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[博士论文] 周爽
植物学 重庆大学 2013(学位年度)
摘要:叶色突变体是一类由于叶绿素含量发生明显变化而呈现出不同叶片颜色的突变,是研究叶绿素代谢和质体发育的良好材料。叶绿素是光合作用中最主要的色素之一,对植物体非常重要,但是游离叶绿素及其前体会对植物细胞造成光氧化伤害,因此植物体进化出一系列复杂的机制来精确调控叶绿素合成过程,使其能够迅速反应于不断变化的生理生化状态以及外界环境。虽然叶绿素的生物合成过程已经研究得比较清楚,高等植物中所有的叶绿素合成关键酶也已经被鉴定了出来,但由于整个叶绿素合成调控网络的复杂性,还有很多关键的问题研究得不够深入,也无从下手。而叶色突变体中必然有叶绿素代谢过程的某一环节发生了突变,可以为我们研究叶绿素代谢调控网络提供难得的切入点。
  羽衣甘蓝白鸽和乌塌菜都是十字花科芸薹属中的叶色突变体,过去对它们突变机理的研究非常稀少,是两种很有价值的研究材料。本文以羽衣甘蓝白鸽和绿鸽,小白菜和乌塌菜为研究材料,对两种叶色突变体:羽衣甘蓝白鸽和乌塌菜进行了生物化学和分子生物学分析,主要研究结果如下:
  (1)白鸽(Brassicaoleraceavar.acephalaf.tricolor)是羽衣甘蓝中的一种温度敏感的叶色突变体,在低温条件下其中心部分会变成纯白色。绿鸽是羽衣甘蓝中的另一个品种,在低温条件下植株仍是绿色。白鸽中的叶绿素含量在低温条件下急剧减少,而绿鸽中的叶绿素含量在相同的温度条件下只是略微减少。检测了白鸽和绿鸽中的五种叶绿素前体后发现,在低温条件下,白鸽中的叶绿素合成被抑制在Pchlide这一步,导致Mg-ProtoIX发生积累。定量PCR的结果显示低温条件下白鸽中叶绿素合成结构基因的表达从POR开始急剧降低,白鸽中的CISC和DBB1B明显受到低温的诱导而表达急剧增加。透射电子显微镜的结果显示生长在室温条件下的白鸽嫩叶中有正常的叶绿体,而生长在低温条件下的白鸽嫩叶中只有未分化的前质体。以上结果表明低温明显抑制了白鸽嫩叶中的质体发育,并通过下调下游的叶绿素合成结构基因的表达将白鸽中的叶绿素合成抑制在了Pchlide这一步,导致低温条件下白鸽嫩叶中的前质体未分化为叶绿体,白鸽嫩叶呈现为纯白色。一些与叶绿素积累相关的基因的表达也受此影响,特别是白鸽中的CISC和DBB1B,在低温条件下表达急剧增加。
  (2)为了更加深入的研究羽衣甘蓝白鸽中的叶绿素合成调控机制,我们对白鸽和绿鸽花瓣、花蕾、花柄和嫩叶中的叶绿素合成情况进行了分析。结果发现这两个物种不同组织中的叶绿素含量有着完全一致的趋势,即:嫩叶中的叶绿素含量最高,花柄次之,花瓣再次,花蕾中的叶绿素含量最低。定量PCR的结果显示,绿鸽叶绿素合成结构基因基本都是在嫩叶中的表达量最高,在花柄中次之,在花瓣和花蕾中的表达量较低,与其叶绿素含量是基本对应的。白鸽上游的叶绿素合成结构基因的表达模式与绿鸽明显不同,在嫩叶中的表达量明显降低;下游的叶绿素合成结构基因的表达模式则与绿鸽非常相似,都是在嫩叶中的表达量远高于其他组织。一些与叶绿素积累相关的基因的表达情况也同时进行了分析,结果发现DBB1A、DBB1B以及GUN4在羽衣甘蓝白鸽不同组织中的的表达模式与绿鸽非常相似,而DET1和CISC在羽衣甘蓝白鸽不同组织中的表达模式却与绿鸽有较大差异。DET1和CISC均与质体发育有密切关系,很有进一步研究的价值。
  (3)乌塌菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinesis(L.)Makinovar.rosularisTsenetLee)是芸薹属中的一种高叶绿素突变体,表现为墨绿色的叶片。乌塌菜中的叶绿素含量比其同种的小白菜要高65.2%。对五种叶绿素前体进行检测后发现:小白菜和乌塌菜中的CoprogenIII含量没有明显差异,乌塌菜中的ProtoIX和Pchlide含量明显高于小白菜,而UrogenIII以及Mg-ProtoIX含量则比小白菜中略低。此外,乌塌菜中的血红素含量比小白菜中高78.13%。定量PCR的结果显示,在两个物种中HEMG2的表达没有明显差异。PPOX,ChlI,MTF,DVR,PORB和PORC在乌塌菜中的表达水平要低于小白菜中,而ChlD,ChlH,MTF,ChlP,CS和CAO则高于小白菜中。乌塌菜叶绿素合成结构基因的表达与其叶绿素及叶绿素前体含量并不是一一对应的。乌塌菜中的ChlH以及GUN4的表达水平分别是小白菜中的约1000倍和5倍。透射电子显微镜的结果显示乌塌菜叶绿体的类囊体膜系统比小白菜叶绿体发达得多,片层堆积更多,更密集。GUN4不仅是质体-细胞核信号因子,还与质体发育有关。ChlH是镁螯合酶的亚基之一,还可以作为质体-细胞核信号因子并被GUN4激活。这些结果表明乌塌菜中高表达水平的ChlH和GUN4可以一起作为质体-细胞核信号因子来调控叶绿素合成以及质体发育,可能是导致乌塌菜叶片中叶绿素含量高,类囊体膜系统高度发达的原因。
  (4)根据前面实验的结果,克隆了芸薹属植物中的一些与叶绿素积累相关的基因并进行了分析:
  在羽衣甘蓝白鸽、绿鸽和小白菜中分别获得了CISC的全长cDNA,都包含了2220bp的开放阅读框,并各自编码了739个氨基酸残基。蛋白质序列比对的结果显示,羽衣甘蓝白鸽BoCISCw和绿鸽BoCISCg的蛋白质序列是完全一致的,并且与小白菜BrCISCp以及拟南芥AtCISC具有很高的同源性。
  在羽衣甘蓝白鸽和绿鸽中分别获得了RCA的全长cDNA,都包含了1317bp的开放阅读框,并编码了438个氨基酸残基。蛋白质序列比对的结果显示,RCA基因编码的蛋白质序列在羽衣甘蓝白鸽和绿鸽中只有两个氨基酸的差异。
  在羽衣甘蓝白鸽、绿鸽、小白菜和乌塌菜中分别获得了DET1的全长cDNA,分别包含了1611bp、1611bp、1614bp和1608bp的开放阅读框,并各自编码了536、536、537和535个氨基酸残基。蛋白质序列比对的结果显示,DET1基因编码的蛋白质序列在羽衣甘蓝白鸽和绿鸽中是完全一致的,而在小白菜和乌塌菜中只有两个氨基酸的差异。
  在羽衣甘蓝白鸽、绿鸽、小白菜和乌塌菜中分别获得了GUN4的全长cDNA,分别包含了771bp、771bp、771bp和783bp的开放阅读框,并各自编码了256、256、256和260个氨基酸残基。蛋白质序列比对的结果显示,GUN4基因编码的蛋白质序列在羽衣甘蓝白鸽和绿鸽中是完全一致的,并且与小白菜BrGUN4p只有一个氨基酸的差异。而乌塌菜BrGUN4w的蛋白质序列与羽衣甘蓝BoGUN4及小白菜BrGUN4p差异较大,有7个保守氨基酸发生了突变。经生物信息学分析后发现,乌塌菜BrGUN4w的等电点、疏水性等理化性质和羽衣甘蓝BoGUN4、小白菜BrGUN4p相比,都发生了改变。尤其值得注意的是,乌塌菜BrGUN4w的磷酸化位点和三维结构都发生了明显改变。羽衣甘蓝BoGUN4和小白菜BrGUN4p都只有7个Ser磷酸化位点、5个Thr磷酸化位点和1个Tyr磷酸化位点,而乌塌菜BrGUN4w有10个Ser磷酸化位点、3个Thr磷酸化位点和1个Tyr磷酸化位点。乌塌菜BrGUN4w的三维结构也比羽衣甘蓝BoGUN4和小白菜BrGUN4p少了一个β折叠结构。这些改变可能导致了乌塌菜BrGUN4w功能的改变,在调控叶绿素合成和质体发育的过程中发挥着重要的作用。
[硕士论文] 金文
食品科学 哈尔滨工业大学 2012(学位年度)
