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[硕士论文] 余今菁
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究结直肠腺癌与腺瘤性息肉患者肠道微生物群落构成变化,探索肠道菌群和结直肠腺癌发生发展间的内在关系。
  方法:选取湖北地区于武汉天佑医院和十堰太和医院消化内科就诊的结直肠腺癌、腺瘤性息肉患者及健康对照人群的粪便样本,应用Illumina Miseq高通量测序平台进行16S rRNA基因V4区测序,采用生物信息学方法分析肠道微生物群落结构、丰度与多样性的变化,筛选与结直肠腺癌发病有显著相关的微生物种属。
  结果:1、本研究最终纳入结直肠腺癌51例,腺瘤性息肉54例,健康对照组42例,组间在年龄、性别上无差异(P>0.05);
  2、测序数据质控后进行OTU分析,共得到1416个OTU,采用稀释曲线、observed species指数、chao指数、shannon指数及simpson指数等Alpha多样性指数进行分析,证实测序量足够覆盖肠道菌群种属,各组样本的丰富度和均匀度良好,随健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化,组内物种多样性呈下降趋势;
  3、在门水平上,三组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门,且样本均表现出明显的个体差异,属水平上三组共包含168个菌属,其中菌群多样性最高的菌属属于厚壁菌门,丰度最高的菌属均来自拟杆菌门;
  4、PCA分析和PCoA分析发现,在结直肠腺癌与健康对照组、腺瘤性息肉与健康对照组间均展现出组间聚类,表明疾病组与对照组间肠道菌群物种多样性存在差异;结直肠腺癌组与腺瘤性息肉组在PCA分析中未表现明显差异,两组菌群构成较为相似;
  5、样品组间菌群构成显著性差异分析发现,门水平上,变形菌门、梭杆菌门相对丰度随健康-腺瘤-腺癌的疾病发展呈升高趋势,厚壁菌门的相对丰度随疾病发展呈降低趋势,厚壁菌门/拟杆菌门比值在CRA组与CRC组中降低;在属水平上,乳杆菌属、消化链球菌属、微单胞菌属、梭菌属、弯曲菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、副球菌属、Morganella菌属、Aggregatibacter菌属、海杆菌属、拟杆菌属、紫单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、Scardovia菌属、奇异菌属、Bulleidia菌属和密螺旋体属的相对丰度在健康、腺瘤、腺癌样本中逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);而罗氏菌属、粪球菌属、Faecalibacterium菌属、Blautia菌属、Anaerostipes菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度在健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化过程中显著降低(P<0.01)。
  结论:肠道菌群与结直肠腺癌及其癌前病变的发生发展存在密切关系,Faecalibacterium菌属、罗氏菌属等丁酸盐产生菌在腺癌及腺瘤性息肉中低表达,弯曲菌属、假单胞菌属、梭形菌属等细菌的丰度变化与癌变过程呈正相关。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[博士论文] 吴苏冬
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见恶性肿瘤,发病率居世界第六,肿瘤相关死亡率居世界第三。据估计,全世界每年新诊断病例约五十万人,统计显示,发展中国家患病率较发达国家更高。早期肝细胞癌的治疗方法有外科手术切除、经皮肝穿刺消融术和肝移植等。然而,对于进展期肝细胞癌,治疗方法有限,且五年生存率极低。
  肝细胞癌的发生发展是一个非常复杂的过程,与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡及血管生成有关,涉及许多分子变化及信号通路,越来越多的证据表明,基因的异常表达或突变与肝细胞癌的发生发展及预后有关,包括癌基因(如CCND1、EGFR、c-myc和Ras等)以及抑癌基因(如p53、GSTP1、p16、RIZ1等)突变。肿瘤转移和复发是HCC预后不良的主要原因,但是HCC的发生及转移的具体机制仍未明确,因此探索其预后相关分子标记具有十分重要的意义,亦有助于为临床治疗提供更多方法。
  上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一种病理状态,指因外环境改变,抑制维持上皮细胞形态的基因,上调表达肌成纤维细胞的基因,细胞丧失原有的上皮特征,从而转变为间充质表型。在这个过程中,上皮标记减少,细胞间黏附作用下降;并出现了间充质标记,从而具备了迁移特性以及分泌功能。肿瘤细胞的EMT是肿瘤进展的主要机制之一。Twist属于原始螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族,是与胚胎发育和肿瘤转移相关的转分化程序EMT的关键诱导剂之一,在调节EMT过程中起着举足轻重的作用。从机制上讲,Twist与E-box的结合可以通过转录抑制E-cadherin的表达,从而破坏细胞间粘附并诱导单个癌细胞从原发部位播散,进一步导致间充质标志物的激活和随后诱导的细胞侵袭。
  XBP1(X-Box Binding Protein1)是一种参与内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激反应的分子,能够使细胞在不利条件下存活。XBP1被非常规的剪接机制激活,具有两种形式:剪接型XBP1s和非剪接型XBP1u,XBP1s由XBP1u经剪切后形成。XBP1u非常不稳定,而XBP1s的半衰期较长,转录活性远高于前者。已经发现XBP1蛋白在肿瘤细胞中异常高表达,但XBP1在HCC进展中的作用尚不清楚。
  我们发现HCC细胞系和组织样本中XBP1s的表达高于对照细胞和组织样本,临床病理分析表明XBP1s的表达与远处转移和预后不良密切相关,体内和体外实验也证实XBP1s的过表达促进了HCC细胞中的EMT和转移,XBP1s的沉默减弱了细胞迁移和体外EMT表型的发展,通过进一步研究发现,在HCC细胞中,XBP1s增强了Twist和Snail的表达,导致促进细胞粘附作用的E-cadherin的表达减少,阐明HCC细胞中XBP1s促进EMT的分子机制,证实XBP1s可以介导Twist的表达。
  综上所述,这项研究揭示了一个新的XBP1s/Twist/Snail通路,可以介导EMT在HCC细胞中的表达及HCC的侵袭转移。
  本课题分为四部分,研究了XBP1s在HCC细胞系与HCC组织中的表达情况,及其表达水平与HCC的预后之间的关系,探讨了该基因在促进HCC的侵袭和转移中的作用及具体机制,并提出下一步研究的方向。
  第一部分 XBP1s在HCC组织和细胞系中的表达
  研究目的:研究XBP1s在HCC细胞系和正常肝细胞之间表达的差异,进一步研究XBP1s在HCC组织及癌旁组织中的表达及其与预后的关系。研究方法:1.采用免疫印迹分析、免疫荧光分析及qRT-PCR分析XBP1s在正常肝细胞系(QZG)和四种HCC细胞系中的表达;2.采用免疫印迹分析、免疫组化及qRT-PCR分析HCC患者癌组织及癌旁组织中的XBP1s表达水平。结果:1.免疫印迹分析及qRT-PCR研究表明,所有四种人类HCC细胞系中XBP1s的表达显著高于QZG细胞(p<0.01);免疫荧光分析显示,与QZG细胞相比,XBP1s在HepG2细胞中显著增加,并且XBP1s的染色模式主要位于肝细胞的细胞核中;2.免疫印迹分析及qRT-PCR研究证实,HCC组织中XBP1s的表达显著高于癌旁组织(p<0.05);免疫组织化学显示,XBP1s主要位于肝细胞核内,XBP1s在HCC组织中的阳性表达率(79/103例,76.7%)显著高于癌旁组织(20/103例,19.4%)(p<0.05),XBP1s的过度表达与肿瘤大小(p=0.028)、肝内转移(p=0.003)和远处转移(p=0.039)密切相关,但与性别、年龄、甲胎蛋白、HBV感染无显著相关性。研究结论:XBP1s在HCC细胞中的表达量明显高于正常肝细胞系;XBP1s在临床HCC组织中的表达增加,且与远处转移有关。
  第二部分 XBP1s促进HCC细胞的侵袭和转移
  研究目的:研究XBP1s在HCC细胞的侵袭和转移中的作用。研究方法:1.采用基质胶侵袭实验测定XBP1s转染的HCC细胞SMMC-7721和HepG2的侵袭能力;2.通过细胞划痕实验,比较HepG2/XBP1s和HepG2/GFP细胞之间的细胞迁移率,分析XBP1s转染的HCC细胞的迁移能力;3.裸鼠尾静脉注射XBP1s-HepG2细胞,用空载体转染细胞作为对照,进行裸鼠体内肿瘤的转移测定。结果:1.基质胶侵袭实验显示,与空载体转染的细胞相比,XBP1s转染的HCC细胞的侵袭能力显著增加(p<0.05);2.细胞划痕实验显示,XBP1s的过表达增加HCC细胞迁移能力(p<0.05);3.裸鼠的转移实验显示,与对照组相比,注射XBP1s-HepG2细胞的裸鼠在肺中检测到的微转移病灶数目显著增多(p<0.05)。研究结论:XBP1s可增强HCC的侵袭和转移能力。
  第三部分 XBP1s促进HCC细胞的EMT
  研究目的:研究XBP1s与HCC细胞EMT的关系。研究方法:1.采用免疫印迹法分析XBP1s、上皮标记(E-cadherin,γ-catenin)和间充质标记(Vimentin)在转染XBP1s的HepG2细胞中的表达;2.采用免疫荧光染色,观察XBP1s的上调与HepG2细胞中E-cadherin,γ-catenin和Snail的表达之间的关系;3.采用免疫印迹法检测HCC组织样本中XBP1s、E-cadherin和Vimentin的表达。结果:1.免疫印迹结果显示,XBP1s过表达的细胞中间充质标记Vimentin的表达增加,而表皮细胞标志物E-cadherin和γ-catenin降低(p<0.05);2.免疫荧光结果显示,与对照细胞相比,XBP1s过表达的细胞中,间充质标记Snail的表达明显增加,而表皮细胞标志物E-cadherin和γ-catenin降低(p<0.05);3.线性分析显示,在HCC组织中,XBP1s的表达与Vimentin呈正相关(p<0.001),与E-cadherin表达呈负相关(p<0.001);进一步分析XBP1s的表达和表皮-间充质标志物的关系,在XBP1s高表达的HCC样本中,Vimentin的高表达和E-cadherin的低表达分别为66.7%和64.5%,而在XBP1s低表达的HCC样本中,Vimentin的高表达和E-cadherin的低表达仅为11.1%和18.2%,两组结果具有显著性差异(p<0.05)。研究结论:XBP1s可促进HCC细胞的EMT。
  第四部分 XBP1s通过Twist/Snail途径调控HCC细胞的EMT
  研究目的:研究XBP1s可否激活Twist/Snail通路,并进一步调控HCC细胞的EMT。研究方法:1.采用免疫荧光染色研究XBP1s在HepG2细胞中是否上调Twist表达;2.采用免疫印迹法进一步明确XBP1s是否诱导Twist及其下游基因表达;3.采用Twist启动子萤光素酶报告基因法分析XBP1s诱导的Twist转录激活;4.采用免疫印迹法进一步研究XBP1s是否通过Twist/Snail通路参与HCC细胞的EMT。结果:1.免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,XBP1s转染的HepG2细胞中Twist表达水平显著增加;2.免疫印迹结果显示,与相应的对照组相比,XBP1s转染的HepG2细胞中,XBP1s表达显著增加,同时Twist和Snail显著增加,而E-cadherin表达显著降低;而XBP1s-siRNA转染的HepG2细胞抑制Twist和Snail表达,同时上调E-cadherin表达;3.萤光素酶报告结果显示,与Twist野生型启动子载体相比,(-14至-20)突变型载体转染的HepG2细胞中的荧光素酶活性显著降低(p<0.01);4.免疫印迹结果显示,Twist siRNA可有效抑制Twist的表达,SnailsiRNA可有效抑制Snail蛋白的表达,并能部分逆转XBP1s诱导的EMT表型。研究结论:在HCC组织和肝细胞中,XBP1s通过XBP1s/Twist/Snail依赖途径诱导HCC细胞EMT,并促进HCC的侵袭和转移。
[博士论文] 孔凡扬
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:肿瘤微环境是肿瘤发育的“土壤”。缺氧是胰腺癌微环境重要的理化特征之一,在驱动肿瘤发生发展中发挥重要作用。胰腺癌血供缺乏,且间质比例高(大于90%),是造成胰腺癌细胞缺氧微环境形成的重要原因。缺氧微环境在胰腺癌细胞增殖、侵袭和转移的过程发挥重要的调节作用。其中,缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor1α,HIF-1α)是缺氧微环境最为重要的调节因子之一。HIF-1α及其下游通路已被证实参与了胰腺癌发生、侵袭、转移、新生血管形成和药物抵抗的全过程,同患者的不良预后密切相关。因此,明确HIF-1α调控胰腺癌侵袭转移相关的靶基因,探究缺氧微环境下信号通路激活的相关机制对寻找胰腺癌新的临床治疗靶点仍有重要意义。
  丝氨酸/苏氨酸激酶33(Serine/Threonine Kinase33,STK33)是钙/钙调蛋白依赖性激酶家族的成员,位于人体的11号染色体。STK33在正常人的睾丸、胎肺和心脏等组织中高表达,在肝、胃和胰腺等组织中低表达,以胞浆分布为主。研究发现STK33在肝癌、鼻咽癌、肺癌等多种癌症组织中高表达并表现出显著的癌基因特性。机制研究发现STK33具有自磷酸化功能,同时通过对下游基因(如Vimentin蛋白)的磷酸化修饰影响下游基因的生物学功能。近期研究表明肝癌中STK33可以通过非激酶活性依赖途径影响C-Myc基因的转录作用,提示STK33可以通过多种方式发挥促癌作用。另有研究发现STK33在携带KRAS突变的细胞系中特异性高表达,且抑制STK33的表达可显著抑制携带KRAS突变的肿瘤细胞的生长和侵袭能力,提示其可能是胰腺癌等KRAS突变相关肿瘤的重要治疗靶点。有文献报道缺氧诱导因子HIF-1α可以诱导KRAS信号通路的激活。课题组生物信息学分析发现STK33与HIF-1α表达密切相关,且STK33启动子区域存在多个HIF-1α结合缺氧反应原件(Hypoxia responsive element,HRE),因此我们提出科学假说:缺氧条件下HIF-1α通过转录调控STK33的表达促进胰腺癌细胞的恶性进展。
  本课题旨在研究胰腺癌中缺氧微环境中STK33的表达水平,探究STK33在胰腺癌增殖、转移和侵袭过程中的作用。本研究证实缺氧处理可显著升高胰腺癌细胞中STK33的表达水平,同时STK33在缺氧环境中受到HIF-1α的转录调控。体内体外功能研究结果表明STK33过表达可显著提高胰腺癌细胞增殖和侵袭能力,低表达STK33可显著抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力。临床组织样本分析发现STK33在胰腺癌患者组织中显著高表达,且STK33的表达水平与胰腺癌分化程度等多个病理参数及不良预后密切相关。此外,存在STK33细胞核表达为主的患者的生存期显著低于浆表达为主的患者。STK33显著的促癌作用以及密切的临床相关性,提示STK33可能是胰腺癌临床治疗的重要靶点。
  第一部分 缺氧环境下HIF-1α调控STK33在胰腺癌细胞的表达
  目的:缺氧条件下(1%O2)培养胰腺癌细胞,观察HIF-1α与STK33的蛋白的表达变化,明确HIF-1α调控STK33变化的分子机制。
  方法:使用缺氧培养箱,在缺氧(1%O2)环境中培养胰腺癌细胞,分别采用real-time PCR和Western blot的方法在0h、6h、12h、24h和48h检测STK33的mRNA以及两者的蛋白表达水平。利用不同浓度的CoCl2模拟缺氧微环境,培养24h后分别检测STK33的mRNA以及两者的蛋白表达水平。分别在胰腺癌细胞中过表达和抑制HIF-1α,检测STK33的蛋白表达变化。采用双荧光素梅报告基因和染色质免疫共沉淀实验明确HIF-1α转录调控STK33的结合位点。
