移有关系,经过治疗后有接触性皮炎的患者疗效更好。
[硕士论文] 章若画
中西医结合临床 南京中医药大学 2017(学位年度)
摘要:本文分为两大部分,第一部分为理论研究,第二部分为临床研究。
  第一部分:第一篇介绍汗法治疗寻常型银屑病的古今研究概述,包括古代文献对银屑病的病因病机、历史沿革、组方遣药的记载以及现代医学对本病的认识、发展以及治疗方法。第二篇介绍皮肤影像学技术(主要介绍共聚焦激光扫描显微镜以及22MHz高频超声)在皮肤病学领域的发展和应用,同时具体论述22MHz高频超声在银屑病治疗前后的疗效观察以及指甲改变的研究成果。
  第二部分:目的:观察麻黄连翘赤小豆汤加减治疗寻常型银屑病表闭里郁证的临床治疗效果。方法:选取南京中医药大学附属医院皮肤科门诊符合斑块型银屑病表闭里郁证患者40例,通过随机、对照的临床试验,观察汗法治疗后的临床疗效。每组20例,共40例。治疗组给予口服麻黄连翘赤小豆汤加减,对照组给予口服实验组中药减生麻黄、川桂枝,加荆芥、防风,运用22MHz高频超声的相关性标定值与传统PASI评分进行治疗前后对比研究。结果:1.两组受试者治疗8周之后,试验组PASI评分及22MHz高频超声的结果均优于对照组,22MHz高频超声和PASI评分的差异有统计学意义(P<0.05)。2.试验组:PASI评分总有效率为80%,22MHz高频超声总有效率为85%;对照组:PASI评分总有效率为45%,22MHz高频超声总有效率为55%;22MHz高频超声略优于PASI评分,统计学无差异(p>0.05)。结论:1.麻黄连翘赤小豆汤加减对斑块型银屑病(表闭里郁证)有较好的临床疗效,且明显优于对照组。2.麻黄连翘赤小豆汤加减是治疗斑块型银屑病表闭里郁证的有效方剂。3.22MHz高频超声评价银屑病治疗前后的疗效观察简便安全,有效可靠,建议临床上使用和推广。
[硕士论文] 高悦
中医外科学 南京中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:采用通络除湿洗剂联合中药协定方5号(导师通络益气活血方)以及小剂量的阿维A胶囊治疗38例中、重度银屑病。观察此方案的临床疗效和安全性。为医治此病开辟出更为宽阔的思维空间。
  方法:病例源于中国医学科学院皮肤病医院门诊部的血瘀证银屑病患者,按院内门诊顺序随机分成两组。治疗组中的病患为38例,给予通络除湿洗剂外洗(艾叶30g、侧柏叶30g、甘草15g、地肤子15g、苦参30g、蛇床子15g),口服通络益气活血方(党参12g、黄芪30g、桂枝8g、干姜3g、厚朴12g、苦杏仁10g、苍耳子10g、白鲜皮15g、防风10g、阿胶9g、黄连3g、白术12g、甘草2g、大枣3g)及小量阿维A10mg qd,36例患者作为对照组,给予阿维A胶囊10mg/bid。4周为一疗程,持续观察两个疗程。
  结果:1.治疗组给予通络除湿洗剂联合口服通络益气活血汤协同阿维A10mg医治38例血瘀证中重度银屑病,有效率为86.84%。对照组中的36例血瘀证中重度银屑病患服用阿维A胶囊20mg,有效率为83.33%。通过比较两组患者临床疗效,无显著统计学差别(P>0.05)。
  2.两组病患未治疗前,治疗组PASI评分为16.84±1.47,对照组PASI评分为16.54±1.46,两组病患之间的PASI评分均无统计学差异。通过4周治疗,治疗组的PASI评分为11.26±1.38,对照组PASI评分为10.89±1.37,经过8周治疗,治疗组PASI评分为2.50±1.25,对照组PASI评分为2.47±1.23。与治疗前PASI评分相比,治疗后两组病患的PASI评分均有所下降,差异有统计学意义(P<0.05);在治疗4周末,8周末时,治疗组PASI评分与对照组在同一时间相比,差异均无统计学意义(P>0.05)
