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[硕士论文] 张宇良
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:真核生物的细胞周期通过连续激活和失活特定的周期蛋白/周期蛋白依赖性激酶复合物活性进行调控。在哺乳动物细胞周期中,周期蛋白A和周期蛋白B通过泛素化降解途径使靶蛋白去磷酸化,促进有丝分裂中期向后期转化;周期蛋白D通过磷酸化Rb蛋白终止G1期,促进细胞G1/S期转化。
  不同的生物体包含的周期蛋白类型不同,单细胞真核生物纤毛虫表现出周期蛋白多样性,表明单细胞生物体内存在精细的调控机制。嗜热四膜虫含有1个小核和1个大核,小核为二倍体,在营养生长期转录沉默,大核为多倍体,转录活跃,营养充足时细胞进行无性生殖,饥饿条件下进行有性生殖。有性生殖过程中,小核进行减数分裂,产生4个原核,其中3个降解,另外1个原核进行有丝分裂产生配子核,配子核交换,融合产生合子核。合子核通过有丝分裂产生新的大核和新小核,完成有性生殖。嗜热四膜虫含有34种周期蛋白,其中Cyc2, Cyc17和Cyc28在四膜虫小核减数分裂期特异表达,Cyc2调控了小核减数分裂的起始,而Cyc17对减数分裂后期的起始和同源染色体的分离是必需的,但是Cyc28的功能目前并不清楚。
  本研究首次从嗜热四膜虫鉴定了有性生殖特异表达的周期蛋白基因CYC28,对其功能进行了分析,主要结果如下:
  1. CYC28生物信息学分析基于四膜虫大核基因组数据库(http//:www.ciliate.org)和功能基因组数据库(http://tfgd.ihb.ac.cn)分析表明嗜热四膜虫 CYC28(TTHERM_00082190)基因全长1174 bp,开放阅读框801 bp,预测编码266个氨基酸。RT-PCR产物测序分析表明CYC28序列正确。序列比对分析N端有一个由121个氨基酸组成的保守性周期蛋白框,周期蛋白框后有一个由9个氨基酸残基组成的破坏框。周期蛋白框同源序列分析表明Cyc28可能属于周期蛋白B3亚家族。Microarray表达谱和实时荧光定量检测结果表明CYC28在营养生殖期和饥饿期不表达,在有性生殖期特异表达,4 h时表达量最高。
  2. HA-Cyc28的细胞定位及表达分析为研究Cyc28的功能,构建带有HA标签的表达载体 pXS75-CYC28,该表达载体由MTT1启动子调控,在Cd2+诱导下高效表达,经基因枪转化,巴龙霉素浓度梯度筛选,选择稳定的细胞株。免疫荧光定位表明,Cyc28在有性生殖早期定位于细胞质,在8 h定位在凋亡的旧大核上,表明Cyc28可能通过泛素化途径,在凋亡的亲本大核中降解或者直接参与了亲本大核的凋亡。蛋白免疫印迹结果表明,HA-Cyc28在四膜虫有性生殖0 h没有表达,2 h后表达上调,在4h和8h蛋白条带变弱,可能部分发生泛素化降解,在16h配对分开后蛋白质消失。
  3.敲减CYC28对有性生殖进程无显著影响 CYC28是有性生殖期特异表达的基因,为进一步分析Cyc28在嗜热四膜虫有性生殖过程中的功能,我们首先构建了CYC28的敲除载体pNeo4-Δ-CYC28,转化不同交配型的四膜虫细胞,通过同源重组,筛选得到CYC28敲减细胞株。同野生型细胞相比,敲减株在有性生殖过程中,细胞配对,小核拉伸,小核减数分裂以及原核选择,合子核的有丝分裂都未见异常。由于未能获得CYC28完全敲除的突变体细胞株,进一步构建了CYC28的干扰质粒pCYC28hpCYH,该质粒由Cd2+调控表达。干扰质粒通过基因枪转化四膜虫,经放线菌酮抗性梯度筛选,获得不同交配型的突变体细胞株。qRT-PCR检测得到稳定的干扰株。观察四膜虫在有性生殖过程中核发育,结果表明小核发育过程未受影响,细胞配对,小核拉伸,减数分裂,配子核交换,新大核形成以及结合后的个体均正常,表明Cyc28的敲减对有性生殖的进程无显著影响。
  4.过表达Cyc28影响有性生殖期原核的有丝分裂在突变体细胞OE-CYC28-B和OE-CYC28-C配对后,CYC28基因的转录水平比野生型提高约10倍,观察有性生殖过程,过表达Cyc28引起原核有丝分裂进程的异常。同野生型相比,在有性生殖3.5h,45.5%细胞第一次减数分裂后期出现浓缩的染色体,未见染色体解聚后的小核;在4h,36.5%的细胞停留在第一次减数分裂后期,31.5%细胞进行的第二次减数分裂,小核松散;而在6h,大多数细胞选出的小核无法进行有丝分裂;在8h,45.3%细胞中未出现新大核,在12 h,未出现发育完成的两个大核一个小核的细胞。过量的外源Cyc28导致细胞核发育异常,原核有丝分裂受阻,有性生殖未能完成。
  本研究首次鉴定了嗜热四膜虫周期蛋白基因CYC28,实时荧光定量PCR表明CYC28在有性生殖期特异表达。敲减CYC28不影响细胞的发育,而过表达CYC28导致细胞有性生殖过程小核有丝分裂异常,暗示它的正常表达和降解对原核有丝分裂的完成是必需的。进一步获得CYC28的敲除株,有望揭示Cyc28在嗜热四膜虫生殖过程中具体功能,完善周期蛋白在纤毛类原生动物中的复杂调控机制。
[硕士论文] 王冰花
生物医学工程 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质翻译后修饰(post-translational modification,PTM)是一种十分重要的生命活动调控方式,可以改变蛋白质的结构并完善蛋白质的功能。因此深入研究蛋白质翻译后修饰的原理、种类、作用机制对于理解人类疾病的发病机制具有重要意义。
  近年来,随着实验技术的不断发展,积累了大量的蛋白质翻译后修饰位点数据,极大地推动了蛋白质翻译后修饰的研究进展。然而实验方法往往耗时耗力且成本较高,因此有必要发展高效、精确的计算方法预测翻译后修饰位点,为后续实验工作提供有用的参考信息。现有的计算方法大部分使用蛋白质氨基酸序列信息进行预测,忽视了蛋白质翻译后修饰间的功能联系信息。有研究表明insituPTM指的是相同蛋白质同一个位点上发生多种翻译后修饰类型,可以反映出翻译后修饰间的功能联系。因此由多位点-多修饰相互作用关系的insituPTM启发本文从磷酸化相关位点-修饰网络的角度充分考虑网络拓扑结构信息,进而应用于翻译后修饰位点预测中来。本文主要研究内容如下:1、利用多种翻译后修饰数据库中收集的丝/苏/酪氨酸位点上的翻译后修饰位点数据,构建了磷酸化相关位点-修饰网络。在该网络的基础上,提出了基于资源配置的网络链路预测算法SMNBI用于磷酸化位点预测。该算法主要利用网络中已知的链路信息对未知的位点与修饰相互作用关系进行预测。将SMNBI算法与现有的网络链路预测算法及磷酸化位点预测方法进行比较,结果表明磷酸化相关位点-修饰网络在磷酸化位点预测中发挥重要作用,能够大幅度提高预测精度。
  2、为解决磷酸化相关位点-修饰网络中孤立节点的预测问题,本文进一步提出了多核支持向量机算法MK-SVM用于全面预测丝/苏/酪氨酸位点上的多种翻译后修饰类型。首先采用高斯核函数和氨基酸置换矩阵BLOSUM62分别设计了高斯互作谱相似性核和蛋白质局部序列相似性核,然后通过线性加权组合核函数的方式输入到SVM进行训练和预测。MK-SVM算法不仅有效解决了磷酸化相关位点-修饰网络中孤立节点的预测问题,而且可对丝/苏/酪氨酸位点上的多种翻译后修饰进行预测。与多种常用的翻译后修饰预测方法的比较结果显示,该算法对于磷酸化、O-GlcNAc、硝基化、硝化等翻译后修饰类型均取得了良好的预测性能。
  
