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[硕士论文] 程小玲
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:目前长链非编码RNA H19对于宫颈癌Hela细胞生物学功能的作用及其作用机制尚缺乏相关研究。本文主要探讨了LncRNA H19在宫颈癌Hela细胞中的生物学功能研究。
  方法:本研究选择在3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)和正常上皮细胞株(H8)中来检测LncRNA H19的表达。构建含H19基因的重组真核表达载体pCDNA3.1-GFP-H19,经双酶切及基因测序等鉴定构建成功,并合成siRNA的LncRNA H19干扰序列,同时设置空白对照组、pCDNA3.1-GFP组及si-NC组。各组细胞转染48h后采用RT-qPCR法检测LncRNA H19mRNA相对表达水平;采用CCK-8法检测在转染后24h、48h、72h及96h细胞的增殖率;采用流式细胞仪分别检测各组24h和48h细胞凋亡率;采用细胞划痕实验检测各组细胞转染后的迁移数,评估细胞迁移能力;采用Transwell细胞体外侵袭实验检测各组细胞转染后的侵袭能力;采用Western blotting的方法检测LncRNAH19对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达。
  结果:3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)中LncRNA H19的表达明显高于正常上皮细胞株(H8)中LncRNA H19的表达。首先,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外增殖和抑制其凋亡,沉默LncRNA H19可以显著抑制Hela细胞体外增殖和促进其凋亡。其次,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外迁移、侵袭,沉默LncRNA H19可以抑制Hela细胞体外迁移、侵袭,该效应直接与EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达相关。
  结论:上调LncRNA H19可以显著促进宫颈癌细胞增殖和抑制宫颈癌细胞凋亡,下调LncRNA H19表达则反之;上调LncRNA H19促进宫颈癌细胞迁移、侵袭,下调LncRNA H19表达则反之,同时可以引起EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达发生改变。LncRNAH19在宫颈癌的发生、发展及预后中充当了重要角色,有可能作为一个发现及判断其预后的潜在生物标记物。
[博士论文] 马重
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:膀胱癌是世界范围内发病率和致死率都很高的一种恶性疾病,是我国泌尿系统中发病率第一的肿瘤。根据膀胱癌细胞侵袭下层组织的深度,可以分为非肌层浸润和肌层浸润性。这两种类型的膀胱癌生物学表型不同、预后不同,临床对应的治疗方法也不同。非肌层浸润性膀胱癌,约占所有膀胱肿瘤的75%,若能早期诊断和治疗,预后较好,但是容易复发。非肌层浸润性膀胱癌,治疗上以经尿道膀胱肿瘤切除术为标准,术后可辅助丝裂霉素等化疗药物或卡介苗膀胱灌注来预防复发和进展。肌层浸润性膀胱癌,对局部组织侵袭严重,转移风险高,预后不良。膀胱癌一旦确诊浸润肌层,在尚未转移时,应当采用更积极的根治性全膀胱癌切除+尿流改道术治疗;根据术中切缘情况,以及术后局部复发、远处转移情况,进行放疗或全身化疗。膀胱癌侵袭深度和临床预后的异质性,反映了膀胱癌细胞在基因、蛋白质水平的差异。研究不同类型膀胱癌的基因差异,探讨高恶性程度膀胱癌的进展机制,是实现膀胱癌早期诊断、精准治疗的前提。
  现有的膀胱癌诊断技术以尿脱落细胞检查和膀胱镜检查为主。尿脱落细胞检查是一项无创性诊断技术,特异性高,但总体敏感性低,诊断低级别膀胱癌的敏感性不到20%。膀胱镜检查是将膀胱内窥镜经过尿道插入被检者膀胱,通过医生肉眼观察,发现形态可疑的新生物后,用活检钳夹取组织样本,进行病理学检查。膀胱镜检查是一项有创性操作,镜检过程会造成尿道、膀胱粘膜的破损,引起出血;检查后尿路感染风险很高。不仅如此,膀胱镜检会造成被检者疼痛和心理不适,患者依从性不够高。鉴于现有膀胱癌诊断技术的不足,发现基于尿液的无创性诊断标志物,具有较高的临床应用价值。新一代测序技术的发展、生物信息学平台的完善,为寻找膀胱癌诊断和分子分型的标志物提供了丰富的资源。也为了解膀胱癌发生、进展机制,提供了强大的工具和线索。
  研究目的:
  为了解国人膀胱癌测序结果,寻找潜在的膀胱癌诊断标志物,探索膀胱癌进展中的分子机制,课题组收集了一系列不同恶性程度的膀胱癌组织样本和患者尿液样本,利用高通量测序技术、体外及活体的细胞分子实验技术,对膀胱癌诊断标志物和分子机制进行研究。
  研究方法:
  1.利用转录组测序技术和生物信息学分析,对膀胱癌组织样本和自身配对的正常尿路上皮样本进行测序和分析,发现差异化表达基因,筛选具有潜在膀胱癌诊断价值、可能调控膀胱癌进展的关键分子。
  2.扩大样本量,抽取组织RNA,通过定量PCR方法,对发现的差异化表达基因Endocan进行验证。
  3.检索生物信息学平台Oncomine,分析Endocan在其他膀胱癌研究中的结果。
  4.构建尿液中Endocan蛋白的检测体系。收集膀胱癌患者和对照人群的尿液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Endocan浓度,用尿肌酐浓度对检测结果进行标化、分析。
  5.制作含有不同恶性程度膀胱癌及正常尿路上皮的组织芯片。用免疫组织化学技术研究Endocan在组织芯片中的表达量。
  6.在膀胱癌细胞中用siRNA干扰Endocan表达,研究Endocan对增殖、迁移、侵袭等膀胱癌生物学表型的影响。
  7.利用慢病毒建立稳转的Endocan敲减膀胱癌细胞系,在裸鼠实验中,探索Endocan在膀胱癌发生、进展中的作用。
  8.通过流式细胞术,研究Endocan对膀胱癌细胞周期、凋亡的影响。
  9.用蛋白免疫印迹(Western-Blotting)研究Endocan与膀胱癌细胞自噬的关系,分析可能的分子机制。
  研究结果:
  1.在10对膀胱癌组织与自身配对的正常粘膜组织的转录组测序中,发现Endocan在膀胱癌组织中显著过表达。
  2.在扩大的组织样本中验证,Endocan在膀胱癌中的表达显著高于正常尿路上皮样本,并且Endocan表达量与膀胱癌恶性程度有关。
  3.在Oncomine数据库中,证实其他研究中Endocan在膀胱癌中也呈现过表达。
  4.在92例膀胱癌患者中检测经肌酐标化的Endocan含量为6.08±0.75,而37例对照人群的尿液中经肌酐标化的Endocan含量为0.75±0.18,差异显著。并且尿液中经肌酐标化的Endocan与膀胱癌恶性程度相关。
  5.在组织芯片研究中,Endocan在膀胱癌中总体表达高于正常尿路上皮,并且Endocan在肌层浸润性膀胱癌表达显著高于非肌层浸润膀胱癌。
  6.用siRNA干扰Endocan,可以显著降低T24、T921膀胱癌细胞系的增殖、迁移、侵袭等生物学表型。
  7.在裸鼠实验中,Endocan稳定敲减T24细胞系与对照细胞相比,成瘤率降低,瘤体增长速度受到抑制。
  8.用siRNA干扰Endocan,可抑制T24、T921膀胱癌细胞的早期凋亡,对膀胱癌细胞周期无显著影响。
  9.Endocan敲减可以上调膀胱癌细胞自噬。这一作用可能是通过mTOR介导的。
  研究结论:
  Endocan基因及编码蛋白膀胱癌组织中过表达,且表达水平与膀胱癌恶性程度相关。膀胱癌患者尿液中标化Endocan的浓度显著高于对照人群,Endocan具有潜在的膀胱癌无创性诊断标志物价值。Endocan参与膀胱癌发生、进展,干扰Endocan可以显著降低膀胱癌细胞的增殖、侵袭能力,并抑制细胞凋亡,这种作用可能是通过上调mTOR介导的细胞自噬引起的。
[博士论文] 黄海
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肿瘤内异质性是促进肿瘤进化、疾病进展,以及导致治疗失败和患者不良预后的重要原因。肿瘤干细胞样细胞,作为肿瘤细胞群体遗传构成的一个亚群,是肿瘤异质性的重要来源。在不同肿瘤中发现,肿瘤干细胞样细胞具备自我更新能力、化疗药耐药、扩增成为肿瘤细胞并具有转移潜能等特性,是肿瘤进展和耐药的重要因素。因此,揭示肿瘤干细胞样细胞内在的分子机制,有助于发现针对进展期肿瘤的新疗法,为临床实践提供理论基础。
  前列腺癌,是世界范围内威胁男性健康的最主要原因之一,且具有高度异质性。雄激素剥夺治疗作为目前广泛应用的一线疗法,尽管对于进展期或是复发性前列腺癌有短时间的缓解效果,但是,最终由于不可逆的耐药,而导致不良预后。
  越来越多的证据提示,雄激素剥夺治疗在诱导耐药的过程中,对前列腺癌细胞进行重编程,导致一部分前列腺癌细胞发展出肿瘤干细胞样细胞特性。并且,在复杂的肿瘤微环境中,多种成分发挥与前列腺癌细胞相互塑造、相互促进的作用,因此,揭示前列腺癌干细胞样细胞与肿瘤微环境细胞相互作用的分子机制,并联合阻断相关通路,将有助于提高雄激素剥夺治疗的有效性。
  内容及结果:
  (一)OV6作为肿瘤异质性和前列腺癌患者预后的指标
  为了了解OV6在前列腺癌组织中的表达情况和患者预后相关性,我们分别在正常前列腺组织、局限性前列腺癌组织、局部性进展前列腺癌组织、激素抵抗性前列腺癌、神经内分泌分化前列腺癌组织中,同时在同一前列腺癌组织内部、不同Gleason评分区域、晚期前列腺癌雄激素剥夺治疗前后组织、原位前列腺癌雄激素剥夺治疗的动物模型、前列腺癌细胞转移的动物模型中,利用免疫组化检测OV6的表达水平,结果发现,OV6与前列腺癌的恶性程度呈正相关,并且在同一肿瘤组织内部高Gleason评分区域相对高表达,并且在前列腺癌雄激素剥夺治疗后组织和转移组织中相对高表达,说明OV6可作为肿瘤异质性和前列腺癌患者预后的指标。
  (二)OV6阳性前列腺癌细胞通过启动自噬维持肿瘤干细胞样细胞特征
  为了了解OV6阳性前列腺癌细胞是否具有肿瘤干细胞样细胞特征以及发挥维持干细胞特性的分子机制。我们通过定量PCR检测OV6阳性前列腺癌细胞的干细胞基因表达;通过梯度稀释体外成球实验和体内成瘤实验检测OV6阳性前列腺癌细胞的自我更新能力;通过增殖和凋亡实验检测OV6阳性前列腺癌细胞对于化疗和雄激素剥夺治疗药物的药物抗性,从而评估OV6阳性前列腺癌细胞的干细胞特性。并通过RNA全转录组测序和一系列分子生物实验如Co-IP、Duolink、ChIP等,探索OV6阳性前列腺癌细胞维持干细胞特性的分子机制,发现,OV6阳性前列腺癌细胞可以通过启动自噬过表达ATG7,维持细胞质内β-catenin的稳定性,并促进后者入核启动OCT4的转录激活,从而维持干细胞特性。
  (三)OV6阳性前列腺癌干细胞样细胞通过和单核细胞相互塑造发挥促进雄激素剥夺治疗耐药的作用。
  我们在上部分研究中发现,单独抑制OV6阳性前列腺癌细胞内部相关通路并不能有效提高原位前列腺癌异种移植模型中雄激素剥夺药物恩杂鲁胺的治疗效果,提示肿瘤微环境细胞可能参与耐药过程。我们通过OV6阳性前列腺癌细胞与单核细胞共培养,抗体芯片和ELISA检测细胞上清中细胞因子的表达变化,发现IL6是OV6阳性前列腺癌细胞和单核细胞相互作用的关键分子。两者的相互作用,一方面,增强OV6阳性前列腺癌细胞的自我更新能力,另一方面,招募并促进单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞分化。联合抑制ATG7和IL6R可以有效提高前列腺癌细胞在原位前列腺癌异种移植瘤模型中对于恩杂鲁胺治疗的有效性。
