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[硕士论文] 张沛
水利工程 重庆交通大学 2018(学位年度)
摘要:呼伦贝尔地区是全球/区域变化的典型敏感地区,以温度增加和降水波动为特征的全球气候变化对呼伦贝尔地区的影响是显著的,近年来呼伦贝尔地区植被退化、沙漠化加速发展,草原生态系统遭到严重破坏。为了揭示呼伦贝尔地区水热条件时空变化特征及其生态效应影响,本文结合6期1990-2015年呼伦贝尔地区更新水体数据后的土地利用分类数据,利用土地利用转移矩阵和景观格局指数分析方法对1990-2015年呼伦贝尔地区土地利用/覆被和地表水体(含地表水体二级类)的面积动态变化特征、转移规律和景观格局特征进行了研究。然后利用呼伦贝尔地区内9个气象站1990~2015年逐年平均气温、平均最低气温、平均最高气温、平均气温距平、日照时数等热量资料,通过在ArcGIS中采用Kriging空间插值法得到区域的热量资料,以探求热量在时间序列上的年际变化特征,并按照年代将数据空间化,求取前后期热量在空间上的变化特征。最后选择植被覆盖指数作为呼伦贝尔草地生态系统的指示因子,分析水热条件时空动态变化与植被覆盖指数的联系,以探求水热条件时空动态变化的生态效应。研究发现:
  (1)由1990-2015年呼伦贝尔地区各土地利用/覆被类型的面积变化特征可知,呼伦贝尔地区的土地利用/覆被变化存在以耕地和居民地等人类活动为主的人为景观增多,以林地和草地等自然覆被为主的自然景观减少的客观形状。在呼伦贝尔地区土地利用/覆被变化的影响下,1990-2015年呼伦贝尔地区的地表水体面积呈现先增后减再增的整体趋势,在1995年达到最大值46759km2,25年间面积从1990年的3377km2增加到2015年的3451km2,共增加74km2。在各地表水体二级分类中,河渠、湖泊和滩地面积在25年内都呈先增后减再趋于稳定的变化趋势,而水库面积在1990-2005年保持稳定状态,从2005年以后呈增加趋势。
  (2)从1990-2015年呼伦贝尔地区地表水体的时空转移分析,与地表水体转移的一级土地利用类型主要为草地、林地、沼泽和未利用地,25年间,地表水体在与其他土地利用/覆被类型的转移上共净增加74km2,从局部变化期来看,1990-2000年,地表水体与其他土地类型发生转移较频繁,2000-2015年地表水体与其他土地类型发生转移较少。对1990-2015年呼伦贝尔地区地表二级类水体的时空转移分析,研究区各地表二级类水体转移趋势与总地表水体的转移趋势较为一致,同样是与草地、林地、沼泽和未利用地的转化较多,与耕地的转化相对较少,与居民地的转化最少。另外,地表二级类水体中各类之间的转化以河渠和滩地与其它地表水体二级类的转化较为剧烈。
  (3)1990-2015年呼伦贝尔地区的景观格局呈现出简单到复杂的变化过程。研究区的景观格局有微弱的倾向于复杂和不连续的斑块镶嵌体的变化趋势,研究区的优势景观占景观的比例趋于减小,且景观有被分割成不连续斑块的倾向,研究区的各土地利用/覆被类型越来越趋于均衡,弱势土地利用/覆被类型的占比有所增加。其中地表水体25年间呼伦贝尔地区地表水体破碎度数值较小,并保持稳定趋势,说明整体水体景观保存较好,连通性高,湖泊、水库等水体景观趋向于成为一个完整的整体,河渠则被分割成不连接斑块的程度越大。
  (4)由1990-2015年呼伦贝尔地区逐年平均气温、平均最低气温、平均最高气温年际变化特征可知,25年间,年均温、年平均最低气温和年平均最高气温变化趋势较为一致,均呈先增加后减小再增加的波动变化趋势。25年间日照时数整体趋势呈较小的减少趋向。1990-2015年间,呼伦贝尔地区平均温度距平只有2010年、2012年、2013年小于零,其它22年均大于零,说明呼伦贝尔地区在近25年内年平均气温高于多年平均气温,气温上升趋势明显。由1990-2015年呼伦贝尔地区年均温空间变化特征可见,呼伦贝尔大部分地区处于增温趋势,但增温趋势较小,处于0-1℃,这与之前得出的呼伦贝尔地区气温进入变暖趋缓的阶段的结论一致。
  (5)利用呼伦贝尔地区9个气象站点的气温和降水资料分别从年际、季候、生长季月变化角度分析该地区植被指数对水热条件时空变化的响应,研究发现降水变化是促使草地植被年际变化的主要因子,从季候水平来看,草地植被指数在不同季节对水热条件变化的敏感性不同,春季植被生长与气温关系密切,夏季草地植被生长受降水强度影响较大;从生长季月变化来看,5月份植被指数变化受气温变化影响较大,6月和7月植被指数变化受降水影响显著,植被生长对7月和8月降水变化具有一定的滞后性。
[硕士论文] 刘晓蓉
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪δ冠状病毒(PDCoV)是近年发现的一种猪肠道冠状病毒,主要引起仔猪腹泻和肠道损伤。PDCoV为有囊膜的单股正链RNA病毒,属于套式病毒目,冠状病毒科,δ冠状病毒属成员。全长基因组约25.4kb,其基因组序列为5'UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7-NS7a-3'UTR,编码15个非结构蛋白(nsp2-nsp16),4个结构蛋白和3个特异性辅助蛋白。研究证实感染脊椎动物的套式病毒目病毒(冠状病毒科和动脉炎病毒科)编码的内切核糖核酸酶(又称为NendoU)较为保守,在病毒的复制和转录中起着关键作用,并且已证实部分冠状病毒的内切核糖核酸酶(nsp15)和动脉炎病毒的同源蛋白nsp11能够拮抗干扰素(IFN)的产生。我们之前的研究发现PDCoV通过抑制RIG-I信号转导拮抗IFN-β的产生,而PDCoV nsp15是否参与拮抗IFN-β的产生尚不清楚。基于此,本课题以PDCoV nsp15作为研究对象,探究其对IFN-β产生的影响以及具体的作用机制。主要研究内容如下:
  1.PDCoV nsp15呈剂量依赖性抑制IFN-β的产生
  将不同剂量的PDCoV nsp15真核表达质粒与IFN-β荧光素酶报告质粒IFN-β-Luc、内参质粒pTK-Luc分别共转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析和RT-PCR检测,发现PDCoV nsp15显著抑制仙台病毒(SeV)诱导的IFN-β启动子激活以及IFN-βmRNA表达,并且呈剂量依赖性,提示PDCoV nsp15具有拮抗IFN-β产生的特性。
  2.PDCoV nsp15主要抑制NF-κB的活化
  IRF3和NF-κB是调控IFN-β产生的关键转录因子,为了探究PDCoV nsp15是否影响它们的活化从而拮抗IFN-β的产生,将nsp15的真核表达质粒分别转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析发现nsp15显著抑制SeV诱导的NF-κB活化并呈剂量依赖性,但对SeV诱导的IRF3的活化无显著影响;IRF3和p65的磷酸化及其核转运分别是IRF3和NF-κB激活的标志,Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明nsp15蛋白主要抑制SeV诱导的p65磷酸化和入核,不影响IRF3的磷酸化和入核。表明PDCoV nsp15主要通过抑制NF-κB的活化拮抗IFN-β的产生。
  3.PDCoV nsp15的关键酶活位点为His219、His234和Lys269
  根据PDCoV和其他冠状病毒nsp15的氨基酸序列同源性比对及结构同源性分析,推测PDCoV的NendoU结构域活性催化氨基酸位点为His219(H219)、His234(H234)和Lys269(K269)。通过定点突变的方法获得3个突变的nsp15基因,并将其和野生型nsp15基因分别克隆至原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-6P-1-nsp15以及相应的突变体质粒(pGEX-6P-1-H219A/H234A/K269A),经IPTG诱导表达、纯化后,利用荧光共振能量转移试验(FRET)分析发现,与nsp15野生型蛋白相比,3个突变体蛋白的NendoU活性显著降低,说明His129、His234和Lys269是PDCoVnsp15的关键酶活位点。
  4.PDCoV nsp15抑制IFN-β的产生不依赖其内切核糖核酸酶活性
  有报道某些冠状病毒nsp15和动脉炎病毒nsp11拮抗I型IFN的产生依赖其内切核糖核酸酶活性;也有研究表明动脉炎病毒nsp11潜在的细胞毒性会影响IFN的产生。为了探讨PDCoV nsp15对IFN-β产生的抑制作用是否依赖于其内切核糖核酸酶活性及细胞毒性,首先检测了PDCoV nsp15野生型和突变体的细胞毒性,发现野生型对细胞有一定的毒性作用,3种突变体对细胞几乎没有毒性。在此基础上,将表达PDCoV nsp15野生型及突变体(H219A、H234A和K269A)的真核表达质粒分别转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析发现,3个突变体与野生型一样均显著抑制SeV诱导的IFN-β产生,相互之间无显著差异;且主要抑制p65的磷酸化,而对IRF3的磷酸化无显著影响。进一步以突变体H234A为代表,检测了nsp15突变体对内源性IRF3和p65核转运的影响,结果与nsp15野生型一样,突变体H234A抑制了SeV诱导的p65入核,但不影响IRF3的入核。上述结果表明PDCoV nsp15抑制IFN-β的产生和NF-κ3的活化不依赖其内切核糖核酸酶活性,也不是其细胞毒性所致。
[博士论文] 李俊
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:我国水牛种质资源丰富,既有沼泽型,又有河流型,主要用于耕地和产肉。近年来,随着水牛向乳用方向改良,奶水牛产业得到快速发展。水牛奶营养丰富全面、消化吸收率高,将水牛奶深加工成乳制品,如“乳豆腐”、“奶饼”、“双皮奶”等,深受消费者喜爱,具有广阔的市场前景。然而,尽管我国水牛存栏量多,但水牛产奶量和繁殖力低,目前为止还没有专门的乳用型水牛品种,从而影响奶水牛产业的进一步发展。
  水牛的繁殖性状和泌乳性状均是重要的经济性状,为典型的数量性状。由于遗传力低和影响因素多,通过传统方法选育高繁殖力和高产奶量奶水牛进展缓慢。目前,全基因组关联分析和转录组测序对研究数量性状提供了新的方向。因此,本研究利用全基因组关联分析和转录组测序方法对影响水牛繁殖性能和产奶性能的候选基因进行筛选与鉴定。本研究的目的旨在揭示奶水牛泌乳性能和繁殖性能的分子遗传基础,为提高奶水牛的产奶性能和繁殖性能以及遗传改良提供理论基础。
  1水牛繁殖性状候选基因分析
  本试验分为三个部分。首先利用商业化水牛90K基因芯片(Affymetrix Axiom(@))对462头意大利地中海水牛的头胎产犊日龄、第二胎产犊日龄、第三胎产犊日龄、受精所需输精次数、空怀天数、产犊间隔6个繁殖性状进行全基因组关联分析。繁殖性状原始数据来自于意大利水牛育种评估中心。通过GWAS分析寻找影响水牛繁殖性状的SNP、基因组区域和候选基因。其次利用二代测序技术对四个时期(卵泡直径<5mm,5~8mm,8~12mm和>12mm)的水牛有腔卵泡颗粒细胞进行转录组测序,并进行定性和定量分析。根据GO和KEGG富集分析,寻找影响卵泡发育的候选基因。最后通过整合GWAS结果和转录组测序结果,鉴别影响水牛繁殖性能的关键候选基因,并利用RNAi技术对候选基因IGFBP7在水牛颗粒细胞中进行验证。主要结果如下:
  (1)全基因组关联分析鉴别到与繁殖性状相关的40个SNP和28个候选基因。
  (2)单倍型分析发现在5号染色体的2.3~2.7Mb区域存在一个与水牛繁殖性能相关的QTL区,其中多个SNP主要位于TRHDE基因内和附近的序列上。
