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[博士论文] 程艳洁
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在20-23个核苷酸之间的、基因组编码的、进化保守的非蛋白编码RNA,通过靶向mRNA的3'UTR影响靶基因的表达,进而发挥重要的调控作用。近年来,大量的研究结果显示,miRNAs在肝脏的生理病理进程中均发挥重要作用。研究结果显示:PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性;miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。主要成果如下:
  1、PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性。
  某些增塑剂、降血脂药、农用化学品和环境污染物等化合物均是过氧化物酶体增殖物(peroxisome proliferators,PPs)。适当剂量的PPs引起过氧化物酶体的数量和大小适度增加。但是,高剂量的PPs则会导致不同程度的有害作用。长期向小鼠和大鼠施用PPs会导致其肝肿大,并最终导致肝癌的发生。核受体过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PARA)被证明在这个过程中发挥重要作用。但是,生物体降低过量PPs产生的危害的生物适应性机制尚不清楚。
  研究发现:(1)高剂量PPARA激动剂诱导miR-181a2表达;(2)进一步研究发现,Hsa-miR-181a2启动子区域含有预测的过氧化物酶体增殖物反应元件(Peroxisome proliferator responsive element,PPRE),且PPARA直接结合于该元件上;(3)高剂量PPARA激动剂引起ROS、DNA断裂、凋亡等细胞毒性;(4)外源表达miR-181a-5p显著降低PARA过度激活引起的细胞毒性。
  结论:miR-181a2和PPARA之间的反馈环路调节在PPARA被过度激活的情况下促进了生物系统的平衡。这一平衡机制的发现有助于建立更有意义的人体风险评估,并为药物的合理设计提供理论基础。
  2、miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。
  各种慢性肝脏损伤,包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝炎均能引起肝脏纤维化,肝纤维化往往导致肝功能受损,并最终导致肝功能衰竭。肝纤维化的一个典型特征是肌成纤维细胞产生的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的堆积。尽管肝纤维化在慢性疾病中引起明显的发病率和死亡率,但是关于对介导肝纤维化的特定分子的认识并不充分,这在一定程度上妨碍了抗纤维化治疗的设计。据报道,在转基因小鼠肝纤维化过程中肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)占肌成纤维细胞群总量的90%。一直以来,HSCs的激活被认为是肝纤维化过程中的核心事件。作为对传统机制的补充,近年来的研究成果显示,肝星形细胞的EMT在肝纤维化过程中发挥重要作用。在大鼠中,上调肝细胞核因子4a(Hepatocyte nuclear factor4a,HNF4α)可通过抑制激活的星形细胞EMT减轻肝纤维化。有研究报道,HSCs激活后,miR-126的表达发生极显著变化。但其在HSCs中的具体功能及作用机制则未见报道。
  在此,以人源的肝脏星形细胞LX2、肝细胞LO2和大鼠肝脏星形细胞系HSC-T6为主要细胞模型,获得主要研究结果如下:(1)外源表达miR-126-5p诱导了肝脏星形细胞的激活和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT);(2)EMT相关转录因子ZEB1的mRNA水平和蛋白水平在外源表达miR-126-5p后均显著升高;(3)进一步的研究显示,miR-126-5p直接靶向糖原合酶激酶3B(Glycogen synthase kinase-3,GSK3B的3'UTR抑制GSK3B的蛋白水平,并通过Wnt/B-catenin信号通路调控ZEB1的表达;(4)外源表达miR-126-5p和GSK3B抵消了单独表达miR-126-5p对EMT的促进作用。
  结论:miR-126-5p直接参与到肝星形细胞的激活和上皮-间质转化过程,证明了miR-126-5p通过直接靶向GSK3B,进而打开Wnt/B-catenin信号通路,这在诱导肝脏星形细胞的上皮-间质转化中发挥重要作用,提示miR-126-5p可能在将来作为一个抗纤维化的分子靶标。
[硕士论文] 刘爱茹
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:轻症急性胰腺炎症状轻,为自限性疾病,中度重症或重症急性胰腺炎症状重,早期并发症多,病死率高。液体复苏是中度重症或重症急性胰腺炎初期治疗的关键环节,在发病早期克服血管内液体丢失,阻止或减轻腹膜后间隙、腹腔及组织间隙液体的潴留,对阻止中度重症向重症急性胰腺炎的进展,降低机械通气率,降低病死率,提高预后效果具有重要意义。补液不及时或补液量不足可导致循环衰竭时间过长,增加胰腺坏死、多器官功能衰竭的发生率,补液过量或晶胶比不恰当则增加第三间隙的液体潴留,导致急性肺水肿、腹腔高压等并发症的增加。有效补液目标不仅仅是纠正低血容量,还包括稳定毛细血管通透性,调节炎症反应,维持肠粘膜屏障功能。而目前对于中度重症或重症急性胰腺炎早期最佳补液类型、补液量及补液速率尚存在争议,且缺乏循证医学的研究证据。本试验拟分别探讨早期不同晶胶比的液体复苏对中度重症急性胰腺炎预后影响及早期不同液体复苏速率对重症急性胰腺炎预后的影响。
  第一部分 不同晶胶比液体早期复苏对中度重症急性胰腺炎预后影响
  目的:探讨不同晶胶比液体早期复苏对中度重症急性胰腺炎(Moderate Severe Acute Pancreatitis,MSAP)预后影响,为阻止MSAP进展为脏器功能衰竭提供治疗方法的依据。
  方法:回顾性分析我院2015年1月至2017年7月,共72例入院初诊为MSAP患者的临床资料。以入院后7d内液体晶胶比4.5和7.5为界,将患者分为低晶胶比组(晶胶比<4.5,n=23)、中晶胶比组(晶胶比4.5~7.5,n=25)、高晶胶比组(晶胶比>7.5,n=24)。分析早期不同晶胶比液体复苏对进展为重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis,SAP)的发生率、多脏器功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Sydrome,MODS)的发生率、机械通气率、胰腺坏死感染的发生率、50d死亡率、全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS)持续的时间,以及肠内营养达全量所需时间的影响。
  结果:(1)入院后7d内高晶胶比组总晶体量显著高于中、低晶胶比组(14485±3917ml比11544±2639ml、10771±2628ml,均P<0.05),总胶体量显著低于中、低晶胶比组(996±528ml比1968±574ml、3680±1310ml,均P<0.05),而补液总量(15480±3910ml比13512±3117ml、14451±3073ml,均P>0.05)、补液速率V1(入院24h补液总量与72h补液总量的比值)、V2(入院72h补液总量与7d补液总量的比值)(0.384±0.088比0.376±0.061、0.358±0.074,均P>0.05;0.515±0.054比0.497±0.057、0.495±0.042,均P>0.05)差异均无统计学意义。(2)高晶胶比组7d内进展为SAP发生率、MODS发生率均显著高于中晶胶比组(50.0%比16.0%,54.1%比20.0%,均P<0.0167),机械通气率、胰腺坏死感染发生率、50天死亡率均高于中、低晶胶比组(12.5%比4.0%、8.7%,均P>0.05;20.8%比8.0%、17.4%,均P>0.05;8.3%比0%、4.3%,均P>0.05),但差异并不显著。(3)高晶胶比组SIRS持续的时间及肠内营养达全量所需的时间(d)均较中晶胶比组显著延长(16.5±15.2比8.2±6.4,7.2±3.6比4.8±2.5,均P<0.05)。
  结论:对于MSAP患者,早期采用合适的晶胶比进行液体复苏可以降低其进展为SAP、MODS发生率,减少SIRS持续时间,促进肠道黏膜屏障功能的恢复。
  第二部分 早期不同补液速率液体复苏对重症急性胰腺炎预后影响
  目的:探讨早期不同补液速率对重症急性胰腺炎(Severe Acute Panereatitis,SAP)预后的影响,为改善SAP的预后提供有效的液体复苏方案。
  方法:回顾性分析我院2016年1月至2017年11月,共40例SAP患者的临床资料。以补液速率(入院后24h补液总量与入院72h补液总量的比值)0.35与0.44为界,将患者分为低补液速率组(补液速率<0.35,n=12)、中补液速率组(补液速率0.35~0.44,n=14)、高补液速率组(补液速率>0.44,n=14)。分析早期不同补液速率的液体复苏对多脏器功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Sydrome,MODS)的发生率、机械通气率、胰腺坏死感染的发生率、40d死亡率、C反应蛋白(C-Reactive Protein,CRP)的水平变化、全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS)持续时间的影响。
  结果:(1)入院后24h内高补液速率组总补液量(4261±1084)ml>中补液速率组(3364±914) ml>低补液速率组(2388±481) ml,均P<0.05;入院后72h高补液速率组总补液量(8771±1871)与中补液速率组(8556±2083) ml、低补液速率组(8256±2230)差异无统计学意义,均P>0.05;高补液速率组的补液速率(0.48±0.04)>中补液速率组(0.39±0.03)>低补液速率组(0.29±0.05),均P<0.05;三组72h晶胶比值差异均无统计学意义。 (2)中补液速率组MODS发生率显著低于高补液速率组(35.7%比85.7%,P<0.0167),中补液速率组机械通气率低于高补液速率组(14.2%比57.1%,P>0.0167),中补液速率组胰腺坏死感染发生率、40d死亡率均低于高、低补液速率组(21.4%比42.8%、41.7%,均P>0.05;7.1%比28.5%、25.0%,均P>0.05); (3)入院24t中补液速率组CRP水平(mg/l)与高、低补液速率组相比差异无统计学意义(277.7±135.8比322.5±132.6、301.6±86.9,均P>0.05),液体复苏72h后复查CRP水平,中补液速率组显著低于高、低补液速率组(171.7±74.1比261.7±87.5、236.5±73.2,均P<0.05),且中补液速率组SIRS持续的时间短于高、低补液速率组(13.2±6.2比27.8±24.4、18.2±11.3,均P>0.05),但差异无统计学意义。
  结论:对于SAP患者,早期采用合适的补液速率进行液体复苏可以降低MODS发生率,控制炎症反应的级联扩大,是否有利于降低胰腺坏死感染率、死亡率尚需大样本的临床研究予以证实。
[硕士论文] 孔二亮
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  阻塞性黄疸是一种由于各种原因导致的肝内外胆管阻塞,胆汁无法通过正常通道排出而淤积在体内所致的一种临床症状,常见于肝内外肿瘤、胰头肿瘤、结石嵌顿等疾病,肝功能在一定程度受到损害,机体发生复杂的病理生理改变。阻塞性黄疸存在特殊的痛觉现象,对伤害性刺激不敏感即痛阈增高。在临床工作中痛阈增高容易导致患者就诊延迟、围术期麻醉镇痛药物使用相对过量、呼吸抑制、苏醒延迟等,不利于病人术后恢复。本课题的目的是探索黄疸患者中枢增高的胆红素(Bilirubin)通过与脊髓背角的5-羟色胺3A(5-hydroxytryptamine3A,5-HT3A)受体结合激活γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能神经元,通过促进抑制性递质GABA的合成释放和增强GABA神经元抑制性活动介导阻塞性黄疸的痛阈增高。
  方法:
  1、通过胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)创建阻塞性黄疸的模型,采用全自动生化分析仪分析血清和脑脊液中肝功能各项指标的改变。BDL和胆红素鞘内注射测定Sprague-Dawley(SD)大鼠的痛阈。BDL、胆红素鞘内注射和脊髓背角神经元培养后,通过western blot的方法观察5-HT3受体各亚型的表达变化,并通过免疫荧光观察BDL后脊髓切片神经元激活情况和5-HT3A受体表达变化。
  2、通过鞘内注射5-HT3A受体拮抗剂、GABAA受体拮抗剂、GABAB受体拮抗剂后测定BDL大鼠痛阈的变化。脊髓背角神经元培养鉴定GABA能神经元上5-HT3A受体的表达情况,并进一步通过western blot的方法观察BDL、胆红素鞘内注射和脊髓背角神经元培养胆红素干预后GABA受体各亚型的表达变化,并通过酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定脑脊液内GABA浓度。电生理技术记录5-HT3A受体激动剂和胆红素对脊髓背角GABA能抑制性突触后电流(spontaneous inhibitory postsynaptic current,sIPSC)的影响以及应用5-HT3A受体拮抗剂后电流变化。
  3、通过慢病毒将携带目的基因的质粒转染进入人胚肾293细胞(human embryonic kidney293,HEK293)构建过表达人5-HT3A受体的HEK293细胞(HEK293-5-HT3A),电生理膜片钳观察胆红素和5-HT3A受体激动剂对细胞内向电流的影响。放射性配基结合实验测定胆红素和5-HT3A受体的亲和力大小,并通过同源建模和分子对接的方法模拟预测胆红素和5-HT3A受体的空间结构、结合方式以及结合位点。
  结果:
  1、胆总管结扎术后大鼠血浆总胆红素(total bilirubin,TB)、直接胆红素(direct bilirubin,DB)和间接胆红素(indirect bilirubin,IB)、胆汁酸(total bile acid,TBA)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)均随着BDL时间增加而增加,而脑脊液中仅有TB和IB升高,且在3、5、7天显著高于sham组。BDL后大鼠机械痛阈和热痛阈显著升高,鞘内直接注射胆红素后大鼠机械性痛阈和热痛阈显著高于注射前。BDL3d大鼠鞘内注射昂丹司琼抑制了胆总管结扎大鼠的痛阈升高,且具有浓度依赖性。BDL、胆红素鞘内注射以及胆红素直接培养大鼠脊髓背角神经元后5-HT3A受体表达逐渐增加。免疫荧光显示BDL后5-HT3A受体表达高于假手术组,且活化的神经元数量增加,活化的神经元同时高表达5-HT3A受体。