[硕士论文] 郭小娟
无机化学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:中心蛋白是EF-hand超家族蛋白成员之一,是一种分子量比较小(20kD)的、酸性钙离子结合蛋白。最初,中心蛋白是在单细胞绿藻中作为纤维收缩的组成成分被发现的。后来,中心蛋白在许多真核生物中发现,包括高等植物、酵母、脊椎动物和人类,在不同的细胞过程中,扮演着重要的角色。
  人体中有四类不同的中心蛋白,分别为centrin1,centrin2,centrin3和centrin4(缩写为HsCen1-HsCen4),四种中心蛋白都与视网膜相互连接的鞭毛相关,参与视力的信号转导。但是四种中心蛋白仍有不同的功能,因此可能有不同的生物意义。本文在研究HsCen2的基础上,进一步研究了HsCen1的如下性质:
  首先,研究了HsCen1磷酸化前后与金属Tb3+和Ca2+的相互结合:Ca2+与HsCen1的反应为放热、焓驱动反应;Tb3+与HsCen1的反应为吸热、熵驱动反应;每摩尔HsCen1可以结合4摩尔Tb3+,蛋白与Tb3+结合顺序为Ⅳ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ。HsCen1磷酸化后减弱了与Ca2+和Tb3+的结合,结合常数减小。
  HsCen1结合金属离子后,构象改变。HsCen1磷酸化后引起的构象变化减弱。
  其次,通过共振光散射光谱法研究了HsCen1的聚集及其影响因素。结果表明:金属离子可以诱导HsCen1聚集,而且Tb3+引起的聚集明显强于Ca2+引起的聚集;HsCen1浓度、不同稀土离子、离子强度以及TNS等都可以影响HsCen1的聚集:HsCen1的聚集程度与蛋白本身的浓度呈正相关;随着金属离子的半径增大,金属离子引起蛋白的聚集减弱;随着KCl盐浓度的增大,Tb3+引起的HsCen1聚集减弱;随着TNS与HsCen1比例的增加,Tb3+引起的HsCen1聚集减弱。HsCen1磷酸化后,HsCen1的聚集程度减弱,HsCen1聚集可能是由疏水作用和静电作用共同调控的。
  最后,通过等温滴定量热法和荧光发射光谱法研究了HsCen1磷酸化前后与R18-Sfi1的相互作用。结果表明:二者之间是焓驱动的放热反应;每摩尔HsCen1可以结合1摩尔R18-Sfi1,不依赖Ca2+,但是Ca2+的存在,增强了二者之间的相互作用;HsCen1磷酸化后,必须依赖Ca2+才可以与R18-Sfi1结合,而且磷酸化后,减弱了二者之间的亲和力。
[硕士论文] 李丽岑
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:目的:不健康的生活方式,是导致非酒精性脂肪肝的重要原因。现有研究表明,急性饥饿容易诱导肝细胞脂肪变性,而间歇性饥饿可以减轻体重,延长寿命。因此,本文旨在探讨间歇性饥饿是否可以改善急性饥饿诱导的肝细胞脂肪变性。
  方法:以小鼠为研究对象,首先对小鼠进行一段时间的间歇性饥饿训练,然后进行急性饥饿处理,最后分离肝脏组织进行生物化学分析和分子生物学分析,探索间歇性饥饿对脂肪代谢的调控和相关机制。
  结果:⑴小鼠在间歇性饥饿处理期间,其累积进食量与自由进食对照组基本一致。间歇性饥饿训练17个循环后,相对于自由进食对照组,间歇性饥饿小鼠体重显著下降(P<0.05)。两组小鼠的肝指数未见显著差异,且肝脏切片染色也未见明显空泡。急性饥饿24小时后,两组小鼠肝指数均下降,而自由进食饥饿24小时组小鼠血清中谷丙转氨酶含量显著上升。肝脏切片染色观察发现自由进食饥饿24小时组中存在许多小泡状脂滴,而间歇性饥饿训练后的小鼠肝脏中未见明显空泡。⑵分离各组间小鼠肝脏组织进行生化和基因分析,间歇性饥饿组小鼠胰岛素水平显著上升,随之小鼠肝脏内糖原含量也明显提高,而肝脏中甘油三酯含量则显著降低。进一步测定小鼠肝脏中与能量代谢相关基因表达情况发现,间歇性饥饿组小鼠Pparα和Glut4表达显著下调。急性饥饿24小时后,间歇性饥饿训练后的小鼠肝脏中与脂代谢相关基因Ppara、Fgf21、Cpt1a和Hmgcs2的表达都显著下调,而与糖代谢相关基因Glut4、Pgc1a和Pygl的表达则显著上调。⑶检测各组间小鼠肝脏中氧化应激反应程度,间歇性饥饿组小鼠血清中丙二醛含量显著下降,总抗氧化能力显著提高,而总巯基含量和抗氧化物酶活力均未见明显差异。急性饥饿24小时后,丙二醛含量显著上升,且自由进食饥饿24小时组小鼠显著高于间歇性饥饿训练小鼠。而抗氧化物酶活力显著下降,且自由进食饥饿24小时组下降更为显著。
  结论:①相比于自由进食对照组小鼠,间歇性饥饿训练可以减缓小鼠体重上升,上调胰岛素水平,促进肝糖原的合成并减少脂肪动员。②间歇性饥饿训练后的小鼠能够减少体内脂质过氧化产物丙二醛含量,提高抗氧化物酶活性,降低肝细胞中氧化应激水平,减少肝损伤。③因此,间歇性饥饿训练可能通过促进糖代谢,抑制脂代谢,改善氧化应激,减少肝损伤,从而抑制非酒精性脂肪肝的发生。
[硕士论文] 葛炳强
食品科学与工程 浙江工商大学 2017(学位年度)
摘要:研究囊泡界面自催化生成脂肪酸的物理化学机理对于理解脂肪消化具有重要的意义。在大分子拥挤环境中脂肪酸酐水解对于理解人体胃肠道囊泡自组装催化脂质进一步水解的物理化学机理是一个合适的模型。本研究采用多种浓度和分子量的聚乙二醇(PEG)、聚蔗糖(Ficoll)和葡聚糖(Dextran)作为大分子拥挤试剂,选用3种不同链长的脂肪酸酐:癸酸酐、月桂酸酐和油酸酐,探究拥挤剂剂量效应对脂肪酸囊泡自催化生成动力学链长依赖性影响的机理。
  (1)聚乙二醇中脂肪酸囊泡自催化生成动力学研究
  通过对聚乙二醇中脂肪酸囊泡自催化生成速率研究发现,在PEG200、PEG2000和PEG20000中,癸酸生成速率与稀溶液中相比是下降,而月桂酸、油酸生成速率是增加。且PEG浓度或分子量越大,癸酸生成速率越慢,月桂酸、油酸生成速率越快。通过测定癸酸囊泡和油酸囊泡在PEG中的粒径发现,PEG会增大癸酸囊泡粒径,减小油酸囊泡粒径,且随着PEG浓度和分子量增加,粒径变化幅度增大。流变实验表明,癸酸囊泡粘度随着PEG浓度增加而增大,油酸囊泡粘度变化趋势正好相反,随着PEG浓度增加而减小。高浓度的PEG溶液在癸酸囊泡作用下网状结构塌缩表现出粘性行为,但在油酸囊泡作用下由于更加结实的网状结构的形成而表现出弹性行为。
  (2)聚蔗糖和葡聚糖中脂肪酸囊泡自催化生成动力学研究
  通过对多糖中脂肪酸囊泡自催化生成速率研究发现,在聚蔗糖70、聚蔗糖400和葡聚糖20中,实验结果与在聚乙二醇中相似,癸酸生成速率与稀溶液中相比是下降,而油酸生成速率是增加。且多糖浓度越大,癸酸生成速率越慢,油酸生成速率越快。与在聚乙二醇溶液中相比,在聚蔗糖溶液中,我们发现聚蔗糖分子量增加对脂肪酸生成速率影响不明显,可见大分子性质对脂肪酸生成速率也有一定影响。通过测定癸酸囊泡和油酸囊泡在聚蔗糖和葡聚糖中的粒径发现,多糖聚合物会增大癸酸囊泡粒径,减小油酸囊泡粒径,且随着多糖聚合物浓度和分子量增加,粒径变化幅度增大。流变实验表明,癸酸囊泡粘度随着聚蔗糖浓度增加而增大,油酸囊泡粘度变化趋势正好相反,随着聚蔗糖浓度增加而减小。高浓度的聚蔗糖溶液在癸酸囊泡作用下网状结构塌缩表现出粘性行为,但在油酸囊泡作用下由于更加结实的网状结构形成而表现出弹性行为。