  (3)对水牛卵泡颗粒细胞的转录组分析鉴别出17700个基因,其中1076个基因在卵泡发育的不同时期差异表达显著,30个基因在卵泡发育的四个时期有差异表达。差异表达基因数最多的是卵泡发育的最后两个时期。
  (4)差异表达基因在卵泡发育末期主要富集在免疫相关信号通路,提示该时期卵泡为排卵做准备。
  (5)整合GWAS分析结果和转录组测序结果,发现与繁殖性状相关的28个候选基因中有25个基因在卵泡发育不同时期有表达,提示这些基因可能直接参与水牛卵泡发育的调控,从而影响水牛繁殖性能。
  (6)IGFBP7基因在卵泡发育的4个阶段均有较高的表达量。水牛颗粒细胞用RNAi敲低IGFBP7后,增值和凋亡以及雌激素和孕激素的分泌均发生显著的变化。
  2水牛泌乳性状候选基因分析
  本试验分为两个部分。首先对1002头水牛的16个体型外貌指标与产奶量进行回归分析,筛选出与产奶量显著相关的体型外貌指标,并用地中海水牛群体对该指标进行验证。其次,根据获得的体型外貌指标,利用90K Affymetrix Axiom(@)Buffalo SNP Array对176头意大利地中海水牛进行基因分型,质控后,分别与关键体型外貌指标进行全基因组关联分析,寻找与体型外貌指标相关的SNP、候选基因和QTL。主要结果如下:
  (1)通过体型外貌指标与泌乳量的分析,发现乳房性状与产奶量显著相关,乳房性状可做为水牛产奶量的直接或间接指标。
  (2)对水牛前乳头长、后乳头长、前乳头间距、后乳头间距和前后乳距5个乳房性状的全基因组关联分析,共获得10个与乳房性状相关的SNP和5个候选基因,分别是PTPN11、ZNF385B、LRP2、COX18和DTHD1。
  (3)单倍型分析发现一个位于候选基因LRP2内的QTL显著影响水牛的乳房性状。对LRP2进行表达谱分析,发现LRP2在乳腺组织中高表达,推测该基因可能参与调控乳腺的发育以及在泌乳调控过程中参与乳蛋白和乳脂肪的重吸收。
[硕士论文] 于菲菲
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:革兰氏阴性菌已经进化出多种蛋白质分泌系统,以输出或输入跨膜大分子来适应环境和存活。2006年,Ⅵ型分泌系统(TypeⅥSecretion System,T6SS)首次在铜绿假单胞菌和霍乱弧菌中作为新型的细菌蛋白分泌系统被定义,并证明其与致病性有关且介导致病菌与宿主的相互作用。T6SS广泛存在于约四分之一的革兰氏阴性菌中,是一种多功能的注射装置,可以将效应分子传递至环境、真核宿主和原核竞争者。T6SS由跨膜复合物和类似噬菌体尾鞘的针管状结构组成。关于T6SS的结构研究中,普遍认为Hcp是T6SS的关键结构组分,以头对头或头对尾的方式聚合形成环状六聚体从而形成T6SS的内管道,在鞘收缩时推动T6SS靶向细胞以输送效应蛋白。作为T6SS结构重要组成部分的同时,Hcp的分泌作为T6SS发挥功能的标志。
  有关细菌分泌系统的结构和机制研究已取得重大进展。近年来,关于分泌系统在宿主一致病菌的互作中尤其是关于免疫应答的复杂作用己成为研究热点。细菌分泌系统传送效应分子来干扰宿主细胞的正常生理功能,以一定的方式影响炎性小体通路。本研究中,PCN033是分离于病猪的肠外致病性大肠杆菌,通过全基因组测序发现其含一套T6SS基因簇。如其他致病性大肠杆菌一样,PCN033的基因组中有3个hcp拷贝,其中两个位于T6SS基因簇内,另一个位于T6SS基因簇外,分别命名为hcp1、hcp2、hcp3。本实验室已构建了并保存了Δhcp1Δhcp2Δhcp3缺失株,hcp作为T6SS发挥功能的标志,缺失hcp后,T6SS无法正常组装进而发挥作用,故本研究利用PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3两个菌株,对PCN033感染后的宿主应答及T6SS在激活炎症过程中发挥的作用进行了探究,主要内容如下:
  1.RNA-seq检测PCN033感染后RAW264.7的转录组变化
  选择小鼠巨噬细胞RAW264.7为PCN033的宿主细胞模型,对感染PCN033后宿主细胞RAW264.7内发生的转录组变化进行分析,发现了508个差异表达的基因,对差异基因进行功能分析,发现在GO数据库中,与之相关且有统计学意义的涉及2052项生物过程、133种细胞组分、211个分子功能及52种KEGG代谢通路。差异基因参与的KEGG代谢通路中与天然免疫相关的有NF-κB、TNF、Apoptosis、TLR、NLR等信号通路。
  2.PCN033激活NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体
  通过Western-blot检测PCN033感染后RAW264.7中NF-κB信号通路的激活情况和胞内蛋白NLRP3、NLRC4、ASC的表达情况。结果表明,随着感染时间增加,p65发生磷酸化、IκBα降解,NLRP3、NLRC4及ASC的表达均明显上调。这说明,PCN033感染后激活NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体。
  3.T6SS在PCN033与宿主互作过程中的作用
  有文献报道T6SS能够促进小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用。对细胞培养液中的LDH进行检测,发现Δhcp1Δhcp2Δhcp3感染相对于PCN033感染后的细胞毒性显著降低,表明了T6SS对小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用有促进作用。PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3以同样的剂量静脉注射小鼠后,通过ELISA测定小鼠血清中的IL-1β。发现相对于野毒株PCN033,缺失hcp后感染使得小鼠产生IL-1β的能力减弱,也就是说T6SS以一定的方式参与PCN033促进IL-1β的释放。进一步,我们对炎性因子的转录水平进行qRT-PCR检测,发现T6SS对促炎因子IL-1β、IL-18、CXCL3、TNF-α的表达有上调作用,说明T6SS确实有一定的促炎作用。经Western-blot检测,发现PCN033感染促进RAW264.7中caspase1的活化及pro-IL-1β的加工,且T6SS在此过程中发挥作用。另外我们发现T6SS参与PCN033感染激活宿主的NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体。
[硕士论文] 李梓芃
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:为探究影响水牛奶中体细胞数(SCC)的因素和外源褪黑素对杂交水牛卵泡发育及奶中体细胞数降低的作用,本研究根据DHI记录,分析月份和胎次对水牛奶中体细胞的影响,并对乳中体细胞数较高的杂交水牛用不同浓度的褪黑素处理,分析血液中各种生理生化指标和乳中体细胞数,检测卵泡发育情况等,旨在为开发降低夏季水牛奶中体细胞数、提高杂交奶水牛繁殖性能的新技术奠定基础。
  1.月份和胎次对水牛奶中体细胞数的影响
  收集2012~2017年奶水牛的DHI数据,分析胎次和泌乳月份对水牛奶中体细胞数的影响。由于体细胞数的分布频率呈偏态性,因此将体细胞数换算成体细胞评分(SCS)进行分析。
  结果表明:泌乳月份对SCS具有显著影响(p<0.05)。SCS值表现为8月份最高、5月份最低。此外,SCC>40万个/mL的牛群占总体样本量的比例,6~8月最多,其次是冬季。乳中SCS值在胎次(1~3胎)间也有显著差异(p<0.05),随着胎次的升高,奶中体细胞数升高。
  2.皮下注射褪黑素对奶中体细胞评分和血中抗氧化及免疫指标的影响
  选择水牛奶中体细胞数高于50万个/mL的泌乳奶水牛20头,随机分为两组(各10头)。低和高剂量组分别连续4天注射4.68mg和20mg褪黑素,并检测奶样中体细胞数和血浆中抗氧化及免疫指标。
  结果表明:皮下注射褪黑素后,高剂量组奶中体细胞评分显著性低于注射前体细胞评分(p<0.05),但是两种剂量组之间没有显著性差异(p>0.05)。此外,通过观察治疗后第11天的治愈奶水牛数,发现高剂量组恢复亚健康(SCC≤50万个/ml)的杂交奶水牛数比低剂量组高10%。褪黑素处理后能够显著提高血液中MT、SOD和IgM含量(p<0.05)。因此,夏季连续4天皮下注射褪黑素能够显著降低奶中体细胞数,作用机制是通过提高血液中SOD和IgM浓度来增强奶水牛免疫和抗氧化能力。
  3.皮下注射褪黑素对奶水牛卵泡发育的影响
  选择30头奶水牛分成3组,每组10头。T1组每天皮下注射60mg/500kg褪黑素,连续注射3天;T2组一次性皮下注射180mg/500kg褪黑素,对照组注射生理盐水。以第1次注射褪黑素当天为第0天,在第4天注射促性腺激素释放激素(GnRH)200μg,第11天注射氯前列腺素(PGF2α)0.5mg,第13天再次注射促性腺激素释放激素(GnRH)200μg,分别于第二次注射GnRH后进行人工授精。一天两次用B超检测记录卵泡发育情况,且于配种后45天进行妊娠诊断。
  结果表明:在注射褪黑素后,处理组血液中SOD、MT和IgM浓度显著高于对照组(p<0.05)。在注射PGF2α以后,皮下注射褪黑素组的优势卵泡半数生存期(有且只有50%的优势卵泡存活的时间)、卵泡平均发育速率(1.Smm/d和0.7mm/d)大卵泡直径显著大于对照组(p<0.05)。此外,单次注射褪黑素组的排卵卵泡直径、排卵率、大卵泡数量以及受胎率都显著性高于其他组(p<0.05)。因此,用褪黑素皮下注射经产水牛后,均能够产生较高的SOD和IgM水平,两组处理方式结合Ovsynch同期发情方案(GPG)均能促进卵泡的发育和排卵,但单次注射组更能显著性增加排卵卵泡的数量和直径,且提高杂交奶水牛在非繁殖季节的发情、排卵和受胎比例。
[硕士论文] 赵兴
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胸腺(thymus)是T细胞发育、分化和成熟的场所,骨髓中淋巴祖细胞在多种趋化因子的作用下进入胸腺,在胸腺微环境内发育分化为成熟的T细胞,进入外周血和淋巴器官中,成为机体健康的卫士。但动物朐腺的增龄性萎缩将导致其功能减退,机体也随之衰老,疾病丛生。因此,掌握动物胸腺发育的基本规律,探索其萎缩的机理和能够增强其功能抑制其退化的有效方法,对疾病的预防和诊断、抵抗免疫衰老具有非常重要的现实意义。目前关于鸡胸腺生长发育过程中的基因表达变化和分子机制的研究鲜有报道。因此,本研究以科宝肉鸡为研究对象,采用HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色、RNA-Seq以及实时荧光定量PCR等方法研究了鸡胸腺生长发育过程中组织结构和基因表达变化规律,主要研究内容和结果如下:
  1.鸡胸腺发育过程中重量和指数的变化规律
  测定了0w、1w、5w、9w、18w和27w鸡(n=6)的体重及胸腺重量,并计算胸腺指数(胸腺重量(g)/体重(kg))。随着周龄的增加,胸腺重量呈现先上升后下降的趋势,18w时胸腺重量达到最大,27w时萎缩严重。0w到1w,胸腺指数呈上升趋势,从1w到27w,胸腺指数呈下降趋势。
  2.鸡胸腺发育过程中组织结构的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织进行石蜡切片,并进行HE染色。结果显示,胸腺分为外周的皮质和内层的髓质,皮质主要由淋巴细胞和少量上皮细胞构成,着色较深;髓质主要由上皮细胞和少量淋巴细胞构成,着色较浅,其中有典型的胸腺小体结构。随着周龄增加,鸡胸腺皮质逐渐变薄,髓质面积增加,皮髓面积比逐渐减小,胸腺中血管和胸腺小体呈增多趋势。