  结果:缺氧(1%O2)处理胰腺癌细胞后,STK33的mRNA和蛋白表达、HIF-1α蛋白表达明显升高。CoCl2处理后的胰腺癌细胞,STK33的mRNA和蛋白表达、HIF-1α蛋白表达明显升高,且呈现浓度依赖性。胰腺癌细胞中过表达HIF-1α质粒,STK33的mRNA和蛋白表达水平均显著升高;相反,转染HIF-1α特异性siRNA可显著下调STK33的表达水平。双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀的实验结果提示HIF-1α靶向识别STK33启动子区域HRE2,激活STK33的转录。
  结论:缺氧条件下,HIF-1α转录激活STK33的表达过程。
  第二部分 缺氧诱导STK33表达对胰腺癌生物学功能的影响
  目的:研究STK33在胰腺癌增殖、转移、侵袭等生物学功能中的作用。
  方法:采用Western blot的方法检测不同胰腺癌细胞系中STK33的相对表达量。选取高表达细胞系转染STK33小干扰RNA(siRNA),选取低表达细胞系转染STK33过表达质粒。分别采用CCK8、Transwell侵袭和转移实验和划痕实验体外观察胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力的变化。在缺氧条件下(1%O2),抑制STK33的表达,观察胰腺癌细胞侵袭能力的变化。裸鼠皮下接种胰腺癌细胞,观察STK33对体内肿瘤生长过程的影响。
  结果:体内外实验结果表明过表达STK33可显著提高胰腺癌细胞增殖、转移和侵袭能力,相反,抑制STK33表达可显著降低胰腺癌细胞增殖、转移和侵袭能力。缺氧处理可显著增强胰腺癌细胞的运动侵袭能力,而缺氧环境中干扰STK33的表达可部分抑制胰腺癌细胞运动侵袭能力的提高。结论:STK33是促进胰腺癌细胞恶性生物学行为的重要调控因子。
  第三部分 STK33在胰腺癌组织中的表达及其临床意义
  目的:检测STK33在胰腺癌组织中的表达水平,分析其在判断病理分级、评价预后等方面的临床意义。
  方法:采用Western blot的方法检测5对胰腺癌与癌旁组织STK33的蛋白表达水平,以β-Actin为内参,观察差异性表达。采用免疫组织化学染色的方法检测胰腺癌组织芯片(98例))中STK33以及HIF-1α的蛋白表达水平,分析两者表达的相关性,评价HIF-1α、STK33表达量以及两者联合评估患者预后的临床价值,统计STK33与临床病理特征的相关性,研究STK33的亚细胞定位及其对临床预后的价值。
  结果:从蛋白水平观察,胰腺癌组织中STK33的表达水平显著高于癌旁组织。组织芯片免疫组织化学染色的结果显示:98例胰腺癌组织中STK33与HIF表达呈显著正相关;STK33高表达与HIF-1α高表达患者的总体生存期均低于STK33低表达与HIF低表达组,且同时高表达HIF-1α和STK33的患者生存期低于单个指标高表达的患者。临床病理特征的相关性分析提示STK33的表达水平与胰腺癌病理分化程度呈正相关。STK33在胞核和胞浆均可表达,胞核表达的患者总体生存期低于胞浆表达的患者。
  结论:STK33与HIF的蛋白表达呈正相关。胰腺癌中STK33表达水平与患者的病理分级密切相关。胰腺癌患者STK33高表达提示预后不良,且STK33的亚细胞定位也是评价患者预后的重要指标。
[博士论文] 杨丽华
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:原发性肝癌是一种全球常见的、高发的恶性消化系统肿瘤,其中肝癌所致的死亡率在中国高居第二位。根据其组织学分型,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的类型,占总数的85%-90%。对于肝癌的治疗,近阶段首选的方法依然是手术切除。尽管近年来在肝癌的诊断以及外科治疗、生物治疗等综合治疗手段方面取得了很大的进步,但患者的5年生存率仍然没有得到较大的改善,由于易复发和肝内外转移,进行放疗或化疗效果也不甚理想,因此肝癌患者的预后不容乐观。究其原因,主要是因为肿瘤细胞尤其是肿瘤干细胞的存在,在肝癌复发和异质性维持中具有重要的作用。
  肿瘤干细胞理论的提出是基于肿瘤组织中并非所有的细胞都能够无限增殖,而只有存在于其中的数量极少的细胞才能持续地进行自我更新,并能形成处于各种分化阶段的具有异质性的肿瘤细胞。BonnetD等首次报道在急性髓细胞性白血病中有肿瘤干细胞的存在,到目前为止,人们已经分离并鉴定出包括黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胶质瘤、胰腺癌等至少30多种肿瘤的干细胞。根据文献报道,肝癌中也鉴定出了肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs),鉴定的表面标志物有CD133、CD13、CD90、EpCAM、OV6或CD24等。有文献证实,肝癌干细胞是肝癌转移、复发与耐药的根源。因此寻找新的、有效的靶向肝癌干细胞的治疗靶点,对于开发针对肝癌干细胞的药物或治疗策略,最终能有效地治疗肿瘤的转移、复发和耐药以降低高死亡率,具有非常重要的科学意义和临床应用潜力。
  转录因子C/EBPβ是CEBPs(CCAAT enhancer binding proteins)家族中已发现的6种成员之一,其C端具有高度保守的bZIP结构域:包含DNA结合结构域和二聚化功能域(亮氨酸拉链),bZIP结构域可以和靶基因的启动子、增强子区域的调节序列相互作用,从而对靶基因进行表达调控。
  C/EBPβ基因mRNA存在3个转录起始位点,因此可以选择性剪接形成3个异构体,翻译形成3种蛋白质,分别为LAP1(38kDa)和LAP2(35kDa)及LIP(20kDa)。其中LAP1和LAP2既有转录激活结构域,又有DNA结合结构域,LIP只有DNA结合结构域,两者在功能上具有拮抗作用。其中LAP1是在肝脏中表达最高的亚型。
  C/EBPβ是人与啮齿动物间进化高度保守的蛋白,在机体各组织中广泛表达。该基因参与细胞增殖、分化、凋亡及机体的免疫、应激反应、能量代谢、血液生成等生命活动。C/EBPβ还参与到了肿瘤的发生与进展,近些年研究表明,C/EBPβ的表达失调可以导致多种肿瘤发生恶化,如胶质瘤、Wilm's瘤、前列腺癌、肾细胞瘤、卵巢癌等。LAP1是具有广泛功能的重要的转录因子,它参与增殖、凋亡、侵袭、EMT等细胞分子事件进而影响肿瘤的发生与发展。本课题利用生物信息学的方法,并结合临床组织样本,发现LAP1在肝癌中表达显著降低,而LAP1在肝癌发生、发展中的作用及对肝癌干细胞(LCSCs)的影响却尚不清楚。本课题结合体外、体内实验系统研究了LAP1在肝癌及肝癌干细胞中的生物学作用,并针对LAP1相关信号转导的特点,选择小分子药物MDV3100开展了初步的临床转化研究。
  本课题首先通过生物信息学的方法及对肝癌组织临床样本的检测,比较LAP1在肝癌组织与癌旁组织或正常肝组织中的表达,发现LAP1在肝癌组织中表达低;进而运用流式细胞术及悬浮成球试验,比较LAP1在CD13+肝癌干细胞与非干细胞的表达情况,结果显示肿瘤干细胞中LAP1的表达显著低于非干细胞中表达,提示LAP1可能对肝癌恶性生物学行为起到负向调控作用。
  为了进一步探讨LAP1的细胞生物学功能,本课题进一步在肝癌细胞中过表达LAP1后,利用体外和体内实验模型,系统地分析了其对肝癌干细胞进而对肝癌群体细胞的各种生物学行为的影响。首先,包装慢病毒,用慢病毒介导的方法建立稳定过表达LAP1及GFP对照质粒的肝癌细胞系Huh7和CLC13,在体外进行悬浮成球实验分析过表达LAP1对成球率的影响,并利用流式细胞术和qPCR分析过表达LAP1对干性标志表达的影响,结果提示过表达LAP1可以抑制肝癌细胞的成球能力、下调肝癌干细胞的比例、以及肝癌干细胞标志物的表达水平;同时,开展了CCK8增殖实验、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验分析过表达LAP1对肝癌细胞的影响,并分析过表达LAP1对细胞周期、细胞凋亡的影响,结果提示LAP1过表达能显著抑制肝癌细胞的增殖能力、迁移能力与侵袭能力,并且诱发细胞周期阻滞;最后进行裸鼠成瘤实验,观察并分析过表达LAP1对肝癌细胞小鼠体内成瘤性和肿瘤生长的影响,结果提示LAP1过表达降低了肝癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力:皮下成瘤的数目、体积和重量均较对照组低,同时LAP1过表达降低瘤体干性标志物CD13、CD133及EpCAM的表达,同时显著降低增殖标志物Ki67的表达。
  细胞功能研究表明,LAP1表现出显著的肿瘤生物学功能的抑制作用,并参与肝癌干细胞的干性调控。诸多结果均提示LAP1可以作为肝癌治疗的有效靶标,基因治疗存在着很大的风险,临床应用还有很多挑战,因此筛选出可上调LAP1的小分子药物,具有更大的临床转化应用的潜力。有研究表明,雄激素受体对LAP1具有负向调控作用,而雄激素受体的表达与肝癌的预后具有相关性,这就提示通过抑制雄激素受体上调LAP1的表达在肝癌治疗中具有潜在应用价值。雄激素受体拮抗剂MDV3100是雄激素受体高度选择性拮抗剂,在前列腺癌的内分泌治疗中应用广泛。
  本课题进一步开展了雄激素受体拮抗剂MDV3100对肝癌治疗的初步研究,促进LAP1成为肝癌治疗靶标的转化应用。在肝癌细胞中,加入不同浓度的MDV3100,检测其对细胞活力的影响,结果显示MDV3100可降低肝癌细胞的活性;然后对不同MDV3100作用浓度处理后的肝癌细胞进行qPCR及WB检测,发现MDV3100可使LAP1的表达升高同时衰老标志物P53、P21、P16的表达也升高;结合经MDV3100处理后细胞形态上的体积增大及对衰老相关的β-半乳糖苷酶表达的比较而发现的SA-β-Gal染色阳性的明显增强,可初步判断出MDV3100可使肝癌细胞发生衰老;另外,对不同MDV3100作用浓度处理后的细胞进行细胞周期检测,发现MDV3100可抑制肝癌细胞的细胞周期。综上,MDV3100可通过上调LAP1诱导肝癌细胞发生衰老进而抑制肿瘤,因而LAP1可能可以作为肝癌治疗的新靶点,希望通过本课题的实施为肝癌的诊疗提供新的思路和可行方法。
  结论:
  本研究发现C/EBPβ在肝癌及肝癌干细胞中低表达;C/EBPβ的最主要且在肝脏中表达量最高的亚型LAP1能抑制肝癌干细胞的干性特征并能抑制肝癌的进展,其机制有待进一步研究;雄激素受体拮抗剂MDV3100可通过上调LAP1诱导肝癌细胞衰老,进而抑制肿瘤的发展。这些研究结果丰富了关于LAP1功能的认识,并提示LAP1具有作为肝癌治疗新靶点的可能性。
[博士论文] 汪超
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor2,HER2)是一种酪氨酸激酶受体,该受体在多种类型的肿瘤中过表达,HER2过表达与患者的不良预后密切相关。曲妥珠单抗(Trastuzumab,Herceptin)是一株靶向HER2胞外段结构域Ⅳ区的人源化抗体,已获美国食品及药物管理局(FDA)批准用于HER2高表达的乳腺癌及胃癌的临床治疗。然而,随后的研究发现,大部分HER2高表达乳腺癌患者对Trastuzumab不产生反应(即原发性Trastuzumab耐药),初期对Trastuzumab产生反应的患者有半数也会在1年内产生耐药(即获得性Trastuzumab耐药)。在胃癌的治疗中同样存在这一情况。
  帕妥珠单抗(Pertuzumab)是另一株靶向HER2胞外段结构域Ⅱ区的人源化抗体。Trastuzumab和Pertuzumab具有协同的抗肿瘤作用,故二者联合用药被FDA批准为一线治疗方案。尽管临床试验证实Trastuzumab和Pertuzumab的联合用药能部分克服Trastuzumab耐药,但仍存在客观反应率及完全反应率低的问题。因此,克服Trastuzumab的原发性及获得性耐药问题仍是基础研究和临床治疗的迫切需求。
  原发性Trastuzumab耐药与获得性Trastuzumab耐药在发生机制上并不相同,在治疗方案上也应区别对待。前期研究中,课题组通过噬菌体展示技术筛选得到一株新的抗HER2全人源单克隆抗体H2-18,该抗体与HER2的胞外段结构域Ⅰ区特异性结合,可通过诱导细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)的方式克服原发性Trastuzumab耐药。本课题中,一方面研究了H2-18在获得性Trastuzumab耐药细胞中的抗肿瘤作用,另一方面研究了H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用在胃癌中的抗肿瘤作用。
  一、H2-18在获得性Trastuzumab耐药细胞中的抗肿瘤作用
  将一株Trastuzumab敏感胃癌细胞株NCI-N87培育成获得性Trastuzumab耐药细胞株NCI-N87-TraRT。鉴于H2-18克服Trastuzumab原发性耐药的机制在于有效诱导细胞发生PCD,首先通过AnnexinⅤ与PI双染检测药物处理后细胞的死亡情况。结果发现,在NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞中,H2-18均能显著的诱导细胞PCD,呈浓度依赖性,而其他抗体均不能产生这种作用。相比NCI-N87细胞,在NCI-N87-TraRT细胞中H2-18能诱导更高比率的PCD。在BT-474与BT-474TraR细胞中也得到了相同的结果。随后,通过增殖抑制实验检测药物对NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞的体外增殖抑制活性。结果发现,H2-18对两株细胞的增殖抑制作用并无差异。在NCI-N87细胞中,H2-18的增殖抑制作用弱于Trastuzumab单用,而在NCI-N87-TraRT细胞中,H2-18的增殖抑制作用超过了Trastuzumab的单用。进一步通过裸鼠皮下移植瘤模型对药物的体内抗肿瘤作用进行研究,结果发现,在NCI-N87细胞肿瘤模型中,H2-18的抑制肿瘤生长作用与Trastuzumab单用相近,但弱于Trastuzumab与Pertuzumab的联用,而在NCI-N87-TraRT移植瘤模型中,H2-18的抑制肿瘤生长作用远强于Trastuzumab的单用,并优于Trastuzumab与Pertuzumab的联用。为了探讨H2-18在获得性Trastuzumab耐药细胞中的抗肿瘤作用机制,使用蛋白印迹法检测药物对NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞HER2下游信号通路的作用。结果发现,在NCI-N87细胞中,H2-18对HER3、AKT、ERK的磷酸化能产生抑制作用,而在NCI-N87-TraRT细胞中,H2-18对HER3、AKT、ERK的磷酸化的作用微乎其微。进一步的研究发现,在两株细胞中,H2-18均能引起细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的升高,同时伴JNK与c-jun磷酸化的上调,而当使用ROS清除剂或使用SiRNA沉默JNK、c-jun后,H2-18诱导的细胞PCD均明显下降。因此,推测在获得性Trastuzumab耐药细胞中,H2-18仍可通过RIP1-ROS-JNK-c-jun通路有效诱导细胞的死亡,进而克服Trastuzumab的获得性耐药。
  二、H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用在胃癌中的抗肿瘤作用