  结论:
  在本项研究中,我们发现OV6阳性前列腺癌细胞具有干细胞特性,并且可以招募和促进肿瘤微环境中的单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞分化。联合靶向OV6阳性前列腺癌细胞与肿瘤相关巨噬细胞之间的网络信号传导可以有效改善原位前列腺癌模型中前列腺癌细胞对于雄激素剥夺治疗的抗性,这为改善前列腺癌雄激素剥夺药物的耐药性和提高疗效,最终改善患者预后提供临床前研究的理论基础。
[硕士论文] 陈海虎
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 探究分段读出平面回波和单次激发平面回波成像序列对膀胱癌成像图像质量的影响
  目的:探究分段读出平面回波成像(RS-EPI)和单次激发平面回波成像(SS-EPI)序列对膀胱癌磁共振扩散加权成像(DWI)图像质量的影响。
  方法:前瞻性收集膀胱镜活检证实为膀胱癌的35例患者,均行膀胱3.0T磁共振RS-EPI和SS-EPI序列扫描。2名放射科诊断医师分别在两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检测性、运动伪影和图像模糊程度四个方面进行评分。由1名放射科诊断医师测量并计算两种DWI图像的信噪比(SNR)、对比度噪声比(CNR)、信号强度比(SIR)和表观扩散系数(ADC)值。采用Kappa检验评价2名医师评分的一致性,分别采用配对样本t检验和配对Wilcoxon秩和检验比较两种序列定性评分和定量评价指标的差异。
  结果:2名医师在RS-EPI和SS-EPI两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检出性、运动伪影和模糊程度的评分一致性较好,Kappa值分别为0.878、0.860、0.748、0.842。RS-EPI和SS-EPI的图像比较,磁敏感伪影、病灶检测性和图像模糊程度的评分差异具有统计学意义(P均<0.05),运动伪影评分无统计学差异(P>0.05),RS-EPI的图像质量明显优于SS-EPI。SS-EPI与RS-EPI序列上膀胱病变的SNR分别为96.65±51.59和85.79±43.41,CNR分别为3.54±1.26和3.91±1.21,SIR分别为5.03±1.26和5.51±1.35,ADC值分别为1239.09±253.73×10-6mm2/s和1230.16±239.60×10-6mm2/s,两者SNR和ADC值的差异无统计学意义,P值分别为0.085和0.627。两者CNR和SIR的差异具有统计学意义,P值分别为0.024和0.015。
  结论:3.0T磁共振中RS-EPI序列较SS-EPI序列明显提高了膀胱癌的DWI图像质量,且SS-EPI和RS-EPI图像中病灶ADC值无显著差异,RS-EPI序列可替代SS-EPI序列在膀胱癌的术前分期及分级中的应用并提供更高质量的诊断图像。
  第二部分 磁共振高分辨率T2WI联合分段读出平面回波成像鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的临床价值
  目的:评估磁共振高分辨率T2加权成像(HR-T2WI)、分段读出平面回波成像(RS-EPI)及两者联合鉴别非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)的临床价值。
  方法:本研究采用前瞻性研究方法,连续纳入95例膀胱镜活检证实为膀胱癌、最终行手术治疗并有明确手术病理分期的患者,均行3.0 T磁共振HR-T2WI和RS-EPI序列成像。2名放射科诊断医师分别在HR-T2WI、RS-EPI及HR-T2WI+RS-EPI上独立分析膀胱癌是否浸润肌层,以病理结果为金标准,绘制受试工作特征(ROC)曲线,计算灵敏度、特异度、准确度和AUC,并采用DeLong检验比较三种方法诊断效能的差异。
  结果:三种诊断方法在鉴别NMIBC和MIBC的诊断中,HR-T2WI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为95.5%、83.4%、88.5%和0.889; RS-EPI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为84.1%、94.1%、89.5%和0.891;HR-T2WI+RS-EPI的灵敏度、特异度为、准确度和AUC分别为93.1%、100%、96.8%和0.966。HR-T2WI联合RS-EPI的诊断效能明显优于两者单独诊断的效能。
  结论:HR-T2WI+RS-EPI可作为术前无创、精确鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的检查方法。
[硕士论文] 杨启维
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:临床上许多进展期肾癌患者已经失去手术机会,接受手术的患者将近有三分之一会发生复发和转移。抗血管治疗药物是针对血管内皮生长因子(VEGFR)受体的较为有效的治疗方法,抗血管药物同时阻滞络氨酸激酶受体(RTK),目前肾癌治疗一线靶向药物中舒尼替尼最为常用。令人惋惜的是有将近五分之一的肾癌患者对抗血管治疗不敏感,剩下的患者最终再接受一到多个疗程之后也会发展为耐药。许多患者因为中断了舒尼替尼的治疗最终导致快速的复发和转移,所以开发新型的抗肿瘤药物迫在眉睫。
  随着纳米科技的快速发展,各种纳米药物的药效学得到深入研究,其中一些甚至进入临床试验和临床治疗。在这些纳米药物中,无机纳米药物得到广泛研究,其中一些也在临床试验中得到理想效果。四氧化三铁纳米粒已经被美国FDA食品与药品监督局批准并认可应用于贫血的治疗。最近,四氧化三铁纳米粒显示出抗巨噬细胞的效应,这样就有潜能应用于肿瘤的生物免疫治疗。而且,银纳米粒已经在妇产科感染性疾病的治疗中取得一定疗效。其它无机纳米药物,例如:纳米氧化锌和纳米金,仍然有成为抗肿瘤药物的很大潜藏价值。在我们的前期研究中,氧化亚铜纳米粒(Cuprous Oxide Nanoparticles,CONPs)展示出理想的抗肿瘤效果和很低的生物毒性。铜伴侣蛋白调节细胞内铜离子转运和剂量,在肿瘤的进展中也扮演了重要角色。纳米药物和铜伴侣蛋白相互作用的机制尚未得到深入研究。
  目的:
  明确CONPs如何左右肾癌细胞的生物学行为,并在肾癌在体动物模型的实验中进行验证。在药效学实验阳性的基础上,迸一步探讨CONPs对抗肾癌进展的分子学机制,并寻找该药物抑制肾癌生长并诱导其凋亡的靶点。
  方法:
  1、通过CCK8法评估CONPs作用于肾癌细胞后,其细胞活力和增殖效应的变化,并通过TRANSWELL实验检测CONPs对肾癌细胞迁移和侵袭的影响,采用AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒在流式仪上对CONPs是否诱导肾癌细胞凋亡进行验证。通过流式仪并利用Cell cycle staining Kit检测CONPs对肾癌细胞周期的效应。
  2、RNA提取和qRT-PCR检测CONPs作用后肾癌细胞转录水平RNA变化情况,WB实验在蛋白水平检测CONPs对肾癌细胞蛋白质翻译有何影响,shRNA干扰靶蛋白寻找并验证CONPs的靶点。
  3、透射电子显微镜观察CONPs作用于肾癌细胞器的亚细胞结构,细胞内铜离子含量通过电感耦合等离子体质谱法的铜总量吸收实验所测定,通过对肾癌细胞内ROS和钙离子浓度的检测来检验细胞内氧化活性反应和内质网应激通路的激活。
  4、裸鼠皮下成瘤在体实验验证CONPs在动物体内是否能发挥抗肾癌效应。取裸鼠皮下瘤体标本TUNEL和KI67实验,进一步在体内实验中验证CONPs对肾癌增殖和凋亡的影响。
  结果:
  1、CONPs对肾癌细胞生长产生抑制,并且阻滞肾癌细胞周期于S和G2期。同时,CONPs抑制了肾癌细胞的侵袭和转移。
  2、透射电子显微镜观察到CONPs使肾癌细胞内质网肿胀,并且用流式细胞技术也检测到CONPs使肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度显著提高,并且与用药浓度和用药时间正相关,ROS水平和钙离子浓度的上升都是内质网应激的使动因素。
  3、CONPs诱导细胞内铜离子积聚,并且靶向作用铜伴侣蛋白发挥抗肿瘤效应。CONPs诱导肾癌细胞内质网应激并促进其细胞凋亡,WB实验验证了内质网通路和凋亡通路上关键蛋白的激活。
  4、CONPs在体内动物模型实验中抑制裸鼠皮下肾癌瘤体的生长。并且靶向AXL和MET蛋白,恢复肾癌耐药细胞对舒尼替尼的敏感性,体内实验的瘤体也同时验证内质网和凋亡通路的激活,以及对耐药蛋白的抑制。
  结论:
  我们系统性了CONPs的药理学效应,以及无机纳米药物在抑制肾癌和耐药肾癌模型的进展,多项研究表明CONPs在体内和体外实验中抑制了肾癌的生长。并且我们研究了CONPs作用于铜伴侣蛋白ATOX1和CCS的药理学效应。我们发现CONPs可以显著影响ATOX1和CCS的功能,干扰细胞内铜转运,并且释放铜元素,导致细胞内铜元素累积,CONPs提高肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度,从而导致内质网应激的发生,并在抑制其增殖的同时促进凋亡。CONPs在抗肾癌细胞的同时显示了极低的肝肾毒性,并且通过下调AXL、MET、AKT、ERK来抑制舒尼替尼耐药。这些研究都可以说明CONPs值得开发为新型抗肿瘤纳米药物从而应用到对进展期肾癌和舒尼替尼耐药肾癌的临床治疗中,这样可以极大程度上促进中晚期肾癌患者的预后。
[硕士论文] 苏晓玲
妇产科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  卵巢癌是妇科致命的妇科恶性肿瘤,由于其发病隐匿,缺少特异可靠的筛查诊断指标,发现时往往已是晚期。转移是卵巢癌患者死亡的主要原因。应激与肿瘤的关系的研究越来越受到关注。应激包括患者因患肿瘤引发的心理应激被认为能促进肿瘤的进展。糖皮质激素(GC)是重要的应激激素,具有强大的免疫抑制、抗炎和维持内环境稳定的作用,并能在其受体(GR)的介导下调节细胞的新陈代谢、分化、增殖及存活。此外GC还是临床广泛使用的药物。除了治疗自身免疫性疾病和炎症外,还被作为实体肿瘤/癌症的化疗或放疗的辅助药物,用来减少放化疗的副反应,增加患者的耐受性。尽管GC与肿瘤的关系的研究一直受到关注,但结果一直不明确。研究证实GC可抑制一些实体肿瘤的增殖和进展,因此,有将GC单药或者联合细胞毒性药物(如5氟尿嘧啶)治疗乳腺癌和前列腺癌,并取得了一定的效果。反之近年来对多种肿瘤的研究表明,GC可以增强肿瘤细胞对放化疗的抵抗,减少放化疗诱导的细胞凋亡,促进肿瘤细胞存活,而这些作用加上GC的免疫抑制作用则有助于肿瘤的发生和发展。因此GC对肿瘤的作用还不清楚,其作用是否因肿瘤的不同类型而异需要进一步研究。
  缺氧是肿瘤常见微环境特征之一,低氧可诱导低氧诱导因子HIF-1的表达。HIF-1是重要的转录因子,由HIF-1α和HIF-1β组成,其中α亚基为氧调节亚基。HIF-1α表达增加被认为与临床上肿瘤患者预后不良相关。研究表明卵巢痛组织中HIF-1α的表达明显高于正常卵巢组织;并且HIF-1α在卵巢癌组织中的表达水平高与卵巢癌患者的预后差呈正相关。近年来研究认为HIF-1α的高表达促进多种肿瘤细胞的迁移和侵袭,因此HIF1-α已经成为几种类型肿瘤进展的关键预测因子。而HIF-1α对卵巢癌细胞侵袭和迁移的研究较少,现有的研究亦认为缺氧下HIF-1α促进卵巢癌细胞的侵袭转移。