  2、鞘内给予昂丹司琼(ondansetron)、荷包牡丹碱(bicuculline)显著降低黄疸大鼠的痛阈,而CGP55845对痛阈的降低作用较弱。且昂丹司琼、荷包牡丹碱抑制了鞘内注射5-HT3A受体激动剂mCPBG、胆红素诱导的痛阈增高。脊髓背角神经元培养免疫荧光染色显示培养的GABA能中间神经元多数表达5-HT3A受体,且BDL、胆红素鞘内注射大鼠以及胆红素直接培养脊髓背角神经元后GABAA受体表达增加,昂丹司琼在一定程度抑制GABAA受体的表达。ELISA提示BDL和胆红素鞘内注射后脑脊液内GABA浓度明显增加,昂丹司琼干预后GABA水平有短暂下降。电生理记录提示mCPBG、胆红素增强GABA能神经元的sIPSC,而昂丹司琼干预后mCPBG、胆红素对sIPSC的作用减弱。
  3、胆红素诱发HEK293-5-HT3A细胞产生内向电流。放射性配基结合实验证实胆红素同5-HT3A受体有较弱的亲和力,两者以能量较低的方式相结合。胆红素能够进入5-HT3A受体亚基之间形成的疏水间隙,两者在空间结构上具有良好的互补性,并且有氢键形成。
  结论:
  本研究可得出如下结论:
  1、胆红素通过5-HT3A受体增高阻塞性黄疸的痛阈。
  BDL后大鼠机械性痛阈和热痛阈显著升高,且脑脊液内胆红素水平增加。鞘内注射胆红素同样增加大鼠痛阈,且可被5-HT3A受体拮抗剂所抑制。同时5-HT3A受体在胆红素干预后表达明显增加,且脊髓背角神经元活性增加。
  2、胆红素通过5-HT3A受体影响GABA通路的功能。
  5-HT3A受体激动剂、胆红素鞘内注射均可增高大鼠痛阈,这种效应可被5-HT3A受体拮抗剂、GABA受体拮抗剂所抑制。同时,5-HT3A受体在培养的脊髓背角GABA能神经元上大量表达,且GABAA受体在胆红素干预后蛋白表达明显增加,GABA浓度在BDL和胆红素鞘内注射后显著增加。
  3、胆红素与5-HT3A受体以氢键相结合。
  胆红素能够诱发HEK293-5-HT3A细胞产生内向电流,且放射性配基结合实验证实胆红素同5-HT3A受体的亲和力较弱,提示两者以共价键或离子键等结合的可能性较小。同源建模和分子对接进一步证实了胆红素能够进入5-HT3A受体两个亚基之间形成的疏水间隙,两者在空间结构上具有良好的互补性,并且有氢键形成。
  阻塞性黄疸中枢升高的游离胆红素能够与脊髓背角的5-HT3A受体以氢键相结合,从而增强GABA能中间神经元的活动,参与黄疸患者的痛阈增高。
[硕士论文] 严晓南
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:现有的胃肠道动力检查方式多样,主要有消化道显像、导管测压、呼气试验、不透X线钡条法、无线动力胶囊等等。无线动力胶囊是检测胃肠道理化状态的功能性胶囊,是一种无创、无辐射检查方式,而其他检查方法多涉及核素标记、放射显影、置管测压等有辐射、有创操作。但是无线动力胶囊不能拍摄消化道图片,只能通过理化值的变化来推测胶囊的位置。为克服这一缺陷,新研发的压力胶囊内窥镜系统将理化检测与内镜、三维示踪技术结合,可以将图像、轨迹一同运用于评估胃肠道运动情况,有望提供一种更为舒适、安全、准确、全面的检查选择。
  目的:
  首先通过自身对照的动物实验研究,(1)探讨新型压力胶囊内窥镜系统的安全性,(2)使用压力胶囊内窥镜观察正常实验犬制备为便秘模型前后胃肠道动力情况的差异。进而对健康志愿者进行压力胶囊内窥镜检查,初步探索健康成年人胃肠道动力的情况。
  方法:
  首先对3只成年雄性比格犬的排便情况进行观察并留取血液、粪便标本,随后进行压力胶囊检查并对比检查前后实验犬的排便情况和血液、粪便化验结果。之后喂服复方地芬诺酯、盐酸阿洛司琼制备便秘模型成功后再次进行压力胶囊检查,与制备便秘模型前的检查结果进行自身对照,压力胶囊排出后留取犬胃肠道标本进行组织学检查。进而纳入1名符合入选标准的健康志愿者进行压力胶囊检查,获得其胃肠道运动状态的相关数据。
  结果:
  动物实验:
  1、压力胶囊获得正常实验犬消化道图像平均205.6±83.9张,压力及温度信息平均38266±17779.6次。正常实验犬全消化道检查平均时间748±369.6mi,体内温度平均38.4±0.4℃,全消化道绝对压力平均值107.63±8.43kPa。
  2、压力胶囊检查前后正常实验犬的每日排便次数、粪便性状、粪便重量以及血常规、肝肾功能电解质、粪常规均未出现显著改变(P>0.05),组织学检查未见明显病理性改变。
  3、压力胶囊在便秘模型犬结肠的通过时间较正常实验犬显著延长(2222.7±239.8vs.453±372.4min,P=0.004),而在胃、小肠的检查时间没有统计学差异(P>0.05)。
  4、压力胶囊在便秘模型犬测得的小肠压力值较正常实验犬显著升高(111.34±7.06vs.101.58±2.26kPa,P=0.01)。而便秘模型犬与正常实验犬胃部、结肠的压力没有统计学差异(P>0.05)。
  临床试验:
  1、压力胶囊共顺利获得健康志愿者消化道图像24798张,记录压力和温度信息35314次。
  2、健康志愿者胃排空时间为102min,结合压力、图像分析胃部收缩频率为0.15次/min,小肠通过时间为224min、小肠管腔收缩频率为0.96次/min。
  3、健康志愿者胃部绝对压力变化范围为101.9至110.4kPa,小肠为102.7至111.6kPa。
  4、压力胶囊在胃内的平均速度为6.57cm/min、小肠内为2.74cm/min、结肠内为2.88cm/min。
  结论:
  运用压力胶囊内窥镜系统检测胃肠道动力安全可行,可成功收集消化道的图像、温度、压力信息并描记压力胶囊在胃肠道内的运动轨迹。便秘模型犬的小肠压力、结肠排空时间较正常实验犬显著增加。我们开展的压力胶囊第一例人体试验,通过图像、压力、三维示踪技术相结合,成功获得健康志愿者胃肠道动力数据。压力胶囊内窥镜系统将胃肠道动力检测变得可视化、空间立体化,具有广阔的应用前景。
[硕士论文] 韦小梅
护理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  本研究旨在采用循证护理研究、专家会议的方法构建出脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)患者肠道功能障碍干预方案,并通过临床类实验研究对方案的有效性进行验证,最终构建出一套科学、系统的SCI患者肠道功能障碍干预方案,为临床护士对SCI肠道功能障碍患者实施科学、规范、系统的肠道功能障碍干预提供理论参考,以降低SCI患者肠道功能障碍的发生率,提高SCI肠道功能障碍患者的生活质量。
  研究方法:
  1.以循证护理研究方法为基础,汇总和推荐SCI患者肠道功能障碍相关的高级别证据,再结合前期文献回顾的内容,初步拟定SCI患者肠道功能障碍干预方案。
  2.通过专家会议法对初步拟定的干预方案进行论证,使方案更具实用性和可操作性。
  3.开展短期临床护士SCI肠道功能障碍干预知识和技术培训,对培训前后护士对SCI肠道功能干预知识和技术的掌握情况进行考核,并对培训前后护士对SCI肠道功能障碍干预的态度和行为变化进行评价。
  4.采用类实验研究实施并评价干预方案,采用方便抽样的方法选取2017年1月至12月入住上海市某康复中心脊髓损伤康复科的71名SCI患者为研究对象,其中2017年1月至5月入住的34名SCI患者为对照组,2017年8月至12月入住的37名SCI患者为干预组。对照组实施常规护理方法,干预组实施本研究构建的脊髓损伤患者肠道功能障碍干预方案。通过比较两组患者肠道功能指标(排便时间,腹胀、便秘、大便失禁发生率,排便频率评分、粪便性状评分、药物依赖、大便控制情况等)、生存质量、健康教育掌握情况对肠道功能障碍干预的效果进行评价。采用SPSS22.0对数据进行分析和处理,患者的一般资料采用描述性分析,对符合正态分布的计量资料采用两独立样本的t检验,不符合正态分布的资料采用非参数检验,计数资料的比较使用卡方检验,当P<0.05时,认为差异有统计学意义。
  研究结果:
  1.循证护理研究共纳入13篇指南和11篇系统评价文献,通过讨论和汇总整理出肠道功能障碍相关证据62条,其中A级13项,B级22项,C级11项,D级16项,内容涉及评估方法、干预措施、干预效果评价、健康教育4大方面,在此基础上形成了SCI患者肠道功能障碍干预方案草案。
  2.遴选12名专家参加干预方案的专家论证会议,专家对研究内容的判断依据系数(Ca)为0.94,熟悉程度(Cs)为0.9,专家权威系数(Cr)为0.92,专家权威程度较高,论证结果可信。
  3.对SCI康复科护士进行SCI肠道功能障碍相关知识和技术的短期培训,培训后护士在SCI肠道功能障碍知识和技术方面考核得分明显高于培训前(P<0.001),对SCI肠道功能障碍干预的认知程度也明显提高(P<0.05),同时对SCI肠道功能障碍干预执行力也显著提升(P<0.05)。
  4.临床实证研究结果显示,干预组患者在干预后排便频率评分、粪便性状评分、腹胀、便秘发生率和药物依赖率明显低于对照组(P<0.05),在大便失禁发生率方面差异无统计学意义(P>0.05);干预组患者排便耗时比对照组短(P<0.05),在大便控制评分上两组对比差异虽无统计意义(P>0.05),但干预组的大便控制评分比对照组高;在生存质量得分上,干预组患者在干预后生存质量总分和各领域得分均高于对照组(P<0.05);在健康教育方面,干预组患者对SCI肠道功能障碍相关知识和技术方面掌握情况明显高于对照组,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。
  研究结论:
  本研究基于循证护理研究的方法,对SCI肠道功能障碍相关的指南和系统评价进行检索和评价,总结高级别证据;结合前期文献回顾的内容,初步拟定出SCI患者肠道功能障碍干预方案,通过专家会议对初拟的干预方案进行论证,使方案更符合中国临床实践;采用类实验研究的方法对干预方案的效果进行临床验证,发现干预方案能有效改善SCI患者肠道功能、提高患者生存质量和对健康教育知识和技术掌握程度,为后期干预方案的推广应用奠定了理论基础。
[博士论文] 徐庆国
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乙型肝炎病毒感染(HBV)是全球范围内的主要公共健康问题之一,尤其是包括中国在内的发展中国家。虽然目前针对HBV的抗病毒治疗可以抑制HBV的复制,但仍不能彻底清除HBV。部分慢性乙型肝炎(CHB)患者发展成为进行性肝纤维化,并逐步导致了肝硬化,甚至是原发性肝细胞癌(简称肝癌)的发生。在中国,由于HBV感染的广泛性和抗病毒治疗的不规范性使得肝硬化和肝癌的发生比例较高。慢性HBV感染所导致的肝硬化和肝癌严重威胁着中国人民的生命健康,是中国十三五规划中需要着重解决的重大课题。
  HBVX基因(HBx)作为HBV四个开放阅读框之一,可以编码出分子量为17KD的HBx蛋白。大量的研究证实HBx蛋白在肝硬化和肝癌的发生发展过程中发挥了至关重要的作用,是尤为重要的病毒蛋白。由于HBV复制过程中不准确的逆转录和缺乏校对能力,HBx DNA存在多种变异。在前期研究中,通过测序技术在大队列的肝癌癌组织和癌旁组织中对HBx的基因型进行了调查,发现了一型携带多个位点共同变异的基因型,即HBx-EHBH2(HBx-E2)。预后分析表明携带HBx-E2的患者预后较好。此外,还初步研究了HBx-E2在肝癌细胞中的生物学功能。
  然而,HBx-E2在判断肝癌患者预后中的作用和在临床转化中的意义还需多中心的队列进行验证,而且HBx-E2在肝癌发生和发展中所发挥的功能,以及具体的分子机制仍需进一步探索。同时,HBx-E2与临床病理指标的相关性分析表明HBx-E2与肝硬化的缺失相关。所以,HBx-E2在肝硬化进程中是否也发挥了与其他基因型不同的作用,也需进一步研究。针对上述的科学问题,开展了本研究。
  第一部分HBx基因EHBH2基因型影响肝癌进程的分子机制
  研究目的:明确HBx-E2基因型在术前预测肝癌患者预后中的作用。确定HBx-E2在肝癌发生发展中的生物学功能及相关分子机制。
  研究方法:在不同地区的肝癌患者队列中检测HBx基因型,并对HBx-E2进行预后分析和临床病理指标相关性分析。构建多株表达多个HBx基因型的肝癌细胞系和肝细胞系,通过细胞计数试剂盒8(CCK8)、克隆形成、流式细胞术等实验明确HBx-E2对细胞增殖的影响。利用体外合成重组HBx蛋白和蛋白芯片筛选HBx-E2与野生型HBx蛋白结合蛋白的差异,并通过免疫共沉淀和激光共聚焦技术探索分子机制。
  研究结果:在不同地区的肝癌患者组织队列(n=171)的癌和癌旁中以及在血清队列(n=168)中,HBx-E2均与患者较好的预后相关。临床病理指标相关性分析表明HBx-E2与肝硬化缺失、肿瘤直径较小相关。按照HBx基因型分类和巴塞罗那肝癌临床(BCLC)分期在组织队列和血清队列分层进行预后分析,结果表明HBx-E2可以作为术前预测BCLC B期患者预后的分子标记物。体内外实验证明相对于其他基因型,HBx-E2失去了促进肝癌细胞和肝细胞增殖的能力。蛋白芯片和免疫共沉淀等实验发现HBx-E2失去与JAK1结合的能力,而且不能激活STAT3和STAT5。JAK1的抑制剂Upadacitinib可以抑制除HBx-E2外其他基因型的增殖能力。
  研究结论:HBx-E2可以作为分子标记物术前预测BCLC B期患者预后。HBx-E2失去了促进肝癌细胞和肝细胞增殖的能力,不能激活JAK1/STATs通路。JAK1是HBV相关肝癌中某些HBx基因型患者的潜在治疗靶点。
[博士论文] 庄璐
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几部分进行论述:
  第一部分 Aurora A激酶在小鼠胰腺组织中的表达分布研究
  背景及目的:研究AuroraA激酶在成年小鼠正常胰腺组织内和胰腺炎期间小鼠胰腺组织中的表达水平规律,并进一步探索胰腺组织中的AuroraA表达水平是否受炎症调控的表达情况。
  方法:首先我们对青年BAC小鼠进行腹腔注射超剂量雨蛙素刺激诱导急性胰腺炎,每天8次,注射一天后,分别在不同的时间节点(day1-7)收集相应的急性胰腺炎动物模型的胰腺组织,并与无雨蛙素刺激组(day0)为对照。通过qRT-PCR、WesternBlot和免疫组织化学染色方法检测不同处理的正常青年BAC小鼠的胰腺组织的AuroraA表达情况,并比较正常小鼠无处理胰腺组织和处于急性胰腺炎不同阶段的胰腺组织中的Aurora A表达水平差异。
