绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
导航
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 45
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 887 条结果
[博士论文] 代涛
整形外科 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:背景:巨大黑色素痣(简称巨痣)分布面积巨大可累全身各个部位,其病因及发病机制尚不清楚。巨痣严重影响患者外貌,恶变风险为5%-10%。因此,完全去除儿童巨痣对降低恶变率和改善外貌具有重要意义。手术治疗是目前治疗巨痣的主要方法。但是尚未有大家普遍认同的一种治疗巨痣的手术方法。本文针对巨痣的皮损面积大小、深度、不同部位等因素,采取个体化治疗方案。
  目的:通过对儿童巨大黑色素痣(简称巨痣)不同手术方式的治疗,探讨巨痣切(削)除后继发创面的最佳修复方案。
  方法:分析2006年5月至2016年4月收治的6个月-12岁巨大黑色素痣1118例患儿,其中男性568例,女性550例,根据不同面积及部位选择巨痣切除+刃厚皮片移植术、巨痣切除+中厚皮片移植术、巨痣切除+全厚皮片游离移植术、巨痣切除+真皮下血管网移植术、巨痣切除+微粒皮植皮术、巨痣切除+Meek植皮术、分次切除术、分次切除巨痣+皮肤牵张闭合器应用、胸科钢丝内固定联合中厚皮片移植术、巨痣切除+自体表皮细胞修复术、巨痣削除+ReCell细胞再生技术的应用、巨痣切除+皮肤扩张术、巨痣切除+脱细胞真皮支架+刃厚皮片移植、巨痣削除+组织工程皮肤等14种手术方法治疗儿童巨大黑色素痣,所有患儿均进行术前术后病理检查。
  术后6个月通过门诊复诊、电话、微信对儿童巨痣患者的治疗效果、复发情况、满意度及并发症进行随访,留随访影像资料。术后6个月自然光下,距患儿50cm处目测,将评定疗效及美容效果分为4级标准:优良:色素完全祛除,受区创口边缘正常皮肤无复发色素痣,呈线状瘢痕或扁平瘢痕,皮肤外观接近正常,无瘢痕挛缩,关节活动无异常,供区轻度色沉或接近正常皮肤。良好:色素完全祛除,受区凹陷或瘢痕增生,正常皮肤边缘无复发色素痣,关节功能轻度受限或呈蹼状瘢痕增生,有瘢痕不适症状,供区仅有色素沉着,无瘢痕增生。较好:色素完全祛除,受区瘢痕增生明显,皮肤创口边缘无新发色素痣,瘢痕增生肥厚,关节部位功能受限,边缘皮肤受到牵拉,有瘢痕不适症状,供区轻度瘢痕增生。一般:色素痣祛除或受区有色素痣复发,瘢痕增生,瘢痕上可有色素痣复发,色沉较重,局部功能障碍,组织牵拉移位。
  结果:1118例患者均一期愈合出院。其中优良438例,良好367例,较好219例,一般94例。术前术后病检皮内痣482例,交界痣128例,混合痣508例。采用巨痣切除+刃厚皮片游离移植术101例,巨痣切除+中厚皮片游离移植术111例,巨痣切除+全厚皮片游离移植术118例,巨痣切除+真皮下血管游离移植术118例,巨痣切除+Meek植皮术54例,巨痣切除+微粒皮植皮术59例,分次巨痣切除术139例,分次切除巨痣+皮肤牵张闭合器应用84例,胸科钢丝内固定联合皮片移植术58例,巨痣切除+自体表皮细胞修复术36例,巨痣削除+ReCell细胞再生技术的应用57例,巨痣切除+皮肤扩张术129例,巨痣切除+脱细胞真皮支架+刃厚皮片移植26例,巨痣削除+组织工程皮28例。每次巨痣切(削)继发创面与供区创面之和不超过体表面积的15%。术后随访6~24个月10例患者复发,术后瘢痕明显的患者经点阵激光每月一次抗瘢痕治疗,67例患者瘢痕已经变软、变平,与正常皮肤基本平齐,其余16例患者仍继续抗瘢痕治疗中。所有患儿创面愈合后的外观、功能、复发、色素脱失、色素沉着、恶变、有无瘢痕增生、残余创面的疗效评定均较满意。
  结论:1.对于颜面部、关节功能部位巨痣,根据情况选择全厚皮片移植术、真皮下血管游离移植术或皮肤软组织扩张器。
  2.对于皮损位于隐蔽部位、美容要求不高的躯干部位巨痣,采用Meek微型皮片移植、微粒皮、胸科钢丝内固定联合中厚皮片移植术修复巨痣切除后继发创面,可有效节省自身皮源,缩短创面愈合时间,减少手术次数,花费低,但术后植皮区有少量、不均匀的疤痕存在。
  3.自体表皮细胞培养、ReCell细胞再生技术、脱细胞真皮支架+刃厚皮片移植、组织工程皮、皮肤牵张闭合器修复巨痣切除后继发创面,为临床治疗巨痣切除后创面提供了新的方法和思路。
[博士论文] 胡永青
皮肤病与性病学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 竹红乙素介导的LED光动力对瘢痕疙瘩成纤维细胞活性和凋亡的影响
  目的:
  研究竹红乙素和LED对瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞毒性,探索两者作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞的合适剂量。研究HB-LED光动力对瘢痕疙瘩成纤维细胞活性和凋亡的影响。
  方法:
  1.以皮肤科门诊切除的瘢痕组织,通过组织块法培养得到原代瘢痕组织成纤维细胞。实验分为阴性对照组(negative controll,NC)、HB组、LED组、HB+LED组。阴性对照组只加DMEM培养液,HB组加入竹红乙素,LED组接受LED黄光照射,HB+LED组加入竹红乙素后接受LED黄光的照射。
  2.将瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于96孔板,加药后3h,将LED组、HB+LED组拿至孵育箱外,以LED治疗仪黄光照射各组细胞,不照光的各组如HB组、阴性对照组也以锡箔纸包裹,拿至孵育箱外放置同样的时间。用改良MTT法检测各组细胞的活力。
  3.将瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于6孔板,加入竹红乙素后,将LED组、HB+LED组拿至孵育箱外,以LED治疗仪黄光照射各组细胞、不照光的各组如HB组、阴性对照组也以锡箔纸包裹,拿至孵育箱外放置同样的时间。以不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶分别消化收集各组细胞,PBS洗涤,AnnexinV-FITC避光、室温孵育细胞15min。每管加PI5μL,5min后以流式细胞仪进行检测。以BD FACSDiva7.0软件分析结果。
  结果:
  1.1.以竹红乙素介导的LED光动力处理瘢痕疙瘩成纤维细胞时,3J/cm2是LED黄光的一个合适剂量。
  1.2.在联合3J/cm2的LED黄光的情况下,竹红乙素的半数致死量(IC50)是3.3252×10-7 mol/L。
  2.与阴性对照组(NC)相比,细胞接受处理12h后,在HB+LED组,瘢痕疙瘩成纤维细胞的活性下降50.23%(P<0.001)。单独的HB(1×10-7 mol/L)和单独的LED(3J/cm2)也能导致细胞活性的下降,分别是25.77%(P<0.001),16.57%(P<0.001)。
  3.1.瘢痕疙瘩成纤维细胞被处理后6小时,发生明显的凋亡,以晚期凋亡为主,但是也有明显的早期凋亡。HB-LED组最为明显,瘢痕疙瘩成纤维细胞总凋亡率达到57.3%(P<0.001)。单独HB引致总凋亡率达25.77%.单独LED也能引起凋亡,但作用较弱,与NC相比,P=0.042,<0.05.
  3.2. 在对瘢痕疙瘩成纤维细胞的光动力作用中,竹红乙素和LED之间有协同作用,不只是简单的叠加效应。
  结论:
  1.竹红乙素介导的LED光动力能够有效的降低体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的活性。
  2.竹红乙素介导的LED光动力能够有效诱导体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡。竹红乙素和LED之间有较好的协同作用。
  第二部分 竹红乙素介导的LED光动力对人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡信号通路的影响
  目的:
  研究竹红乙素介导的LED光动力对瘢痕疙瘩成纤维细胞中凋亡相关基因BAX和BCL-2 mRNA、蛋白质水平的影响,以及对细胞中的钙离子水平、caspase-3活性的影响。探讨HB-LED光动力诱发人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的可能信号途径。
  方法:
  1.实时定量PCR检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中凋亡相关基因BAX和BCL-2mRNA水平的变化
  1.1.用Trizol法提取总RNA,将RNA反转录为模板。
  1.2.扩增时,先95℃预变性8 min,然后45个循环,每个循环:95℃×15s,59℃×20s,72℃×30s。
  1.3.用△△Ct法分析结果。
  2.流式胞内染色法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中凋亡相关蛋白BAX和BCL-2水平的变化
  2.1.收集细胞,分组放入流式管内,离心,弃上清,PBS洗2次。
  2.2.加BioLegend固定液,室温避光孵育15min。离心,弃上清。
  2.3.加BioLegend破膜液重悬,离心,弃上清。
  2.4.然后细胞重悬于相应的破膜液中,加荧光标记的抗BAX抗体,抗BCL-2抗体,孵育45min。以FITC标记IgG1和PE标识IgG1做同型对照。
  2.5.以破膜液洗涤细胞2次。最后每管细胞用500μL破膜液重悬,上机检测。
  2.6.用FlowJo10.0.7软件分析目的蛋白质的量。
  3.竹红乙素介导的LED光动力对凋亡早期的瘢痕疙瘩成纤维细胞内钙离子水平的影响
  3.1.处理细胞后,吸除培养液,加入Fluo-3 AM,37℃孵育30min,PBS洗涤2次。
  3.2.将生长有细胞的盖玻片置于共聚焦显微镜上,选择激发波长为488nm,发射波长为530nm,扫描获取图像。钙离子水平用平均荧光强度(mean fluorescenceintensity,MFI)表示,平均荧光强度通过共聚焦显微镜自带的软件(ImagingSoftware for Microscopy)分析获得。
  4.caspase-3活性的测定
  4.1.收集处理过的细胞,PBS洗涤,弃上清,加入裂解缓冲液。
  4.2.将上清按组别小心加入96孔板,每孔再加入乙酰天冬氨缬氨酸对硝基苯胺(Ac-DEVD-pNA),37℃孵育2小时。用酶标仪在405 nm波长处检测样品的吸光度。
  结果:
  1.与阴性对照组相比,HB-LED组,HB组, LED组的BAX mRNA分别增加了72.67%,23.33%,6.61%(P=0.006,<0.05);相反,对比阴性对照组,在以上3组中BCL-2 mRNA的表达则分别下降了48.57%,26.77%和6.73%(P<0.001)。
  2.与阴性对照组相比,HB+LED组的BAX蛋白升高了3倍,而BCL-2蛋白则下降至阴性对照组的17.50%,BAX/BCL-2的比率由阴性对照组的0.1766升高至3.0238。HB组,LED也有相似的变化。
  3.HB+LED组显著增加了瘢痕疙瘩成纤维细胞内的游离钙水平,与阴性对照组相比,升高了2.77倍。