  上述结果表明,在聚乙二醇和多糖溶液中,癸酸和油酸生成速率变化趋势一致,说明脂肪酸囊泡自催化生成动力学链长异常效应在不同大分子拥挤剂构成的拥挤环境中是存在一定的普遍性。拥挤程度(浓度和分子量)增加使癸酸生成速率减慢,月桂酸和油酸生成速率加快。实验表明,这背后的原因主要有三点:1、拥挤环境中脂肪酸囊泡粒径变化影响囊泡催化效率;2、拥挤环境中脂肪酸囊泡粘度变化影响囊泡界面物质扩散速率;3、大分子网状结构粘弹性变化影响物质转运。综上而言,拥挤环境中,在复杂的催化反应情况下,脂肪酸和大分子之间存在不同的疏水相互作用。在脂肪酸囊泡自催化生成过程中,对于中链脂肪酸,扩散对反应速率起到了主要作用;但是对于长链脂肪酸,大分子拥挤剂的拥挤效应促进了脂肪酸囊泡自催化反应速率。本研究为拥挤环境中脂肪酸囊泡自催化生成链长差异性分析提供了有用的信息,也对理解生理相关的脂肪酸消化链长依赖性提供了依据。
[硕士论文] 李晓静
预防兽医学 河南农业大学 2016(学位年度)
摘要:基因工程技术、基因组学和蛋白质组学技术的发展使得重组蛋白表达技术日益成熟。重组蛋白已经在生物、医药、农业和畜牧兽医等多种领域得到广泛应用。但是,重组蛋白的快速和廉价纯化依然是蛋白质规模化制备的瓶颈。亲和标签是蛋白质纯化的高效工具,能够从污染的宿主蛋白中一步纯化重组的目的蛋白。目前,已经有多种亲和标签被用于蛋白质的表达和纯化。最常用的亲和标签包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S转移酶(GST)标签、葡萄球菌蛋白A(SPA)、硫氧还蛋白(TRX)、小泛素样修饰蛋白(SUMO)和六聚组氨酸标签(6×His)等。使用这些标签需要将标签对应的配体偶联到固相载体上,利用标签与配体的可逆性结合特性,利用合适的洗脱条件将目的蛋白洗脱和纯化。考虑到与将配体偶联到固相载体相关的蛋白纯化费用,商品化纯化介质均十分昂贵且只能重复利用数次等问题,现有的纯化标签系统无一适合蛋白质的规模化制备。
  本论文利用硫磺菌蘑菇凝集素(LSL)可逆性结合琼脂糖的特性,将其作为融合标签,建立了一种一步纯化LSL标签融合蛋白的方法。不用任何处理的琼脂糖凝胶柱和乳糖溶液分别作为LSL标签蛋白的特异性吸附剂和洗脱剂。所构建的表达载体中在LSL标签的下游含有烟草花叶病毒(TEV)蛋白酶识别位点,方便后续融合蛋白分子中LSL标签的去除。为了纯化不含标签的目的蛋白,本论文表达了带有LSL标签的TEV蛋白酶。本研究构建的LSL融合标签表达与纯化系统具有表达蛋白可溶性好、纯化工艺简单、成本低等优点,为实现规模化生产和纯化性状确切的蛋白提供新的思路。研究内容包括以下三个方面:
  1.硫磺菌蘑菇凝集素融合标签表达载体构建
  本研究通过合成硫磺菌蘑菇凝集素(LSL)N端含187个氨基酸的糖结合域,并在其下游引入烟草花叶病毒蛋白酶(TEV)的识别位点,通过克隆获得重组质粒pET-LSL,随后将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导进行表达。所构建的pET-LSL重组质粒能够在BL21(DE3)中表达可溶性的硫磺菌蘑菇凝集素,而且所表达的凝集素可以经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化,可以得到单纯的凝集素。为构建以硫磺菌蘑菇凝集素为标签的廉价、高效重组蛋白表达和纯化方法奠定基础。
  2.模式蛋白表达与纯化
  本研究在硫磺菌蘑菇凝集素融合标签表达载体构建成功后,以该重组质粒为基础,分别以绿色荧光蛋白GFP和PCV2的衣壳蛋白(Cap)为模式蛋白,进一步研究硫磺菌蘑菇凝集素作为融合标签在蛋白表达上的应用。通过克隆的方法,成功构建了重组质粒pET-LSL-GFP和pET-LSL-Cap。分别将重组质粒转化至BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导进行表达。实验表明GFP和Cap重组蛋白都能以可溶性形式进行表达,可溶性表达水平在90%左右,经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化,可以得到单纯的重组蛋白。在荧光下观察重组蛋白LSL-GFP,可以看到明显的荧光,通过Western Blot,重组蛋白LSL-Cap可被PCV2多克隆抗体特异性识别,证明LSL融合标签不影响模式蛋白的生物学活性和抗原性。
  3.用于切割融合蛋白的TEV工具酶表达与纯化
  本研究利用硫磺菌蘑菇凝集素作为标签,构建了表达TEV蛋白酶的重组质粒pET-LSL-TEV,将重组质粒转化至BL21(DE3)宿主菌后,经IPTG诱导表达。实验表明TEV重组蛋白酶以可溶性形式表达,可溶性水平为60%左右,经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化后,可以得到单纯的重组蛋白。所表达的TEV蛋白酶具有良好生物学活性,可以将目的蛋白与LSL标签一步分离。
  总之,本论文研究结果证明硫磺菌蘑菇凝集素LSL可以作为有效的亲和标签,并且具有以下优势:(1)LSL标签可以一步亲和层析纯化融合蛋白;(2)LSL标签可以提高目的蛋白的可溶性,并且对靶蛋白的功能不产生影响。值得指出的是,Sepharose-4B柱经过含0.2M乳糖的PBS洗净残留蛋白后,再用PBS洗涤,可以多次重复使用。此外,因为琼脂糖本身就是树脂,并且可以作为LSL标签的配体,本研究所使用的方法比传统需要配体固定到树脂上的亲和纯化方法更廉价、方便。
[硕士论文] 王婷婷
生物化学与分子生物学 暨南大学 2016(学位年度)
摘要:抗氧化或清除自由基是身体自我保护的表现。食物中所含的很多物质都有抗氧化功能,蛋白质作为食物中最主要的成分之一,研究它们的抗氧化特性,特别是研究这些蛋白质在消化液作用下水解形成多肽后,即在水解状态下抗氧化特性的变化状态,就可加深对蛋白质的生理功能等的认识,也为制备抗氧化多肽奠定基础。这对于生物化学、营养学或食品学等都具有意义。本研究选取三种食物中最常见的蛋白,血清白蛋白、大豆水溶性蛋白和卵清白蛋白,以胰蛋白酶进行水解,研究水解状态下这些蛋白质的抗氧化性变化规律,以及抗氧化与水解度、多肽产物变化的关系等。研究得到的主要结果如下:
  1、以胰蛋白酶对牛血清白蛋白(BSA)进行水解,最适条件为40℃,底物与酶质量比为20:1。随着水解进程,水解产物的自由基清除能力明显增加。在反应的前80min,水解度与自由基清除能力都有很大的增长,其中水解度增大到15.1%,自由基清除率由29.91%提高到了50.12%,增大20.21%。在继续水解过程中,多肽水解度不断增大,但增加缓慢,最后趋于平稳,自由基清除能力也开始减小,这表明过度水解不利于抗氧化性的提高。通过SDS-PAGE对水解产物多肽进行分析,发现不同水解度下的产物分布存在一定规律;随着分子量为25-28KD左右的肽段不断被水解,其抗氧化性增加,推测此多肽段中具有未暴露的抗氧化活性基团。