  结果:qRT-PCR结果显示正常青年BAC小鼠胰腺组织中Aurora A基因的基础表达量较低,随着雨蛙素诱导胰腺组织内急性炎症的发生发展,Aurora A在胰腺组织内的表达量逐渐上升,并在雨蛙素诱导急性胰腺炎后的第4-5天达到峰值,约为正常无处理组的25倍,达到此峰值后Aurora A的表达量在几天内显著降低。Western blot和石蜡切片免疫组织化学染色的结果与qRT-PCR结果相似,均证实了Aurora A蛋白的表达量在处于急性炎症期间的胰腺组织内较之无处理组正常小鼠胰腺组织内显著高表达,其表达水平在雨蛙素构建的急性胰腺炎一周内呈现一个双相曲线的状态,Aurora A蛋白的表达水平在第3-5天达到峰值,显著高于雨蛙素诱导胰腺炎后的第1-3天、6-7天的胰腺组织内的表达量。
  结论:Aurora A激酶在小鼠正常胰腺组织和急性炎症期间的胰腺组织内均有表达,且雨蛙素构建的急性胰腺炎症动物模型的胰腺组织内Aurora A的表达水平有着明显的时效性。胰腺急性炎症期间的胰腺组织内的Aurora A的表达水平会随着时间的推移产生较为明显的双向性改变,并显著高于正常胰腺组织内的表达。
  第二部分 胰腺腺泡细胞Aurora A酶特异性敲除转基因动物的培育及其表型
  背景及目的:利用外源性他莫西芬诱导型Cre-Loxp重组系统构建胰腺腺泡细胞内的Aurora A激酶条件性敲除小鼠(AUO/BAC)。我们通过这种方法构建和培育了纯合AUO/BAC工具鼠,并观察了它的表型。
  方法:我们使用带有胰腺腺泡-弹力蛋白酶Ⅰ特异性的启动子调控的CreERT工具鼠(BAC),与带有floxed Aurora A片段的AUO纯合工具鼠(AURKAflox/flox)进行交叉培育,在他莫西芬外源性诱导的条件下,预期得到纯合的胰腺腺泡细胞内AuroraA基因条件性敲除AUO/BAC工具鼠(Ela-CreERT; AURKAf/f)。他莫西芬诱导重组后,我们通过qRT-PCR验证了Aurora A在AUO/BAC工具鼠胰腺组织内的相对低表达。我们还通过计算和比较目的基因敲除工具鼠和对照组BAC工具鼠的全胰腺重量占总体重比例百分比,并通过对两种不同小鼠的正常无处理胰腺组织的组织病理学以及免疫荧光核染图片的比较,初步明确了AuroraA在胰腺腺泡细胞内敲除后的胰腺组织病理学相关表型的改变。
  结果:首先是我们成功构建了纯合的AUO/BAC工具鼠。因如上部分所述,Aurora A激酶在成年BAC小鼠胰腺组织内的基础表达量较低,我们通过对比两组小鼠在雨蛙素构建急性胰腺炎动物模型3天后收集的胰腺组织内的Aurora A基因的相对表达量水平发现,AUO/BAC小鼠胰腺组织内的Aurora A表达量相比BAC小鼠胰腺组织内的表达水平显著降低。而H&E和免疫荧光DAPI染色的结果提示AUO/BAC工具鼠的正常胰腺组织与正常小鼠胰腺相比无明显差异,但AUO/BAC小鼠较之对照组BAC小鼠的胰腺腺泡内的胞核增大、积聚,多倍体细胞数量明显增多。
  结论:Aurora A激酶在小鼠胰腺腺泡细胞内的特异性条件性敲除可在胰腺腺泡细胞的组织病理学上产生有辨识度的改变,但对小鼠胰腺本身的发育功能和小鼠存活无明显影响。
  第三部分 胰腺腺泡细胞Aurora A激酶特异性敲除对胰腺炎的作用影响
  背景及目的:本部分实验中,为了明确胰腺腺泡细胞内Aurora A基因敲除是否会对急、慢性胰腺炎造成影响。我们对实验组AUO/BAC和对照组BAC小鼠同期进行腹腔注射大剂量雨蛙素急性和慢性胰腺炎造模,并检测和比较不同基因型小鼠胰腺组织的急性和慢性损伤程度以及损伤的恢复情况。
  方法:首先培育小鼠,将前两部分中得到并验证过基因型的小鼠按年龄、性别等匹配分组。他莫西芬灌胃诱导基因条件性敲除后休息几天,对实验组和对照组小鼠予以同等剂量的雨蛙素刺激。雨蛙素注射剂量为100ug/kg/b.wt./次,急性胰腺炎组动物予以腹腔注射雨蛙素,注射间隔时间为一小时一次,共10次/天,于首次注射雨蛙素24小时后处死小鼠,记录湿/干体重比,收取血清标本测量淀粉酶释放水平,观察急性胰腺炎损伤程度,qRT-PCR检测细胞因子IL-1b,IL-6,CXCL-10的表达水平,采用CD11b特特异性染色检测炎症细胞浸润水平,Ki-67特异性色检测细胞增殖水平,Caspase-3特异性染色观察细胞凋亡水平;慢性胰腺炎组动物予同样予以雨蛙素刺激,6次/天,每周3次,重复三周后停止给药,于首次注射雨蛙素4周后处死小鼠,记录湿重/干重比重,取胰腺组织观察胰腺病变损伤和恢复程度,CD11b和F4/80免疫组织化学染色检测炎性细胞浸润情况,Sirius-Red特殊染色检测胶原纤维沉积,并注意对比实验组和对照组小鼠间的区别。
  结果:他莫西芬诱导后,我们在2种基因型小鼠身上成功构建了雨蛙素诱导型急性胰腺炎动物模型,HE染色结果显示AUO/BAC-AP组小鼠的胰腺组织中存在更多的腺泡细胞坏死和炎性细胞渗出,炎性细胞因子IL-1b,IL-6,CXCL-10表达量在AUO/BAC-AP组小鼠中较BAC组小鼠显著升高,CD11b和Caspase-3染色阳性细胞在AUO/BAC-AP小鼠组中明显较多,而Ki-67表达量显著低于BAC-AP小鼠组,另外两组间的血清淀粉酶水平和胰腺重量/总体重比并无明显差别。基于以上结果,我们进一步在2种基因型小鼠身上成功构建了雨蛙素诱导型慢性胰腺炎动物模型,H&E染色和Sirius-Red染色结果显示AUO/BAC-CP组小鼠胰腺组织存在更多腺泡细胞萎缩和坏死,胰腺纤维化,脂肪替代等慢性胰腺炎改变。而体重比显示胰体萎缩程度显著高于BAC-CP组小鼠,CD11b及F4/80免疫组织化学阳性细胞染色在AUO/BAC-CP组中的表达量也显著高于BAC-CP组小鼠。
  结论:综上实验所述,我们通过动物体内实验明确了胰腺腺泡细胞内Aurora A激酶条件性敲除可显著提高小鼠对雨蛙素诱导下胰腺组织的炎性反应,包括在早期加重炎性细胞浸润和细胞坏死等,这说明Aurora A激酶可在炎症早期保护腺泡细胞死亡,并在远期继续影响胰腺组织的恢复和纤维化改变等。通过以上结果最终明确Aurora A或对胰腺炎症中的腺泡细胞存活和细胞再生起到保护作用,敲除后可在雨蛙素动物模型中加重急慢性胰腺炎症反应。
[硕士论文] 张娴
急诊医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胃肠功能障碍对危重症患者的预后起着至关重要的作用。前期基础研究表明大黄,作为一种中药,能够有效保护胃肠道屏障功能,阻止肠道细菌移位,促进肠蠕动,但至今临床研究较少。本研究的目的在于探讨中药大黄对危重症患者胃肠功能障碍的疗效。
  方法:
  根据纳入及排除标准对2015年6月至2017年5月期间进入重症监护室(intensive care unit,ICU)的患者进行筛选,最终共有368位患者进入本次回顾性队列研究。再根据暴露因素(即胃肠功能障碍患者是否接受大黄治疗)将患者分为大黄组和常规治疗组。大黄组接受常规药物治疗+生大黄粉治疗,常规治疗组仅接受常规药物治疗。常规药物治疗方法包括促胃肠动力、抑制胃酸分泌、保护胃粘膜、抗感染、抗炎、保肝、维持循环稳定、维持水电解质平衡等。收集患者进入ICU24小时内及治疗7天后的临床资料,比较两组治疗效果。采用倾向性评分匹配法(propensity score matching,PSM)控制两组间的混杂偏倚。
  结果:
  根据是否使用大黄治疗,入选患者被分为大黄组(219例,59.51%)和常规治疗组(149例,40.49%)。
  基线特征:纳入时与常规治疗组相比,大黄组患者腹胀程度、急性胃肠损伤(Acute gastrointestinal injury,AGI)级别较高(重度腹胀:43.84%vs4.70%;AGIⅢ:43.84%vs4.70%,P<0.05),序贯器官衰竭评分(Sequential Organ Failure Assessment score,SOFA)评分、急性生理与慢性健康评分Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ,APACHEⅡ)评分较低(SOFA评分:4.84±3.09vs6.44±3.45;APACHEⅡ评分:12.88±6.14vs14.98±5.77,P<0.05),甘油灌肠剂、米雅、促胃肠动力药使用比例较少(甘油灌肠剂:54.79%vs77.18%;米雅:35.16%vs48.32%;促胃肠动力药:17.35%vs32.21%,P<0.05),其余指标差异无统计学意义(P>0.05)。为控制两组间的混杂偏倚,采用倾向性评分匹配法,以大黄组为基准组进行匹配,最终68对匹配成功,共136例病例,匹配后两组患者基线特征无统计学差异。
  主要研究结果:匹配前大黄组和常规治疗组喂养耐受率分别为59.82%、39.60%,匹配后大黄组和常规治疗组喂养耐受率分别为77.94%、30.88%,大黄组喂养耐受率均较常规治疗组高,差异有统计学意义(P<0.05)。
  次要研究结果:匹配前后大黄组患者AGI分级改善率、肠鸣音改善率均较常规治疗组高(匹配前:AGI分级改善:75.34%vs29.53%,肠鸣音改善:90.41%vs72.48%;匹配后:AGI分级改善:76.47%vs33.82%,肠鸣音改善:91.18%vs64.71%,P<0.05),SOFA评分、APACHEⅡ评分、住ICU天数、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、内毒素均较常规治疗组低(匹配前:SOFA评分:4.23±3.57vs5.84±3.69,APACHEⅡ评分:11.92±6.55vs14.11±6.30,住ICU天数:12.00(9.00,18.00)vs14.00(9.50,21.00),CRP:23.21(9.00,52.97)vs47.08(24.00,92.86),内毒素:0.06(0.04,0.10)vs0.07(0.05,0.11);匹配后:SOFA评分:4.54±3.61vs5.63±3.79,APACHEⅡ评分:12.56±6.03vs13.74±6.00,住ICU天数:12.00(9.00,18.50)vs13.00(9.50,20.50),CRP:25.39(12.03,67.71)vs53.48(28.19,100.25),内毒素:0.06(0.04,0.10)vs0.07(0.05,0.10),P<0.05),差异有统计学意义。28天死亡率在匹配前后两组患者间差异无统计学意义(匹配前:22.37%vs22.15%;匹配后:30.88%vs23.53%,P>0.05)。两组患者均未发现严重不良反应。
  结论:
  中药大黄能够有效提高危重症患者肠内营养耐受性,缓解胃肠功能障碍,且无严重不良反应,为临床实践中应用大黄治疗胃肠功能障碍提供了循证医学证据。
[硕士论文] 孟欣
化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:肝硬化是肝脏疾病引起死亡的主要病症,而肝纤维化是肝硬化的重要过程。此过程可逆,通过治疗肝纤维化成为预防和治疗肝硬化的重要手段。肝纤维化的重要特征为细胞外基质的增殖与沉淀,主要来源是肝星状细胞活化增值及上皮细胞间质转型等形成肌成纤维细胞。α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白为肝星状细胞活化增值及上皮细胞间质转型的主要生物指标,可以通过检测两者的表达水平来检验肝纤维化的发生。木犀草素(Lut)作为一种天然黄酮类化合物可以有效降低肝组织中的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白的mRNA水平,抑制肝星状细胞的活化和胶原的合成,有效缓解肝纤维化程度。近期研究发现核糖体蛋白S5(RPS5)可以通过抑制肝星状细胞的活化,参与苦参碱及其衍生物治疗肝纤维化的过程,推测RPS5为治疗肝纤维化的靶蛋白。然而Lut治疗肝纤维化机制是否也与RPS5有关目前尚不清楚。本课题组前期研究发现,体外表达His6-Tag-RPS5与Lut有一定的结合,但是结合位点尚不明确。
  本论文主要研究了RPS5在Lut治疗肝纤维化过程中的作用,并通过体外表达纯化RPS5及其突变体、研究它们与Lut的结合来探索Lut-RPS5的结合区域及结合位点,从分子结构角度初步探讨RPS5参与Lut抗纤维化的作用机制。首先采用RPS5siRNA(small interference RNA)干扰肝星状细胞内RPS5mRNA表达水平,通过RNA抽提、反转录PCR与荧光实时定量PCR(Real-time PCR)等方法检测出干扰RPS5表达后,α-SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达水平明显增加,而加入Lut则可反转这一现象,表明RPS5参与了Lut治疗肝纤维化的过程;然后通过克隆RPS5片段与pET-28a载体连接,构建重组质粒pET-28a-RPS5,转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,并对表达条件进行探索和优化,使RPS在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达,通过离子交换层析柱分离、复性,凝胶过滤柱纯化,得到纯度高达95%的RPS5蛋白;再利用DS3.5分子模拟软件模拟RPS5与Lut的结合,分析可能的结合区域及结合位点,通过表达、纯化可能结合位点的蛋白突变体,用OCTET、Biacore检测Lut与RPS5、蛋白突变体的结合常数,初步确定区域Ⅰ(MET76~LYS85、ARG159)和区域Ⅱ(ARG60~GLN65、ARG145)为可能的结合区域,其中Lys63、Arg81、Lys85、Lys193及Arg145为可能的结合位点。
  通过上述研究,我们从分子生物学方面表明核糖体RPS5蛋白参与了Lut治疗肝纤维化过程;构建了RPS5原核表达体系,得到纯度的RPS5蛋白;通过计算机模拟,结合蛋白质定点突变和OCTET、Biacore技术,初步确定了RPS5与木犀草素的可能结合区域和可能结合位点,这为进一步阐明Lut抗肝纤维化的作用机制,对以RPS5为靶分子、以Lut为母体,设计新型抗肝纤维化药物具有重要意义。
[博士论文] 朱建伟
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:纤调蛋白(fibromodulin,FMOD)是一种富含亮氨酸的小分子蛋白,参与组织器官修复中的ECM调节[16]。在肝纤维化过程中,纤维化组织FMOD表达增高,且能够诱导肝星状细胞的活化,进而增加肝星状细胞的增殖和侵袭能力[17],提示FMOD是肝纤维化的启动基因。因此,鉴于肝脏纤维化与胰腺纤维化有众多相似之处,以及肝星形细胞与PSCs在基因、形态及功能上具有高度的同源性[18],我们推测在CP中,FMOD能够激活PSCs细胞,进而引起胰腺纤维化。另外,FMOD又是一种OS敏感蛋白,在人成纤维细胞OS可诱导FMOD的表达。通过生物学信息软件分析发现,在FMOD启动子区域含有AP-1的结合位点,并且AP-1是MAPK信号通路的下游效应分子。因此在本研究中我们假设OS通过MAPK/AP-1信号通路诱导FMOD的表达激活PSCs,引起胶原纤维沉积,进而引起胰腺纤维化。
  第一部分:纤调蛋白在慢性胰腺炎患者血清中表达增高且能够诱导胰腺星状细胞的活化
  目的:探讨FMOD在CP患者血清中表达情况,及异常表达的FMOD能否引起静息状态的PSCs活化,及对影响PSCs生物学功能。
