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[博士论文] 黄鑫
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:乳是雌性哺乳动物哺育其初生幼仔生长和发育的天然营养品,同时也是人类生存必不可少的重要食品。乳合成的调控机理是生命科学的重要基础问题之一。探究乳合成相关信号转导途径,寻找调控乳合成的关键信号分子将会为奶牛乳产量和乳品质的提高提供重要的实验依据。营养素和激素通过调控基因的表达,在乳合成方面发挥重要的调节作用,特别是氨基酸在调控乳蛋白合成方面已成为近年来的研究热点。目前,氨基酸和激素调控乳合成方面的研究已经取得一定的成果,但对其调控乳合成分子机制的研究还不够深入。因此,进一步探究乳合成的分子调控机制,完善其分子调控网络是泌乳生物学领域的重要研究内容。
  核因子κB(NFκB)作为真核细胞中重要的转录因子,广泛参与多种基因的表达调控,在细胞增殖与分化、细胞凋亡、免疫应答和炎症反应等方面发挥重要作用,但在泌乳生物学领域的相关研究鲜有报道。本课题以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)为研究基础,通过系统全面的研究,揭示了NFκB1通过PI3K信号途径接受外源信号氨基酸(蛋氨酸)和激素(雌激素),正向调节下游靶基因mTOR、SREBP-1c、β4Gal-T2、Cyclin D1的表达。此外,本研究进一步揭示甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)能够介导蛋氨酸(Met)和雌激素(E)信号,促进NFκB1磷酸化进而调控BMECs的乳合成和细胞增殖。本研究进一步丰富和完善了乳合成的分子调控网络,为营养素和激素调控乳合成的作用机理提供重要的实验依据。
  本研究使用的BMECs由组织块培养法分离和纯化获得。用免疫荧光染色法检测BMECs中角蛋白18(Cytokeratin18)和β-酪蛋白(β-casein)的表达以鉴定细胞纯度及泌乳能力。在培养液中添加Met(0.6 mmol/L)或E(2.72×10-2μg/L),qRT-PCR和Western blot结果显示,NFκB1的表达量显著上升,p-NFκB1水平显著提高。免疫荧光结果显示,Met和E还能够促进NFκB1入核及磷酸化。研究结果表明,NFκB1可能是介导Met和E促进BMECs乳合成的重要调节因子。
  对NFκB1基因进行过表达和干扰。qRT-PCR和Western blot结果表明,NFκB1能够正向调控与乳合成和细胞增殖相关的重要信号分子mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1的表达,以及提高β-casein和β4Gal-T2的表达水平。进一步研究结果显示,NFκB1基因过表达能够显著促进BMECs甘油三酯和乳糖的合成与分泌以及细胞增殖;而NFκB1基因干扰后,细胞合成与分泌甘油三酯和乳糖的水平及细胞增殖能力显著降低。此外,对NFκB1基因过表达和干扰后BMECs中合成的脂滴进行BODIPY染色,实验结果显示,NFκB1能够促进细胞内脂滴的合成,与上述结果一致。以上研究结果表明,NFκB1能够正向调控BMECs的乳合成及细胞增殖。
  采用生物信息学手段,对mTOR、SREBP-1c、β4Gal-T2、Cyclin D1转录起始位点上游2000 bp的启动子区域进行分析,发现这些基因的启动子区域均可能含有NFκB1结合位点(κB序列)。染色质免疫共沉淀(ChIP)结果证实NFκB1与这些基因的启动子存在结合。ChIP-qPCR结果显示,添加Met和E后,NFκB1与靶基因启动子的结合显著升高。以上研究结果表明,Met和E能够激活NFκB1并通过提高其与靶基因启动子的结合,在转录水平上调控乳合成和细胞增殖相关基因的表达。
  为了探究NFκB1接受Met和E信号的分子机制,实验进一步检测了在添加PI3K抑制剂(wortmannin)和mTOR抑制剂(rapamycin)分别抑制PI3K和mTOR信号途径后,NFκ1的表达与激活情况。结果显示,抑制PI3K途径后NFκB1和p-NFκB1的蛋白水平显著下降,而抑制mTOR途径后NFκB1和p-NFκB1的蛋白水平无显著变化。进一步研究发现,在添加Met或E同时抑制PI3K途径后,Met和E对NFκB1表达的促进作用被明显削弱。研究结果表明,Met和E通过PI3K途径激活NFκB1。
  此外,对GlyRS介导Met和E信号促进NFκB1磷酸化的分子机制进行了研究。观察过表达GlyRS及同时利用siRNA干扰NFκB1后,对下游靶基因mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1表达的影响;以及观察添加Met或E同时利用siRNA干扰GlyRS后,对NFκB1磷酸化的影响。研究结果表明,GlyRS介导了Met和E促进NFκB1磷酸化的作用,以及GlyRS主要通过NFκB1调节mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1信号通路。进一步观察利用siRNA干扰GlyRS同时干扰GCN2对NFκB1基因表达和磷酸化的影响。研究结果表明,GlyRS促进NFκB1磷酸化的作用与GCN2途径及NFκB1基因表达无关。本实验室其它研究工作表明GlyRS直接结合和促进NFκB1磷酸化,与本研究结果一致。
  综上所述,NFκB1作为重要的转录因子能够正向调控BMECs的乳合成和细胞增殖。Met和E通过PI3K途径和GlyRS激活NFκ B1。p-NFκB1通过与靶基因mTOR、SREBP-1 c、β4Gal-T2和Cyclin D1启动子的结合,在转录水平上调控这些靶基因的表达。
[博士论文] 殷实
遗传学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:卵泡发育的正常进行对于雌性生育能力的维持十分重要。卵泡发育是一个复杂的生物学过程,其间涉及到细胞的生长、增殖及分化等方面,需要基因的精确调控。组蛋白乙酰化是一种重要的基因调控方式,乙酰化转移酶和去乙酰化酶能够通过改变组蛋白与DNA的结合能力改变染色质的状态,进而对基因的转录进行调控。
  赖氨酸(K)乙酰化转移酶KAT8,作为果蝇中X染色体剂量补偿系统中的重要组成部分,负责组蛋白H4第十六位赖氨酸大部分的乙酰化。我们发现Kat8在小鼠卵母细胞及颗粒细胞中均有所表达,并且高表达于生发泡期卵母细胞胞核。接下来我们进一步利用条件性敲除小鼠模型研究了Kat8在小鼠卵泡发育过程中的功能,结果表明卵母细胞特异敲除Kat8后小鼠不育,次级及腔前卵泡的发育受阻,闭锁卵泡数目增多,大量卵母细胞出现严重的DNA损伤和凋亡,而颗粒细胞的增殖并未受到明显影响。Kat8敲除的卵母细胞组蛋白H4第十六位赖氨酸乙酰化的水平显著下调,细胞内异染色质的形态明显异常,卵母细胞中抗氧化基因Prdx1、Prdx、Gpx1及Gpx4的表达显著下调,活性氧水平明显升高。向敲除小鼠注射抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可以促进敲除鼠的卵子发生和卵泡发育,同时降低卵母细胞活性氧、DNA损伤及凋亡水平。KAT8可以直接结合在抗氧化基因的启动子区域,调控这些基因表达。而颗粒细胞敲除Kat8对小鼠的生育力及卵泡发育并无明显影响。