  4.竹红乙素介导的LED光动力可显著增加瘢痕疙瘩成纤维细胞中caspase-3的活性,HB+LED组的caspase-3活性是阴性对照组的5.37倍(P<0.001)。单独的HB和单独的LED也可增加caspase-3活性,分别是阴性对照组的2.37倍和1.15倍(P<0.001,P<0.001)。
  结论:
  竹红乙素联合LED光动力能明显上调瘢痕疙瘩成纤维细胞内BAXmRNA表达,而下调BCL-2 mRNA的表达,在蛋白水平也是如此。此种光动力也上调细胞内游离钙水平和caspase-3活性。线粒体凋亡路径很可能参与了竹红乙素联合LED光动力导致的细胞凋亡。
[博士论文] 曲燕
皮肤性病学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:比较10600nm CO2点阵激光照射和外用维A酸制剂对Wistar大鼠皮肤的组织学和超微结构改变。初步探讨10600nm CO2点阵激光和维A酸治疗效果的长效性和时效性,为临床实践提供参考。
  方法:选取45只雌性Wistar大鼠,随机分为9组,将背部皮肤作为实验观察区,进行脱毛后用十字形标记线将观察区分为四部分:近头端左侧为正常对照组(A区),近尾端左侧为维A酸组(B区),近尾端右侧为联合治疗组(C区),近头端右侧为点阵激光组(D区)。C区和D区于实验开始时照射10600CO2点阵激光1次,参数设置:能量15mJ,能量密度5%,频率300Hz,图形为方形,10mm×10mm;激光照射完毕后B区和C区开始每日外擦0.025%维A酸乳膏,持续3周。分别在第3天、第1-8周分批处死9组大鼠,每组大鼠取背部4区皮肤组织,在组织切片镜下检测真皮厚度,采用羟脯氨酸试剂盒检测组织中羟脯氨酸含量,Real-time PCR法检测Ⅲ型前胶原mRNA的表达。3周时在透射电镜下观察大鼠皮肤的超微结构改变。
  结果:①自3周至8周,各治疗组(B、C、D)Wistar大鼠真皮厚度较正常对照组(A)增加(P<0.05);2~4周点阵激光组(D)与维A酸组(B)比较真皮厚度明显增加,差别有统计学意义(P<0.05);2~6周联合治疗组(C)比维A酸组(B)真皮厚度明显增加(P<0.05)。②第3天各治疗组(B、C、D)羟脯氨酸含量较正常组下调,1周时各治疗组(B、C、D)羟脯氨酸含量较正常组(A)升高并持续上调,联合治疗组(C)和点阵激光组(D)于第5周达最大值,维A酸组(B)于第6周达最大值;8周时联合治疗组(C)羟脯氨酸含量仍明显高于其他各组(P<0.05);点阵激光组(D)和维A酸组(B)羟脯氨酸含量于照射后1~4周差别有统计学意义(P<0.05);③3天~1周时点阵激光组(D)Ⅲ前胶原mRNA的表达较正常对照组(A)下调;1周后各治疗组(B、C、D)的Ⅲ前胶原mRNA的表达均较前上升,联合治疗组(C)上升最为明显,并且达峰值最快(3周达峰值,5.61±0.7);④.3周时观察各分区大鼠的皮肤超微结构改变,透射电镜下显示单位面积内各治疗组(B、C、D)胶原数量比正常对照组(A)明显增多,胶原纤维排列方式更加紧致密集。
  结论:维A酸制剂和10600nm CO2点阵激光均具有促进Wistar大鼠皮肤胶原增生和重构的作用,可维持起效至少8周;与维A酸制剂相比,10600nm CO2点阵激光的嫩肤作用起效迅速,维持时间较短;联合应用CO2点阵激光和维A酸制剂能够产生良好的协同作用。
[硕士论文] 杨刚
中西医结合临床(皮肤性病学) 南京中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:观察青蒿鳖甲汤加减联合窄谱中波紫外线(NB-UVB)与单用青蒿鳖甲汤加减治疗结节性痒疹临床疗效。
  方法:本研究选择的结节性痒疹患者均来自江苏省中医院皮肤科门诊病例,将符合纳入标准的36例结节性痒疹患者分为治疗组、对照组,每组各18例。治疗组予以青蒿鳖甲汤加减联合窄谱中波紫外线(NB-UVB),中药每日1剂,水煎2次,共计500ml,分早晚饭后半小时后服用,同时予以NB-UVB照射,每周2次,初始剂量为0.5J/cm2,如照射部位无红斑或仅轻度反应,则每次增加原剂量的20%;反之则维持原治疗剂量。对照组单用青蒿鳖甲汤加减治疗,服用方法同治疗组。两组患者均使用江苏省中医院院内制剂大风子酊,每天3次外用。分别在第2周、第4周和第8周观察临床疗效,记录治疗组及对照组的人口学资料、PIP评分[1]、VAS评分、DLQI评分,最后进行统计分析。
  结果:第2周、第4周、第8周两组患者组内综合评分比较P<0.05,差异有统计学意义,两组患者临床症状均有改善。在第2周治疗组与对照组组间比较P>0.05,差异无统计学意义,两组患者疗效无明显差别。第4周和第8周治疗组与对照组组间比较P<0.05,差异有统计学意义,治疗组疗效优于对照组。
  两组患者组内治疗前后生活质量评分比较,治疗前后患者生活质量评分P<0.05,差异有统计学意义,两组患者治疗前后生活质量评分均有改善。第8周治疗组与对照组组间比较P<0.05,差异有统计学意义,说明治疗组较对照组患者生活质量评分明显改善。
  治疗8周后,治疗组总有效率为88.8%,对照组总有效率为77.8%。治疗组与对照组综合疗效比较P<0.05,差异有统计学意义,说明治疗组综合疗效优于对照组。
  结论:青蒿鳖甲汤加减及青蒿鳖甲汤加减联合窄谱中波紫外线(NB-UVB)治疗结节性痒疹均有较好的临床疗效。青蒿鳖甲汤加减联合窄谱中波紫外线(NB-UVB)可减轻单用NB-UVB治疗的副作用,安全有效,值得推广应用。
[硕士论文] 李炳旻
皮肤病与性病学 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:吡非尼酮是一种具有抗纤维化功能的药物,目前主要用于特发性肺纤维化的治疗。其主要的作用机制为抗纤维化、抗炎及抗氧化。其中,抗纤维化作用是通过抑制或调控TGF-β、IL-1β、CTGF、α-SMA、PDGF等信号分子的产生来实现。增生性瘢痕是皮肤科的常见病,大量研究表明其发病机制可能与TGF-β/Smad通路异常有关。因此,我们提出设想:吡非尼酮能够抑制瘢痕的增生吗?
  目的:
  建立兔耳瘢痕模型,探究口服或外用吡非尼酮对兔耳增生性瘢痕的影响,并对其作用机制进行初步探究,研究吡非尼酮对兔耳瘢痕模型中TGF-β/Smad通路的影响。
  方法:
  将20只日本大耳白兔(2.0~2.5kg)随机分为四组,A、B、C三组建立兔耳增生性瘢痕模型。14天后,待创面基本实现上皮化,A组予0.5%吡非尼酮与食物混合饲养;B组予8%吡非尼酮软膏外用;C组为瘢痕对照;D组为正常皮肤对照(不做任何处理)。造模2月后分别测量瘢痕厚度,处死实验动物并对瘢痕组织/正常皮肤标本进行HE染色、Masson染色,了解各组瘢痕组织的病理学改变。最后,采用Western-blot的方法检测兔耳增生瘢痕组织中TGF-β1,Smad2,Smad3,Smad4蛋白表达情况。
  结果:
  口服吡非尼酮组(A组)瘢痕平均厚度为1.79±0.32cm,外用吡非尼酮组(B组)瘢痕平均厚度为1.95±0.39cm,瘢痕对照组(C组)瘢痕平均厚度为1.99±0.43cm,A组小于B,C组,差异有统计学意义(P<0.05);HE染色、Masson染色可见A组胶原结构排列较B、C组疏松。Western-blot结果显示口服吡非尼酮组TGF-β1,Smad2,Smad3,Smad4表达均低于瘢痕对照组,外用吡非尼酮组TGF-β1,Smad2,Smad3,Smad4表达量下降程度不及口服吡非尼酮组。
  结论:
  口服吡非尼酮对兔耳增生性瘢痕有一定的抑制作用,外用8%吡非尼酮效果不显著。在口服吡非尼酮组兔耳增生性瘢痕组织中,TGF-β1,Smad2,Smad3,Smad4蛋白表达均下降,说明口服吡非尼酮抑制兔耳瘢痕增生可能通过TGF-β/Smad通路实现,即通过抑制TGF-β1表达,下调Smad2,Smad3,Smad4的表达,从而抑制胶原的增生。
[博士论文] 宋峰
外科学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  皮肤是人体面积最大的器官,覆盖全身,发挥着保护、感觉、调节体温、分泌与排泄、吸收、代谢、免疫等作用。作为人体的第一道屏障,皮肤直接与外界接触,各种物理、化学、生物等因素都能引起皮肤的损伤,不及时有效治疗会给患者带来极大痛苦,甚至威胁生命。对于皮肤缺损,传统的治疗方法是进行皮肤移植或皮瓣移植术,但存在供体不足和免疫排斥等问题。
  组织工程皮肤(Tissue Engineering Skin,TES)是将种子细胞与细胞外基质替代物混合制成的人工皮肤,可用于创面修复,重建皮肤功能,具有良好的发展前景。现在已能制备比较成熟的表皮-真皮组织工程皮肤,基本能够快速覆盖创面,但是缺乏毛囊等皮肤附属器。毛囊含有丰富的毛囊干细胞,在皮肤创伤的修复、重建中有重要作用。毛囊所生长出的毛发除了调节体温、分泌与排泄等基本功能之外,对于人类还有影响美观,进而进一步影响心理及社交的作用。构建有毛发生长能力的组织工程皮肤不但能促进皮肤损伤修复,还可以重建皮肤功能,而且对于脱发等疾病有一定治疗作用。
  研究目的:
  1.观察毛囊胚胎发育及毛囊干细胞动态衍变过程,探讨毛囊的发生、发展过程,为寻找有诱导毛发形成能力的种子细胞提供依据。
  2.掌握体外构建表皮-真皮组织工程皮肤的技术及明确移植后的体内转归,探讨表皮-真皮组织工程皮肤的皮肤缺损修复以及毛发生长能力。
  3.寻找具有诱导毛发形成能力的种子细胞,明确其能维持诱导能力的培养方式及构建方式,为构建有毛发生长能力的组织工程皮肤奠定基础。
  4.构建有毛发生长能力的组织工程皮肤并修复皮肤缺损。
  研究方法:
  1.以C57BL/6不同胎龄胎鼠的皮肤为模型,通过HE染色观察毛囊胚胎发育过程,免疫荧光染色标记相关毛囊干细胞并观察毛囊干细胞动态衍变过程。
  2.分离、培养儿童包皮表皮细胞及真皮成纤维细胞,以自制SD大鼠鼠尾胶原为基质,应用气-液面培养,构建表皮-真皮组织工程皮肤。制备大鼠背部急性全层皮肤损伤模型,将构建的表皮-真皮组织工程皮肤覆盖伤口,观察其体内转归。将原代培养的成人毛乳头细胞与成人毛囊干细胞以上述方式制备组织工程皮肤,并进行体内移植观察其转归。
  3.将新鲜分离的C57BL/6新生鼠(24小时以内)真皮细胞、贴壁培养的原代真皮细胞、悬浮培养的原代真皮细胞以及悬浮培养后吹打成单细胞悬液,和表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部制备的皮肤全层缺损处,三周后观察毛发生长情况并组织学染色观察毛囊结构。将C57BL/6成鼠胡须毛乳头细胞P1代与新鲜分离的新生鼠表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,植入C57BL/6小鼠肾外膜下,三周后进行观察。
  4.将成人头皮来源毛乳头细胞、儿童包皮成纤维细胞、人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞分别复合儿童包皮表皮细胞为种子细胞,进行2D或3D的构建及培养方式,将其移植裸鼠体内,验证不同种子细胞毛发形成能力的异同,寻找能稳定诱导毛发形成的种子细胞。
  5.以儿童包皮来源的表皮细胞和成纤维细胞为种子细胞,使用3D打印的方法在表皮-真皮组织工程皮肤的真皮层中打印毛囊样3D结构,构建有毛发生长能力的组织工程皮肤;此外,还以人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞混合儿童包皮来源的表皮细胞为种子细胞直接构建有毛发生长能力的组织工程皮肤;将构建的组织工程皮肤移植裸鼠体内修复皮肤缺损并观察有无毛发生长能力。