  3.鸡胸腺发育过程中细胞增殖的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织切片进行免疫组织化学染色,检测PCNA阳性细胞的分布和发育变化规律。结果显示,PCNA阳性细胞在胸腺皮质和髓质均有分布,随周龄增加,阳性细胞数目逐渐减少。以上结果表明,鸡胸腺中细胞增殖活动随着周龄的增加而减弱。
  4.鸡胸腺发育过程中肥大细胞的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织切片进行甲苯胺蓝染色,检测肥大细胞的分布和发育变化规律。结果显示,肥大细胞主要位于胸腺髓质和血管周围。肥大细胞数目在1w升高然后下降,在9w又升高以后逐渐减少。
  5.鸡胸腺发育过程中基因表达的变化规律
  采用RNA-Seq技术检测鸡胸腺发育过程中的基因表达变化规律。测序共获得原始数据21723697300bp,经过过滤质控去除低质量读段后,剩余有效数据21708736650bp,有效读段434174733条,平均24120819条有效读段,有效读段率均大于99.8%,与参考基因组比对率均达到了90%。根据基因表达量进行表达趋势分析,共获得显著富集趋势10个。对持续上调趋势Profile39和持续下调趋势Profile8进行GO和KEGG通路富集分析发现,profile39(即上调趋势)GO富集主要与炎症、免疫、信号转导、凋亡等有关;KEGG富集主要与免疫系统、分泌系统、感染性疾病、信号传递、细胞活动和脂质代谢有关;profile8(即下调趋势)GO富集主要与遗传物质相关组成、传递、修复以及能量代谢等有关;KEGG富集主要与细胞生长和死亡、遗传信息传递、能量和碳水化合物代谢、氨基酸和核苷酸代谢有关。
  对下调趋势细胞周期通路中与细胞增殖和遗传信息传递密切相关的几个关键基因PCNA、CDK1、CCNA2、CCNB2进行实时荧光定量PCR检测,发现其变化规律和测序结果一致,随周龄增加表达量持续降低。
  以上研究结果表明,随着周龄增加,细胞增殖减少,胸腺结构完整性被逐渐破坏,微环境发生变化,导致胸腺重量减少。胸腺中遗传物质传递被破坏阻断,胸腺中物质代谢水平降低,脂肪代谢增加,炎症反应和免疫反应增强。
[硕士论文] 陈文娟
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:清平猪具有妊娠期短和产仔数多等优良繁殖性状,利用标记辅助选择对繁殖、生长和胴体性状进行选育能有效加快清平猪杂交品系的育种进程。本试验选择了9个候选基因:ESR、FSHβ、PRLR、MC4R、GH、IGF1、NR6A1、FUT1和MUC13,分别对清平猪杂交群体(F1和F2)的繁殖、生长和胴体性状进行关联性分析,以期为生产实践中对清平猪杂交品系的选育提供一些理论依据。本试验的研究结果如下:
  1.F1群体和F2群体的平均妊娠期分别为112.89d和113.36d,总产仔数分别为12.42头和9.98头,清平猪的杂交后代(F1和F2)均具有妊娠期短的优良特性。
  2.FSHβ基因、ESR基因、PRLR基因、IGF1基因和MUC13基因与清平猪杂交后代的关联性:
  (1)两个群体中FSHβ不同等位基因的优势均不明显,不同基因型对F1群体的产活仔数以及F2群体的总产仔数、初生重、断奶仔猪重和3周龄重等重要繁殖性状均有显著影响(P<0.05),其对繁殖性状的有利基因型为BB型。
  (2)两个群体中ESR的优势基因均为B等位基因,三种基因型对妊娠期的影响趋势均为AB<AA<BB,对F2群体的妊娠期和木乃伊性状有显著影响(P<0.05)。ESR基因的AB型个体可能具有较短的妊娠期,A等位基因可能会增加每胎木乃伊的数量。
  (3)F1和F2群体中PRLR的优势基因均为C等位基因,不同基因型对F1群体的妊娠期和乳头数(左和右)均有极显著影响(P<0.01),对总产仔数、断奶仔猪数、70日龄存活数和70日龄重均有显著影响(P<0.05),对F2群体的弱仔数、初生重、断奶仔猪重和3周龄重均有显著影响(P<0.05),其有利基因为T等位基因。
  (4)F2群体中IGF1-1位点和IGF1-2位点的优势基因分别为G基因和A基因,两个位点对繁殖性状的有利基因型可能均为AA型。
  (5)MUC13基因的G等位基因在F2群体中优势明显,AG和GG型对背膘厚的影响接近显著水平,对妊娠期、断奶仔猪重和3周龄重的影响均显著(P<0.05),其有利基因型为GG型。
  3.MC4R、GH和NR6A1对F2群体生长和胴体性状的影响:
  (1)MC4R的优势基因为G等位基因,不同基因型对背膘厚差异显著(P<0.05),AA型个体的平均日增重与AG型个体差异显著(P<0.05),与GG型个体差异极显著(P<0.01),其有利基因型为GG型。
  (2)GH的G等位基因优势明显,不同基因型对平均日增重的影响接近显著性水平(P≈0.08),对达100kg日龄的影响差异极显著(P<0.01),其有利基因为G等位基因。
  (3)NR6A1的优势基因为A等位基因,不同基因型对背膘厚的影响差异极显著(P<0.01),其对胴体和生长性状的有利基因分别为A和G等位基因。
  4.F2样本中的FUT1基因暂未检测到TT抗性基因型,呈极端单态分布。其对妊娠期、总产仔数、初生重、断奶仔猪数和3周龄重等繁殖性状的影响趋势均为CT>CC,对达100kg日龄的影响接近显著性水平,其有利基因为T等位基因。
[博士论文] ANJUMAN ARA BHUYAN
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:牛病毒性腹泻(BVD)由是牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的能严重影响牛群的健康状态和生产情况,可引起持续的经济损失,是全球最重要的牛传染病之一。BVDV为黄病毒科瘟病毒属成员,其致病机制独特且能引起免疫抑制,常导致该病防控失败。正确的免疫程序、准确的检测方法和清除持续感染动物等措施对于持续有效地防控该病十分重要。本研究构建了表达BVDV E2蛋白的重组干酪乳杆菌(L.casei)评估了其免疫原性,研究了干酪乳杆菌的抑制病毒增殖能力,同时还建立检测BVDV抗原的ELISA方法,为该病的预防与控制提供技术支持。
  1、表达BVDV囊膜糖蛋白E2重组干酪乳酸杆菌(L.casei/pELX1-E2)的构建和免疫原性评价
  1.1、重组干酪乳酸杆菌(L.casei/pELX1-E2)的构建
  BVDVE2蛋白可以诱导机体产生高水平的中和抗体,同时L.casei在腹泻病的防控中被广泛使用,常被用作异源基因表达载体。本研究首先通过RT-PCR扩增BVDV(NADL-AV67)的E2基因,将其克隆至pELX1载体,构建重组载体pELX1-E2。将构建好的重组载体转入大肠杆菌BL21感受态细胞中,通过SDS-PAGE和Western blot(WB)验证E2蛋白的表达。将重组载体pELX1-E2电转到L.casei感受态细胞中,得到重组菌株L.casei/pELX1-E2。通过SDS-PAGE和WB证实重组L.casei/pELX1-E2能成功表达E2蛋白。表达产物大小约为40kDa,且当菌液OD600值达到1.5时表达量最高。通过间接免疫荧光(IFA)试验证实E2蛋白表达于重组细菌的表面。
  1.2、用BALB/c小鼠评估疫苗株免疫原性。
  将小鼠随机分成5组,其中3组分别通过口服、鼻内和肌内注射等途径免疫等量的(1010CFU/mL)重组干酪乳杆菌(L.casei/pELX1-E2),另外2组分别口服含空质粒的干酪乳杆菌(L.casei/pELX1)和无菌PBS。两周后加强免疫,共免疫三次。在免疫后0、14、28、42天,尾静脉采血,检测IgG、IFN-γ和IL-12水平,收集粪便检测sIgA水平以评估黏膜免疫水平。使用105TCID50剂量的BVDV-1株攻击免疫鼠以评估疫苗的保护效力。与肌肉注射L.casei/pELX1-E2相比,口服或者鼻内注射L.casei/pELX1-E2能显著(P<0.01)提高黏膜sIgA、血清IgG、IFN-γ和IL-12水平,其中鼻内接种免疫效果最好。中和试验结果显示,该疫苗株能产生针对BVDV的中和抗体,效价为1∶128。由此可见,L.casei/pELX1-E2可以作为一种安全、有效的预防BVD的候选疫苗。
  2、L.caseiMCJ蛋白质代谢物(LPM)抑制BVDV-1感染MDBK细胞的研究。
  乳酸杆菌被广泛应用于人和动物胃肠疾病的预防和治疗。本试验使用MDBK细胞模型,研究LPM体外抗BVDV的作用。首先从L.casei培养液中提取其安全性和活性好的LPM;其次,测定了LPM对细胞的毒性,当LMP浓度达到3000μg/ml细胞活性仍高于80%,说明LPM的细胞毒性较小。空斑试验结果证明LPM可以有效抑制BVDV感染。为了研究LPM的抗病毒机制,分别在BVDV-1病毒感染前、感染时和感染后用LPM处理MDBK细胞。间接免疫荧光试验、定量RT-PCR和WB结果显示,经LPM处理后BVDV感染细胞的数量、病毒的拷贝数以及BVDV E2蛋白的表达量显著减少,在三种处理中,在BVDV感染的同时加入LPM抑制效果最好。本研究证明LPM具有潜在的抗BVDV作用。
  3、BVDV抗原检测夹心ELISA方法的建立
  3.1、重组蛋白的表达、单克隆抗体和多克隆抗体的制备。
  首先将BVDV的NS3和E2基因分别克隆到pET-30a(+),使用原核表达系统表达NS3和E2蛋白。将纯化的E2蛋白免疫四周龄BALB/c小鼠(n=5)。间接ELISA结果显示杂交瘤细胞(IB-10)产生的抗体可识别与E2蛋白和BVDV-1抗原,其效价为1∶12800。纯化用杂交瘤细胞免疫小鼠的腹水,获得E2蛋白的单克隆抗体。使用纯化的NS3蛋白免疫10周龄新西兰白兔制备针对NS3蛋白的多克隆抗体(PAb)。采用间接ELISA、WB和IFA试验鉴定MAb和PAb。
  3.2、抗原捕获ELISA反应条件的优化。
  使用棋盘滴定法确定能产生最高P/N值的反应条件。以兔抗NS3多克隆抗体为捕获抗体、鼠抗E2单克隆抗体为检测抗体。检测了25份BVDV阴性白细胞样品,根据平均OD值确定该方法的判定标准是OD值0.523。该ELISA可检测最低浓度为50ng/mL的BVDV蛋白的和103TCID50的病毒量。批间和批内变异系数分别为3.87%和6.90%。本AC-ELISA方法可以有效区分BVDV与引起牛和猪腹泻的其他病原,无假阳性结果。
  3.3、模拟阳性样品的检测。
  将BVDV人为加入白细胞样品、皮肤和肺样品中,用本方法、TaqMan qRT-PCR和传统RT-PCR同时检测计算Kappa值。本方法与这两种方法之间的Kappa值为0.86,1.0;0.86,0.72和0.72,0.85,检测结果具有高度一致性。表明一种敏感性和特异性较好的BVDV-1的抗原捕获ELISA方法已经建立,但还需要进一步的临床评价。
  结论:本研究用小鼠模型评估了表达BVDV E2蛋白的重组干酪乳杆菌的免疫原性,结果表明该重组菌有成为新的抗BVDV疫苗的潜力;发现干酪乳杆菌在体外具有抗BVDV的活性,表明干酪乳杆菌在预防BVDV感染中的潜在治疗功能本研究还建立了高灵敏度、特异性的抗原捕获ELISA。本研究为BVD的防控提供了新的手段。
[硕士论文] 景若曦
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:卵巢发育是一个受多因子调控的动态过程。实验证明,哺乳动物和禽类的卵巢发育过程在卵巢雌激素调控方面存在差异。芳香化酶(CYP19A1)是雄激素转化为雌激素所需要的重要限速酶。本研究将围绕鸡卵泡颗粒细胞层以及膜细胞层,通过高通量测序技术检测鸡小黄卵泡中各细胞层转录组情况,利用生物信息学技术分析鸡卵泡颗粒细胞层与膜细胞层基因表达特点;并运用转录组测序数据与牛卵泡颗粒细胞层与膜细胞层转录组数据进行比较,通过基因表达模式筛选出鸡卵泡中可能调控芳香化酶基因的潜在转录因子,并通过双荧光素酶报告系统对候选转录因子进行验证。主要研究结果如下:
  (1)通过对鸡卵泡各时期各细胞层CYP19A1表达谱的结果分析,发现芳香化酶在鸡卵泡膜细胞层中高表达,并且在小黄卵泡时期表达量最高;
  (2)对鸡小黄卵泡膜细胞层以及颗粒细胞层进行转录组测序,通过分析得到膜细胞层特异表达基因179个,膜细胞层偏好表达基因196个,颗粒细胞层特异表达基因18个,颗粒细胞层偏好表达基因39个;
  (3)通过对鸡小黄卵泡阶段与牛卵泡分化及卵泡选择两个阶段分别进行共表达网络的构建、通过对比发现鸡小黄卵泡阶段基因表达模式与牛卵泡分化期更为接近;对鸡共表达网络进一步分析,发现两个与芳香化酶表达高度相关的基因模块;
  (4)通过对牛与鸡相似卵泡发育阶段基因表达模式的比较与筛选,确定ESR2为调节鸡卵泡芳香化酶基因的候选转录因子;
  (5)在细胞水平,通过双荧光素酶报告系统验证ESR2对CYP19A1启动子片段活性有抑制作用。
[博士论文] 王婷
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:外泌体(Exosomes)是细胞向胞外分泌的一类双层膜包被的囊泡,直径为30-150nm。外泌体可以介导蛋白质或核酸的转运,从而参与多种生理或病理过程。以前的研究发现,某些病毒可以通过外泌体携带其基因组或病毒粒子,从而介导病毒在细胞之间的传递或建立感染。我们前期在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染细胞的分泌蛋白质组学研究时发现,PRRSV感染细胞后外泌体释放途径被激活。同时,国外学者发现,从PRRSV感染猪的血清中提取的外泌体中含有PRRSV部分编码蛋白。但是,外泌体是否能够携带PRRSV基因组RNA或病毒粒子从而介导病毒在细胞之间的扩散尚不清楚。因此,本研究开展了外泌体在PRRSV感染中的作用研究,发现PRRSV感染细胞的外泌体携带病毒的基因组RNA,分泌的外泌体可以建立感染。更重要的是,我们发现外泌体介导的PRRSV感染不能被PRRSV特异性中和抗体中和,是PRRSV逃逸中和抗体作用的一种策略。主要研究内容如下:
  1.PRRSV感染细胞释放的外泌体(PRRSV-exosome)提取与纯化
  为了获得无游离PRRSV污染的外泌体,我们先采用PEG沉淀法富集PRRSV感染细胞上清中的外泌体,经超高速离心去除杂蛋白,然后通过CD63磁珠免疫亲和法对提取的外泌体进行纯化。通过Western blot检测、电镜观察和免疫金标记技术对提取的外泌体纯度进行检测。Westem blot结果证实提取的外泌体含有外秘体标志蛋白CD9,CD63和Alix,但未检测到内质网标志蛋白GRP94;电镜下观察到提取的外泌体呈典型的囊泡结构,大小为30~150nm;免疫金标记技术能检测到外泌体的标记蛋白Alix,但检测不到PRRSV的病毒粒子蛋白nsp2和GP4。上述检测结果表明提取的外泌体纯度高,且无游离的病毒粒子污染。
  2.PRRSV-exosome包含病毒成分
  采用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)对纯化的外泌体进行分析,发现外泌体中含有216种宿主蛋白,大部分是以前报道的外泌体分泌蛋白。同时,我们还发现纯化的外泌体中含有PRRSV的3种结构蛋白(GP5、M和N),用针对这三种结构蛋白的单克隆抗体通过Western blot检测纯化的外泌体,证实这三种结构蛋白确实包含在纯化的外泌体中。进一步通过RT-PCR分析了纯化的外泌体中是否包含PRRSV基因组RNA,将PRRSV的基因组分成5个重叠的片段进行检测,可以成功扩增5个重叠的片段,提示纯化的外泌体中可能含有PRRSV的完整基因组RNA。
  3.PRRSV-exosome对允许细胞和非允许细胞均具有感染性
  将纯化的PRRSV-exosome接种PRRSV允许细胞PK-15CD163和Marc-145细胞,通过观察细胞病变、检测病毒蛋白表达和TCID50测定分析PRRSV-exosome是否具有感染性。结果发现,在两种细胞上均能观察到PRRSV所引起的典型细胞病变,间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot均能检测到PRRSV N蛋白表达,TCID50检测证实外泌体感染所获得的病毒滴度与PRRSV感染细胞所获得的病毒滴度无显著差异。进一步将PRRSV-exosome接种PRRSV的非允许细胞PK-15,同样能观察到典型的细胞病变和PRRSVN蛋白的表达,说明PRRSV-exosome在PRRSV允许细胞和非允许细胞上均能建立增殖性感染。
  4.外泌体释放抑制剂能抑制PRRSV-exosome介导的PRRSV传播
  采用Transwell system建立PK-15cD163和PK-15细胞的共培养模型,检测在共培养体系中加入外泌体抑制剂GW4869后两种细胞中PRRSV感染与增殖情况。Real-time PCR和Western blot检测发现,加入抑制剂后不影响PK-15CD163细胞中病毒基因组RNA水平和nsp2蛋白表达,而PK-15细胞中病毒RNA水平和nsp2的表达量均显著降低,说明外泌体释放抑制剂能抑制外泌体介导的PRRSV传播,同时也间接证实PRRSV-exosome能在PRRSV非允许细胞上建立增殖性感染。
  5.PRRSV中和抗体不能阻断PRRSV-exosome介导的PRRSV传播
  将PRRSV特异性中和抗体处理的PRRSV-exosome和PRRSV分别接种PK-15CD163细胞和Marc-145细胞,IFA和Westem blot检测PRRSV N蛋白或nsp2蛋白的表达,结果经中和抗体处理过的PRRSV所接种的细胞中N蛋白和nsp2蛋白表达均显著降低,而中和抗体处理过的PRRSV-exosome接种的细胞中N蛋白和nsp2蛋白表达均无明显变化。进一步采用Transwell system共培养PK-15cD163和Marc-145细胞,通过荧光定量RT-PCR检测中和抗体对PRRSV-exosome感染性的影响,结果与对照相比,两种细胞中PRRSV RNA水平无显著差异,并且在PK-15CD163和原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)的共培养模型中也获得了同样的结果,说明中和抗体不影响PRRSV-exosome介导的PRRSV传播。
  6.PRRSV N蛋白可通过外泌体途径激活NF-κB信号通路并诱导炎症反应
  由于PRRSV感染细胞的外泌体含有病毒的N蛋白,而以前的研究证实PRRSVN蛋白具有诱导炎症反应的特性。为了探讨N蛋白是否可以通过外泌体途径介导炎症反应,将N蛋白的真核表达质粒转染HEK-293T细胞并从转染细胞上清中纯化外泌体(N-exosome),Western blot检测证实纯化的外泌体中含有N蛋白。用纯化的外泌体处理PK-15CD163细胞,检测NF-κB的激活和炎症因子表达,发现含有N蛋白的外泌体可激活NF-κB的荧光素酶活性、促进p65的磷酸化和核转运,IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES等炎症因子mRNA水平也显著上调,而且在PAM细胞上也观察到同样的结果,说明N-exosome可激活NF-κB信号通路并诱导炎症反应。
[博士论文] 黄淑成
临床兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胫骨软骨发育不良(Tibial dyschondroplasia,TD)是一种家禽的营养代谢性腿部疾病,主要在胫骨干骺端的肥大软骨细胞区出现非血管化和非钙化的不成熟的软骨细胞堆积在生长板,表现为软骨内骨化的异常。在1965年,该病最先在美国被Leach RM和MC Nesheim在青年肉鸡上发现并报道,随后在火鸡和鸭等家禽上也陆续发现,临床主要表现为不愿站立,腿部骨骼变形,行动缓慢并常常以双翅来辅助行走,严重者丧失行走能力,影响采食。禽类TD病在世界各国呈广泛分布,没有区域集中性或特意高发性,每年给全世界禽类行业造成不可估量的经济损失。由于发病原因的复杂性,增加了研究其机理的难度性,肉鸡发生TD的最根本的病因至今还不清楚。
  藏鸡(Tibetan chicken,TBC)主要生活在海拔2,200~4,100m的青藏高原农牧地区,是世界上在高海拔低氧环境生活历史最悠久的土著鸡种,且至今未见有藏鸡腿病的报道,这可能与其长期生活在高海拔低氧环境有关。研究指出肉鸡TD的发生与胫骨生长板血管生成的异常有关,而骨骼的形成过程都与血管生长的过程是紧密相关的。鉴于此,我们对高海拔藏鸡和低海拔肉鸡进行了对比研究,并验证高海拔低氧环境对低海拔肉鸡的胫骨生长发育的影响,也对肉鸡TD的发生是否与胫骨生长板血管生长抑制有关作进一步研究,同时更深入的研究肉鸡发生TD时,胫骨生长板血管生长过程是如何调控的以及血管生成的减少如何影响胫骨的生长和发育。主要研究内容如下:
  1.藏鸡与肉鸡在生产性能和骨骼发育上的对比研究
  与生活在低海拔肉鸡相比,藏鸡在骨骼生长方面是否存在什么特殊之处至今仍很大的未知。在同一月份内,120只1日龄健康高海拔TBC和低海拔爱拔益加肉鸡(Arbor Acres chicken,AAC)分别在两地进行饲养。结果显示:TBC的采食量、日增重和体重,以及胫骨的重量、胫骨的长度和胫骨生长板的宽度均显著低于低海拔AAC(p<0.05)。然而,胫骨的组织病理观察到藏鸡胫骨生长板区域血管的分布明显增多。qRT-PCR结果显示HIF-1α、VEGFA以及其受体VEGFR1和VEGFR2在藏鸡胫骨生长板上的表达量均显著高于低海拔AAC(p<005)。ELISA结果也显示类似的改变,整个试验期间藏鸡血清VEGFA的蛋白含量均高于低海拔AAC。血清中VEGFR2和IL-8蛋白含量除了第7天低于AAC,在第3天、第10天和第14天均显著高于AAC(p>0.05)。这些结果表明,高海拔缺氧环境对TBC的身体和胫骨的生长是抑制的。但藏鸡胫骨生长板区域分布丰富的血管,而且较高血管生成调控基因HIF-1α、VEGFA以及其受体的表达,这可能就是TBC不发生TD的原因。
  2.高海拔低氧环境对肉鸡胫骨生长板上HIF-1α/VEGF/VEGFR信号通路表达的影响
  藏鸡是青藏高原上一个土著的地方鸡种,能够对当地严酷的高原低氧含量、低气压、高寒的环境有很好的适应性。并且通过之前的研究发现藏鸡胫骨生长板区域拥有更丰富的血管分布,血管生长相关调控基因表达水平也较高。那么,高海拔低氧环境是否可以诱导胫骨生长板更多的血管分布还未深入研究。因此,本实验选取120只健康低海拔AAC,运输到高海拔地区西藏进行饲养,分为自然低氧组和正常氧气组进行试验。结果显示,在高海拔低氧环境下AAC的生产性能和体重都受到抑制,死亡率增加;另外,胫骨的重量和长度也不同程度受到抑制。然而,血液常规指标显示在低氧环境下AAC在第14天出现的红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)和红细胞压积(Hct)增加。值得注意的是,胫骨的组织病理学分析显示在自然低氧环境14天后AAC胫骨生长板区域血管密度显著增加。qRT-PCR和Western blot结果显示肉鸡在高海拔低氧的条件下,胫骨生长板上缺氧应激基因HIF-1α和血管生长相关基因VEGFA和VEGFR1的表达水平都有显著的过表达。ELISA检测血清蛋白含量进一步证实缺氧条件下可以增加血清中VEGFA、VEGFR2和IL-8的蛋白含量。这些结果说明,低海拔AAC生活在高海拔低氧环境下,可以通过调控机体缺氧应激基因HIF-1α和血管生长相关基因VEGFA和它的受体的表达,促进胫骨生长板肥大软骨细胞区血管分布的增加。