摘要:叶黄素和花青素是两类主要的植物色素,具有抗氧化功能和许多生理功能。本研究以叶黄素、花青素为研究对象,采用两次包封方法制备叶黄素—花青素脂质体,并研究其抗氧化和缓解视疲劳功能。
  制备叶黄素—花青素脂质体过程中采用两次包封,第一次包封叶黄素,用浊度法筛选叶黄素最适复合表面活性剂,第二次以卵磷脂为媒材响应面优化叶黄素—花青素脂质体制备的工艺条件。研究光照、温度、pH对叶黄素—花青素脂质体稳定性的影响,寻求最佳的储存条件。进行叶黄素—花青素脂质体清除ABTS、DPPH、羟基自由基实验,通过三者CI值评价其体外协同抗氧化能力。建立光损伤模型,测定大鼠眼球和血清的体内抗氧化能力。人群试食叶黄素—花青素脂质体缓解视疲劳实验,记录受试人群远视力水平、症状评定和视觉持久度,评价叶黄素—花青素脂质体对视疲劳的缓解作用。
  包封叶黄素最适HLB值为10.9,复合表面活性剂48%双乙酰酒石酸单甘油酯+52%辛奎酸甘油酯对叶黄素的包封效果最好,复合表面活性剂的添加量为1%。叶黄素—花青素脂质体最佳的工艺条件:温度60.17℃,时间47.38min,膜材用量7.75%,pH值为9.15,在此条件下达到的理论值为39.72%,实际操作中控制条件温度60℃,时间45min,膜材用量8%,pH值9,叶黄素—花青素脂质体包封率实际值为(38.37±0.4)%。叶黄素—花青素脂质体在温度50℃、pH3保存于暗处附近的保存效果较好。叶黄素—花青素脂质体清除ABTS、DPPH、羟基自由基的CI值分别为:0.956、0.065、0.83,数值均小于1,证明叶黄素—花青素脂质体对三种自由基的清除均具有协同效果。体内实验和人群试食实验表明叶黄素—花青素脂质体有很好地缓解视疲劳功能。
[硕士论文] 彭胜军
生物医学工程 华中科技大学 2012(学位年度)
摘要:钙是生命活动中最重要的基本元素之一,在真核生物细胞内以离子状态充当第二信使。钙离子通过与特定钙受体或者钙结合蛋白绑定实现其生物学功能,调控细胞信号传导和细胞生命周期(包括细胞分裂、分化和凋亡)等过程。基于钙结合蛋白的功能结构域组成可将之分为两类:一类具有EF-hand结构域,其典型代表是钙调蛋白(Calmodulin);另一类不具有EF-hand结构,即非EF-Hand钙结合蛋白。随着对钙结合蛋白研究的日趋深入,实验证据表明钙离子与蛋白质结合形式具有复杂性和不规则性。鉴定钙结合蛋白中钙离子与蛋白质的结合位点是了解生物系统中钙离子如何调控蛋白质结构和功能首要步骤。实验验证钙离子结合位点需要耗费大量的时间、精力和资金。利用生物信息学的方法开展预测,能够有效地去除潜在的假阳性结果,为进一步的实验研究提供有价值的参考信息。迄今为止,所有预测钙结合蛋白结合位点的生物信息学方法,都基于蛋白质的三级结构,从而具有较大的局限性。在本论文中,我们设计了一种基于位点特异性打分矩阵(PSSM)算法的方法,能够快速、准确的预测潜在的钙结合蛋白位点。通过阅读科学文献,搜集了实验验证的369个钙结合蛋白,包含了986个钙离子结合位点,对这些数据进行训练,并通过“除一法”(Leave-one-outvalidation)等方法评估其预测性能,发现本方法的灵敏度(Sensitivity)和特异性(Specificity)分别为69.67%和90.00%。本方法仅需提供蛋白质的一级序列即可预测蛋白质的钙离子结合位点。
  与此同时,对搜集到的实验验证过的钙结合蛋白数据做了GO统计分析,从钙结合蛋白的生物学过程(Biologicalprocess)、分子功能(Molecularfunction)以及亚细胞定位(Cellularcomponent)三个层面进行了生物统计学分析。我们的结果表明:(1)钙结合蛋白主要分布在细胞质(GO:0005829)、细胞膜(GO:0005886)和细胞外区域(如组织液)(GO:0005576)等区域;(2)钙结合蛋白参与的生理过程主要有肌肉的收缩(GO:0006936)、突触信号传递(GO:0007268)和信号转导(GO:0007165)等过程;(3)钙结合蛋白具有的分子功能有与钙离子的结合(GO:0005509)、与钙依赖的蛋白结合(GO:0048306)和与其他蛋白质绑定(GO:0005515)等。另外,我们从Uniprot数据库中下载了人、小鼠、果蝇、线虫、酵母和拟南芥六个具有代表性的模式生物的序列信息,并对这六个物种进行了大规模预测,得到了与钙结合的蛋白质数目分别为人76.4%、小鼠68.6%、果蝇47.8%、线虫23.2%、酵母14.7%、拟南芥53.5%。从中可以得到两个结论:(1)钙结合蛋白在这六个物种中普遍存在;(2)物种由低等到高等,钙结合蛋白的比例逐渐增加。
  综上所述,我们对钙离子结合蛋白及作用位点进行了系统性分析,为进一步的实验分析提供了潜在的数据资源。我们相信,计算预测与实验验证的有机结合可将钙结合蛋白的研究带入一个新的发展阶段。
[硕士论文] 代法国
生物学 重庆大学 2011(学位年度)
摘要:绿色植物的叶片由于含有丰富的叶绿素而呈现绿色,植物物种间或者同一物种的不同时期可以呈现出不同的颜色也是由于不同的色素所造成的。其色素组成受遗传和环境刺激的影响,是其合成与降解之间相互平衡的结果。近年来,叶绿素的合成途径已经研究的比较清楚,而对于其降解途径,随着水稻中sgr(t)滞绿突变体的发现及SGR基因的识别,研究者对于叶绿素降解的起始阶段又有了新的认识。目前,SGR基因已经在很多物种中被发现,它的功能缺失可以导致绿色植物出现滞绿突变,但是其机制目前还不清楚。通过对更多的SGR基因及其滞绿突变体进行研究,对于探明SGR基因的作用机制及叶绿素降解途径将有所帮助。
  本课题中,我们分析了已报道的各物种SGR滞绿基因的同源性,并设计特异引物,分别克隆了雪里蕻和白菜的SGR基因的编码区。对获得的基因序列进行了生物信息学分析,并对雪里蕻SGR基因的表达模式进行了分析。为了进一步研究雪里蕻和白菜SGR基因的功能,本研究构建了雪里蕻和白菜SGR基因的RNAi沉默载体,并采用了农杆菌介导的花序浸染法和组织培养转化法,进行了雪里蕻的遗传转化。本研究的主要结果如下:
  ①成功的克隆了雪里蕻和白菜的SGR基因的编码区,测序结果表明,雪里蕻和白菜的SGR基因序列都是807bp,它们几乎完全相同,只有三个碱基的差别。雪里蕻SGR基因与拟南芥NYE1的同源性为85%、乌塌菜91%、烟草77%、番茄76%等。
  ②通过生物信息学分析表明,雪里蕻和白菜的SGR基因都编码了268个氨基酸残基,并且序列完全相同,分子量为30.3kD,等电点为8.56。同时雪里蕻SGR基因编码的蛋白是一个具有N末端叶绿体转运肽与信号肽的非分泌蛋白。在细胞亚结构中可能定位于叶绿体中,分布于叶绿体基质、淀粉体。由于其不具跨膜结构,而又具有多个磷酸化位点,因此可能是在细胞中直接参与信号的传导或者反应。其编码的氨基酸序列和其它SGR蛋白有很高的同源性,并且和其它SGR蛋白一样都含有一个高度保守的C末端基序(C-X3-C-X-C2-F-P-X5-P),与拟南芥NYE1蛋白的同源性为87%、水稻61%。和芸薹属中乌塌菜的SGR蛋白的同源性为92%,除了中间插入的21个氨基酸外,只有一个氨基酸的差别。通过和其它物种的氨基酸序列对比发现,对于乌塌菜多出的21个氨基酸序列,除了结缕草的整个氨基酸序列较短外,其它物种中都不具有这个序列。这进一步说明这个序列很可能是后期插入的,而乌塌菜的SGR基因也可能因此造成功能缺失。
  ③雪里蕻SGR基因(Brassicajunceavar.crispifolia,BjSGR)表达模式分析表明,BjSGR基因受衰老诱导而特异地表达。在幼嫩叶中表达量很低,而在绿色稍微褪去的衰老叶片中其表达量迅速增加。