  研究结果:
  1.毛囊胚胎发育及相关毛囊干细胞动态衍变过程
  (1)HE染色显示:C57BL/6小鼠从胚胎发育E14.5天开始出现表皮局部增厚,形成基板,真皮细胞在下方聚集;E15.5天增厚的表皮细胞逐渐形成毛芽,基板下方聚集的真皮细胞开始被形成的毛芽包裹;E16.5-E17.5天毛芽进一步发育,真皮细胞逐渐被毛芽包裹,形成毛囊的毛乳头结构;E18.5天至出生后,继续完成毛囊的胚胎发育,出生时毛囊的结构基本形成。
  (2)毛囊干细胞免疫荧光标记显示:随着毛囊发育和延长,标记的毛囊干细胞呈时空动态表达。
  2.体外构建的表皮-真皮组织工程皮肤
  (1)体外构建的表皮-真皮组织工程皮肤气-液面培养5天后,HE染色可观察到表皮和真皮两层结构,且表皮呈现复层化。表皮细胞及成纤维细胞状态良好,分布均匀。胶原蛋白交织成网将成纤维细胞固定在基质中。移植3周后,皮肤创口处完全愈合,与周围组织紧密连接,未见毛发;组织学显示缺损处皮肤形成表皮、真皮双层结构,且表皮复层化,未见毛囊结构。
  (2)将原代培养的成人毛乳头细胞与成人毛囊干细胞以上述方式制备的组织工程皮肤植入裸鼠体内三周后也未见毛发生长,组织学染色观察未见毛囊结构。
  3.寻找具有诱导毛囊形成能力的种子细胞
  (1)新鲜分离的C57BL/6新生鼠真皮细胞和表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部制备的皮肤全层缺损处三周后可见黑色毛发生长。
  (2)贴壁培养的原代真皮细胞组,三周后未见毛发生长,组织学染色未见毛囊结构;而在悬浮培养的原代真皮细胞组,三周后可见黑色毛发生长;悬浮培养的原代真皮细胞吹打成单细胞悬液组,三周后无毛发生长。提示3D悬浮培养可保留新生鼠原代真皮细胞的诱导毛发形成能力。
  (3)C57BL/6成鼠胡须毛乳头细胞P1代与新鲜分离的新生鼠表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,植入C57BL/6小鼠肾外膜下三周后可见黑色毛发生长,组织学染色观察见毛囊结构。
  (4)成人毛乳头细胞P1与新鲜分离的儿童包皮表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,移植至裸小鼠背部皮肤皮下观察3周,见白色毛纤维生长。
  (5)儿童包皮成纤维细胞P1与新鲜分离的儿童包皮表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,移植至裸小鼠背部皮下观察3周,见白色毛纤维生长。植入皮内,导丝引导,三周后有白色毛纤维长出,经线粒体DNA检测毛发含有人类源性的DNA。
  (6)人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞、新鲜分离的新生鼠表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部皮下能长出黑色毛发。入神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞、新鲜分离的儿童包皮来源表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部皮下能长出黑色毛发。
  4.构建带有毛囊的表皮-真皮组织工程皮肤
  (1)使用3D打印方法在表皮-真皮组织工程皮肤的真皮层中打印含儿童包皮来源表皮细胞和成纤维细胞的毛囊样3D结构,将构建的组织工程皮肤移植到裸鼠背部全层皮肤缺损处,三周后可见白色毛发。
  (2)人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞与新鲜分离的儿童包皮表皮细胞混合制备组织工程皮肤,皮下移植及移植到裸鼠背部全层皮肤缺损处,三周后可见黑色毛发。
  研究结论:
  1.毛囊胚胎发育及相关毛囊干细胞动态衍变过程
  毛囊胚胎发育进一步确认了毛囊的胚胎发育是表皮细胞与真皮细胞相互作用的结果,E14.5-E17.5是C57BL/6毛囊形态学发育的关键时间。
  2.构建表皮-真皮组织工程皮肤
  (1)体外构建的表皮-真皮组织工程皮肤经气-液面培养5天后呈现表皮、真皮双层结构,表皮呈现复层化。体外移植至裸鼠全层皮肤创伤模型能使皮肤创口的愈合良好。
  (2)培养的人毛乳头细胞以单细胞的方式接种于真皮层中表皮-真皮组织工程皮肤体内移植后不具备形成毛发的能力。
  3.寻找能够诱导毛发形成的种子细胞
  (1)能够诱导毛发形成的细胞制备成类似毛囊样3D结构,并经3D培养后,可较好的维持其诱导毛囊形成的能力。
  (2)儿童包皮的成纤维细胞与表皮细胞制备成类似毛囊样的3D结构具有诱导毛发形成的能力,但是所生长出的毛发不含黑色素。
  (3)人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞具有良好的诱导毛发形成的能力,并且长出的毛发是含黑色素的。
  4.构建带有毛囊的表皮-真皮组织工程皮肤
  (1)使用3D打印机将能诱导毛发形成的种子细胞在表皮-真皮组织工程皮肤的真皮层上接种成含种子细胞的3D结构,体内移植3周后可构建带有白色毛发的表皮-真皮组织工程皮肤。
  (2)入神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞与新鲜分离的儿童包皮细胞制备成表皮-真皮组织工程皮肤皮下移植及移植到裸鼠体内,可构建带有黑色毛发的表皮-真皮组织工程皮肤。
[硕士论文] 林佳婷
针灸推拿学 广州中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过观察患者治疗前后主客观症状及生活质量评分的改变,科学地评价针刺治疗血热风盛型敏感性皮肤综合征的临床疗效,以期为为临床上治疗敏感性皮肤综合征提供新的临床思路。
  方法:
  考虑临床15%的脱落率,本次研究一共从广州中医药大学第一附属医院针灸科、皮肤科选取符合纳入标准69例血热风盛型敏感性皮肤综合征的患者,随机分为两组,治疗组34例,对照组35例。针刺治疗组,运用针刺疗法隔日治疗一次,治疗7次为一疗程,连续治疗3个疗程。1%吡美莫司对照组30例,面部局部部外涂1%吡美莫司软膏,一日两次,间隔12小时,10天为一个疗程,一共治疗3个疗程。两组不治疗时配合外擦维生素E软膏和冷喷。通过对观察纪录治疗前后皮损症状评分,计算总积分,评估生活质量、总体疗效,建立好数据库,进行统计学分析,对两种方法的疗效进行对比评价。
  结果:
  1.最终入选统计学分析患者共60人,治疗组、对照组各30例。治疗后,两组患者客观症状中毛细血管的评分,治疗组:1.23±0.504,对照组:0.83±0.699,P<0.05,差异有统计学意义,说明对照组在改善毛细血管扩张方面优于治疗组。其余症状组间对比及症状总积分差异没有统计学意义,说明两组治疗方法对其他症状的改善疗效相当。治疗前后的症状总积分对比,差异有统计学意义,P<0.05,说明两组治疗均有疗效。
  2.两组的生活质量评分较治疗前均明显改善,治疗前后的比较差异有统计学意义(P<0.05),两组组间对比的差异没有统计学意义,说明两种治疗方法对患者生活质量均有改善,且两组疗效相当。
  3.治疗后,治疗组总有效率86.7%,对照组93.3%,对照组有效率优于治疗组,两者差异无统计学意义(P>0.05),说明两种治疗方法均有一定疗效。
  结论:
  两种疗法对血热风盛型敏感性皮肤综合征均有确切疗效,对主客观症状都有明显改善。吡美莫司乳膏在改善患毛细血管扩张方面比针刺疗法较好,但在总症状积分、总有效率、生活质量方面,针刺组与吡美莫司组没有明显差异,吡美莫司是临床上治疗敏感性皮肤综合征的一线药物,针刺在治疗上几乎达到了同样的治疗效果,因此针刺疗法治疗血热风盛型敏感性皮肤征合症是有效的,操作方便,绿色安全,无毒副作用,在临床上值得推广。
[硕士论文] 彭霖
皮肤病与性病学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2017(学位年度)
摘要:目的:评价皮秒翠绿宝石激光治疗雀斑的有效性和安全性。
  方法:入组20名受试者,采用随机、盲法、自身对照研究。分别使用皮秒和Q开关翠绿宝石激光,各治疗1次,疗后8周±5天随访1次。评价皮损清除计数、GAIS评分、受试者满意度以及疼痛程度,同时评价不良反应。
  结果:1次治疗后,试验侧及对照侧皮损清除计数分别为68.20±12.30、68.60±11.80,无统计学差异(P>0.05);两组GAIS评分、疼痛程度及受试者满意度无统计学差异。两组能量密度存在差异,PSAL侧平均能量密度低于QSAL侧。术后不良反应主要表现为轻中度红斑、水肿、结痂,两组间无统计学差异(P>0.05)。
  结论:皮秒翠绿宝石激光治疗雀斑的疗效及安全性与Q开关翠绿宝石激光相当,但所需的能量密度更低。
[硕士论文] 刘万成
微生物学 中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学 2017(学位年度)
摘要:自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID)是一类由多种因素导致的慢性炎症性疾病,发病机制复杂,至今尚未完全阐明。目前临床治疗这类疾病的药物疗效不佳,副作用大,导致疾病反复发作。越来越多的研究显示,AID与固有免疫和适应性免疫紊乱密切相关。其中,在固有免疫系统激活过程中,模式识别受体(pattern recognitionreceptor,PRRs)扮演着重要角色,它们能特异性识别病原相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMPs),从而活化相关信号通路导致一系列免疫炎症反应。然而正是这些受体的过度活化,导致一系列AID的发生,如类风湿性关节炎(RA),系统性红斑狼疮(SLE)和银屑病(Psoriasis)。那么,探索并围绕AID发病机制寻找药物靶标,已成为当今治疗免疫性疾病的突破口。
  重要的PRRs有Toll样受体(TLRs)和NOD样受体(NLRs),它们能够特异性地识别病毒、细菌、真菌和寄生虫特定的组分,构成了固有免疫的第一防线。在TLRs家族中,根据其亚细胞定位可分为两大类,即:细胞膜表面TLRs(TLR4/MD-2,TLR1,TLR2和TLR6)和位于内质网和内体上的细胞内型TLRs(TLR3,TLR7/8和TLR9)。然而,值得注意的是,第一、TLRs受体的识别具有特异性,比如:TLR3和TLR7/8识别病毒dsRNA和ssRNA,而TLR9识别微生物DNA产生的未甲基化CpG基序;第二、不同的TLRs对应的下游信号通路不同,如:TLR3通过TRIF信号通路,TLR7通过MyD88,导致大量炎症因子(TNF-α、IL-6和干扰素等)的释放。
  NLRs作为另一类重要的细胞内型PRRs,参与识别宿主来源和微生物的损伤相关分子(damage associated molecular patterns,DAMPs)。其中NLRP3作为NLRs蛋白家族成员之一,广泛表达于DCs和巨噬细胞。由NLRP3、ASC和无活性的caspase-1前体组成的复合体称为NLRP3炎症小体,具有调控机体慢性炎症反应的功能,是内源性或外源性危险信号的胞质内感受器。它能够活化caspase-1,调控IL-1β和IL-18等促炎因子的成熟和分泌。