  3.HIF-1α/VEGF/VEGFR信号通路在福美双诱导的TD肉鸡上的作用机制
  TD是一种比较棘手的家禽腿病问题,组织病理显示在胫骨近端的生长板上出现大面积的非血管化和非钙化的“软骨楔”为特征,导致骨骼钙化不全,这可能与胫骨生长板血管生成异常有关。然而,血管生成抑制在肉鸡TD发生中所扮演的角色仍然还不清楚。通过福美双诱导肉鸡发生TD期间观察到肉鸡发生跛行,胫骨生长板增宽,呈白色的非血管区。对胫骨形态指标测量显示胫骨的重量和长度减少,生长板宽度及生长板宽度系数增加。组织病理显示AAC发生TD时,胫骨近端静止区和增殖区血管的分布没有显著改变,而肥大软骨细胞区血管的分布呈显著的减少并且软骨细胞大量死亡。另外,血常规指标也显示AAC发生TD时,RBC、Hb和Hct都显著减少。接下来通过qRT-PCR、Western blot和ELISA的方法分别检测胫骨生长板上和肉鸡血清中血管生成相关基因和蛋白的表达情况,结果显示:HIF-1α、VEGFA以及它的受体的基因表达和蛋白水平在第7天TD肉鸡组都显著的减少,并且这些基因的表达水平与胫骨生长板血管的分布呈极强的正相关。总之,这些发现说明AAC发生TD时,机体可能是通过下调胫骨生长板上血管生成相关基因和蛋白HIF-1α、VEGFA以及它的受体的表达,从而抑制胫骨肥大软骨细胞区血管的分布,导致家禽胫骨生长发育的抑制。
  4.VEGF/FGF/Ang-1/PDGF-BB及其受体在TD肉鸡胫骨血管形成过程中的作用机制
  先前的研究表明,骨骼是一种高度血管化的组织,并且依赖于血管生成与成骨形成之间的协调耦联。既然血管生成的抑制和肉鸡TD的发生具有极大的相关性,那么肉鸡TD发生时,胫骨生长板肥大区血管形成过程是如何被调控的仍不清楚。研究结果显示:AAC发生TD时,中胚层分化的标志性基因纤维母细胞生长因子2(FGF2)和受体FGFR1表达水平下降;血管岛形成标志性基因血管内皮生长因子(VEGF)和受体VEGFR1\VEGR2的血清蛋白浓度被显著降低;血管岛成熟相关基因的调控包括血管生成素(Ang1,Ang2)以及它们的内皮受体酪氨酸激酶Tie2等相关基因被抑制,这些或许将导致血管发生的推迟。另外,机体通过下调VEGFA和VEGFR1\VEGFR2受体基因和蛋白的表达,上调血小板源性生长因子(PDGF)-BB及受体PDGFR-β基因表达和血清蛋白水平的升高,导致胫骨生长板血管的异常增殖和成熟,血管生成的减少。总之,肉鸡发生TD时,血管生成的抑制可能是通过抑制血管发生和血管生成过程的相关调控基因和蛋白的表达,从而导致胫骨生长板上血管分布的减少。
  5.OPG/RANKL信号通路在TD肉鸡胫骨生长上的作用机制
  TD肉鸡血管形成的抑制势必会影响骨的正常形成,那么骨生成过程发生怎样的异常调控至今仍不清楚。研究结果显示:与正常组AAC相比,肉鸡发生TD时,肉鸡的体重,胫骨的骨量、长度和中央直径都显著减少,并且体重与胫骨的骨量呈正相关。组织病理和形态学结果显示TD肉鸡胫骨近端生长板肥大区血管分布显著减少,软骨细胞呈核固缩和核溶解,生长板宽度增加。血清生化结果显示AAC发生TD时血清碱性磷酸酶(ALP)活性受到抑制,钙磷平衡被破坏。另外,通过qRT-PCR和ELISA检测胫骨生长板和血清中调控骨骼生成相关基因和蛋白发现TD肉鸡胫骨生长板和血清中骨保护素(OPG)基因和蛋白的表达都显著受到抑制,核因子κB受体活化因子配体(RANKL)表达水平上调,这将促进其受体核因子-κB受体活化因子(RNAK)信号的激活。并且OPG的水平与胫骨生长板上血管的分布以及胫骨的生长呈正相关,RANKL呈负相关。这些结果说明肉鸡TD发生时,胫骨近端血管浸入的减少导致软骨细胞的死亡影响骨架的延伸,同时死亡软骨细胞在生长板肥大软骨细胞的堆积,在生长板处形成严重的损伤区域。另外,肥大软骨细胞区血管侵入的减少,血清钙磷水平的失调影响肥大区软骨基质的钙化。基因水平进一步说明,促进骨形成的OPG基因被抑制,而RNAKL基因的上调,促进RNAK信号激活破骨细胞的骨吸收功能,从而影响骨的转化,导致骨量的减少。
  总之,试验通过对藏鸡的研究首次揭示藏鸡不发生胫骨软骨发育不良的生理机制可能是通过长期的高海拔低氧环境适应,上调HIF-1α,VEGF以及其受体基因的表达,提高胫骨生长板上血管的侵入有关;而且,高海拔缺氧环境对肉鸡的影响进一步证实这一作用机制。另外,福美双诱导的肉鸡TD模型显示胫骨生长板上VEGF以及其受体VEGFR1和VEGFR2基因的异常表达,抑制胫骨生长板血管化与肉鸡TD发生存在极强的正相关,这一过程可能是通过血管发生与血管生成过程中相关调控基因的异常表达,从而抑制胫骨血管化的正常分布而实现的;重要的是,血管与骨的形成是紧密相偶联的,胫骨血管化的减少影响OPG/RANKL信号通路的不平衡的表达,血清中钙磷比的异常,最终影响骨的形成,引起胫骨骨量的减少。
[博士论文] 杨新
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本论文对湖北省山羊主要寄生蠕虫开展分子流行病学调查方面的研究。论文主要包括文献综述,描述已取得成果的八个章节以及讨论。文献综述发现了一些需要解决的问题(第一章),这些问题主要包括山羊寄生虫分子流行病学调查、山羊寄生虫的分子鉴定与诊断以及山羊线虫的抗药性。
  本研究的目的是针对这些需要解决的问题开展相关方面的研究,包括:(1)通过对湖北省山羊寄生蠕虫的调查明确其流行情况;(2)对调查中发现的重要前后盘吸虫开展线粒体基因组的研究,为今后的分子流行病学、种群遗传结构以及遗传进化分析的研究提供更多的分子标记;(3)针对优势虫种捻转血矛线虫建立环介导等温扩增检测方法用于捻转血矛线虫病的特异性诊断;(4)同时,对湖北省山羊消化道线虫的抗药性进行调查,为该地区山羊寄生蠕虫病的防控提供参考。
  结合形态学检测技术及基于PCR的DNA测序方法对张港镇(第二章)及罗田县(第三章)放牧山羊寄生蠕虫感染情况进行调查,结果表明山羊寄生蠕虫,尤其是消化道线虫,全年都维持在较高的感染水平,线虫在2月份、5月份、9月份和12月份会出现感染的小高峰;吸虫感染主要出现在3-8月份,这可能与中间宿主螺蛳的活动相关;绦虫感染没有明显的季节动态。山羊寄生蠕虫主要包括捻转血矛线虫、蛇形毛圆线虫、奥斯特线虫、鞭虫、粗纹食道口线虫、前后盘吸虫、矛形双腔吸虫、肝片吸虫、胰阔盘吸虫、细颈囊尾蚴和扩展莫尼茨绦虫,优势虫种为捻转血矛线虫、前后盘吸虫及细颈囊尾蚴。
  针对重要前后盘吸虫长菲策吸虫(第四章)、荷包腹带吸虫(第五章)及野牛平腹吸虫(第六章)开展线粒体基因组的测序与分析,为后续的分子流行病学、种群遗传结构以及遗传进化分析的研究提供有用的分子标记。结果表明长菲策吸虫、荷包腹袋吸虫及野牛平腹吸虫线粒体基因组具有相同的基因排序,并且,基于线粒体全基因组的遗传进化分析表明三种前后盘吸虫与鹿前后盘吸虫的亲缘关系最近,这与它们在分类学上的关系相一致(第四至六章)。
  针对优势虫种捻转血矛线虫核糖体第二内转录间隔(ITS-2)建立了环介导等温扩增检测方法,并将该方法用于生产实践中捻转血矛线虫病的诊断,结果表明该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强及省时的优点(第七章)。
  在山羊寄生蠕虫调查过程中,发现驱虫药的超剂量使用在山羊驱虫过程中十分普遍,尤其是伊维菌素。为了验证是否存在抗药性,结合粪便虫卵计数减少实验(FECRT)及死后剖检在湖北省张港镇及罗田县放牧山羊中开展抗药性的调查,结果首次证明张港镇(第八章)和罗田县(第九章)山羊消化道线虫存在苯并咪唑、左旋咪唑及伊维菌素抗药性。
  本研究对于湖北地区山羊寄生蠕虫流行病学调查、重要吸虫分子生物学特性及抗药性检测等方面的研究具有重要的意义。本研究的结果为湖北省山羊寄生蠕虫的后续研究及其防控提供参考(第十章)。虽然本研究主要关注山羊优势寄生蠕虫,但本研究的结果对于我国其它家畜寄生蠕虫的系统研究具有借鉴意义。
[博士论文] 郝兴杰
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:全基因组关联分析(Genome-wide Association Study,GWAS)和基因组选择(Genomic Selection,GS)已经成为研究人类和动植物复杂性状遗传基础和表型预测的重要手段。随着测序技术的发展,人类和动植物基因组的功能注释不断完善,在GWAS和GS中整合SNP的生物学注释信息将有利于复杂性状遗传基础的挖掘和表型预测准确性的提高。因此,本研究基于混合线性模型分别在GWAS和GS中提出整合功能注释信息的策略和模型,建立了整合先验生物学信息的全基因组最佳线性无偏预测(incorporate Prior biological information in Genomic Best Linear Unbiased Predictor,pGBLUP),整合多种注释信息鉴定性状相关组织(Scalable Multiple Annotation integration for trait-Relevant Tissue identification and usage,SMART)两种遗传学分析方法。本研究的主要研究结果如下:
  (1)建立了pGBLUP模型和方法,通过模拟比较pGBLUP和常见基因组选择方法(GBLUP和BayesR),发现pGBLUP使用生物学注释信息可以提高基因组选择功效,但对注释信息的功能也存在依耐性;
  (2)pGBLUP模型可以被拓展后用于遗传力富集分析,可以准确估计不同功能注释信息的遗传力富集程度,作为衡量不同功能注释对性状性状影响的指标;
  (3)pGBLUP应用于奶水牛基因组选择,奶牛产奶性状QTL区域对奶水牛产奶性状具有中等较弱的遗传力富集(fe<5),在奶水牛样本量有限(412头)的情况下,整合奶牛产奶性状QTL信息以提高奶水牛产奶性状基因组选择的效果不明显,但pGBLUP为将来在小群体中整合先验生物学功能信息进行基因组选择提供了策略;
  (4)pGBLUP应用于仔猪八字腿功能注释信息遗传力富集分析,鉴定出了在仔猪八字腿遗传力上高度富集(fe>100)的7条KEGG信号通路,其中信号通路KEGG_MTOR_SIGNALING_PATHWAY控制肌肉发育,值得进一步深入研究;
  (5)建立了SMART模型和方法,通过模拟测试以及真实数据应用,发现SMART整合多种注释信息有利于准确鉴定性状相关组织(细胞),且利用SMART鉴定的性状相关组织构建的SNP权重,可以提高SNP-set检验功效,在GWAS中鉴定出更多的位点;
  (6)SMART应用于人类复杂性状和基因组功能注释公共数据:根据性状与组织相关性,将43个性状分层聚为5大类,从整合多组学功能注释信息角度发现性状之间的相关关系;同时对不同组蛋白注释信息效应的估计,发现组蛋白H3K4me1和H3K4me3具有较大效应,适合进行基因组功能预测。
  总之,本研究建立了整合功能注释信息的基因组选择方法pGBLUP和全基因组关联分析方法SMART,通过整合功能注释信息提高基因组选择和全基因组关联分析的功效,将为复杂性状遗传基础的研究和表型预测提供新的思路和工具,有助于通过整合和利用动物多组学功能注释信息加快动物的遗传选育。
[硕士论文] 屈文萍
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:骨骼肌卫星细胞是一类位于肌纤维膜表面与基底膜之间的细胞,在肌肉的发育和再生过程中发挥着重要的作用。长非编码RNA(Long non coding RNAs,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt,具有低蛋白编码潜力的RNA分子。lncRNA能够调控基因表达、参与表观遗传修饰,影响细胞增殖、分化和凋亡等多种生命活动的进程。本研究以体外分离的猪骨骼肌卫星细胞为材料,研究一个新的lncRNA-AK394747在细胞增殖和分化过程发挥的功能及可能存在的机制。主要研究结果如下:
  1.利用两步酶消化法成功分离出活性较高、有一定增殖能力的猪原代骨髂肌卫星细胞,经差速贴壁纯化后,用Pax7基因对分离的细胞进行鉴定,免疫荧光结果显示细胞阳性率高达95%。同时,对分离的细胞进行分化诱导培养,能形成肌管,且稳定表达MyoD、MyoG和MyHc这三个成肌标志基因。
  2.通过RACE和测序验证了猪AK394747全长为1586bp,生物信息学分析发现该lncRNA不具有编码蛋白的能力,主要存在于细胞质中,时空表达谱分析表明AK394747在腿肌、背肌等肌肉组织中高表达,且随着猪骨骼肌细胞的分化表达量上升。
  3.在猪骨骼肌细胞中利用干扰和超表达实验研究了AK394747对细胞增殖和分化的影响,EdU、RTCA以及细胞周期检测等实验结果发现该lncRNA对骨骼肌细胞的增殖过程无显著影响,并且增殖相关基因ki67、N-Ras和CDK家族基因表达变化不显著;而干扰AK394747后,利用Q-PCR、Westren Blotting以及免疫荧光技术检测发现肌细胞分化标志基因MyoD、myoG、MyHc等的mRNA和蛋白水平表达显著下降,表明AK394747促进了猪骨骼肌细胞分化。
  4通过生物信息学筛选了4个潜在的与AK394747结合的miRNA—ssc-miR-32,ssc-miR-218,ssc-miR-218-3p,ssc-miR-301。在干扰AK394747后,其中ssc-miR-32及其pri-RNA表达降低。通过在线软件预测发现AK394747基因与NICD蛋白可能相互结合,同时利用Q-PCR技术检测发现干扰AK394747后NICD(Notch1胞内片段)基因的表达显著升高。
  本实验研究了猪lncRNA-AK394747的基本性质,验证了其促进骨骼肌细胞分化的基因功能,初步预测了其可能发挥作用的方式,为研究AK394747在骨骼肌细胞发育过程中的作用机制奠定了基础,同时也为研究猪骨骼肌生长发育调控机制提供了新的思路。
[硕士论文] 吕梦婷
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种病毒性肠道传染病。自2010年底,由PEDV变异毒株引起的PED大规模暴发,给全球养猪业带来了严重的经济损失。目前尚无有效的药物用于该病的治疗,因此抗PED药物的开发成为研究热点。PEDV3C样蛋白酶(3CLpro)在PEDV增殖及致病过程中发挥关键作用,且在PEDV不同变异毒株中具有较好的保守性,因此,PEDV3CLpro可以作为开发抗病毒药物的重要靶标。而PEDV3CLpro和底物间相互作用机制的阐明将为靶向PEDV3CLpro特异性药物的研制提供理论依据。
  本实验室前期的分子生物学实验研究发现,PEDV3CLpro可以识别天然免疫信号通路中关键分子-NEMO的第231位(P1)谷氨酰胺并对其进行切割,当NEMO切割位点邻近的第229位(P3)谷氨酰胺突变为精氨酸(Q-P3-R)、赖氨酸(Q-P3-K)或丙氨酸(Q-P3-A)后,发现Q-P3-A突变体完全不能被PEDV3CLpro切割,而Q-P3-K和Q-P3-R突变体被PEDV3CLpro切割的程度减弱,表明P3位点的突变会影响NEMO被PEDV3CLpro识别和切割,提示NEMO P3位在PEDV3CLpro识别底物自身底物过程中可能具有某些特殊作用。但是,P3位氨基酸是如何影响底物被PEDV3CLpro识别的机制尚不清楚,因此,本论文利用分子动力学模拟针对PEDV3CLpro与NEMO之间的相互作用开展了以下研究:
  1.Western blot实验分析PEDV3CLpro识别NEMO P3位的特征
  有文献报道冠状病毒3CLpro底物P3位偏爱正电荷氨基酸和长侧链氨基酸,我们在分析PEDV3CLpro底物P3位偏爱性时,发现P3位偏爱性最高的氨基酸为天冬酰胺(N)。基于此,我们构建了NEMO229(QP3)位突变的2个突变体:Q-P3-E和Q-P3-N,将这两个突变体的真核表达质粒和实验室之前构建的NEMO野生型(WT)及3个突变体(Q-P3-A、Q-P3-K、Q-P3-R)的真核表达质粒分别转染HEK-293T细胞,通过Western blot实验检测不同转染体系中PEDV3CLpro对NEMO的切割程度。发现WT(无电荷、长侧链)、Q-P3-K(正电荷、长侧链)、Q-P3-R(正电荷、长侧链)可以被PEDV3CLpro切割,而Q-P3-A(无电荷、短侧链)不能被PEDV3CLpro切割,与本实验室前期实验结果相符;此外,Q-P3-E(负电荷、长侧链)及Q-P3-N(无电荷、长侧链)也可以被PEDV3CLpro切割,说明PEDV3CLpro底物NEMO P3位也可以是负电荷氨基酸。进一步分析发现在可以发生切割反应的体系的中,底物NEMO P3位均具有长侧链的特征,提示PEDV3CLpro底物NEMO P3位可能偏爱长侧链氨基酸。
  2.NEMO P3位点不同突变体与PEDV3CLpro间的自由能分析
  分子生物学实验是进行分子动力学研究的基石,而分子动力学研究可以从微观角度上观察到模拟体系原子尺度上的运动变化。为探究NEMO P3位点不同突变对PEDV3CLpro识别底物的影响,我们借助分子动力学模拟分析了NEMO野生型(WT)及5个突变体(Q-P3-A、Q-P3-K、Q-P3-R、Q-P3-E和Q-P3-N)与PEDV3CLpro间的自由能。发现Q-P3-A与PEDV3CLpro间的自由能值最大,说明Q-P3-A体系中酶与底物的亲和力最低,发生切割反应的可能性最小,与生物学实验证实Q-P3-A是唯一不能被切割的结果是一致的。
  3.NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV3CLpro的切割
  有文献报道:冠状病毒3CLpro底物P3位偏爱可以形成β-sheet结构的氨基酸,而PEDV也属于冠状病毒,因此,我们利用分子动力学模拟分析了不同突变体P3位点及其邻近氨基酸的二级结构变化,发现在可以发生切割反应体系中的NEMO(WT、Q-P3-K、Q-P3-R、Q-P3-E、Q-P3-N)均存在由P3、P2形成的β-sheet结构;但是,在无切割反应发生的体系中的NEMO(Q-P3-A)则不存在由P3、P2形成的β-sheet结构,表明NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV3CLpro的切割。进一步利用分子动力学模拟分析了6个体系中底物P3、P2位β-sheet结构存在的时间,发现在WT、Q-P3-N、Q-P3-K中,P3、P2位的二级结构始终为β-sheet,在Q-P3-R中,P3、P2位的二级结构由β-sheet逐渐转变为loop,在Q-P3-E中,P3、P2位的二级结构由loop逐渐转变为β-sheet,而在Q-P3-A中,P3、P2位的二级结构由β-sheet很快转变为loop,表明NEMO P3位的突变会影响P3、P2位β-sheet结构的形成和维持。
  4.NEMO P3位点的突变影响PEDV3CLpro酶活位点H41和C144间的距离
  在证实NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV3CLpro的切割后,利用分子动力学模拟对其作用的具体机制进行了分析。发现当底物P3、P2位二级结构由β-sheet转变为loop时,底物P2位氧原子构象由溶剂化表面翻转至PEDV3CLpro酶活口袋方向,底物P2位氧原子构象的变化又导致PEDV3CLpro上S2口袋氨基酸中H41的构象发生了改变,而H41构象的改变,则导致了其与另一个酶活位点C144间的相对定位发生了改变。而PEDV3CLpro酶促反应的第一步是H41上的N夺取C144上-SH的H,暗示H41和C144间的距离对酶促反应的发生至关重要。因此,进一步分析了PEDV3CLpro H41和C144间参与酶促反应的重原子间距,发现在不同体系中,H41和C144间的距离波动差异明显,表明NEMO P3位的突变会影响PEDV3CLpro酶活位点H41和C144间的距离。此外,我们分析了酶活位点间距和NEMO的切割程度间的相关性,发现二者的相关性系数为0.846,表明二者之间具有强相关作用,说明PEDV3CLpro中H41和C144间的合适距离是影响其对NEMO切割的重要因素。
[硕士论文] 牛红丹
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:应激反应导致机体内应激激素大量分泌,其中以皮质醇为主,它是影响肉质的一个较为重要的因素。课题组前期研究表明,在动物日粮饲喂过程中添加皮质醇会导致仔猪背最长肌肌肉组织受损严重,肌纤维间隙增大,凋亡细胞数增多。但目前关于应激激素是如何影响肉质以及通过何种方式导致肉质发生变化的机制并不完全清楚。现今研究表明糖皮质激素(glucocorticoid,GC)主要通过细胞膜与体内糖皮质激素受体α(glucocorticoid receptor alpha,GRα)结合发挥一系列调控作用。在这些基础上,本课题以GRα为主要研究对象,探究GRα对猪原代骨骼肌细胞(pig skeletal muscle cells,PSC)生长的影响以及在猪劣质肉产生过程中的作用,并探究相关分子调控机制。本课题主要研究结果如下:
  1.地塞米松引起猪肌细胞氧化应激
  地塞米松(dexamethasone,DEX)处理PSC细胞后发现其对肌细胞有明显的毒性,且与对照组相比DEX组细胞内的活性氧自由基大量上升,造成细胞氧化应激;等浓度米非司酮(mifepristone,RU486)处理后细胞内的活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)明显下降。通过MTT法检测DEX对PSC细胞增殖的影响,实验结果表明:DEX抑制PSC细胞增殖。通过qPCR和Western blot检测DEX对细胞应激的影响,结果表明:DEX能促进PSC细胞中HSP90的表达;等浓度RU486处理后能抑制PSC细胞中HSP90的表达。
  2.GRa对PSC细胞功能的影响
  通过构建GRα超表达载体和合成siRNA来超表达和抑制GRα的表达。通过流式细胞仪和MTT法检测GRα对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达GRα可以促进PSC细胞凋亡,抑制PSC细胞增殖。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR检测GRα对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达GRa能促进PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和GPX2的表达;同样,干扰GRα能抑制HSP90、CAST和GPX2的表达。超表达GRα和干扰GRα后检测谷胱甘肽过氧化物酶活性,实验结果表明:超表达GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高,干扰GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性降低。可能是机体应激水平过高,并通过提高谷胱甘肽过氧化物酶活性以维持机体稳定。
  3.GRα靶基因的筛选