  首先通过蛋白印迹法及流式法对多株胃癌细胞HER2表达情况进行检测。结果发现,只有在NCI-N87细胞株以及本实验室自行培育的NCI-N87-TraRT细胞株中存在HER2的高表达。通过增殖抑制实验检测药物联用对胃癌细胞的体外增殖抑制活性。结果发现,在HER2高表达的NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞中,Trastuzumab与Pertuzumab联用的增殖抑制作用要强于Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18各自的单用,而Trastuzumab与H2-18联用的增殖抑制作用超过了Trastuzumab与Pertuzumab联用,H2-18、Trastuzumab、Pertuzumab三者的联用表现出最强的抑制活性。用CompuSynsoware软件拟合之后发现H2-18与Trastuzumab联用或H2-18、Trastuzumab、Pertuzumab三者联用均具有协同的抗肿瘤作用。而在HER2低表达的胃癌细胞中,均未发现这一这结果。进一步使用平板克隆实验检测药物联用对细胞增殖能力的作用。结果发现,在NCI-N87细胞中,H2-18与Trastuzumab联用较Trastuzumab与Pertuzumab联用对克隆形成都有一定的抑制作用且作用效果相近,在NCI-N87-RraRT细胞中,H2-18与Trastuzumab联用对克隆形成的抑制作用超过了Trastuzumab与Pertuzumab联用,而在两株细胞中,Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18联用均表现出最强的克隆形成抑制作用。同样通过裸鼠皮下移植瘤模型对药物联用的体内抗肿瘤作用进行研究。结果发现,在两株细胞移植瘤模型中,H2-18与Trastuzumab联用对裸鼠皮下移植瘤抑制作用均超过了Trastuzumab与Pertuzumab联用,Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18三者联用同样表现出最强的肿瘤抑制作用。进一步的研究发现,在胃癌细胞中,抗体联用组对HER3、AKT、ERK磷酸化的抑制要强于各抗体的单用,H2-18与Trastuzumab联用较Trastuzumab与Pertuzumab联用对HER3、ERK、AKT磷酸化的抑制作用相近,Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18三者联用对HER3、AKT、ERK的磷酸化表现出最强的抑制作用。更重要的是H2-18单用或是H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用均能引起细胞PCD,同时伴ROS升高以及JNK、c-jun磷酸化的上调,而Trastuzumab与Pertuzumab的单用或是联用均不能引起ROS-JNK-c-jun通路的改变。因此,推断H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用均具有协同抗肿瘤作用的机制在于同时抑制胃癌细胞下游PI3K/AKT及RAS/MAPK信号传导通路以及H2-18通过HER2胞外Ⅰ区有效诱导细胞PCD。
  综上所述,H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用在Trastuzumab耐药的胃癌中均展现出良好的体内外抗肿瘤作用,提示这样的药物组合有望成为克服Trastuzumab耐药的新型方案。
[博士论文] 王田田
遗传学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),作为肝癌恶性肿瘤的一类,是中国发生率高且危害极大的恶性肿瘤之一。研究表明,肝内转移是肝癌的首要转移位点,也是肝癌致死的首要原因。目前对肝癌细胞的肝内转移过程虽有所了解,但是研究尚不深入,尚无有效治疗靶点和药物阻断肝癌肝内转移过程。因此需要进一步明确肝癌细胞肝内转移过程中的关键分子及其作用机制。
  除了自身抑癌或促癌基因的改变外,细胞与他们赖以生存的微环境之间的相互作用对于正常组织内稳态以及肿瘤组织的生长都是至关重要的。特别是肿瘤细胞与相关间质之间的相互作用形成了一个强大的关系网,可影响肿瘤的发生、进展和预后。肿瘤的转移是一个复杂的、多步骤、多因素参与的过程,包括原发肿瘤的形成、原发灶肿瘤细胞的局部侵袭,肿瘤细胞内渗入血管和淋巴管,在血管和淋巴管中的生存,外渗出血管和淋巴管,在远端定植灶的存活。肿瘤转移过程中,肿瘤的微环境发挥了重要的作用,其中包括肿瘤低氧环境、肿瘤相关的巨噬细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、肿瘤相关的成纤维细胞以及内皮细胞等。任何肿瘤转移的最终结局都是在远端定植灶上形成新的肿瘤,肿瘤是如何在远端定植灶的存活和再生这个问题一直是科学家想攻克的难题。为了研究肿瘤转移过程的最终阶段-在远端定植灶的存活,筛选出能够高定植的细胞显得尤为重要。
  为了研究肝癌转移过程的最终阶段-在远端定植灶的存活,构建了脾脏注射-肝定植(转移)模型,利用该模型筛选获得了一系列的高定植(转移)能力的肝癌细胞株。利用表达谱芯片检测,根据P值<0.05,差异倍数≥5倍,筛选到64条在高定植细胞中差异表达的mRNA。进一步在更多的高定植细胞中验证,以确保在除了芯片中的两株细胞以外至少还有另外两株高定植细胞表达符合差异基因的表达结果,以此筛选到31条基因,其中上调表达基因17条、下调表达基因14条。根据与肝癌临床病人预后之间的关系,最终筛选到SLC38A4、GJA1在高定植细胞株中普遍存在差异表达,在多个队列的肝癌组织样本中也存在差异表达,并且与肝癌病人的高复发率、差的预后相关。
  发现SLC38A4不仅在肝癌组织样本中下调表达并且随着肝癌的进展表达量逐渐降低,在肝脏发育过程中还呈现逐渐上调表达的趋势,且与肝癌病人的预后呈正相关,即肝癌病人SLC38A4含量越高,病人的预后情况越好。又对SLC38A4的临床预后进行研究,发现SLC38A4的表达情况与肝癌病人的肿瘤大小、TNM分期、BCLC分期、肿瘤转移以及血清AFP含量相关。随后进行了SLC38A4的生物学功能研究,干性球形成实验证实干扰SLC38A4增强肝癌细胞的干性能力;CCK8、乙炔脱氧尿甘结合染色(EDU)细胞增殖实验以及细胞周期检测证实干扰SLC38A4促进肝癌细胞增殖;划痕实验以及transwell实验证实干扰SLC38A4可以促进肝癌细胞的迁移、侵袭;裸鼠体内皮下荷瘤实验证实干扰SLC38A4促进肿瘤的增殖。上述结果证明SLC38A4为抑癌基因,干扰SLC38A4在体内体外条件下都可以促进肝癌的进展。Western blot结果显示干扰SLC38A4可以增加ERK和AKT磷酸化水平,表明干扰SLC38A4可以使肿瘤中的MAPK信号通路及PI3K/AKT信号通路活化,促进肝癌的进展和转移。
  对GJA1进行了研究,发现GJA1在高定植细胞中普遍高表达,在多个队列的肝癌组织中也是高表达,并且与肝癌病人的高复发率、差的预后呈正相关。裸鼠脾脏注射-肝定植体内实验证实,GJA1能够增强肝癌细胞的肝内定植能力。对过表达GJA1的细胞进行了体外功能学实验,CCK8、克隆形成、EDU检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,transwell实验以及细胞划痕实验检测细胞迁移侵袭能力,发现过表达GJA1对细胞本身的增殖能力、迁移侵袭能力没有统计学意义的影响。为了探究高定植肝癌细胞株高定植的原因,对高定植肝癌细胞株进行裸鼠皮下荷瘤,发现体内情况下高定植细胞株所形成的肿瘤增殖更快,有更强的血管形成能力。将过表达GJA1的细胞进行裸鼠皮下荷瘤,CD31、CD34染色显示过表达GJA1细胞形成的皮下荷瘤有更高的血管密度。为了探究GJA1对血管形成的影响,用过表达GJA1细胞及对照组细胞的条件培养基刺激脐静脉内皮细胞(HUVEC)发现小管形成并无差异性改变。由于GJA1可以使两种细胞之间形成缝隙连接(gap junction),使其相互之间传递物质,猜测过表达GJA1的细胞可能和HUVEC通过直接接触后形成缝隙连接促进小管的形成,于是将过表达GJA1及对照的肝癌细胞与HUVEC进行共培养,检测到过表达GJA1细胞相对于对照细胞与HUVEC共培养后形成小管能力增强。
  综上所述,对肝癌转移过程中的最终环节-在定植灶中的存活进行了研究,发现在肝癌转移晚期即在定植灶的存活阶段时,肿瘤细胞中的基因SLC38A4以及GJA1在其中发挥了重要的作用。该项研究为进一步理解肝癌转移进程中肿瘤本身因素及微环境因素发挥的作用提供了新鲜的思路和视角,为肝癌的转移提供了潜在预防及诊疗靶点。
[硕士论文] 王瑜
外科学(普通外科学) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  在中国胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,在新增的胃癌患者中90%以上为进展期。对于此类患者,外科手术常难以获得根治性效果,因此,临床开展胃癌新辅助化疗,对于提高手术根治率、提高可切除率以及延长患者生存时间具有重要意义。然而,患者对化疗药物存在个体差异,甚至有部分患者化疗形成耐药后,肿瘤会形成报复性生长。是什么导致肿瘤呈现报复性生长?
  众多研究表明,衰老是凋亡、自噬之外细胞对于化疗介导DNA损伤反应的一种重要应答形式。通过新辅助化疗的人体内标本研究发现,胃癌新辅助化疗后很大一部分细胞发生衰老。因此,对化疗介导的DNA损伤诱导衰老这重要临床现象进行深入研究,对于提高临床化疗效果具有重要意义。化疗介导衰老细胞的产生,将对化疗本身产生两方面重要影响。首先,该群细胞本身处于不可逆的G0期,因此对放、化疗的反应性极低而难以被彻底清除,成为耐药与复发的重要来源;其次,该群细胞还维持活跃的生理学特性,其重要要特征是持续不断分泌大量生物生物活性物质,如IL-6、IL-8、IL-1α/β、MMPs以及相关生长因子等,即衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)。
  科室前期使用以紫杉醇类药物为基础的联合方案对胃癌患者进行新辅助化疗,化疗无效组胃癌组织IL-6表达水平显著高于有效组,说明由化疗介导的胃癌组织SASP相关因子IL-6与化疗不敏感密切相关。提示:SASP在胃癌新辅助化疗耐药过程中发挥了重要作用。那么SASP和肿瘤的报复性生长是否存在一定的联系?
  如果SASP和肿瘤报复性生长存在联系,那么它是通过什么机制产生的呢?近年来,有研究表明固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)在多种肿瘤中过表达,提示肿瘤细胞的快速增殖和脂类的快速合成具有密切相关性,抑制SREBPs表达可以显著抑制肿瘤细胞生长。SREBPs转录因子家族成员包括SREBP1和SREBP2。前者在非饱和脂肪酸和甘油三酯合成中起主要调节作用,而后者在调节胆固醇内环境稳态中起关键作用,它是调节脂类平衡的主要转录因子。SREBPs调控多种脂类合成相关基因的表达,如在人胶质母细胞瘤中SREBP1上调并促进及其下游靶基因ACC和FASN的表达;此外,在去年2月,Ayano Kondo等在Cell Reports上发表论文指出,细胞外H+通过激活SREBP2上调胆固醇合成相关酶基因如:IDI1、MSMO1、INSIG1的表达,促进胰腺癌进展。因此,推测SASP可能通过激活SREBP2来促进胃癌细胞增殖,从而促进肿瘤进展。
  方法:
  在科室前期研究基础上,提出如下科学假设:新辅助化疗药物紫杉醇能够诱导胃癌细胞发生衰老,衰老胃癌细胞通过分泌SASP激活SREBP2促进未衰老的肿瘤细胞增殖。
  (化疗→细胞衰老→SASP→SREBP2专细胞增殖)
  具体研究分两部分进行:一、现象验证,即SASP促进胃癌细胞增殖;二、机制研究即SASP通过激活SREBP2促进细胞增殖。
  一、现象验证
  体外实验方法利用紫杉醇(paclixel,PTX)处理BGC823细胞构建衰老细胞模型,使用β-半乳糖苷酶染色证实衰老细胞模型的建立;ELISA检测SASP-CM中主要的SASP因子的浓度;CCK8比色法及细胞克隆形成实验检测SASP-CM对BGC823细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。所获得BGC823细胞培养上清,即胃癌衰老细胞相关分泌表型条件培养基(senescence-associated secretory phenotype conditioned medium group,SASP-CM),以不加PTX处理的BGC823细胞培养上清为肿瘤细胞条件培养基组(control condition medium group,CTR-CM组)和正常培养基组(normal medium group,NOR-CM组)为对照,共计3组实验。
  体内实验方法裸鼠皮下成瘤实验分2组,即实验组:5周龄雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接种200μL等比例胃癌衰老细胞和正常肿瘤细胞混合悬液(5×107/mL)。对照组:5周龄雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接种200μL正常肿瘤细胞悬液(5×107/mL),观察成瘤大小。
  结果PTX35nmol/L诱导BGC823细胞72h可建立稳定的细胞衰老模型,此条件下衰老细胞比例最高(66.95±3.54)%。SASP-CM中主要SASP因子IL-6、IL-8、CXCL1、CCL2、INF-γ浓度均高于CTR-CM。SASP-CM组细胞的相对克隆形成率高于CTR-CM组(P<0.001)和NOR-CM组(P<0.05)。48、72、96h时SASP-CM组细胞的增殖活性高于CTR-CM组和NOR-CM组(P<0.05)。SASP-CM组的S期细胞比例高于CTR-CM组和NOR-CM组(P<0.01),细胞凋亡率各组间差异无统计学意义。裸鼠皮下成瘤实验实验组瘤体重量、体积显著高于对照组(P<0.01)。
  二、机制研究
  1、用SASP-CM和CTR-CM培养BC823细胞72h后,提取总RNA做基因表达谱分析,并根据差异表达基因做GO分析。2、SREBP2是胆固醇合成通路中关键转录因子,因此,通过qRT-PCR验证SREBP2及其靶基因表达,免疫荧光及WB证实SREBP2激活。3、用siRNA干扰SREBP2表达,并利用qRT-PCR、验证干扰效果,然后用SASP-CM培养SREBP2干扰和未干扰的BC823细胞,cck8检测细胞增殖活性。
  结果:
  1、通过基因表达谱分析发现:衰老细胞条件培养基能够促进BGC-823细胞胆固醇合成通路中相关酶表达;2、胆固醇合成通路中关键转录因子SREBP2及其靶基因IDI1,MSMO1,INSIG1mRNA表达水平显著上调;衰老细胞条件培养基导致SREBP2激活并发生核转移;3、siRNA干扰SREBP2表达能够降低衰老细胞条件培养基促进BGC-823细胞增殖的能力。
  结论:
  新辅助化疗药物紫杉醇能诱导胃癌细胞发生衰老,衰老的胃癌细胞通过衰老相关分泌表型激活SREBP2促进未衰老的胃癌细胞增殖。
[博士论文] 虞淦军
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)是全球第三大常见的恶性肿瘤,全球每年新发病例数约为140万例,其发病率在男性及女性中均处于恶性实体肿瘤的第3位,癌症相关死亡原因已分别上升至第2位和第3位。近年来,结直肠癌的发病率不断上升,而中国的上升速度是国际平均增速(2%)的2倍,尤其在上海等东南沿海发达城市,发病率达到实体肿瘤的第二位,严重威胁着人类的健康和生活质量。肠癌发病隐匿,相当一部分患者在首次就诊确诊时已经发生远处转移。目前对于晚期结直肠癌患者而言,姑息手术、新辅助放化疗以及靶向药物的应用是主要治疗手段,但又由于患者间个体差异和耐药性的出现等,晚期结直肠癌的疗效和预后不够理想。
  近年来,肿瘤的免疫治疗越来越受到关注。2012年,被Science杂志评为未来值得关注的六大领域之一;2013年,又被Science杂志评为“年度十大进展之首”;并连续成为2015、2016年全球肿瘤研究顶级盛会——美国临床肿瘤学会(ASCO)热点中的焦点,当仁不让的成为了会议的主旋律。Topalian博士因其在PD-1和PD-L1免疫治疗研究的突出贡献,被授予2015年“David A.Karno fsky Memorial Award”(ASCO最重要的奖项)。目前,大量的基础和临床研究已经聚焦肿瘤免疫治疗。
  结直肠癌患者也从免疫治疗中看到了希望,尤其是错配修复基因缺陷(Mismatch repair deficiency,dMMR)的CRC患者,对PD-1单抗药物的敏感性比微卫星稳定性(Microsatellite stability,MSS)患者显著提高。微卫星不稳定(Microsatellite instability,MSI)是结直肠癌发病的重要原因之一。它是指MSH2、MSH6、MLH1、PMS1和PMS2等错配修复基因发生突变导致DNA重复序列(微卫星)的增加或缺失,进而引起肿瘤的发生。由于微卫星序列突变累积,蛋白质翻译过程中发生框移突变,导致肿瘤细胞产生了大量异常的多肽片段,这些片段更容易被免疫系统所识别,激发机体的抗肿瘤免疫应答反应,这也是微卫星不稳定患者对PD-1单抗敏感的主要原因。微卫星不稳定性在散发性结直肠癌中的发生频率大约仅为15%。但是对于大部分微卫星稳定性的结直肠癌患者而言,PD-1单抗难以取得显著的疗效,如何提高这部分患者的疗效成为结直肠癌治疗的重大问题。