  综上所述,我们的研究结果表明卵母细胞内KAT8通过调控细胞内抗氧化基因的表达降低了卵母细胞的活性氧水平,进而减少了卵母细胞的凋亡,提高了卵泡的存活能力,维持了雌性的正常生育力。KAT8是迄今为止首个报道的在小鼠卵泡发育过程中所必需的乙酰化转移酶,同时本研究为卵泡发育障碍引起的不孕症的诊断、治疗提供了重要的科学依据。
[硕士论文] 杨芳
生物学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物排卵在雌性生殖活动中发挥重要作用,孕酮是开启排卵的关键因子,其主要通过孕酮受体(Progesterone receptor,PGR)产生生理作用,用PGR抑制剂或将其条件性敲除后均降低卵母细胞的数目,甚至出现不育现象。此外,在该过程中,因脉管脱落和重塑而形成间断的低氧环境,也能影响排卵事件的正常进行。因此孕酮和低氧在排卵过程中至关重要。近年来通过大数据分析筛选出大量的PGR下游基因,但在已知的基因中却很少发现孕酮响应元件,如参与排卵过程中卵泡破裂和炎症反应的Edn2、PPARγ。这两个基因是否受PGR和低氧的调控,如何进行调控,以及如何协调参与排卵过程等,这些问题均有待阐明。
  本实验以未性成熟的雌性昆明小鼠和人源KGN细胞为研究对象。1)用PMSG/hCG构建小鼠超排卵模型,联用PGR抑制剂RU486,收集小鼠卵泡中的颗粒细胞检测Edn2和PPARγ的mRNA的表达情况;2)在此基础上,辅以低氧模拟物CoCl2,探究低氧对颗粒细胞中Edn2和PPARγ的影响;3)进一步地,在KGN中超表达PGR、HIF1,以探究PGR、HIF1对Edn2和PPARγ的影响;4)为确认HIF1α的调控作用,采用CRISPR-Cas9技术在KGN细胞中构建HIF1α特异性敲除细胞系,辅以CoCl2处理,研究HIF1α介导PGR调控Edn2和PPARγ的机制;5)利用生物信息学分析孕酮调节信号中的网络节点。
  结果发现:1)PPARγ和Edn2在PMSG处理48h,hCG处理11h后表达量显著性增加,但经RU486处理后表达量却显著下降;2)经CoCl2处理12h后显著提高Vegfa、PPARγ和Edn2的表达量;3)在KGN细胞中超表达HIF1各载体发现其主要通过HIF1α调控下游基因,且可通过低氧响应元件调控Edn2;4)缺失HIF1α后Edn2和PPARγ的mRNA与蛋白本底水平在CoCl2刺激下均显著下降;而且超表达PGR致Vegfa、Edn2和PPARγ的表达升高因HIF1α缺失后受阻;5)通过芯片数据分析探索并初步证实孕酮调节信号网络通路中存在4个关键网络节点,并发现9个潜在受PGR调控的基因。
  总的来说,在排卵过程中PGR和低氧能够调节PPARγ、Edn2,且PGR对二者的调控依赖于HIF1α。孕酮调节信号网络通路分析为我们进一步了解在排卵过程中孕酮、低氧等因素如何通过基因调控来影响排卵进程奠定基础,而且也为理解哺乳动物排卵过程及相关疾病的发生机理提供一定的理论知识。
[硕士论文] 陈龙
生物学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:排卵是雌性哺乳动物中非常重要的生理活动,而这一过程受到许多因素的协同调控,其中,由于激素调节广泛性和容易引起级联反应的特点被认为是排卵期主要的调控因素之一。排卵的正常发生除了要受到促卵泡激素,黄体化激素的调节,还会受到雌激素和孕酮的调节。哺乳动物体内雌激素和孕酮发挥生理作用几乎都要与其特异性受体结合才能实现。在对孕酮受体敲除型小鼠的各项研究中发现,当孕酮受体表达异常时,可直接影响雌性哺乳动物的诸多生殖功能的正常进行,特别是在排卵这一生理过程中,孕酮受体的正常表达变得十分重要。近年来,通过RNA-Seq和CHIP-Seq实验已经筛选出了大量孕酮受体的下游基因,其中,过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1被认为是孕酮受体在卵巢中介导排卵过程的关键信号分子。此外,排卵过程中,雌激素和孕酮的血液内含量呈现一定的相关性,是否彼此调控对方的分泌尚未清楚。同时,雌激素能够影响细胞内孕酮受体的表达已得到证实,但具体的分子机制还有待研究。
  随着雌性生殖研究的深入,大量研究结果发现,雌激素含量变化会导致部分miRNA出现差异性表达。此外,也有实验证实 miRNA是调控孕酮受体表达的诸多要素之一。miR-26a/b是一类常见的哺乳动物miRNA,测序数据显示在卵泡发育期间的颗粒细胞中,miR-26a/b维持高水平表达且在卵泡发育不同时期存在表达差异,这一现象说明miR-26a/b可能作为一种重要的调节因子参与排卵过程。本实验拟探究在排卵过程的正常进行,是否要依赖于颗粒细胞中miR-26a/b介导雌激素对孕酮受体的调控作用。研究结果显示,在小鼠原代颗粒细胞中,经雌激素处理24h后,通过RT-PCR检测pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表达量都显著下调(p≤0.05),此外,通过RT-PCR和Western Blot检测发现孕酮受体及其下游基因过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1的mRNA和蛋白表达均发生显著上调。通过生物信息学分析miRNA调控孕酮受体3’-UTR序列的靶位点序列,构建双荧光报告载体以及位点突变载体。荧光数据显示,miR-26a/b可特异性结合到孕酮受体3’-UTR序列,并引起蛋白水平的下调。为了进一步证实miR-26a/b可介导雌激素对孕酮受体表达的调控,实验选取了人颗粒细胞系(KGN)作为实验对象。KGN细胞在经雌激素处理24h之后,细胞内pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表达量都显著下调(p≤0.05),此外,孕酮受体及其下游基因过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1的mRNA和蛋白表达均发生显著上调,结果与小鼠原代颗粒细胞处理组一致。通过采用雌激素受体拮抗剂,它莫西芬和雌激素受体干扰RNA,shER阻断雌激素信号通路,结果显示,细胞内pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表达量都显著上调(p≤0.05),同时孕酮受体及下游基因在mRNA和蛋白水平显著下调。为了进一步证实miR-26a/b对于下游基因的调控,实验中采用miR-26a/b minics和miR-26a/b inhibitors分别处理KGN细胞,结果显示,miRNA minics处理后,孕酮受体及下游基因的表达受到阻遏;当用miRNA inhibitors处理细胞后,孕酮受体及下游基因的表达发生显著性上调趋势。为更加精确模拟miRNA在细胞内的成熟过程,实验通过构建pre-miR-26a/b表达载体以实现miRNA在细胞中长期稳定表达。瞬时转染miRNA表达载体,可抑制雌激素对孕酮受体的调控。