  3.不良反应治疗组2例患者有呕吐、食欲不振征象,嘱患者于早晚饭后两小时,温热服药。对照组中2例病患出现皮肤脱屑,瘙痒难耐,3例病患出现口唇干燥,1例患者出现结膜炎,2例患者AST增高,均及时进行对症治疗。治疗组的不良反应率为5.26%,对照组的不良反应率22.22%比较差异有统计学意义。
  结论:通络除湿洗剂联合口服通络益气活血汤协同阿维A胶囊10mg医治中重度寻常型银屑病,功效较好,运用安全性相对较高,病患依从性好。
[博士论文] 朱红柳
中医外科 南京中医药大学 2017(学位年度)
摘要:雄激素性秃发(Androgenic alopecia,AGA),又称脂溢性脱发、男性型脱发,属中医学“发蛀脱发”、“蛀发癣”范畴,是皮肤科临床的常见病、多发病,也是难治性疾病之一,该病病程漫长且顽固难愈。目前AGA的病因及发病机制尚不明确,一般认为雄激素及其受体的表达在本病的发生中起关键作用,而Ⅱ型5α-还原酶是其发病的重要因素。研究认为,雄激素(睾酮)在Ⅱ型5α-还原酶作用下转化为活性更强的双氢睾酮(Dihydrotestosterone,DHT),双氢睾酮与其受体结合后进一步诱导TGF-β2表达,TGF-β2是毛发生长的负调控因子,可导致毛发生长期缩短,提前进入休止期,从而引起脱发。此外,TGF-β2还能够促进caspase3和caspase9的表达,影响Bcl-2/Bax比率,引起细胞(如毛乳头细胞)线粒体凋亡。
  目前国内经国家食品药品监督管理局(SFDA)批准的用于治疗男性AGA的口服药物主要是非那雄胺片。该药虽广泛应用于临床,但不能完全阻断病程进展,且存在不同程度的不良反应。锯叶棕(Saw palmetto),又名沙巴棕,是生长于美国东南部一种常见的棕榈科灌木,其果实提取物富含油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、亚油酸等,是目前广泛应用于治疗前列腺增生的天然植物制剂。现代研究发现,锯叶棕果实提取物(Saw palmettoextracts,SPE)具有非竞争性抑制5α-还原酶活性(Ⅰ型和Ⅱ型)、抑制双氢睾酮与其受体结合、抗炎及抗凋亡等药理作用,而其是否具有促毛发生长的作用尚未见报道。基于AGA与前列腺增生的发病均与雄激素和Ⅱ型5α-还原酶相关,本研究以非那雄胺作参比,观察锯叶棕果实提取物对人角质形成细胞和人毛乳头细胞存活的影响,同时构建雄激素性秃发小鼠模型,探索其是否具有促毛发生长作用,并初步探讨其相应的机制。
  研究内容:
  1.观察锯叶棕果实提取物对人角质形成细胞(human keratinocytes,HaCaTs)及人毛乳头细胞(human hair dermal papilla cells, HHDPCs)增殖的影响以及量效关系;
  2.建立雄激素性秃发小鼠模型,并进行分组实验处理,观察锯叶棕果实提取物对小鼠毛发的促生长作用并初步探讨其机制。
  研究方法:
  1.细胞实验:常规培养HaCaTs和HHDPCs细胞,并进行分组给药:空白组:正常培养细胞,不予处理;双氢睾酮(DHT)组:加入0.03μg/mL DHT培养液;DHT+非那雄胺组:加入0.03μg/mL DHT+0.08μg/mL非那雄胺培养液;DHT+SPE组:加入0.03μg/mLDHT+(1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)SPE培养液。用MTT法检测各组细胞增殖率。
  2.动物实验:
  2.1建立C57BL/6小鼠雄激素性秃发的动物模型,并随机分为四组,每组8只:空白对照组、双氢睾酮(DHT)组、DHT+非那雄胺组、DHT+SPE组;观察各组小鼠灌服给药后各个时期(第7、14、21、28、35天)毛发的生长情况并记录评分;
  2.2给药35天后,脱颈处死小鼠,取其背部脱毛区圆形皮片,手术刀刮取皮片上所有毛发并称重,记录各组小鼠毛发质量;
  2.3取部分圆形皮片进一步做组织切片,HE染色,计算各组生长期(A)、退行期(T)毛囊数量;
  2.4采用Western blot法分别检测四组圆形皮片组织中TGF-β2、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3蛋白的表达量。
  研究结果:
  1.DHT对HaCaTs细胞增殖的影响:DHT能够诱导HaCaTs凋亡,且随着培养时间的延长而增强。SPE和非那雄胺均能够抑制DHT诱导的HaCaTs凋亡,并促进其增殖。其中SPE呈浓度依赖性和时间依赖性,随着给药浓度的增加(≤100μg/mL)和培养时间的延长,其促进作用逐渐增强,在25μg/mL浓度时,开始优于非那雄胺,在100μg/mL浓度时达到最强;而当SPE达到200μg/mL时,其促进HaCaTs增殖作用随着时间的延长而减弱。各实验组间存在统计学差异。
  2.DHT对HHDPCs细胞增殖的影响:DHT能够诱导HHDPCs凋亡,且随着培养时间的延长而增强。SPE和非那雄胺均能够抑制DHT诱导的HHDPCs凋亡,并促进其增殖。SPE在低浓度时(1μg/mL、5μg/mL)即表现出较强的促增殖作用,且均优于非那雄胺,差异有统计学意义。当浓度≥25μg/mL时,其促增殖作用逐渐减弱。
  3.C57BL/6小鼠雄激素性秃发模型的建立:C57BL/6小鼠脱毛区皮肤均呈现粉红色,毛发生长处于休止期,说明成功建立了C57BL/6小鼠秃发模型。
  4.SPE对小鼠毛发生长的影响:空白对照组、非那雄胺组、SPE组小鼠在28天、35天毛发生长情况评分结果一致,但总的来说,空白对照组小鼠毛发生长相对最好,背部皮肤最早出现黑色(7天内),非那雄胺组次之(14天内),SPE组相对较差,皮肤出现黑色较晚(21天内)。而DHT组35天内未见新生毛发长出。毛发称重结果中,空白组和非那雄胺组接近,分别为41.38g和40.8g, SPE组17.95g,DHT组为0。取背部圆形皮片HE染色100X下毛囊计数发现,非那雄胺组和SPE组毛囊总数接近,分别为68和65,均明显高于空白组(48)和DHT组(33)。SPE组处于生长期毛囊计数与非那雄胺组接近,视野下各组毛囊分布较均匀。
  5.SPE对TGF-β2、cleaved easpase3、Bax、Bcl-2的影响:Western blot结果显示,细胞凋亡因子TGF-β2、 cleaved caspase3、Bax在DHT组的表达量明显高于其它三组,依次是DHT组>SPE组>非那雄胺组>空白组;而细胞凋亡抑制因子Bcl-2的表达正好相反,在空白组最高,依次为空白组>非那雄胺组>SPE组>DHT组。
  结论:
  锯叶棕果实提取物能够促进毛发生长。与非那雄胺相比,其促进作用稍弱,起效相对较慢。其机制可能与抑制TGF-β2、cleaved caspase3、Bax,而促进Bcl-2的表达相关。
[硕士论文] 黎永良
化学工程与技术 广东工业大学 2017(学位年度)