  ④通过对拟南芥花序浸染法的探索和改进,采取用移液枪点滴重悬液的方式转化雪里蕻(雪里蕻,Brassicajunceavar.crispifolia)花蕾,最终获得了转基因雪里蕻。同时通过对影响转化效率的蔗糖浓度、表面活性剂浓度、菌液OD600值等进行研究,发现用5%的蔗糖(w/v)+0.03%的Silwet-77(v/v)重悬农杆菌,使重悬液的菌液浓度OD600为0.8时,可以获得较高的转化效率,转化率为2.3%。该方法避免了真空操作及浸染时间的影响,使得操作更加简便,且转化周期更短,为雪里蕻的遗传转化提供了一种更为简便的转化方法。
  ⑤在组织培养转化法中,通过对外植体的选择以及激素配比研究发现,2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA组的子叶的芽再生率较高,并且获得了抗性苗,目前处于诱导生根阶段。这为以后研究雪里蕻和白菜SGR基因的功能打下了基础。
[博士论文] 林显光
生物物理学 华中科技大学 2010(学位年度)
摘要:生物体的生命活动是在多方面因素的严格调控下进行的,囊泡的分泌过程在对生物体的调控作用中起着重要作用,是大多数宏观调控过程的分子基础。通过高分辨率电子显微镜观察发现,囊泡可以分为致密核心大囊泡(LDCVs)和突触小囊泡(SVs)两类。致密核心大囊泡中的内涵物主要是大分子蛋白质和神经肽类物质,突触小囊泡中的内涵物则主要是一些神经递质。而近年来随着电生理技术和细胞成像技术的迅猛发展,我们可以直接对活体细胞中囊泡的分泌事件进行高时间分辨率和高空间分辨率的观测,从而研究在这一过程功能基团(如蛋白质)之间的相互作用及其作用机理。
   UNC-31是由S.Brenner 于1974年在筛选表型异常的EMS诱变的线虫时发现的。缺失UNC-31的线虫表现出运动共济失调(UNC)、反应迟钝、产卵障碍等表型。其哺乳动物中的同源物CAPS(Ca2+-dependent activator protein for secretion) 于1992年在鼠脑中发现,已经证实其一种与囊泡分泌过程中不可缺少的重要蛋白,随即成为分泌研究领域中的热点对象之一。这一蛋白含有5个预测的功能结构域,从N端到C端,分别是动力蛋白激活蛋白1结合结构域(DBD)、C2结构域、PH结构域、Munc-13同源结构域以及致密核心大囊泡结合结构域(DCVBD)。一些侧面研究(如同源序列比对,竞争性过表达)表明这些结构域有着各自的功能,但是尚无直接的证据证明这些结构域确实在UNC-31行使其囊泡分泌相关功能中发挥作用或者仅仅是进化过程中的无实际作用的遗留片段。
   本文以此为切入点,将线虫作为模式生物,有机的结合了传统的线虫行为、药理学分析和近年来兴起的电生理技术、全内反射细胞成像技术以及活体荧光检测技术对这些结构域的功能进行了研究,这样就将微观上的分子或细胞水平上的观测结果和宏观上的表型联系起来。我们的结果表明:综合来看,这些功能结构域对于UNC-31行使分泌过程中的功能是缺一不可的,但Munc-13同源结构域却表现出一些特殊的性质。当线虫中的UNC-31缺少这一结构域时,其神经元细胞在电生理实验中分泌状态正常,类似于野生型;而其他实验中,如果线虫中UNC-31缺少这一结构域却都表现出类似于UNC-31基因缺失的突变体的表型。我们猜测这一异常的结果可能是由于电生理实验中必须的较高的基础钙浓度导致的特殊现象。
[硕士论文] 张从晓
生物化学与分子生物学 北京工业大学 2010(学位年度)
摘要:过亚硝酸根(ONOO-)是生物体的一类内源性细胞毒素,具有强烈的氧化和硝化作用,能够诱导蛋白质、脂质、DNA等生物大分子的损伤。如何清除过亚硝酸根、抑制过亚硝酸根的毒性,一直是过亚硝酸根研究的热点。研究表明,金属卟啉能够有效催化过亚硝酸根分解,起到清除过亚硝酸根的作用。因此,寻找、合成更多的金属卟啉,研究它们催化过亚硝酸根分解的效果及催化机理,对于过亚硝酸根毒性抑制剂的研究及过亚硝酸根相关疾病预防和治疗药物的开发具有积极的意义。
   利用紫外-可见分光光度技术,对10种新型金属卟啉清除过亚硝酸根的效果进行了研究,比较了它们催化过亚硝酸根分解的能力,发现铁卟啉T(p-COOH)PPFeCl的催化效果最好;研究发现了铁卟啉催化过亚硝酸根分解的高价卟啉中间体的产生,探讨了卟啉催化过亚硝酸根分解的反应机理。
   利用快速反应动力学方法,研究了铁卟啉催化过亚硝酸根分解的反应动力学。铁卟啉碱性条件下催化过亚硝酸根分解的表观速率常数kobs为12.31s-1,半衰期为0.06S:铁卟啉生理条件下催化过亚硝酸根分解的催化反应速率常数kcat为1.09×106 M-1s-1;铁卟啉生理条件下催化过亚硝酸根分解的活化能Ea为19.9KJ·mol-1,相比空白实验活化能显著降低,说明铁卟啉生理条件下催化过亚硝酸根分解的效果明显。
   利用快速反应动力学方法,研究了铁卟啉生理条件下催化过亚硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的的反应动力学。铁卟啉生理条件下催化过亚硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的催化反应速率常数kcat为6.07×105M-1·s-1:铁卟啉生理条件下过亚硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的活化能Ea为19.9 KJ·mol-1,相比空白实验活化能显著降低,说明铁卟啉生理条件下过亚硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的效果明显。
   胰岛素是人体内重要的蛋白质激素之一,对人体物质代谢尤其糖代谢起着重要的调节作用。研究表明,糖尿病与过亚硝酸根及蛋白质硝化损伤密切相关,过亚硝酸根对胰岛素酪氨酸的硝化损伤影响胰岛素的生物活性。因此,研究过亚硝酸根对胰岛素的硝化损伤有助于糖尿病分子机理的揭示,对糖尿病的治疗也有所启示。
   利用停留快速反应动力学技术,对生理条件下过亚硝酸根损伤胰岛素的反应进行动力学研究。测定了胰岛素存在条件下过亚硝酸根分解的反应速率常数和过亚硝酸硝化胰岛素酪氨酸产生3-NT的反应速率常数,同时测定了胰岛素存在条件下过亚硝酸根分解的活化能Ea为48.8KJ·mol-1,过亚硝酸硝化胰岛素酪氨酸产生3-NT的活化能Ea为42.7KJ·mol-1。推断胰岛素的谷氨酸残基对过亚硝酸根分解与酪氨酸硝化同时起到了促进作用,降低了反应活化能。
[博士论文] 葛丽丽
植物学 厦门大学 2009(学位年度)