  综上,研究结果显示,在雌性哺乳动物颗粒细胞中,孕酮受体响应雌激素信号分子有可能是由miR-26a/b介导来实现的,这说明孕酮受体调控雌性哺乳动物排卵时并不单纯依靠孕酮的调控。这为进一步探索激素协同调控雌性哺乳动物排卵过程提供新的视角。
[硕士论文] 崔馨元
生物化学与分子生物学 大连医科大学 2017(学位年度)
摘要:背景与目的:
  孕激素(Progesterone,P)在胚胎发育成熟和着床过程中起重要作用,孕激素不足可导致胚胎发育不良,及妊娠终止引起流产。孕激素通过调节与着床有关分子的表达促进胚胎的增殖和黏附能力。多种病理和生理过程受到蛋白质糖基化的影响,其中包括了胚胎发育与着床过程。O-糖基化和 N-糖基化是蛋白质糖基化的主要形式。蛋白质的O-岩藻糖基化受蛋白质O-岩藻糖基转移酶(poFUTs,protein-fucosyltransferases)的催化,而poFUTs在促进胚胎发育与着床过程中的作用未见报道。激活蛋白-1(AP-1)是一种转录因子,转录因子家族由Jun和Fos的细胞同源物组成,参与细胞增殖、分化、和侵袭过程和内分泌基因的调节。研究发现,AP-1(c-Jun/c-Fos)广泛表达于人胎盘中,活化的AP-1具有调控胎盘的形成和胎儿发育的作用。本研究拟探讨孕激素对蛋白质 O-岩藻糖基化的调控作用及影响胚胎增殖和着床过程。研究结果表明 JAR细胞经孕激素作用,增加AP-1(c-Jun/c-Fos)的磷酸化表达,上调poFUT1的基因表达,并促进胚胎细胞的黏附能力与增殖能力。实验有助于揭示岩藻糖在着床糖生殖生物学中的作用及其机制,为临床医学提供研究及诊断治疗的新思路。
  方法:
  1.利用ELISA和Western blot检测健康未孕、早孕和流产妇女血清中孕激素和poFUT1的蛋白表达水平。通过免疫荧光的方法验证人绒毛组织中poF UT1的定位和表达。
  2.利用Wester n blot,免疫荧光和Real-ti me PCR等方法,观察孕激素对胚胎滋养层细胞中poFUT1基因和蛋白表达水平的影响,以及孕激素与米非司酮联合应用对poFUT1基因和蛋白表达水平的影响。
  3.利用Wester n blot,免疫荧光和Real-ti me PCR等方法,观察孕激素影响poFUT1的表达及对细胞增殖黏附功能的改变。
  4.为了探讨孕激素是如何调控poFUT1表达,我们采用Western blot、EMSA和免疫荧光方法确定孕激素可激活转录因子AP-1的转录活性。
  5.利用染色质免疫沉淀技术检测转录因子AP-1直接作用在poF UT1的启动子区域,促进poFUT1转录,并且通过Western blot和Real-time PCR检测瞬时转染c-Jun/c-Fos siRNA干扰质粒和AP-1抑制剂(TIIA)处理后poFUT1基因和蛋白表达的变化。
  6.体外着床模型是在荧光显微镜下,观察和统计黏附率,检测了包括正常组、孕激素组、孕激素联合米非司酮组、转染 c-Jun/c-Fos siRNA干扰质粒组,AP-1抑制剂(TIIA)组以及分别联合孕激素等9组的胚胎黏附率。并且利用Western blot、免疫荧光和CCK-8检测JAR细胞增殖能力。
  结果:
  1.收集临床样品包括健康未孕、正常早孕和先兆流产女性血清进行 ELISA检测发现:正常早孕妇女血清中,孕激素和poF UT1的含量均高于先兆流产患者和健康未孕的女性;而先兆流产患者血清中,孕激素和poF UT1的含量比早孕妇女低。孕激素和poF UT1在血清中的表达变化呈正相关。通过免疫荧光确定人早孕绒毛中poFUT1的定位和表达。
  2.孕激素促进 poFUT1的基因和蛋白水平的表达。经过不同浓度的孕激素和不同作用时间处理后,通过Real-time PCR和Western blot等方法检测发现,孕激素能显著促进JAR细胞 poFUT1基因和蛋白的表达;Real-time PCR、Western blot和免疫荧光结果表明,联合应用米非司酮(RU486)可抑制孕激素的效用;瞬时转染poFUT1 siRNA后,poFUT1表达明显降低,联合孕激素处理后可回调poFUT1的表达。
  3.孕激素促进 poFUT1的表达并调节 JAR细胞的增殖与黏附的能力。Real-time PCR、Western blot和免疫荧光结果发现,干扰poFUT1的JAR细胞中合并应用孕激素可以恢复poFUT1的表达。通过Western blot、CCK-8和免疫荧光等方法分析发现孕激素调控poFUT1的表达影响JAR细胞的增殖和黏附能力。
  4.孕激素激活转录因子AP-1的转录活性。Wester n blot、EMSA和免疫荧光结果发现,孕激素(10-5mol/L)可上调转录因子AP-1(c-Jun/c-Fos)的表达水平,并促进其在核中的积累。
  5. AP-1直接影响靶基因poFUT1的转录,Real-time PCR、Western blot结果显示,与对照组相比,抑制了AP-1的转录激活能力可降低poF UT1的表达水平。通过CHIP实验进一步确定了AP-1直接作用在poFUT1启动子区域,引起下游靶基因poFUT1转录并调控其表达变化。
  6.孕激素通过激活转录因子 AP-1上调 poF UT1表达水平。孕激素可调控poFUT1的表达,poFUT1的表达变化可影响胚胎细胞增殖能力。通过 Western blot、CCK-8和免疫荧光分析发现,与对照组相比,孕激素能提高JAR细胞的增殖能力;c-Jun/c-Fos siRNA能降低JAR细胞的增殖能力;联合孕激素处理可一定程度的回调由c-Jun/c-Fos siRNA引起JAR细胞增殖能力降低的现象;同时,孕激素也能够回调由AP-1抑制剂(TIIA)引起J AR细胞低的增殖能力;研究发现,孕激素可提高胚胎细胞的增殖能力。
  7.利用体外黏附模型,观察胚胎细胞的体外黏附率。孕激素可提高JAR细胞的黏附率;瞬时转染c-Jun/c-Fos siRNA干扰质粒可降低JAR细胞的黏附率;同时,孕激素能够恢复c-Jun/c-Fos siRNA预处理的JAR细胞的低黏附率;孕激素也能够恢复预处理AP-1抑制剂TIIA的JAR细胞低黏附率;进一步的研究发现孕激素可恢复 poFUT1 siRNA导致的胚胎较低的黏附率。孕激素通过促进poFUT1的表达提高了胚胎的黏附能力。
  结论:
  1.正常早孕时期女性血清中孕激素和 poFUT1的含量较先兆流产患者高,且呈正相关性。人绒毛组织上有poFUT1的表达。
  2.孕激素促进poFUT1基因与蛋白的表达水平。
  3.孕激素激活转录因子AP-1(c-Jun/c-Fos),并上调poFUT1的表达。
  4.孕激素促进胚胎细胞增殖能力。
  5.孕激素通过激活转录因子 AP-1(c-Jun/c-Fos)的转录活性,进而调控靶基因poFUT1的转录,促进胚胎细胞与子宫内膜细胞的黏附。
[硕士论文] 朝鲁蒙
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2016(学位年度)
摘要:受精作用因单倍体精子和卵子融合创造出新的基因不同的二倍体有机体而对物种的延续和发展有着重要的意义。精卵融合是完成受精作用的关键,是由多分子参与的复杂过程,但目前为止还尚不明确其分子机制。研究精卵融合过程中的蛋白间相互作用,对了解并解决其中存在的问题有着不可估量的价值。IZUMO1-JUNO间相互作用是精卵融合过程中最为关键的蛋白相互作用,缺少其中任何一个都无法正常的受精。因此本实验选择JUNO蛋白作为研究对象,筛选除IZUMO1外与其相互作用的蛋白。