摘要:银屑病是一类常见的通常伴有角化细胞异常增殖等特征的鳞屑丘疹性皮肤病,属于一种慢性易复发的炎性皮肤疾病。银屑病在世界范围内的发病率为0.1-3%,不同国家的发病率差异较大,在欧美国家发病率高达2-3%,我国银屑病发病率为0.4%,约有500万患者。银屑病患者病程较长、容易复发、有的病例几乎终生不愈。此外,银屑病患者易患上其他疾病,如银屑病关节炎、焦虑与抑郁、淋巴瘤和代谢综合征等,对患者的身体健康和精神状况造成很大的影响。近年来,银屑病新药研发取得了较大的进展,主要以肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Janus激酶(JAK)和白介素(IL)及其受体(ILR)等免疫相关炎症介质为靶点开发抗银屑病药物。针对这些靶点研发的银屑病治疗药物已有多个上市或进入临床研究,但仍然存在疗效和毒副作用等问题。因此,研究高效、低毒的抗银屑病新药仍然是当前研究的热点。
  芳姜黄酮是姜黄油的主要的成分,具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等活性。其抗炎机理是通过调控JNK、p38 MAPK、ERK1/2的磷酸化水平以及PI3K/Akt信号通路,影响NF-κB的活性,控制内源性炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)、干扰素(IFN)以及其他相关致炎因子的表达。芳姜黄酮在抗炎方面的重要应用,引起了课题组极大的关注。
  本论文在文献调研的基础上,以抗银屑病为目标,研究芳姜黄酮抑制银屑病的作用及机理,开展了芳姜黄酮分离纯化及结构鉴定、芳姜黄酮与银屑病靶点相互作用和对小鼠银屑病的抑制作用及机理研究。主要研究内容及结果如下:
  (1)通过文献调研,综述了银屑病的发病机理和当前治疗药物的研究进展,同时概述了芳姜黄酮的分离、纯化和生物活性的研究进展。
  (2)从姜黄油中分离芳姜黄酮样品,并进行了结构及纯度鉴定。采用柱色谱层析富集、反相制备色谱分离和石油醚萃取获得芳姜黄酮,经过质谱、核磁共振和高效液相色谱的手段确证了所制备样品的主要成分为芳姜黄酮,纯度为98.6%。
  (3)研究了芳姜黄酮对咪喹莫特诱导小鼠银屑病模型的抑制作用效果。建立了咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型,通过PASI评价、H&E染色发现芳姜黄酮可以显著缓解咪喹莫特引起的银屑病样皮肤损伤,明显抑制过度角质化现象,能轻微抑制皮肤表皮层细胞增殖和表皮层的厚度增加,对皮肤屏障具有保护作用。
  (4)研究了芳姜黄酮抑制银屑病的作用机理。调研并整理了银屑病治疗的靶点信息,从 RCSB蛋白数据库获得相关靶点的晶体结构,应用 Sybyl软件中Surflex-Dock程序构建了17个靶点的对接模型,将芳姜黄酮与17个靶点进行对接预测,筛选出芳姜黄酮对TLR7和p38 MAPK具有潜在的抑制作用;利用免疫组化的方法测量了小鼠表皮层CD8+ T细胞、COX-2和NF-κB的含量变化情况,证实芳姜黄酮可有效抑制表皮层CD8+ T细胞含量增加,并在低浓度下降低COX-2的含量,不影响表皮层 NF-κB的表达;采用蛋白免疫印迹法考察银屑病相关的激酶磷酸化水平以及免疫因子表达量变化,发现芳姜黄酮抑制p38 MAPK的磷酸化和下调皮肤NF-κB的表达,提高IL-1β的水平,同时对IFN-γ、IL-6、TNF-α的表达具有抑制作用;通过荧光定量PCR研究银屑病相关的免疫因子基因转录水平,发现芳姜黄酮明显抑制IFN-α基因的转录,对IL-17、IL-22的转录均具有一定的抑制作用,同时调节白介素IL-12和IL-23的RNA合成,具有免疫调节的作用。
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