  方法:分别收集10例CP患者及10例正常人的血液样本,采用ELISA方法检测2组血清样本中FMOD蛋白的表达情况。合成FMOD过表达质粒、包装病毒构建稳定高表达FMOD的PSCs细胞系。采用PCR及WB方法检测过表达FMOD后PSCs活化标志物a-SMA的变化情况。采用CCK-8及迁移实验评价过表达FMOD对PSCs的功能的影响。
  结果:ELISA检测结果显示正常人及CP患者血清FMOD蛋白浓度分别为10.10±1.47,56.52±6.32;与正常人相比,CP患者血清FMOD蛋白浓度显著增高,(t=22.64,p<0.01)。PCR结果显示上调FMOD表达后,PSCs活化标志物a-SMA mRNA的相对表达量为1.81±0.08。与对照组相比,上调FMOD表达后a-SMA mRNA的相对表达量显著增加(p<0.01)。同样,WB结果也显示上调FMOD表达后,可引起PSCs中a-SMA的蛋白表达量增加。CCK-8结果显示,与对照组相比,上调FMOD表达后PSCs的增殖能力增加。迁移实验结果显示,与对照组迁移细胞数相比(9.2±2.0),上调FMOD表达后PSCs的迁移细胞数目显著增加(45.53±2.77;t=18.43,p<0.01)。
  结论:FMOD在CP患者中异常高表达,过表达的FMOD可诱导PSCs的活化,并维持PSCs的纤维化表型。因此明确CP纤维化过程中FMOD表达上调的分子机制可为抑制PSCs活化,终止CP纤维化进程提供新的药物治疗靶点。
  第二部分:OS诱导FMOD过表达促进PSCs活化
  目的:探讨OS能否诱导PSCs的活化,且OS诱导的PSCs活化是否依赖于FMOD的表达。
  方法:用促氧化剂甲萘醌(menadione,MND)处理静息状态的PSCs细胞,以等体积的DMSO作为对照,采用PCR及WB检测MND处理后PSCs活化标志物a-SMA的变化情况。合成FMOD-shRNA,构建稳定低表达FMOD的PSCs细胞系,采用PCR及WB检测下调FMOD表达后对MND诱导的PSCs活化的影响。并采用细胞免疫荧光实验进一步验证下调FMOD表达后对MND诱导的PSCs表达的a-SMA表达变化情况。
  结果:PCR结果显示MND处理静息状态的PSCs后,与等体积的DMSO组比,α-SMA及FMOD mRNA相对表达水平明显增加,FMOD及α-SMA mRNA相对表达量分别为3.39±1.17(P=0.036)、2.20±0.52(P=0.023)。WB结果也提示MND处理后FMOD及α-SMA的蛋白表达也明显增加。构建稳定低表达的FMOD细胞系后,PCR结果显示:下调FMOD表达后,MND促α-SMA表达作用明显下降,MND+FMOD-shRNA组和MND组α-SMA mRNA相对表达量分别为2.07±0.11vs.3.64±0.78(P=0.026);WB结果也显示与对照组相比,敲降FMOD后MND诱导的α-SMA蛋白表达量下降。细胞免疫荧光实验结果也显示与MND单独处理相比,MND+FMOD-shRNA组PSCs中α-SMA表达明显下降。以上结果提示MND通过启动FMOD的表达促进PSCs的活化。
  结论:OS在体外通过诱导FMOD的表达促进人源性PSCs的活化。
  第三部分:OS通过MAPK/AP-1信号通路上调FMOD的表达诱导PSCs
  目的:探讨OS是通过何种机制上调FMOD表达进而诱导PSCs活化的。
  方法:用MND处理PSCs细胞,以等体积的DMSO作为对照,采用WB检测MND处理PSCs后,MAPK三条经典信号通路P-38/p-P-38、ERK/p-ERK、JNK/p-JNK的蛋白表达情况。用MND处理PSCs细胞,同时采用ERK、JNK、P38通路特异的抑制剂(U0126、SP600125、SB2021906)处理PSCs细胞,采用WB方法检测FMOD、α-SMA、MAPK三条经典信号通路的蛋白表达变化情况。构建AP-1过表达质粒,并转染PSCs细胞,采用WB检测过表达AP-1后,PSCs细胞FMOD表达情况。采用双荧光素报告酶实验及染色质蛋白免疫共沉淀(ChIP),探究AP-1是否通过直接与FMOD启动子区域结合诱导FMOD的表达。
  结果:MND处理后,WB结果显示与对照组相比,MND组的p-P-38、p-ERK、p-JNK蛋白表达增加。联合特异的抑制剂处理后,WB结果显示与MND处理组相比MND+SB2021906组相对MND组FMOD表达无明显变化,MND+U0126组及MND+SP600125组FMOD的表达较MND组明显降低。生物信息分析软件(rVISTA)分析的转录因子数据库TRANSFAC Professional,结果显示在距FMOD第一外显子1.1kb的区域含有AP-1结合位点,且过表达AP-1后,FMOD的蛋白表达水平增高。荧光报告素酶实验结果显示与对照组相比,AP-1表达质粒组荧光强度明显增加(6.25±1.52vs.1.00±0.23,P<0.001)。ChIP实验结果显示AP-1表达质粒组,检测到FMOD启动子区域片段,且富集度较阴性对照组显著升高(34.51±2.26vs.1.06±0.11,P<0.001)。
  结论:OS通过MAPK/AP-1信号通路上调FMOD的表达诱导PSCs。
  第四部分:体内检测CP中FMOD、OS、MAPK信号通路的变化情况及FMOD表达与胰腺纤维化的关系
  目的:在DBTC诱导的大鼠CP模型中检测CP中FMOD、OS、MAPK信号通路的变化情况及FMOD表达与胰腺纤维化的关系。
  方法:采用DBTC鼠尾静脉注射的方法构建CP模型,用HE染色明确造模是否成功,采用Sirius-Red染色明确胰腺纤维化程度,免疫组织化学染色的方法检测CP胰腺组织中FMOD的表达情况,用MDA检测试剂盒检测CP和正常胰腺组织中MDA的含量变化情况。提取CP和正常胰腺组织中蛋白,WB检测FMOD、α-SMA、P-38、p-P-38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK的蛋白表达变化情况。
  结果:DBTC静脉注射4周后,CP组存活率为70%,VC组为100%;造模2周后CP组体重明显低于对照组,2周体重(222.46±3.40vs.232.10±5.96,P=0.02),3周体重(231.46±6.94vs.251.74±6.01,P<0.01),4周体重(233.14±6.69vs.263.74±7.55,P<0.01)。HE染色结果显示CP组胰腺腺泡萎缩、小叶间出现大量的纤维组织及炎症细胞。Sirius-Red染色后,CP组可见除血管及胰管周围外,有大量鲜红色条索状及网状的胶原纤维沉积于小叶间隙和腺泡间,而对照组仅在血管及胰管周围有少许纤维沉积,两组之间染色面积有显著差异(CP:vs.对照,0.46±0.07vs.0.08±0.03,P<0.01)。免疫组化评分结果显示与对照组相比,FMOD表达升高。检测组织中MDA含量,发现CP组MDA含量明显高于对照组(2.63±1.42vs.1.50±0.64,P=0.046)。WB结果显示,与对照组相比,CP组FMOD、α-SMA、p-P-38、p-ERK、p-JNK表达显著上调。
  结论:在大鼠CP模型中,胰腺组织中FMOD表达增高。OS在胰腺组织中表达增高且其下游信号通路MAPK激活。
[博士论文] 徐岩
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  冷水束缚应激(Water immersion restraint stress,WIRS)因为其良好的可重复性和临床相关性,被广泛应用于应激诱导急性胃黏膜损伤的实验模型。因此,本课题采用冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤模型,初步探讨:
  1.冷水束缚应激对支配大鼠胃组织相应阶段背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中TRPA1和P物质表达的影响,观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的作用并探讨可能的机制。
  2.大鼠鞘内、腹腔注射TRPA1特异性拮抗剂HC-030031和口服TRPA1特异性激动剂异硫氰酸烯丙酯(Allyl isothiocyanate,AITC),进一步观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的影响并探讨可能的机制,以及TRPA1对P物质释放的影响。
  方法:
  雄性Wistar大鼠(weight180-220g,6-8weeks old),随机分为6组,空白对照组(Control group),大鼠未经过任何处理;冷水束缚应激模型组(WIRS group),大鼠在自制的鼠笼内冷水(16±1℃)浸泡6h,水位平大鼠剑突;鞘内注射HC-030031组(ITIH group),大鼠冷水束缚应激前30min鞘内注射HC-03003110μl(10μg/μl,HC-030031溶解在二甲基亚砜);腹腔注射HC-030031组(IPIH group),大鼠冷水束缚应激前1h腹腔注射HC-030031(150mg/kg,HC-030031溶解在0.5%甲基纤维素)。冷水束缚应激6h后,取大鼠的背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜。AITC组,口服AITC17mg/kg(AITC溶解在含有3%乙醇和10%吐温的生理盐水中),AITC对照组口服不含有AITC的溶液,2h后,取大鼠的背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜,应用苏木素-伊红染色(Hematoxylin and eosin stain,HE)或戊二醛、四氧化锇酸固定及一系列处理胃组织后,分别应用光学显微镜(Optical Microscope,OM)和透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察各组大鼠胃黏膜和胃黏膜细胞的损伤情况。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)、免疫组织化学(IHC)分别检测背根神经节和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达的变化。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胃黏膜中P物质浓度的变化。
  结果:
  1.光学显微镜观察各组大鼠胃组织HE染色胃黏膜损伤情况显示,未经处理的Control组:胃黏膜结构正常,层次清楚,上皮完整,上皮层细胞排列紧密、规则,未见坏死脱落;间质无水肿及红细胞渗出和炎症细胞浸润;固有层腺体排列整齐、密集,未见萎缩和缺失;黏膜下层也未见肿胀及毛细血管出血倾向和瘀血扩张。WIRS组:胃黏膜片状脱落,多发浅表溃疡,有时可见火山口样巨大溃疡。可见大量急性糜烂性出血性坏死灶;黏膜层广泛的上皮细胞弥漫性凝固坏死脱落,同时伴有广泛的红细胞渗出和炎性细胞浸润,毛细血管出血及瘀血扩张;固有层腺体结构紊乱、萎缩明显,数量减少甚至缺失;细胞间质变大水肿;黏膜下层结构疏松水肿、血管淤血扩张。与Control组比较,WIRS组胃黏膜损伤评分明显提高(P<0.001)。ITIH组或IPIH组:胃黏膜完整性较好,受损黏膜较表浅局限,仅有轻度充血、水肿,偶见炎性细胞浸润;表层上皮有少部分坏死、脱落;局部腺体结构紊乱。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜损伤评分明显降低(P<0.001)。AITC组:可见胃黏膜受损,上皮细胞坏死脱落;黏膜层水肿,可见红细胞渗出和毛细血管出血;偶见黏膜下层结构疏松水肿和血管淤血扩张。与Control比较,AITC组胃黏膜损伤评分明显提高(P<0.001)。
  2.TEM观察各组大鼠胃黏膜细胞损伤情况显示,未经处理的Control组:胃组织上皮细胞完整;线粒体、粗面内质网和细胞核结构正常。WIRS组:胃组织上皮细胞变性;广泛存在主细胞和/或壁细胞的细胞核受损、核周间隙增宽;线粒体受损严重,有些完全失去正常结构,轮廓模糊、线粒体嵴减少或消失;粗面内质网扩张甚至空泡变性;紧密连接松散;有些分泌小管极度扩张。与Control比较,胃黏膜细胞损伤评分明显提高(P<0.001)。ITIH组或IPIH组:局部可见线粒体损伤,但线粒体嵴和轮廓存在;粗面内质网局部扩张,空泡变性基本消失;紧密连接结构正常;未见分泌小管扩张。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜细胞损伤评分明显降低(P<0.001)。AITC组:可见胃组织的主细胞和/或壁细胞核受损、周间隙增宽;可见线粒体损伤,多伴有线粒体嵴减少或消失,但轮廓存在;粗面内质网局部扩张,偶发空泡变性;偶见分泌小管扩张。与Control组比较,AITC组胃黏膜细胞损伤评分明显提高(P<0.001)。
  3.同Control组比较,WIRS组大鼠背根神经节(T8-11)和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达上调、胃黏膜中P物质释放增加(P<0.001)。
  4.同WIRS组比较,鞘内或腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-03003(1ITIH组或IPIH组),有效减轻WIRS诱导的大鼠急性胃黏膜损伤和抑制背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中P物质释放(P<0.001)。
  5.同Control组比较,口服TRPA1特异性激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤,大鼠背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中P物质的释放明显增加(P<0.001)。
  结论:
  1.冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤,使背根神经节(T8-11)和胃组织中TRPA1和P物质的表达上调、胃黏膜中P物质的释放增加。应激诱导的急性胃黏膜损伤与TRPA1和P物质的激活密切相关,其机制可能是二者的激活引起神经元性和非神经源性炎症以及内脏痛觉过敏。
  2.TRPA1拮抗剂HC-030031明显改善冷水束缚应激引起的大鼠急性胃黏膜损伤,其机制可能是HC-030031显著抑制TRPA1的表达和P物质在背根神经节、胃组织和胃黏膜中的释放,减轻其在胃组织引起的神经源性和非神经源性炎症及内脏痛觉过敏。
  3.TRPA1激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤和P物质在大鼠背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中的释放明显增加。
  4.在应激诱导的AGML的大鼠模型中,P物质的释放主要由TRPA1调控。