  1、大鼠睾丸酵母双杂交cDNA文库的构建
  本实验通过采用SMARTTM cDNA合成技术构建了大鼠睾丸的酵母双杂交文库。构建的文库库容为1.5×106 cfu,滴度为8×107 cfu/mL,重组率为78%,插入片段平均长度为0.7 kb,有较高的进行蛋白相互作用筛选的价值。
  2、pGBKT7-juno诱饵载体的构建
  以实验室克隆并保存的pMD19T-juno为模板,去掉信号肽扩增后连接到pGBKT7载体上,并对其进行鉴定、自激活检测和细胞毒性检测。通过利用载体上c-Myc抗原标签,western blot检测了pGBKT7-juno诱饵载体在酵母细胞中表达情况。使用生物信息学分析常见哺乳动物的JUNO氨基酸序列,绘制了系统发生树,分析了在进化过程中的亲缘关系。
  3、酵母双杂交筛选与JUNO相互作用蛋白
  使用构建好的大鼠睾丸酵母双杂交cDNA文库和pGBKT7-juno诱饵载体进行杂交。共筛选出5个特异性基因(mkrn1,rps21,irgc,wdr54和rnaseh2a),并分别予以分析。本实验初步筛选出了精子上与JUNO蛋白相互作用的蛋白,为进一步研究精卵融合过程提供了候选分子。
[硕士论文] 邵东梅
渔业资源 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:本文对口虾蛄Oratosquilla oratoria的繁殖生物学特征进行如下探究:⑴利用酶联免疫吸附技术(ELISA),研究了水温和体重对卵巢发育中雌二醇(E2)和孕酮(P)激素含量的影响。设置5℃、15℃、25℃、30℃4个实验组,选择实验时间60天,结果表明:温度对雌二醇、孕酮激素浓度的影响显著。在25℃时,卵巢处于成熟期或成熟前期,其E2含量值达到最高,为0.957 ng/g;在5℃即卵巢发育初期最低,含量为0.434 ng/g。卵巢中孕酮激素含量在5℃与25℃孕酮含量差异不显著。其最高值出现在30℃,此时卵巢处于排卵期,其含量为1.062 ng/g,此时雌二醇含量相对偏低,其值为0.626 ng/g;另外取性腺发育状态一致的口虾蛄,其体重分别为10.0±1.5 g、20.0±1.5 g、30±1.5 g,实验表明,卵巢内雌二醇含量随着体重的增加呈上升趋势。经多重比较,除20±1.5 g的口虾蛄,各组间差异显著。在体重10±1.5 g的虾蛄群体中,其雌二醇含量最低,为0.431 ng/g。在20±1.5 g的口虾蛄体内,其雌二醇含量为0.456 ng/g,。在体重为30±1.5 g的口虾蛄群体中,其雌二醇含量最高,为0.555 ng/g。⑵对雄性口虾蛄促雄腺的结构和功能进行了初步探究。在解剖镜下观察发现:口虾蛄促雄腺1对,乳白色,大小约为5-10mm3,位于第三步足的交接肢基部内侧,包埋于肌肉、肝胰腺之间,通过组织膜附着在输精管表面。利用组织切片和透射电镜技术,观察发现腺体的发育主要分为增殖期、合成期、分泌期。增殖期腺细胞嗜碱性强,腺泡间隙明显;合成期腺细胞嗜碱性减弱,腺细胞增大且排列规则,其细胞核也规则的排列在细胞外围,核仁1-3个;分泌前期腺细胞染色深,嗜碱性强,细胞质含量少,腺细胞细胞核固缩,位于腺细胞中央,分泌后期腺泡内腺细胞数量减少,腺泡内出现大量滤泡。腺体分泌方式为全浆式分泌。
[硕士论文] 王桂萍
细胞生物学 山东师范大学 2016(学位年度)
摘要:雌性哺乳动物生殖生物学研究内容包括:卵巢发育、卵子发生、受精、胚胎发育和着床以及妊娠维持等多个过程,这些过程受到多个基因和信号分子的严密调控。非洲爪蟾激活素信号转导者1(Xenopus forkhead activin signal transducer1,xFAST1)是发现的第一个Smad蛋白转录协助者。FAST2是FAS相关蛋白在小鼠中的同系物,属于叉头框(forkhead box,Fox)蛋白家族,由foxh1基因编码。FAST2主要在胚胎发育的早期阶段表达,在原肠胚形成、前脑和心脏等发育过程中发挥重要功能。foxh1缺失小鼠的胚胎中线结构、前端原条、节点、脊索中胚层、脊索和内胚层等无法正常形成。但是对于FAST2在小鼠卵巢及着床前胚胎发育中的功能还不甚了解。在本实验中,我们以新生雌性小鼠卵巢、外源促性腺激素诱导的未成熟雌性小鼠卵巢、美洛昔康(meloxicam,MEL,前列腺素合成酶2活性抑制剂)处理的外源促性腺激素诱导的未成熟雌性小鼠卵巢、GV期卵母细胞和着床前胚胎为研究对象,利用免疫组织化学技术和免疫印迹等实验方法,研究FAST2在小鼠卵巢卵泡和着床前胚胎发育过程中的表达。
  免疫组化结果显示,FAST2表达在出生后1天小鼠卵泡卵母细胞和出生后第8天卵母细胞和膜细胞中,并且在随后不同时间点卵泡卵母细胞和膜细胞中持续表达,但是在颗粒细胞中表达为阴性。在外源促性腺激素(PMSG和hCG)诱导卵泡成熟和排卵过程中,FAST2定位在PMSG24 h和PMSG48 h有腔卵泡和成熟卵泡卵母细胞、膜细胞以及hCG24 h排卵后形成的新生黄体中。伴随着黄体退化(hCG48 h和hCG72 h),FAST2表达量降低。免疫印迹分析显示,FAST2在PMSG24 h到hCG24 h阶段(卵泡成熟排卵并黄体形成阶段)维持高水平表达,在hCG48 h和hCG72 h黄体退化阶段表达量显著减少,这与免疫组化结果相符。用美洛昔康处理外源促性腺激素诱导的未成熟雌性小鼠卵巢, HE染色结果显示,在hCG注射后的18 h、24 h和36 h,对照组中形成许多黄体,而MEL处理组排卵受到抑制,在完整卵泡中出现黄体化颗粒细胞和滞留的卵母细胞。免疫组化结果显示,FAST2定位在对照组黄体和MEL处理组卵泡膜细胞、黄体化颗粒细胞和滞留的卵母细胞中。免疫印迹结果显示,FAST2在两组中的表达量没有显著性差异。共聚焦结果显示,FAST2在除核仁以外的整个GV期卵母细胞中表达,在胚胎早期1-8细胞阶段的表达模式和GV期卵母细胞相似。在随后发育阶段中,FAST2表达在桑椹胚和囊胚内细胞团的细胞质中。
  综上所述,FAST2可能在卵泡发育成熟、排卵、黄体化及着床前胚胎发育过程中发挥重要作用。
[硕士论文] 丁晓萌
生物学;发育生物学 南京师范大学 2016(学位年度)
摘要:下丘脑弓状核中合成的神经肽Y(Neuropeptide Y)是一种强摄食物质,它参与调节食物的摄取、心率、血管收缩、呼吸运动、平滑肌舒缩以及下丘脑神经内分泌等重要生命活动功能。有研究表明,NPY除了参与调节以上重要活动的能量代谢,也参与了生殖活动的调控。NPY蛋白不仅表达于下丘脑与生殖调控相关区域,在垂体水平也有报道参与LH峰的形成。另有研究发现在性腺、生殖管道均有NPY神经纤维的分布,在卵泡液中也能检测到NPY mRNA的表达,说明NPY广泛地分布在HPG轴中,并参与生殖功能的调控。
  研究目的:本研究试图探究NPY在动情周期中的表达与分布的规律,并研究探讨NPY对于动情周期的维持、各级卵泡的发育与排卵的影响。