  MUC1是一种跨膜黏蛋白,常过表达于一些上皮肿瘤,能够与膜上的多种蛋白相互作用,激活细胞内的PI-3K/AKT通路、Wnt通路等多条信号转导通路,从而调节细胞的侵袭转移等。近年来,MUC1被当作一种新的低氧诱导因子受到人们的关注,有报道MUC1与HIF-1α之间存在相互作用,但确切作用机制还不清楚。小G蛋白Rho激活的蛋白激酶ROCK2作为一个下游信号通路分子可通过调节细胞骨架进而调节细胞运动,与肿瘤细胞的转移密切相关。有国外学者在其研究中发现,Rho/ROCK途径可以调节HIF-1α信号转导。
  我校病生教研室前期的研究发现GC在体内和体外可以明显促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和转移,并且GC可以上调卵巢癌细胞中MUC1及ROCK2的表达。本课题在此基础上进一步探讨GC是否能影响卵巢癌细胞中HIF-1α信号通路进而促进卵巢癌细胞的迁移,并且探讨其可能的机制,主要观察了MUC1和ROCK2与GC增加HIF-1α蛋白进而促进卵巢癌细胞迁移中的作用的关系。
  研究方法:
  我们在细胞水平进行实验,以卵巢癌细胞系HO-8910、SKOV3为研究对象,实验过程中用含10%去激素血清的1640培养基培养细胞,去除血清中的激素对细胞的影响,用100nM DEX对细胞处理不同的时间。用Western Blot的方法检测HIF-1α蛋白的表达水平。siRNA干扰实验分别对HIF-1α、MUC1的表达进行干扰,继而使用Western Blot的方法验证MUC1、ROCK2及HIF-1α的表达。利用Transwell小室检测卵巢癌细胞的垂直迁移能力。
  研究结果:
  1.DEX可以明显上调卵巢癌细胞中HIF-1α蛋白的表达,干扰HIF-1α的表达明显阻断DEX促卵巢癌细胞迁移的作用。
  2.DEX能上调卵巢癌细胞中MUC1的表达,干扰MUC1的表达不仅可以明显阻断DEX促卵巢癌细胞迁移的作用,也能明显阻断DEX上调HIF-1α的作用;反之干扰HIF-1α却不影响DEX诱导MUC1表达的作用。
  3.干扰HIF-1α并不影响DEX上调ROCK2的表达。
  研究结论:
  DEX能明显增加卵巢癌细胞中HIF-1α蛋白的表达水平,该作用与Dex上调MUC1的表达密切相关。DEX上调MUC1进而增加HIF-1α在DEX促进卵巢癌细胞迁移中具有重要作用。
[博士论文] 韩萍
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究分为以下四部分:1.蟾皮抑制卵巢癌细胞增殖有效成分的筛选;2.酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响;3.酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长作用研究;4.酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及影响顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的机制研究。
  第一章 蟾皮抑制卵巢癌细胞增殖有效成分的的筛选
  方法:
  5种蟾皮活性成分酯蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵、华蟾酥毒基、蟾蜍噻咛配置浓度梯度0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20、100、500μM作用于卵巢癌SKOV3细胞72小时,用In cell2000 analyzer统计存活细胞数目,计算细胞存活率。筛选出抑制作用较强的2种成分,进一步作用于人胸水来源的卵巢癌原代细胞72小时,计算细胞存活率。
  结果:
  5种蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它灵有较好的抑制卵巢癌SKOV3细胞活性作用,在浓度高于20μM时,有明显的量-效关系;72小时测定并计算酯蟾毒配基IC50=48.62μM,蟾毒它灵IC50=86.86μM;其余脂溶性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基和水溶性成分蟾蜍噻咛抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖活性作用较弱。酯蟾毒配基和蟾毒它灵在浓度高于20μM时,对人胸水来源的卵巢癌原代细胞抑制率均高于50%,能明显抑制人胸水来源的卵巢癌原代细胞增殖。
  结论:
  蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它灵有较好的抑制卵巢癌SKOV3细胞和人胸水来源的卵巢癌原代细胞增殖,为5种蟾皮有效成分中抑制卵巢癌细胞增殖活性的优势成分。
  第二章 酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响
  方法:
  酯蟾毒配基配置浓度梯度20、100、500μM单独或与顺铂5μM联合作用于卵巢癌SKOV3细胞24、48、72小时,用MTS方法检测细胞增殖情况。流式细胞术和Hoechst荧光染色法检测细胞凋亡。
  结果:
  1、各浓度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3细胞后,卵巢癌SKOV3细胞增殖活性降低。酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用,随着酯蟾毒配基浓度增加、作用时间的延长而增强。
  2、当不同浓度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,相对于空白对照组,酯蟾毒配基组的早期凋亡细胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)及死亡细胞(UL)比例均明显增加,并且这种变化呈现出了剂量依赖性。
  3、酯蟾毒配基给药处理后,随着酯蟾毒配基浓度(20μM、100μM、500μM)的增加,凋亡小体增多。
  4、在不同浓度(20μM、100μM、500μM)酯蟾毒配基和5μM顺铂联合作用72小时后,卵巢癌SKOV3细胞增殖活性发生不同的变化趋势。20μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性低于酯蟾毒配基20μM组(P<0.001),高于顺铂组(P<0.05);100μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性低于酯蟾毒配基100μM组(P<0.001),低于顺铂组(P<0.01);500μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性与酯蟾毒配基500μM组比较,无显著性差异(P>0.05),低于顺铂组(P<0.001)。
  5、当不同浓度酯蟾毒配基联合顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,相对于顺铂组,酯蟾毒配基20μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)比例明显减少,晚期凋亡(UR)比例变化不明显。酯蟾毒配基100μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)变化不明显,晚期凋亡(UR)比例有所增加。酯蟾毒配基500μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)比例均明显增加。
  6、当不同浓度酯蟾毒配基联合顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,Hoechst荧光染色法检测到的凋亡变化情况同流式检测结果一致。
  结论:
  酯蟾毒配基能明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,具有明显的浓度、时间依赖性。并能促进卵巢癌SKOV3细胞的凋亡。
  酯蟾毒配基20μM联用顺铂,抑制卵巢癌细胞增殖活性的效果不及单用顺铂;酯蟾毒配基100μM联用顺铂,抑制卵巢癌细胞增殖活性效果优于单用顺铂和单用酯蟾毒配基。不同浓度的酯蟾毒配基和顺铂联用后,对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用可产生增强或减弱的影响。
  第三章 酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长作用研究
  方法:
  卵巢癌细胞SKOV3注射于裸鼠皮下进行移植瘤造模,造模成功后随机分为8组,分别给予低、中、高浓度酯蟾毒配基,低、中、高浓度酯蟾毒配基与顺铂合用进行干预,设置空白对照组和顺铂组,腹腔注射给药,酯蟾毒配基隔日1次,顺铂每周1次,比较各组裸鼠移植瘤体积、瘤重。
  结果:
  各组给药后裸鼠皮下移植瘤的生长均受到抑制。酯蟾毒配基低、中、高剂量组各组间抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率由低到高依次为酯蟾毒配基低剂量组(L)<酯蟾毒配基中剂量组(M)<酯蟾毒配基高剂量组(H),顺铂组(PT)、酯蟾毒配基低、中、高剂量和顺铂合用组四组间抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率由低到高依次为L+PT< PT< M+PT< H+PT。
  结论:
  酯蟾毒配基能抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长,低剂量酯蟾毒配基对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长有拮抗减效作用,中、高剂量酯蟾毒配基对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长有协同增效作用。
  第四章 机制研究
  方法:
  选择AffymetrixPrimeViewTMHuman Gene Expression Array表达谱芯片,用基因芯片筛查技术分析卵巢癌细胞SKOV3在接受酯蟾毒配基作用、酯蟾毒配基与顺铂联合作用处理后基因表达的变化,利用生物信息学分析差异基因,通过表达模式聚类分析、GO富集分析、KEGG富集分析,寻找有显著差异变化信号通路及关键分子,通过PCR、Western Blot方法检测关键基因的蛋白表达进行结果验证。
  结果:
  1、酯蟾毒配基可能通过调节PI3K/AKT/CREB通路,促进凋亡,抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,是酯蟾毒配基影响顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用的关键所在。