[硕士论文] 华夏
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征,与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化1。在美国罹患NAFLD的人群已达到人口总数的30%2,国内流行病学的研究表明,NAFLD已成为我国引起肝功能异常以及慢性肝病的第二大元凶3。
  烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)又称为辅酶Ⅰ,是电子传递链中的ComplexⅠ的重要递氢物。NAD的合成包括从头合成途径(De novo pathway)和补救(Salvage pathway)合成途径两条途径,其中补救合成途径是维持NAD体内水平的主要途径。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)是补救合成途径中的合成限速酶,维持体内NAD的水平4。NAD是生成ATP的必须物质,同时ATP还广泛参与机体发育、血管生成、细胞凋亡、组织炎症、神经退行性病变和肿瘤发生等病理生理过程5-7。
  在我们课题组之前关于NAMPT功能方面的研究发现,NAMPT和NAFLD之间存在重要关联。NAMPT在NAFLD模型的老年小鼠肝脏中,会随着年龄增大而表达量逐渐减低,而且NAMPT表达量的降低是老年鼠NAFLD发病和进展的重要促因8。但NAMPT的相关激活剂能否对NAFLD起到治疗作用,以及其治疗作用的机制都尚不明确。
  由于NAMPT是一个酶,因此我们期望能直接找到可以干预其作用的化合物。我们把目光瞄准了P7C3-A20这一化合物。P7C3-A20的CAS号1235481-90-9,属于氯丙基咔唑类化合物,是latrepirdine(一种神经元保护剂)的同源化合物。前期有报道发现该化合物可作为“潜在的NAMPT激动剂”升高脑内的NAD水平,发挥神经保护作用。我们猜测,P7C3-A20很有可能也能在肝脏内发挥作用,拟分三步对化合物P7C3-A20对NAFLD的治疗作用和机制进行了探讨。
  实验方法:
  1.将实验动物分成四组,每组不少于6只,分别为Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组。Chow组以普通饲料喂养,HFD组以高脂饲料喂养。HFD+A20组在HFD诱导16W后体外腹腔给药,给药量20mg/kg/d。给药2W后,先从体重、代谢率上对小鼠整体代谢水平对NAFLD造模进行评价,然后验证经过P7C3-A20治疗后的小鼠肝脏中是否存在NAD含量水平的改变。
  2.第二步检测P7C3-A20对NAFLD各项病理指标及并发症进程相关指标的影响。首先检测血清中的血脂、肝功酶系等指标各组之间的差异,然后再在肝脏组织中检测氧化应激、炎症因子、肝脏纤维化标志物、细胞凋亡标志物、胰岛素敏感度等指标,检测P7C3-A20对NAFLD病程进展和并发症的治疗作用。另外,我们还检测了另一NAD补充药物nicotinamide riboside(NR)与SIRT1过表达对NAFLD的治疗作用。
  3.第三步探讨P7C3-A20对NAFLD治疗作用的机制进行研究,根据实验结果中发现P7C3-A20可升高血清FGF1和FGF21的浓度,推测P7C3-A20可能和AMPK/CREB通路激活存在一定的关系。所以对AMPK/CREB在肝细胞中的表达进行检测,同时检测磷酸化的标志物phospho-CREB和phospho-AMPK。将AMPKα2+/-小鼠进行杂交配种,制备AMPKα2-/-小鼠。将WT小鼠设置为对照组,AMPKα2-/-小鼠设置为实验组。两组小鼠均给予腹腔注射P7C3-A20,3天,20mg/kg/d。取血清检测血清中FGF1和FGF21的变化,取肝脏检测AMPK通路相关标志物的表达情况。
  实验结果:
  1.首先HFD组相较于Chow组,可以明确HFD诱导NAFLD模型成功。然后对NAFLD模型小鼠按照Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组四组分组进行NAD、NADH以及NAD/NADH的检测,首先验证P7C3-A20给药后确实提升对NAD在肝脏中的表达水平。
  2.HFD组给予P7C3-A20后,相比较于HFD对照组,小鼠减重明显,代谢率也有所提升;血清中肝功酶系指标有所改善;小鼠肝脏的脂质沉积、氧化应激水平、细胞炎症水平以及细胞凋亡水平均有所下降;肝脏的纤维化及纤维成分均有所好转,说明P7C3-A20对NAFLD确实有治疗作用。NR、SIRT1过表达对NAFLD也都有治疗作用,但是NR比SIRT1过表达作用更为明显。
  3.在NAFLD模型小鼠上给予化合物P7C3-A20,可上调血清中两种重要代谢调控因子FGF1和FGF21的表达。同时P7C3-A20给药可增加phospho-CREB和phospho-AMPK的表达。同时,此外,P7C3-A20还明显增加血FGF1和FGF21的浓度。肝脏以及血清中FGF1和FGF21表达明显提高,相对于对照组野生型小鼠,P7C3-A20在AMPKα2-KO小鼠上对AMPK/CREB通路的激活作用被极大地抑制,且肝脏FGF1和FGF21的上调被抑制,血清中FGF1和FGF21的上调也被极大地削弱。
  实验结论:
  1.化合物P7C3-A20可有效提高NAFLD中NAD的含量。
  2.化合物P7C3-A20可有效缓解NAFLD的病程和并发症的进程。
  3.P7C3-A20对FGF1和FGF21的调控依赖于AMPK/CREB通路。
[硕士论文] 于金
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:便秘是一组临床常见的复杂症状,表现为排便次数减少、排便困难、粪便干硬。排便次数减少指每周排便少于3次。排便困难包括排出困难、排便费力、排便不尽感、排便费事以及需要手法辅助排便。由于缺乏有效的治疗方法,它给病人带来了巨大的经济负担,极大地影响了患者的生活质量,促使人们寻找新的、有效的方法来治疗便秘。2015年,Ron等人10进行了一项验证振动胶囊安全性和通过其来治疗便秘的潜在功效的研究。该胶囊是利用电磁信号和固定的振动档位(A或B,由医师推荐)预定延迟6-8h使胶囊到达结肠后开始振动。
  结果报告没有发生严重的不良反应,有暂时的轻微的副作用。26例患者中有23例肠蠕动平均数显著增加。但是该振动胶囊只有一种振动模式,且无法在体外对服用的胶囊进行监测和调试。
  目的:
  我们和上海安翰医疗技术有限公司合作,研制出一种经智能手机体外调控的、多档位的创新型振动胶囊系统(Vibrating Capsule,VC),该系统由振动胶囊本身和通常称为适配器的外部配置装置(external configuration device,ECD)组成。VC有各自的半导体芯片,每个芯片都有自己独自的序列号,以利于被ECD识别和控制。我们利用该系统先后对8条比格犬和便秘患者应用来验证其安全性,并探索其可能对排便的影响和便秘的治疗作用。
  方法:
  在第一部分实验中,8条比格犬均先后依次喂服低、中、高3个档位的VC并运用常规方法和设备测其相应的一般生理指标(包括体温、心率、呼吸、体重、行为活动状态,每日摄食量、每日饮水量等)、血液指标(血白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白,血小板计数,丙氨酸氨基转移酶,天冬氨酸氨基转移酶,总胆红素,直接胆红,总蛋白,白蛋白,尿素氮,血肌酐,钾,钠)、粪便指标(排便量、排便次数,排便的布里斯托大便性状评分,粪便常规及粪便潜血检查)等;之后对8条犬喂服超高档位的VC,并行腹部CT及安乐死后解剖取样行病理检查。
  在第二部分试验中,我们设计了一项计划45例功能性便秘患者的双盲、安慰剂对照研究,以评价振动胶囊对于缓解和治疗功能性便秘的有效性及对肠道传输的作用。包括2周不服用胶囊的基础期,6周双盲、安慰剂对照治疗阶段,及最后一次使用胶囊后14天随访阶段(随访至胶囊排出停止)。受试者参与这个试验的总持续时间约10至14周,包括基础期阶段、治疗阶段及试验后随访阶段。
  结果:
  在动物试验中(1)应用VC前后犬的一般生理指标和血液指标并无明显差异(P>0.05)。腹部CT及病理检查均未见明显异常。(2)应用VC后犬的排便次数增加(P<0.05或<0.01),但不同档位之间的VC没有显著差异(P>0.05)。(3)随着胶囊档位的不同,排出VC的时间呈缩短趋势,但统计学没有显著差异(P>0.05)。(4)VC对犬排便的性状未产生明显影响(P>0.05)。(5),能够顺利通过智能手机检测到犬体内的VC信号,并进行参数调试。
  在临床试验中的初步结果显示(1)已完成振动胶囊治疗的患者,无明显与试验器械有关的不良事件发生。(2)胶囊自服用到自发排出时间未发生超过14天的情况。(3)第6周达到≥3SCBM的受试者百分比:假胶囊组为33.3%,而振动胶囊组为60%。(4)临床试验目前仍在进行中。
  结论:
  在动物实验中,VC是安全的,应用VC能使犬的排便次数增加,随着胶囊档位的不同,排出VC的时间的均值呈现缩短趋势;VC对犬排便的性状无明显影响;体外通过智能手机调控VC是可行的。
  在临床试验中,初步认为振动胶囊是安全的,对受试者生活质量具有改善作用。
[硕士论文] 彭巍
医学心理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着社会的进步和科技的发展,应激成为了人们生活中不可避免的事件,而且应激的复杂性和强度也不断增加。按应激持续的长短,可分为急性应激和慢性应激,慢性应激指机体长期而持久的紧张状态。长期慢性应激会导致人体内环境的紊乱,引起包括肝脏脂肪变性在内的各种病理变化,但应激导致肝脏脂质沉积的具体机制并不清楚。长期以来,肝脏脂质沉积被认为是肥胖者的“专利”,是长期不良的生活习惯和生活方式所致,但是越来越多的“瘦子”被查出患有脂肪肝,特别是在长期慢性应激状态的人群中比率更高。因此,阐明慢性应激致肝脏脂质沉积的作用及其机制,从而寻求行之有效的防治方法,具有着显著的现实意义。FoxO1是叉头蛋白O家族的一员,是调节细胞生长、分化和代谢的关键分子,在糖代谢调控中起重要作用。越来越多的研究表明,FoxO1在脂代谢中也起关键作用。本实验室前期研究表明慢性应激可导致肝脏脂质沉积和FoxO1激活,但FoxO1在应激致肝脏脂质沉积中的作用及其机制仍不清楚,且国内外研究鲜有报道。
  研究目的:明确FoxO1在应激致肝脏脂质沉积的关键性作用,探讨FoxO1在肝脏脂质沉积中的作用机制。
  研究方法:1、将雄性C57BL/6小鼠分为四组:对照组、慢性应激组、慢性应激+FoxO1抑制剂组、FoxO1抑制剂组,6周后通过肝脏脂质检测和油红O染色评定小鼠肝脏脂质沉积情况;通过Western blot检测小鼠肝脏FoxO1蛋白及其磷酸化水平,用实时荧光定量PCR检测FoxO1基因及经典下游调控基因的转录水平,明确慢性应激及抑制剂对FoxO1的影响。
  2、用实时荧光定量PCR检测脂质代谢相关基因的转录水平,并分别检测四组小鼠摄食量、体重、糖代谢变化情况,探究FoxO1致应激小鼠肝脏脂质沉积的机制。
  3、将Hepa1-6细胞分为四组:对照组、皮质酮处理组、皮质酮+FoxO1抑制剂处理组、FoxO1抑制剂处理组,48h后通过油红O染色评定细胞脂质沉积情况;通过Western blot检测四组细胞FoxO1蛋白及其磷酸化水平,用实时荧光定量PCR检测FoxO1基因及经典下游调控基因、脂质代谢相关基因的转录水平。
  研究结果:1、慢性应激可致小鼠肝脏甘油三脂沉积,血清甘油三脂、游离脂肪酸含量显著增加,同时肝脏FoxO1激活;而FoxO1抑制剂可以抑制FoxO1活性,改善小鼠肝脏甘油三脂沉积,降低血清甘油三脂、游离脂肪酸含量;四组小鼠肝脏和血清胆固醇含量无明显差异。
  2、慢性应激使小鼠摄食量和体重增长减少,肝脏甘油三脂合成基因Fasn、脂肪酸摄取基因FATP和FABP、胆固醇合成基因HMG-CoAR、胆固醇氧化基因CYP7A1转录增加,FoxO1抑制剂降低这些基因转录水平,但对摄食量和体重增长无明显作用;四组小鼠空腹血糖、餐后血糖、胰岛素、葡萄糖耐量和胰岛素耐量以及肝脏ACC1、SCD1、CD36、PPARα、Acox1、Lcad、Mcad、Pdk4、Cpt1a、Ucp2、ABCG1基因转录无明显差异。
  3、皮质酮可致Hepa1-6细胞脂质沉积、FoxO1激活、甘油三脂合成基因Fasn转录显著增加,FoxO1抑制剂抑制FoxO1活性、减轻细胞脂质沉积、降低Fasn转录水平。
  研究结论:慢性应激可致小鼠肝脏脂质沉积,这一作用是通过应激激素皮质酮激活FoxO1从而促进肝脏甘油三脂合成及游离脂肪酸的摄取所介导。
  全文小结:本工作通过研究FoxO1在应激小鼠肝脏脂质沉积中的作用,发现慢性应激可以通过皮质酮激活FoxO1,而FoxO1作为转录因子通过调控肝脏甘油三脂合成和游离脂肪酸摄取相关基因的表达,导致肝脏脂质沉积和高甘油三脂血症,表明FoxO1在脂代谢紊乱中起重要的调节作用,并提示FoxO1抑制剂可作为脂代谢紊乱防治新的途径。
[硕士论文] 刘佳萱
临床病理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:肝纤维化是常见的病理状态,是多种原因导致的慢性肝损伤所致的病理改变,表现为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的积聚。肝纤维化是对慢性肝损伤愈合和疤痕形成的应答,并且可能进展为肝硬化、肝癌和肝衰竭。然而,迄今在肝纤维化防治方面尚无十分有效的方法,因此有必要对肝纤维化发生的具体分子机制进一步进行深入研究。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),又称贮脂细胞,是肝纤维化发生过程中产生ECM的主要细胞,HSC活化被认为是肝纤维化发生的关键环节。近年来,表观遗传学改变对肝纤维化相关基因表达及HSC活化的影响日益受到重视,其中,miRNAs(microRNAs)这一表观遗传调控机制在许多生物学过程和代谢稳态中起重要作用,包括蛋白质分泌和脂肪酸代谢等。研究表明,miR-30a、miR-9-5p、miR-142-3p等多种miRNA可以促进或抑制HSC活化。因此,研究miRNA在HSC激活中的作用对抑制甚至逆转肝纤维化有着重要意义。
  清道夫受体B类Ⅰ型(scavenger receptor class B typeⅠ,SR-BⅠ)是清道夫受体蛋白的B类家族的成员,编码SR-BⅠ的基因已被命名为清道夫受体B类成员1(scavengerreceptor class B member1,SCARB1)。SR-BⅠ可介导选择性脂质摄取并且在逆向转运胆固醇中起关键作用。SR-BⅠ可受不同核受体和转录因子的调控,包括过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs),肝Ⅹ受体(liverⅩ receptor,LⅩR),肝受体同系物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1)和胆固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins,SREBPs)等,而这些核因子及其相关分子可通过影响炎症及脂质代谢等参与肝纤维化进程。但SCARB1在肝纤维化进程中的作用机制尚未见报道。