  研究方法:本研究以C57BL/6雌性小鼠为研究对象,每日定时通过阴道涂片确定动情周期,并称量子宫湿重来验证动情周期划分的准确性。取相同动情时期的卵巢组织,Real-time PCR技术检测NPY在不同动情时期中的转录水平,并提取组织蛋白用Western Bolt的方法检测蛋白水平的表达。对卵巢进行固定包埋后,通过免疫组织化学技术检测NPY在卵巢动情期的分布。腹腔注射NPY2R受体拮抗剂BIIE0246,并连续15天监测动情周期的变化是否随着NPY受体的拮抗而改变。统计卵泡计数结果,观察拮抗NPY2R受体组与对照组相比是否影响各级卵泡的发育,同时检测卵巢组织中卵泡发育相关基因的变化。超排抑制试验中,每只雌鼠注射10IU PMSG的同时注射BIIE0246(0.2ug/g),44小时后注射10IU hCG,8小时后处死小鼠眼球取血用于激素检测并计数排卵个数,药物处理组在第一次打药后每隔12小时注射BIIE0246,对照组则用等量生理盐水替代BIIE0246溶液。
  结果与结论:NPY的转录水平在动情期的表达量较其他时期有显著性差异,Western Blot的结果与Real-time PCR结果基本一致。免疫组织化学检测结果表明:动情期中,NPY除了在卵巢组织间质中表达之外,还分布在卵泡膜细胞与黄体中,这些结果提示NPY在卵巢组织中的表达受动情周期的影响。NPY在动情期中的高表达,同时分布在膜细胞中,所以我们推测NPY有可能参与了卵泡的发育和排卵。BIIE0246处理后发现,小鼠的动情周期与对照组并无差异,而卵泡计数结果显示:窦状卵泡(早期)与Graffin卵泡较对照组显著减少,闭锁卵泡显著增加,而原始卵泡、初级卵泡的数量无显著性差异。检测卵泡发育相关基因发现:c-kit、AMH、GDF-9、CD-2均显著减少、凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Fas显著减少。超排抑制实验结果显示:BⅡE0246处理组排卵数较对照组正常超排的小鼠显著减少,检测排卵相关基因发现:Cox-2、HA-2、TSG-6、ADAMTS-1、EP-2、Egr1基因显著减少。
  所以得出结论:1.NPY随着动情周期的变化而发生变化,在动情期时表达水平最高;但是NPY不能影响动情周期。2.拮抗NPY Y2受体可以使晚期卵泡发育的成熟受阻。3.拮抗NPY受体可以导致获卵数下降。基于以上结果说明NPY与初级卵泡到次级卵泡的发育和窦状卵泡的形成相关、促进卵泡的闭锁并参与排卵的过程,NPY的受体拮抗并不改变雌性小鼠的动情周期,也不参与卵泡早期发育过程。
[硕士论文] 李媛媛
细胞生物学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2016(学位年度)
摘要:目的:
  哺乳动物的精子发生是一个高度复杂的细胞分裂与分化过程,许多生精细胞特异性基因的表达和调控具有发育阶段特异性的特征,任一阶段的异常都有可能导致雄性不育,因此,研究精子发生过程中起重要作用的睾丸特异性基因,并对这些基因的表达特征及其在精子发生过程中所起的生物学功能进行深入研究,对理解精子发生的内在机理、防治精子发生异常引起的男性不育、研制男性避孕药及保健药等具有重要意义。Speedy/Ringo基因是一类新发现的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)激活因子,在精子发生过程中起重要作用。利用四环素(tetracycline,Tet)基因调控表达系统可以在时间和空间上实现对基因的可控性表达,为基因功能的研究提供有效的解决途径。本文旨在建立基于Tet-On系统诱导表达的Speedy A基因RNA干扰转基因小鼠模型,研究Speedy A基因表达下调对精子发生的影响,并且探讨Tet-On系统在研究精子发生相关基因中的应用。
  方法:
  利用生物信息学软件,按照RNA干扰序列设计原则设计RNA干扰靶点序列,构建质粒后转染大肠杆菌,筛选阳性菌并验证插入序列,慢病毒包装干扰片段后感染精母细胞,Real-time PCR检测下调Speedy A基因表达的有效干扰片段;Gateway技术构建包含有效干扰片段和四环素反应元件(TRE)的质粒,建立转基因小鼠并筛选到纯合子,然后与四环素调控的反式激活子(rtTA)转基因小鼠杂交,筛选TRE和rtTA双阳性的小鼠,喂食强力霉素(Dox)诱导小鼠体内RNA干扰片段的表达,下调SpeedyA基因的表达水平,建立可控性SpeedyA基因RNA干扰转基因小鼠模型,以Real-time PCR及Western Blot分别检测模型组小鼠与对照组小鼠在mRNA水平以及蛋白水平Speedy A基因的表达差异;HE染色初步观察睾丸组织形态学变化,TUNEL法检测小鼠睾丸组织的细胞凋亡情况。
  结果:
  实验设计了4个RNA干扰靶点序列,通过体外实验筛选下调Speedy A基因表达的有效干扰片段,Real-time PCR检测到精母细胞中最佳干扰片段对Speedy A基因表达的敲减程度达75%(P<0.01),为有效靶点;成功构建了PDOWN-shSpdya入门克隆及pRP.EX2d-TRE>shSpdya表达克隆;成功建立了四环素诱导的SpeedyA-RNA干扰转基因小鼠模型,诱导RNA干扰片段表达后,实时荧光定量PCR及Western Blot结果显示模型组小鼠与对照组小鼠相比SpeedyA基因的表达量明显下降;HE染色及TUNEL法检测到模型组小鼠睾丸组织的精母细胞发生大量凋亡。
  结论:
  本实验成功建立了基于Tet-On系统诱导表达的可控性Speedy A基因RNA干扰转基因小鼠模型,说明可以基于Tet-On系统活体研究精子发生相关基因的功能;初步分析发现Speedy A基因表达下调使生精细胞发生异常凋亡。模型的成功建立为进一步系统分析SpeedyA基因在雄性生殖系统中的功能及其作用机制打下了基础。
[硕士论文] 苑凤
细胞生物学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2016(学位年度)
摘要:雌激素和孕激素作为重要的甾体类性激素,对于大鼠的妊娠起始、妊娠中胎盘功能维持、胎儿生长发育以及分娩发动都有着重要作用。合理的雌孕激素水平是保证妊娠持续的关键因素,也是最基本的条件。文中从以下几方面进行论述:
  第一部分 妊娠大鼠着床后短暂抑制雌激素的合成对胎儿胎盘及分娩的影响
  目的:研究大鼠胚胎着床后短暂抑制雌激素合成对分娩结局的影响。
  方法:大鼠胚胎着床后GD6.5至GD8.5给予雌激素抑制剂来曲唑灌胃(实验组)或溶媒灌胃(对照组),观察其对胎儿及胎盘的发育和分娩结局的影响。
  结果:对照组在GD22.5均能正常分娩,实验组孕鼠在GD22.5均不能正常分娩,在GD23.5体力衰竭死亡,而于GD22.5时剖腹取出的仔鼠体重和发育正常,且可代乳存活;实验组和对照组的窝仔数和胎(仔)鼠重量无统计学差异(P>0.05);实验组和对照组相比胎盘重量增大(P<0.05),且组织形态学异常;GD21.5和GD22.5时,对照组外周血孕酮水平快速下降至6.7±4.4 nmol/L和5.6±3.5 nmol/L,实验组孕酮水平分别为19.7±7.0 nmol/L和18.0±4.2 nmol/L,显著高于对照组(P<0.05)。
  结论:大鼠胚胎着床后给予来曲唑短暂抑制雌激素合成可导致孕鼠难产,胎盘组织形态学异常,同时妊娠末期孕酮水平不能迅速下降。
  第二部分 妊娠大鼠着床后短暂抑制雌激素的合成造成孕鼠难产的可能原因
  目的:研究上述孕鼠难产的可能原因。
  方法:啮齿类分娩前孕酮水平必需下降,所以我们测定临近分娩前血清孕酮水平,结果提示实验组孕酮水平未下降可能是难产的原因。为了确认这一点我们运用抗孕激素米非司酮从受体水平阻断孕酮的作用,观察对分娩的影响。