  2、运用脱脂法对大豆粉中的水溶性蛋白进行提取的提取率为8.738%;在胰蛋白酶水解大豆水溶性蛋白中,对样品蛋白进行预处理有利于水解的进行,预处理最适条件为温度85℃,处理时间20min;样品蛋白随着水解时间的延长,水解度不断增大,水解速率先快后慢,逐渐趋于稳定,而自由基清除能力随着水解度的增大逐渐增大。当酶量为0.01g/50mL样品,水解90min时,水解度为2.682%,自由基清除率达到46.53%,该条件下可以得到抗氧化性良好的大豆肽。
  3、卵清白蛋白的胰蛋白酶水解,随着水解时间的延伸,水解度逐渐变大,底物逐渐减少,且随着酶的用量越大,开始阶段水解速率越高,最终底物分解越多。在酶量为15625U/g底物,水解5小时后,水解度基本趋于稳定,水解度达到25%以上。在这一水解度下,自由基清除能力达到最大,为23.87%。随着水解时间的延长,水解度的增大速度和自由基清除能力均出现减弱趋势。因此,适量水解有利于卵清白蛋白抗氧化性的提高。通过SDS-PAGE对水解产物多肽进行分析,发现其抗氧化活性与分子量约为30KD和25KD的肽段产物的含量存在相关性。
[硕士论文] 熊乐
生物信息学 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:真核生物广泛使用组合调控方式调节基因表达。在该过程中,转录因子蛋白-蛋白相互作用与其DNA结合特异性存在耦合关系。然而,其背后的分子机制所知甚少。
  在本论文中,我们对碱性亮氨酸拉链(Basic leucinezipper, bZIP)转录因子组合调控分子机制进行了深入的理论研究。通过生物信息学分析,鉴定了一个对碱性亮氨酸拉链超家族DNA结合特异性至关重要的蛋白-蛋白互作位点。随后,以cAMP响应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)作为模型,通过分子动力学模拟研究,发现上述蛋白互作通过控制连接区域的柔性和移动性与Argl7-DNA相互作用耦合,进而影响CREB蛋白的DNA结合特异性。进一步的结构分析支持Arg17-DNA相互作用耦合的组合调控机制普遍存在于整个bZIP超家族中。本研究为理解bZIP蛋白组合调控机制提供了基本的分子模型,对理解真核生物其他转录因子超家族组合调控具有一定的启发意义。
[硕士论文] 喻广强
微生物学 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:嗅觉系统能够感知外界环境中瞬息万变的气味信号,对于生命体的觅食、求偶、避险、繁殖和警戒等各种生命活动都有重要意义。在气味的识别和结合过程中,气味结合蛋白(Odorant binding proteins,OBPs)首先探测、结合、区分并转运气味小分子,然后呈递至气味受体(Olfactory receptors,ORs)等下游蛋白并最终产生嗅觉。因此研究气味结合蛋白和常见气味物质间的相互作用机理对于理解气味的本质具有重要意义。
  本研究首先对花绒寄甲气味结合蛋白DhelOBP21进行了同源模建,获得了其三维结构。发现它符合Minus-C类OBPs的特征:具有4个保守的半胱氨酸并形成2个二硫键用于稳定蛋白的三维结构;结合腔相对疏水,利于结合疏水性气味小分子。其后的分子对接则初步获得了蛋白DhelOBP21与18个小分子的结合构象,用于后续的动力学模拟。
  随后的常规动力学和恒定pH动力学模拟则首次观测到了气味结合蛋白的N端在无规卷曲和Alpha螺旋之间的转变,我们据此提出了新的理论假设:对于Minus-C类的OBP,它们的构象同时受环境pH和小分子的调节。当pH由酸性增高到中性时,蛋白的远离结合腔并且为无规卷曲的N端逐渐向结合腔靠近,并转变成规则的Alpha螺旋,利于小分子的结合和转运;而当pH由中性降低为酸性时,蛋白的N端由Alpha螺旋逐渐解旋为无规卷曲并逐渐远离结合腔,利于小分子的释放。
  此外,蛋白结合腔内部的部分氨基酸残基对18个小分子(17个常见挥发物和荧光探针1NPN)的结合活性都很高,它们为“基础性氨基酸”,可能决定蛋白结合小分子的杂泛性;而另外一些氨基酸残基对于18个小分子的结合活性各不相同,它们为“选择性氨基酸”,可能决定了蛋白结合小分子的选择性。
  本研究对Minus-C类的气味结合蛋白和小分子的相互作用机制提出了新的理论假设,并从蛋白的角度解释了气味结合蛋白结合小分子的杂泛性和选择性的原因,为昆虫的气味识别和宿主定位等难题提供了新的洞察和理解。
[硕士论文] 王君
食品科学 安徽农业大学 2016(学位年度)
摘要:蛋白磷酸酶5(protein phosphatase5,PP5)是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,在细胞生长、增殖、分化、迁移以及胁迫条件下细胞的生存等多个方面发挥着重要作用。实验中发现 PP5基因敲除小鼠的体重较野生型轻,体型也较小。进一步以PP5基因敲除小鼠(PP5KO)为模型,较为深入地研究了PP5在脂肪代谢和骨发育中的作用。首先对高脂饲养WT和PP5 KO小鼠体重进行了动态检测,MRI检测小鼠体内脂肪的分布,HE和油红O染色对小鼠肝脏组织进行病理学和组织化学分析,利用体外诱导WT和KO小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast cells,MEF)脂肪分化,利用western blotting和realtime-PCR研究了PP5基因对脂肪分化及脂代谢相关通路基因的调控。同时为探究PP5在骨分化方面的作用,首先对WT和KO小鼠的体重及股骨长度进行测量分析;利用HE染色、CT扫描分别对WT和KO小鼠股骨组织结构进行比较分析;利用生物力学仪检测了WT和KO小鼠股骨应力的差异;利用体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)成骨分化、利用siRNA干扰前成骨细胞系MC3T3-E1 PP5基因的表达,研究PP5对骨分化的影响;利用western blotting、realtime-PCR和免疫组化技术研究了PP5基因对骨发育调控通路相关基因的调控。主要结果如下:
  1.与WT对照小鼠相比,高脂饲喂的PP5 KO小鼠体重显著减轻且体重增加显著变慢;肝脏中脂滴数量显著减少,且脂滴较小;CT扫描显示PP5 KO小鼠体内脂肪积累显著少于WT对照组。
  2.通过体外诱导MEF细胞脂肪分化,发现与WT MEF细胞相比,PP5 KO MEF细胞脂肪分化明显减弱,同时形成的脂滴较小。
  3.real time PCR检测PP5 KO小鼠肝脏组织中脂肪分化标记基因:脂肪酸转位酶(fatty acid importer cluster of differentiation36,CD36)、AP2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(peroxisome proliferator activated receptorγ2,PPARγ2)、葡萄糖转运子4(glucose transporter4,GULT4)的相对表达量与WT小鼠相比显著降低;western blotting的结果表明PP5 KO小鼠肝脏组织中磷酸化糖皮质激素受体(phosphorylation glucocorticoid receptor,p-GR)和解耦联蛋白1(uncoupling protein1,UCP1)蛋白表达量显著高于WT小鼠。