  本组前期研究发现,miR-185在肝纤维化患者外周血中上调,可作为诊断肝纤维化的外周血循环标记物,并且相关文章已经发表。为进一步研究miR-185促进肝纤维化发生发展的具体机制,我们利用生物信息学分析和双荧光素酶报告实验筛选并验证SCARB1为miR-185的靶基因,成功构建了干扰SCARB1表达的稳定细胞株,并在人肝星状细胞(LX-2)中证实了miR-185靶向SCARB1影响HSC活化并促进肝纤维化进程,为临床防治肝纤维化提供一条新的途径。
  第一部分:miR-185靶基因的筛选及验证
  目的:
  筛选及验证miR-185的靶基因
  方法:
  1、通过Targetscan、miRWalk、miRDB等miRNA靶点预测软件预测分析miR-185的靶基因。
  2、在HEK293工具细胞中对miR-185与SCARB1的靶向关系检测:构建载有SCARB1的野生型或突变型质粒,与miR-185共转染293T细胞,转染72h后应用荧光素酶报告系统检测双荧光素酶表达的差异,筛选出miR-185的直接作用靶点。
  3、HSC中miR-185与SCARB1的靶向关系验证:用miR-185mimic及miR-185 inhibitor转染HSC,利用qRT-PCR方法和Western blot方法检测上调或者下调miR-185后SCARB1表达水平的变化以及肝星状细胞活化标志物Ⅰ型胶原(TypeⅠcollagen,colⅠ)与α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的变化。
  结果:
  1、miRNA靶点预测软件预测发现SCARB1与miR-185在3'-UTR区域有结合位点,可能是miR-185的靶基因。
  2、靶基因鉴定结果:共转染SCARB1野生型质粒和miR-185过表达质粒的细胞中双萤光素酶比值降低,差异有统计学意义,表明miR-185对SCARB1有直接调控作用,并抑制其表达。
  3、HSC中miR-185与SCARB1的靶向关系验证结果:与空白组和阴性对照组相比,HSC中转染miR-185 mimic之后SCARB1的表达量减少, colⅠ和α-SMA的表达量增加,而空白组与阴性对照组相比,SCARB1、colⅠ和α-SMA的表达量无显著差异;与空白组和阴性对照组相比,HSC中转染miR-185 inhibitor之后SCARB1的表达量增加,colⅠ和α-SMA的表达量减少,而空白组与阴性对照组相比,SCARB1、colⅠ和α-SMA的表达量无显著差异。
  结论:
  1、生物学信息预测SCARB1为miR-185的靶基因。
  2、荧光素酶报告鉴定SCARB1为miR-185的靶基因。
  3、上调miR-185可促进HSC活化,下调miR-185可抑制HSC活化。
  第二部分:miR-185靶向SCARB1促使HSC活化的机制研究
  目的:
  阐明miR-185靶向SCARB1促HSC活化/肝纤维化进程的生物学机制。
  方法:
  1、构建三个干扰SCARB1表达的稳定慢病毒细胞株sh1、sh2、sh3,利用qRT-PCR检测三个稳定株的干扰效率。挑选出干扰效率最高的细胞株进行后续实验。
  2、回复实验:利用qRT-PCR、Western blot方法检测SCARB1干扰稳定株组、SCARB1干扰稳定株内转染miR-185 inhibitor组HSC中SCARB1表达及HSC活化指标colⅠ和α-SMA的表达水平。
  3、CCK8增殖实验明确miR-185是否靶向SCARB1影响HSC活化。
  4、凋亡实验明确miR-185是否靶向SCARB1影响HSC凋亡。
  结果:
  1、稳定株筛选结果:用qRT-PCR方法检测sh1、sh2、sh3三个不同干扰细胞株中SCARB1的干扰效率。sh1干扰稳定细胞株SCARB1的干扰效率最高,因此选为下一步实验过程中的SCARB1干扰稳定细胞株。
  2、回复实验结果:与空白组和SCARB1干扰对照株组相比,SCARB1干扰稳定株组内SCARB1的表达明显下降, colⅠ和α-SMA的表达明显增加;SCARB1干扰稳定株组内转染miR-185 inhibitor后,与SCARB1干扰稳定株组相比, SCARB1的表达增加,colⅠ和α-SMA下降,进一步验证了miR-185靶向SCARB1促进HSC活化/肝纤维化的作用。
  3、CCK8增殖实验结果:(1)与空白组和SCARB1干扰对照株组相比,转染SCARB1干扰慢病毒稳定株组细胞在转染24 h、48 h、72 h和96h显著增殖。(2)SCARB1干扰稳定株组内转染miR-185 inhibitor后,与SCARB1干扰稳定株组相比,细胞增殖在转染24 h、48 h、72 h和96h被抑制,有统计学差异。
  4、凋亡实验结果:(1)与空白组和SCARB1干扰对照株组相比,转染SCARB1慢病毒干扰稳定株48h后细胞凋亡减少,有统计学差异。(2) SCARB1干扰稳定株组内转染miR-185 inhibitor48h后,与SCARB1干扰稳定株组相比,细胞凋亡增加。
  结论:
  1、成功构建干扰SCARB1稳定表达的细胞株。
  2、miR-185通过靶向SCARB1促进HSC活化,进而促进肝纤维化的发生发展。
  3、干扰SCARB1基因表达可以促进HSC增殖。
  4、干扰SCARB1基因表达可以抑制HSC凋亡。
[硕士论文] 张齐
内科学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.观察不同中医辨证分型的非酒精性脂肪肝患者的临床特点;2.超低频脉冲电流章门穴位照射治疗对非酒精性脂肪肝患者临床治疗效果(肝功能、血脂、肝脏超声背向散射积分量表、脂肪肝指数等改变);3.非酒精性脂肪肝患者对超低频脉冲电流章门穴位照射治疗的依从性;4.超低频脉冲电流章门穴位照射治疗非酒精性脂肪肝患者所产生的不良反应。探讨超低频脉冲电流章门穴位照射治疗应用于非酒精性脂肪肝患者的临床意义,为非酒精性脂肪肝的预防、诊断、治疗提供依据。
  方法:
  将83例非酒精性脂肪肝患者。随机分为治疗组及对照组两组,分别检测患者的肝功能、血脂、肝脏超声背向散射积分(Integrated backscatter,IBS)参数、脂肪肝指数(Fatty liver index,FLI)、镇痛-伤害性指数(Analgesia nociceptive index,ANI)。
  两组患者均予以静脉输注甘草酸二铵注射液150mg,每日一次;注射用还原性谷胱甘肽2.4g,每日一次。治疗组患者在此基础上,加用HD-91Ⅱ型肝病治疗仪超低频脉冲章门穴位照射电流治疗30min,每天早晨9时开始一次,每日一次。患者接受三疗程治疗,每个疗程均为15天,一个疗程结束后均休息7天再继续下一个疗程治疗。治疗过程中对患者的心理及饮食进行指导,减少观察数据的偏移。三个疗程治疗结束后再次分别检测两组患者的肝功能、血脂、肝脏超声背向散射积分、脂肪肝指数、镇痛-伤害性指数将检测结果、同时治疗过程中患者的依从性及出现的不良反应事件进行比较分析。两组人群均为2011年6月至2014年6月在南京二院及六合区人民医院的住院患者。
  依据《中药新药临床研究指导原则(试行)》中非酒精性脂肪肝的疗效标准拟定。凡满足以下全部4项者为近期治愈,满足3项者为显效,满足2项者为有效,未满足有效标准者为无效:
  (1)B超检查超声背向散射积分(Integrated backscatter,IBS),即图像平均强度(averageimageintensity,AII)、图像强度标准差(standarddeviation ofimage intensity,SDI)、图像峰一峰强度(peaktopeakintensity,PPI)这三项B超积分,B超积分至少有2项指标每项比治疗前下降1分或1分以上为有效;
  (2)丙氨酸转移酶(Alanine transaminase,ALT)、血清总胆固醇(Total cholestero,TC)、甘油三酯(Triacylglycerol,TG)、脂肪肝指数(Fatty liver index,FLI)、身体质量指数(Body mass index,BMI)恢复正常范围或下降≥40%;
  (3)体检肝脏明显回缩;
  (4)临床症状明显改善,证候积分下降≥70%。中医证候积分标准:按临床症状轻、中、重程度分别记1、2、3分。计算公式为[(治疗前积分—治疗后积分)÷治疗前积分]×100%。
  结果:
  1、患者基本情况:对照组共41例,其中男性20,女性21例,年龄主要分布在27岁至68岁之间,中位数年龄49.4岁,平均病程3.7±1.21年,体重指数23.4±2.3kg/m2;按照中医辨证分型,其中肝郁脾虚型12例、痰浊壅阻型9例、湿热内蕴型8例、痰瘀互结型6例、肝肾不足型6例;脂肪指数FLI均值66.74±8.27。
  治疗组42例,其中男性21例,女性21例,年龄主要分布在26岁至69岁之间,平中位数年龄49.7岁,平均病程3.6±1.19年,体重指数23.7±2.5kg/m2;按照中医辨证分型,其中肝郁脾虚型12例、痰浊壅阻型9例、湿热内蕴型8例、痰瘀互结型6例、肝肾不足型7例;FLI均值67.26±8.08。
  两组患者的所有自然资料,不具有明显的统计学差异。
  两组患者基础的肝功能、FLI、BMI及血脂均没有明显统计学差异。
  2、患者按照中医辨证分型后分为5组,分别为肝郁脾虚型、痰浊壅阻型、湿热内蕴型、痰瘀互结型、肝肾不足型,将各型各项指标对比分析,其中湿热内蕴组的肝功能中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)284.28±25.33u/l、丙氨酸转移酶(Alanine transaminase,ALT)256.6±20.13u/l、FLI71.7±8.27、总胆汁酸(Total bile acid,TBA)34.68±2.43umol/L、镇痛-伤害性指数(Analgesia nociceptive index,ANI)-1.56±0.25数值较其他各组明显异常,有统计学意义,P<0.05。
  3、治疗效果:治疗组治愈3例(7.3%),显效12例(29.3%),有效24例(58.5%),无效2例(4.9%),总有效率95.1%。对照组治愈0例(0%),显效5例(11.9%),有效18例(42.9%),无效19例(45.2%),总有效率54.8%。两组总有效率比较,经卡方检验,有显著性差异(X2=8.65,P=0.00002)。
  4、治疗组治疗前后肝功能、血脂、超声背向散射积分、脂肪肝指数、镇痛-伤害性指数,进行对比分析,治疗后各项指标均有明显改善(P<0.05),对照组也同样治疗后各项指标均有明显改善(P<0.05)治疗组与对照组治疗后相关数据相比差异明显(P<0.05),且治疗组优于对照组,具有统计学意义。
  结论:
  1、非酒精性脂肪肝患者按中医辨证分型后,其中湿热内蕴组的肝功能中LDH、ALT、FLI、TBA、ANI数值较其他各组明显异常;
  2、本次研究中可以观察到,在治疗前后,FLI与超声背向散射积分均出现了改善,显示非酒精性脂肪肝患者的脂肪肝指数与其肝脏背向散射积分具有较好的一致性,对临床预防、诊断、治疗非酒精性脂肪肝提供了新的有益的探索。
  3、治疗组、对照组治疗后肝功能、血脂、肝脏IBS、FLI均有明显改善,但两组治疗总有效率有显著性差异,治疗组总有效率更高;
  4、肝区疼痛、食欲不振、腹胀、肝功能恶化及其他不良事件,治疗组与对照组无明显差异性。
[硕士论文] 李谦
护理学 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  了解老年患者结肠镜检查前肠道准备质量的现况及影响因素,探索有肠道准备不充分史老年患者的肠道准备改进方案,探讨降低老年患者肠道准备不良反应的肠道准备方法,以提高老年患者肠道准备的有效性和安全性,提高肠道准备的质量。
  方法:
  1、问卷调查法:采用自行设计的“老年患者结肠镜检查前肠道准备情况调查表”,对307例在我院行非紧急结肠镜检查的老年患者进行调查,记录患者的一般资料、就诊原因和肠道准备情况等,并对患者的肠道准备质量进行判断。
  2、自身对照试验:根据结肠镜检查前肠道准备质量的影响因素,对研究第一部分发现的肠道准备不充分的老年患者,采取有针对性的改进措施,观察其对肠道准备质量的改进效果。
  3、临床对照研究:采用便利抽样法,抽取拟在我院住院行结肠镜检查的120名老年患者,随机分为三组,采用口服50%的硫酸镁溶液+果味补液盐溶液、口服50%的硫酸镁溶液+白开水和口服聚乙二醇电解质散溶液三种方式进行肠道准备。分析对比三组老年患者的肠道准备完成情况、肠道准备质量、不良反应发生率和肠道准备后血生化指标情况。
  结果:
  1、问卷调查结果:共调查了307例老年患者,OBPS≤6分(肠道准备充分)172例(56.03%),OBPS≥6分(肠道准备不充分)135例(43.97%),279例患者结肠镜插入到达回盲部(回盲部插镜率为90.88%),101例患者有结肠息肉(息肉检出率为32.9%);单因素分析发现,年龄、便秘、首次检查、护士对患者教育、饮食准备、口服液体量及不良反应是老年患者结肠镜检查前肠道准备是否充分的可能影响因素(P<0.05);多因素分析发现,便秘(OR,2.621;95%CI,1.475-4.998)、护士教育不足(OR,2.231;95%CI,0.421-6.012)、饮食准备不合格(OR,2.227;95%CI,0.532-4.694)和出现不良反应(OR,1.400;95%CI,0.370-3.115)是肠道准备不充分的独立危险因素,增加口服液体量(OR,0.386;95%CI,0.200-1.406)是肠道准备保护因素。
  2、自身对照研究结果:对有肠道准备不充分史的老年患者采取改进肠道准备方法后,①便秘情况:本次检查前,存在便秘的患者比例明显低于干预前(P<0.05)。②饮食准备合格率:本次肠道准备中,患者饮食准备合格率明显高于干预前(P<0.05)。③口服液体量:患者口服液体量较干预前增加(P<0.05)。④患者对护士教育评价:在本次肠道准备中,有90%的患者认为护士给予了足够的肠道准备相关知识教育,这一比例较干预前有明显提高(P<0.05)。⑤肠道准备质量:本次患者肠道准备的OBPS总得分低于干预前(P<0.05),且各段结肠的OBPS得分也均较干预前低(P<0.05),肠道准备不充分患者的比例明显下降(P<0.05);肠腔总液体量的得分干预前后无明显差异(P>0.05)。干预前后两次结肠镜检查的回盲部插镜率和息肉检出率的差异无统计学意义(P>0.05)。⑥不良反应发生情况:干预前后两次肠道准备中,患者不良反应发生率均较高,分别为61.67%和51.67%;不良反应的总发生率和各种不良反应的各自发生率干预前后相比均无统计学差异(P>0.05)。