  2、PCR结果显示酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3细胞后,AKT1不表达;与空白对照组比较,酯蟾毒配基20μM组中CREB1水平无明显差异(P>0.05),酯蟾毒配基100μM组中CREB1水平明显增加(P<0.05)。与顺铂5μM组比较,酯蟾毒配基20μM+顺铂5μM组中CREB1水平无明显差异(P>0.05),酯蟾毒配基100μM+顺铂5μM组中CREB1水平明显增加(P<0.05)。
  3、Western Blot结果显示,酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3细胞后,与空白对照组比较,酯蟾毒配基20μM组、酯蟾毒配基100μM组中AKT水平均降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平均增高。与顺铂5μM组比较,酯蟾毒配基20μM+顺铂5μM组中AKT水平增高、Caspase3水平降低,磷酸化CREB水平降低;酯蟾毒配基100μM+顺铂5μM组中AKT水平降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平增高。
  结论:
  1、酯蟾毒配基通过PI3K/AKT/CREB通路,上调Caspase3水平,促进卵巢癌SKOV3细胞凋亡,可能是酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的机制。
  2、CREB可能是卵巢癌SKOV3细胞的抑癌转录因子。
  3、不同浓度的酯蟾毒配基和顺铂联用后,可能通过PI3K/AKT/CREB通路,调节Caspase3水平,通过凋亡途径对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞的作用产生协同或拮抗影响。
[硕士论文] 王晓宇
药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常见的恶性肿瘤,伴随着较高的致死率,BC的治疗引起人们的广泛关注。常规的治疗手段有手术、放疗和化疗,但是会引起各种不良反应,以及后续引发的多药耐药现象(multidrug resistance,MDR),对患者的身体健康和生活质量产生不良影响。中药治疗以其多靶点作用、辨证施治、整体调理等特点在BC的治疗过程中可以发挥重要的辅助作用,目前已经有一些中药单体或复方应用于BC临床治疗,但是仍旧主要依赖于广大医生的临床经验,发挥其抗乳腺癌药效的机制仍不清楚。因此,从中药中快速筛选出其中发挥药效的活性成分,并对其机制进行研究是十分重要的工作。
  细胞膜色谱(cell membrane chromatography,CMC)是从上世纪九十年代开始发展迅速的一种生物亲和色谱技术,以细胞膜和硅胶载体作为固定相,采用色谱分析的方法,可在体外模拟小分子化合物与细胞膜受体的相互作用过程。细胞膜色谱法将成分分离与活性筛选相结合,具有操作方便、快速稳定,灵敏度高等优点,尤其适用于中药等复杂成分体系的活性筛选。
  本课题的主要研究内容分为以下三个部分:
  1、P-gp高低表达的MCF7和MCF7/ADR全二维细胞膜色谱系统的构建
  以MCF7和MCF7/ADR两株细胞为研究对象,用流式细胞术和Western Blot方法验证MCF7细胞膜表面P-gp呈低表达水平,MCF7/ADR细胞株呈高表达水平,且无药培养两周后表达水平并没有发生显著变化。搭建了经APTES修饰的MCF7和MCF7/ADR-C18柱/TOF-MS全二维细胞膜色谱系统,同时构建硅胶色谱柱和经APTES修饰的硅胶色谱柱全二维分析系统作为参比,进行系统的有效性和专属性考察。系统有效性考察结果显示,吉非替尼在硅胶色谱柱和经APTES修饰的硅胶色谱柱上没有保留行为,但是在MCF7和MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有显著的保留行为;相应的,地塞米松在四种色谱柱上均没有表现出任何保留行为,证明该系统有效性良好。系统的专属性考察结果显示,Tariquidar在硅胶色谱柱、经APTES修饰的硅胶色谱柱和MCF7细胞膜色谱柱上没有显著的保留行为,但是MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有显著的保留行为,显示该系统有一定的专属性。可以用于筛选中药中抗乳腺癌潜在活性化合物。
  2、基于全二维乳腺癌细胞膜色谱法对中药抗乳腺癌活性成分的筛选
  首先选择了八种有抗乳腺癌作用的中药材作为对象,构建其化学成分库,制备了中药提取液,并用HPLC/TOF-MS系统对中药提取液进行了分离和分析,并且为后续的全二维分析提供第二维分离的优化条件。应用经APTES修饰-MCF7/CMC-C18/TOF-MS和经APTES修饰-MCF7/ADR/CMC-C18/TOF-MS全二维分析系统实现对八种中药中抗乳腺癌潜在活性成分的筛选,结果显示,大黄和黄芩保留成分较多,保留行为较好,因此继续以大黄和黄芩为研究对象,完成了保留成分全二维等高线图谱的绘制和TOF-MS初步鉴定结果表,并用标准品进行了验证。结果显示,大黄提取液在MCF7细胞膜色谱柱上共有14种保留成分,在MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有15种保留成分,其中在两株细胞都有保留的成分有10种,并对其中食用大黄苷、大黄酚、丹叶大黄素、大黄素甲醚、云杉鞣酚和大黄素六种成分进行了验证。黄芩提取液在MCF7细胞膜色谱柱上共有15种保留成分,在MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有14种保留成分,其中在两种细胞膜色谱柱都有保留的成分有10种,并对其中的汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A、黄芩素和汉黄芩苷五种成分进行了验证。为下一步潜在活性成分的药效验证研究和活性成分与P-gp之间关系研究奠定了良好的基础。
  3、潜在活性成分抗乳腺癌活性及其与P-gp的关系研究
  根据全二维MCF7和MCF7/ADR细胞膜色谱系统对中药大黄和黄芩的筛选结果,选择其中可获得11个化合物为对象。首先对其潜在抗乳腺癌的作用进行体外增殖抑制的药效验证,结果显示,大黄中丹叶大黄素、云杉鞣酚和大黄素,黄芩中汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A和黄芩素对MCF7和MCF7/ADR两株细胞均有一定杀伤作用,且对两株的敏感性不同。进而采用流式细胞术考察它们是否通过细胞凋亡这个途径发挥其杀伤作用。结果显示,丹叶大黄素、云杉鞣酚、汉黄芩素和黄芩素是通过凋亡途径对MCF7细胞产生杀伤作用,而其他化合物则不是。丹叶大黄素、汉黄芩素和千层纸素A是通过凋亡途径对MCF7/ADR细胞产生杀伤作用,而其他化合物则不是。之后,为了研究同一个化合物对两株细胞杀伤作用的差异是否与P-gp作用相关,考察了大黄中丹叶大黄素、云杉鞣酚和大黄素,黄芩中汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A和黄芩素对P-gp酶活的作用,结果显示黄芩苷是P-gp酶活性的抑制剂,而其他6种成分是P-gp酶活性的激动剂。进一步研究黄芩苷和P-gp之间关系,采用流式细胞术和Western blot检测不同浓度的黄芩苷对MCF7/ADR细胞中P-gp表达量的影响,结果显示黄芩苷并没有显著影响P-gp表达。黄芩苷和DOX之间的协同作用,结果显示黄芩苷可以逆转MCF7/ADR细胞对阿霉素的耐药性。
[博士论文] 杨琦
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 前列腺癌相关细胞系及组织中环状RNA的表达谱
  目的:(1)通过高通量转录组测序的方法获取前列腺癌相关细胞系及组织中环状RNA(circRNAs)的表达谱。(2)筛选出前列腺癌相关细胞系及组织中差异表达的circRNAs。(3)对差异表达的circRNAs进行功能预测及分析。
  方法:选择3种前列腺癌相关细胞系(正常前列腺上皮细胞系RWPE-1、前列腺癌原发灶细胞系22RV1、前列腺癌骨转移细胞系PC-3)及65对前列腺癌与癌旁组织,进行高通量转录组测序,并结合生物信息学方法综合分析。
  结果:(1)3种前列腺癌相关细胞系中共识别出9,545个circRNAs,其中845个circRNAs在3种细胞系中均有表达,同时还发现了大量差异表达的circRNAs。GO功能分析和KEGG通路分析提示这些差异表达circRNAs的宿主基因具有重要的生物学功能并在许多重要的分子信号通路中发挥关键作用。(2)采用DCC、find circ和circRNA_finder这三种算法在65对前列腺癌与癌旁组织中共识别出277,122个circRNAs,其中三种算法共同识别出的circRNAs有82,797个。非监督聚类和PCA分析提示前列腺癌与癌旁组织中circRNAs的表达谱存在明显差异,其中有9个circRNAs在前列腺癌组织中表达显著上调,86个circRNAs在前列腺癌组织中表达显著下调。对这95个差异表达的circRNAs进行功能预测提示其与相应的miRNAs具有多个结合位点。
  结论:(1)circRNAs在前列腺癌相关细胞系及组织中均广泛存在,而且不同细胞系及组织之间具有显著表达差异;(2)生物信息学分析显示,前列腺癌中差异表达的circRNAs可能通过竞争性吸附miRNAs发挥相应生物学功能,或与其宿主基因一起参与前列腺癌的疾病进展,并可能具有潜在的诊断应用价值。
  第二部分 前列腺癌中差异表达环状RNA的验证及作用研究
  目的:(1)对前列腺癌相关细胞系及组织中circRNAs的测序结果进行验证。(2)结合细胞系测序及验证结果分析环状RNA-circFUT8在前列腺癌相关细胞系中的表达差异及意义;(3)结合组织测序及验证结果探讨环状RNA-circAMACR在前列腺癌诊断及进展过程中的作用及意义。
  方法:(1)选择测序结果中部分差异表达的circRNAs,采用qRT-PCR的方法分别在正常前列腺上皮细胞系与前列腺癌细胞系、前列腺癌与癌旁组织中对其进行表达量验证。(2)结合细胞系测序结果选择circFUT8(在正常前列腺上皮细胞系RWPE-1中低丰度表达,在前列腺癌原发灶细胞系22RV1和前列腺癌骨转移细胞系PC-3中表达逐渐升高)为研究对象,对其在前列腺癌细胞系与正常前列腺上皮细胞系中的表达差异进行qRT-PCR验证,并结合其宿主基因功能,分析circFUT8在前列腺癌细胞转移及雄激素非依赖转化过程中的作用及意义。(3)结合组织测序结果选择circAMACR(在前列腺癌组织中表达上调最为显著,fold change=6.19,P=1×10-13)为研究对象,对其在前列腺癌组织与癌旁组织、前列腺癌细胞系与正常前列腺上皮细胞系中的表达差异进行qRT-PCR验证,并通过siRNA干扰前列腺癌细胞中circAMACR的表达,观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响,探讨其在前列腺癌诊断及进展过程中的作用及意义。
  结果:(1)前列腺癌相关细胞系及组织中差异表达circRNAs的qRT-PCR验证结果与测序结果基本一致。(2)circFUT8在前列腺癌细胞系中的表达显著高于正常前列腺上皮细胞系,在前列腺癌转移细胞系(PC-3、DU145)中的表达显著高于前列腺癌原发灶细胞系(22RV1),在雄激素非依赖性前列腺癌细胞系(PC-3、DU145)中的表达也显著高于雄激素依赖性前列腺癌细胞系(LNCap)。(3)circAMACR在前列腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织,在前列腺癌细胞系中的表达也显著高于正常前列腺上皮细胞系。circAMACR主要表达于细胞质中,干扰前列腺癌细胞中circAMACR的表达后,细胞的增殖和迁移能力减弱。