  近年来,越来越多的研究显示AID与固有免疫中的多种PRRs的过度活化密切相关。然而,不同PRRs具有各自对应的信号通路,这种多对多的方式,使得在信号通路上寻找治疗靶位,变得尤为复杂。为了对抗这种多因子诱发的炎症反应,目前的药物开发侧重于效应阶段的遏制,譬如,在治疗银屑病时,采用TNF-α、IL-17或IL-23的抗体。尽管这种后端靶标的治疗策略,能够改善炎症因子发生后续的免疫损伤,但是对免疫的干预面太大,而伴随着免疫系统损耗,严重感染等不良反应。因此,如果在致病前端过程,寻找有效的靶标,阻断免疫系统激活,降低副作用,这将是一个更好的策略。但前端受体较多,目前仍然没有发现合适的靶标与药物。
  我们前期报道了一段包含未甲基化CpG结构的20bp寡聚核苷酸(CpG-ODN)序列,命名为CpG-c41(5'-TGGCGCGCACCCACGGCCTG-3'),可高效抑制TLR9介导的炎症反应。后来研究发现,CpG-c41亦可显著抑制TLR7的活化,改善由酵母多糖(Zymosan)诱导的RA炎症,说明其具有了成药可能。然而,CpG-c41安全性如何,对其它TLRs是否也有影响,是否对于AID起到很好的治疗作用。为了探究CpG-c41在一定范围内的安全性和免疫学作用特点,在本课题我们进行了以下研究:
  目的:
  对通过生物信息学技术,高通量筛选出的无免疫刺激性CpG-c41分子,进行初步安全性评价;探究其对不同TLRs介导的免疫学效应的影响及其机制;构建咪喹莫特乳膏(Imiquimod,IMQ)诱导的银屑病样小鼠模型,观察CpG-c41对该模型的治疗作用。
  方法:
  1、CpG-c41初步安全性评价
  动物急性毒性试验,Balb/c小鼠12只,雌雄各半,分为实验组和对照组,每组6只。实验组一次性尾静脉注射治疗剂量10倍(80mg/kg)的CpG-c41,对照组尾静脉注射等体积生理盐水(norman saline,NS),初步观察CpG-c41对动物的急性危害性质和危害强度。
  体外细胞毒性实验,通过CCK-8实验观察高浓度下CpG-c41(2-64μM)对于L929细胞活性的影响。
  2、CpG-c41对不同TLRs介导的免疫学效应研究
  (1) CpG-c41对不同TLRs介导的炎症因子释放的影响
  体外实验,使用TLR2,3,4,7/8,9激动剂分别刺激BMDMs,BMDCs和Thp-1细胞,另外联合使用TLR3,7/8,9激动剂中的两种刺激RAW264.7,同时给予CpG-c41(4μM)进行干预。24h后ELISA检测各组细胞上清中TNF-α、IL-6表达水平。各激动剂终浓度:TLR2激动剂(Zymosan,200μg/ml),TLR3激动剂(Poly(I∶C),100μg/ml),TLR4激动剂(LPS,100ng/ml),TLR7激动剂(Imiquimod,2μg/ml),TLR7/8激动剂(ssRNA120,30μg/ml)与DOTAP混合后使用,TLR7激动剂(R848,0.2μg/ml)和TLR9激动剂(CPG-1826,2μM)。
  体内实验,野生型(WT)小鼠(18-20g)腹腔分别注射TLR3,7,9激动剂,治疗组尾静脉注射CpG-c41(320μg/20g),安慰剂组尾静脉注射等体积生理盐水。ELISA检测各组各时相点血清中TNF-α、IL-6、IFN-α和IL-12/23p40的水平。各激动剂终浓度:TLR3激动剂(polyI∶C,40μg/20g),TLR7激动剂(R848,10μg/20g)和TLR9激动剂(CpG-1826,160μg/20g)。
  (2) CpG-c41对胞内型TLRs介导的炎症小体形成和活化的干扰
  使用TLR3,4,7,9激动剂分别刺激WT BMDMs和RAW264.7细胞,同时给予CpG-c41(8μM)进行干预,4h后加入ATP诱导30min。Western blot检测各组在BMDMs细胞中NLRP3和Caspase-1蛋白变化;ELISA检测RAW264.7细胞上清中IL-1β的水平。各激动剂终浓度:TLR3激动剂(Poly(I∶C),100μg/ml),TLR4激动剂(LPS,100ng/ml),TLR7激动剂(R848,1μg/ml)和TLR9激动剂(CPG-1826,3μM)
  结果:
  1、CpG-c41初步安全性评价
  动物急性毒性实验发现,实验组和对照组均未出现明显不良症状;L929细胞毒性试验显示,各梯度浓度CpG-c41组L929细胞活性与对照组无差异(p>0.05)。表明,在实验浓度范围内,作为核酸序列的CpG-c41安全性良好。
  2、CpG-c41选择性抑制胞内型TLRs介导的免疫反应
  (1)CpG-c41降低胞内型TLRs介导的炎症因子释放
  DCs和巨噬细胞是主要的固有免疫细胞,表达多种TLRs。所以我们以BMDMs和BMDCs细胞为对象,采用不同的TLRs激动剂进行刺激,同时加入CpG-c41进行干预。ELISA检测发现,各TLRs激动剂均能诱导大量TNF-α和IL-6的产生。而CpG-c41选择性的抑制TLR3、7和9激动剂诱导的炎症因子释放(P<0.01),但是对于TLR2/4无此作用(P>0.05)。
  由于小鼠免疫细胞不表达TLR8,所以我们使用人THP-1为研究细胞。使用本课题组前期开发的TLR7/8激动剂ssRNA120进行刺激,同时加入CpG-c41进行干预。ELISA检测发现,ssRNA120能诱导该细胞产生大量前炎症因子。而CpG-c41能够显著抑制这些因子的释放(P<0.01)。
  (2)CpG-c41抑制胞内型TLRs介导的炎症小体形成和活化
  Western blot和ELISA检测发现LPS、R848和CPG-1826能够有效诱导NLRP3表达,caspase-1的产生和IL-1β的释放,而CpG-c41选择性降低由TLR7和9介导的这一效应(P<0.01),对于TLR4介导的无影响(P>0.05)。有报道称,TLR3激动剂也可有效诱导NLRP3炎症小体的形成和活化,但在本次实验中未能检测该效应。
  结论:
  1、CpG-c41在高剂量下对于动物和细胞均未发现急性毒副作用,同时由于CpG-ODN与核酸代谢类似,初步提示在实验范围浓度内,CpG-c41安全性良好。
  2、体内外实验一致显示,CpG-c41有效抑制胞内型TLRs介导的炎症反应,并且能够有效抑制由胞内型TLRs介导的炎症小体形成和活化。而这种多重免疫抑制效应在TLR9-/-条件下仍然存在,表明CpG-c41的免疫抑制效应机制非依赖于TLR9。
  3、CpG-c41能够显著阻断银屑病样小鼠模型皮损处免疫细胞浸润和炎症因子的产生,病情得到改善,鳞屑减少。提示CpG-c41可有效缓解IMQ诱导的银屑病样小鼠模型皮损症状。
[硕士论文] 杨航
皮肤病与性病学 中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)是利用光敏剂、氧气和特定波长的光照共同作用产生的氧化还原反应进行治疗的方法。近年来,光动力治疗在皮肤科广泛应用并取得了令人欣喜的疗效,其适应症包括多种皮肤病,如痤疮、日光性角化、鳞状细胞癌、基底细胞癌、尖锐湿疣和细菌、真菌感染性皮肤病等。在治疗过程中,研究者们发现了一个很有趣的现象,高剂量的PDT主要用来杀灭肿瘤细胞和微生物,低剂量的PDT对皮肤的效果则不同。越来越多的研究表明,低剂量PDT有治疗光老化、促进细胞增殖、加速皮肤愈合的作用,甚至有研究用低剂量PDT预防移植后高危人群的光老化和皮肤癌的发生。有多组实验应用自体双侧面部对照研究发现,PDT治疗侧的肤质、皱纹、肤色比对照侧有显著的改善。而2016年的美国皮肤外科学会(American Society for Dermatologic Surgery,ASDS)临床共识指南也指导PDT应用于嫩肤中。既往对于光动力治疗机制的研究主要集中在高剂量杀灭肿瘤细胞、炎症细胞和微生物方面,而低剂量光动力对于皮肤细胞的生物学作用及相关机制探讨较少,仍有许多不清楚的地方。单态氧是PDT治疗的核心因素,既往的研究表明,不同的光源和光敏剂、不同的作用部位、不同的细胞等产生的PDT的最终氧化应激效应并不相同。而核转录因子NF-E2相关因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor2,Nrf2)是氧化应激反应中的关键因子,调控下游抗氧化蛋白和生长因子等的表达,在皮肤光老化的治疗和细胞防御保护中也发挥着重要作用。ALA(5-aminolevulinic acid)-PDT对皮肤细胞生长的影响和Nrf2及其相关因子是否在低剂量ALA-PDT嫩肤的过程起着重要作用等问题值得深入研究。
  方法:
  1.观察ALA-PDT处理后角质形成细胞和成纤维细胞的细胞形态变化;
  2.用MTT法判断ALA-PDT对角质形成细胞和成纤维细胞增殖的影响;
  3.用ELISA分析ALA-PDT对成纤维细胞分泌bFGF和VEGF的影响;
  4.用WST-8法检测ALA-PDT处理成纤维细胞后SOD的活力变化;
  5.用免疫印迹法分析ALA-PDT处理后的成纤维细胞中Nrf2、TGF-β1和MMP-9的变化。
  结果:
  1.ALA-PDT对人皮肤细胞生长的影响
  (1)倒置显微镜下,高剂量ALA-PDT(1mM,48J/cm2)干预后48h,可见少分HaCaT细胞、角质形成细胞和成纤维细胞死亡。
  (2)MTT结果显示,ALA浓度为0.1mM时,21J/cm2和42J/cm2两种能量的光照后24h,HaCaT细胞、角质形成细胞和成纤维细胞增殖与单纯红光组无明显差异;48h后,低剂量ALA-PDT(0.1mM,21J/cm2)干预后三种细胞都表现出增殖的趋势,而高剂量(1mM,48J/cm2)则抑制。
  2.ALA-PDT对成纤维细胞Nrf2和相关因子表达的作用研究
  (1)ELISA结果显示,高剂量ALA-PDT(1mM,48J/cm2)组和低剂量ALA-PDT(0.1mM,21J/cm2)组的bFGF浓度都呈现上升趋势,而尤以24h时上升趋势最为明显。而针对VEGF浓度,高低两种能量作用下,三种ALA浓度(0、0.1mM和1mM)处理的成纤维细胞都出现了VEGF的增高,PDT干预组VEGF高于单纯红光组,干预后48h增高更明显。
  (2)ALA-PDT干预后1h,各剂量组间SOD活力差异不明显;6h后,可见低剂量组SOD的活力明显上升,而高剂量组明显下降。
  (3)WesternBlot结果可见,低能量ALA-PDT作用后1h,Nrf2、TGF-β1和MMP-9的表达增加,低剂量组Nrf2的量高于高剂量组;6h后各剂量组TGF-β1仍有增加,Nrf2差异却不明显,而高剂量MMP-9有所下降。另外,24h后,两个PDT组中Nrf2再次出现升高;单纯红光组、低剂量组、高剂量组MMP-9相比于0h都有明显下降,两个剂量PDT组在48h时没有条带;而三个组TGF-β124h和48h时仍在增加,且PDT组上升较单纯红光组更为明显。
  结论:
  1.低剂量ALA-PDT能一定程度的促进角质形成细胞和成纤维细胞生长;
  2.低剂量ALA-PDT能上调成纤维细胞Nrf2表达;
  3.低剂量ALA-PDT能促进成纤维细胞bFGF和VEGF的分泌,上调TGF-β1的表达,同时在短时相内促进MMP-9的表达,长时相则抑制MMP-9;
  4.低剂量ALA-PDT能增加SOD的活力发挥抗氧化还原反应,保护细胞。
[硕士论文] 王雪丽
外科学(整形) 中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学 2017(学位年度)