  3、临床对照研究结果:①肠道准备完成情况:三组患者开始服药至大便清澈时间无差异(P>0.05);硫酸镁+果味补液盐组的总饮水量明显多于硫酸镁+白水组和PEG组(P<0.05),排便次数也明显多于其他两组(P<0.05)。②肠道准备质量:三组患者OBPS总分和各段肠道(右段结肠、中段结肠、直乙结肠)得分差异均无统计学意义(P>0.05),各组息肉检出率、回盲部插镜率的差异没有统计学意义(P>0.05)。③不良反应发生率:果味补液盐组不良反应总发生率明显低于其他两组(P<0.05),其中恶心、腹胀发生率均低于其他两组(P<0.05),其他不良反应的发生率在三组之间无差异(P>0.05)。④血生化指标:a.与基线值比较:硫酸镁+果味补液盐组的血糖值高于基线值(P<0.05),硫酸镁+白开水组的血清Na+浓度低于基线值(P<0.05),两组其他指标与基线值比较无明显差异(P>0.05)。PEG组的各项血生化指标与基线相比均无统计学差异(P>0.05)。b.组间比较:三组患者的血清K+、Na+、Cl-浓度无差异(P>0.05),硫酸镁+果味补液盐组的血糖值明显高于其他两组(P<0.05)。c.各组与基线的差值比较:硫酸镁+果味补液盐组血糖值较基线水平的改变幅度大于其他两组(P<0.05),硫酸镁+白开水组血清K+、Na+浓度较基线值降低幅度大于其他两组(P<0.05)。④患者满意度和肠道准备意愿:硫酸镁+果味补液盐组患者对肠道准备的满意度评分高于其他两组(P<0.05),愿意再次接受同法进行肠道准备的患者多于其他两组(P<0.05)。
  结论:
  老年患者结肠镜检查前肠道准备不充分的比例较高,便秘、护士对患者教育不足、饮食准备不合格及出现不良反应是其独立危险因素,增加口服液体量是肠道准备的保护因素,临床上应据此为老年患者实施针对性干预措施,帮助其获得充分的肠道准备;对有肠道准备不充分史的老年患者采取改进肠道准备方法,可减少患者存在的影响肠道准备质量的因素,提高肠道准备质量;硫酸镁联合使用果味口服补液盐,不影响患者的肠道准备质量,可减少老年患者肠道准备中的不良反应,增加肠道准备的安全性,提高患者对肠道准备过程的满意度。
[硕士论文] 王旋
外科学(肝胆外科) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  缺血-再灌注损伤是临床实践中比较多见的病理过程,是指在组织或器官缺血一段时间后重新恢复血流灌注,组织器官功能不仅没有恢复,反而缺血所致的损伤进一步加重的现象。在行肝脏手术时有时仍需要采取阻断入肝血流来减少出血风险和降低手术难度,但残余肝脏在恢复供血后会发生缺血-再灌注损伤,严重的甚至导致肝衰竭。特别是在长时间缺血情况下,如肝移植术后,缺血-再灌注损伤的发生更为常见。因此,研究肝脏缺血-再灌注损伤的发生机制,具有重要的临床价值。缺血-再灌注损伤涉及多种机制,包括线粒体功能紊乱、乳酸堆积和酸中毒、钙离子超载、活性氧、自由基的生成和中性粒细胞活化等。
  大量研究发现miRNA在细胞内发挥着重要的生物学作用。miRNA特异性的识别其作用靶基因mRNA的3'-非编码区(3'-UTR),降解mRNA或者抑制mRNA的翻译,降低效应蛋白水平。本研究旨在探讨miRNA在肝脏缺血-再灌注中的作用,为肝脏缺血-再灌注损伤的预防和治疗提供可能的理论依据。在前期实验中,以L02人肝细胞系建立了肝细胞缺氧/复氧模型,以在体外模拟肝脏缺血-再灌注过程。建模后,采用生物芯片技术对缺氧/复氧前后肝细胞中全部miRNA和mRNA表达变化进行检测。结果显示miR-20a-5p和HSP70mRNA在缺氧/复氧前后均存在显著变化。
  因此,本实验拟探究miR-20a-5p和HSP70是否存在相互作用,以及它们对缺氧/复氧诱导的肝细胞损伤的影响,为临床中肝脏缺血-再灌注损伤的预防和治疗提供理论依据。
  研究方法:
  1、建模:体外培养L02肝细胞,分别建立缺氧和复氧时间梯度,用流式细胞术检测细胞凋亡,筛选L02肝细胞缺氧/复氧模型的建立条件;
  2、利用CCK8实验检测细胞凋亡,对缺氧/复氧模型进行验证;
  3、检测在缺氧/复氧前后细胞培养液中ALT、AST的含量变化;
  4、分别取对照组、缺氧组和复氧组,用基因芯片技术对全部miRNA和mRNA表达变化进行检测;
  5、利用Real-time PCR技术检测miR-20a-5p和HSP70mRNA在对照组、缺氧组和复氧组的变化;
  6、利用Western blot检测HSP70在对照组、缺氧组和复氧组的变化;
  7、采用Lipofectamine2000将miR-20a-5p mimic转染入L02细胞,以上调miR-20a-5p的表达,将miR-20a-5p inhibitor转入细胞,以下调miR-20a-5p的表达;
  8、在分别转染miR-20a-5p mimic和miR-20a-5p inhibitor后,利用流式细胞术和CCK-8实验检测肝细胞在缺氧/复氧前后细胞损伤的变化;
  9、利用Targetscan生物信息学分析对miR-20a-5p的作用靶基因进行预测;
  10、在分别转染miR-20a-5p mimic和miR-20a-5p inhibitor后,采用Western blot检测肝细胞中HSP70在缺氧/复氧前后的变化;
  11、双荧光素酶报告基因技术对miR-20a-5p与HSP70mRNA3'-UTR的结合进行检测;
  12、合成HSP70siRNA,用Lipofectamine2000瞬转入L02细胞以敲低HSP70的表达,用Western blot检测转染效率;
  13、将miR-20a-5p inhibitor和HSP70siRNA同时转入L02细胞,用CCK8试验和流式细胞技术检测缺氧/复氧后细胞的损伤情况,检验miR-20a-5p inhibitor在缺氧/复氧过程中对肝细胞的保护作用是否会被HSP70siRNA逆转,以验证miR-20a-5p是通过对基因HSP70的调控作用来诱导复氧后肝细胞的损伤;
  14、将miR-20a-5p mimic和miR-20a-5p inhibitor分别转入L02肝细胞,接着进行缺氧/复氧处理,用ATP检测试剂盒检测缺氧/复氧后各组ATP含量的变化;
  15、将miR-20a-5pmimic和miR-20a-5p inhibitor分别转入L02肝细胞,接着进行缺氧/复氧处理,然后用Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和胞质中细胞色素C(Cyt-c)的表达变化。
  研究结果:
  1、建模:流式细胞术检测结果显示缺氧12h,复氧12h后L02细胞损伤最为明显,以此条件建立L02细胞缺氧/复氧模型;
  2、基因芯片结果显示,共检测到miRNA2588个,检测到mRNA19783个,其中miR-20a-5p和HSP70mRNA在缺氧组和复氧组均存在明显变化;
  3、Real-time PCR结果显示,miR-20a-5p在缺氧组表达下调,在复氧组表达上调;HSP70mRNA在缺氧组表达上调,在复氧组表达下调;
  4、Western blot结果显示,HSP70在缺氧组表达上调,在复氧组表达下调;
  5、CCK8实验和流式细胞术结果显示,与对照组(转染miR control)相比,转染miR-20a-5pmimic组,在缺氧/复氧处理后细胞损伤加重;而在转染miR-20a-5p inhibitor组,缺氧/复氧处理后细胞损伤明显减轻;
  6、TargetScan生物信息学分析发现miR-20a-5p与HSP70mRNA3'-UTR存在可能的结合位点;
  7、Western blot结果显示,miR-20a-5p inhibitor可以抑制缺氧/复氧后HSP-70的下调;
  8、双荧光素酶基因报告检测结果显示,在HSP70mRNA3'-UTR存在miR-20a-5p的结合位点。miR-20a-Sp通过作用于HSP70mRNA3'-UTR来抑制蛋白HSP-70的表达;
  9、与单独转染miR-20a-5p inhibitor相比,同时将miR-20a-5p inhibitor和HSP70siRNA转入L02细胞,缺氧/复氧处理后细胞损伤加重。说明在缺氧/复氧过程中,miR-20a-5p inhibitor对肝细胞的保护作用能够被HSP70siRNA逆转;
  10、转染miR-20a-5p inhibitor后再进行缺氧/复氧处理组较只进行缺氧/复氧处理组肝细胞ATP表达量增加。说明缺氧/复氧后miR-20a-5p的上调导致了线粒体功能的紊乱;
  11、转染miR-20a-5p inhibitor后再进行缺氧/复氧处理组较只进行缺氧/复氧处理组Bax和胞质中Cyt-c表达均下调,而Bcl-2在缺氧/复氧后各组间变化不明显。这表明缺氧/复氧后miR-20a-5p上调抑制蛋白HSP-70的表达,线粒体相关损伤蛋白表达增加,间接导致了线粒体功能的紊乱,加重了肝细胞。
  研究结论:
  在缺氧/复氧诱导的肝细胞损伤中,缺氧时miR-20a-5p表达下调,而复氧后miR-20a-5p表达迅速上调;复氧后miR-20a-5p的上调抑制了具有线粒体保护功能的HSP70表达,导致线粒体功能紊乱,从而复氧后肝细胞的损伤加重。
[硕士论文] 雷淑娟
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤的病理性修复反应,以肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSC)活化、细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)过度沉积为主要特征。肝纤维化是病毒性、自身免疫性、酒精性、非酒精性脂肪性以及铜铁代谢异常等病因导致的慢性肝损伤发展为肝硬化的必经过程[1,2],但这一过程是可逆的。因此,肝纤维化的治疗具有重要的意义。
  微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长约15-22个核苷酸的内源性非编码RNA,其主要通过结合靶向信使RNA(mRNA)的3'非编码区(3'-untranslated region3'UTR),直接降解mRNA或抑制其转录来调节基因的表达[3,4]。研究表明人体中约有1880种miRNAs[5],且三分之一的mRNA受到miRNA的调控[6][1],因此miRNA参与细胞的增殖、分化、凋亡、代谢及内分泌等多种功能的调节[7-10][2]。MicroRNA的表达异常与肿瘤形成、心脏衰竭、神经再生等多种疾病相关[11-13]。大量研究发现体内多种器官(心脏、肾脏、肺、肝脏)的纤维化伴随着miRNA的表达异常。在肝纤维化中,许多miRNA可通过影响HSC增殖活化、细胞外基质合成以及肝纤维化相关信号通路等多个环节调控肝纤维化的发生发展。因此,miRNA可能成为诊断和治疗肝纤维化的重要靶点。
  MicroRNA-134位于人14号染色体印记基因Dlk1/Dio3区域上hsa-miR-379~hsa-miR-656miRNA簇,首先被发现为脑特异miRNA[14],能够参与突触细微结构的调控,并促进树突生长和脊髓形成[15]。研究发现miR-134与神经系统肿瘤关系密切,能够通过诱导细胞周期阻滞、靶向干细胞相关基因Nanog等,参与调控肿瘤干细胞分化,抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[16]。本实验室前期研究证实,MicroRNA-134通过靶向调控KRAS抑制肝癌细胞增殖、克隆形成和转移等恶性生物学行为,且肝癌组织中miR-134表达水平与肝癌临床恶性表型存在密切关联[17]。晚近数据显示miR-134与特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)关系密切,相比健康人群,IPF患者miR-134表达显著下调[18]。miR-134在非小细胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC)中可抑制TGF-3诱导的上皮细胞间质转型(Epithelial-to-mesenchymal transition EMT)过程[19]。Liu Y等在肾细胞癌中也证实了miR-134可抑制肿瘤细胞的增殖及EMT过程[20]。而Sangyoon Lee等近期研究发现miR-134介导昆布(Dieckol)的抗肝纤维化作用[21]。以上研究表明miR-134参与了多种器官的纤维化进程,但miR-134在肝纤维化发生、发展中的作用及其机制尚不明确。
  基于以上研究,本课题拟研究miR-134在肝纤维化发生发展的作用及其机制,为肝纤维化的治疗提供新的思路。
  研究方法:
  一、MicroRNA-134的表达情况与肝纤维化的关系
  1.从中国科学院上海动物中心购买Sprague-Dawley(SD)大鼠8只,重约180-200g,随机分为两组:对照组和模型组,每组各4只。对照组按照每公斤体重一毫升生理盐水给予腹腔注射,每周2次,共8周;模型组按照每公斤体重一毫升50%CCl4/橄榄油混合液腹腔注射,每周2次,共8周,构建大鼠肝纤维化模型。于第8周末麻醉、处死所有大鼠。肝组织石蜡包埋、切片后用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin,H&E)、天狼星红-饱和苦味酸染色(Sirius red)进行组织化学染色评价肝纤维化程度,并用相关软件Image-Pro Plus进行纤维化半定量分析。Real time RT-PCR检测miR-134及肝纤维化相关基因α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen typeⅠ,COLⅠ)的mRNA表达水平。Western blot检测肝纤维化相关基因α-SMA、COLⅠ的蛋白表达水平。
  2.HSC活化过程中miR-134表达变化
  利用不同浓度TGF-β(0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml)处理人HSC-LX224h后,利用Real time RT-PCR技术检测miR-134及α-SMA、COLⅠ的表达水平。
  二、MicroRNA-134对HSC的增殖及活化的影响
  1.MicroRNA-134对HSC增殖能力影响
  接种HSC-LX2至96孔板,每孔3000个细胞,24h后转染对照NC和miR-134模拟物(mimic)上调人HSC-LX2中miR-134表达。通过CCK8方法检测上调miR-134对HSC增殖能力影响。
  接种HSC-LX2至96孔板,每孔3000个细胞,24h后转染对照和miR-134抑制剂(inhibitor)下调人HSC-LX2中miR-134表达。通过CCK8方法检测下调miR-134对HSC增殖能力影响。
  2.MicroRNA-134对HSC活化的影响
  转染miR-134mimic上调HSC-LX2中miR-134或转染miR-134inhibitor下调miR-134后,分别收集RNA和蛋白,分别利用Real time RT-PCR和western blot检测HSC-LX2α-SMA、COLⅠ在mRNA和蛋白水平表达变化情况。
  三、MicroRNA-134抑制HSC增殖及活化的机制研究