  4.在骨发育方面,与WT小鼠相比,PP5 KO小鼠体重显著减轻、股骨变短、变粗,骨小梁数量增加、骨小梁分离度变小、骨小梁厚度变大,相对骨体积(股骨中骨成分的体积/股骨的总体积)增大、骨密度显著增大,皮质骨厚度增加,骨相对表面积(股骨中骨成分的表面积/骨体积)减少,利用生物力学仪检测发现PP5 KO小鼠股骨最大载荷显著减小,说明PP5基因敲除后小鼠骨分化增强但是股骨承重能力显著减弱。
  5.体外诱导骨分化实验表明,与WT骨髓间充质干细胞相比,PP5 KO间充质干细胞体外骨分化显著增加。
  6. real time PCR结果显示,PP5 KO小鼠骨髓间充质干细胞及软骨中骨分化相关基因:骨桥蛋白(osteopontin,Opn)、骨钙素(osteocalcin,Ocn)、成骨转录因子(runt-related transcription factor2,Runx2)相对表达量明显升高,而骨分化抑制基因(peroxisome proliferator activated receptorγ1,PPARγ1)和(peroxisome proliferator activated receptorγ2,PPARγ2)相对表达量显著降低;免疫组化结果显示Runx2蛋白表达量显著升高,PPARγ蛋白表达量无显著性变化;利用 western blotting检测 PP5 si-RNA干扰后的MC3T3-E1细胞蛋白表达变化时发现磷酸化PPARγ(p-PPARγ)蛋白表达量显著升高。
[硕士论文] 任玺
生物学(生物信息学) 上海交通大学 2016(学位年度)
摘要:蛋白质在基质表面上的吸附动力学研究是生物学、医学、食品加工等许多领域共同关切的重要科学问题。时间分辨光谱技术通常被用来实时监测蛋白质的结合动力学过程,但是基于单变量分析的传统数据处理方法难以区分复杂动力学数据中的重叠组份,因此有必要引入多变量分析方法来实现对复杂体系的动力学分析和数学建模。本论文围绕蛋白质和金纳米的动态相互作用深入开展了以下两个案例的研究。
  第一个案例研究和揭示了金纳米(AuNPs)和两种高度同源的血清白蛋白(即人血清白蛋白HSA和牛血清白蛋白BSA)的结合动力学差异。首先,我们收集了两种同源蛋白的紫外可见光谱动力学数据。然后,通过结合多变量分析及数学建模等分析手段,我们设计出了一个可行性较高的蛋白质吸附动力学研究策略,实现了对蛋白质和纳米材料之间发生的相互作用的定量和定性分析。在此基础上,我们又利用多级指数函数对该动态转换过程进行了数学刻画,通过对拟合公式中的参数进行定量分析从而推算出两种蛋白质的不同吸附特性。我们发现血清蛋白和金纳米的结合过程可被两个一级指数反应方程所描述,故整个的反应可被看作两个过程:一个快过程和一个慢过程,恰好对应于血清蛋白的三角棱柱形结构所能采取的两种可能的结合构象。两种蛋白质所不同的结合构象偏好性取决于不同的结构特性以及表面电荷分布。
  作为一个方法学的拓展研究,我们又进一步研究分析了一种具有自聚集特性的抗菌蛋白—胰岛再生源蛋白(REG3A)在金纳米(AuNPs)表面的结合及聚集特性。已知内毒性分子脂多糖(LPS)能够抑制REG3A的杀菌功能,故我们利用多变量分析手段对二元的AuNPs-REG3A和三元的AuNPs-REG3A-LPS作用体系分别进行了研究,发现REG3A在金纳米上同样具有非常强的自聚集成纤维网络的倾向,当聚集到一定程度时,REG3A会从金纳米表面脱落下来从而在动力学光谱上表现为多过程行为。而LPS加入后,LPS会在REG3A之前迅速吸附到纳米颗粒表面上,且对REG3A蛋白的自聚集起到比较明显的抑制效应,从而在其吸附动力学数学模型中出现体系组份数减少以及结合动力学曲线平滑化等现象。
  本论文将多变量分析方法和结合动力学的研究相结合实现了一种新的二维动态光谱数据分析方法,这种数据处理方法能够对蛋白质-纳米体系的相互作用模式和机制进行较为准确的研究和探索。该分析流程方案简单、有效、灵敏,可以应用于构建和开发基于纳米材料的生物传感器,从而揭示体液中的一些疾病相关且低表达蛋白在纳米材料上的特殊动力学行为,同时也为探究具有特殊结构组成或聚集能力的蛋白质或多酶体系提供了新的思路和手段。
[硕士论文] 郝利科
体育学 北京体育大学 2016(学位年度)
摘要:目的:本研究建立一去卵巢大鼠模型,通过运动和体外补充雌激素,探讨运动和雌激素对去卵巢大鼠脂肪代谢PPARγ和GSK-3β、P-GSK-3β的影响。
  方法:以雌性去卵巢SD大鼠为研究对象,进行为期15周的实验,分别进行运动和补充雌激素,分为假手术安静组(Sham)、假手术运动组(Sham+E)、去卵巢安静组(OVX)、去卵巢运动组(OVX+E)和去卵巢雌激素组(OVX+E2)。运动组大鼠18m/min,坡度5°,45min,每周运动5天;去卵巢激素组大鼠每周按体重25ug/kg注射E2,每周3次。实验结束后测定大鼠腹腔内脂肪重量,采用放射免疫方法测血清中雌激素E2水平,HE染色观察脂肪细胞形态;采用Bradford法和Western Blot测定大鼠脂肪总蛋白含量和脂肪组织PPARγ、GSK-3β和P-GSK-3β蛋白表达。
  结果:(1)经过15周实验后,去卵巢安静组大鼠体重显著高于假手术安静组(P<0.05),运动和补充雌激素之后体重明显下降(P<0.05)(2)去卵巢安静组大鼠腹腔内脂肪重量最大,运动和雌激素补充干预后脂肪重量明显降低(P<0.05)(3)大鼠去卵巢之后脂肪组织中甘油三酯含量显著升高(P<0.05),运动和补充雌激素后又显著下降(P<0.05)(4)去卵巢安静组大鼠的脂肪细胞面积显著增大(P<0.05),运动和雌激素干预后明显减少(P<0.05)(5)去卵巢安静组大鼠脂肪组织PPARγ与假手术组相比表达升高,运动后,假手术运动组和去卵巢运动组大鼠脂肪组织PPARγ均升高,补充雌激素之后PPARγ也升高(6)运动训练后,假手术运动组大鼠和去卵巢运动组大鼠脂肪组织P-GSK/GSK蛋白表达蛋白表达量均显著升高(P<0.05);去卵巢激素组大鼠的蛋白表达量无显著性变化(P>0.05)。
  结论:1.运动训练和体外补充雌激素,在一定程度上可以缓解去卵巢大鼠腹腔内脂肪的积累;2.中等强度运动训练能够提高去卵巢大鼠体内雌激素水平;3.运动能够上调脂肪组织PPARγ、P-GSK-3β/GSK-3β蛋白的表达,促进脂肪组织的代谢;雌激素也能上调脂肪组织PPARγ蛋白的表达,而对于P-GSK-3β/GSK-3β蛋白的表达却无明显影响。
[博士论文] 宋捷
药理学 第二军医大学 2016(学位年度)
摘要:脂肪组织遍布于全身各处,长期以来一直被认为是机体储存能量的主要部位。除了储存多余能量,脂肪组织作为机体内高度活跃的内分泌器官,可分泌产生多种脂肪因子。这些脂肪因子可作用于局部脂肪组织,也可通过血液循环作用于其他组织器官。它们在生物体内的平衡与能量代谢、心脑血管功能、免疫炎症等过程密切相关。一旦这种平衡被打破,由此引发的代谢紊乱、免疫系统异常将会导致肥胖、动脉粥样硬化以及诸多心脑血管疾病的发生。因此,对脂肪因子的深入研究,对新脂肪因子的发现和功能阐明对疾病的诊断、治疗和预防都具有非常重大的意义。本课题利用细胞特异性转基因小鼠和分子特异性抑制剂研究脂肪因子Metrnl和Nampt在机体内的重要功能,并对机制进行了深入研究。本课题分为以下两个部分。