摘要:瘢痕疙瘩(Keloid)是皮肤损伤异常愈合后的结果,以纤维基质过度沉积为主要特点,生长面积常超出损伤范围,呈肿瘤样侵袭性生长,并伴随疼痛瘙痒等症状,严重影响容貌,常导致患者严重的身心健康障碍。目前Keloid形成机制研究仍未取得突破性进展,因外科切除、药物以及放射治疗均不能达到良好的治疗效果,且容易复发,这一问题亟需解决。近年来,干细胞的相关研究涉及多个领域,因其具有多向分化能力,在特定的诱导条件下可分化成为目的细胞修复损伤和功能萎缩的组织,使之成为研究热点,且Moon等[1]在2008年从Keloid中分离出一类具有增殖分化潜能的多能干细胞KMLSCs(Keloid-derived mesenchymal stem cells),这些细胞通过失控性自我更新、增强细胞增殖和药物抵抗而实现调控Keloid的致病过程[1-3],但是具体的致病机制尚不甚清楚。骨母特异性因子2(osteoblast-specific factor2,Periostin),是细胞外基质中具有中轴意义的因子,主要参与肿瘤局部基质干细胞功能的维持,阻断Periostin,可抑制肿瘤转移。既往研究发现,Periostin在瘢痕中的表达明显高于正常皮肤,可能与瘢痕形成相关,该蛋白异位表达,可促进MSCs(Mesenchymal stem cells)迁移、侵袭、附着等[4,5]。在对胃癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的相关研究中发现,Periostin与肿瘤的恶性程度和转移之间存在密切联系,这说明Periostin可能是肿瘤形成过程中一个重要分子。此外,研究表明Periostin可促进脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,hADSCs)、人角膜干细胞(human limbal stem cells,hLECs)以及神经干细胞(neural stem cells,NSCs)等[6-踟的增殖,抑制凋亡从而参与相关组织器官癌变过程,但是Periostin是否调控瘢痕疙瘩微环境内间充质干细胞的增殖而参与瘢痕疙瘩的发病过程尚不清楚,故研究Periostin与KMLSCs之间相互关系在瘢痕疙瘩发生发展中作用尤为重要。
  目的:
  探讨Periostin对瘢痕疙瘩间充质干细胞体外增殖的影响。
  方法:
  1.临床标本选择标准
  年龄在5~30岁之间,性别不限;
  在我科明确诊断为“瘢痕疙瘩”者;
  无心、肝、脾、肺等系统的器质性病变;
  无其他系统的纤维性病变;
  首次进行瘢痕治疗;
  瘢痕疙瘩和正常皮肤均来自同一个体。
  2.瘢痕疙瘩干细胞(KMLSCs)的分离
  将西南医院整形科提供的无菌瘢痕疙瘩组织以及同体正常皮肤组织分为两组,即瘢痕疙瘩组和同体正常皮肤组,结合组织培养法和消化法,在相同条件下分离瘢痕疙瘩和同体正常皮肤组织的细胞,干细胞专用培养基终止消化后,加入培养基直接进行贴壁培养,在光学显微镜下观察细胞的形态和均一程度,通过酶消化法传代培养至第3代后,利用细胞免疫荧光技术和流式细胞术进行鉴别,最后通过流式细胞术进行干细胞分选,获得具有活性的目的干细胞。
  3.Periostin对KMLSCs增殖影响的体外实验研究
  利用Western blot、免疫组织化学技术检测瘢痕疙瘩和同体正常皮肤组织中Periostin蛋白的表达差异,通过Western blot、qPCR、免疫细胞化学技术进一步验证KMLSCs和真皮干细胞中Periostin的表达同在同体组织中的表达水平是否一致,然后通过体外构建目的基因的慢病毒干扰表达载体,对目的基因的表达进行人为干预,利用qPCR、Westernblot检测细胞的干扰效率,最后通过MTT、流式细胞术、免疫荧光技术和激光共聚焦技术对细胞的增殖强度、周期与凋亡变化情况以及下游相关分子蛋白LRP5的表达进行检测,阐明Periostin基因对瘢痕疙瘩干细胞增殖的作用,以及可能的机制。
  结果:
  1.成功从瘢痕疙瘩组织中分理处瘢痕疙瘩间充质干细胞(KMLS Cs)。细胞免疫荧光共聚焦检测干细胞标志物发现,分离培养的细胞瘢痕疙瘩间充质干细胞和真皮干细胞均阳性表达CD73,CD90和CD105,阴性表达CD34和CD45,进一步通过流式细胞术检测与分选,CD73+CD90+CD34-的瘢痕疙瘩间充质干细胞纯度高达95.1%,真皮干细胞纯度达到94.9%,符合国际骨髓间充质干细胞的认定标准;
  2.成功分离出干细胞后,利用细胞免疫化学技术和Western Blot检测,结果发现瘢痕疙瘩间充质干细胞中Periostin的表达明显强于其所对应的同体真皮干细胞中的表达(P<0.05):
  3.构建Periostin基因的慢病毒干扰表达载体并感染KMLSCs。利用qPCR、Western blot技术检测感染效率。结果显示,与空载体组和未转染组相比,干扰组Periostin的表达显著降低。
  4.MTT结果示,敲低Periostin可显著抑制体外KMLSCs的增殖(P<0.05),流式细胞术检测发现,同空载体组和未转染组相比较,敲低Periostin基因可促进KMLSCs凋亡,并显著延长KMLSCs的细胞周期;
  5.免疫荧光检测结果示:在KMLSCs中敲低periostin基因后,明显抑制Wnt信号通路中的LRP5蛋白分子的表达(P<0.05)。
  结论:
  1.瘢痕疙瘩组织微环境中可分离培养出间充质干细胞,这些干细胞均阳性表达CD73,CD90,CD105,几乎不表达CD34和CD45,符合国际骨髓间充质干细胞的认定标准;
  2.瘢痕疙瘩间充质干细胞中Periostin的表达显著高于同体真皮干细胞(P<0.05);
  3.Periostin基因慢病毒干扰表达载体可有效干扰Periostin基因表达;
  4.干扰Periostin基因后,可有效抑制KMLSCs增殖能力,促进细胞凋亡,延长细胞周期;
  5.干扰Periostin基因后,可引起Wnt信号通路中辅助受体LRP5蛋白的表达减弱。
[硕士论文] 陈岳峰
外科学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  ⑴解决传统毛发移植手术永久性破坏供区毛囊的问题;⑵减少毛囊移植的操作步骤,保护毛囊活性;⑶根据毛囊上下的结构再生形成新的毛囊结构的原理设计新的的毛囊移植笔;⑷提高再生毛囊的存活率。
  方法:
  ①传统毛囊移植器械的手术方式、所需时间、费用、人数及操作步骤的比较,说明发明新的全功能毛囊移植笔的必要性。②阐述第一、二代全功能毛囊移植笔的结构及其特性。
  结论:
  ⑴提取SD大鼠触须或人了毛囊上段进行移植,保留供发区毛囊的毛球部,保留的毛囊供区仍具有再生的能力,把提取的毛囊上段移植到受发区,具有再生能力的“隆突区”会诱导毛乳头的再生,保证供区和受区的毛发都能够各自再生形成新的毛囊结构。⑵全功能的毛囊移植笔将传统毛囊的提取和移植两种功能合二为一,减少操作步骤,缩短了手术时间,更好的保持毛囊活性。⑶对比传统的手术方式,该手术方式的伤口小,提高了受区毛囊的存活率和再生率。
[硕士论文] 周逸伟
皮肤病与性病学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种以炎症、瘙痒为主的慢性、复发性皮肤病,常伴皮肤功能障碍及个人和(或)家族过敏性疾病史,如过敏性鼻炎及支气管哮喘等。此病常首发于婴儿时期,学龄前儿童发病占患者总数的一半左右,成人也可发病。患者往往有剧烈瘙痒,严重影响其生活质量及身心健康。我国虽无完整的全国发病统计,但从部分地区的数据来看,近年我国特应性皮炎的患病率也呈逐步上升趋势。如2006年对天津0~6岁儿童特应性皮炎患病率调查结果显示,儿童特应性皮炎患病率为2.9%。2012年上海地区流行病学统计结果显示,3~6岁儿童患病率达8.3%,城市显著高于农村(分别为10.2%、4.6%)。
  特应性皮炎的发病原因十分复杂,发病机制也尚未完全清楚。但目前多数学者认为是遗传因素与环境因素相互作用的结果。其发病主要与T细胞的分化、局部细胞因子的活化、IgE的多种化学效应及感染等多种因素有关。其中皮肤屏障功能破坏、免疫功能失常及局部细胞因子的改变可能比过敏性因素发挥了更大作用。而近期研究发现多种植物、昆虫多糖有抗氧化、抗肿瘤的作用,其中白蜡虫多糖抑制肿瘤的效果显著。它通过影响免疫细胞、补体、网状内皮系统等途径在抗肿瘤中起到了重要作用。目前关于白蜡虫多糖的研究较少,而它对免疫性皮肤病的作用及作用机理尚不明确,是一片崭新的领域,仍需对其继续深入探索。
  目的:
  探讨白蜡虫多糖对二硝基氯苯诱导的小鼠特应性皮炎模型的作用及可能的作用机制。
  方法:
  将12只6周大的雄性BALB/c小鼠随机分为白蜡虫多糖组和对照组(每组各6只),12只小鼠全部用DNCB经耳、背部皮肤致敏,以建立特应性皮炎小鼠模型。白蜡虫多糖组(治疗组)在开始建模时,同时予以1mg/g的5%白蜡虫多糖生理盐水溶液灌胃,并测量小鼠耳厚度;生理盐水组(对照组)予以等量的生理盐水灌胃,治疗2,4-二硝基氯苯致敏化小鼠,也测量小鼠耳厚度。两周后处死小鼠并收集血样及背部皮损标本,用ELISA法检测小鼠血清总IgE水平;皮损标本进行石蜡切片HE染色和甲苯胺蓝染色,显微镜下观察皮肤表皮层角质形成细胞的改变与真皮层炎症细胞的浸润情况;提取皮损总RNA,RT-PCR法检测炎症因子IL-6、IFN-γ、IL-17的表达水平。
  结果:
  与生理盐水组相比,白蜡虫多糖组小鼠耳厚度减小,表皮层角质形成细胞异常增生情况明显缓解;白蜡虫多糖组小鼠血清总IgE水平降低,肥大细胞数目减少;在白蜡虫多糖组小鼠中皮损处检测到的IL-6、IFN-γ、IL-17等相关细胞因子表达水平均下降。
  结论:
  白蜡虫多糖可明显缓解二硝基氯苯诱导的特应性皮炎小鼠的症状,降低血清总IgE的水平、改善角质形成细胞异常增生以及肥大细胞的浸润。其作用机制可能是通过下调Th17的分化以及抑制促炎因子IL-6、IFN-γ和IL-17的表达,减轻炎症反应实现的。
[博士论文] 郎宏鑫
细胞生物学 中国医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:皮肤组织创伤是临床及生活中的常见问题,可以由外伤因素,如机械性外伤、烧烫伤、手术等因素,或者全身性疾病如糖尿病所致皮肤受损等引起。皮肤创伤愈合是皮肤受损后机体进行的主动的复杂而有序的病理生理学修复过程。皮肤受损后通过一系列复杂的生理学事件,如凝血,炎症反应,细胞增殖分化,组织重塑[1],伴随着多种细胞因子生长因子以及酶类的参与,这些过程相互重叠又有序进行。瘢痕组织形成是成体皮肤创伤愈合的终末状态,成熟的瘢痕组织是狭小的,平整的并色素沉着浅的[2],而过度的瘢痕组织形成则由于张力应力及胶原沉积排列有别于正常组织致使组织器官的正常生理功能受到影响,皮肤的过度瘢痕组织还存在着会影响外观的可能性。因此,众多科研人员都在致力于寻求可以减少皮肤瘢痕形成的有效治疗措施。
  无瘢痕创伤愈合的概念首次由Burrington于1971年提出,Burrington发现胚胎皮肤创伤愈合后没有瘢痕组织学表现[3],引发了人们对胚胎皮肤无瘢痕愈合机制的研究。无瘢痕的现象只出现在妊娠的早期阶段[4],之后过渡为少瘢痕期和瘢痕期。组织创伤后的瘢痕修复,既影响功能又影响美观,是多年来困扰广大医患人员的难题。妊娠早期胎儿皮肤由于其细胞的固有特性[5],如低炎症反应,特有的成纤维细胞表型,特有的基因型表达,最终达到无瘢痕愈合的状态,妊娠早期胚胎皮肤创伤后的这种无瘢痕愈合,为人们提供了一个理想的组织修复模型,也同时为研究皮肤无瘢痕愈合提供了新的平台。