  结论:(1)通过高通量转录组测序获取的前列腺癌相关细胞系及组织中的circRNAs表达谱是可靠的。(2)circFUT8在前列腺癌相关细胞系中具有独特的差异表达模式,可能参与了前列腺癌细胞转移及雄激素非依赖转化的生物学过程。(3)circAMACR在前列腺癌中具有肿瘤特异性并且在其进展过程中具有一定的肿瘤生物学作用。
  第三部分 环状RNA应用于前列腺癌血浆检测的初步研究
  目的:(1)提高前列腺癌患者血浆中circRNAs检测的稳定性;(2)筛选前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中qRT-PCR检测的最适内参基因数目及最适内参基因组合。(3)初步探讨circRNAs应用于前列腺癌血浆检测的临床意义。
  方法:(1)改进血浆样本总RNA提取方法,优化前列腺癌患者血浆中circRNAs检测的qRT-PCR反应条件。(2)利用前列腺癌和良性前列腺增生各10例患者的血浆样本,对β-Actin、GAPDH、18s rRNA、β2M、GUSB、HPRT1、PPIA、SDHA等8个候选内参基因进行qRT-PCR检测,并使用NormFinder和geNorm软件分析实验数据。(3)利用45例前列腺癌和30例良性前列腺增生患者的血浆样本,对组织测序结果中差异表达显著的29个circRNAs(表达上调9个,表达下调20个)进行qRT-PCR检测,并结合组织测序及验证结果进行分析。
  结果:(1)本研究实验体系下前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中qRT-PCR检测的最适内参基因数目为2个,最适内参基因组合为GAPDH和PPIA。(2)血浆qRT-PCR检测时,有9个circRNAs无扩增曲线,14个circRNAs的扩增产物电泳时无目的条带,3个circRNAs的扩增产物电泳时杂带明显,只有3个circRNAs(circAPLF、circLPAR1和circSLC45A4)在前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中稳定表达。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血浆中的总体表达水平显著低于良性前列腺增生患者,而circLPAR1在前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中的总体表达水平无显著差异。
  结论:(1)在前列腺癌患者血浆中进行circRNAs检测是可行的,但应根据具体实验体系做出适当优化。(2)GAPDH和PPIA的内参基因组合可作为均一化标准用于前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆样本的qRT-PCR检测。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血浆中稳定存在,且总体表达水平显著低于良性前列腺增生患者,提示其对于前列腺癌具有一定的诊断应用价值。
[硕士论文] 林健
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  乳腺癌(breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤,约占女性所有肿瘤的30%,具有侵袭性,难治愈性,且易复发转移,近年来,乳腺癌死亡率已成下降趋势。然而,中国乳腺癌的发病率增长非常快,复发转移率依旧比较高。
  肿瘤转移是导致乳腺癌死亡的最主要原因。及时了解乳腺癌患者肿瘤负荷,准确掌握抗肿瘤转移情况,以及应用确切有效的治疗手段,是降低乳腺癌患者死亡率的关键。近年来一些研究发现,肿瘤细胞存在很大的异质性。一些肿瘤细胞具有较强的自我更新能力和侵袭性,其生物学特征与干细胞的基本特性十分相似,因此,有学者提出肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell,CSC)的理论,而寻找最具转移性和侵袭性的乳腺癌肿瘤干细胞是乳腺癌治疗和预后的关键。目前,尚无公认的肿瘤干细胞的标志物。CD133、三磷酸腺苷结合转运体(AB CG2)和乙醛脱氢酶(ALDH1)在多种来源的干细胞膜均有表达,不能区分正常与肿瘤干细胞。表达CD44+CD24-的乳腺癌细胞因具有肿瘤产生能力而被认为是肿瘤于细胞。
  最新研究报道多巴胺受体(Dopamine Receptor,DR)可能是一个肿瘤干细胞的生物标志物,研究者发现正常人多能干细胞不表达多巴胺受体,而肿瘤干细胞表达所有五种多巴胺受体,在三阴性乳腺癌中发现CD44+CD24的肿瘤干细胞同样表达多巴胺受体。另外,研究者筛选到多巴胺受体拮抗剂硫利达嗪,能通过表达在肿瘤干细胞上的D2受体家族,特异性地作用于肿瘤干细胞,抑制肿瘤干细胞的增殖生长,而不影响人普通干细胞。这不仅提示肿瘤干细胞特异性地表达多巴胺受体,并且能通过多巴胺受体信号途径靶向抗肿瘤干细胞治疗,也说明了多巴胺受体既是一个肿瘤干细胞的生物标志物,也是一个潜在靶向抗肿瘤干细胞的药物靶点,具有十分重要的研究价值。
  多巴胺是一种重要的神经递质,根据生化和药理学特点分为两类:D1样(D1-like)和D2样(D2-1ike)受体。D1样受体包括DRD1和DRD5受体;D2样受体包括DRD2,DRD3和DRD4受体。已有众多研究利用多巴胺受体激动剂或拮抗剂进行乳腺癌的体外或体内试验,实验结果表明,多巴胺受体与乳腺癌的发生、发展、预后和疗效等密切相关,通过多巴胺受体信号途径,具有显著的抗乳腺癌的效果。但目前,多巴胺受体在乳腺癌中作用机制还不是十分清楚,尤其是多巴胺受体五个亚型在乳腺癌中的具体表达情况尚不清晰,这是开展多巴胺受体信号途径与乳腺癌机制研究的基础。
  因此,本研究拟针对多巴胺受体五个亚型在乳腺癌中的表达情况展开检测,具体分析各亚型在乳腺癌及其癌旁组织中的表达情况和分布特征,并结合TCGA数据库中有关乳腺癌组织多巴胺受体表达情况来验证,结合病人临床病理特征,进一步分析DR的表达情况与乳腺癌的关系,研究结果将为今后乳腺癌肿瘤干细胞的研究积累数据,为乳腺癌循环肿瘤干细胞研究提供参考,也为今后多巴胺受体靶向药的开发利用奠定基础。
  方法:
  一、TCGA数据库生物信息分析
  从癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas,TCGA)TCGA数据库下载乳腺癌样本,筛选多巴胺受体表达信息的样本,筛选得到样本癌和癌旁组织的DR表达的数据,分析乳腺癌样本中DR的五种亚型基因的表达情况,并结合病人临床病理资料进行分析。
  二、实时荧光定量PCR(real time PCR,RT-PCR)
  收集长海医院确诊乳腺癌患者的癌和癌旁组织样本,抽提RNA,反转录为cDNA,用RT-PCR技术检测乳腺癌组织癌与癌旁DR五种亚型的表达情况。以GAPDH基因为内参基因,检测癌和癌旁组织在RT-PCR反应中的Ct值,根据2-△△Ct来估算DR亚型基因在该患者癌组织中的相对表达量。另取最大△Ct为对照,计算所有样本的相对表达量,以此分析各亚型的表达情况,并结合病人临床病理资料进行分析。
  三、蛋白质免疫印迹法(Westen Blot,WB)
  收集长海医院确诊乳腺癌患者的癌和癌旁组织样本,用Western Blot方法检测DR五种亚型在乳腺癌患者癌和癌旁组织中的蛋白表达情况。将肿瘤组织剪碎,加入RIPA裂解液(含PMSF,蛋白酶等)提取总蛋白,以BCA法测定总蛋白浓度。各取适量抽提好的蛋白样品进行变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,转膜后分别进行DR的五种亚型抗体和GAPDH内参抗体孵育。显色拍照,分析DR的五种亚型在乳腺癌组织和癌旁组织中的蛋白表达水平。
  四、免疫组织化学(immunohistoehemistry,IHC)
  收集长海医院确诊乳腺癌患者的癌和癌旁组织样本,肿瘤组织一部分用福尔马林固定后,进行石蜡包埋,然后进行组织切片。选择肿瘤组织面积较大、形态保存较为完好的石蜡切片,进行免疫组化染色。经过一系列脱蜡和水化之后,用PBS缓冲液配制的多巴胺受体抗体室温避光孵育2h,然后用免疫组化试剂盒进行显色反应。每个样本进行10片以上石蜡组织的IHC染色,人工阅片,结合使用Image-pro plus图片分析软件分析。使用Image-pro plus软件进行平均光密度分析,软件自动根据免疫组化图片黄染程度的不同,得出不同的光密度值,半定量地计算阳性染色,根据选取的测量区域面积(atea of interest,AOI)、累积光密度值(integrated optical density,IOD),最后得出IOD/AOI的比值为检测结果,最后综合分析该组织样本对多巴胺受体的表达水平。
  结果:
  一、TCGA数据库乳腺癌样本DR表达情况
  从TCGA数据库下载了112例乳腺癌患者癌和癌旁组织的DR表达的数据,分析乳腺癌样本中DR的五种亚型基因的表达情况。其中DRD4基因在癌组织中的表达显著高于癌旁组织(p<0.05),DRD1和DRD2基因在癌组织中的表达显著低于癌旁组织(p<0.05),DRD3和DRD5基因在癌和癌旁组织中的表达无显著差异(p=0.9565,p=0.5441)。结合病人临床病理特征研究发现,DRD1基因在乳腺癌中表达与年龄相关,按年龄50岁分层,大于50岁的患者更多表现为DRD1基因在癌中表达下调(x2=13.852,p<0.05)。腋窝淋巴结转移情况,可能与DRD4的表达存在相关性(Likelihood Ratio=5.8,p=0.055)。
  二、乳腺癌组织癌与癌旁多巴胺受体基因表达检测情况
  收集了20例乳腺癌患者的癌和癌旁手术样本,通过RT-PCR实验检测分析DR亚型基因在该患者癌组织中的相对表达量。
  检测结果表明,20例患者的乳腺癌样本中,DRD1基因在9例样本中表达上调,11例样本表达下调;DRD2-DRD4基因都发现在6例样本中表达上调,14例样本表达下调;DRD5基因在4例样本的表达上调,16例样本的DRD5基因表达下调。通过所有DR亚型在癌和癌旁中表达情况分析比较可见,DRD5基因在癌旁组织(18.29±3.34)和癌组织(15.44±3.16)、DRD4基因在癌旁组织(14.15±6.11)和癌组织(11.17±5.04)的相对表达量较高,两者癌与癌旁组织基因表达差异有差异,DRD4基因、DRD5基因在癌组织中表达下调(11.17±5.04VS14.15±6.11;15.44±3.16VS18.29±3.34)(p<0.05)。
  三、乳腺癌组织癌与癌旁多巴胺受体蛋白检测结果
  选取5例乳腺癌患者,使用Western Blot的方法检测了DR的五种亚型在乳腺癌患者癌和癌旁组织中的蛋白表达情况。分析DR的五种亚型在乳腺癌组织和癌旁组织中的蛋白表达水平。
  结论:
  通过本研究检测分析,总结所得到的DR在乳腺癌中的表达情况结果如下:TCGA数据库生信分析和免疫组化实验结果均提示DRD1、DRD2在乳腺癌组织中低表达,在癌旁组织高表达。而实时荧光定量PCR、蛋白质印迹实验检测则提示两者癌与癌旁表达无差异。在免疫组化实验中提示DRD3蛋白在乳腺癌组织低表达,在癌旁组织高表达,其余分析及实验检测提示DRD3在癌与癌旁组织表达无差异。除免疫组化实验提示无差异外,TCGA数据库生信分析、蛋白质印迹实验检测均提示DRD4蛋白在乳腺癌组织中高表达、在癌旁组织低表达,而RT-PCR检测则得出了相反的结论。RT-PCR检测和免疫组化实验均提示DRD5蛋白在癌旁组织高表达,在乳腺癌组织低表达,且提示DRD5在癌旁组织的表达高于所有亚型在癌和癌旁的表达,但是蛋白印迹实验结果得出了相反的结论,TCGA数据库生信分析未得出差异结论。同时,分析乳腺癌患者临床病理特征与多巴胺受体亚型表达的关系表明:DRD1基因在乳腺癌中表达与年龄相关,腋窝淋巴结转移情况可能与DRD4的表达存在相关性,而分子分型与DR各亚型的表达关系比较密切。
  综上所述,通过生信分析及实验结果,得出DR在乳腺癌中的表达情况为:DRD1蛋白、DRD2蛋白在乳腺癌旁组织高表达,在乳腺癌组织低表达;DRD3蛋白在乳腺癌和癌旁组织中表达无差异;DRD4蛋白在乳腺癌组织中高表达,在癌旁组织低表达;而DRD5在乳腺癌组织中表达下调,在癌旁组织中高表达,且其表达水平高于所有亚型。DR表达与乳腺癌患者的临床特征密切相关。
[硕士论文] 刘溪
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过研究PDLIM5在前列腺癌组织及细胞系中的表达水平,验证PDLIM5在前列腺癌中的异常高表达。筛选高表达PDLIM5细胞株进一步进行生物功能学实验,以探索PDLIM5介导肿瘤发生及转移的生物学功能及调控机制。
  方法:
  (一)PDLIM5在前列腺癌相关芯片数据库中表达分析及组织标本验证
  收集Oncomine、PROGGENE数据库中的前列腺癌样本中PDLIM5表达、转移及预后相关信息,验证PDLIM5在癌和正常腺体中的表达差异,明确高表达PDLIM5与PCa转移预后的相关性。进一步收集长征医院泌尿外科前列腺癌根治术后临床组织样本44例,运用免疫组织化学染色法检测癌和癌旁组织标本明确PDLIM5组织表达水平。
  (二)前列腺癌PDLIM5敲减细胞株筛选及构建与沉默效率验证
  在PCa常见细胞系中通过Western Blot和qPCR分析PDLIM5的表达情况,选取高表达PDLIM5的转移性PCa细胞株DU145和PC-3作为后续实验对象,构建包含靶向干扰PDLIM5的质粒的慢病毒进行细胞感染。观察质粒上的报告基因荧光强度,并分别在mRNA及蛋白水平验证PDLIM5的敲减效率,确认沉默PDLIM5的细胞株构建成功。
  (三)检测PDLIM5沉默后前列腺癌细胞株增殖、细胞周期凋亡水平变化及对侵袭转移能力影响
  在稳定沉默PDLIM5的DU145和PC-3细胞中,通过MTT比色法、克隆形成试验来评估肿瘤细胞增殖能力的变化;通过细胞流式术检测细胞周期及凋亡水平变化以明确PDLIM5敲减后对肿瘤细胞的周期阻滞及诱导凋亡作用;通过划痕愈合实验及TRANSWELL实验来检测PDLIM5对肿瘤迁移侵袭的影响。
  (四)PDLIM5对前列腺癌增殖转移调控机制的初步探究
  根据细胞表型相关实验结果及数据库信息分析,PDLIM5对肿瘤细胞的转移侵袭能力具有显著影响。首先在PDLIM5沉默状态下通过Western Blot和qPCR对上皮细胞-间充质转化(EMT)相关分子进行了检测,随后通过构建过表达质粒,在同种细胞株中过表达PDLIM5,检测EMT相关分子表达回复情况,并分别在PDLIM5敲减及过表达两种情况下对前列腺骨转移相关分析因子进行检测。最后通过免疫共沉淀,确定PDLIM5与AMPK的相互作用并对敲减PDLIM5后AMPK磷酸化水平进行检测,探索PDLIM5-AMPK-EMT的调控机制。
  (五)动物实验研究PDLIM5在体内功能作用
  使用沉默PDLIM5的DU145细胞进行裸鼠皮下成瘤实验,观察体内环境下PDLIM5敲减后对细胞成瘤及增殖能力的影响。随后将取瘤体组织进行裂解,通过Western Blot对PDLIM5蛋白表达水平进行检测,明确PDLIM5的沉默效率并检测AMPK、EMT相关信号通路分子表达变化,明确在动物实验中PDLIM5对细胞增殖转移的调控机制。
  结果:
  1.发现PDLIM5在PCa组织中异常高表达,并且与PCa生化复发与生存期相关。通过免疫组化及生物信息学分析方法,确认PDLIM5在PCa中较正常前列腺组织表达水平升高,且深入分析数据库芯片资料发现异常高表达的PDLIM5与预后不良因素如:转移、高Gleason评分及TMN分期相关。同时,通过多因素分析及生存分析发现高表达PDLIM5是PCa生化复发的独立危险因素并导致患者总生存率下降。
  2.成功建立稳定沉默PDLIM5的DU145及PC-3细胞株,通过相关细胞学实验发现沉默PDLIM5可导致前列癌细胞恶性增殖、克隆形成、侵袭转移能力受抑制,并可诱导G2/M阻滞和细胞凋亡的发生。
  3.检测PDLIM5敲减后上皮-间质转化(EMT)相关分子表达水平,通过Western Blot及qPCR发现人紧密连接蛋白1(ZO1)、波形蛋白(Vimentin)、SNAIL等出现不同程度下调,而EMT关键分子E-cadherin表达量上升,证实EMT过程受到抑制。
  4.在DU145及PC-3细胞中过表达PDLIM5可以在一定程度上通过上调SNAIL的表达,从而使及关键分子E-cadherin表达量下降,证实PDLIM5对细胞侵袭和转移的影响与EMT密切相关。同时在细胞实验中检测已知促进前列腺癌骨转移的相关分子,如结缔组织生长因子(CTGF),甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)。qPCR结果显示,沉默PDLIM5后,PC-3细胞中这些促肿瘤转移因子的表达显着下调。当PDLIM5过表达时,这些分子的表达水平出现上调,且在DU145细胞中也观察到类似的结果,进一步证实PDLIM5在促进肿瘤转移中起作用
  5.免疫共沉淀确定PDLIM5可与AMPK相结合,敲减PDLIM5后AMPK蛋白及磷酸化AMPK蛋白水平下降。随后通过放线菌素阻断上游蛋白质合成,在给药后不同时间点检测AMPK蛋白水平,结果发现PDLIM5沉默组AMPK蛋白降解加快。即PDLIM5可通过维持AMPK的稳定性,使AMPK通路持续性激活,从而促进前列腺癌的恶性增殖及转移。
  6.裸鼠成瘤实验证明在体内条件下,沉默PDLIM5可抑制肿瘤细胞生长。通过组织蛋白水平检测,在动物实验中PDLIM5同样可通过AMPK-EMT相关通路对前列腺癌细胞增殖及转移进行调控。
  结论:
  本研究证实了PDLIM5表达水平在PCa组织中发生上调,表明PDLIM5可能是PCa形成中的致癌基因。通过生物信息学分析探索PDLIM5与PCa复发和转移的关系,表明高表达PDLIM5是前列腺癌预后不良的相关因素。此外,细胞和动物实验都表明,PDLIM5通过激活AMPK通路可以促进癌细胞的增殖并增强EMT介导的侵袭和转移。探索PDLIM5相关相关通路及作用靶点可能有助于丰富PCa的进展和转移机制,并为mCRPC患者带来新的治疗策略。
[博士论文] 陈津
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,其发病率一直高居女性各器官恶性肿瘤发病率之首,每年因乳腺癌死亡人数多达50多万。ErbB2过表达型乳腺癌是恶性程度较高、预后较差的乳腺癌分子亚型,约占乳腺癌患者的25~30%。紫杉醇作为乳腺癌化疗方案中重要的候选药物,被广泛地用于转移性乳腺癌的化疗实践中,也是ErbB2阳性乳腺癌新辅助治疗中采用最多的紫杉烷类。随着紫杉醇药物的广泛使用,原发和继发性紫杉醇耐药性的产生这一问题也日益凸显,鉴于目前对其相关耐药分子机制的了解甚少,这极大的限制了紫杉醇在乳腺癌综合治疗中的临床疗效。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性可以是内在的或是后天获得的。内在的耐药意味着一开始化疗就无效;获得性耐药是在肿瘤治疗过程发展的,可能是由于突变也可能是由于其他适应性反应如激活代偿信号通路引起的。ErbB2介导的耐药性增加是导致肿瘤恶性程度增强和病人存活率降低的重要原因,然而迄今尚未发现ErbB2自身可识别的配体,它必须与其它可识别相应配体的受体相互作用方可有效发挥其生物学功能。ErbB3与ErbB2同属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶(RTK)家族,是ErbB2最为重要的相互作用受体伙伴,经常共表达于ErbB2阳性乳腺癌细胞。我们先前的研究发现ErbB3活性升高可导致紫杉醇耐药,靶向抑制ErbB3可增强紫杉醇对ErbB2-过表达乳腺癌的抗肿瘤活性。ErbB2/ErbB3对下游信号转导通路的激活有赖于ErbB3与其配体NRG-1的有效结合,但研究发现ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌细胞NRG-1的表达水平极低。
  近年来,肿瘤微环境在肿瘤生物学中的作用日益得到认可。间充质干细胞(也称间充质基质细胞,MSC)能够特异性的募集到包括乳腺癌在内的许多原发和转移的肿瘤部位,是构成肿瘤微环境的重要组成部分。MSC可通过旁分泌细胞因子、外泌体等方式影响肿瘤细胞生长、迁移和治疗耐药。然而,MSC与肿瘤细胞之间的相互作用关系复杂,既可能支持肿瘤生长,也可能抑制肿瘤生长,在不同分子亚型乳腺癌中甚至出现截然相反的结果;因此,进一步深入揭示MSC与特定分子亚型乳腺癌之间确切的相互作用关系及作用机制,阐明作为肿瘤微环境中一个大群体的MSC与肿瘤细胞的关系,有助于进一步了解实体肿瘤的耐药机制。
  研究目的:
  探讨MSC对ErbB2/ErbB3共表达的乳腺癌细胞增殖以及对紫杉醇敏感性等肿瘤生物学行为的影响,并进一步探讨其可能的分子机理,冀望能拓展我们对肿瘤化疗耐药分子机制的认知水平,从而为临床ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌病人克服紫杉醇耐药和新的靶向治疗策略提供初步的实验依据。
  研究方法:
  1.首先分离脐带来源的MSC作为细胞的种子来源,通过超滤法、超离法富集脐带MSC培养上清的外泌体,通过透射电镜鉴定外泌体的大小,WB和流式鉴定外泌体特异性标志物的表达。
  2.通过MTS和ELISA凋亡定量检测,分析MSC或其外泌体(0,1,2,5,10,20μg/ml)、重组NRG1对乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖的影响,以及对不同浓度紫杉醇(0,2,4,8,16,32nM)诱导乳腺癌细胞凋亡的影响。并通过平板克隆形成试验、流式凋亡分析等方法进行验证;qPCR和WB检测与增殖相关的细胞周期调控基因p21、p27、Cyclin D1、Cyclin E1的表达情况。
  3.通过PCR分析MSC和乳腺癌细胞的NRG-1基因mRNA的表达情况;WB分析MSC及其外泌体的NRG-1蛋白表达以及MSC外泌体、NRG-1作用后乳腺癌细胞ErbB3、Akt、MAPK等信号通路活化和Survivin、PARP等蛋白的表达情况,探讨MSC或其外泌体对乳腺癌MDA-MB-453细胞紫杉醇耐药性影响的分子机制。
  4.构建慢病毒载体pLKO.1_NRG-1_shRNA,用NRG-1shRNA、ErbB3shRNA分别特异性敲低MSC的NRG-1表达和乳腺癌细胞ErbB3受体的表达后,通过平板克隆形成试验、凋亡分析以及WB检测Survivin、PARP蛋白等验证NRG1-ErbB3介导的信号通路在MSC诱导乳腺癌MDA-MB-453细胞紫杉醇耐药中的作用。再通过小分子抑制剂LY294002,Akt抑制剂Ⅷ和YM155分别抑制乳腺癌细胞PI3K、AKT、Survivin,分析MSC外泌体对紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡的影响。