  第一部分为 Metrnl调节胰岛素敏感性的机制研究。我们前期的研究结果表明,Metrnl是一种分泌蛋白,高表达于小鼠和人的皮下白色脂肪。在限食情况下,白色脂肪中Metrnl的表达会出现下调。而在高脂饮食(High fat diet,HFD)喂养的肥胖小鼠中,白色脂肪的Metrnl会出现显著升高。此外,Metrnl的表达在白色脂肪细胞分化过程中也会显著增加。一系列结果提示Metrnl作为一种脂肪因子,可能参与调节白色脂肪的生物学功能和能量代谢。我们前期利用基因工程手段制备了脂肪细胞特异性过表达Metrnl小鼠(Metrnl-Tg)以及脂肪细胞特异性敲除Metrnl小鼠(Metrnl-/-)。在这部分实验中,我们首先对Metrnl-/-小鼠的鉴定方法进行了改进和优化,建立了Metrnl细胞特异性敲除小鼠鉴定方法的标准操作流程。运用葡萄糖耐量实验(GTT),我们再次验证Metrnl-/-将会加重HFD引起的胰岛素抵抗,而脂肪细胞特异性过表达Metrnl可以对抗HFD或者瘦素缺乏引起的胰岛素抵抗。在胰岛素信号通路的研究中我们发现,Metrnl可显著提高白色脂肪胰岛素作用下AKT的磷酸化水平。为了进一步明确Metrnl增敏作用的机制,我们运用多种实验手段,对调节胰岛素敏感性的多种机制进行了探索。研究结果表明,Metrnl可抑制炎症因子的表达、改善脂质代谢、促进脂肪分化从而提高胰岛素敏感性。我们还检测到Metrnl在脂肪组织和成熟脂肪细胞中的分泌,并证实Metrnl可通过分泌的形式促进脂肪细胞的分化。使用PPAR小分子化学抑制剂或者PPARγ干扰慢病毒可以阻断Metrnl的胰岛素增敏作用,证明了Metrnl可通过PPARγ参与机体胰岛素敏感性的调节。通过这一部分实验,我们阐明了Metrnl在白色脂肪中的重要功能。脂肪组织Metrnl可通过PPARγ信号通路促进脂肪细胞分化、改善代谢、抑制炎症从而调节脂肪功能,对抗肥胖引起的胰岛素抵抗,有望成为治疗代谢综合征和2型糖尿病的新靶点。
  第二部分为 Nampt在限食调节氧化应激以及线粒体生物合成中的作用。限食也被称为饮食干预,是一种限制能量摄入的饮食调理手段。限食在延缓衰老、改善代谢、预防多种疾病发生发展过程中具有重要作用。SIRT家族是介导限食效应的关键分子,SIRT活性依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的生物合成。烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)是NAD+生物合成中的重要限速酶,我们前期的实验结果证明了Nampt参与限食介导的代谢功能改善作用。在这部分实验中,我们使用Nampt特异性化学抑制剂FK866全身性抑制Nampt酶活性,发现限食介导的SIRT3活性的增强、氧化应激水平的下降、抗氧化能力以及线粒体生物合成能力的增强都会被取消,证明了Nampt在限食调节氧化应激以及线粒体生物合成中的重要作用。
[硕士论文] 范茂兵
药理学 第二军医大学 2016(学位年度)
摘要:目的:
  脂肪因子在调控脂肪组织功能和机体代谢方面发挥着重要作用。Metrnl是我们课题组新发现的脂肪因子。该蛋白在机体多种组织中表达,尤其在白色脂肪和粘膜组织中高表达。目前文献报道,Metrnl具有神经营养因子的作用,促进轴突生长和神经细胞迁移;脂肪形成和肥胖时Metrnl表达上调。本课题研究Metrnl组织表达谱,聚焦于Metrnl高表达的脂肪组织和肠道组织,通过创制细胞特异性基因敲除小鼠探索Metrnl功能。
  方法:
  1.考察小鼠Metrnl ELISA试剂盒的灵敏度、精确度、特异性等,建立一套稳定准确的Metrnl检测方法。
  2.利用Metrnlloxp/loxp小鼠和Fabp4-Cre小鼠交配,制备Metrnl脂肪细胞特异性敲除小鼠。
  3.正常饮食下,取Metrnl脂肪细胞特敲小鼠和野生型小鼠脂肪组织、肝脏、肌肉、心脏和脑组织检测Metrnl mRNA水平,利用ELISA方法检测Metrnl血液水平。另外,监测小鼠能量消耗和进行葡萄糖耐量实验。
  高脂饮食下,监测Metrnl脂肪细胞特敲小鼠和野生型小鼠能量消耗,并进行葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验。H&E染色观察小鼠白色脂肪组织形态和real-timePCR分析棕色脂肪脂代谢和产热相关基因表达。
  4.利用正常人组织芯片进行Metrnl免疫组织化学分析,以及利用real-time PCR方法分析C57BL/6小鼠组织Metrnl mRNA表达。
  5.利用Metmlloxp/loxp小鼠和Villin-Cre小鼠交配,制备Metrnl肠上皮细胞特异性敲除小鼠。
  6.考察Metrnl肠上皮细胞特敲小鼠和野生型小鼠体重和结肠长度,H&E染色观察结肠形态和利用ELISA方法检测血液和肠液Metrnl水平。肠道粘液染色分析肠道粘蛋白的分泌,以及利用real-time PCR方法分析肠上皮细胞中抗菌肽mRNA表达水平如Regenerating islet-derived3 gamma(Reg3g)、Lactortansfferin、Serum amyloid a-3(SAA3)和Regenerating islet-derived3 beta(Reg3b)。
  结果:
  1.建立了一套成熟稳定准确的Metrnl ELISA检测方法。该方法灵敏度高,精密度的变异系数为5-15%,且只能由于检测小鼠血液Metrnl,大鼠和人血液都不能检测。另外,小鼠血液的采集方法必须一致,否则影响Metrnl值的比较。
  2.成功制备Metrnl脂肪细胞特异性敲除小鼠模型。脂肪组织Metrnl表达下降57%,而肝脏、肌肉、心脏和脑组织Metrnl表达不改变。Metrnl脂肪细胞特异性敲除后小鼠血液水平有降低趋势,无显著差异。
  3.正常饮食下,与野生型小鼠相比,Metrnl脂肪细胞特异性敲除小鼠的能量消耗和葡萄糖耐受能力不受影响。
  高脂饮食下,与野生型小鼠相比,Metrnl脂肪细胞特敲小鼠白色脂肪细胞显著变小,机体胰岛素抵抗加重,但棕色脂肪脂代谢和产热相关基因mRNA表达无明显变化。
  4.正常人组织Metrnl免疫组化和C57BL/6小鼠组织Metrnl mRNA表达水平表明,Metrnl在人和小鼠组织中表达谱几乎一致,且肠上皮细胞Metrnl表达最高。
  5.成功制备Metrnl肠上皮细胞特异性敲除小鼠模型。肠上皮细胞Metrnl表达下降96%,而肝脏、肌肉、心脏和脂肪组织Metrnl表达不改变。Metrnl肠上皮细胞特敲后小鼠血液水平有降低趋势无显著差异,而肠液Metrnl水平显著降低。
  6.与野生型小鼠相比,Metrnl肠上皮细胞特敲小鼠体重和结肠长度,结肠形态也没有显著变化。肠道粘液染色没有发现其分泌有明显变化,肠上皮Mucin2表达也没有差异。但肠上皮细胞中抗菌肽mRNA表达减少如Reg3g和Lactotransfferin分泌显著减少,SAA3和Reg3b有减少趋势。
  结论:
  Metrnl脂肪细胞特异性敲除不会引起血液Metrnl水平显著下降;Metrnl肠上皮细胞特异性敲除不会引起血液Metrnl水平显著下降,但导致肠液Metrnl水平显著降低。脂肪细胞Metrnl能增强机体胰岛素敏感性;肠上皮细胞Metrnl能促进肠上皮细胞抗菌肽表达,Metrnl可能参与肠道免疫调节。