  微小RNA(microRNA、miRNA)作为内源性微小RNA,是一类近年来发现的广泛存在于真核生物中的非编码小分子RNA[6]。由21-23个核苷酸分子组成,从基因组DNA转录而来,通过miRNA自身的种子序列(从5'端开始的第2-8位核苷酸序列)与靶基因的3'UTR反向互补结合,形成RNA沉默复合体(RISC),从而介导靶蛋白的翻译合成抑制或使其降解,miRNA参与调控个体发育,细胞增殖,分化及凋亡等多个生物学过程。但是miRNA在皮肤创伤愈合过程中的作用机制尚未完全明了,急需发现更加有效的miRNA来促进皮肤创伤愈合过程。在本研究中,我们探讨了已知的miR-149和测序新发现的miRNA seq-915。文献表明miR-149可以在骨关节炎及巨噬细胞中充当免疫调节因子的作用[7,8],结合前期测序结果,推测miR-149也可以在皮肤创伤愈合过程中的炎症反应发挥一定作用。同时,我们将在测序中新发现的,未被报道和验证过的miRNA称之为“新 miRNA”,而“seq-”表示在测序中我们对新发现的miRNA所进行的暂时性命名。seq-915作为新发现的miRNA,通过前期分析推测,其与皮肤创伤愈合过程中的炎症反应也具有一定相关性。
  炎症反应作为皮肤创伤愈合过程中的必经阶段,炎症反应程度和炎症反应时间在皮肤创伤愈合过程中起着至关重要的作用。胎儿皮肤具有低炎症反应,较少促炎性因子分泌,较高水平抗炎性因子分泌和较少炎性细胞浸润的特点[5]。当炎症反应过于强烈或者转为慢性炎症,都是瘢痕形成的重要影响因素之一。只有当多种炎性细胞与炎性因子相互协调,达到一个相对平衡适度的水平,才会使炎症反应在创伤愈合过程中最大程度的展现它的优势作用。目前,我们对miRNA在炎症阶段的作用机制尚未完全明朗。创伤发生后,中性粒细胞和淋巴细胞通过受损血管向创伤处浸润,随后,免疫细胞释放趋化因子和细胞因子,如PDGF,血小板因子Ⅳ,TGF-β和TNFα等[9]。白细胞介素作为炎性介质,是参与炎症反应和创伤后修复过程的重要炎性因子,其中包括促进肉芽组织形成,阻碍再上皮化和组织重塑等。白细胞介素通过直接或间接的方式影响创伤愈合,同时具有一定的时间相关性与浓度依赖性,并且白介素家族的成员间也彼此作用,形成复杂的调控网络。
  研究表明,在正常和创伤皮肤中miRNA的表达具有显著的差异性。研究人员对损伤不同时间阶段人创伤处皮肤进行高通量分析[10],结果显示出在创伤后0h和24h的创伤处皮肤中,很多miRNA存在显著表达差异。通过进一步的生物信息学分析,研究人员得出差异表达的miRNA对多个靶基因以及多个传导通路具有显著的调控作用。这些miRNA能够通过调控炎症反应过程而在皮肤创伤无瘢痕愈合过程中发挥作用。
  人胚胎皮肤发育过程中也伴随着基因的选择性表达,使得胎儿皮肤具有其低炎症反应等一系列固有特点[11-13],那么在孕中晚期创伤愈合形成瘢痕与否的转变是否是伴随着基因表达发生转变的结果?也就是说人孕中、晚期胎儿皮肤中miRNA的表达不同是否影响无瘢痕愈合的机制还不清楚。因此,在本研究中,我们通过检测人孕中、晚期胎儿皮肤角质形成细胞中miRNA的表达情况,来探究人皮肤角质形成细胞中差异表达的miRNA对皮肤创伤无瘢痕修复的作用机制。
  方法:
  一、孕中期与孕晚期人胎儿皮肤角质形成细胞中miR-149和新miRNA seq-915的差异表达和靶基因验证
  1、通过比对及生物信息学分析,从前期筛选到的具有差异表达的miRNA数据中,筛选得到与炎症有关的新miRNA和已知miRNA。
  2、通过实时荧光定量qRT-PCR技术验证测序得到的miRNA的相对表达结果。
  3、应用生物信息学分析预测miR-149和新miRNA seq-915可能作用的靶基因。
  4、构建含有miR-149和新miRNA seq-915靶基因的3'UTR的荧光素酶报告基因载体。
  5、应用荧光素酶报告基因检测技术检测miR-149和新miRNA seq-915在HaCaT细胞中对各自相应靶基因的调控作用。
  二、miR-149和新miRNA seq-915调节角质形成细胞和成纤维细胞中的炎症反应促进皮肤创伤无瘢痕修复的研究
  1、通过脂质体转染技术构建过表达miR-149和新miRNA seq-915的人皮肤角质形成细胞系HaCaT细胞。
  2、通过MTS增殖实验检测过表达miR-149后HaCaT细胞的增殖能力。
  3、通过Transwell迁移实验检测过表达miR-149后HaCaT细胞的迁移能力。
  4、将构建好的过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞与人皮肤成纤维细胞进行Transwell共培养。
  5、通过实时荧光定量qRT-PCR技术检测在炎症条件下miR-149和新miRNAseq-915的表达改变情况。
  6、通过实时荧光定量qRT-PCR技术检测过表达miR-149和新miRNAseq-915的HaCaT细胞在正常和炎症条件下炎性相关因子的mRNA水平表达情况。
  7、通过ELISA技术检测过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞在正常和炎症条件下炎性相关分泌蛋白水平表达情况。
  8、通过western blot技术检测过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞在正常和炎症条件下炎性相关蛋白表达情况。
  9、通过western blot技术检测过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞在正常和炎症条件下对NF-κB通路的影响情况。
  10、通过实时荧光定量qRT-PCR及western blot技术检测与过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞共培养的成纤维细胞中无瘢痕愈合相关基因的表达改变情况。
  三、miR-149和新miRNA seq-915调节皮肤创伤炎症反应促进无瘢痕修复的研究
  1、制作wistar大鼠背部全层皮肤圆形直径1cm的皮肤缺损模型。
  2、通过Nunc UpCell培养表面技术获取过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞层。
  3、将获取到的HaCaT细胞层作用于大鼠背部全层皮肤缺损的创面,并被覆以水凝胶、纱布、绷带,用来固定创面。
  4、在第1、3和28天切取皮肤创面组织,拍照观察皮肤创伤愈合速度。
  5、OCT包埋后,进行冰冻切片,HE和masson染色,免疫荧光染色检测中性粒细胞表面标志物Ly6G和巨噬细胞表面标志物F4/80,免疫组化染色检测成肌纤维细胞表面标志物αSMA。
  结果:
  一、分析得到在孕中期比孕晚期中人胎儿皮肤角质形成细胞中高表达的miRNA:miR-149和新miRNA seq-915
  1、发现人胎儿皮肤角质形成细胞在孕中期比孕晚期高表达的miRNA,其中miR-149和新miRNA seq-915验证结果最理想。
  2、预测新miRNA seq-915与炎症相关。
  3、miR-149抑制角质形成细胞中IL-1α,IL-1β和IL-6的表达。
  4、新miRNA seq-915抑制角质形成细胞中IL-8和TNFα表达。
  二、人孕中期皮肤中高表达的miR-149和新miRNA seq-915抑制角质形成细胞系和成纤维细胞的炎症反应促进皮肤创伤无瘢痕修复。
  1、过表达miR-149显著促进HaCaT细胞的迁移能力。
  2、过表达miR-149对皮肤角质形成细胞的增殖能力没有显著影响。
  3、过表达miR-149和新miRNAseq-915抑制炎性相关因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNFα的表达。
  4、过表达miR-149和新miRNA seq-915促进无瘢痕愈合相关因子TGF-β3和collagenⅢ的表达。
  三、miR-149和新miRNA seq-915抑制皮肤创伤炎症反应促进无瘢痕修复
  1、miR-149和新miRNA seq-915可以减少炎性细胞浸润。
  2、miR-149和新miRNAseq-915可以使皮肤真皮层胶原排列更加规律整齐,呈网织状,更趋向于正常未受损的皮肤组织结构。
  3、miR-149和新miRNA seq-915作用的皮肤创伤处中性粒细胞表面标志物Ly6G,巨噬细胞表面标志物F4/80和成肌纤维细胞表面标志物αSMA表达均降低。
  结论:
  过表达miR-149和新miRNA seq-915抑制角质形成细胞中的炎症反应,促进皮肤创伤无瘢痕修复。
[硕士论文] 龚洋洋
皮肤病与性病学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1、评估NB-UVB联合硫辛酸治疗散发型白癜风的临床疗效及安全性。
  2、评估NB-UVB、CO2点阵激光联合外用皮质类固醇激素乳膏治疗肢端型白癜风的临床疗效及安全性。
  方法:
  1、招募散发型白癜风患者,采用随机、双盲研究方法,将患者分为A、B两组。A组:NB-UVB(3次/周)+硫辛酸片(300mg/日);B组:NB-UVB(3次/周)+安慰剂(1片/日);疗程6个月,试验结束后评价治疗疗效。
  2、招募肢端型白癜风患者,采用随机、自身对照研究方法,将研究对象的对称性皮损随机分成A、B两组。A组:NB-UVB联合点阵激光及外用卤米松/三氯生乳膏;B组:NB-UVB联合外用卤米松/三氯生乳膏。点阵激光每2周一次,NB-UVB每周3次,卤米松/三氯生乳膏每天两次,疗程12周,试验结束后评价治疗疗效。
  结果:
  1、NB-UVB联合硫辛酸治疗散发型白癜风试验中。治疗3月A组与B组显效率分别为42.9%(3/7),12.5%(1/8);有效率分别为85.7%(6/7),75%(6/8)。显效率(P=0.282,P>0.05)及有效率(P=1.0,P>0.05)均无明显统计学差异。治疗6月A组与B组显效率分别为57.1%(4/7),50%(4/8);有效率分别为100%(7/7),75%(6/8)。显效率(P=1.0,P>0.05)及有效率(P=0.467,P>0.05)均无明显统计学差异。不同部位复色率不同,躯干部位复色率较高:A组52.8±38.4%,B组40.4±29.7%;肢端复色率较低:A组10.5±13.7%,B组0.33±0.81%。治疗过程中均未见明显严重不良反应。
  2、NB-UVB、点阵激光联合外用皮质类固醇激素乳膏治疗肢端型白癜风试验中,A组与B组显效率分别为31.25%(5/16),12.5%(2/16);有效率分别为50%(8/16),31.25%(5/16)。显效率(P=0.394,P>0.05)及有效率(P=0.473,P>0.05)均无明显统计学差异。A组开始复色出现在治疗2.67±1周,B组为3.2±1.79周,满意度评分A组5.29±2.70,B组4.0±2.18。治疗过程中均未出现严重不良反应。
  结论:
  1、NB-UVB单一治疗散发型白癜风安全有效,治疗6月显效率及有效率分别为50%及75%。相同疗程下联合硫辛酸治疗组显效率及有效率均高于单一对照组,但两者疗效、显效率及有效率比较均无明显统计学差异,考虑可能为病例数过少,需扩大样本量进一步研究,该研究亦发现不同部位NB-UVB治疗疗效不同,躯干复色率较高,肢端最低。
  2、NB-UVB、CO2点阵激光及外用皮质类固醇激素乳膏治疗肢端型白癜风安全有效,点阵激光治疗组显效率及有效率优于对照组,开始复色时间短于对照组,患者满意度高于对照组,但两者疗效、显效率及有效率均无明显统计学差异,考虑可能为病例数过少,需进一步扩大样本量研究。对常规治疗无效的肢端型患者可尝试该治疗方案。