  地西他滨(5-aza-2'-deoxynucleoside,DAC)是一种腺苷类似物,通过抑制DNA甲基转移酶,降低DNA的甲基化水平,从而抑制肿瘤细胞的增殖,是作用能力较强的DNA甲基化特异性抑制剂,已经广泛应用于骨髓增生异常综合征、急性白血病的治疗,作为甲基化抑制剂也在实体瘤中被广泛研究。研究证明,低剂量DAC不仅可以明显诱导和提高肿瘤抗原的表达,如NY-ESO-1、MAGE-A3/6等,还能提高CD80、MHC-I类分子等免疫标志物的表达,进而增加肿瘤局部免疫细胞的浸润,为免疫检查点抑制剂、治疗性疫苗、过继性细胞治疗等免疫疗法提供了更加适合的免疫微环境。
  本课题旨在研究低剂量DAC对肿瘤生物学特征、免疫原性的影响以及对肿瘤微环境的作用及其机制,探讨其与PD-1单抗、NY-ESO-1特异性TCR-T细胞等免疫治疗的协同效应,为MSS结直肠癌的临床治疗提供新的策略和科学依据。
  本研究主要分为三个部分:
  第一部分:低剂量地西他滨对肿瘤的表观修饰作用研究
  DNA甲基化是一种不改变基因碱基序列的可逆的基因修饰,其甲基化水平与基因的“开放”状态密切相关。
  为了探究DAC对不同微卫星状态的CRC细胞的影响,选取了两株MSI细胞HCT116、LOVO和两株MSS细胞HT29、SW480,用0μM、0.1μM、1μM、10μM等不同浓度的DAC进行处理,在处理后的不同时间点(第1天,第3天,第7天)收集了肿瘤细胞的总RNA、DNA和蛋白质,通过qPCR、Western Blot等技术检测了细胞中NY-ESO-1抗原mRNA和蛋白的表达水平,并通过甲基化测序检测了基因组DNA中NY-ESO-1启动子区的甲基化情况。
  通过第一部分的研究,证实了小鼠微卫星稳定性肠癌细胞系CT26细胞经过低剂量DAC处理后,其基因组甲基化水平明显下调,重新激活或上调了大量功能基因的表达,改变了肿瘤的免疫学特征,提高了其免疫原性。在PDX肿瘤模型中,这一现象得到了再次验证。该部分研究结果为下一步的研究提供了理论依据。
  第二部分:低剂量地西他滨对肿瘤微环境的作用研究
  影响免疫治疗在实体瘤中疗效的主要问题是肿瘤抑制性的免疫微环境。如何打破和重塑肿瘤微环境,激发机体的抗肿瘤免疫应答是实体瘤治疗取得突破的关键。肿瘤微环境中的免疫微环境决定了免疫治疗的有效性,而免疫相关分子的表达及细胞的浸润是肿瘤微环境的关键组成。
  通过第二部分的研究,发现了低剂量DAC可以重塑肿瘤微环境,召募更多的T淋巴细胞,包括CD4+T细胞、CD8+T细胞,浸润到肿瘤局部,且大部分细胞分泌高水平的IFN-γ,但是这些细胞大部分是PD-1阳性的,其功能可能通过PD-1/PD-L1通路被抑制。
  第三部分:地西他滨为基础的协同免疫治疗策略的研究
  一、地西他滨与PD-1抑制剂协同性治疗策略研究
  研究证明,PD-1单抗对于MSS肿瘤基本上是无效的。通过前面两部分的研究,发现低剂量DAC可以改变肿瘤的免疫学特征,提高其免疫原性,且能够召募大量的T淋巴细胞浸润到肿瘤局部,从而有可能对肿瘤微环境进行重塑。但是这部分浸润到肿瘤局部的T淋巴细胞大部分为PD-1阳性,因此紧接着联合应用PD-1单抗,探讨协同效应提高疗效的可能性。
  在这一部分中,首先选取CT-26小鼠肠癌细胞构建了MSS的荷瘤小鼠模型,给予了DAC+PD-1单抗联合用药的治疗方法,将PBS、PD-1单抗单药、DAC单药治疗作为对照组,探讨了DAC与PD-1单抗协同治疗的疗效。结果显示,DAC+PD-1单抗组与PD-1单抗组、DAC单药组相比,对肿瘤生长具有明显的抑制作用,延长小鼠生存期的效应也更加显著。
  二、地西他滨与TCR-T细胞治疗协同性治疗策略研究
  在第一部分中,证实了DAC可以诱导和提高MSS肿瘤细胞NY-ESO-1抗原的表达,而肿瘤抗原的表达直接决定着特异性细胞免疫治疗的效应。因此,探索了将DAC与NY-ESO-1特异性的T细胞进行协同治疗的疗效。首先,从文献和数据库中获得了NY-ESO-1157-165(SLLMWITQC)特异性TCRα/β基因序列,将α链95-96位的TS突变为LY,以提高其抗原特异性杀伤功能;另外,将旺链的Thr48和β链的Ser57突变成Cys,有利于形成二硫键,提高其与外源基因的匹配成功率。
  通过本部分的研究,通过将DAC分别与两种免疫治疗方法PD-1单抗、NY-ESO-1特异性TCR-T细胞联合应用,通过体内外实验,证实了DAC可以提高PD-1单抗、NY-ESO-1特异性TCR-T细胞的免疫治疗的疗效,对MSS肿瘤发挥了协同治疗效应,为MSS肿瘤患者提供了新的治疗策略和依据。同时,DAC特异性诱导肿瘤细胞表达NY-ESO-1等多种肿瘤抗原,为治疗性疫苗、TCR-T细胞等以抗原为基础的免疫治疗提供了更多的靶点,以DAC为基础的协同免疫治疗有望显著提高实体肿瘤患者的临床疗效。
  全文结果与结论:
  1、低剂量DAC可以显著降低小鼠结直肠癌细胞CT26细胞以及人MSS性CRC的PDX模型肿瘤细胞基因组甲基化水平,提高结直肠癌细胞中抗原加工递呈、细胞因子等基因的表达水平。低剂量DAC能够通过靶基因启动子区的去甲基化作用,诱导和提高MSI-H以及MSS性CRC细胞中NY-ESO-1抗原的表达。说明低剂量DAC改变了CRC细胞的免疫学特性,提高了其免疫原性。
  2、经过低剂量DAC处理后的CRC肿瘤可以招募更多的CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润到肿瘤局部,具有更多的高分泌IFN-γ的细胞。这些浸润的T淋巴细胞大多呈现PD-1阳性。说明低剂量DAC改变了CRC的肿瘤微环境,但是其状态可能通过PD/PD-L1通路被抑制。
  3、低剂量DAC与PD-1单抗联合应用可以显著抑制小鼠体内CRC肿瘤CT26的生长,并延长小鼠的生存期。说明低剂量DAC为PD-1单抗疗效的发挥提供了良好的肿瘤微环境,而PD-1单抗再次激活了肿瘤微环境中被PD-1/PD-L1通路抑制的T淋巴细胞,发挥抗肿瘤效应。DAC和PD-1单抗能够发挥协同性作用,提高抗肿瘤疗效。
  4、通过慢病毒转染人外周血T淋巴细胞,成功制备了NY-ESO-1特异性TCR-T细胞,并在体内外进行了功能验证。所制备的TCR-T细胞对HLA-A2限制性的NY-ESO-1阳性肿瘤具有良好的特异性识别和杀伤能力。
  5、低剂量DAC的预处理可以提高MSS性结直肠癌细胞中NY-ESO-1抗原的表达水平,与TCR-T细胞联合应用可以明显抑制肿瘤生长,延长小鼠生存期。说明低剂量DAC对肿瘤细胞的诱导为TCR-T细胞发挥抗肿瘤效应提供更多的靶点,提高TCR-T细胞治疗的疗效,两者具有协同作用。
[博士论文] 方征
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胆囊癌(gallbladder carcinoma,GBC)是胆道系统中一种发病率较高的恶性肿瘤,在胆道系统恶性肿瘤中占于首位,在消化系统恶性肿瘤中占第五位。但随着流行病学调查、研究的不断深入,近年来发病率亦出现了逐年上升的趋势。胆囊癌发病初期较隐匿,潜伏期长,早期诊断困难,往往发生在胆囊结石合并胆囊炎而行胆囊切除术时发现的“意外胆囊癌”,而无明显的临床表现。再加上手术方式尚不固定,很多意外胆囊癌行经腹腔镜胆囊切除术而导致早期腹腔内广泛转移亦不为少数。而且,对不能手术者或术后复发或转移者,药物化学性治疗以及放射治疗,效果均不十分理想。因此,此种疾病越来越得到大家的重视,胆囊结石,胆囊炎至胆囊癌的“炎癌转变”亦受到大家关注。对于胆囊癌发病的具体分子机制尚不特别明确,以及耐药性强的特点,多种基因、信号转导通路的研究都在广泛的进行中,如Nakamura报道的EGFR、ERBB3和PTEN在胆囊癌中的发生了突变,以及针对HER2、VEGF、PI3k/PTEN、AKT/mTOR、FGFR、IDH、MEK/ERK和多激酶途径的药物或抑制剂的实验的实施。但是,目前仍无关于胆囊癌的发生发展的具体分子机制及靶向治疗的报道。
  同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)是一种十分重要的癌症监护基因,亦被认为是仅次于P53的第二大的肿瘤抑制性基因。PTEN编码的蛋白质能够抑制PI3K/Akt、MAPK、FRAP/mTOR、NF-κB等信号传导通路,参与调节细胞生长、代谢、维持内环境稳态等多种生命活动,其功能和表达的异常与人类多种恶性肿瘤的发生、发展有密切相关性。PTEN可以通过干扰细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、阻碍肿瘤的侵袭和转移、维持免疫稳态等一系列进程,完成其强大的抑癌作用。在胆囊癌中,PTEN在其发生、发展等系列过程中也起着十分重要的作用。PTEN的缺失与胆囊癌,特别是胆囊腺癌的临床、病理、预后之间的关系密切相关,但分子机制尚不明确。此文中,进一步探究PTEN在胆囊癌发生发展中的作用以及发挥功能的具体分子机制,为胆囊癌的临床分子的靶向治疗策略提供潜在的干预靶点和新的思路。
  方法:
  1.本研究获取了2010年1月到2016年12月海军军医大学附属东方肝胆外科医院收治的胆囊癌患者,收集了经过根治性治疗并经术后病理诊断为胆囊癌的患者的临床病理资料。共350例患者纳入了此项研究。所有患者均常规接受了术前的系列相关检查,均予以行胆囊根治性切除性手术。临床胆囊癌TNM(Tumor node metastasis,TNM)分期(2017)均根据AJCC(American Joint Committee on Cancer)(美国癌症联合委员会)(第八版)标准。该组患者均根据标准随访流程进行随访。总体生存时间是本次研究的终点。分类变量用例数(百分数)表示,组间比较应用x2检验,Yates'校正检验或者Fisher's精确检验。连续型变量用中位值(四分位数)进行表示,组间差异性比较,应用t检验或者Mann-Whitney U检验。采用Kaplan-Meier法,来估计,这组患者术后的总体生存率。采用Log-Rank检验的方法,比较生存分布之间差异。采用COX等比例风险回归模型,探索了影响了胆囊癌患者的术后复发以及总体生存率的独立的危险因素。利用SPSS19.0和R软件2.10.1(R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria;www.r-proj ect.org)进行数据分析。
  2.对本院收集的正常胆囊及胆囊癌组织提取的mRNA进行实时定量RT-PCR检测,检测PTEN在转录层面的表达水平。同时,抽取样品蛋白进行蛋白质印迹分析。随后对这些样品进行石蜡包埋,后用免疫组织化学的方法检测了PTEN蛋白的表达。
  3.对东方肝胆外科医院张永杰教授手术组2014.1-2016.12行胆囊癌根治手术的患者的胆囊癌组织,共计157例蜡块病理组织标本,进行免疫组织化学染色分析PTEN表达情况。用K-M方法,在检测样本中比较高、低表达PTEN的患者预后情况。
  4.对胆囊癌细胞系GBC-SD、EHGB1、NOZ、NZ细胞,提取蛋白,采用Western Blotting方法检测PTEN、p-AKT、AKT和β-actin蛋白水平。设计针对PTEN基因的外显子的引物对四种细胞系进行PCR检测。并设计靶向PTEN探针,进行深度靶向测序分析。
  5.构建PTEN稳定干扰的细胞系,进行PCR检测,Western Blotting方法检测在此细胞系中;PTEN的mRNA水平和蛋白水平。用此细胞系进行平板克隆形成实验,同时CCK-8实验法,来检测细胞增殖的情况。
  6.对低表达PTEN和对照组细胞进行软琼脂克隆形成实验来探讨高低表达PTEN对胆囊癌细胞恶性生长的影响。随后,用Matrigel-coated Boyden chamber检测PTEN对胆囊癌细胞转移和侵袭能力的影响。
  7.应用Western Blotting实验检测了的PARP、P53和γH2AX的蛋白水平,这些蛋白反应了DNA损伤程度。应用定量PCR和Western Blotting的方法检测差异表达PTEN的癌细胞中是否存在EMT表型的转变。
  8.选取多种通路的抑制剂和常用肿瘤化疗药物,用CCK-8试验的方法对胆囊癌进行药物筛选试验。
  结果:
  1.本研究纳入病人350例,单因素分析显示,黄疸,肿瘤位于肝脏侧,淋巴结N2、N1转移,非根治性切除,肿瘤差分化,以及TNM分期Ⅲ&Ⅳ期为患者术后总生存的影响因素。多因素分析发现肿瘤位于肝脏侧,淋巴结N2、N1转移,非根治性切除以及TNM分期Ⅲ&Ⅳ期是患者术后总体生存的独立危险因素。
  2.胆囊癌组织中PTEN在转录层面的表达低于正常胆囊组织。对收集的冰冻的胆囊癌和胆囊组织样品进行分析,PTEN在6例肿瘤组织中5例呈低蛋白表达,4例胆囊癌组织中p-AKT呈现较高表达水平。对这两组石蜡包埋后检测PTEN,PTEN在正常胆囊组织中为高水平的表达,而在胆囊癌组织中约50%呈现低水平表达。
  3.在157例张永杰教授组实施手术时获取的胆囊癌组织中,根据免疫组化PTEN蛋白表达强度分为2组,PTEN蛋白高有67例,PTEN蛋白低表达有90例。与高表达PTEN组患者相比,低表达PTEN组患者总的生存时间更短,预后更差(p=0.006)。且PTEN低表达是术后总体生存的独立危险因素。
  4.四种胆囊癌细胞系检测PTEN、p-AKT、AKT和β-actin蛋白水平,显示GBC-SD细胞中PTEN为低水平表达,而另外三种相反,呈较高水平。提示PTEN的低表达促进了下游信号通路的活化。检测了PTEN基因的9号外显子拷贝数,GBC-SD细胞9号外显子为单拷贝,其余3株细胞为双拷贝。设计的靶向PTEN的探针,进行了深度靶向测序分析,GBC-SD细胞PTEN为杂合性丢失,其余细胞为双拷贝,并且这四株细胞均没有检测到PTEN发生突变。
  5.建立稳定干扰PTEN细胞系,行细胞克隆形成及CCK-8细胞增殖试验,结果提示PTEN的干扰与否对正常培养的胆囊癌细胞增殖可能影响不大。采用软琼脂克隆形成实验,干扰PTEN非常显著的抑制了肿瘤细胞的恶性增殖,同时受抑制的还有胆囊癌细胞迁移及侵袭能力。
  6.测定DNA损伤的相关蛋白的水平,提示PTEN的干扰引起了基因组DNA的损伤,引发的基因组的不稳定性。PTEN对胆囊癌间质样表型有维持作用。
  7.相比野生型NOZ,PTEN单拷贝的GBC-SD胆囊癌细胞对多种药物显示较高的敏感性。
  8.干扰PTEN的表达增强了NOZ-shPTEN对GEM的药物敏感性,EPB反而对药物产生抵抗,对Bortezomib表现出高度药物敏感性。Bortezomib处理使得更多PTEN敲低细胞发生凋亡。光镜观察和PI染色,处理后的细胞剪切的PARP及Caspase3水平,以及发生凋亡的细胞进行流式检测也证实这一点。
  结论:
  根据以上实验结果可以清楚地发现,PTEN在胆囊癌病人肿瘤组织中,存在较高比例的缺失或低表达,而在正常胆囊中则正常阳性表达。PTEN缺失或低表达的患者总生存时间短,恶性程度高。在胆囊癌细胞系中,发现,PTEN对肿瘤细胞的基因组稳定性和DNA的损伤修复具有调节作用,而PTEN的缺失则会影响基因组的稳定性和DNA的损伤,而导致较差的预后。
  选取了多种信号通路的抑制剂和临床常用的肿瘤化疗药物进行针对胆囊癌治疗的药物筛选实验。不管是PTEN缺失的肿瘤细胞,还是在裸鼠体内细胞荷瘤实验,或是PDX小鼠体内行荷瘤实验,均提示,在PTEN阴性组单独BTZ给药即可达到很好的治疗效果。
  最后,进一步在细胞系中证实,PTEN的缺失或低表达上调了蛋白酶体组分的表达和蛋白酶活性,使得肿瘤细胞对高蛋白酶体活性产生高度依赖性。
[硕士论文] 盛彧
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 主胰管的影像学表现在鉴别主胰管型胰腺导管内乳头状黏液瘤良恶性中的价值
  目的:探讨主胰管的MSCT影像学表现在鉴别主胰管型胰腺导管内乳头状黏液瘤(MD-IPMN)良恶性中的价值。
  方法:回顾性分析经手术病理证实的66例MD-IPMNs患者影像学资料。患者术前均行MSCT检查。由两名医师观察主胰管的影像学表现,将主胰管最宽处直径、主胰管扩张形态与病理检查结果进行对照研究。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,计算曲线下面积(AUC),评价主胰管直径在鉴别MD-IPMNs良恶性中的作用,并确定最佳诊断界值和敏感性、特异性。
  结果:主胰管直径判断病变良恶性有临床意义,其鉴别良恶性的AUC为75.9%,最佳诊断界值为11mm,敏感性73.9%,特异性85.5%。主胰管扩张不均匀可提示该病倾向恶性。
  结论:主胰管的影像学表现对MD-IPMNs良恶性的鉴别具有敏感性,对术前评估和随访具有一定的临床价值。
  第二部分 壁结节的影像学表现在鉴别主胰管型胰腺导管内乳头状黏液瘤良恶性中的价值
  目的:探讨壁结节的MSCT影像学表现在鉴别主胰管型胰腺导管内乳头状黏液瘤(MD-IPMN)良恶性中的价值。