  干扰GRα后根据表达差异筛选GRα的靶基因,定量结果显示,干扰GRa后极显著下调Tβ10的表达,下调HSP90和HSP7的表达;且超表达GRα后Tβ10的表达显著升高,上调HSP90和HSP27的表达,且在网站上预测出GRα与Tβ10的结合位点。因此推测Tβ10可能是GRα的靶基因,双荧光素酶报告和染色质免疫共沉淀等试验初步验证,结果表明Tβ10可能是GRα潜在的靶基因。构建Tβ10超表达载体后通过流式细胞仪检测Tβ10对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达Tβ10可以促进PSC细胞凋亡。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR实验检测Tβ10对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达Tβ10能促进PSC细胞中BAX、HSP90、HSP27和CAST的表达。
  4.APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激
  与GRα组相比添加不同浓度的(0.1mg/mL,1mg/mL,10mg/mL和100mg/mL)黄芪多糖(astragalus Polysacharin,APS)后可缓解细胞应激,并通过检测ROS含量找出最适浓度为10mg/mL。添加10mg/mL APS后机体的ROS水平显著降低,且与对照组趋于一致。通过MTT法检测APS对PSC细胞增殖的影响,结果表明:APS可显著缓解超表达GRα后抑制PSC细胞增殖的作用。且添加APS后与GRα组相比谷胱甘肽过氧化物酶活显著降低,从而维持机体稳定。通过QPCR和Western blot检测APS对PSC细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果显示:与GRα组相比添加APS可抑制PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和Tβ10的表达。表明APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激。
[博士论文] 李中华
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株引起的新型猪流行性腹泻在世界范围内暴发,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。然而,当前防控手段的匮乏无法应对PED带来的威胁。因此,研究PEDV的致病机理以及开发抗PEDV药物对PED的防控和治疗具有深远的意义。
  本研究基于iTRAQ技术,开展了PEDV强毒株及其传代致弱毒株感染仔猪空肠组织的比较蛋白质组学分析,为揭示PEDV的致病机理和宿主的免疫应答提供参考。根据蛋白质组学的分析结果,研究了hnRNP A1和PEDVN蛋白的互作关系,为揭示PEDV的复制过程提供参考。研究了槲皮素的抗PEDV作用并阐明了其抗病毒机理,为PEDV的治疗和相关药物的开发提供了参考。主要研究内容如下:
  1.PEDV强毒株及其致弱毒株感染仔猪空肠的蛋白质组学分析
  本研究使用iTRAQ定量蛋白质技术结合液相二级质谱技术(LC-MS/MS),研究了PEDV强毒株及其传代致弱毒株感染仔猪空肠的蛋白质组学变化。在强毒株YN13株感染组和弱毒YN144感染组分别鉴定到269和301个差异表达蛋白。生物信息学分析发现,差异蛋白主要涉及应激反应,信号转导和免疫反应等过程。进一步分析发现,PEDV感染可以导致多种干扰素刺激基因的上调表达,表明PEDV感染会诱导宿主的先天性免疫过程。通过对比分析两感染组的蛋白,发现许多热激蛋白家族成员和一些转录翻译相关因子在两组中呈现不同的表达情况,提示这可能是造成两毒株致病性差异的因素。
  2.核不均一蛋白A1(hnRNP A1)参与PEDV的复制过程
  根据蛋白质组学结果,发现hnRNP A1在两病毒感染组表现为不同的表达情况,提示该蛋白的变化可能会造成病毒致病力的变化。首先研究了该蛋白在细胞中定位情况,通过共聚焦试验发现该蛋白和PEDV的N蛋白存在共定位,表明两者之间存在互作关系。使用免疫共沉淀技术,进一步确认了两者之间的互作关系。hnRNP A1和PEDV N蛋白的定位区主要位于核周,而核周是冠状病毒复制转录复合体存在的位置,提示hnRNP A1可能参与了该复合体的组成,进而参与了PEDV的复制过程。为了验证hnRNP A1是否参与了PEDV的复制过程,通过siRNA沉默hnRNP A1的表达,而后使用不同PEDV毒株感染。通过间接免疫荧光试验、荧光定量RT-PCR和Western blot试验发现hnRNP A1沉默后,PEDV的基因组、PEDV感染的细胞数量以及PEDV N蛋白的表达量都显著减少,说明hnRNP A1参与了PEDV的复制过程。结合蛋白质组学结果,推测hnRNP A1在YN144感染组的下调表达是造成两病毒毒力差异的原因之一。
  3.槲皮素抗PEDV研究
  通过间接免疫荧光和Western blot试验,发现槲皮素可以有效抑制PEDV的感染过程。首先研究了槲皮素对PEDV吸附和入侵过程的影响,发现其并不能抑制PEDV吸附和入侵Vero细胞,表明槲皮素抗PEDV的作用发生在病毒入侵宿主细胞之后。由于槲皮素是一种很好的HSPA1抑制剂,其可能通过抑制HSPA1发挥抗PEDV效果。为验证此设想,使用siRNA沉默HSPA1的表达,然后再感染PEDV,通过荧光定量RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot试验发现PEDV的感染过程并未受到影响。表明槲皮素的抗病毒效果并不依赖其HSPA1抑制剂的活性。通过Docking分析,发现槲皮素可以结合于PEDV3C样蛋白酶的活性位点,表明其可能抑制PEDV的3C蛋白酶活性。表达纯化了PEDV的3C样蛋白酶,通过表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)验证了两者可以发生互作。为验证槲皮素是否可以抑制PEDV3C样蛋白酶的活性,建立了一种荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)方法,通过该方法发现纯化的蛋白具有很好的酶活性,在酶反应体系中加入槲皮素,发现PEDV3C样蛋白酶的活性受到显著抑制,而且抑制效果呈剂量依赖性。因此,认为槲皮素可以通过抑制PEDV3C样蛋白酶的活性而发挥抗PEDV效果。
[博士论文] 黄海波
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胸腺是T细胞发育的场所,其稳态的维持对免疫系统的正常发育具有重要意义。由于血-胸腺屏障的存在,胸腺曾经被视为免疫豁免器官,在感染性疾病的研究和防治工作中被忽视。近来大量的证据表明胸腺是多种病原物的靶器官。鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)是一类具有严重危害性的人畜禽共患病原微生物,该菌感染可导致雏禽多个器官损伤,甚至个体死亡。然而有关该菌感染对雏鸡胸腺的影响及其机理的研究极为匮乏。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是该菌的主要毒力因子,常用于该菌致病机制的研究。LncRNAs是近来发现的一类不编码蛋白质的长链RNA,可直接以RNA形式调控生命活动。转录组研究可以全面地反映所有RNA的表达规律和功能属性,在家禽疾病研究中发挥着越来越重要的作用。因此,本研究的目的是首先从器官、组织和细胞层面检测S Typhimurium及其LPS刺激对雏鸡胸腺的影响,然后进一步从mRNAs和lncRNAs转录组层面系统地研究LPS刺激诱导雏鸡胸腺损伤的机制,进而为家禽细菌性疾病的防控提供理论基础。本研究取得的主要结果如下:
  (1)S.Typhimurium感染导致雏鸡胸腺损伤,表现为细胞大量死亡和器官萎缩。与生理盐水组相比,雏鸡胸腺皮质区细胞死亡数目在5×104CFU S Typhimurium感染后36h达到最大值,显著增加到3.81倍(P<0.05)。胸腺重量和胸腺指数在细菌感染后72h达到最小值,分别显著下降了43%(P<0.01)和26%(P<0.05)。HE染色结果显示,雏鸡胸腺组织皮质和髓质分界清晰,结构完整。
  (2)Salmonella LPS刺激比沙门氏菌刺激更快地诱导雏鸡胸腺损伤。与生理盐水组相比,雏鸡胸腺皮质区细胞死亡数目在50mg/kg Salmonella LPS刺激后12h达到最大值,Forrnamide-MAb和TUNEL方法检测到细胞死亡数目分别显著增加到2.95倍和5.23倍(P<0.001)。雏鸡胸腺质量和胸腺指数在LPS刺激后36h达到最小值,分别显著下降了35%(P<0.01)和20%(P<0.05)。胸腺组织结构在LPS刺激后同样未受到破坏。此外,脾脏中chT1+细胞亚群的比例,以及脾脏和胸腺中的CD4+/CD8+细胞亚群的比例在LPS刺激后36h均未发生显著变化。雏鸡胸腺髓质区和皮髓质交界处的肥大细胞数量以及皮质区的巨噬细胞标记物LEP100的表达在LPS刺激后12h达到最大值,分别显著增加到1.90和3.69倍(P<0.05)。
  (3)1767个雏鸡胸腺mRNAs在Salmonella LPS刺激后显著差异表达(P<0.001,|log2(fold change)|≥0.585)。Poly(A)+RNA-seq获得158978794个高质量的长50bp的单端有效读段(clean reads),其中约77.05%的读段可以匹配到鸡的基因组。873、536和856个mRNAs的表达量在12h vs.0h、36hvs.0h和72h vs.0h的比较中存在显著差异。在12hvs.0h比较中上调mRNAs被注释到炎症反应、免疫反应等过程,以及急性时相反应信号等通路;下调mRNAs被注释到细胞分裂、染色体分离等过程,以及Polo样激酶介导的有丝分裂等通路。在36hvs.0h比较中上调mRNAs被注释到抗菌应答、抗革兰氏阴性菌应答等过程,以及急性时相反应信号等通路;下调mRNAs被注释到着丝粒组装和染色体分离等过程。在72h vs.0h比较中上调mRNAs主要与代谢活动相关;下调mRNAs主要与细胞死亡、代谢和免疫活动相关。因此,在雏鸡胸腺损伤最严重的时期(12h和36h),差异表达的胸腺mRNAs主要涉及免疫反应和细胞分裂活动。整合通路分析结果进一步显示LPS可能通过TLR4-MAPKs-FOS/JUN通路诱导雏鸡胸腺的炎症反应,进而促使DNA损伤和细胞周期阻碍。
  (4)鉴定了5520个雏鸡胸腺lncRNAs。rRNA-depleted RNA-seq获得385393591对高质量的长150bp的双末端有效读段,其中约79.66%的读段可以匹配到鸡的基因组。通过读段的组装和转录本的筛选,最终鉴定了2283个基因间型lncRNAs、2810个内含子型lncRNAs和427个反义链型lncRNAs。88.59%的lncRNAs是最新发现。与鸡mRNAs相比,鸡lncRNAs的外显子较长,外显子数目较少。