[硕士论文] 陶丛珊
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  青藤碱是一种从防己科植物青藤中分离出的单体生物碱,其结构类似吗啡。青风藤在东亚被用于治疗风湿性疾病已有百年历史,具有抗炎、免疫抑制等传统药理作用,但还未见青藤碱对皮肤性炎症治疗作用的报道。青藤碱也具有抗肿瘤、缓解神经性疼痛、减轻吗啡及海洛因成瘾或戒断症状等生物学活性。生物碱类毒品存在与黑色素的结合位点,且青藤碱已知的作用靶点与调控黑色素合成限速酶——酪氨酸酶活性的相关信号通路存在交叠,作为吗啡类似物的青藤碱是否能发挥美白的作用,也未见报道。
  研究目的:
  研究青藤碱对已存在的黑色素、黑色素合成过程以及对酪氨酸酶活性的影响。基于青藤碱的结构特征,探索青藤碱是否具有一定的抗氧化能力。考察青藤碱对炎症性皮肤病是否有治疗潜质。制备青藤碱凝胶剂,探索青藤碱在外用制剂中是否能到达皮肤深层发挥作用以及对皮肤是否具有安全性。
  研究方法:
  1.通过CCK-8法考察青藤碱在不同浓度下(1500-0.14μg/mL)对细胞增殖(B16-F10细胞,HepG2细胞,HaCaT细胞,人真皮成纤维细胞)的影响,确定合适的体外给药浓度范围。
  2.以B16-F10细胞为模型,熊果苷为阳性对照,通过氢氧化钠裂解法考察青藤碱在10-100μg/mL浓度范围内对黑色素合成抑制率以及对存在黑色素的消除率(毛喉素和8-MOP诱导B16-F10细胞造模),通过多巴氧化法测定青藤碱对细胞中酪氨酸酶活性的抑制率。
  3.以HepG2细胞为模型,维生素C为阳性对照,检测青藤碱在33.3-300μg/mL浓度范围内的抗氧化能力。
  4.以ELISA为检测方式,先筛选在TNF-α诱导下的表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞可分泌的细胞因子(被筛选的细胞因子:IL-1β,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10,MMP-1,MMP-9)。从TNF-α刺激HaCaT细胞和真皮成纤维细胞分泌的细胞因子的时效及量效曲线,确定青藤碱干预实验中的检测指标以及TNF-α刺激的剂量和时间,再进行青藤碱的干预实验。
  5.制备青藤碱和盐酸青藤碱凝胶剂,用高效液相色谱法建立青藤碱以及盐酸青藤碱的体外含量测定方法,采用体外透皮实验考察比较两种凝胶剂的平均透皮速率和12h累积渗透量。
  6.制备青藤碱和盐酸青藤碱凝胶剂,以新西兰白兔为模型(正常皮肤组、破损皮肤组),分别考察凝胶剂在单次以及多次给药后,对皮肤的刺激性。
  研究结果:
  1.当青藤碱浓度为300μg/mL以下时,各细胞系以及人真皮成纤维细胞的存活率均可达到85%以上。
  2.青藤碱可以消除已存在的黑色素(浓度为100μg/mL时,存在的黑色素消除率为68.2%),有效抑制黑色素的合成(浓度为100μg/mL时,黑色素合成抑制率为36.8%),并可以抑制酪氨酸酶活性(浓度为100μg/mL时,酪氨酸酶活性抑制率为39.3%)。
  3.青藤碱和维生素C的给药浓度梯度为0,33.3,100和300μg/ml。青藤碱各给药浓度对应的羰基化平均抑制率是1.3%,30.4%,59.8%和52.5%。维生素C各给药浓度对应的羰基化平均抑制率是1.2%,31.1%,58.3%和65.1%。
  4.ELISA结果显示,青藤碱与其盐酸盐形式,可抑制皮肤细胞被TNF-α诱导分泌的IL-6、MMP-1和MMP-9(P<0.01),其均对诱导分泌的IL-8无效(P>0.05)。
  5.青藤碱凝胶经皮渗透作用良好,在相同处方下,青藤碱凝胶的透皮速率和累积渗透量均显著高于盐酸青藤碱凝胶。
  6.青藤碱以及盐酸青藤碱凝胶对皮肤刺激性较小,具有一定的安全性。
  综上所述,青藤碱具有缓解皮肤炎症,改善和保护正常肤色,促进皮肤内环境稳态的潜质。并且,青藤碱凝胶经皮渗透作用良好、对皮肤刺激性小。
[硕士论文] 苗颖颖
皮肤病与性病学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景及目的:
  皮肤老化表现为皱纹形成、色沉增多、弹性下降等,受内源性因素和外源性因素的共同影响[1]。内源性因素导致的皮肤老化又称为自然老化,由遗传和不可抗力(如内分泌变化、免疫功能的下降等)导致,是机体自然衰老的体现之一,目前尚不可人为调控。造成皮肤老化的外源性因素有很多,如紫外线辐射、吸烟、不健康饮食、空气污染、睡眠质量差、化学物质刺激等,这些因素是可以人为控制的[2]。虽然相关机制尚未研究透彻,但目前研究已经证明,紫外线辐射是导致皮肤老化的主要因素,某种角度上来讲光老化即外源性老化的代称[3-5]。有关光老化机制及干预手段的研究一直是皮肤科领域的热点。
  A型肉毒素(Botilium Toxin Type A,BoNTA)是肉毒杆菌分泌的七种神经毒素中最有效的一种,在临床得到广泛应用[6]。BoNTA可引起肌肉松弛,由于它这种肌肉松弛的特性可以使皱纹(主要是动态性皱纹)得到改善,现已成为皮肤科治疗外源性老化的重要手段之一[7.8]。2005年和2008年,一些研究人员发现在颜面的中下1/3处皮下注射BoNTA,可一定程度地提升面部曲线[9,10]。为了解BoNTA在改善皮肤状态中的真实效用,2012年,Sang-Ha Oh等研究了BoNTA对离体状态下对正常人真皮成纤维细胞(Human dermal fibrolasts,HDFs)的影响,得出BoNTA具有显著的提高胶原蛋白产生水平、降低其降解作用的结论[12]。2014年,本研究小组对于UVB所致光老化的HDFs进行了体外研究,得出了BoNTA可以有效提高COL-Ⅰ及COL-Ⅲ水平,减少MMP-1及MMP-9分泌的结论[13]。2016年,朱洁等证明了局部应用BoNTA可以增强二氧化碳(cnarbon dioxide,CO2)点阵激光术后的复原效果,进一步表明BoNTA可以改善皮肤质地,使皮肤变得更光滑[14]。这些研究不仅证明了BoNTA对HDFs在改善皮肤状态上的积极作用,而且也暗示了HDFs的重要性。
  长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一组长度大于200个核苷酸片段、不具有编码蛋白质的功能[15]。随着基因检测技术的进步和相关知识不断深入,以前被认为是转录“噪声”的LncRNA现在被证明具有一定的功能,lncRNA可通过调节基因组印记、染色体修饰、核转运、转录激活、干扰等来参与生物学过程[16,17]。在生理条件下对细胞功能的理解如果忽略了对lncRNAs所发挥的作用的分析,是不全面的。因此,我们将从研究UVB辐射对正常HDFs、BoNTA对正常HDFs及BoNTA对UVB诱导的提前衰老(UVBinduced premature senescence,UVB-IPS)HDFs中lnc-RNA表达的影响着手,研究原来被认为没有功能的lncRNA在光老化发生和BoNTA改善皮肤老化中的可能机制及作用环节。
  研究方法:
  1.各部分实验的分组
  从包皮环切术后的皮肤分离培养的人真皮成纤维细胞(Human dermalfibrolasts,HDFs),选处于对数生长期8-11代的正常HDFs,分别分组如下:
  (1)第一部分:①对照组;②UVB诱导提前衰老成纤维细胞(UVB-IPS)组:UVB以10mJ/cm2大小能量连续照射5天,静置3天。用β-半乳糖苷酶验证两组细胞的衰老状况。
  (2)第二部分:①对照组;②BoNTA处理组(2.5U48h):BoNTA的处理剂量为2.5U/106细胞,与HDFs共孵育时间为48h;③BoNTA处理组(5U48h):BoNTA的处理剂量为5U/106细胞,与HDFs共孵育时间为48h;④BoNTA处理组(7.5U48h):BoNTA的处理剂量为7.5U/106细胞,与HDFs共孵育时间为48h;⑤BoNTA处理组(5U24h):BoNTA的处理剂量为5U/106细胞,与HDFs共孵育时间为24h;⑥BoNTA处理组(5U72h):BoNTA的处理剂量为5U/106细胞,与HDFs共孵育时间为72h
  (3)第三部分:①对照组;②BoNTA处理UVB-IPS组(2.5U48h): BoNTA的处理剂量为2.5U/106细胞,与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为48h;③BoNTA处理UVB-IPS组(5U48h): BoNTA的处理剂量为5U/106细胞,与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为48h;④BoNTA处理UVB-IPS组(7.5U48h): BoNTA的处理剂量为7.5U/106细胞,与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为48h;⑤BoNTA处理UVB-IPS组(5U24h):BoNTA的处理剂量为2.5U/106细胞,与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为24h;⑥BoNTA处理UVB-IPS组(5U72h): BoNTA的处理剂量为5U/106细胞,与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为72h。
  2.RNA芯片筛选差异表达的RNA(lncRNA和mRNA)及生物信息学分析
  使用TRIzol提取各组HDFs的总RNAs,进行RNA芯片分析。以归一化强度的|log2(Ratio)|≥2为条件筛选UVB-IPS的HDFs,BoNTA(5U48h)处理的HDFs和BoNTA(48h5U)处理UVB-SIPS的HDFs中差异表达的lncRNA和mRNA,并对所得差异RNA的靶基因进行GO分析以及pathway富集分析。使用qRT-PCR(Quantitative real time PCR,实时定量PCR)法验证UVBvs对照组、BoNTA(5U48h) vs对照组、BoNTA处理UVB-IPSvs对照组按照设定原则筛选的lncRNA和mRNA。
  3、qRT-PCR法进一步验证筛选出来的lncRNA和mRNA
  利用qRT-PCR法对筛选出来的各造模组中均差异表达的RNA(FGFR3P,COL19A1)进行进一步验证:即检测在BoNTA(5U48h) vs对照组、BoNTA处理UVB-IPSvs对照组中FGFR3P和COL19A1表达水平随BoNTA剂量、时间不同发生的变化。
  结果:
  1.UVB诱导提前衰老HDFs中lncRNA的筛选及初步分析:(1)以亚毒性计量的UVB(10m J/cm2)多次(5次)照射HDFs后,β-半乳糖苷酶阳性率显著高于未照光组(P<0.05)。(2)利用差异倍数Fold change值进行筛选,设定差异倍数(Fold change,FC)值≥2时与对照组相比较,UVB诱导光老化HDFs中检测出差异表达的lncRNA和mRNA数分别为3224和1630个:生物信息学分析提示,差异表达的lncRNA涉及多种生物学功能,部分生物学功能与光老化有关,如:细胞对UVB的反应、自噬、细胞凋亡等。(3)选择出来RNAs的qRT-PCR的结果与RNA芯片分析结果趋势一致,证明芯片分析结果的可靠性。