  方法:回顾性分析经手术病理证实且在影像学检查中明确观察到壁结节的41例MD-IPMNs患者影像学资料。患者术前均行MSCT检查。由两名医师观察病灶壁结节的影像学表现,将壁结节大小、位置、个数、边界及强化方式与病理检查结果进行对照。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,计算曲线下面积(AUC),评价壁结节大小在鉴别MD-IPMNs良恶性中的作用,并确定最佳诊断界值和敏感性、特异性。
  结果:壁结节大小对判断病变良恶性有临床意义,其鉴别良恶性的AUC为74.7%,最佳诊断界值为1.35cm,敏感性56%,特异性91.7%。多个壁结节或壁结节边界不清可提示该病倾向恶性,壁结节位置、强化程度对良恶性鉴别诊断价值不大。
  结论:壁结节影像学表现对MD-IPMNs良恶性的鉴别有临床意义,对术前评估和随访具有一定的临床价值。
  第三部分 其他影像学征象对主胰管型胰腺导管内乳头状黏液瘤良恶性鉴别的意义
  目的:探讨胰腺实质内钙化灶、胰腺实质萎缩、肝内外胆管扩张在鉴别主胰管型胰腺导管内乳头状黏液瘤(MD-IPMN)良恶性中的价值。
  方法:回顾性分析经手术病理证实的66例MD-IPMNs患者影像学资料。患者术前均行MSCT检查。由两名医师观察病灶是否有钙化灶、胰腺实质萎缩及肝内外胆管扩张情况,并与病理检查结果进行对照。评价以上影像学表现在鉴别MD-IPMNs良恶性中的作用。
  结果:三种影像学表现对该病良恶性鉴别均有统计学意义。
  结论:胰腺实质内出现钙化灶、胰腺实质萎缩、肝内外胆管扩张的影像学表现均可提示MD-IPMNs恶性。可从更全面角度为临床提供参考信息。
[硕士论文] 樊逸夫
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  长期以来,中医药一直是治疗肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要力量。在国内,中医药被广泛应用于肝癌预防和治疗的全过程,尤其在晚期肝癌中的应用更为常见。多年的中西医结合研究为临床提供了为数不少的成药、验方,其疗效也逐步得到认可。2011年中国卫生部颁布的《原发性肝癌诊疗规范》明确将中医药列入晚期肝癌的系统治疗,并指出中医药“可以改善癌症相关症状和生活质量,可能延长生存期,可以作为肝癌治疗的重要辅助手段”。
  中药解毒颗粒是我科开发的院内制剂,在我科的日常肝癌防治中应用广泛,经过十几年的临床验证,疗效确切。但其作用机制尚不明确。众所周知,中药复方成分复杂,需要煎煮后,经患者口服,并通过肠道吸收代谢后发挥疗效,这就使其有效成分、及后续作用机制的研究变得相当复杂。近年来,肠道菌群与肿瘤相关联的研究备受关注,肠道也是中药吸收代谢的必经之地,因此,本课题想从肠道菌群的角度去探讨口服解毒颗粒所产生的影响。
  此外,免疫治疗是近年来治疗晚期肝癌的重要手段之一。其中,免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade)是当下研究的热门。细胞毒T淋巴细胞抗原-4(lymphocyte-associated antigen4,CTLA-4)及程序性细胞死亡受体1(programmed cell death protein1,PD-1)是常见的阻断靶点;阻断CTLA-4及PD-1,可以通过影响T细胞功能发挥抗肿瘤作用。有文献报道,肠道菌群可增强上述靶点的抑制剂的作用。因此,本课题以免疫检查点阻断为切入点,探讨解毒颗粒对CTLA-4及PD-1的调节作用。
  目的:
  1、观察解毒颗粒对晚期肝癌患者肠道菌群的影响。2、研究解毒颗粒对晚期肝癌患者外周血淋巴细胞CTLA-4与PD-1表达的调节作用。
  方法:
  1、选取年龄≥18岁、巴塞罗那临床肝癌分期为C期(BCLC-C)的HCC患者,随机分为解毒颗粒组和对照组,每组各10例。解毒颗粒组每日冲服解毒颗粒,早晚各一次;解毒颗粒组服药前留取一次粪便,服解毒颗粒后一个月与两个月各留取一次粪便,共三次。对照组不服用解毒颗粒,共留取三次粪便,每次间隔一个月。解毒颗粒组服药前留取一次静脉血,两个月后再留取一次静脉血,共两次。对照组共留取两次静脉血,间隔两个月。
  2、采用16S多样性测序分析对收集的粪便标本分别进行DNA提取、质量检测、测序,通过各菌属丰度产生的变化,观察解毒颗粒对肠道菌群所产生的影响,并通过SPSS21.0(IBM Corp)软件对数据进行统计学分析。两组细菌丰度治疗前后的变化趋势使用重复测量的多因素方差分析(ANOVA of repeated measurement data);菌属OTU水平的差异分析使用Kruskal-Wallis检验法(Kruskal-Wallistest)。
  3、采用流式细胞术探讨解毒颗粒对晚期肝癌患者外周血淋巴细胞CTLA-4及PD-1表达的影响。
  结果:
  1、解毒颗粒组的患者在服药前所具有的与肠癌、肝癌发病相关的梭菌属Ⅺ(ClostridiumⅪ)及消化链球菌科细菌(Peptostreptococcaceae)在服用解毒颗粒后一个月与两个月均消失不见,而在对照组中,上述两菌治疗前后无明显变化。2、对照组中,可以增强肝癌免疫抑制剂疗效的拟杆菌属细菌(Bacteroides)的占比随时间变化呈明显减少趋势,在各个时间点拟杆菌属细菌的占比差异具有统计学意义(P<0.001)且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.032)。而解毒颗粒组中拟杆菌属细菌的占比随时间变化并不明显。3、在解毒颗粒组中,可产生丁酸从而起到抗结肠癌作用的有益菌罗氏菌属细菌(Roseburia)随着时间变化,其占比呈增加趋势;而在对照组中,罗氏菌属细菌的占比随着时间变化呈减少趋势,且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.029)。4、在解毒颗粒组中,与结直肠癌相关的普氏菌属细菌(Prevotella)的占比随时间变化呈减少趋势;而在对照组中,普氏菌属细菌的占比随时间变化呈增加趋势。虽然普氏菌属细菌的占比在两组中的变化趋势比较明显,两组在时间、时间与分组的因素上的差异并无统计学意义。5、在解毒颗粒组中,与结直肠疾病相关的毛螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae)的占比随时间呈轻微减少趋势;而在对照组中,毛螺旋菌科细菌的占比随时间变化呈增加趋势,且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.044)。6、随着时间的变化,解毒颗粒组的物种比起对照组更为相似。7、对照组中,晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的细胞中CTLA-4的阳性率及平均荧光强度呈增长趋势;而在解毒颗粒组中,晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的细胞中CTLA-4的阳性率及平均荧光强度较前变化不大或呈减少趋势。两组患者外周血CD4+和CD8+的细胞中PD-1的阳性率及平均荧光强度变化趋势均不明显。
  结论:
  通过观察中药解毒颗粒对BCLC-C肝癌患者肠道菌群的影响,发现解毒颗粒对有益菌拟杆菌属及罗氏菌属细菌有良性促进作用,对有害菌梭菌Ⅺ及消化链球菌科细菌可能有抑制作用,其中拟杆菌属与肝癌的免疫治疗疗效密切有关。还发现解毒颗粒对患者外周血CD4+和CD8+细胞中的免疫抑制蛋白CTLA-4的表达具有一定的抑制作用,该结论有待进一步的大样本实验进行验证。
[硕士论文] 张允硕
病理学与病理生理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  胰腺癌是常见的恶性程度很高的消化道肿瘤之一,无论是国内还是国外,其发病率在近些年来有逐年上升的趋势。在美国,胰腺癌死亡病例数在各恶性肿瘤致死数中位居第4位,在中国,胰腺癌死亡率在各恶性肿瘤中排在第6位。由于胰腺癌起病较隐匿,缺乏特异的临床表现,恶性程度高,进展快,极易发生转移,不易早期诊断,多数患者就诊时已经处在晚期。手术根治切除是目前临床上治疗胰腺癌最有效的方式,但是多数患者在确诊时已经丧失了手术切除的机会,导致胰腺癌预后很差。因此深入探究胰腺癌发生发展的分子调控机制,寻找新的早期诊断标志物和潜在治疗靶点已成为胰腺癌研究领域的热点。
  目前认为肿瘤具有十大基本特征,即生长信号自给自足、抗生长信号不敏感、抵抗细胞死亡、无限的增殖潜能、诱导血管生成、组织浸润与转移、免疫逃逸、肿瘤相关性炎症、基因组不稳定与突变、细胞能量异常,而肿瘤相关性炎症被认为是肿瘤的第七大特征。越来越多的研究表明炎症与肿瘤的发生发展息息相关,炎症性疾病可以增加某些肿瘤的发病风险,非甾体抗炎药可降低多种肿瘤的发病率和死亡率,而在所有早期肿瘤及转移灶的微环境中可以检测到大量炎性细胞的聚集以及细胞因子和趋化因子的分泌,说明天然免疫与获得性免疫在肿瘤的发生发展中具有不可替代的作用。因此,希望从天然免疫的角度来阐述天然免疫中重要的分子在肿瘤的发生发展中发挥怎样的作用。
  模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)是机体对危险信号进行免疫识别并启动免疫应答的主要媒介,而Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)家族是近年来新发现的介导免疫应答的模式识别受体之一,TLRs的活化可以启动下游信号通路,调控天然免疫应答向获得性免疫应答的转变,在机体抵御外来病原微生物感染中发挥着重要作用,也是目前研究较为透彻的受体。作为TLRs的重要成员之一,TLR3的配体主要是dsRNA病毒和Poly I∶C。在许多免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞)及某些非免疫细胞(如内皮细胞、上皮细胞和肿瘤细胞)中均有表达,当TLR3被dsRNA病毒或外源性Poly I∶C活化后,可以激活下游信号通路。已有研究表明,TLR3的下游信号通路主要包括MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径。通过MyD88依赖信号通路途径可以诱导一些炎症细胞因子的表达,如IL-1、IL-6、TNF-α等,参与非特异免疫应答反应,同时通过MyD88非依赖信号通路途径诱导Ⅰ型干扰素等细胞因子表达,诱导DC细胞分化成熟,参与抗病毒反应。
  越来越多的证据显示,TLR3与肿瘤之间存在着重要的联系,在肿瘤方面具有双重作用。首先,大量研究表明TLR3可以促进肿瘤细胞的凋亡,如在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌等肿瘤中,可以通过活化TLR3引起肿瘤细胞的凋亡。同时,TLR3的激活可以促进一些炎症因子及干扰素的分泌,增强树突状细胞、自然杀伤细胞以及巨噬细胞等免疫细胞的抗肿瘤效应。因此,TLR3激动剂被应用于某些类型肿瘤的免疫辅助治疗。TLR3除了具有抗肿瘤的作用,还具有一定的促肿瘤效应。有既往报道TLR3可通过增加肿瘤细胞的转移能力介导肿瘤的侵袭和转移。比如过表达的TLR3与口腔鳞状细胞癌神经周围转移紧密相关;宿主肺上皮细胞TLR3活化促进肿瘤向肺部转移。
  通过对胰腺癌原发肿瘤及淋巴结转移肿瘤组织进行转录组测序,发现TLR3在淋巴结转移灶中的表达升高。而且目前在胰腺癌研究领域,TLR3对胰腺癌发生、发展及转移的研究较少,对其作用机制更是尚不明确。因此希望通过探究TLR3在胰腺癌淋巴结转移中作用及作用机制,找到辅助胰腺癌诊断、提示预后的新指标。
  目的:
  研究TLR3在胰腺癌及其淋巴结转移组织中的表达特征与临床意义,进一步探究TLR3促进胰腺癌淋巴结转移的分子机制,为胰腺癌的诊断、治疗与预后评估提供新的靶标。
  方法:
  1.采用转录组测序技术,对收集的3例胰腺癌原发肿瘤组织及对应的淋巴结转移肿瘤组织中基因的表达情况进行检测。
  2.利用免疫组化技术对57例伴有淋巴结转移的胰腺癌患者原发肿瘤组织和淋巴结转移肿瘤组织中TLR3的表达进行对比研究,同时检测27例无淋巴结转移的胰腺癌患者原发肿瘤组织中TLR3的表达,并分析所有84例胰腺癌患者原发肿瘤组织中TLR3的表达与患者临床病理指标间的相关性。
  3.通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测人胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIAPaCa-2中TLR3的表达情况。
  4.选取PANC-1细胞株作为研究对象,通过脂质体转染质粒(pUNO1-hTLR3-GFP)的方法在PANC-1细胞中过表达TLR3,利用Blasticidin S对细胞进行筛选,得到相对稳定的过表达细胞株PANC-1TLR3,利用荧光显微镜与qRT-PCR检测PANC-1TLP3过表达情况后,进行后续的体内体外实验。
  5.利用TLR3过表达细胞株进行体外细胞学实验,观察TLR3对于胰腺癌细胞生物学行为的影响。通过CCK-8细胞增殖实验,检测TLR3对胰腺癌增殖能力的影响,利用Transwell迁移侵袭实验,检测TLR3对于胰腺癌迁移侵袭能力的影响。
  6.将胰腺癌细胞注射进入裸鼠胰腺,构建胰腺癌原位种植模型,观察TLR3在体内对于胰腺癌增殖的影响;将胰腺癌细胞注射进入裸鼠脾脏,构建胰腺癌肝转移模型,观察TLR3在体内对于胰腺癌细胞转移能力的影响。
  7.利用qRT-PCR、Western blot等分子生物学技术检测TLR3过表达后胰腺癌细胞内一些信号通路中关键分子的变化,探讨TLR3影响胰腺癌细胞淋巴结转移能力的分子机制。
  结果:
  1.转录组测序发现TLR3在胰腺癌淋巴结转移组织中的表达高于原发肿瘤。
  2.免疫组化结果显示,在57例伴有淋巴结转移的胰腺癌患者中,淋巴结转移肿瘤中TLR3的表达高于原发肿瘤(Wilcoxon符号秩和检验统计量Z=-2.668,P=0.008)。而在所有84例胰腺癌患者中,原发肿瘤组织中TLR3表达与肿瘤最大直径和淋巴结转移存在一定的相关性(分别为P=0.0383,P=0.0006),即与TLR3低表达患者相比,TLR3高表达的患者肿瘤相对较大,且更易发生淋巴结转移。
  3.Kaplan-Meier生存分析结果显示,原发肿瘤中TLR3高表达的胰腺癌患者中位生存时间(12个月)显著低于TLR3低表达胰腺癌患者(20个月)(x2=7.1114,P=0.0077),因此TLR3可以作为提示胰腺癌患者预后的一个指标,但是Cox回归分析表明尚不能认为TLR3的表达高低是影响胰腺癌预后的独立危险因素。
  4.体外细胞学实验结果显示,TLR3过表达的PANC-1细胞增殖能力增强,迁移能力显著升高,但侵袭能力未受明显影响。裸鼠原位种植模型结果表明,TLR3过表达组肿瘤明显大于对照组;裸鼠脾脏注射肝转移模型表明,与对照组相比,TLR3过表达后的PANC-1细胞转移至肝脏并形成克隆性生长的数量明显增加。
  5.细胞分子生物学实验发现,TLR3过表达后,PANC-1细胞与EMT相关的E-cadherin的表达下降,N-cadherin表达升高,β-catenin表达升高,CD44分子的表达也同样升高,说明TLR3可能是通过Wnt/β-catenin通路调控胰腺癌细胞发生EMT同时上调CD44的方式促进淋巴结转移。
  结论:
  胰腺癌淋巴结转移肿瘤中TLR3的表达高于原发肿瘤。与原发肿瘤组织中TLR3低表达的患者相比,原发肿瘤组织中TLR3高表达的患者肿瘤直径相对较大,且与淋巴结转移相关,预后也相对较差,因此TLR3是反映患者病情和预后的有价值的指标。TLR3表达升高可以增强胰腺癌细胞的增殖能力,提高胰腺癌细胞的转移能力,而胰腺癌转移能力的增强主要是通过降低胰腺癌细胞E-cadherin的表达,诱导细胞发生上皮间质转化(EMT)来实现的,这一过程可能是由Wnt/β-catenin信号通路来调节的,同时TLR3可以上调CD44的表达,使得胰腺癌细胞更易向淋巴结转移。
[博士论文] 李自雄
流行病与卫生统计学;流行病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  基于全球的肿瘤登记数据,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发病率在男性和女性肿瘤中分别位列第五位和第九位,而每年因HCC而死亡的患者,在男性和女性肿瘤中排列为第二位和第六位。中国每年新发HCC和因其死亡人数均约占到世界范围内的50%左右。中国HCC患者绝大部分是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染导致的;而且HBV慢性感染人群基数庞大,这是引起HCC高发的最主要原因之一。HBV large S基因(preS1/preS2/S)编码了病毒颗粒的表面蛋白,是病毒感染肝细胞、机体抗原识别表位和引起HCC发生发展的关键影响因素。前期大量的流行病学数据显示,该基因片段preS区的相关变异是促进HCC发生发展的危险因素。但是何种preS变异序列,以及这些变异是通过何种机制导致了HCC的发生,目前尚无相关研究能够完全阐明。