  1.利用电脑软件target Scan预测miR-134的靶基因,查阅文献,选择与肝纤维化相关的靶基因-转化生长因子激酶1(transforming growth factor-beta-actived kinase1,TAK1)结合蛋白1(TAK1binding protein1,TAB1)进行验证。
  2.转染miR-134mimic上调HSC-LX2中miR-134的表达或转染miR-134inhibitor下调miR-134表达,通过Real time RT-PCR和western blot检测预测靶基因TAB1mRNA和蛋白水平变化。
  3.根据软件预测的miR-134与TAB13'UTR的结合位点构建荧光素酶报告基因质粒,检测miR-134对该萤光素酶报告基因作用。将miR-134在TAB13'UTR上的结合位点突变后,检测miR-134对突变后的荧光酶报告基因的作用,以明确TAB1是否为miR-134的直接靶基因。
  4.明确TAB1是否介导miR-134对HSC的作用
  利用化学合成的TAB1siRNA下调HSC-LX2中TAB1的表达后,通过CCK8方法检测HSC增殖能力变化。通过Real time RT-PCR和western blot检测α-SMA、COLⅠ的表达变化,共转染miR-134inhibitor和TAB1siRNA后,通过CCK8方法HSC增殖能力变化和western blot检测α-SMA、COLⅠ的表达变化,证实TAB1是否介导miR-134对HSC的抑制作用。
  四、上调miR-134对实验性大鼠肝纤维化的影响
  雄性SD大鼠24只,重180-200g,将大鼠随机分为2组:对照组(12只)按5×109pfu/只尾静脉注射AdGFP病毒,2次/周;AdmiR-134治疗组(12只)按5×109pfu/只尾静脉注射Ad-134病毒,2次/周,共7周。注射病毒1周后,两组均给予50%CCl4/橄榄油1ml/Kg体重腹腔注射,2次/周,共6周,于第6周末处死所有大鼠。进行肝组织H&E、Sirius red化学染色评价肝纤维化程度,利用Real time RT-PCR检测miR-134及α-SMA、COLⅠ的表达变化。
  五、统计学处理
  采用SPSS17.0统计软件包进行相关数据分析,方差齐性两样本资料采用两样本双尾T检验方法进行分析;P<0.05为差异有统计学差异,P<0.01为具有非常显著性差异。
  研究结果:
  一、MicroRNA-134表达下调与肝纤维化的进展相关
  1.H&E染色发现,相比正常组,模型组肝组织中肝小叶结构破坏、脂肪变性明显,大量纤维间隔形成。天狼星红-饱和苦味酸染色显示造模后肝组织大量纤维疤痕形成。Real time RT-PCR和Western blot检测发现,与正常对照相比,纤维化相关基因α-SMA、COLⅠmRNA及蛋白表达均上调。上述结果提示:CCl4诱导的肝纤维化模型构建成功,且肝纤维化后肝组织中miR-134表达水平较正常肝脏明显下调。
  2.HSC活化过程中miR-134表达下调
  用TGF-β活化HSC-LX2细胞后,Real time RT-PCR检测发现α-SMA、COLⅠ表达显著上调,miR-134表达则显著下调。
  二、MicroRNA-134抑制HSC的增殖及活化
  1.MicroRNA-134抑制HSC增殖
  转染miR-134mimic上调HSC-LX2细胞中miR-134的表达后,通过CCK8检测发现miR-134可显著抑制HSC增殖能力。
  转染miR-134inhibitor下调HSC-LX2细胞中miR-134的表达后,通过CCK8检测发现下调miR-134可促进HSC增殖能力。
  2.MieroRNA-134抑制HSC的活化
  转染miR-134mimic上调HSC-LX2中miR-134的表达后,α-SMA、COLⅠ在mRNA和蛋白水平均明显下降,而转染miR-134inhibitor下调HSC-LX2中miR-134的表达后,α-SMA、COLⅠ表达均升高。
  三、TAB1是miRNA-134的直接靶基因
  1.Target Scan软件预测结果显示TAB13'UTR上含有miR-134的作用位点。上调HSC-LX2细胞中miR-134表达后,TAB1mRNA和蛋白表达显著降低;下调HSC-LX2细胞中miR-134表达后,TAB1mRNA和蛋白表达显著升高。
  2.上调miR-134表达可显著抑制TAB13'UTR荧光素酶报告基因活性。将TAB13'UTR上的miR-134结合位点突变后,miR-134对此报告基因的活性无明显影响,表明TAB1为miR-134的直接靶基因。
  3.下调HSC-LX2细胞中TAB1表达可显著抑制HSC的增殖和活化,与miR-134mimic效应相似,转染miR-134inhibitor下调miR-134后促进HSC-LX2细胞增殖及活化,而共转染miR-134inhibitor和TAB1siRNA后,此促进作用减弱,表明TAB1可能部分介导miR-134对HSC细胞增殖及活化的抑制作用。
  四、上调miRNA-134抑制实验性大鼠肝纤维化进程
  H&E染色发现,相比AdGFP组,AdmiR-134治疗组肝组织中肝小叶结构基本正常、脂肪变性较少。天狼星红-饱和苦味酸染色显示AdmiR-134治疗组肝胶原沉积明显减少;Real time RT-PCR检测发现AdmiR-134治疗组α-SMA、COLⅠmRNA及表达下调。上述结果提示:上调miR-134抑制实验性大鼠肝纤维化进程
  研究结论:
  1.MicroRNA-134表达下调与肝纤维化的进展相关;
  2.MicroRNA-134可抑制HSC的增殖及活化;
  3.MicroRNA-134通过调控其直接靶基因TAB1的表达抑制HSC增殖及活化;
  4.上调miRNA-134抑制实验性大鼠肝纤维化进程。
[硕士论文] 高云
儿科学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease,GERD)发病机制复杂,多种因素参与GERD的发生和发展,普遍认为GERD的发生主要是由反流物对食管的化学性损伤、局部免疫炎症反应和食管内脏高敏感等因素所致。大量研究证实GERD患者,尤其是NERD患者,食管对酸和机械性刺激的敏感性升高,提示食管内脏高敏感对GERD症状的产生和持续具有重要作用。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channel,ASICs)是一种配体门控阳离子通道,当细胞外pH下降和质子浓度增加时被激活,产生内向Na+电流,参与化学和机械信号的传导。大量研究证实,ASICs与伤害性感受的产生和中枢致敏有关,参与疼痛的调节和产生。蛋白激酶C结合蛋白1(protein interacting with C-kinase1,PICK1)是一种高度保守的外周膜蛋白,是唯一含有PDZ(PSD-95/Dlg/ZO-1)结构域和BAR(Bin-Amphiphysin-Rvs)结构域的蛋白质。其功能多样,可以与多种蛋白质结合,在蛋白质转运和突触传递中具有重要作用。研究发现PICK1通过PDZ结构域与ASIC1结合,调节ASIC1的表达和功能。GERD内脏高敏感机制至今未明,ASIC1、PICK1是否参与GERD的发生和发展尚无明确报道。本研究意在明确GERD食管内脏高敏感与躯体感觉的关系,ASIC1和PICK1是否参与食管酸敏感性的调节。
  研究方法:
  对雄性SD大鼠分别采用不同材料和直径的幽门限制术(A组:将特制18Fr Nelaton导管环套于幽门;B组:丝线结扎控制幽门直径为4.17mm;C组:丝线结扎控制幽门直径为3.42mm;D组:丝线结扎控制幽门直径为2.98mm)结合胃底结扎术的方法建立GERD大鼠模型,S组为假手术组。术后观察各组大鼠体重变化;取贲门5mm以上食管行食管大体观察和苏木素伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色病理分析;对不同幽门直径的幽门限制术后大鼠的生存率及成模率进行评估。雄性SD大鼠随机分为两组,对GERD组大鼠行幽门限制术结合胃底结扎术,控制幽门直径为3.42mm,Sham组为假手术组,分别于术前1天,术后第3、7、11、15天检测两组大鼠机械缩足反射阈值(mechanical paw withdraw threshold,MWT)和热缩足反射潜伏期(thermal paw withdraw latency,TWL);用DiI示踪法定位食管特异性背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元,术后第15天进行全细胞膜片钳检测;用Western Blot、RT-PCR的方法检测术后第15天两组大鼠食管黏膜及T3~T5DRG中ASIC1、PICK1蛋白表达和mRNA含量。用SPSS18.0软件分析数据,计量资料用均数±标准差((X)±S)表示,生存率和成模率用百分率表示。对数据进行正态性和方差齐性检验,符合正态分布且方差齐时,两组比较用独立样本t检验,多组比较用单因素方差分析;不符合正态分布的资料根据需要使用秩和检验或Fisher确切概率法;用Chi-square的统计学方法对各组大鼠术后生存率和成模率进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。
  研究结果:
  1.不同直径幽门限制术建立GERD大鼠动物模型的比较
  术后S组大鼠毛发光泽,活动敏捷。其余各组大鼠被毛粗糙、灰暗,反应迟钝,行动迟缓,饮水量、食量下降。术后15天S组和B组大鼠体重增加,两组大鼠体重无显著性差异(296.00±19.408g vs278.50±19.156g,P=0.077),术后15天A、C、D组大鼠体重下降(168.75±13.823g,177.50±15.501g,152.00±5.701g),A、C、D组与Sham组相比,差异均有统计学意义(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。S组生存率100%,A、B、C、D组生存率分别为40%、85%、60%、25%。5组生存率不全相等,差异有统计学意义(P<0.001));其中S组与B组生存率无显著性差异(P=0.231);S组生存率与A、C、D组相比,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05,P<0.05);A组生存率与B组相比,差异有统计学意义(P<0.05);B组生存率与D组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。
  术后第15天取大鼠食管所见:S组食管黏膜光滑、完整,其余各组食管有不同程度黏膜糜烂、坏死、出血、溃疡或瘢痕等。15天后食管HE病理示:S组食管上皮角质层完整,上皮层薄。其余各组食管基底细胞增生,乳头延长,超过上皮的2/3以上,溃疡形成,黏膜下层炎症细胞浸润等。A、B、C、D组成模率分别为100%、41.18%、91.67%、100%。A组与B组相比,成模率差异有统计学意义(P<0.05),A组与C组相比,C组与D组相比,成模率无显著性差异(P=1.00)。B组与C组成模率差异有统计学意义(P<0.05)。
  2.GERD大鼠MWT下降,TWL无明显改变,DRG神经元敏感性升高
  造模前1天GERD组与Sham组大鼠MWT无显著性差异(49.14±15.44g vs54.63±8.80g,P=0.511);造模后第3天两组MWT明显下降,两组之间无显著性差异(9.64±6.19g vs6.33±4.42g,P=0.307);造模后第7、11、15天GERD组大鼠与Sham组相比缩足反射阈值明显下降(7.98±5.66g vs24.28±17.02g,P<0.05;12.08±13.78g vs36.12±16.60g,P<0.01;16.16±17.71g vs39.40±14.97g,P<0.05)。
  造模前1天及造模后第3、7、11、15天,两组大鼠TWL无显著性差异(18.34±1.14s vs18.31±0.86s,P=0.948;9.10±0.91s vs8.43±0.80s,P=0.139;9.95±1.51s vs9.06±1.35s,P=0.232;13.26±1.61s vs11.70±1.84s,P=0.092;13.48±1.63s vs12.70±1.46s,P=0.335)。
  膜片钳结果显示GERD组大鼠食管DRG神经元静息膜电位较Sham组去极化显著(-45.27±0.56mV vs-51.91±0.34mV,P<0.001);GERD组大鼠DRG神经元阈电流较S组明显降低(25.91±5.98pA vs83.64±3.88pA,P<0.001);2倍、3倍阈电流刺激下GERD组、Sham组大鼠DRG神经元动作电位发放频率明显增加(6.27±0.76vs3.36±0.41,P<0.001)、(10.91±0.77vs5.64±0.49,P<0.001)。
  3.ASIC1在GERD组大鼠食管黏膜中表达下调,PICK1在GERD组大鼠食管黏膜中表达上调
  Western Blot结果显示GERD组大鼠食管黏膜ASIC1蛋白表达下降(1.1594±0.4678vs0.7190±0.2284,P<0.05);GERD组与Sham组大鼠DRG中ASIC1蛋白表达无显著性差异(1.4948±0.2657vs1.5180±0.6213,P=0.925)。与Sham组相比,GERD组大鼠食管黏膜PICK1蛋白表达上调(0.5109±0.2484vs0.9141±0.3924,P<0.05)。GERD组与Sham组大鼠DRG中PICK1蛋白表达无显著性差异(0.4963±0.4560vs0.3183±0.2476,P=0.375)。
  RT-PCR结果显示GERD组大鼠食管黏膜ASIC1mRNA表达下降,差异有统计学意义(1.0207±0.2126vs0.6559±0.1193,P<0.01);GERD组与Sham组大鼠DRG中ASIC1mRNA含量呈下降趋势,差异无统计学意义(0.9204±0.2190vs1.1055±0.2811,P=0.232)。与Sham组相比,GERD组大鼠食管黏膜PICK1mRNA表达上调,差异有统计学意义(1.3428±0.1621vs1.0111±0.1626,P<0.01),GERD组与Sham组DRG中PICK1mRNA含量无显著性差异(1.0295±0.2249vs1.0176±0.1978,P=0.924)。
  研究结论:
  1.控制幽门直径为3.42mm的幽门限制术结合胃底结扎术是建立GERD组大鼠模型的可靠方法;
  2.GERD组大鼠食管特异性DRG神经元兴奋性增高,痛觉行为学显示GERD组大鼠机械痛觉敏感性升高,提示内脏高敏感影响躯体感觉的形成;
  3.ASIC1在GERD组大鼠食管黏膜表达下降,PICK1在GERD组大鼠食管黏膜表达升高,提示ASIC1、PICK1参与GERD食管内脏高敏感的形成。
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