  结果:大鼠胚胎着床后GD6.5至GD8.5给予雌激素抑制剂来曲唑灌胃(实验组)或溶媒灌胃(对照组),两组孕鼠均分别在GD19.5、GD20.5以及GD20.5、GD21.5连续2d给予米非司酮,两组孕鼠均分别于GD20.5和GD21.5启动分娩并正常生产,证明孕酮受体的不能失活是来曲唑实验组难产的原因。同时用荧光实时定量PCR观察孕酮的下游靶标CX43在妊娠末期子宫表达变化。实验组与对照组比GD22.5子宫肌Cx-43的表达下调(p<0.01),实验组使用米非司酮组与未使用米非司酮GD20.5子宫肌Cx-43的表达上调(p<0.01)。
  结论:大鼠胚胎着床后给予来曲唑短暂抑制雌激素合成可导致孕鼠妊娠末期孕酮水平不能迅速下降进而引起难产,妊娠末期给予米非司酮可以挽救难产结局。
[硕士论文] 刘娜
遗传学 重庆医科大学 2016(学位年度)
摘要:目的:胚胎着床的成功是囊胚和子宫内膜之间相互作用的结果。PDCD4作为最新被发现的抑癌基因之一,参与了多项细胞生理过程,包括细胞的凋亡、分化、DNA损伤、粘附等。课题组前期定量蛋白质组技术检测的结果显示其在第五天小鼠子宫内膜着床点和着床旁的表达有差异,但是其在胚胎植入过程中的作用却未见报道。因此我们对 PDCD4在小鼠子宫内膜中的表达模式及其作用进行了研究,以期初步阐明其对胚胎植入的影响。
  方法:⑴采用荧光定量PCR、免疫蛋白印迹、免疫组化以及原位杂交研究PDCD4的mRNA以及蛋白在正常妊娠小鼠和假孕小鼠早孕期子宫内膜中的表达规律。⑵通过体内体外人工诱导蜕膜化,研究PDCD4对小鼠基质细胞蜕膜化的影响。⑶利用免疫蛋白印迹和免疫组化技术对女性不同月经周期子宫内膜以及自然流产子宫内膜中的PDCD4的蛋白表达进行了检测。
  结果:①在正常妊娠小鼠早孕期子宫内膜中,PDCD4在D4和D5表达显著高于D1,并且在D6和D7逐渐降低。此外,PDCD4在D6和D7着床旁的表达明显高于着床点。②在假孕早期小鼠子宫内膜中,PDCD4的表达没有显著差异,但是与正常妊娠小鼠早孕期对比后发现,PDCD4的表达受到胚泡信号诱导。③下调PDCD4对小鼠基质细胞的增殖、分化没有影响,但有利于蜕膜化。④在女性子宫内膜分泌期、增生期及蜕膜中PDCD4表达均不相同,分泌期>蜕膜>增生期。对比自然流产女性子宫内膜和正常蜕膜发现,PDCD4在自然流产子宫内膜中的蛋白表达明显高于正常女性蜕膜组织。
  结论:PDCD4在妊娠小鼠早孕期受到胚泡信号的诱导,在植入前后表达量发生改变,通过调控蜕膜化细胞适时凋亡从而有利于蜕膜化。而PDCD4在人类自然流产的子宫内膜中异常高表达,更进一步的提示了 PDCD4可能对妊娠有着重要作用。
[硕士论文] 郑兰萍
化学生物学 厦门大学 2016(学位年度)
摘要:卵泡作为卵巢结构与功能的基本单位,不仅是雌性生殖细胞发生的场所,同时也是雌性激素合成与分泌的场所。卵巢内的卵泡发育大致经历卵泡库建立、原始卵泡募集、腔前卵泡发育、有腔卵泡发育、卵泡闭锁几个阶段,这些阶段的有序进行受到一系列细微而精确的调控,这些调控涉及激素、生长因子和细胞因子相互作用的复杂信号网络,其中MAPK、PI3K-AKT、TGFβ等信号通路在卵泡发育过程中发挥着极为重要的调控作用。
  Shp2作为一种表达广泛的蛋白酪氨酸磷酸酶,对维持胞质信号的平衡至关重要,它参与调控多种生长因子信号介导的细胞生长、分化等生理过程。雄性睾丸支持细胞Shp2敲除能够导致雄性不育,但Shp2在雌性卵巢颗粒细胞中的作用还不清楚,因此研究颗粒细胞中的Shp2在卵泡发育过程中的作用具有重要的现实意义和理论意义。
  本研究旨在揭示Shp2在卵泡发育过程中的作用,为此我们借助Cre-loxp系统,利用Cyp19-cre和FSHR-cre两种工具酶分别特异性地在成熟卵泡(排卵前卵泡)和生长卵泡颗粒细胞中敲除Shp2。两种不同发育阶段的卵泡颗粒细胞Shp2敲除模型的生殖统计实验及卵巢形态观察表明,颗粒细胞中Shp2的下调对小鼠生殖能力、排卵能力及卵泡发育进程并无显著影响,但生长卵泡颗粒细胞中Shp2的下调能够选择性地降低了FSH诱导的卵泡发育关键基因的表达而对LH诱导的排卵相关基因的表达无显著影响。另外,生长卵泡颗粒细胞Shp2的下调能够促进卵巢内卵泡闭锁和黄体化,进一步的信号通路机制探讨发现生长卵泡颗粒细胞Shp2敲除导致ERK1/2及AKT磷酸化水平的下调,这表明Shp2可能通过MAPK以PI3K-AKT信号通路来参与卵泡发育的调控,但Shp2敲除引起的AKT的磷酸化下调仅体现在生长卵泡敲除模型中,由此说明Shp2在卵泡发育过程中的调控作用具有一定的阶段特异性。
[硕士论文] 刘鑫
遗传学 重庆医科大学 2016(学位年度)
摘要:目的:探讨ApoAⅣ在早孕期小鼠和妊娠期女性不同时期的表达规律,初步分析其在早孕期小鼠胚胎着床和蜕膜化过程中的作用。
  方法:应用ELISA方法分析早孕期真孕和假孕小鼠孕d1~孕d7天血清中ApoAⅣ和HDL的表达规律,以及未孕女性、孕早期12周、13周和孕中期15~18周女性血清中ApoAⅣ和HDL的表达情况;利用免疫组化法,分析ApoAⅣ在孕d1、孕d5、孕d6、孕d7子宫内膜中的表达情况。
  结果:ApoAⅣ和HDL在早孕期小鼠真孕组中孕d1~孕d7随着妊娠天数的增加,其表达量逐渐升高,孕d2~孕d7分别与孕d1相比具有统计学差异(p<0.01),而在假孕组中并无明显的变化;ApoAⅣ和HDL在早、中孕期女性血清中的表达量高于未孕组,差异具有明显的统计学意义(p<0.0001),且随着妊娠周数的增加其升高趋势也逐渐加强;通过免疫组化发现,ApoAⅣ在孕d1的腺上皮有轻微的表达,而在孕d5、孕d6具有广泛表达且在孕d7初级蜕膜区表达明显降低。
  结论:早孕期小鼠血清中的ApoAⅣ的表达量可能与胚胎发育相关,其可能通过调节子宫内膜中毛细血管的生成来影响胚胎着床和蜕膜化的进程。
[博士论文] ISHWARI KADARIYA
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2015(学位年度)
摘要:抑制素α(INHα)是TGFβ超家族的成员之一、生殖功能的重要调节剂,在卵泡发育、细胞分化以及卵母细胞发育过程中发挥重要的作用,从而影响动物的繁殖性能。为研究INHα在动物繁殖中作用与机理,在本实验室前期研究中,利用shRNAi技术分别构建了水牛INHα基因RNAi-B和小鼠INHα基因RNAi-M,并分别获得了INHα基因沉默的RNAi-INHα转基因小鼠(RNAi-B转基因小鼠和RNAi-M转基因小鼠);本试验以该转基因小鼠为对象开展研究,主要结果如下:
  (1)转基因小鼠的INHα基因表达的分析:转基因小鼠的INHα基因的mRNA转录表达水平和蛋白翻译水平都受到了干扰抑制,其中RNAi-M转基因小鼠的INHα基因mRNA表达水平的抑制率为64%、RNAi-B抑制率为44%;
  由于RNAi-M转基因小鼠的INHα基因抑制水平较高,而且RNAi-M是根据小鼠INHα基因序列设计的,故选择RNAi-M转基因小鼠作为对象开展以下研究的:
  (2)转基因小鼠的产仔性能的探讨:RNAi-M转基因小鼠的F1代产仔数呈下降的趋势(P<0.05),RNAi-M转基因小鼠平均产仔为6.2±0.79只,野生型对照组平均产仔为9.8±0.16只;