  研究目的:
  证实影响HBV慢性感染患者发生HCC的危险因素,阐明何种HBV preS区的基因变异能促进HCC的发生;在体外实验中,发现这些变异序列所引起的癌症相关表型的改变和调控的下游基因与其作用机制;在体内实验中,验证large S序列及变异的致炎、致癌效果。为后续如何预防慢性HBV感染患者发生HCC和进行相应的治疗,提供理论依据。
  研究方法:
  应用纳入2114位HBV慢性感染者队列,设计特异性引物扩增患者外周血中HBV基因组preS区片段,采用sanger测序的方法,序列比对后鉴定相关preS变异。纳入患者人口学资料、临床一般信息和治疗信息等,采用COX单因素和多因素风险回归模型分析方法,促进HCC发生和患者肝病相关死亡的风险因素。
  应用HBV large S基因野生型和筛选出的三种变异型序列,构建相关慢病毒载体,转染HepG2细胞系;通过检测细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、裸鼠皮下荷瘤等表型,观察相关基因序列对细胞恶性表型的影响。测定不同细胞内RNA表达谱芯片,比较分析large S基因及其变异调控的下游基因。通过实时荧光定量PCR(reverse transcription quantitative PCR,RT-qPCR)、免疫印迹实验(Western Blot,WB)等分子生物学实验研究其可能的调控机制。
  将相关基因序列构建Sleeping Beauty相关载体,用尾静脉注射的方式表达于小鼠肝脏。阐明变异型large S基因所致小鼠肝脏炎症状态和肝细胞癌的发生情况。通过小鼠肝脏RNA表达谱芯片的测定,比较分析large S基因及相关变异在动物体内的调控的基因及参与的信号通路。后续相关分子的免疫组化等实验来验证靶分子的表达水平,进一步验证large S基因及其变异调控的作用机制。
  研究结果:
  该研究第一部分,人群队列的研究结果显示,2114例HBV慢性感染患者队列,随访的中位时间为8.92年,总共随访18406人年。在随访期间内,共有209例患者发生HCC,发生率为9.89%(209/2114)。经COX回归分析后,得出男性患者、高年龄患者、肝硬化、HBV C2基因亚型、未使用抗病毒治疗、高直接胆红素(>7mmol/L)、甲胎蛋白阳性、低白蛋白水平(<35g/L)、低血小板计数(<100×109g/L)是促进HCC发生的危险因素(P<0.05)。此外,HBV基因组preS区中C3116T和T31C突变促进了HCC的发生发展。在HBV慢性感染者体内,C2为主要基因亚型(73.1%),由C2基因亚型所引起的HCC发生,占83.3%(125/150)。HBV C2基因亚型相关preS变异,如G2950A、G2951A、A2962G、C2964A、A3054T、C3063G、T3069G和A3120T,均促进了HCC的发生。preS区相关变异的组合,如G2950A/G2951A/A2962G/C2964A(mutation1),促进了HCC的发生(HR2.51,95%CI,1.10-5.74,P=0.030);联合突变C3116T/T31C(mutation2)变异也增加了HBV慢性感染患者HCC的发病风险(HR1.57,95%CI,1.07-2.31;P=0.022)。此外,preS2deletion(>5bp)在使用抗病毒治疗的人群中,促进了HCC发生(HR2.81,95%CI,1.27-6.22;P=0.011)。
  课题第二部分,体外实验结果显示,HBV large S基因deletion序列较wild type序列显著提高了细胞增殖能力、软琼脂克隆能力和裸鼠皮下荷瘤能力(P<0.05)。但三种变异型large S序列(mutation1、mutation2和deletion)对细胞迁移、细胞侵袭等细胞转移运动能力没有提升,差异无统计学意义(P>0.05)。在转染目的基因后,mRNA表达谱芯片结果显示,野生型large S基因主要影响了细胞内基因转录、细胞周期和促进细胞凋亡等生物学进程。Mutation1、mutation2和deletion序列与wild type基因比较后发现,三种变异均降低了细胞凋亡和细胞内免疫相关基因的表达,并上调了癌症相关的信号通路。基因定量的结果也证实了促进凋亡的相关基因OLR和MAIP1在变异组中低于wild type组,且抑制凋亡基因BIRC3和BIRC2则在变异组中高于wild type组。癌症相关基因的表达水平,如STAT3信号通路在deletion组中,其表达水平较wild type组高(P=0.027)。Western blot实验的结果显示,STAT3分子的表达水平在三种变异组中高于野生型large S组,但磷酸化后的p-STAT3蛋白表达量在各组间未见明显差异。在STAT3分子抑制剂stattic作用下,各组间的细胞增殖趋于一致。而在STAT3信号通路激动剂IL-6作用下,各组间的细胞增殖能力有显著的提高,并增大了组间差异。相关交互作用分析显示,三种变异型large S基因与炎症因子,协同通过IL-6/STAT3信号通路促进了HepG2细胞的增殖。
  通过构建好的小鼠模型,发现3种变异型large S基因导致小鼠的生存期受到不同程度的降低。三种变异型基因(mutation1、mutation2和deletion)引起小鼠肝脏肿瘤的发生率,较wild type有不同程度的提高,分别为36.4%(4/11)、57.1%(4/7)、66.7%(4/6),(Ptrend=0.023)。肝脏实物图和H&E染色镜下可见表达HBV large S基因的小鼠肝脏炎症状态明显,肝细胞呈现出水肿、变性;在严重挤压状态下,肝脏特征性结构不明显。肝癌相关特异性分子CK18、细胞增殖相关蛋白Ki-67和PCNA的免疫组化评分,在mutation1、mutation2和deletion组中均较vector组或wild type组显著提高(P<0.05)。小鼠肝脏的mRNA表达谱芯片结果显示:野生型large S基因的表达,调节了细胞凋亡、免疫应激,以及癌症相关相关信号的激活。Mutation1、mutation2和preS2deletion序列的表达后与野生型large S基因比较,这些相关均进一步的上调了小鼠肝脏细胞内炎症与癌症相关基因集,以及癌症相关信号通路的激活。小鼠外周血中相关分子ELISA结果显示,炎-癌转化相关细胞因子IL-5、IL-6和IL-12均表现为,wild type组中的表达较vector组高,而三种变异型组较wild type组高。此外,表达三种变异型large S基因的小鼠肝脏中,STAT3和p-STAT3分子的表达评分均较vector组与wild type组高,差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明,三种large S基因变异,尤其是preS2deletion可与小鼠体内的炎症状态,共同通过激活IL-6/STAT3相关信号通路,进而促进了HCC的发生发展。
  研究结论:
  本课题通过队列研究证实了众多临床指标和HBV基因preS区相关突变是慢乙肝患者发生HCC的危险因素。进一步研究发现相关preS区的组合突变(G2950A/G2951A/A2962G/C2964A,C3116T/T31C和preS2deletion),具有促进慢性HBV感染者发生HCC的作用。在体外实验中,证实三种变异型large S基因,尤其是preS2deletion序列可通过上调STAT3分子的表达,激活癌症相关信号通路,促进了HCC的发生发展。小鼠模型中,也证实了三种变异型large S基因的表达具有促进小鼠肝脏炎症、癌症的作用。本课题充分解释了HBV large S基因preS区相关突变促癌发生发展的作用机制,为防控HCC的发生,提供了新的思路。
[博士论文] 余建
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近年来的研究表明,环状RNA广泛存在于人体正常组织、癌组织、血清及血浆等。而且已有相关报道显示它们在膀胱癌、胃癌及结肠癌等癌症的进展中发挥了重要作用。然而,环状RNA在肝细胞癌(简称为肝癌)中的作用尚不清楚。在本研究中,探索了环状RNA在肝癌中的功能以及诊断价值。我们的研究由下面两个部分组成。
  在本研究的第一部分,利用高通量测序检测了五对肝癌及对应的癌旁组织的环状RNA的表达情况并以cSMARCA5(来自SMARCA5基因第15和第16外显子的环状RNA分子,其在CircBase数据库的编号为hsa_circ_0001445)为代表探索了环状RNA在肝癌中的功能。首先,通过环状RNA测序,发现了4727个较高丰度(在肝癌或癌旁组织的平均RPM≥0.1)的环状RNA。它们中的大多数来自外显子,而且大多数长度低于1000个碱基。重要的是,在人类肝组织中发现了513个新的环状RNA分子以及236个在肝癌癌旁差异表达的环状RNA分子,其中,108个环状RNA分子在肝癌组织中上调,128个环状RNA分子在肝癌组织中下调。通过实时定量PCR,琼脂糖凝胶电泳以及Sanger测序,成功验证了五个在肝癌组织中上调的环状RNA(cDNAJC6,cGPC3,cME1,cPVT1和cSATB2)和五个在肝癌组织中下调的环状RNA(cCYP2C8,cKCNN2,cLIFR,cPIK3R1和cSMARCA5)。
  其次,通过RNase R(一种5'→3'核酸外切酶,能特异性地消化线性RNA而保留环状RNA)消化实验,放线菌素D转录抑制实验,荧光原位杂交(FISH,fluorescence in situ hybridization)以及实时定量PCR实验等,证明了cSMARCA5是一种稳定的、高丰度的,主要存在于细胞质中的环状RNA分子,并且在肝癌组织中的表达低于癌旁组织。
  第三,通过构建野生型(从第14内含子到第16内含子全部克隆到过表达质粒中)以及I14RC(reverse complementary sequences in intron14,SMARCA5基因第14内含子上的一段序列,与I16RC反向互补)和(或)I16RC(reverse complementary sequences in intron16,SMARCA5基因第16内含子上的一段序列,与I14RC反向互补)缺失型的cSMARCA5过表达质粒,实时定量PCR,Northern blot,RNA干扰以及RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)等实验,证明了I14RC和I16RC在cSMARCA5的生成过程中是必不可少的,而DHX9(DExH-Box Helicase9,一种高丰度的细胞核内RNA解螺旋酶)能够通过结合I14RC和I16RC来抑制它们的配对,从而抑制cSMARCA5的形成。另外,DHX9的mRNA和蛋白在肝癌组织的表达高于癌旁组织,并且肝癌组织中DHX9的免疫组化评分与CSMARCA5的表达水平呈正相关。
  接着,在一个有163名肝癌患者的队列中,也证实了cSMARCA5在肝癌组织的下调。进一步发现cSMARCA5在肝癌组织中的低表达与侵袭性特征显着相关,包括增加的肿瘤大小(>5cm),较差的Edmondson分级,存在微血管侵犯,较晚的TNM及巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期。cSMARCA5的下调表明HCC患者的总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)较短。多因素分析表明cSMARCA5的下调是肝癌患者手术后OS和RFS的独立危险因素。
  然后,利用cSMARCA5过表达质粒在肝癌细胞系中成功地过表达了cSMARCA5,利用靶向其反向剪切位点的小干扰RNA(small interfering RNAs,siRNAs)在肝癌细胞系中成功地干扰了cSMARCA5的表达。CCK-8(Cell Counting Kit-8),细胞划痕、Transwell、皮下荷瘤、肿瘤肝脏原位种植肝内转移以及尾静脉注射肺转移等实验表明过表达cSMARCA5能抑制肝癌细胞的增殖和转移。CCK-8(Cell Counting Kit-8)、细胞划痕和Transwell等实验表明干扰cSMARCA5能促进肝癌细胞的增殖和转移。
  最后,通过miRanda软件预测、AGO2抗体的RIP实验、circRIP实验、双荧光素酶报告系统、生物素标记的microRNA捕获以及RNA荧光原位杂交实验等,证明了cSMARCA5能结合miR-17-3p及miR-181b-5p。通过查阅文献以及实验验证,发现过表达或干扰cSMARCA5之后,miR-17-3p和miR-181b-5p的共同靶基因TIMP3变化最明显。因此,假设cSMARCA5主要是通过吸附miR-17-3p和miR-181b-5p来保护TIMP3不受降解,从而上调TIMP3,起到抑制肝癌生长和转移的作用。为了验证这个假设,进行了一系列的实验。首先,发现miR-17-3p和(或)miR-181b-5p对TIMP3的降解作用可以被cSMARCA5所阻断。其次,CCK-8增殖实验表明miR-17-3p和(或)miR-181b-5p对肝癌细胞增殖的促进作用可以被cSMARCA5所阻断。而Transwell实验表明miR-17-3p和(或)miR-181b-5p对肝癌细胞转移的促进作用可以被cSMARCA5所阻断。另外,TIMP3的mRNA水平在肝癌组织中的表达量低于癌旁,并且与cSMARCA5的表达量呈正相关关系。综上所述,cSMARCA5(至少部分)通过miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制肝癌的生长和转移。
  综上所述,环状RNA cSMARCA5能抑制肝癌的生长和转移,是潜在的肝癌治疗靶点。
  在本研究的第二部分,用环状RNA芯片检测了五例乙肝相关肝癌(简称肝癌)及五例慢性乙型肝炎(简称慢乙肝)患者的血浆。发现了371个差异表达的环状RNA分子,其中326个在肝癌血浆中高于慢乙肝血浆,45个在肝癌血浆中低于慢乙肝血浆。将326个上调的环状RNA与肝癌组织中检测到的环状RNA取交集后,获得了10个候选环状RNA分子。通过实时定量PCR,琼脂糖凝胶电泳,Sanger测序,RNase R消化以及室温孵育等实验,成功鉴定出了其中的四个(hsa_circ_0000976,hsa_circ_0003506,hsa_circ_000775和hsa_circ_0139897),证明它们是环状的并稳定存在于血浆和肝组织中。
  检测这四个分子在肝组织的表达时使用的是实时定量PCR,以β-actin为内参。由于血浆RNA没有公认的内参,检测这四个分子在血浆中的表达时使用的是绝对实时定量PCR。结果表明,hsa_circ_0000976和hsa_circ_0007750这两个环状RNA分子不仅在肝癌患者血浆中的表达量高于健康人、慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者,在肝癌手术前血浆中的表达量高于手术后,而且在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量呈正相关关系,在肝癌组织中的表达量高于癌旁组织。hsa_circ_0139897虽然在肝癌及癌旁组织的表达量未见显著差异,但是其在肝癌患者血浆中的表达量高于健康人、慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者,在肝癌手术前血浆中的表达量高于手术后,而且在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量呈正相关关系。推测这可能是因为肝癌组织中的hsa_circ_0139897比癌旁或健康组织中的hsa_circ_0139897更容易分泌到血浆中。因此,选择hsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897这3个环状分子作为肝癌诊断标志物进一步研究。
  通过Cut off Finder(http://molpath.charite.de/cutoff/)网站的ROC曲线(Euclidean distance)分析法确定了血浆中hsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897用于区别肝癌和非肝癌的最佳截断(cut off)点分别为1067,4324以及1108copies/ml plasma,大于或等于这些cut off值的记为1,诊断为肝癌,而小于这些cut off值的记为0,诊断为非肝癌。为了提高诊断效果,将这三个环状分子的组合(Panel of circRNAs,简称CircPanel)用于诊断肝癌。