摘要:Ca2+是植物生长发育过程中不可缺少的元素之一,有很多重要的生理功能。植物有性生殖过程与Ca2+密切相关,从大、小孢子发生、雌、雄配子体发育,到传粉、受精、胚胎发生等过程,Ca2+都参与其中,并发挥重要作用。但目前有关植物中的钙功能研究主要集中在Ca2+信号方面,对Ca2+在植物生长发育过程中的生理功能研究较少,尤其是对于有关植物有性生殖过程中Ca2+的分布特征还没有完全了解,对其生理功能也还没有深入的认识。烟草是植物学研究的一种模式植物,对其有性生殖研究已积累了大量的资料。我们对烟草有性生殖过程中钙在花药和雌蕊组织中的分布特征进行了研究,并根据这些分布特征对其在有性生殖各个环节中的生理功能进行了探讨。 对烟草花药发育过程中Ca2+的动态分布研究表明,Ca2+参与了调控花粉发育过程,尤其是与小孢子转变过程中的重要事态有密切关系。小孢子发育过程中最明显的形态结构变化是大液泡的形成,将细胞核挤到细胞的边缘,造成明显的极性。这为小孢子的不等分裂做好准备,使小孢子转入配子体发育。这一时期也是花药中Ca2+含量最高的时期。小孢子分裂形成二胞花粉后,大液泡分解,花粉粒中的Ca2+也随之减少。另外,在烟草花药发育过程中,Ca2+与小孢子母细胞胼胝质壁溶解、药壁中层和绒毡层细胞的退化,以及花粉壁的形成均有密切联系。 烟草柱头为湿型。开花时柱头表面有一层覆盖物。成熟花粉粒首先落到柱头覆盖层的表面,开始从柱头覆盖层吸收水分萌发。在柱头覆盖层中有许多小泡,其中含有丰富的钙沉淀颗粒。水合的花粉萌发孔处积累了较多的Ca2+沉淀颗粒,很可能是花粉粒从覆盖层中吸收Ca2+的痕迹。水合的花粉吸收了柱头覆盖层中的水和Ca2+后,在花粉细胞质中出现许多小液泡,汇集成大液泡产生膨压,花粉开始萌发。萌发的花粉管穿过覆盖层时,其表面上仍附有许多Ca2+沉淀颗粒,显示花粉管仍在从覆盖层小泡中吸收Ca2+。 烟草花柱为实心型,中间是花粉管生长的引导组织。花粉管在引导组织细胞之间的细胞壁中生长。其中的Ca2+沉淀颗粒呈梯度分布,越接近子房,引导组织之间的细胞壁中的钙颗粒越多。但是这一Ca2+梯度直到开花后1天才会形成。这也是烟草雌蕊的成熟要晚于雄蕊的一种特征。烟草花粉管正是随着此梯度分布向子房定向生长。在去雄一天但不授粉的烟草花柱引导组织中也会产生相同的钙梯度分布。 Ca2+对烟草大孢子发生和雌配子体形成也有重要的调控作用。蓼型胚囊珠孔端三个大孢子退化的现象是一个有趣的问题,其过程可能是由细胞程序性死亡机制调控。而大孢子内部Ca2+浓度的变化可能与这一调控密切相关。烟草近珠孔端的两个大孢子来自二分体珠孔端的细胞,二者同时退化,伴随着其内部钙颗粒含量的增加;而第三个大孢子来源于二分体合点端的细胞,它的退化则伴随着大孢子内部钙颗粒含量的减少,而功能大孢子中的钙颗粒含量明显增高等特征。我们推测,大孢子母细胞可能在减数分裂I时即预定了合点端两个大孢子与珠孔端两个大孢子将来的命运,即烟草胚囊二分体阶段的两个大孢子具有细胞结构和生理功能上的差异。 在烟草雌配子体发育过程中,游离核胚囊中的Ca2+颗粒分布与大液泡的形成有密切关系:在功能大孢子细胞质中分布有较多的Ca2+颗粒,但随着胚囊的发育,在二核,四核,八核胚囊中的大液泡体积增大,细胞质中Ca2+颗粒的数量减少。游离核胚囊分化出雌配子体细胞后,在各个细胞中的Ca2+颗粒又有了重新分布:其中助细胞中的Ca2+沉淀颗粒增加明显,尤其是在成熟助细胞的丝状器中积累了大量的Ca2+颗粒;卵细胞中的Ca2+颗粒一直较少;而中央细胞中的Ca2+颗粒也相对较少,可能与中央细胞具有硕大的大液泡,Ca2+溶解入大液泡中有关。 Ca2+通过在细胞中的转运参与调控细胞生理的功能。烟草有性生殖过程中Ca2+的细胞化学定位研究表明:生殖器官中的Ca2+的分布具有一定的时、空分布特征,与有性生殖各个环节的转变密切相连,表明钙参与了调控有性生殖的过程。通过揭示烟草生殖细胞中的钙分布特征,使我们进一步认识了植物有性生殖的发生过程和调控机制。
[硕士论文] 朱娟娟
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2008(学位年度)
摘要:阿维菌素(avermectins)是由阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)NRRL8165产生的一组具有相似结构的十六元大环内酯类抗生素,该抗生素驱虫活性极强,且抗寄生虫机制独特,与其它抗寄生虫药无交叉耐药性,在农业和畜牧业中得到广泛的应用。阿维链霉菌除了产阿维菌素,还可产生多种其他的次级代谢产物,如孢子色素、黑色素和寡霉素等。其中孢子色素属于芳香族聚酮类化合物,从聚酮途径分析来看,阿维菌素和孢子色素聚酮化合物的合成过程都需要乙酰辅酶A的参与。推测孢子色素与阿维菌素生物合成之间可能有竞争底物的现象。本文以野生型阿维链霉菌NRRL8165为出发菌株,用PCR方法克隆孢子色素基因簇直系同源基因(whiEa)侧翼片段,并构建基因置换载体pHL643。将pHL643跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165,通过同源重组,对染色体上的whiEa基因簇进行置换,得到3株阿泊拉霉素抗性、硫链丝菌素敏感的重组菌株(ZJ1-1,ZJ1-2和ZJ1-3),均表现为孢子色素合成缺陷。经摇瓶发酵和HPLC检测,发现whiEa基因簇置换菌株所产阿维菌素产量明显提高,表明孢子色素与阿维菌素生物合成之间是有一定的相互影响。 许多不同种类的抗生素及其它次级代谢物的生物合成都受磷酸盐调节。只有在磷酸盐限制性培养条件下,一些有价值的组分才能产生。近年研究证明,在变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)中对环境中磷酸盐代谢的调节是由PhoR-PhoP双组分信号传导系统介导的,将其中断后,放线紫红素和十一烷灵菌红素超量表达。本文通过分析阿维链霉菌的基因序列,发现同样也存在着与phoR-phoP高度同源的基因。为了研究其功能,本文构建基因置换载体pHL645,将其跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165,筛选得到phoR-phoP基因置换菌株ZJ2。ZJ2在不加磷酸盐的YMS培养基上,菌体生长状态不良,但在加入一定量磷酸盐的YMS培养基上,菌体生长良好且菌落颜色加深。经摇瓶发酵和HPLC分析,发现ZJ2菌株只有在加入一定量的磷酸盐条件下发酵,才能合成阿维菌素,但产量相比野生型很低。
[硕士论文] 张海涛
病理学与病理生理学 山东大学 2008(学位年度)
摘要:[目的] 本实验利用体外培养成纤维细胞模型,运用形态学观察、免疫细胞化学技术、流式细胞术及相关生化指标检测等多种方法研究不同浓度的碘离子及碘分子对体外培养成纤维细胞增殖活性与功能的影响,探讨碘对甲状腺外组织的作用,丰富微量元素碘的实验研究。 [方法] 1.细胞株:人皮肤成纤维(HSF)细胞株,购于协和医科大学基础医学细胞中心。常规细胞培养,待传代稳定后进行以下实验。 2.试剂配制及实验分组:碘化钾,分析纯,以纯水配制成为1000mgT/L母液,避光保存,以DMEM培养液稀释待用。碘,分析纯,以纯水配制成饱和溶液,以化学滴定法测定其浓度,现配现用。本实验中,碘离子设1个空白对照组及50~15000μg/L中若干实验组;碘分子设1个空白对照组及50~4000μg/L中若干实验组。 3.细胞计数及形态学观察:种24孔板,待细胞贴壁后加入不同浓度的碘离子及碘分子,每板均设对照组,于作用4、12、24、48小时后进行细胞计数及观察细胞形态学改变。 4.MTT:种96孔培养板,不同浓度碘离子及碘分子处理4、12、24、48小时后,每孔添加2μl(5mg/ml)MTT试剂,37℃孵育4小时,小心弃去培养液,每孔加入15μl二甲基亚砜(DMSO),振荡10分钟。以酶标仪在490nm波长下测其光吸收值(吸光度A值),可间接反映细胞数量。 5.流式细胞术:不同浓度碘离子及碘分子处理细胞48小时,经离心-PBS冲洗-吹匀-固定-再离心-冲洗-吹打-染色(4℃,20~30分钟)后,以400目尼龙网过滤后上机检测。ModFit分析软件分析,用细胞分裂增殖指数表示相对增殖活力。 6.免疫细胞化学:将洁净无菌的盖玻片放入6孔培养板中,制备单细胞悬液,种6孔板,以不同浓度的碘离子及碘分子处理48小时后取出盖玻片,固定细胞,检测细胞中Ki-67的表达。 