  (5)111个雏鸡胸腺lncRNAs在Salmonella LPS刺激后显著差异表达(Q-value<0.05,|log2(fold change)|≥1)。在12h vs.0h比较中有47个lncRNAs差异表达,它们分别对应了1260个邻近mRNAs(cis-mRNAs)和2811个共表达mRNAs(co-mRNAs)。在36hvs.0h比较中有81个lncRNAs差异表达,分别对应了1766个cis-mRNAs和3203个co-mRNAs。在12h vs.0h比较中差异表达lncRNAs的cis-mRNAs注释于染色质沉默和蛋白激酶的负调节等过程,以及贾纳斯激酶-信号传导及转录活化因子和丝裂原活化蛋白激酶信号等通路;差异表达lncRNAs的co-mRNAs注释于细胞分裂和LPS应答等过程,以及细胞周期等通路。在36hvs.0h比较中差异表达lneRNAs的cis-mRNAs注释于免疫反应和细胞分裂等过程,以及卵母细胞减数分裂和贾纳斯激酶,信号传导及转录活化因子等通路;差异表达lncRNAs的co-mRNAs注释于炎症反应和细胞分裂等过程,以及细胞周期、细胞因子和细胞因子受体互作等通路。因此,在雏鸡胸腺损伤最严重的时期,差异表达的胸腺lncRNAs也主要涉及炎症反应和细胞分裂活动。通路可视化分析结果进一步显示在TLR-MAPKs-Cytokines和细胞周期通路中的大部分mRNAs均有与之共表达或者邻近的lncRNAs,因而lncRNAs也可能通过以上这些通路参与Salmonella LPS诱导的雏鸡胸腺损伤过程。
  (6)实时荧光定量PCR试验检测了22个mRNAs和6个lncRNAs的表达。为验证RNA-seq结果,将10个差异mRNAs的实时荧光定量PCR结果与Poly(A)+RNA-seq结果进行比较,二者表达趋势一致,具有显著强相关性(P=1.65e-8,r=0.828)。6个差异lncRNAs的表达模式也与rRNA-depleted RNA-seq结果基本一致,且二者同样具有显著强相关性(P=2.28e-4,r=0.871)。因而Poly(A)+RNA-seq和rRNA-depleted RNA-seq可以分别真实地反应雏鸡胸腺mRNAs和lncRNAs的表达模式。在LPS诱导的雏鸡胸腺损伤过程中,基因转录变化很迅速,6个mRNAs的表达量早在刺激后2~6h显著上调。S.Typhimurium感染诱导确实可以使如上10个mRNAs的表达呈现类似的趋势,但是其峰值相对LPS刺激滞后。因此,STyphimurium可能主要通过LPS来影响雏鸡胸腺基因表达。除了以上10个mRNAs以外,Poly(A)+RNA-seq和实时荧光定量PCR试验均显示LPS刺激可以上调雏鸡胸腺TLR4通路和氧化应激通路中的6个mRNAs的表达,下调细胞周期6个mRNAs的表达。
  综上所述,本研究证明了S Typhimurium感染及其LPS刺激均可导致雏鸡胸腺损伤。TLR4-MAPKs-FOS/JUN通路在这个过程中可能起着重要的调节作用,lncRNAs也可能通过如上通路参与了LPS诱导的雏鸡胸腺损伤过程。
[硕士论文] 赵席功
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一种能够引起临床上以急性出血和坏死性、慢性纤维素性胸膜肺炎为主要特征的高度接触传染性疾病猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumoniae,PCP)的病原菌,一旦发病,将给国内外养猪业带来很大的经济损失。毒素-抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系统是一种在细菌和古生菌中广泛分布的小型基因组件。大多TA模型在许多细菌中已经被研究,并被证实在细菌生理机能和毒力方面起着重要作用。然而,在放线菌属中还没有被研究。因此,本研究主要研究猪胸膜肺炎放线杆菌中TA系统的分布存在情况,深化我们对APP生物学特性的认识;对APP中TA系统进行预测鉴定并对鉴定为TA系统的作进一步功能研究,希望可以筛选出与毒力相关的TA系统,为临床上弱毒疫苗及药物靶标的研究提供参考。
  主要研究内容如下:
  1、APP中Ⅱ型TA系统的鉴定
  在APP中,通过Ⅱ型TA系统预测软件RASTA-Bacteria和TADB2.0预测胸膜肺炎放线杆菌JL03菌株中TA系统,并选择两软件预测相同的7对作进一步的研究。通过RT-PCR实验验证TA基因共转录;超表达毒素使细菌生长受到抑制,但这种抑制可被其同源抗毒素中和;pull-down实验表明毒素与其同源抗毒素在体内发生相互作用;启动子活性实验表明抗毒素能够促进或者抑制自动调节TA操纵子的转录活性;此外,APJL_0660/0659TA系统在被检测的部分APP血清型中存在,而其它3对TA系统在所检血清型中都存在。最终,我们在APP中确定了4对TA系统,为进一步的功能研究奠定基础。
  2、APP中4对TA系统的功能研究
  首先,通过自杀性质粒pEMOC2构建重组质粒pE△TA,将测序正确的pE△TA转化到β2155感受态中,将pE△TA/β2155与亲本菌株APP5进行结合转移,挑出单交换菌株,进一步通过单交换传代挑取到基因缺失株△TA。其次,通过E.coli-APP穿梭质粒pJFF224-XN构建重组质粒pJFTA,将重组质粒电转化到△TA感受态中,挑菌鉴定氯霉素抗性菌株即可得到互补菌株C△TA。最后,研究缺失株及互补菌株的生长特性、遗传稳定性和对小鼠的毒力。结果显示:C△TA3和△TA3生长特性与APP5略有差异,而其它3对TA系统生长特性与亲本菌没有明显差异;4对TA系统对APP5的毒力没有影响。
[博士论文] 郭云清
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的家鸭、鹅、火鸡和多种禽类的一种细菌性传染病,临床剖检症状主要为全身浆膜的炎性渗出。本病在世界广泛分布,感染引起高发病率和死亡率,为我国法定的二类动物疫病。RA血清型众多且复杂,各血清型之间交叉保护性低,给该病的防治带来诸多困难。而且本病一旦发生很难彻底清除,主要以药物防治为主。因此加强RA的致病机制的研究,对从根本上预防该病的发生具有重要意义。
  铁是细菌生长和繁殖的关键性元素,广泛存在于细菌代谢途径中。但是过量的铁容易引起芬顿反应产生羟自由基进而对细胞产生毒害反应。铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)不仅调控细菌铁的稳态,并且能够与其它调控系统协同作用,直接或间接调控细菌的生长、代谢和毒力。但是Fur在RA中的作用尚不清楚。基因缺失是细菌分子生物学研究的基本工具,但目前还没有关于RA无抗性基因缺失株方法的报道。因此,本研究首先利用苯丙氨酸-tRNA合成酶pheS和lacZ,构建了RA-YM株fur基因无抗性缺失突变株。以野生型质粒pRA-JX为基础,构建了穿梭质粒pRES-JX-spc,利用该质粒构建回复株C△fur。通过动物实验验证Fur与RA的毒力有关。利用转录组测序技术,筛选了鸭疫里氏杆菌基因组中受铁调控基因和受Fur调控基因,对Fur调节RA的毒力机制进行研究。具体内容如下:
  1.鸭疫里氏杆菌fur基因无抗性基因缺失突变株△fur及回复株C△fur的构建与鉴定
  本文首先构建了用于RA无抗性基因缺失突变株的自杀性质粒pRE-lacZ-mpheS-spc和回复株的穿梭质粒pRES-JX-spc。利用生长抑制试验发现RA对0.2%对氯苯丙氨酸敏感,证实pheS可以做为负筛选标记。通过对PheS301位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸,其它进行无义突变,野生型核苷酸序列与突变型核苷酸序列同源性71%,减少在该位点发生同源重组的概率。将突变型pheS与RA的rpsL基因启动子融合构建mpheS表达盒。克隆lacZ基因,与rpsL启动子融合,利用X-gal通过颜色可以直观的鉴定同源重组是否完成。以pRE112质粒为基础,结合抗性基因spc,负筛选标记pheS和指示标记lacZ连接构建自杀性质粒pRE-lacZ-mpheS-spc。克隆pRA-JX质粒的复制区域,构建穿梭质粒pRES-JX-spc,利用该质粒可以构建稳定遗传的回复突变菌株。
  构建了RA-YM△fur无抗性基因缺失突变株和回复株C△fur。克隆fur基因的左、右同源臂,利用重叠PCR将左右同源臂融合,通过酶切的方法并连接至自杀性质粒pRE-lacZ-mpheS-spc。以含有自杀性质粒pRE-lacZ-mpheS-spc-fur的E.coli X7213为供体菌,以RA-YM株为受体菌,通过两步同源重组法筛选得到RA-YM△fur无抗性基因缺失突变株。第一步首先利用筛选标记spc筛选杂合体菌株,第二步利用筛选标记pheS和lacZ筛选无抗性基因缺失株。克隆fur基因启动子和编码区序列,利用重叠PCR融合fur基因启动子和编码区,通过酶切的方法连接到穿梭质粒pRES-JX-spc。以含有重组穿梭质粒pRES-JX-spc-fur的E.coli X7213为供体菌,以RA-YM△fur为受体菌,利用筛选标记spc筛选回复株C△fur。
  通过感染雏鸭测定RA-YM△fur的致病性。动物试验结果显示野生株RA-YM、基因缺失突变株RA-YM△fur和回复突株C△fur的LD50分别为2.0×106CFU,1.6×108CFU和1.2×107CFU。RA-YM△fur基因缺失突变株的毒力较野生株RA-YM毒力下降约80倍,回复株C△fur的毒力较RA-YM△fur毒力有所回升。对野生株RA-YM和RA-YM△fur基因缺失突变株的血液和组织载菌量进行比较,结果显示RA-YM△fur基因缺失突变株的载菌量均较野生株RA-YM低。另外组织剖检和病理切片观察,RA-YM△fur基因缺失突变株引起的组织病变较野生株RA-YM轻微。证实fur基因与RA-YM株的毒力有关。
  2.转录因子Fur的转录调控基因的研究
  通过对RA-YM菌株和RA-YM△fur菌株在限铁和富铁情况下的转录组进行比较,从全基因组水平上筛选受铁调控基因和受Fur调控基因。并随机挑选4个受铁调控的基因和4个受Fur调控的基因,利用荧光定量PCR对转录组测序结果进行验证,结果显示荧光定量PCR结果与转录组测序结果相符。转录组测序结果筛选出70个受铁调控基因和17个受Fur调控基因。转录组测序具体结果如下:
  限铁条件下,铁调控的基因中有45个基因表达上调。其中7个与细菌的铁运输和储存有关,6个与细菌的固氮过程有关,5个与氨基酸和辅酶的合成有关,5个与细胞表面结构与修饰有关,2个与嘌呤和核苷酸的合成有关;其余的与大分子的合成、转录调控功能以及未知功能等有关。限铁条件下,铁调控的基因中有25个基因表达下调。其中6个与三羧酸循环有关,7个与氧化应激有关,其余与细胞的转运功能以及未知功能等有关。
  Fur直接调控的基因有17个,其中5个参与铁的获取,2个参与氧化应激,1个为Ⅸ型分泌系统元件,其余参与氨基酸的合成和未知功能等。另外对Fur直接调控的基因启动子序列分析,预测得到Fur结合位点的序列为5'-ATTTAGAATTATTCTAAAT-3'。
  利用pET28a-fur质粒对Fur蛋白进行原核表达。扩增fur基因的编码区,通过酶切构建pET28a-fur质粒,并转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞。利用IPTG诱导表达并利用His标签纯化柱纯化Fur蛋白。随机选择4个受Fur调控的基因,利用生物素标记的引物扩增其启动子序列,利用原核表达的Fur蛋白,通过凝胶迁移实验验证Fur蛋白与启动子的互作,结果显示Fur蛋白在体外可以与调控基因的启动子序列结合。
  综上所述,本试验成功的构建了基于苯丙氨酸-tRNA合成酶pheS和lacZ为筛选标记的无抗性基因缺失株方法,构建了fur基因缺失株RA-YM△fur。构建了穿梭质粒pRES-JX-spc,利用该质粒构建了回复株C△fur。通过动物实验验证fur基因与RA的毒力有关。并通过对RA-YM和RA-YM△fur在限铁和富铁情况下的转录组进行比较,获得受铁调控基因以及Fur调控基因,预测得到RA的Fur-box序列为5'-ATTTAGAATTATTCTAAAT-3'。Fur通过调节铁摄取系统和氧化还原反应以及Ⅸ型分泌系统等,进而调节TCA循环相关酶类的表达,芳香族氨基酸,嘌呤和核苷酸的合成,影响RA的毒力。
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