  2.A型肉毒毒素处理后人真皮成纤维细胞长链非编码RNA表达谱的筛选及初步分析:(1)与对照组相比较,BoNTA以5U/106细胞的剂量孵育48h后,设定FC≥2时,HDFs中差异表达的lncRNA和mRNA数分别为2124和638个。(2)生物信息学分析提示,差异表达的lncRNA涉及多种生物学功能,部分生物学功能与皮肤老化有关,如:胶原蛋白的产生、细胞增殖等。(3)初步选择出来RNAs的qRT-PCR的结果与芯片分析结果趋势一致;筛选出来FGFR3P和COL19A1的qRT-PCR验证结果说明BoNTA对FGFR3P和COL19A1表达的调控有一定的时间及剂量相关性。
  3.A型肉毒毒素处理对UVB-IPS的HDFs中lncRNA表达谱的影响:(1)与对照组相比较,BoNTA以5U/106细胞的剂量孵育48h后,设定FC≥2时,UVB-IPS的HDFs中差异表达的lncRNA和mRNA数分别为1651和1221个。(2)生物信息学分析提示,差异表达的lncRNA涉及多种生物学功能,部分生物学功能与皮肤老化有关,如:如有丝分裂细胞周期G1/S间转换、成纤维细胞增殖、胶原蛋白产生、细胞老化等。(3)初步选择出来RNAs的qRT-PCR的结果与芯片分析结果趋势一致;进一步的qRT-PCR验证结果表明BoNTA对FGFR3P和COL19A1表达的调控与处理时间和剂量相关。
  结论:
  UVB和BoNTA可以显著改变HDFs中lncRNAs和mRNAs的表达水平,BoNTA亦可通过作用于UVB-IPS的HDFs而引起lncRNAs表达的变化;这些与包括皮肤老化在内的多种生物学行为有关。
[硕士论文] 谭杨
皮肤病与性病学 中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  氨基酮戊酸-光动力疗法(δ-Aminolevulinic acid photodynamic therapy,ALA-PDT)被认为是一种非常有前景的新的消除微生物感染的治疗方法。PDT因它良好的疗效目前已经被广泛用于某些感染性皮肤病的治疗,如痤疮、病毒疣等。此外,一些研究发现PDT对于细菌真菌及其生物膜(Biofilm,BF)的感染同样有效,包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌及一些耐药菌(如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)等。然而,很少有PDT对生物膜结构、功能以及其中作用的机制的研究。群体感应(quorum sensing,QS)系统是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)生物膜形成和产生毒力因子的最重要的调节系统,而PDT对铜绿假单胞菌生物膜相关研究中对QS系统及相关基因的影响从未被报道过。本研究通过建立铜绿假单胞菌体外生物膜模型,探索ALA-PDT对铜绿假单胞菌杀灭作用及对其生物膜清除作用及机制。为我们临床应用ALA-PDT治疗铜绿假单胞菌相关感染提供实验依据。
  方法:
  1.建立铜绿假单胞菌体外生物膜模型,不同浓度的ALA、单纯照光、ALA-PDT分别根据分组要求进行相应的处理;
  2.用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)检测ALA在铜绿假单胞菌体内的转化;
  3.用XTT活菌定量实验检测ALA-PDT对铜绿假单胞菌生物膜中细菌的杀灭作用;
  4.通过对铜绿假单胞菌生物膜的荧光染色,使用CLSM观察ALA-PDT对生物膜中活菌的杀灭作用及对生物膜三维结构的影响;
  5.使用扫描电镜(Scanning electron microscopy,SEM)观察ALA-PDT对铜绿假单胞菌生物膜中细菌及生物膜结构和功能的影响;
  6.毒力因子检测试验研究ALA-PDT对绿脓菌素和弹性蛋白酶分泌的影响;
  7.通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测基因的表达,研究ALA-PDT对毒力因子调控基因(phzH、LasB)与QS相关基因(lasI、lasR、rhlI、rhlR)表达的影响。
  结果:
  1.ALA孵育组在CLSM下可见大量砖红色荧光,而对照组在CLSM下未见无明显荧光;
  2.XTT活菌定量实验提示,ALA-PDT能有效杀灭铜绿假单胞菌生物膜中的活细菌,这种杀灭作用与ALA的浓度呈正相关,单纯ALA孵育、单纯照光组与对照组无明显差异,不能产生光动力效应;
  3.从CLSM和SEM的观察结果看出,ALA-PDT对铜绿假单胞菌生物膜的清除作用与ALA的浓度呈正相关,且ALA-PDT能明显杀灭生物膜中的活细菌,同时破坏生物膜的三维结构,单纯ALA孵育、单纯照光组与对照组无明显差异,不能产生光动力效应;
  4.从毒力因子检测试验看出,ALA-PDT能显著抑制铜绿假单胞菌毒力因子的分泌,这种抑制作用与ALA的浓度呈正相关,单纯ALA孵育、单纯照光组与对照组无明显差异,不能对毒力因子的分泌产生抑制效应;
  5.从qRT-PCR试验结果看出,单纯ALA孵育和红光照射时,铜绿假单胞菌毒力因子调控基因和QS相关调控基因的表达无明显变化,只有ALA和红光照射同时存在的情况下,才能发挥PDT作用,ALA-PDT能明显降低QS系统相关基因的表达,这种对基因表达调控的抑制效应与ALA的浓度呈正比。
  结论:
  我们的研究初步阐明了ALA-PDT清除铜绿假单胞菌生物膜的作用及其相关机制。ALA-PDT产生的单线态氧能够产生毒性效应破坏靶细菌的细胞膜、细胞器、细胞核,同时破坏了QS系统的基因和蛋白,这种对QS系统的作用进一步破坏了生物膜,同时减少了生物膜的复发率。我们的研究结果表明,ALA-PDT可以有效的杀灭体外的铜绿假单胞菌及其生物膜,为我们在临床中使用PDT治疗铜绿假单胞菌相关感染提供了进一步的实验依据。PDT是目前对于耐药性或难治性细菌感染的最有前景的治疗方法之一,需要我们更加深入的进行研究。
[硕士论文] 刘煜凡
外科学(胸心外) 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:皮肤是机体最大的器官,因烧、创伤导致的皮肤大面积损伤会造成机体局部畸形、皮肤功能失调,内环境稳态失衡甚至危及生命。因此,针对创伤后皮肤的修复再生是临床上亟待解决的问题。基于组织工程技术制成的皮肤替代物一度成为有效的修复途径,但这种皮肤替代物缺少汗腺、皮脂腺、毛囊等皮肤附属器,无法恢复正常皮肤的生理功能。目前,针对皮脂腺、毛囊的再生研究已相对成熟,但针对汗腺再生的研究进展缓慢,有功能的再生汗腺有助于提高机体对外环境的适应能力和恢复排汗功能。表皮干细胞作为皮肤发育的祖细胞,在分化为皮肤和皮肤附属器时有显著的优势,是汗腺再生研究中首选的干细胞类型。本团队在前期已证实3D微结构可诱导表皮干细胞分化为汗腺细胞,但不同构架的3D微结构在诱导效应上有差别,这为后续基于3D生物打印技术的汗腺再生研究在结构选择上造成了的困难。因此探索不同构架的3D微结构对表皮干细胞行为的影响并建立稳定且具良好诱导效应的3D微结构是后续研究的重要基础。
  目的:基于3D生物打印技术探索不同构架的微结构对表皮干细胞行为学变化的影响并建立稳定且具良好诱导效应的3D微结构,为创伤后皮肤的修复与再生提供理论基础。
  方法:1、表皮干细胞的提取:胚胎期12.5天的GFP-C57BL/6小鼠,剪取其背部皮肤后,采用已成熟的表皮干细胞培养方法进行培养。2、足趾部真皮基质匀浆:选择出生后0.5天的野生型C57BL/6小鼠,剪取其足趾部研磨成真皮基质匀浆(PD)。3、3D生物打印:选择3种不同直径的打印喷头(210μm、340μm和420μm)构建微结构。4、表皮干细胞行为学检测:荧光显微镜和活/死细胞染色技术用于展示3D微结构中表皮干细胞的增殖能力和细胞活性,免疫荧光染色技术用于检测3D微结构中表皮干细胞分化为汗腺细胞的能力。5、统计学分析:采用方差分析和样本t检验等方法进行统计学分析。
  结果:1、三种不同构架的3D微结构均可促进小鼠表皮干细胞的有效增殖。2、在各个观察时间点上,210μm组3D微结构中的表皮干细胞活性最低,420μm组的细胞活性最高,细胞活性与剪切应力呈反比。3、三种不同构架的3D微结构均可诱导小鼠表皮干细胞分化为汗腺细胞。4、340μm组3D微结构中表皮干细胞可聚集形成类腺样球形结构。
  结论:本次研究构建的340μm组3D微结构具有最佳的诱导效应。这为后续基于3D生物打印技术的汗腺再生研究以及进一步构建具有生物相容性的组织工程表皮模型奠定了基础。
[硕士论文] 姜卫
整形外科学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:随着组织工程与再生医学的发展,构建组织工程毛囊将会是治疗秃发较有前景的方法。毛乳头细胞(DPCs)是毛囊再生重要的种子细胞。但是,DPCs经体外培养扩增后其诱导能力逐渐丧失。许多方法用于维持或者恢复体外培养的DPCs的诱导能力。但是,短时间内要获取足够数量的且具有诱导能力的DPCs仍比较困难。目前,组织工程毛囊的研究均处于实验阶段,DPCs通常来源于小鼠的触须毛囊或者是手术废弃的人头皮毛囊,其来源非常有限。因此,尝试分离并培养小鼠背毛DPCs以期提供一种新的DPCs来源。
  目的:
  (1)分离、培养C57小鼠背毛DPCS.
  (2)检测体外培养的C57小鼠背毛DPCs诱导能力.
  (3)探讨培养的背毛DPCs用于毛囊重建的可行性.
  方法:
  (1)C57小鼠背毛DPCs的分离与培养
  取5w C57BL/6小鼠背部皮肤,经酶消化及Ficoll密度梯度离心后分离获取毛乳头(DP),显微镜下观察DP外观、贴壁及细胞迁出情况,计算DP贴壁率。观察传代细胞生长情况。
  (2)体外培养的C57小鼠背毛DPCs诱导能力的检测
  取P3代的小鼠背毛DPCs、触须DPCs及真皮成纤维细胞(Fbs),分别采用qRT-PCR、免疫荧光。
  (3)体外培养的背毛DPCs用于毛囊重建
  分别取P3代小鼠背毛DPCs、触须DPCs及Fbs结合新生鼠上皮细胞用于毛囊重建。分别于移植后4周对移植部位进行组织取材,对移植部位进行大体观察、组织切片H&E染色观察。
  结果:
  (1)C57小鼠背毛DPCs的分离与培养
  经酶消化及Ficoll密度梯度离心后获取的DP呈圆形或椭圆形,24h贴壁率达90%。传代后的DPCs呈明显长梭形,漩涡样生长,随着传代次数增加,DPCs逐渐失去凝集性生长能力。
  (2)体外培养的C57小鼠背毛DPCs诱导能力的检测
  qRT-PCR、免疫荧光染色检测结果表明:体外培养的小鼠背毛DPCs可表达ALP、β-catenin和Versican在内的与诱导能力相关的细胞标记物基因及蛋白,且与触须DPCs表达无明显差异,与Fbs表达有明显差异。
  (3)体外培养的背毛DPCs用于毛囊重建
  将Fbs与新鲜表皮细胞联合移植或者仅表皮细胞单独移植均未能重建出毛囊。将培养的背毛DPCs或者触须DPCs与新鲜表皮细胞联合移植后均能重建出毛囊。
  结论:
  (1)通过酶消化结合Ficoll梯度离心法可分离获得小鼠背毛DP,该方法具有高收获率、高分离效率、低劳动强度和高贴壁迁出率的优点;且该方法并未明显影响DPC在体外培养时的细胞形态、生长方式。
  (2)qRT-PCR、细胞免疫荧光实验结果均证实,体外培养的小鼠背毛DPCs可表达与毛囊诱导能力相关的特异性标记物ALP、β-catenin及Versican,且与触须DP相比并无明显差异。
  (3)体外培养的小鼠背毛DPCs具有诱导毛囊再生的能力,可用于毛囊重建的实验研究。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部