  研究结果:
  1.从脐带wharton胶中分离出MSC,经鉴定符合MSC的标准。采用超滤法可以富集脐带MSC培养上清中的外泌体,经鉴定为30-100nm大小,表达CD9,CD63,CD81等外泌体标志,同时还表达脐带MSC的表面标志CD73,CD90,CD105,说明获得的外泌体来源于脐带MSC。
  2.MTS试验结果显示,以乳腺癌细胞MDA-MB-453单独培养组为对照(100%),MSC共培养组、加外泌体组乳腺癌细胞的增殖率分别为(116±2.53%,114.5±0.48%,n=3),与对照组相比没有统计学差异(p=0.061,p=0.092)。RT-qPCR结果显示,加入MSC外泌体组乳腺癌细胞周期调控相关基因CyclinD1、CyclinE1、p21和p27的表达水平无明显改变;与对照组相比分别增加(1.322±0.121倍,1.142±0.158倍,0.889±0.08倍和1.248±0.244倍,n=4),无统计学差异(p=0.125,p=0.171,p=0.068,p=0.135)。WB结果也证实细胞周期调控蛋白表达没有明显变化。
  3.平板克隆形成试验结果显示,随着紫杉醇浓度(0,2,4,8nM)增加,乳腺癌细胞克隆数逐渐减少;与对照组相比,紫杉醇诱导凋亡中加入MSC共培养或重组NRG1,乳腺癌细胞克隆数明显增多。定量结果显示(n=3),对照组乳腺癌细胞活率分别为(100±1.19%,85.69±1.04%,51.71±0.60%,18.88±0.62%);MSC共培养组分别为(104±1.24%,92.44±1.2%,75.29±1.2%,46.78±0.22%);rNRG1组分别为(107±1.022%,94.24±0.67%,76.49±0.39%;40.69±0.37%);MSC和NRG1明显提高乳腺癌细胞对紫杉醇的耐受性,促进乳腺癌细胞存活(p=0.013,p=0.001,p=0.0001和p=0.0007,p=0.0003,p=0.0006)。
  4.MTS结果显示,在不同浓度紫杉醇诱导乳腺癌细胞MDA-MB-453凋亡模型中,随着紫杉醇浓度的增加,乳腺癌细胞存活率逐渐降低;加入MSC外泌体或rNRG1后,乳腺癌细胞活率明显提高,紫杉醇浓度(2,4,8nM)组具有明显差异(p<0.001)。并且,MSC外泌体降低乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性具有浓度依赖性,随着外泌体浓度的增加(0,1,2,5,10,20μg/ml),乳腺癌细胞活率增加;当外泌体浓度大于2μg/ml时,具有统计学差异(p=0.0518,p=0.018,p=0.008,p=0.0003,p=0.0001)。
  5.细胞凋亡分析结果显示,MSC外泌体显著降低了紫杉醇对乳腺癌细胞的诱导凋亡作用(p=0.0009,n=3);凋亡相关指示蛋白PARP活性剪切体cleaved-PARP表达降低。流式细胞凋亡分析结果也证实,MSC外泌体明显抑制紫杉醇引起的乳腺癌细胞凋亡(加入MSC外泌体组,紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡率由43.2±0.71%降至23.35±0.64%,p<0.01,n=3)。
  6.MSC及其外泌体高表达ErbB3的配体NRG-1,乳腺癌细胞不表达;MSC外泌体可明显激活MDA-MB-453乳腺癌细胞ErbB3受体,引起Akt信号通路磷酸化,上调Survivin表达,而MAPK信号通路不受影响。当MSC细胞的NRG-1被shRNA特异性敲低或MSC外泌体NRG-1被特异性抗体中和后,MSC及其外泌体的作用效果被逆转。当乳腺癌细胞ErbB3被shRNA特异性敲低,或当PI3K、AKT、Survivin被小分子抑制剂特异性抑制后,乳腺癌细胞凋亡增加,MSC外泌体对对乳腺癌细胞紫杉醇耐药的影响也被消除。
  研究结论:
  1.通过超滤离心法可以较简便地对MSC条件培养基中的外泌体进行富集。
  2.MSC没有明显促进ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌细胞MDA-MB-453增殖,但是MSC明显降低乳腺癌细胞对化疗药紫杉醇的敏感性,促进肿瘤细胞的存活。
  3.MSC通过外泌体旁分泌NRG-1,通过与Erb3/ErbB2介导的信号级联反应,引起Akt信号通路磷酸化,上调Survivin表达,抑制细胞凋亡,诱导乳腺癌MDA-MB-453细胞对紫杉醇耐药性。
  4.特异性靶向抑制MSC的NRG-1或肿瘤细胞的ErbB3、PI3K、AKT、Survivin,可消除MSC诱导的ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌细胞紫杉醇耐药。
  5.研究结果表明靶向肿瘤微环境中的MSC,可能是克服ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌患者中紫杉醇耐药性的新策略.
[硕士论文] 赵娜
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 弥散基组光谱成像在乳腺良、恶性病变鉴别诊断中的应用探究
  目的:探究弥散基组光谱成像(DBSI)参数在正常乳腺腺体及乳腺病变组织中的变化特点,并进一步比较DBSI参数及常规ADC对乳腺良、恶性病变的鉴别诊断效能。
  方法:收集我院2016-09至2017-11行术前DBSI检查且经术后病理证实的乳腺可疑病变患者75例,共81个病灶(良性病灶20例,恶性病灶61例)。DBSI图像后处理之后,依据T1WI增强扫描图像准确选择肿瘤感兴趣区,测量并收集相应DBSI参数(HR,RF,HF,FF,ADC*)及常规ADC值。利用多个独立样本非参数检验(Kruskal-Wallis检验)比较正常腺体、乳腺良性及恶性病变的DBSI参数和ADC的不同;使用MedCalc绘制DBSI各参数及ADC的ROC曲线,比较DBSI参数及ADC对于乳腺良、恶性病变的鉴别诊断效能。
  结果:乳腺正常腺体、良性及恶性病变的ADC(P<0.0001)及DBSI各参数均明显不同(P<0.0001,P<0.0001,P<0.0001,P=0.011,P<0.0001)。良性病变和恶性病变的HR值均低于正常腺体组织(P=0.001,P<0.0001);恶性病变、良性病变、正常腺体的RF值依次减低(P=0.001,P<0.001,P=0.033);恶性病变的HF值低于良性病变及正常腺体组织(P<0.001,P<0.001);恶性病变的FF值小于正常腺体组织(P=0.034)。当HR阈值选择为0.08%时,鉴别乳腺良、恶性病变的特异性为95%,但敏感性极低(5%),曲线下面积(AUC)为0.549;RF阈值为51.45%时,鉴别良、恶性病变的敏感度和特异度为83.6%、90%(AUC=0.906);HF阈值为14.51%时,鉴别良、恶性病变的敏感度和特异度为70.5%、85%(AUC=0.872);FF阈值选择为23.78%时,鉴别诊断良、恶性病变的特异度为86.9%,但敏感度仅为35%(AUC=0.559);ADC*≤0.82×10-3mm2/s时,诊断恶性病变的灵敏度和特异度为80%、82.0%(AUC=0.837);ADC阈值选择为1.20×10-3mm2/s时,对良、恶性病变鉴别诊断的敏感度和特异度分别为85.3%、75%(AUC=0.813)。当RF和HF联合使用时,鉴别诊断良、恶性病变的敏感度和特异度为77.0%、99.0%(AUC=0.929)。
  结论:DBSI各参数可以较好地区分组织内炎性细胞、肿瘤成分、水肿或正常乳腺腺体以及纤维等病理构成成分。DBSI特有参数(HR,RF,HF,FF)鉴别乳腺良、恶性病变的特异度较高,RF与HF联合应用可进一步提高对恶性病变诊断的特异度。RF、HF、ADC*可以获得与常规ADC相近的良、恶性病变鉴别效能。
  第二部分 DBSI参数与乳腺癌病理预后因子及分子亚型的相关性研究
  目的:探究DBSI各参数与乳腺浸润性导管癌组织学分级的关系;探究DBSI各参数与乳腺癌预后因子(ER,PR,HER-2,Ki-67)表达状态及乳腺癌分子亚型(Luminal A、Luminal B、HER-2过表达、TNBC)的关系。
  方法:收集我院2016-09至2017-11行术前DBSI检查且经术后病理证实的乳腺恶性病变患者共57例,61个病灶。DBSI图像后处理之后,依据T1WI增强扫描图像准确选择肿瘤感兴趣区,测量并收集相应DBSI参数(HR,RF,HF,FF,ADC*)。利用两样本比较的Wilcoxon秩和检验比较浸润性导管癌低级别、高级别组病灶的HR、RF、HF、FF、ADC*值的差异;同样用Wilcoxon检验比较不同ER表达(ER+/-)、不同PR表达(PR+/-)、不同HER-2表达(HER-2+/-)、Ki-67高与低表达乳腺癌之间DBSI参数的差异,并用Spearman相关对DBSI各参数与Ki-67表达率之间是否存在相关性进行分析;利用多个独立样本的非参数检验(Kruskal-Wallis检验)比较四个分子亚型乳腺癌DBSI参数的差异,并进一步使用Nemenyi检验进行两两组间差异的比较。
  结果:乳腺低级别浸润性导管癌的RF (62.33%)低于高级别组(73.71%),HF (14.43%)及ADC*值(0.78× 10-3mm2/s)高于高级别组(8.40%,0.72×10-3mm2/s),均具有统计学意义(P=0.011,P=0.004,P=0.005)。ER阳性乳腺癌的HF(7.66%)及ADC*值(0.71×10-3mm2/s)低于ER阴性组(14.02%,0.77×10-3mm2/s)(P=0.012,P=0.007),FF值(14.09%)高于ER阴性组(4.35%) (P=0.023)。PR阳性组HF (7.60%)及ADC*值(0.71×10-3mm2/s)低于PR阴性组(13.33%,0.75×10-3mm2/s) (P=0.009,P=0.013)。HER-2阳性组HF (14.28%)及ADC*值(0.76× 10-3mm2/s)高于HER-2阴性组(8.40%,0.72× 10-3mm2/s) (P=0.048,P=0.024)。Ki-67高表达(>20%)与低表达组的DBSI各参数差异均不具有统计学意义,且各参数与Ki-67表达百分率间相关性不明显。Luminal B亚型的FF值大于TNBC (P=0.024)。余诸亚型乳腺癌的各DBSI参数间的差异均不具有统计学意义。
  结论:DBSI各参数对乳腺癌组织学分级及各预后因子的表达情况具有一定预测作用,并且一定程度上能够揭示不同类型病灶内部组织学构成的差异,尤其是参数RF和HF。但DBSI参数与分子亚型的关系尚不明确。
[硕士论文] 宫春爱
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乳腺癌是严重威胁全球女性健康的常见恶性肿瘤之一。在美国女性癌症中是除了皮肤癌之外的最普遍的癌症,占接近三分之一。美国癌症协会2018年最新数据表明,乳腺癌在预计新发人数上位居第一,预计死亡人数上排名第二(仅次于肺及支气管癌)。目前,乳腺癌治疗存在很多难点,特别是一些患者在接受治疗时发生耐药及术后放化疗后肿瘤复发、转移。近些年来,有研究表明,自噬在乳腺癌的发生发展以及治疗过程中发挥着重要的作用。如何改善乳腺癌的治疗效果已成为研究热点。自噬是一种广泛存在于真核生物的细胞中高度保守的一种依赖溶酶体的降解途径,是通过清除自身衰老、受损的细胞器,或通过降解蛋白质、脂类等生物大分子供细胞再次利用,以维持细胞内环境稳态。自噬常作为一种细胞在特殊情况下的保护自我的一种机制,例如在机体出现损伤、缺氧、应激等病理生理情况后一种调控细胞代谢活动的过程,可被认为是与化疗失败的重要耐药机制之一。本课题选用广谱抗癌药多西他赛(DTX)和自噬抑制ATG7siRNA(siATG7),通过硫辛酸修饰的固有无序多肽形成的多肽胶束加以介导,并载入化疗药多西他赛,从体内和体外对其抗乳腺癌的作用机制进行研究。