[硕士论文] 潘奕鸥
生物学 河南科技大学 2016(学位年度)
摘要:阿魏酸是植物界中普遍存在的一种酚酸,主要存在于各种水果,蔬菜和谷物,具有极强的抗氧化性。肥胖是一种代谢综合征,表现为体重过度增加和高血脂,是Ⅱ型糖尿病、心血管疾病和某些类型癌症的诱导主要诱因之一。本文通过阿魏酸对雄性瘦素基因缺陷型ob/ob小鼠脂肪代谢的影响研究、阿魏酸对高脂饲粮诱导的肥胖小鼠脂肪代谢的影响研究,分别探讨了它们的影响机制。
  本研究阿魏酸对雄性瘦素基因缺陷型ob/ob小鼠脂肪沉积和腹脂脂肪酸组成的影响。随机选取雄性5周龄ob/ob小鼠30只分为三组(n=10),各组在基础饲粮中分别添加0、0.25%和0.5%的阿魏酸,试验期9周。与对照组相比,阿魏酸降低了ob/ob小鼠的总增重、腹脂率、血清甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇水平,显著降低了肝脏甘油三酯和总胆固醇水平,减少肝脏脂滴积累,减少了腹部白色脂肪组织中的棕榈油酸(C16:1)和油酸(C18:1),降低了脂肪酸饱和度指数棕榈油酸/棕榈酸(C16:1/C16:0)和油酸/硬脂酸(C18:1/C18:0)。结论,阿魏酸可以抑制 ob/ob小鼠的脂肪沉积,改善其白色脂肪组织脂肪酸组成,降脂效果明显。研究阿魏酸对高脂饲粮诱导的肥胖小鼠脂肪代谢的影响,并探索其影响机制。将144只雄性C57BL/6J小鼠随机分成4组,分别为对照组、对照添加阿魏酸组、高脂饲粮组和高脂饲粮添加阿魏酸组,试验期7周。与高脂组相比,阿魏酸显著抑制了肥胖小的的体重增长,降低了肥胖小鼠的腹脂率、血糖和血清甘油三酯水平,提高了高密度脂蛋白胆固醇水平,促进了肥胖小鼠了肝脏脂代谢相关基因过氧化物酶体增殖物活化受体和肉碱棕榈酰转移酶1的基因表达。阿魏酸可以改善高脂饲粮诱导的肥胖小鼠体内的脂质沉积,其机制为通过上调氧化物酶体增殖物活化受体和肉碱棕榈酰转移酶1水平,增强脂肪酸的β氧化。结果表明,阿魏酸通过调节脂肪代谢相关的基因氧化物酶体增殖物活化受体和肉碱棕榈酰转移酶1的表达,对肥胖小鼠的脂肪沉积有一定的抑制作用,为肥胖病症的预防与治疗提供了科学依据。
[硕士论文] 管天冰
药学 重庆大学 2016(学位年度)
摘要:代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白组学后出现的新兴学科,是系统生物学的重要组成部分。它通过定性鉴别和定量描述生物基质中小分子代谢物的表达与修饰变化来系统反馈生命体对自身机体调控或者外界环境扰动所做出的代谢应答。当前,代谢组学已广泛应用于药理毒理,疾病发病机制和临床诊断,植物生长发育等研究领域并取得良好的进展。以往的代谢组学研究以非靶向研究方法为主,即采用核磁共振和质谱平台进行不同生物基质中小分子代谢产物(代谢组)的无歧视全扫描分析,以获得最大化的代谢组信息。然而,由于分析仪器固有属性的特殊性,非靶向代谢组学方法一方面无法高灵敏检测具有特殊属性的代谢物,同时,目前一个最大瓶颈就是差异代谢物的精准鉴定与定量。面临如此困境,靶向代谢组学方法在突破通量的瓶颈的前提下,将是一个优势选择,尤其解决多生物基质的目标代谢组的精准定性和定量问题,即不需要繁琐的代谢产物的鉴定过程,另对每个目标代谢产物精准优化分析参数,达到最佳灵敏检出。基于此,本研究拟基于高效液相色谱质谱联用系统(LC/TQ MS系统)和目标小分子代谢物标准品,优化开发能够高灵敏分析目标代谢组的精准靶向代谢组学方法,并将该方法应用于不同生物基质的目标代谢组分析,验证普适性,以实现方法宽口径应用于多基质精准修饰代谢组分析和应用研究。
  本研究首先通过对目标代谢组的标准化合物以针泵进样模式进行三重四级杆分析 MRM定性和定量参数的手动优化,并结合多分析参数自动优化,稳定建立糖、氨基酸、核酸、维生素、有机酸和生物碱共6大类203个目标代谢物的MRM定性检测和定量分析方法。并在此基础上,针对性地优化高效液相色谱分离分析参数,通过对不同化学类型色谱柱、流动相梯度、流动相的 pH值和柱温等色谱参数进行优化,确定最佳的色谱条件,最终成功建立能同时快速稳定分析152个目标代谢物的的LC/TQ MS精准靶向代谢组分析方法。
  针对已经建立的精准靶向代谢组分析方法,本研究进行随机的方法学验证,分别考察该方法学的检测限、定量限、线性、稳定性和重复性等方面内容,即选取果糖、胞嘧啶、亮氨酸、烟酸、硫胺素和乙酰胆碱为代表性代谢物。结果表明,它们的线性回归方程相关系数(R2)均大于0.999,日间精密度和日内精密度相对标准偏差(RSD)均小于5%。确证所优化建立的方法灵敏度高,线性、稳定性和重复性良好,可应用于精准靶向代谢组学研究。
  为了验证所开发代谢组分析方法的生命科学领域应用研究的普适性,我们将已建立的基于 LC/MS的精准靶向代谢组分析方法应用于不同生物基质的的代谢组分析。本研究主要选择生物体液(尿液和血液)、微生物、细胞、植物组织和昆虫等进行代谢组分析,并通过应用多种模式识别方法(Heatmap和 PCA等)对处理组和正常对照组数据进行区组分析。最终结果显示,每种生物基质靶向代谢组的处理组和正常对照组均可显著区分,而且组内不同生物样品明显聚集分布。因此,实验证实,前述所开发精准靶向代谢组方法具有良好稳定性和区分度,可满足不同生物基质的代谢组研究的需要,用于不同生物学科学问题的解决。
  综上所述,本研究已经成功建立了基于高效液相色谱质谱联用系统的精准靶向代谢组分析方法,该方法稳定灵敏覆盖150个具有明确生理功能的小分子代谢物,这些代谢物涉及100个以上主要代谢通路,它们生物合成和表达水平的修饰改变反馈许多至关重要的生物学过程和生物学事件。并且,该代谢组分析方法具有良好的普适性,已成功地应用于体液(尿液和血清)、微生物、细胞、植物组织和昆虫等不同生物基质的精准靶向代谢组学研究。总之,本研究首次开发了一套精准靶向代谢组分析方法,可普适性应用于不同生物基质的精准靶向代谢组学研究,用于不同学科领域生命科学相关科学问题的解决。
[硕士论文] 李瑞娟
应用化学 青岛科技大学 2016(学位年度)
摘要:滚环扩增(RCA)技术是一种等温扩增技术,是在酶促作用下合成一条具有多个重复序列的长的单链DNA。用化学信标(如炔基或叠氮基)代谢标记聚糖可以把化学基团标记在细胞中的糖缀合物上,代谢标记技术与生物正交化学相结合是一种有力的糖成像工具。目前,代谢标记技术已被用于细胞表面糖和糖蛋白的成像。本课题研制了一种基于代谢标记和RCA技术对细胞表面标记的聚糖成像的方法。
  首先,RCA被用于检测细胞表面代谢标记的叠氮糖。这种方法的优点是它避免了引入过多的干预细胞正常生理功能的非自然糖。本实验所用最优叠氮糖浓度是5.0μM。由于荧光强度的增加,因而可通过酶标仪方便地检测细胞自身生物合成的糖。结果表明,代谢标记的能力对于不同的糖和不同的细胞都是不同的。这一现象说明叠氮糖参与聚糖生物合成过程并不是随机的,聚糖的类型由细胞的种类确定。因此,利用这种方法可以对生理过程中不同阶段糖含量的变化进行追踪。
  其次,RCA被用于对细胞表面代谢标记的糖成像。结果表明,滚环扩增技术对代谢标记的放大效果显著,可以在低浓度叠氮糖的作用下得到清晰的荧光成像图。