7.SOD、MDA检测:利用试剂盒对培养细胞的上清液中丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)进行检测。 【结果】 1.细胞计数及MTT检测:碘离子浓度及碘分子浓度较低(如48小时:碘离子≤3000μg/L,碘分子≤400μg/L)时,细胞计数随浓度增加而增加,细胞活性也随浓度增加而升高;碘离子浓度及碘分子浓度较高(如48小时:碘离子≥3000μg/L,碘分子≥400μg/L)时,细胞计数随浓度增加而减少,细胞增殖活性也随浓度增加而降低,且可见细胞形态学改变。 2.流式细胞术:碘离子浓度100~4000μg/L(碘分子浓度50~700μg/L)实验组细胞增殖指数明显高于对照组,同时细胞凋亡率明显低于对照组;碘离子浓度5000μg/L(碘分子浓度800μg/L)实验组细胞增殖指数与对照组比较没有明显差别,而细胞凋亡率明显高于对照组;碘离子浓度≥6000μg/L(碘分子浓度≥900μg/L)实验组细胞增殖指数明显低于对照组,同时细胞凋亡率明显高于对照组。 3.免疫细胞化学:碘离子浓度100~3000μg/L(碘分子浓度50-500μg/L)实验组Ki-67的阳性率明显高于对照组;碘离子浓度≥5000μg/L(碘分子浓度≥700μg/L)各实验组Ki-67的表达率明显低于对照组。 4.SOD、MDA检测:碘离子浓度50~600μg/L(碘分子浓度50~300μg/L)实验组随碘离子浓度的增加SOD含量增加,碘离子浓度800~10000μg/L(碘分子浓度600~4000Aμg/L)实验组随碘离子浓度的增加SOD含量减少;碘离子浓度50~800μg/L(碘分子浓度50-500μg/L除200μg/L外)各实验组MDA含量与对照组比较无明显差别,碘离子浓度1000~10000μg/L(碘分子浓度700-400μg/L)各实验组MDA含量与对照组比较明显高于对照组。 【结论】 1.碘对成纤维细胞增殖活性具有促进和抑制两方面的作用,其作用效果与作用时间作用浓度密切相关,即高碘对成纤维细胞增殖活性存在时间-剂量-效应关系。 2.初步分析碘主要是通过对成纤维细胞氧化-抗氧化体系、细胞周期和细胞凋亡的调控来影响成纤维细胞增殖活性。 3.碘分子对成纤维细胞增殖活性的作用明显强于碘离子,可能与碘分子本身的强氧化性有关。
[硕士论文] 李婷
人体解剖与组织胚胎学 天津医科大学 2008(学位年度)
摘要:目的:研究不同碘摄入量对20同龄、40日龄子二代Balb/c小鼠生长发育的影响及大脑、小脑皮质和海马的形态学改变,进一步探讨碘缺乏和碘过量对子二代小鼠生长发育、大脑、小脑发育及功能的影响。 方法:选用断乳后一个月,体重在16~20g的SPF-VAF级的Balb/c小鼠,雌雄各半,随机分为5组:低碘组(LI)、适碘组(NI)、5倍碘组(5HI)、10倍碘组(10HI)、50倍碘组(50HI),LI组动物饲以低碘饲料(平均碘含量<50μg/kg),其余各组饲以正常饲料(平均碘含量300μg/kg),上述两种饲料中各种粮食的配比相同,只是碘含量不同。LI组饮用去离子水,其余各组饮用含不同浓度碘化钾的去离子水,其饮水中碘化钾含量分别为10μg/L(NI),1200μg/L(5HI),2700μg/L(10HI),14700μg/L(50HI)。小鼠每日的碘摄入量估计如下:小鼠每日进食5g,进水5ml,各组动物每日碘摄入量分别为:<1μg/d(LI),1.5μg/d(NI),7.5μg/d(5HI),15μg/d(10HI),75μg/d(50HI)。喂养三个月后,雌雄随机1:1合笼,连续传两代,分别取20日龄、40日龄子二代小鼠脑组织,电子天平称重,中性福尔马林溶液固定后常规石蜡包埋,进行焦油紫染色、免疫组化(NSE、GFAP、MBP)染色,观察大脑皮质,海马区神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞形态学的改变。应用MoticImagesAdvanced3.1图像分析系统测量以下指标:焦油紫染色切片中大脑皮质分子层厚度;免疫组化切片中海马CA3区NSE阳性神经元面数密度、平均光密度;CA1区GFAP阳性星形胶质细胞面数密度、平均光密度及MBP阳性少突胶质细胞平均光密度。小脑NSE阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞的面数密度(NA)、体积密度(VV)、细胞质的平均光密度,MBP阳性神经纤维平均光密度,小脑皮质分子层及颗粒层厚度。 结果:1.子二代小鼠生长发育:20同龄时,LI组和50HI组子二代小鼠的体重、脑重和身长、尾长、后肢长与NI组相比呈现出了不同程度的发育落后,其中LI组表现更为明显。40日龄时小鼠体格有所增长,但与NI组比较,LI组和50HI组仍呈现不同程度的发育落后。2.子二代小鼠大脑皮质、海马发育:与NI组相比,20同龄、40日龄子二代小鼠其余各组均表现出不同程度的脑发育差别,其中LI组、50HI组落后更为明显,且差异有统计学意义。3.子二代小鼠小脑皮质、颗粒层,髓质发育:与NI组相比,20日龄、40日龄子二代小鼠其余各组小脑GFAP、NSE、MBP及皮质层、颗粒层厚度均降低,其中LI组、50HI组落后更为明显,且差异有统计学意义。 结论:1.子二代小鼠生长发育:碘缺乏和严重碘过量都会影响子二代小鼠的生长发育,其中碘缺乏的影响更为明显,其机理可能与碘缺乏和碘过量所致甲状腺功能低下有关。2.子二代小鼠大、小脑皮质、海马发育:脑发育临界期碘缺乏和严重碘过量都会影响子二代小鼠大脑皮质发育,海马区及小脑神经元、神经胶质细胞的酶和蛋白的合成和代谢。
[硕士论文] 冯治中
水产养殖 海南大学 2008(学位年度)
摘要:采用机械打磨处理贝壳样品,并采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定常见珍珠贝贝壳中二十种元素,Mg、Al、Ti、V、Cr、Fe、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Ge、As、Sr、Mo、Cd、Ba、La、Ce和Pb的含量,并对测定的结果进行主成分分析、聚类分析和元素含量差异比较。 一、在马氏珠母贝2x2双列杂交组合(II、IS、SI和SS)贝壳中,Sr,Mg,Fe,Mn,Zn,Ni含量高,V含量甚微。用元素含量的变异系数表示不同组贝壳元素含量的相对离散度,表明Al,Ti,Cr,Zn的含量变异较大,Mg,V,Mn,Co,Ni,Sr,Cd,La,La,Ce含量较稳定。四个杂交组合的元素含量差异反映了具有不同遗传背景的杂交组合对元素的吸收和富集的差异,说明马氏珠母贝对富集元素的能力与遗传因素直接相关。通过主成分分析,主成分1:As、Ba、Al、Ge、Cr、Ce、Zn.、CA和La的影响最大;主成分2:Mn,Mg,Cu,Ti、Sr、Ni和Mo影响较大。杂交组合(IS和SI)距离较近,首先聚合在一起,然后再与Ⅱ组聚合在一起,最后与SS组聚合在一起。2个杂交组合的元素含量接近,两个杂交组合的元素含量偏向作为亲本之一的II,与另一个亲本SS差距比较大。这个结果与使用微卫星分子标记得到的结果是一致的; 二、通过将马氏珠母贝优良品系“海优1号”在不同海域养殖后的贝壳元素分析表明,Sr、Mg、Fe、Ni和Mn含量较高,其它元素含量较小。在不同养殖海域,Al、Ti、Zn、Ge的含量变化较大,Mg、Mn、Co、Ni、sr、Cd、Pb的含量比较稳定;环境因素对贝壳的元素含量影响较大。