  (3)转基因小鼠的发情的分析:RNAi-M转基因小鼠发情期(29.44±0.38天)显著地比野生型(27.11±0.49天)长(P<0.05);
  (4)转基因小鼠的生殖激素的分析:对RNAi-M转基因雌鼠血液中INHα和FSH的浓度进行了测定和分析,血清中INHα水平在3和6周龄呈现显著下降(P<0.05); FSH在3周显著增加(P<0.05),而6周FSH浓度变化不显著。
  (5)转基因小鼠的排卵数的探讨:进一步对RNAi-M转基因小鼠排卵数进,结果表明RNAi-M转基因小鼠的排卵数也有所减少;
  (6)转基因小鼠的颗粒细胞生长发育的分析:RNAi-M转基因小鼠显著地降低了卵巢颗粒细胞GCs的细胞周期G1期和S期细胞的数量(P<0.05);
  (7)转基因小鼠的颗粒细胞凋亡的研究:与野生型对照组相比,RNAi-M转基因小鼠显著地提高了卵巢颗粒细胞GCs的凋亡水平(P<0.05,由3.40%提高到9.70%);
  (8)转基因小鼠的颗粒细胞相关基因表达的研究:RNAi-M转基因小鼠抑制了卵巢颗粒细胞GCs的INHα的转录和翻译水平,从而显著促进了细胞凋亡相关Caspase-3、BCL2、INHβ B和GDF9基因的表达、降低了kitl和TGFβ RⅢ基因的表达;
  综合上述试验结果:(1) INHα基因表达受到了强烈抑制(如本试验的64%),从而改变了卵巢颗粒细胞中重要基因的正常表达,导致了卵巢颗粒细胞生长发育、卵巢排卵、生殖激素分泌的紊乱,抑制了小鼠的发情和产仔数性能;(2) INHα基因虽然具有抑制FSH等重要激素分成分泌、负调控动物繁殖性能,但在动物体内还是要维持一定的表达水平和发挥其重要作用,不能过度地抑制INHα基因的表达和功能;(3)还需要进一步探讨动物体内适宜的INHα基因的表达水平,从而通过调控INHα基因的表达来提高动物繁殖性能。
[硕士论文] 程文君
细胞生物学 山东师范大学 2015(学位年度)
摘要:粘着斑相关蛋白(FAAP,focal adhesion associated protein)是由小鼠D10Wsu52e基因编码的分子量为55kD的蛋白,进化上非常保守,在细菌、古生菌和后生动物中广泛分布。在小鼠不同组织中的表达分析发现,FAAP在生殖器官中高表达,推测其是一个与生殖系统紧密相关的基因。为探索FAAP在雄性生殖系统中的功能,本实验运用反转录PCR及Western Blot研究了FAAP在雄性生殖系统中的表达模式。结果显示,FAAP mRNA在睾丸、附睾、输精管、前列腺中都检测有表达,在精囊中未检测到其表达,而睾丸和附睾中FAAP的表达量高。Western Blot检测C57BL/6J雄性小鼠出生后第1、7、14、21、28、35、42天附睾及睾丸中FAAP蛋白表达量发现,FAAP蛋白的表达量随出生后天数而逐渐增加。这表明FAAP可能在小鼠附睾形态发育、功能维持和精子成熟中起作用。实验可以作为 FAAP基因敲除小鼠的野生型对照组来观察敲除组和野生型不同发育时期附睾和睾丸中FAAP的表达变化,进而为观察不同发育时期小鼠的附睾形态、精子形态和受精能力做铺垫。
  利用基因打靶技术构建FAAP基因敲除小鼠模型:KO(knockout)-First基因敲除小鼠模型。KO-First是一种多用途的模型,与条件敲除策略类似,在靶片段的两侧分别放置方向相同的loxP位点,同时还在靶片段5’端内含子中放置一个两侧带有FRT位点的SA-IRES-reporter片段。这样的模型可以用靶基因的启动子表达报告基因(reporter),通过检测报告基因的表达即可了解靶基因的表达情况;与表达Flp的工具鼠交配可去除 SA-IRES-reporter片段,得到常规的flox小鼠。KO First模型的flox小鼠与conditional KO模型的flox小鼠不同,conditional KO中的flox小鼠表型正常,但KO First却是KO表型。所以通过检测 KO-First小鼠表型分析可以初步检测FAAP KO表型。本实验所用的KO-First小鼠是插入了FRT-lacZneo-FRT-loxP元件及 loxP位点的基因敲除小鼠,带有LacZ报告基因,可用LacZ染色定位检测报告基因了解FAAP的表达情况,结果显示,在KO-First小鼠的大脑和睾丸附睾中FAAP的表达量高。通过KO-First小鼠与C57BL/6J小鼠检测繁殖力发现,与C57BL/6J雄鼠相比,KO-First小鼠受孕率明显降低。KO-First小鼠后代从出生后14天左右开始出现死亡,在出生后第28天至42天存活率低,很少有活过2个月的。表明 FAAP在小鼠生长发育过程中起了重要作用。FAAP KO First小鼠可与 Flper小鼠交配后去除FRT-lacZneo-FRT元件,得到常规的FAAP flox小鼠。FAAP flox小鼠与Defb41iCre/wtCre小鼠交配即可获得在附睾特异性敲除FAAP的条件敲除小鼠。
  本实验利用KO-First基因敲除小鼠模型,可以进行FAAP基因敲除小鼠初步的表型分析,为定向敲除附睾起始段中FAAP的表达做铺垫;可以检测FAAP对精子成熟的影响,检测 FAAP在小鼠雄性生殖系统中的作用,为研究开发新的避孕药物及治疗男性不育奠定理论基础。
[硕士论文] 赵琨
生物学 上海交通大学 2014(学位年度)
摘要:果蝇作为一种模式生物被广泛应用于生物学研究中,其中果蝇卵巢是研究发育的良好模型。果蝇的卵子发生涉及到干细胞的维持,细胞分化,细胞迁移,体轴的建立等重要的生物学过程。利用卵巢组织探究卵子发生过程及其调控机制一直是生物学热点研究领域之一。果蝇的卵子发生过程可以分为三个阶段即前期、中期和后期。卵子发生中的滤泡细胞谱系发育起始于干细胞的分化,位于卵原区的成体干细胞分化为两类前体细胞即前体茎/极细胞和前体滤泡细胞,其中前体茎细胞/极细胞进一步分化为成熟的茎细胞和极细胞,茎细胞在相邻卵室的连接与分隔中起着重要的作用。而前体滤泡细胞则分化为包裹生殖细胞的上皮滤泡细胞。当卵子发生到中期的时候,上皮滤泡细胞经历一个DNA内复制阶段,此时细胞不发生分裂,而细胞核加倍。在卵子发生9期的时候,有一群4-8个滤泡细胞由于受到Unpaired配体的作用,从卵室前端分化脱离出来形成一个花环型的边界细胞簇,向卵母细胞前端迁移,于第10期时到达滋养细胞与卵母细胞的分界处,并最终形成精子进入的通道。卵子发生到10b期后滤泡细胞则进入绒毛膜基因扩增阶段,进而完成卵壳结构的发育。在卵子发生过程中滤泡细胞的分化与发育主要受到JAK-STAT,Notch和EGFR信号通路的调控。microRNA(miRNA)是长度约为22个核苷酸的非编码RNA,通过转录后调控抑制其靶基因的表达。miRNA已被证明广泛参与发育、生理及病理过程。有关miRNA参与调控果蝇卵巢滤泡细胞谱系发育的研究正处于起步阶段。