  在两个独立的大规模队列(训练集:158名乙肝相关肝癌患者,53名健康人,52名慢性乙型肝炎患者和50名乙肝肝硬化患者;验证集:152名乙肝相关肝癌患者,50名健康人,54名慢性乙型肝炎患者和50名乙肝肝硬化患者)中用ROC曲线(receiver operating characteristic curve,受试者工作特征曲线)下面积(Area Under Curve,AUC),对血浆CircPanel的肝癌诊断效果进行了评价。
  CircPanel在区别肝癌组与非肝癌组时比AFP具有更高的诊断价值(训练集:AUC0.863[95%CI0.819-0.907]vs0.790[0.738-0.842],P=0.036;验证集:AUC0.843[0.796-0.890]vs0.747[0.6910.804],P=0.011),而CircPanel与AFP的联合进一步提高了诊断价值(训练集:AUC0.878[0.836-0.920]vs0.790[0.738-0.842],P=0.010;验证集:AUC0.863[0.819-0.908]vs0.747[0.691-0.804],P=0.002)。CircPanel在区别小肝癌(单发,直径≤3cm)组与非肝癌组时也比AFP具有更高的诊断价值(训练集:AUC0.862[0.796-0.928]vs0.680[0.589-0.770],P=0.001;验证集:AUC0.838[0.776-0.900]vs0.699[0.613-0.785],P=0.011),而CircPanel与AFP的联合进一步提高了诊断价值(训练集:AUC0.873[0.817-0.929]vs0.680[0.5890.770],P<0.001;验证集:AUC0.874[0.823-0.925]vs0.699[0.613-0.785],P=0.001)。重要的是,CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与非肝癌组(训练集:AUC0.838[0.761-0.914],验证集:AUC0.857[0.793-0.922])以及AFP阴性小肝癌组与非肝癌组(训练集:AUC0.881[0.797-0.965],验证集:AUC0.897[0.827-0.968])时也具有较高的诊断价值。
  还将非肝癌组划分为健康组,慢乙肝组和乙肝肝硬化组,并对CircPanel在下列几对比较时的诊断价值进行了评价:肝癌组与健康组、肝癌组与慢乙肝组、肝癌组与乙肝肝硬化组、小肝癌组与健康组、小肝癌组与慢乙肝组以及小肝癌组与乙肝肝硬化组。
  综上所述,由外周血血浆三个环状(RNAhsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897)所组成的组合CircPanel具有较高的诊断价值,可以单独或与AFP联合使用,并且能用于小肝癌以及AFP阴性肝癌的诊断。
[硕士论文] 王硕
流行病与卫生统计学;流行病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  肝癌是中国第二大肿瘤死因。随着老龄化和环境危险因素暴露增加,肝癌发病率居高不下。男性高发是肝癌一个重要流行病学特点。据估计,中国男性肝癌发病率约是女性3倍。生活方式如饮酒、吸烟等不足以解释所有的男性肝癌发病风险。饮酒、乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus,HBV)、性激素受体以及它们之间的交互作用可能是男性肝癌高发的原因。性激素受体被认为明确与肝癌发生有关。目前认为,雄激素受体(Androgen Receptor,AR)发挥促癌作用,雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)发挥抑癌作用。HBV可能与性激素受体相互作用,共同促进肝癌发展。饮酒与HBV的交互作用也会增加HBV的致癌能力。
  目前在肝癌发病性别差异上的研究主要集中在两方面:第一,探究男性肝癌高发人群特征以及肝癌男性高发相关危险因素。第二,利用分子生物学手段研究某一特定分子和通路在男性肝癌高发中的作用。目前,尚没有研究对男性肝癌高发原因进行整体描述和分析。
  利用生物信息学的手段,全面描述男性肝癌的基因特异性表达模式,分析其与预后的关系,并预测可能调控机制。
  研究目的:
  根据转录组学分析男性肝癌基因特异性表达模式。从表观修饰、微小RNA(micro RNA,miRNA)和性激素受体角度预测男性肝癌基因特异性表达模式的调控机制。通过生存分析,探索男性特异性表达模式的临床价值,构建男性肝癌预后模型。
  研究方法:
  1.数据来源:本研究数据来源于癌症和肿瘤基因图谱计划(The Cancer Genome Atlas,TCGA)公共数据库中肝癌相关的RNA-seq、miRNA、甲基化数据和临床数据。本研究验证数据来源于本教研室收集并测序的男性肝癌患者癌症与癌旁组织的RNA-seq数据。
  2.样本纳入:采用频数配对法和倾向评分匹配的方法进行样本纳入筛选。首先保证肝癌和癌旁组织中病毒感染信息匹配。其次,根据年龄、肝癌病理分期、身体质量指数(Body Mass Index,BMI)等进行倾向评分匹配。
  3.本研究将肝癌性别特异性基因或表达模式定义为:1)存在性别差异的基因或表达模式,即某一性别基因或表达模式相对于另一个性别存在高、低表达;2)与肝癌有关的基因或表达模式,即排除正常人中与性别有关,与肝癌无关的基因或表达模式。
  4.在肝癌、癌旁组织中进行基因差异表达分析,筛选出男性特异性高、低表达基因和女性特异性高、低表达基因,并对差异基因进行功能富集分析。
  5.利用生存分析,探究男性特异性基因富集通路与肝癌患者预后的关系。
  6.利用验证集数据对男性特异性差异表达基因、富集通路的表达水平、富集通路与肝癌预后的关系进行验证。
  7.采用Spike-and-Slab Lasso Cox模型,构建基于男性特异性差异表达基因的男性肿瘤风险预后模型。
  8.在肝癌和癌旁组织中进行miRNA差异表达分析,筛选出男性特异高、低表达miRNA,女性特异性高、低表达miRNA。利用TARGETSCAN和miRANDA数据库预测miRNA靶基因。并将靶基因与差异表达基因相结合,寻找miRNA和基因相互作用关系。
  9.利用加权基因共表达网络(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)寻找男性中具有类似表达模式的模块(module)。对模块内基因进行富集分析,确定模块相关功能。构建共表达网络,筛选模块中处于核心地位的基因。
  10.对纳入样本的甲基化数据进行分析,筛选男性差异甲基化位点和甲基化区域。结合差异表达基因,探究甲基化在男性肝癌中的作用。
  11.根据AR和ER转录因子识别模体预测其可能参与调控的靶基因。利用DNase-seq数据探究AR和ER的可能调控靶基因的染色质可接近性。筛选具有可接近性的、可能被AR、ER调控的基因,探究AR、ER在男性肿瘤高发中可能发挥的作用。
  研究结果:
  1.在基因差异表达分析中共筛选出男性特异性高表达基因633个,男性特异性低表达基因852个;女性特异性高表达基因713个,女性特异性低表达基因339个。基因富集分析结果显示男性特异性高表达基因富集在核蛋白复合体形成、非编码RNA、核糖体形成、细胞热反应通路上。男性特异性低表达基因富集于免疫相关通路中。女性特异性高表达基因富集通路与细胞形态、跨膜转运有关。女性特异性低表达基因未富集在任何通路上。
  2.男性特异性基因表达模式与男性肝癌患者预后有关。男性特异性低表达基因富集通路整体表达水平低,患者预后差;男性特异性高表达基因富集通路整体表达水平高,患者预后差。
  3.Spike-and-Slab Lasso Cox模型中共纳入29个基因,其中男性特异性低表达基因9个,男性特异性高表达基因20个。该模型可以较好预测男性肝癌患者预后。
  4.通过miRNA差异表达分析,共筛选出34个男性特异性高表达miRNA,34个男性特异低表达miRNA。18个miRNA与男性特异性差异表达基因存在相互作用关系,其中14个为男性特异性高表达miRNA。根据miRNA靶基因预测,481个男性肝癌特异性差异表达基因被miRNA调节。其中322个为男性特异性低表达基因,这些基因富集于免疫相关通路。
  5.加权基因共表达网络分析发现12个模块,免疫相关模块与RNA相关模块、甲基化模块、类固醇激素代谢模块呈负相关关系。
  6.甲基化芯片分析共检测出174551个差异甲基化位点,33444个位点位于启动子区。启动子区甲基化位点数≥3的基因中包含大量miRNA、lincRNA。本研究共检测出1506个差异甲基化区域。甲基化区域包含了97个男性特异性低表达基因,其中一部分为免疫相关基因。
  7.男性差异表达基因中有157个可能受到AR调控,其中80个具有可按近性。男性差异表达基因中有72个可能受到ER调控,其中40个具有可接近性。AR和ER调控的靶基因与RNA的形成与修饰有关。
  研究结论:
  1、免疫抑制是男性肝癌基因特异性表达模式。
  2、男性特异性表达基因富集通路与患者预后相关,男性特异性差异基因可以用于男性肝癌预后模型构建。
  3、miRNA可能通过降低免疫相关基因的表达,引起男性肝癌免疫抑制。
  4、甲基化可以通过参与RNA形成和修饰过程间接调节免疫功能,也可以通过DNA甲基化直接调节免疫功能。
  5、AR和ER作为转录因子可能通过参与RNA形成与修饰过程,进而调节男性特异性肝癌基因的表达。
[硕士论文] 余嘉惠
中医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:课题组前期发现lncRNA-ncRuPAR在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,且与胃癌的浸润程度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤的大小及TNM分期密切相关,临床有效方药“滋阴化痰方”可抑制胃癌细胞增殖。本课题旨在通过一系列体内外实验探究ncRuPAR与胃癌增殖、侵袭、转移、凋亡的关系及其可能的作用机制,并验证“滋阴化痰方”是否通过干预ncRuPAR发挥其对胃癌的治疗作用,以期深化对胃癌发病分子机制的认识,并为阐释滋阴化痰方可能的作用机制提供数据支持。
  研究方法:(1)通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real Time PCR,qPCR)技术检测AGS,HGC27,MKN45,MGC8034株胃癌细胞中ncRuPAR的表达水平。(2)重组慢病毒LV-NCRUPAR(15034-1)和LV-NCRUPAR-CON分别感染HGC27细胞,构建HGC27过表达细胞株HGC27-ncRuPAR及对照细胞株HGC27-Empty Vector;重组慢病毒LV-NCRUPAR-RNAi和LV-NCRUPAR-RNAi-CON分别感染MGC803细胞构建MGC803干扰细胞株MGC803-ncRuPAR-RNAi及对照细胞株MGC803-Empty Vector,嘌呤霉素2μg/mL筛选72h后形成慢病毒感染表达稳定株,qPCR检测各稳株中ncRuPAR的表达量。(3)CCK-8法检测ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803增殖的影响;流式细胞计数仪分析ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影响;细胞划痕实验观察ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803迁移能力的影响;Transwell实验观察ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803侵袭能力的影响。(4)将HGC27-ncRuPAR,HGC27-Empty Vector及HGC27-Control细胞株分别在裸鼠皮下接种造HGC27皮下移植瘤模型,观察各组裸鼠一般情况及比较瘤体体积和质量,比较ncRuPAR对HGC27皮下移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响。(5)Affymetrix基因表达谱芯片技术筛选HGC27-ncRuPAR细胞株和HGC27-Empty Vector细胞株之间差异表达基因,并将芯片分析的差异基因结果进行IPA(Ingenuity Pathway Anaylsis,IPA)分析,推测ncRuPAR影响胃癌细胞增殖凋亡的可能通路;Western blot实验检测ncRuPAR对HGC27和MGC803细胞中PAR-1蛋白及PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表达的影响。(6)中药“滋阴化痰方”干预HGC27和MGC803细胞株,CCK-8法检测细胞增殖变化,观察滋阴化痰方对胃癌细胞增殖的影响;流式细胞计数仪分析滋阴化痰方对胃癌细胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影响;qPCR检测滋阴化痰方对胃癌细胞ncRuPAR表达的影响,观察滋阴化痰方是否对ncRuPAR的表达存在调控作用;Western blot验证滋阴化痰方对PAR-1蛋白及PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表达的影响,探究滋阴化痰方可能的作用机制。
  研究结果:(1)qPCR结果显示:ncRuPAR在HGC27细胞中低表达,在MGC803细胞中高表达。(2)选择HGC27细胞构建ncRuPAR过表达稳定株,选用MGC803细胞构建ncRuPAR干扰稳定株,qPCR验证ncRuPAR过表达及干扰稳株构建成功。(3)CCK-8和流式细胞周期结果显示:过表达ncRuPAR可抑制HGC27细胞的增殖,使细胞周期阻滞于G1期,并促进其凋亡,而干扰ncRuPAR表达则抑制MGC803细胞增殖、减少细胞凋亡。划痕实验和transwells实验结果显示:ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803的迁移及侵袭能力影响不显著。(4)体内实验中,HGC27-ncRuPAR组与对照组相比,实验组裸鼠成瘤减慢,瘤体减小。(5)Western blot结果显示:过表达ncRuPAR使HGC27细胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表达下降;而干扰ncRuPAR则可使MGC803细胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表达升高。(6)中药“滋阴化痰方”作用于胃癌HGC27和MGC803细胞,CCK-8和流式细胞周期结果显示:中药“滋阴化痰方”可以抑制细胞增殖,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡;qPCR结果显示滋阴化痰方可以增加胃癌细胞中ncRuPAR的表达;Western blot结果显示滋阴化痰方可以抑制PI3K、p-Akt、CyclinD1和Bcl-2蛋白的表达。
  研究结论:ncRuPAR可通过下调PAR-1的表达和抑制PI3K/Akt通路发挥其抑制胃癌细胞增殖及促凋亡作用。上调ncRuPAR的表达和抑制PI3K/Akt通路是中药“滋阴化痰方”抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡的可能分子机制之一。
[硕士论文] 赵安静
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胃癌是世界第四大常见癌症,致死率居于世界第二位。在一些亚洲国家,通过食管胃十二指肠镜(EGD)筛查胃部疾病及胃癌可以提高了胃癌的生存率。然而,EGD检查产生的恶心、呕吐等不适使得患者不愿意遵循检查,不利于EGD的大范围推广。我们的研究表明,磁控胶囊胃镜(MCCG)有着良好的耐受性,且与EGD准确性高度一致。本研究旨在评估MCCG在无症状人群中溃疡、息肉、粘膜下隆起(SMT)及胃癌等疾病的筛查结果,并比较疾病在性别、年龄、地域等方面的差异。
  方法:
  通过严格的统一入选标准,收集2016年4月至12月在全国99家体检中心参与体检登记的3182名无症状体检者的MCCG图片,通过安翰云平台阅片中心,进行中心统一阅片。通过多中心的临床数据研究分析,评估MCCG对胃癌、溃疡、息肉、SMT等疾病的筛查结果。对疑似胃癌及溃疡的病人,性EGD和病理活检进一步明确诊断。
  结果:
  1.本研究共计纳入的3182例受检者,检查时间为2016年4月至2016年12月,包含全国99家体检中心,其中男性1971人(61.9%),女性1211人(38.1%),平均年龄为44.8岁(年龄范围18-94岁),其中41-45岁年龄组的比例最大,共574例受检者。11例受检者由于缺少年龄信息而被排除在年龄分析之外。所有检查者均完成MCCG检查。
  2.MCCG对胃癌筛查结果:通过对3182例体检者的进行MCCG,发现7名体检者(0.22%)被为晚期癌症,2名患者存在多处癌性病变。在这7名癌症患者中,男性4人,女性3人。所有这些患者年龄均超过50岁,因此在大于50岁的体检人群中,胃癌的检出率为0.74%。对于每个病灶位置分析,发病率最高为胃体(n=3),食管(n=1),贲门(n=2),胃底(n=1),胃角(n=1)和胃窦(n=2),7例患者通过胃镜进行活检,病理证实均为腺癌。
  3.MCCG对胃病的筛查结果:在无症状体检者中发现阳性病灶(包括溃疡、息肉、粘膜下隆起(包含胃及十二指肠)609处。其中49例体检者检查到多种病变(≥2种病变类型)。其中,发现息肉331例(10.4%),溃疡156例(4.9%),SMT115例(占3.6%)。息肉、溃疡及SMT分别占阳性总数的58.4%、27.5%、20.3%。
  4.不同年龄段、不同性别的病灶检出率:随着年龄的增加,局灶性病变的患病率增加(P<0.05)。50岁以上患者局灶性病变的患病率明显升高。男性患者溃疡患病率较高,息肉患病率较低(P<0.001),SMT患病率无性别差异。
  5.安全性指标:纳入的3182例受试者均顺利完成检查,MCCG胃检查时间1~142min,平均21min,四分位间距(IQR)27min。其中13例少于10分钟,MCCG检查完全率为99.6%。有27例受检者(0.8%)在2周内未排除胶囊。3-4周后再次随访发现,所有受检者未经特别的干预或治疗均自发排出胶囊。
  结论:
  MCCG作为一种新型检查方式,对于胃部疾病的筛查具有较高的检出率,并可发现无临床症状的癌症患者,为胃癌的筛查提供了一种舒适、准确且依从性高的方式。推荐使用磁控胶囊胃镜作为无症状体检人群中胃癌等疾病的筛查方式。
[硕士论文] 姜宏雪
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:胰腺癌起病隐匿,恶性程度高,预后差,因此正确诊断胰腺实性占位性病变的良恶性尤为重要。目前临床上广泛应用的诊断胰腺实性占位性病变的影像学手段有经腹超声(Transabdominal Ultrasound,TUS)、CT、MRI和PET-CT等。值得提出的是由于超声内镜技术的迅速发展,超声内镜(Endoscopic Ultrasonography,EUS),超声内镜引导下细针穿刺抽吸术(Endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration,EUS-FNA)和超声内镜引导下细针穿刺活检术(Endoscopic ultrasound-guided fine-needle biopsy,EUS-FNB)在胰腺实性占位性病变的诊断中正发挥着越来越重要的作用。这归功于超声内镜可近距离的对消化道管壁及邻近脏器进行超声扫查,因此可以更为清晰的显示病变超声图像,同时超声内镜引导下穿刺技术可获取细胞学和组织学样本,明确胰腺实性占位性病变的病理诊断,在EUS的基础上进一步提高了胰腺实性占位性病变的诊断准确性。而目前比较影像学手段和EUS-FNA/FNB诊断胰腺实性占位性病变准确性的相关研究相对较少。同时比较EUS-FNA和EUS-FNB诊断胰腺实性占位性病变准确性的相关研究仍存在较大争议,即EUS-FNB是否可获取更多的组织学样本以提高胰腺实性占位性病变的诊断准确性,值得进一步讨论。因此本研究分以下两部分进行探讨。
  第一部分:EUS-FNA/FNB与增强CT、增强MRI、PET/CT在胰腺实性病变诊断中的比较
  目的:探索EUS-FNA/FNB与增强CT、增强MRI和PET-CT诊断胰腺实性占位性病变的准确性,分析各项检查手段的优势,指导临床决策及进一步治疗。
  方法:本研究回顾性纳入2012年11月至2016年11月期间怀疑胰腺实性占位性病变就诊于上海长海医院消化内科行EUS-FNA/FNB的病例。共纳入行EUS-FNA病例254例,穿刺胰腺病灶256个,其中同期行增强CT和EUS-FNA共计159例,同期行增强MRI和EUS-FNA共计89例,同期行PET-CT和EUS-FNA共计34例。共纳入行EUS-FNB病例168例,穿刺胰腺病灶171个,其中同期行增强CT和EUS-FNB共计107例,同期行增强MRI和EUS-FNB共计49例,同期行PET-CT和EUS-FNB共计20例。分析比较影像学手段与EUS-FNA/FNB诊断胰腺实性占位性病变的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值。
  结果:EUS-FNA诊断胰腺实性恶性肿瘤的特异性和阳性预测值均为100%,显著高于增强CT的75.0%和91.3%,显著高于增强MRI的75.9%和88.5%,差异有统计学意义(P<0.05)。EUS-FNB诊断胰腺实性恶性肿瘤的特异性和阳性预测值均为100%,显著高于增强CT的80.0%和92.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。EUS-FNA/FNB与PET-CT在诊断胰腺实性恶性病变的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确性方面无明显统计学差异。
  结论:相较于增强CT,EUS-FNA/FNB诊断胰腺实性恶性病变的特异性和阳性预测值较高。相较于增强MRI,EUS-FNA诊断胰腺实性恶性病变特异性和阳性预测值较高。相较于增强CT或增强MRI,EUS-FNA/FNB更有助于减少胰腺良性病变的误诊率。EUS-FNA/FNB与PET-CT在诊断胰腺实性恶性病变的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确性方面无明显差异。
  第二部分:EUS-FNA和EUS-FNB在胰腺实性病变鉴别诊断中的应用比较
  目的:比较两种穿刺技术诊断胰腺实性恶性病变的敏感性、特异性、准确性以及22G FNA和22G FNB两种穿刺针的安全性、可行性,尤其是比较两种穿刺技术鉴别诊断特定胰腺实性肿瘤的准确性,从而明确EUS-FNB是否可获取更多的组织条提高胰腺实性恶性肿瘤的鉴别诊断准确性。
  方法:本研究回顾性纳入2012年11月至2016年11月期间因怀疑胰腺恶性占位在上海长海医院消化内科行EUS-FNA/FNB的病人。共纳入422例患者,427个胰腺穿刺病灶,其中254例患者行EUS-FNA,168例患者行EUS-FNB。比较细胞及组织学样本的质量分析,穿刺针的安全性、可行性以及两种穿刺技术诊断胰腺实性占位性病变的敏感性、特异性和准确性。
  结果:EUS-FNA和EUS-FNB两组在细胞学、组织学及总体诊断胰腺恶性病变的敏感性、准确性、特异性、阳性预测值、阴性预测值方面均无明显差异。然而22GFNB组织学鉴别诊断胰腺导管腺癌与胰腺实性非导管腺癌肿瘤准确性为69.8%,显著高于22G FNA的57.9%,两组比较差异有统计学意义(P=0.033)。
  结论:两种穿刺技术诊断胰腺实性恶性病变的敏感性、准确性、特异性、阳性预测值、阴性预测值无明显差异。22G FNB和22G FNA两种穿刺针在可行性、安全性、有效性方面无明显差异,然而在鉴别诊断胰腺实性肿瘤方面,22G FNB可以获取更多的组织条帮助正确鉴别诊断特定的胰腺实性肿瘤。
[硕士论文] 王超
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:细胞不可逆地脱离细胞周期,丧失增殖能力,达到一种相对稳定的状态,这种状态被称为细胞衰老(cellular senescence),它能够改变微环境和组织稳态。许多研究证明,肿瘤的发生、发展以及治疗都与细胞衰老有着密切的联系。一方面,表现出无限增殖能力的肿瘤细胞通常具有衰老障碍的特点,最终表现为细胞周期调控机制的紊乱。肿瘤发生的前提条件是细胞突破周期调控机制获得无限分裂增殖能力,即永生化,肿瘤细胞无限分裂增殖的必要条件则是细胞衰老相关调控信号通路的障碍,而这种细胞衰老相关调控信号通路的障碍则是肿瘤发生的早期事件之一。另一方面,我们知道细胞凋亡和细胞自杀是细胞抑制肿瘤形成的重要途径,除此之外,细胞还可以通过进入衰老的状态来阻滞细胞周期,影响细胞分裂,进而抑制肿瘤的发生。随着衰老研究的不断进行,细胞衰老是阻止肿瘤形成的天然屏障这一观点得到了越来越多研究者的认可。因此,探讨细胞衰老与肿瘤发生之间的关系,将细胞衰老与肿瘤形成机制及肿瘤治疗联系在一起,将为肿瘤发生机制和治疗方案的研究带来很多有益的启示。
  肝癌是一种严重危害我国人民身体健康的恶性癌症之一,近年来我国肝癌的发病率逐年上升,据统计全世界肝癌发病总人数的二分之一以上分布在中国,我国已经成为一个名副其实的“肝癌大国”。肝细胞癌在肝癌患者中的比例高达80%以上,通常发生在慢性肝损伤患者中。慢性肝损伤是一种由多种损伤因素如病毒感染、长期饮酒、药物毒性、遗传性物质代谢障碍所引起的进行性肝实质细胞破坏与再生的复杂病理过程,而这些病理变化往往通过不同的机制促进了肝病的进展,并成为肝癌发生发展的诱因。研究慢性肝损伤中细胞衰老与肝癌发生发展的关系,对阐明肝癌的发生机制与发展肝癌的治疗方案具有重要意义。
  本课题的研究内容主要分为四个部分。首先,我们建立了急性和慢性肝损伤的动物模型,并开展了急慢性损伤下肝脏的病理变化规律和肝细胞衰老规律的研究。延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase,Fah)基因敲除小鼠,简称Fah-/-小鼠,是由Grompe等建立的酪氨酸血症Ⅰ型小鼠模型。该模型由于FAH的缺失使得酪氨酸代谢受阻,产生具有DNA损伤作用的毒性代谢产物从而导致急性肝损伤,小鼠因肝衰竭8周左右死亡。添加药物NTBC能够抑制酪氨酸代谢上游代谢酶活性,从而抑制毒性代谢产物产生,Fah-/-小鼠表现为正常表型。当仅添加2.5%治疗剂量的NTBC饲养时,Fah-/-小鼠发生慢性肝损伤。我们分别对8周龄的Fah-/-小鼠给予停药处理和给予2.5%治疗浓度的NTBC处理,使得两组小鼠分别出现肝脏急性损伤和慢性损伤。我们发现给予2.5%治疗剂量NTBC的Fah-/-小鼠直到8周仅表现为较轻的慢性肝脏病变,如小的炎症坏死灶、小的脂肪变性病灶及轻微的核多态化和肝细胞肿胀,而完全停药组在8周时呈现出严重的急性肝损伤,主要表现为大量肝细胞多核化、广泛的弥漫性坏死、胆管增生性病变及严重的肝细胞脂肪变性和肿胀。由于细胞周期阻滞细胞不能完成正常分裂可导致衰老细胞的体积增大,因此细胞体积的变化可以用来指示细胞衰老。利用肝细胞面积作为分析肝细胞体积变化的指标,我们发现急性损伤4周和8周时,Fah-/-小鼠的肝细胞面积显著增大,而慢性损伤时Fah-/-小鼠其肝细胞面积在4周时没有明显增加,在8周时虽有所增加但仍显著低于急性损伤组。这提示我们不同肝损伤程度下肝细胞衰老的状况不同。为了进一步确认急慢性肝损伤下肝细胞衰老的情况,我们建立了综合的肝细胞衰老鉴定方案,包括衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、衰老相关的异染色质(SAHF)染色和细胞周期抑制因子p53及p21的表达水平检测。为了明确急性肝损伤下Fah-/-小鼠肝细胞的衰老规律,我们在Fah-/-小鼠急性损伤后0、2、4、6、8周等五个时间点分别取材,利用建立的衰老评价方案进行评价,我们发现随着急性肝损伤时间的增长,肝细胞衰老相关的各项指标表达不断升高,从而表明急性损伤下Fah-/-小鼠肝细胞确实发生了衰老,Fah-/-小鼠肝细胞表现出稳定的衰老表型。为了进一步验证我们的推断:慢性损伤下Fah-/-小鼠肝细胞未发生细胞衰老。我们在慢性损伤后0、4、8、12周等四个时间点分别取材,我们发现慢性损伤下Fah-/-小鼠肝细胞并未表现出稳定的衰老表型。结合急慢性肝损伤下不同的个体命运,我们提出这样的假设:肝细胞衰老的诱导需要损伤程度达到一定阈值,慢性损伤下Fah-/-小鼠肝细胞不能衰老可能是其高发肝癌的主要原因。
  第二,为了明确肝细胞衰老的发生与否确实影响了急慢性肝损伤下肝癌的发生,我们进行了如下实验。首先我们通过肝功能指标检测进一步确认了Fah-/-小鼠呈现的急慢性肝损伤表型。我们发现完全停药处理下,Fah-/-小鼠血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶及总胆红素水平显著升高,白蛋白的含量显著降低,表现为急性肝损伤;低剂量处理下Fah-/-小鼠血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶及总胆红素水平仅有一定升高,而血清白蛋白的含量仅有一定的降低,表现为慢性肝损伤。接下来我们统计了急慢性肝损伤情况下Fah-/-小鼠的成瘤情况。我们知道急性损伤下Fah-/-小鼠在6-8周会因毒性代谢产物导致的肝衰竭而死亡,为了延长急性损伤时间到达慢性损伤所需的成瘤时间,即12周和26周,我们在急性损伤下Fah-/-小鼠损伤到达极限(体重下降至原始体重的70%-75%)时给予3天治疗剂量的NTBC,然后再次停药,如此循环往复使急性损伤时间延长至12周和26周。经统计比较,我们发现急性损伤12周时均未见Fah-/-小鼠成瘤,而慢性损伤12周时Fah-/-小鼠成瘤率为100%。急性损伤26周时,Fah-/-小鼠成瘤率为36%,相对于慢性损伤26周(100%)显著降低,同时急性损伤下Fah-/-小鼠肝脏中瘤状体的数量、大小均显著低于慢性损伤组。通过上述研究,我们可以看出在不给予任何干预的情况下,急性损伤的Fah-/-小鼠由于毒性代谢产物蓄积,引起了严重的肝损伤最终导致Fah-/-小鼠走向死亡;通过在损伤极限时给予短时NTBC使得急性损伤下Fah-/-小鼠逃避了因肝衰竭而死亡的命运,同时又利用急性损伤的特点保证了小鼠肝细胞衰老及衰老监控的正常激活,使得肝癌的发生得以有效抑制;慢性损伤下Fah-/-小鼠避免了严重的肝损伤,肝细胞未表现出稳定的衰老表型,Fah-/-小鼠中DNA损伤的肝细胞不能通过细胞衰老清除,导致了肝癌的发生。进一步,通过收集急慢性各个时间的样本进行RNA-seq分析,通过衰老相关信号通路、肝癌相关信号通路,细胞周期及细胞增殖相关通路变化规律的分析,从整体转录组水平印证了我们之前的实验推测,即肝细胞衰老抑制的同时伴随着肝癌的发生。
  第三,为了进一步证实慢性肝损伤下肝细胞未发生衰老是肝癌发生的主要原因,我们通过加重损伤程度诱导慢性损伤下肝细胞发生衰老,观察肝癌发生是否受到抑制。选取已经慢性损伤8周的Fah-/-小鼠,给予完全停药诱导急性损伤4周,诱导肝细胞发生衰老,12周后统计小鼠成瘤情况。我们发现慢性肝损伤8周再诱导急性损伤4周后,Fah-/-小鼠肝细胞再次呈现衰老表型,即肝细胞衰老被重新启动。而且12周时小鼠成瘤率仅为14.29%,相对于慢性肝损伤12周时Fah-/-小鼠的成瘤率显著降低。由此可见,慢性肝损伤下的Fah-/-小鼠,通过诱导急性肝损伤诱导肝细胞发生衰老,可以有效的阻止肝细胞癌的发生。
  第四,探究细胞衰老抑制肝癌发生的相关机制。细胞衰老是生物体内潜在的肿瘤抑制机制,虽然关于细胞衰老与肿瘤发生的相互关系越来越受到科研工作的重视,但肝细胞衰老抑制肝癌发生关系的机制仍不明确。肝细胞衰老抑制肝癌发生的重要机制是细胞衰老诱导的免疫监控。通过比较慢性损伤和慢性损伤诱导急性损伤肝脏中的免疫细胞数量,我们证实Fah-/-小鼠肝细胞衰老发生后重新激活了衰老相关的免疫监控,衰老细胞激活CD4+Th1细胞,进一步促进NK细胞和巨噬细胞的活化和增值,从而介导了细胞毒效应而清除衰老的肝细胞,从而发挥抑制肝癌的作用。
  本研究通过应用Fah-/-小鼠模拟不同损伤程度的急性和慢性肝损伤,使得肝细胞衰老的发生可以调控,作为肝癌模型完美的再现了肝细胞衰老与肝癌发生的关系,清晰表明肝细胞衰老是抑制肝癌发生的主要保护机制,从而为慢性肝损伤下调控肝细胞衰老抑制肝癌发生奠定了理论基础,为实现肝细胞衰老可调控性和肝癌衰老诱导治疗提供了理论依据和实验方案。这对于研究细胞衰老与肝癌发生的关系,对阐明肝癌的发生机制,完善肝癌的治疗方案,具有重要生物学和医学意义。
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