通过主成分分析,主成分1:正向作用的元素及强弱顺序:Pb>Ni>V>Co>Sr>As>Ba>Fe>Mo>Ti>Mg>Cr;负向作用的元素及强弱顺序:Ge>Al>Mn>Zn>Cu>Cd>La>Ce。主成分2:正向作用的元素及强弱顺序:Pb>Ce>La>Mn>Zn>Ti>Fe>Co>V>As>Ni;负向作用的元素及强弱顺序:Mg>Al>Cu>Cd>Ba>Sr>Mo>Ge>Cr。主成分3:正向作用元素及强弱顺序:Cr>Mo>Cu>La>Al>Mg>Pb>Fe>Ce>Zn>Co>V;负向作用元素及强弱顺序:Cd>Ti>As>Ba>Sr>Ni>Ge>Mn。Cr、Cd、Ti、Mo、Cu对主成分的影响较大。聚类分析表明,养殖在广东雷州英利镇英良村养殖和YPL广西北海铁山港营盘镇当地养殖“海优1号”贝壳元素含量接近,与养殖在海南陵水县黎安镇黎安港海域的“海优1号”贝壳元素不相同; 三、在7种珍珠贝的贝壳元素中,Sr、Mg、Fe、,Mn含量较高,As含量最低,其中Al、Ti、Ge、As、Ba含量变化大:Mo的含量变化最小。在主成分分析中,主成分1:呈正向作用的元素主要有Co、Cd、Sr、Mg,呈负向作用的元素主要有As,Cr、Mn;主成分2;呈正向作用的元素主要有Cr,V,Ni,呈负向作用的元素主要有Mn,Ge,Pb;主成分3:呈正向作用的元素主要有Zn,La,Ce,V,Cr,呈负向作用的元素主要有Mg;主成分4:呈正向作用的元素主要有As,Pb,Al,呈负向作用的元素主要有Fe。聚类分析表明,企鹅珍珠贝与斑珠母贝首先聚在一起,再与大珠母贝汇聚,与解氏珠母贝和黑珠母贝聚合的一支汇合,最后与马氏珠母灵与珠母贝聚合的一支结合。此结果与分子标记的聚类结果不一致,主要原因可以是取样的地点不一样,环境因子极大地影响不同珍珠贝贝壳元素含量。依此作为系统分类的标准需要慎重。 四、从整个试验分析的珍珠贝贝壳元素含量表明,印度-三亚贝杂交系列凡在海南陵水黎安港养殖至成贝后其贝壳中铅(Pb)和砷(As)元素含量上都高于“我国食品卫生法对食晶中有害元素含量的规定”。而本试验中采用的7种珠母贝以及马氏珠母贝-海优一号在广西北海和广东雷州养殖后其贝壳中铅(Pb)和砷(As)元素含量上均低于我国食品卫生法对食品中有害元素含量的规定”,说明这类贝的贝壳均适合作为食品或食品添加剂。
[硕士论文] 柳乐
生物化学与分子生物学 西南交通大学 2008(学位年度)
摘要:硒是生物体内必需的生物微量元素,是生物体内重要的生理生物活性物质。机体内硒水平下降将直接影响骨骼、心肌及肝、眼、前列腺、甲状腺等重要的生命器官。天然食品中的硒含量普遍较低,难以满足人体对硒摄入量的需求,而无机硒毒性较高不能用于食品中,因而通过微生物合成法开发含硒食品是很有意义的。 本实验首先对实验室保藏的22株酵母菌株进行耐硒及富硒性能的比较实验,筛选获得耐硒、富硒能力强的菌株为出发菌株Y2。随后以此菌株为出发菌株进行60Coγ射线照射诱变育种,筛选出了一株高生物量高富硒的突变菌株YR166。 通过正交实验确定诱变菌株YR166最佳发酵培养基配方:麦芽汁10%,(NH4)2SO4 1.0%,KH2PO4 0.2%,Se4+浓度为5μg/mL。通过进一步对菌株YR166富硒发酵工艺条件研究,获得最佳发酵条件为:温度30℃,500mL三角瓶中装样60mL,培养6h后加硒,整个培养时间为36h。在此最优化条件下,硒酵母硒含量达到2531.4μg/g,较原菌株提高了74.2%,干酵母生物量达到14.9g/L,较原菌株提高36.7%,硒总含量达37717.86μg/g。为了进一步探讨其在工业生产的可行性,在摇瓶实验结果的基础上进行了10L发酵罐的富硒发酵实验。10L发酵罐装量7.5L发酵培养基,以10%接种量接种培养16h的种子,控制搅拌转速350r/min,通气量1:0.6vvmin,发酵温度30℃,发酵32h,富硒酵母菌株YRl66的硒含量达到2608.7μg/g,生物量达到15.4g/L。 采用斯皮尔曼系数(R)分析本实验室10株酵母菌富硒能力与胞内谷胱甘肽的含量的相关程度,计算出R值为0.8939。由于R=0.8939>0.8,表明本实验所研究的酵母的富硒能力与其谷胱甘肽的含量具有一定的相关性。 本实验通过对酵母富硒部位的研究初步结果表明,酵母富硒的富集部位主要集中在原生质体破碎的沉淀物即细胞的膜蛋白,该部分硒的含量占总硒含量的73%,细胞壁的硒含量仅占总硒含量的9%,细胞可溶部分的硒含量占18%。
[硕士论文] 肖正华
有机化学 新疆大学 2007(学位年度)
摘要:植物多酚遍布整个植物界,由于其多酚羟基特性而用途广泛,具有很好的开发利用价值;尤其,在鞣革工业中,历史悠久,工艺成熟。在色素,医药等领域,方兴朱艾。木樨科梣属大叶白蜡树为城市绿化树种,全新疆均有分布,资源丰富。其皮(秦皮):苦,寒,清热燥湿,收敛;其种子:辛,温,镇静安神。根据文献得知,该植物富含香豆素,槲皮素等多酚类物质;测试得出鞣质含量达到4.8%。国内外对秦皮化学成分的研究较深入,但对其种子的研究,目前未见报道。 为了充分开发利用好该植物,我们对其进行了较系统地研究。采用系统溶剂法提取分离;利用正己烷,乙酸乙酯,甲醇等溶剂反复洗脱,从丙酮-水提取物中分离出9个化合物和1个色素。它们分别是3个香豆素类,2个芳香类,2个黄酮类,2个原花色素二聚体化合物和1个花色苷类色素。通过硅胶柱色谱,大孔树脂,葡萄糖凝胶,制备薄层色谱等方法反复分离,纯化。经理化常数检测,标准品对照,文献比较和波谱学等方法鉴定为:七叶素(Ⅰ),七叶苷(Ⅱ),莨菪亭(Ⅲ),咖啡酸(Ⅳ),丁香苷(Ⅴ),槲皮素(Ⅵ),槲皮素-13-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅶ),原花青定B-4,即儿茶素-(4a→8)-表儿茶素(Ⅷ),原花青定B-4-3’-0--桔酸酯,即儿茶素-(4a→8)-3’-0--格酰-表儿茶素(Ⅸ)。 以上化合物均为首次从该属植物的种子中分得;该色素色价高,含量大,稳定性强,具有很好的开发,利用价值。
[硕士论文] 李丽娜
生物化学与分子生物学 内蒙古科技大学;内蒙古科技大学包头医学院 2007(学位年度)
摘要:目的:
  生物体内微量元素的化学形态分布对理解微量元素的营养学、毒理学及药理学机理是十分重要的。本研究初步建立一种基于电泳分离和同步辐射x荧光(SRXRF)分析技术的生物样品内微量元素的种态分析方法,并对定量分析做了初步探讨。将所建立的方法用于研究人肝癌及癌旁组织中金属蛋白的分布特征,为人肝蛋白组学研究提供金属蛋白分布信息。同时应用于研究汞矿区鱼体内金属蛋白的分布特点,对人类健康,环境保护具有重要的实际意义。研究的开展可以为微量元素的形态分析研究提供技术基础,拓宽现代核分析技术在生命科学研究领域中的应用。
  方法:
  1.在电泳凝胶制备时,加入等量的金属样品,改变其它基体成分的含量,用SRXRF测定凝胶中金属样品的荧光强度,研究不同含量的基体成分对金属样品X荧光检测结果的影响。
  2.人肝癌组织及癌旁组织蛋白提取液(上清液)用IEF分成不同pI的蛋白条带,经干胶处理后,用SRXRF测定蛋白条带内的金属含量得到人肝癌组织及癌旁组织的金属蛋白分布信息。
  3.鱼肝组织蛋白提取液(上清液)用IEF分成不同pI的蛋白条带,经干胶处理后,用SRXRF测定蛋白条带内的金属含量得到汞矿区鱼肝组织的金属蛋白分布信息。
  结果:
  1. SDS为12ul时,X荧光检测出Fe,Cu,Zn的相对含量最大,大于或小于该值检测值均减小。随着Tris-Hcl的增加,X荧光检测出Fe,Cu,Zn的相对含量依次减小。随着丙烯酰胺的增加,X荧光检测出 Fe,Cu,Zn的相对含量依次减小。随着甘油的增加,X荧光检测出Fe,Cu,Zn的相对含量依次减小。
  2.在所检出的含铁蛋白中,癌旁组织细胞胞质溶胶的pI为6.06、5.81、5.32、3.45、5.07的蛋白条带内含铁量明显高于癌组织,而癌组织样品中 pI为5.94的条带内铁含量略高于癌旁组织;癌旁组织样品中铜含量高于癌组织则主要体现在 pI为6.06、5.81的条带内;癌旁组织样品中锌含量高于癌组织主要体现在pI为6.06、5.32—6.19、5.07—6.44、5.32—6.06、4.32—5.81的蛋白条带内。
  3.在贵州草鱼1肝上清液中,主要有1个含Zn条带,pI为4.94;在贵州草鱼2肝上清液中,主要有1个含Zn条带,pI为5.05;在贵州鲤鱼肝上清液中,主要有1个含Zn条带,pI为4.82;在贵州鳙鱼肝上清液中,主要有2个含Zn条带,pI为4.94,5.17;在贵州草鱼2肝上清液中,主要含Hg条带为pI6.2,同时检测出高含量的As和Se;在贵州鳙鱼肝上清液中,主要含Hg条带为pI3.67,伴有高含量的As,同时也是主要的含Se条带;
  结论:
  1.等量的金属样品在不同的凝胶基体中 X荧光检测出的相对含量是不同的,并且是有一定规律可循的,该结论为荧光强度和含量间关系的数学模型和基体校正程序的建立提供有意义的信息。
  2.肝细胞癌和癌旁组织的细胞胞质溶胶中,所检出的含铁、铜、锌蛋白基本是一致的,但金属在各个蛋白中的分布模式有所不同。MT与肿瘤的关系已引起人们广泛的重视,在pI4.32—6.44范围内癌旁组织样品中锌含量高于癌组织,已有报道MT在肝细胞癌中呈低表达,与我们的实验结果相类似。我们测得的主要含锌蛋白就可能是金属硫蛋白(MT)以及它们的聚合体。
  一些工作显示:肝癌组织中某些金属蛋白含量或活性反常如原发性肝细胞癌组织以及肝细胞瘤细胞系铜、锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn.SOD)的活性与正常组织、癌旁组织以及正常肝细胞系相比有明显降低,说明肝癌细胞的抗氧化功能受到了严重的损害。癌旁组织pI为6.06,5.81、5.56、5.44的含锌蛋白同时铜含量也高于癌组织,应该是 Cu/Zn.SOD,文献报道人肝 Cu/Zn.SOD的pI为5.37、5.56和5.66。
  3.已有大量的报道表明硒对很多重金属,如砷、镉、汞、铅等的毒性具有拮抗作用,实验结果表明,高Hg鱼肝中Se同时增高,与以往的研究相符。另外,Hg蓄积时间长短不同,鱼种的差别和鱼体的营养状况等个体差异可能也是影响因素之一。还需要进一步加大样本量来获得更有力的证据。我们还发现 Hg,As存在于同一等电点蛋白中,说明这两种元素具有某种相关性。这种相关关系不一定是因果关系,也可能仅是表面上的伴随关系。MT参与生物体内微量元素(Cu,Zn)的储存、运输和代谢和重金属(Cd,Hg)的解毒作用等多种生理功能。文献报道:各种亚型的MT结合不同数目的金属离子时,其pI3.36—5.57范围内。我们测得的贵州鱼肝上清液中主要含锌蛋白就可能是MT以及它们的聚合体。这有助于进一步研究汞与MT的关系及相互作用的机制。
  综上所述,SRXRF是一种高灵敏度,高分辨率的多元素分析方法,特别适合于电泳分离后生物样品中微量元素的形态分析。结果中这些分布特征的普遍性及生物学意义还有待进一步研究。
[硕士论文] 张涛
生物化学与分子生物学 内蒙古科技大学;内蒙古科技大学包头医学院 2007(学位年度)
摘要:硒是人体必需的营养元素,在体内发挥着重要的生理、生化功能,如抗氧化、增强免疫力、抗衰老等。同时硒也属于稀散元素,在地球上的含量少且分布不均,全世界有2/3的地区属于缺硒地带,我国缺硒地区占全国总面积的2/3,其中1/3为世界公认的严重缺硒区。当机体硒水平下降时会影响心肌、肝脏、甲状腺等重要的生命器官的正常功能,导致多种疾病的发生。我国科学家通过补硒来治疗和预防克山病、大骨节病等严重危害人们健康的疾病,已取得非常明显的效果。研究表明每天补充一定量的硒还可以使癌症的发生率和死亡率下降50%。植物是自然界硒循环生态链中将无机硒转化为有机硒的关键载体,又是人类硒摄入的重要来源。由于硒化合物存在形式不同,它们在机体的生物利用度,功能有效性,代谢过程都会明显不同,因此对于植物中硒形态分析对于指导人们补硒,保障人们健康有着非常重要的意义。
  本文对于富硒大米中的各种蛋白的硒含量进行了测量,根据Osbrone对谷物蛋白质组份分类原则,尝试着采取一种顺序搅拌离心法分离提取大米中存在的四类蛋白,即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。采用电感耦合等离子质谱(ICPMS)作为硒的检测方法,测定了四种蛋白提取液中各自的硒含量。运用排阻色谱与电感耦合等离子质谱联用方法对于清蛋白提取液中含硒蛋白组份的分子量进行了测定,初步分析了清蛋白中含硒蛋白组份的分布。通过蛋白酶解和蛋白酸水解法释放富硒大米及富硒酵母中结合在蛋白多肽链中的氨基酸,运用反相离子对色谱和电感耦合等离子质谱联用方法对于酶解液及盐酸水解液中含有的含硒氨基酸成份进行了定性及定量分析,初步探讨了在富硒大米和富硒酵母中与蛋白结合的含硒氨基酸形式。
  结果表明:富硒大米中的蛋白提取液的硒含量约占富硒大米中总硒量的73%,由此推测含硒蛋白是富硒大米中硒的主要存在形式,其中谷蛋白提取液中硒含量占总硒量的48%,是主要的含硒蛋白形式。对于清蛋白提取液中含硒蛋白组份的分析,从色谱图中可以看出分子量分别为17.9 KDa、12.6 KDa、8.35 KDa的蛋白中含有硒元素,分子量为12.6 KDa的蛋白含硒量占清蛋白总硒量的50.2%,是清蛋白提取液中主要的含硒蛋白。分析结合到蛋白中的各种含硒氨基酸形式表明:富硒酵母中与蛋白结合的主要含硒氨基酸是硒代蛋氨酸,含量约占总硒量的46%;在富硒大米的酶解液中,只测定出硒代半胱氨酸,未检测到硒代蛋氨酸的存在,另外还检测出一种与硒代蛋氨酸保留时间相近的未知物质,可能是氧化的硒代蛋氨酸形式,但需要做进一步准确鉴定及分析。
  本文对于富硒大米中的四类蛋白含硒量测定和清蛋白中含硒蛋白组份分布的分析以及富硒大米中与蛋白结合的含硒氨基酸的检测结果可为今后进一步研究硒在大米蛋白中的结合形态以及评价大米蛋白的生理功能和营养价值提供重要参考。
[硕士论文] 石姗姗
细胞生物学 辽宁师范大学 2006(学位年度)
摘要:本文对脱脂豆粕中提取大豆异黄酮的最佳提取溶剂、最佳提取条件及大豆异黄酮的抑菌活性、抑菌机制进行了研究。实验结果表明:乙醇作为提取大豆异黄酮的最佳溶剂,最佳提取条件为乙醇浓度60﹪,提取温度70℃,物料比1:18,提取时间2h,提取次数2次。采用该方法从脱脂豆粕中可提取大豆异黄酮的量为0.45﹪。超声提取一次,30min所得大豆异黄酮的提取率比加热回流法提取120min的提取率高约46﹪,与加热回流提取二次,提取240min的提取率一致。将大豆异黄酮用于抑菌实验,发现大豆异黄酮具有抑细菌和抑真菌活性,其中对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、腊状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李氏菌、白色念珠菌、犁头霉菌和米曲霉均有明显的抑制作用,但对大肠杆菌和酵母菌无抑制作用,其抑菌作用的成分是其甙元形式。以金黄色葡萄球菌为指示菌,研究大豆异黄酮的抑菌机制,结果表明大豆异黄酮能够抑制菌体对数生长期的分裂。扫描电镜结果显示,菌体表面皱缩、出现囊泡状或不规则形状的突起状结构甚至出现干瘪、扭曲变形等。透射电镜结果显示,菌体出现质壁分离的现象,细胞膜破裂,细胞质固缩,凝集成块,解体出现空腔。呼吸代谢抑制实验结果显示:大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌的呼吸代谢有抑制作用,这种抑制主要是通过抑制TCA途径而起作用。因此,可以推测大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌的抑制作用可能是破坏细菌细胞壁及细胞膜的完整性,抑制蛋白质的合成和抑制细菌的呼吸代谢等多种作用的综合结果。