  最后,RCA技术与荧光能量共振转移(FRET)技术相结合应用到细胞表面特异性蛋白聚糖的成像中。通过与FRET技术相结合,使用特异性的蛋白质和适当的叠氮糖可以实现对特定糖缀合物的检测。这种方法广泛适用于细胞蛋白糖基化的成像,可以对特异性蛋白上的特定糖型进行检测。
  本实验主要是把RCA技术应用在糖代谢标记中,利用这种方法可以监测细胞糖基化的状态和研究糖基化对细胞功能的调节,为由蛋白糖基化异常引起的疾病的早期诊断和治疗提供科学的指导。
[硕士论文] 张睿哲
电气工程 重庆大学 2016(学位年度)
摘要:脑重大疾病以其高发病率、高致残率和高致死率给患者的家庭和生活带来沉重的负担。此类疾病究其电生理本质为神经元的过度同步放电,而其根本诱因则是神经元动作电位的异常改变。现有研究表明,电场脉冲(根据脉宽不同,可分为微秒、纳秒及皮秒脉冲)可通过调控细胞动作电位、继而实现相应的生物学效应。近年来,脉宽为皮秒级的超短脉冲匹配超宽带时域天线以其优异的方向性和精细的操控性在生物医学无创治疗领域得到广泛关注,可有效避免现有临床治疗手段的缺点和不足,有望为脑重大疾病的靶向无创调控提供一种全新的策略。
  然而,皮秒脉冲电场对细胞生物效应的机理研究仍处于一个探索阶段,皮秒脉冲调控神经元动作电位发放的研究更尚属空白。而前述研究工作顺利的开展,则有赖于皮秒脉冲刺激系统的成功研制,其中包括皮秒脉冲发生器与实验电极。为此,本文在国家自然科学基金青年科学基金项目(51307187)的支持下,成功研制出了用于神经调控的皮秒脉冲发生器及细胞实验开展所必需的电极,并通过动物实验初步探索了皮秒脉冲对动物在体神经调控作用。取得的主要成果有:
  ①基于传统 Marx电路原理并引入微带传输理论,研制出一台便携式紧凑型皮秒脉冲发生器(18 cm×18 cm×4 cm)。该装置可在50Ω衰减器负载上产生最大峰值电压1200 V,半高宽550 ps,上升时间150 ps,重复频率0~10 kHz的高稳定性高重复频率皮秒脉冲。
  ②基于 PSPICE电路仿真软件,建立引入微带线的 Marx电路模型,通过仿真探寻输出脉冲波形畸变的原因,并在此基础上优化皮秒脉冲输出波形。仿真与性能测试结果表明,串联谐振电感可以消除皮秒脉冲快速抖动的毛刺;基于渐变传输理论并在终端采用10 pF锐化电容,可得到幅值更高脉宽更窄的皮秒脉冲。
  ③基于微波传输理论,采用 MEMS制作工艺,研制了适用于不同实验的两种电极装置:一种用于多细胞微观物质含量检测;另一种便于显微镜下实时观察,两者细胞悬浮液中均可产生理想的皮秒脉冲电场。以上细胞实验电极的研制为后期皮秒脉冲调控神经元的机理研究奠定良好工作基础。
  ④基于皮秒脉冲发生器及Cerebus多通道神经信号采集系统等实验平台,以大鼠在体运动皮层神经元为实验对象,探讨不同皮秒脉冲参数(幅值、重复频率、作用时间)对神经元电生理活动的影响,揭示了神经元动作电位的发放与施加皮秒脉冲参数的关系。
  综上所述,论文通过引入微带传输理论与渐变传输理论,设计并研制出便携式紧凑型皮秒脉冲发生器,基于同轴传输理论和MEMS制作工艺研制出多细胞电极池与单细胞微流控系统,并初步探讨了皮秒脉冲对大鼠运动皮层神经元动作电位发放的调控作用,为皮秒脉冲无创聚焦治疗脑部疾病技术提供了必要的工作基础和技术支撑。
[硕士论文] 刘伟伟
生物化工 东华大学 2016(学位年度)
摘要:血脂是血浆中的中性脂肪(甘油三酯和胆固醇)和类脂(磷脂、脂、固醇、类固醇)的总称,是细胞基础代谢的必需物质。近来,由于饮食生活不当或者缺乏锻炼造成的肥胖患者越来越多,由此引发的高血脂症受到广泛关注。常用的降脂药物主要有胆酸结合树脂、他汀类、烟酸类和苯氧芳酸衍生物。其中吉非罗齐属于苯氧芳酸类,是一种较新的血脂调节剂,其作用机理主要是抑制极低密度脂蛋白(VLDL)在肝脏的合成,增加脂蛋白脂酶的活性,促进VLDL的分解代谢,从而降低TG和低密度脂蛋白的形成。但其在细胞内对脂代谢的调控机制尚不清楚,因此我们利用模式生物酵母探究吉非罗齐在细胞内对脂类代谢的调控机制。
  吉非罗齐处理野生型酿酒酵母by4741a后,与我们预测相反,TAG含量和脂滴数目均有显著增加。然后我们逐一检测细胞中性脂代谢通路中关键基因缺失(pah1△、tgl3△、tgl4△、tgl3△tgl4△、lro1△、are1△、are2△、dga1△、dgk1△等)后吉非罗齐的升脂效应,对比发现,DGK1敲除之后细胞内TAG和脂滴数目不再受药物的影响。初步确定DGK1p可能是吉非罗齐细胞内靶向调控的酶。
  由于DGK1p调控DAG生成PA,因此进一步检测吉非罗齐对细胞PA含量的影响,结果表明其可以抑制DGK1p的活性。RT-PCR检测吉非罗齐处理显著下调DGK1的表达,并且下调依赖于转录因子TUP1和CYC8;随后,实验数据表明吉非罗齐通过 TUP1p-CYC8p与DGK1启动子-TATA-高度保守元件(-400bp—-200bp)结合起调控作用;同时,发现药物也可以通过上调具有转录抑制作用的转录因子TUP1、CYC8基因的表达,增强对DGK1基因启动子的抑制作用,从而降低DGK1基因的表达量,进而升高细胞内TAG的含量。最后,我们对pah1△背景下酵母必需基因超表达文库进行吉非罗齐耐受筛选鉴定,发现过表达NAF1、KIN28、RPL15A等能明显提高细胞的药物抗性,其中大部分与蛋白质的转录与翻译息息相关,为进一步研究吉非罗齐通过TUP1、CYC8调控DGK1对细胞内中性脂肪代谢调节机制奠定基础。
[硕士论文] 刘哲
生态学 南京师范大学 2015(学位年度)
摘要:本研究以乌龟(Chinemys reevesii)和红耳滑龟(Trachemys scripta elegans)的亚成体为模型动物,分别在16~36℃下进行的一系列实验,本文分别研究了温度对两种亚成体龟空腹状态下的体静息代谢率和运动表现的影响,以及相同温度下(28±1℃)两种亚成体龟的特殊热动力作用,并探究了上述研究内容的种间差异。
  本研究表明:⑴饥饿状态各实验温度下乌龟单位体重代谢率显著高于红耳滑龟。环境温度与两种龟亚成体静息代谢率呈正相关,不同温度下两种龟的呼吸代谢率均存在差异,其中36℃下呼吸代谢率最高,16℃下呼吸代谢率最低,32℃、36℃和28℃下的呼吸代谢率无显著差异。各实验温度下乌龟和红耳滑龟疾游速无显著差异,两种龟的游速与环境温度也没有显著的相关性。⑵用于本实验的红耳滑龟和乌龟单次摄食量分别为2.56±0.2 g和2.88±0.14g,无显著种间差异。实验结果显示:乌龟和红耳滑龟单次摄食后的呼吸代谢率存在显著差异,在摄食2h和6h后两种龟类呼吸代谢无显著差异,此后的12h、24 h、32 h,3个时间点,乌龟的呼吸代谢均高于红耳滑龟。两种龟均在摄食后6h和12h达到最大呼吸代谢率,其余时间点的呼吸代谢无显著差异。⑶乌龟和红耳滑龟单次摄食相同食物的实验中,SDA模式与其它动物类似实验的典型模式相似,单次摄食后耗氧量在一定时间内快速增长到一个峰值。而后随时间推移,耗氧量逐渐恢复到进食前的水平。单次摄食虾干的红耳滑龟和乌龟SDA达到峰值的时间分别是6h和12 h;进食后呼吸代谢的增幅分别约为2.7倍和1.8倍;SDA的持续时间分别为24 h和72 h。通过对这些数据的比较分析可以看出,不同动物即使摄食同种食物,其SDA达到峰值的时间、持续时间和耗氧量的相对增幅都存在着较为显著的差异。
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