  本论文利用可获得的果蝇miRNA遗传资源,应用UAS/GAL4二元表达系统时空特异性地过表达或敲减(knock down)miRNA基因,对总计30个miRNAs在滤泡细胞谱系发育中的功能进行了系统筛查,获得了有价值的实验结果。按卵子发生时相,本研究所获实验结果可归纳如下:(1)利用e22c-Gal4在卵子发生前期过表达mir-1或mir-124均能导致卵室融合的表型,进一步实验发现,融合卵室间无茎细胞分子标记 Bib的表达,提示茎细胞分化的缺陷;(2)利用GR1-Gal4或C306-Gal4驱动miRNA在卵子发生中期过表达发现,mir-7,mir-263b或mir-276b的过表达均能诱发边界细胞迁移延迟的发生,其中,边界细胞迁移延迟表型同样出现在mir-7表达下调(Slbo-Gal4驱动UAS-mir-7 sponge表达)的遗传背景中;(3)利用在卵子发生后期滤泡细胞中表达的55B-Gal4或CY2-Gal4驱动子筛查发现,过表达 mir-7或mir-263b可导致卵壳图式建成的缺陷。本研究通过遗传表型筛查获得了多个miRNA分子参与调控滤泡细胞发育的实验证据,说明本研究策略可应用于更大范围的功能性miRNA的筛查,同时,本研究结果还为进一步探讨miRNA调控机理奠定了基础。
[硕士论文] 张坤
发育生物学 暨南大学 2014(学位年度)
摘要:第一部分:
  目的:
  通过检测RANK信号通路分子在衰老卵巢的表达情况,为进一步揭示RANK信号通路与卵巢衰老的相关性奠定基础。
  方法:
  1、HE染色检测:收集8周和12个月的ICR小鼠卵巢,进行冰冻切片、HE染色检测小鼠卵巢中原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡的数目。
  2、RT-PCR检测:收集8周和12个月的ICR小鼠卵巢,分别提取卵巢总RNA,RT-PCR检测RANK信号通路相关分子RANK、RANKL和AIRE在卵巢中的表达情况。
  结果:
  1、卵泡统计结果显示:8周的小鼠卵巢内原始卵泡数目为66±17个,初级卵泡数目为50±7个,次级卵泡数目为36±13个,成熟卵泡数目为6±2个;12个月的小鼠卵巢内原始卵泡数目为13±3个,初级卵泡数目为2±1个,次级卵泡数目为2±1个,成熟卵泡数目为0±0个。
  2、RT-PCR结果显示:8周的小鼠卵巢表达RANK信号通路相关分子RANK、RANKL和AIRE;而12个月的小鼠卵巢不表达RANK信号通路相关分子RANK、RANKL和AIRE。
  结论:
  衰老卵巢中各级卵泡数目明显减少;衰老卵巢不表达 RANK信号通路相关分子RANK、RANKL和AIRE。
  第二部分:
  目的:
  利用慢病毒将基因特异性shRNA慢病毒质粒导入小鼠2-细胞期胚胎,为建立基因knockdown小鼠模型奠定基础。
  方法:
  1、体外培养:收集小鼠2-细胞期胚胎,分为两组:一组直接培养,一组去除胚胎透明带后培养。观察小鼠2-细胞期胚胎和去透明带的小鼠2-细胞期胚胎体外发育情况。
  2、慢病毒感染:收集小鼠2-细胞期胚胎,去除胚胎透明带。通过慢病毒感染的方式将基因特异性shRNA慢病毒质粒导入小鼠2-细胞期胚胎。
  结果:
  1、小鼠2-细胞期胚胎经体外培养发育至囊胚阶段。
  2、去透明带的小鼠2-细胞期胚胎经体外培养发育至囊胚阶段。
  3、加入慢病毒后的小鼠2-细胞期胚胎经体外培养发育至囊胚阶段,基因特异性shRNA慢病毒质粒未成功导入胚胎。
  结论:
  去透明带处理和慢病毒感染均不影响小鼠2-细胞期胚胎体外培养至囊胚阶段。
[硕士论文] 范晓杰
生物化学与分子生物学 山东农业大学 2014(学位年度)
摘要:生殖活动是由神经、内分泌和免疫系统共同参与的过程,妊娠过程是一个复杂的生理过程,而一个成功的妊娠过程中胚胎着床是非常重要的,在着床窗口期胚囊经过附着、粘附、渗透和滋养层浸润来完成着床过程。这个过程是神经递质、内分泌激素、细胞因子和免疫细胞协同作用的结果。Wnt信号通路作为细胞信号传导系统之一与胚胎着床联系密切。但是有关植物性神经对胚胎着床过程中Wnt细胞信号传导调节影响的资料很少。因此,本试验目的就是观察支配子宫的植物性神经损毁或功能抑制处理是否影响着床期子宫内Wnt信号通路的关键分子β-连接蛋白(β-catenin)和Wnt-1的动态表达。
  本试验通过手术和化学损毁方法去除或抑制支配大鼠子宫的植物性神经作用,观察大鼠着床情况;应用免疫组化法定位观察了不同处理组的大鼠在妊娠4d、5d、6d子宫中β-catenin和Wnt-1免疫阳性细胞的分布规律;应用实时荧光定量RT-PCR技术,分析β-catenin mRNA和Wnt-1 mRNA的表达量的差异性。结果表明:(1)阻断支配子宫的植物性神经作用后,在妊娠5d并未看到着床点或其数量比较少,子宫腺上皮细胞发生不同程度的空泡和和核固缩现象影响了子宫腺的正常分泌,进而推迟了胚泡着床。(2)在妊娠4d-6d的大鼠子宫中,β-catenin免疫阳性细胞分布在腔上皮下边基质细胞的胞质中;Wnt-1免疫阳性细胞分布在基质细胞胞质、子宫腺上皮细胞胞质和胞膜以及子宫腔上皮细胞中偶有分布。在妊娠4d-6d子宫基质中的β-catenin和Wnt-1表达数量有所变化,且神经阻断后对其数量影响明显。正常妊娠4d中β-catenin和Wnt-1免疫阳性表达出现高峰,而在妊娠5d明显减少,妊娠6d又开始增加;交感神经和副交感神经全部阻断后,β-catenin和Wnt-1阳性基质细胞随着妊娠时间的变化呈现上升趋势,且较之正常组各阶段明显升高;阻断交感神经后,β-catenin和Wnt-1阳性基质细胞随妊娠时间的变化呈现上升趋势,但明显低于正常组各阶段的阳性表达;阻断副交感神经后,β-catenin和Wnt-1阳性基质细胞与正常组的变化趋势一致,但是在妊娠5d表达较正常5d明显增加。这些结果提示神经损毁后β-catenin和Wnt-1的表达量远远高于正常或表达量不足,通过这些变化而影响正常着床窗口期子宫内膜的正常发育,神经损毁后影响正常的表达分布,不能提供适宜的胚泡发育及着床的内环境,从而使胚泡着床延迟或着床数减少。我们通过qRT-PCR法mRNA的水平也发现了同样的变化规律,进一步验证了结果可靠。
  总之,支配子宫的植物性神经损毁影响胚胎着床使胚胎着床延迟或着床数减少,妊娠早期子宫中的β-catenin及Wnt-1的表达异常可能是神经影响胚胎着床的重要机制之一。
[硕士论文] 王雪
动物遗传育种与繁殖 东北林业大学 2014(学位年度)
摘要:为了检测味觉受体mT1Rs(taste receptor family1 members,mouse,mT1Rs)及其下游信号通路(α-gustducin、Gγ13)在小鼠雌性生殖系统的表达,探讨味觉在雌性生殖机能中可能发挥的作用及其在生殖医学方面的潜在应用。本实验采用半定量RT-PCR、超敏ABC免疫组化和Western Blot方法检测味觉受体mT1Rs(mT1R1、mT1R2、mT1R3)及其下游信号通路元件(α-gustducin、Gγ13)在6周龄间情期小鼠卵巢、子宫、输卵管组织中的基因表达和蛋白分布。结果发现,在小鼠雌性生殖系统中均发现味觉受体mT1Rs及其下游信号通路元件(α-gustducin、Gγ13)的转录子,免疫组化和Western Blot研究进一步证实了味觉受体mT1Rs及其下游信号通路(α-gustducin、Gγ13)基因确实在小鼠卵巢卵母细胞、黄体颗粒细胞、子宫壁和输卵管黏膜上皮细胞处存在阳性分布。由此可见,味觉受体(mT1Rs)及其相关偶联G蛋白(α-gustducin、Gγ13)在雌性生殖系统中存在表达,预示着生殖系统也可对味觉进行感知,为进一步研究味觉受体在雌性生理机能中可能发挥的调控功能奠定初步的研究基础,同时也为有关味觉的细胞生物学研究提供新的发展方向。
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