[硕士论文] 李琴
材料学 北京化工大学 2006(学位年度)
摘要:本文论述了利用生物大分子活性中心元素群态分布特点诠释心脑血管相关疾病。   微量元素与心脑血管系统相关疾病的关系越来越受到西医界的关注,如其中很多学者都提出冠心病与血清中某些个别元素如Zn、Cu分布的异常有关,但是在这些研究中学者们往往只是单独考虑某种或某几种微量元素对心脑血管疾病的单独作用,陷入了“微量元素对号入座”论。金日光教授提出了第四统计力学——群子统计理论很好地解决了这个问题。利用这一统计理论考察了患者血清或头发中生物大分子活性中心元素整体分布的特点,由于这些元素的分布与生物大分子的分布有着直接的关系,所以可以通过这些分布规律预测出生物大分子的分布,探讨心脑血管疾病的病因和病机,避免了“唯微量元素论”,又避免了“唯有机药成分论”。在以前的研究中发现生物大分子活性中心元素的分布特点可以诠释中医学中的相关理论,联系中、西医学,这为中西医结合提供了理论依据,为治疗心脑血管相关疾病打开了新的思路。 通过计算发现各疾病患者生物大分子活性中心元素的分布特点是:高脂血患者血清及头发中的分布特点一致,k2*r1/r2(高脂血)<k2*r1/r2(对照组),即亲电强度较低的生物大分子活性中心元素分布占据优势;根据k*r1、k*r2可以把高血压患者分成四种类型,与中医对高血压患者的辩证分型一致;绝大部分冠心病患者血清中的生物大分子活性中心元素分布参数k2*r1/r2较对照组小,少部分较对照组的大;脑梗塞患者血清中的生物大分子活性中心离子分布特点则是与心血管疾病的分布特点相反,即大部分患者k2*r1//r2对照组的高。可见从高脂血到脑梗塞,血清的阳性越来越弱,而阴性则越来越强。 本文还利用通过分析中药中生物大分子活性中心元素分布探讨了治疗相关心脑血管疾病的高频中药的药理和药效。结果表明治疗心脑血管系统疾病的高频中药主要有两类:第一类是亲电强度较强的生物大分子活性中心元素分布较多的偏阴中药,以补阴虚,这类中药抑制脂质合成的效果较好;第二类是亲电强度较弱的生物大分子活性中心元素分布占据优势的偏阳性中药,这一类中药有很好的促进脂质代谢的作用。在治疗心脑血管相关疾病的时候一般以偏阴性中药为主,辅助与偏阳性中药,但是随着病情的加剧,阳性中药使用频率有明显上升趋势。
[硕士论文] 黄宇峰
微生物学 四川大学 2006(学位年度)
摘要:本文研究并筛选了本实验室保存的56株红曲菌株,建立了GABA的提取及定性的方法。首先用75%(v/v)乙醇对红曲固体发酵物进行40min的超声抽提,用G层析板,分别以正丁醇:乙醇:氨水:水=16:16:3:12和异丙醇:甲醇:氨水:水=20:12:3:12为展开剂对红曲发酵抽提液进行薄层层析,茚三酮显色。通过对GABA显色的比较获得高产菌株三株。同时通过分光光度计对红曲菌株产红色素进行了筛选,获得高产红曲红色素的菌株一株.色价达到3696U/g。 本文还通过本实验室开发的一种新型护色剂对红曲红色素的稳定性进行了研究,证明了护色剂不会影响红曲红色素的化学结构,并确立了本护色剂的最佳添加添加量0.0001%(m/v),最佳pH为7。在最佳添加方案的情况下,红曲红色素在阳光曝晒6小时后其残存率是对照的2.85倍。本护色剂同时对其他的天然色素如红曲黄色素,姜黄色素同样具有非常明显的护色效果。
[硕士论文] 唐晓丹
分析化学 东北大学 2006(学位年度)
摘要:硒是人体生命活动不可缺少的微量元素之一,硒的缺乏和过剩都与人的生命休戚相关。硒摄入不足会导致多种疾病;同时硒也具有毒性,硒摄入量过多,对人体会造成危害。硒的毒性和生物利用度在很大程度上取决于硒的化学形态,如无机形态中,Se(Ⅵ)的毒性大于Se(Ⅳ)。因此,建立灵敏、可靠的测定方法,特别是对于测定各种环境和生物样品中硒的形态分析有着重要意义。 本文将流动注射(FI)与氢化物发生-原子荧光法(HG-AFS)联用,建立了在线共沉淀预富集痕量硒的体系。通过优化各种条件,成功测定了多种生物样品和环境样品中的痕量硒Se(Ⅳ)以及硒的形态分布。实验方法基于硒Se(Ⅳ)在碱性介质中与La(OH)3共沉淀,沉淀被收集在PTFE微珠上,HCl溶液洗脱沉淀后和还原剂NaBH4反应,产生的气态氢化物被载气(Ar)引入原子化器中,在硒空心阴极灯激发下产生原子荧光。当进样体积为3.4ml时,采样频率为38样h-1,富集系数为11,检出限为5ngl-1(3σ),对0.5μgl-1Se(Ⅳ)连续11次测定的相对标准偏差为1.2%。在相同条件下,对比了6.8ml进样量,富集系数达到20,检出限为3ngl-1(3σ),相对标准偏差为1.1%[n=11,0.5μgl-1Se(Ⅳ)]。测定了标准物质CRM176(Citywasteincinerationash)、CRM63(Skimmilkpowder)和GBW09101(Humanhair)中的痕量硒,并对发样和尿样进行了加标回收实验,同时还对三种地表水中的痕量硒进行了形态分析。
[硕士论文] 周桦
分析化学 东北大学 2006(学位年度)
摘要:在环境水中,镁含量影响水体硬度,也是衡量某些水体污染程度的重要指标。在人体细胞内,镁几乎参与所有的新陈代谢过程。在生理学浓度范围内,镁本身没有基因毒性,但是它对保持核酸结构的稳定性却有着重要的作用。另外,它还能激活体内多种酶,是DNA过程中酶的主要催化剂。镁缺乏有可能导致心血管系统疾病,如严重心律失常、缺血性心脏病、高血压病等,因此无论是从环境科学本身及其对人类生存的影响,还是从生命医学的角度,测定镁含量都具有重要的意义。 本文以镁与8-羟基喹啉-5-磺酸(HQS)在碱性溶液中反应可以产生荧光为基础,乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)作为掩蔽剂,十六烷基三甲基氯化铵(HTAC)为增敏剂,将顺序注射分析与荧光光度检测技术联用,建立了测定血清和环境水样品中镁含量的灵敏的自动分析方法。使用单因素优化法对与反应有关的实验参数进行了优化。在最佳实验条件下,方法的线性响应范围为8~1200ng/ml,检出限为4ng/ml,在60样/h的实验频率下,对500ng/ml的Mg2+进行11次平行测定,得到该方法的精密度为0.2%。方法灵敏,简单,快速,每次测定仅需150μl试样和试剂。 为了验证该方法的准确度,进行了回收率实验和方法对比实验。环境水和血清样品的回收率均在93.8~100.3%范围内。对环境水样品的测定结果与国家标准方法火焰原子吸收光谱法测定结果无显著性差异。对牛血清(冻干)成分分析标准物质[GBW(E)090006]的测定结果与推荐值一致。
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