  本课题分为三个部分,第一部分对共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束的构建及表征进行了报道。通过固相合成法合成了含有硫辛酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸的硫辛酸修饰的固有无序多肽的单体,然后进一步通过制备型高效液相色谱对产物进行纯化,且纯度检测结果显示符合实验要求。利用硫辛酸五元环内二硫键在一定比例的半胱氨酸催化下可实现分子间交联,进一步形成多个多肽单体聚合的载体。通过核磁共振氢谱对其结构进行了检测,结果显示了多肽单体聚合成功。然后采用超声乳化的方法制备胶束及载药,利用多肽胶束结构中分别含有疏水性的空腔以及富含带正电的阳离子型氨基酸,分别包载疏水性化疗药物多西他赛和包裹压缩带负电荷的siATG7基因药物。表征结果表明超声乳化法所制备的多肽胶束的平均粒径为165nm左右,电位值在31mV左右,且载药量在8.81%左右。
  本课题的第二部分进一步报道了共载化疗药多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束抗乳腺癌的体外评价。首先我们选用了以下五种不同种类乳腺癌细胞(MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-468,BT474,SKBR-3),对其进行抗增殖、促凋亡,以及周期阻滞实验研究,结果表明不同种类乳腺癌细胞对于自噬水平的依赖性不同,抑制自噬所引起的疗效也不相同。我们选择其中MCF-7细胞进一步研究通过siATG7对自噬的调控研究其抗乳腺癌的作用机制进行研究。用尼罗红代替多西他赛,荧光素FAM标记siATG7,对其摄取进行考察,结果显示尼罗红和siATG7可以在多肽胶束的介导下进入细胞。体外细胞实验表明,硫辛酸多肽胶束可以有效介导siATG7在MCF-7细胞内发挥作用并抑制了化疗药多西他赛引起的自噬,通过自噬抑制而实现增强化疗药的疗效的作用。多西他赛和siATG7可协同抗乳腺癌细胞增殖及周期阻滞并促进乳腺癌细胞凋亡。自噬抑制作用的考察上,我们通过构建稳定表达mRFP-EGFP-LC3的MCF-7细胞,然后对不同给药组的自噬流进行了考察,同时,通过Western Blot和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)对自噬相关的蛋白及ATG7mRNA的表达水平进行了考察,并通过电镜考察不同给药组产生的自噬泡的情况。结果显示共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束可以有效的抑制乳腺癌细胞MCF-7的自噬水平。
  本课题的第三部分对共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束抗乳腺癌体内作用机制进行了报道。实验成功构建了MCF-7乳癌裸鼠移植瘤模型,通过siRNA用Cy5荧光标记后通过多肽胶束进行体内递送研究,活体成像结果显示胶束具有较好的体内靶向性。肿瘤生长抑制实验和肿瘤组织的HE染色切片观察显示,多西他赛和siATG7在硫辛酸多肽胶束介导下,可以起到协同抑制裸鼠乳腺癌移植瘤生长。最后进一步通过HE对其安全性进行了考察,结果表明该多肽胶束具有较低的系统性毒性。免疫组化实验也表明,多西他赛和siATG7硫辛酸多肽胶束可以有效抑制自噬水平。
  通过对本课题进行研究,以硫辛酸进行修饰的固有无序多肽胶束作为载体,共载疏水性化疗药物和siRNA基因药物。通过抑制化疗药引起的自噬实现增敏为临床治疗乳腺癌以及其他癌症的综合治疗提供了参考依据和借鉴。
[硕士论文] 王安邦
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,具有起病隐匿和高致死率的特点。大约有30%的患者在肾癌确诊的时候已经发生转移。肾癌对放疗及化疗均不敏感,靶向药物的应用改善了肾癌患者的总体预后,但用药一段时间后,患者大多会出现耐药。因此,研究肾癌发展和转移的机制,就显得十分迫切而重要。除此之外,肾癌缺乏有效的早期诊断标志物。近年来,长链非编码RNA的在细胞的多种生物学进程中发挥着重要作用,如细胞生长、凋亡、分化和转移。很多研究报道了长链非编码RNA在肿瘤进展和转移中发挥着重要的作用,这类非编码RNA可以通过多种途径影响编码基因的转录和翻译。然而,长链非编码RNA在肾癌中的研究仍存在很多不足,因此,通过对大样本中lncRNA表达谱的分析,探索lncRNA在肾癌发展和转移中的作用以及寻找肾癌相关的分子标志物,为肾癌的治疗提供可能的靶点。
  方法:(1)利用GEO和TCGA芯片数据库查找肾癌相关的数据集,通过质检和样本分析,选定GSE40911、GSE61763、GSE76207、GSE82122和TCGA数据库进行lncRNA的筛选。对这5个数据库进行深入的芯片分析,再根据p值和差异倍数筛选出有意义的lncRNA。(2)进一步增大样本量进行验证,筛选最有意义的lncRNA,确定研究对象。(3)分析选定标本的临床特征,检测研究lncRNA的表达量,分析lncRNA与患者临床特征和指标的相关性。(4)分析lncRNA的基因组学特点,设计功能实验,观察lncRNA对肾癌细胞增殖和迁移能力的影响。(5)根据基因组位置及既往文献报道,探索长链非编码RNA EGFR-AS1与EGFR的相关作用关系。(6)利用RNA免疫共沉定等,探索EGFR-AS1如何调控EGFR的表达,寻找EGFR-AS1直接作用的靶蛋白或靶基因。
  结果:(1)通过大数据分析,筛选出与肾癌发展和转移相关的长链非编码RNA EGFR-AS1。临床样本验证发现EGFR-AS1在肾癌组织中显著上调表达,并且EGFR-AS1的高表达与TNM分期,T分期和淋巴结转移有关。(2)细胞功能学实验表明,EGFR-AS1能促进肾癌细胞的增殖和转移,体外实验研究表明,下调EGFR-AS1后能降低肾癌细胞的增殖和转移能力。(3)在肾癌组织标本中,发现EGFR的表达和EGFR-AS1表达量呈显著正相关。EGFR-AS1可通过增加EGFR的稳定性,促进其表达。(4)RIP实验证实HuR与EGFR-AS1存在富集效应,并且HuR与EGFR mRNA存在比较明显的结合。沉默HuR的表达可以减少EGFR的mRNA的稳定性。HuR参与对EGFR mRNA稳定性的调节。(5)EGFR-AS1通过EGFR促进肾癌细胞的增殖和转移。并且EGFR-AS1和EGFR mRNA存在共定位现象。EGFR-AS1通过结合HuR维持EGFR的稳定性,抑制EGFR的降解。
  结论:EGFR-AS1在肾癌组织中高表达,EGFR-AS1通过结合HuR维持了EGFRmRNA的稳定性,进而促进肾癌的增殖和转移。在此研究基础上,EGFR-AS1有望成为肾癌诊断的标志物以及潜在的治疗靶点。
[博士论文] 施晓磊
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  前列腺癌(prostate cancer,PCa)是全球男性人群中最常见的恶性肿瘤之一,发病率位居第二位,死亡率居于第六位,严重威胁着老年男性的健康。虽然目前中国的前列腺癌发病率低于欧美国家,但是其增长速度非常迅速,预计至2020年发病率接近欧美发达国家平均水平,达到40/10万男性人口。由于前列腺癌症状隐蔽,国内患者诊断前列腺癌时分期较晚,超过50%的患者确诊时已发生局部进展或转移,与美国确诊时超过80%以上都是局部前列腺癌相比差距巨大,除了PSA筛查尚未在国内大规模普及的原因外,可能存在的种族差异也是重要的原因。美国国家癌症中心SEER(Surveillance Epidemiology and End Results,SEER)数据库2006-2012年的资料显示,局限性前列腺癌的5年生存率达到100%,而转移性前列腺癌的5年生存率仅为29.3%。因此,探索前列腺癌早期诊断标志物对于中国前列腺癌诊疗和研究意义重大。
  人类基因组计划研究成果表明,仅有约19000个基因编码蛋白质,占整个基因组的1-2%,剩下98-99%都是“暗物质”非编码序列。随着下一代测序技术(Next generation sequencing,NGS)的成熟,最初被认为转录噪声的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)逐渐展现出其重要的作用。正是这些lncRNA才使得基因组调控异常复杂,充分发挥生物学功能。lncRNA是转录本长度超过200个碱基的RNA,不编码蛋白质或只编码较短的多肽——微肽,具有广泛的组织表达谱,较强的组织和细胞表达特异性,lncRNA可在表观遗传、转录和转录后水平等多个层面调控基因表达,调节蛋白基因功能。越来越多的研究表明lncRNA可通过多项机制调节基因功能,从而影响肿瘤细胞的生物学功能,发挥促进或抑制肿瘤的作用。同时,也有大量的lncRNA用于前列腺癌的早期诊断和分子分型。
  研究目的:
  本课题的主要研究目的是基于前列腺癌组织的二代测序数据筛选出肿瘤相关长链非编码RNA,并研究其在调节前列腺癌增殖和侵袭迁移中的作用机制,探寻前列腺癌的治疗靶点,寻找前列腺癌微创体液诊断的生物标志物,为前列腺癌的个体化诊治提供参考。从而为研发新型的前列腺癌靶向药物、优化临床治疗方案提供可靠的理论依据。
  研究方法:
  本课题采用NGS技术对65例中国人前列腺癌组织样本进行测序,分析RNA-seq数据,筛选显著差异表达的肿瘤相关lncRNA分子。对于筛选出来的lncRNA分子进行组织学和细胞学验证,利用生物信息学方法验证lncAPP的编码能力。qRT-PCR检测长海医院单中心291例拟行前列腺穿刺患者的前列腺按摩后尿渣中lncAPP表达水平,分析其是否能作为早期诊断指标有效区分前列腺癌患者与良性前列腺增生患者,和作为分子分型标志物区分低级别前列腺癌与高级别前列腺癌。
  应用RNA荧光原位组织杂交技术与核质分离技术明确lncAPP在前列腺癌肿瘤细胞系中的功能定位。应用干扰lncAPP表达的siRNA和外源性表达lncAPP的质粒作用于前列腺癌肿瘤细胞系,研究其对于维持肿瘤细胞生长能力包括肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响。应用慢病毒介导的稳定外源性表达lncAPP细胞系建立动物体内皮下荷瘤模型,应用瘤内持续注射siRNA介导的干扰lncAPP表达的皮下荷瘤模型,研究lncAPP对于维持肿瘤生长能力的影响。应用尾静脉注射稳转过表达lncAPP细胞系构建裸鼠转移模型,研究lncAPP对于肿瘤细胞转移能力的影响。
  应用生物信息学分析预测可能与lncAPP结合的miRNA及其结合位点,构建lncAPP-MS2-12X质粒通过RNA免疫沉淀(RIP)实验验证lncAPP能够与miRNA结合,构建野生型和突变型荧光素酶报告基因明确lncAPP与miRNA的结合位点。探索miRNA靶向的mRNA分子,验证lncAPP通过与miRNA竞争性结合调节下游关键分子,从而发挥维持肿瘤细胞生长的能力。运用micro-array芯片分析外源性高表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系的表达谱,筛选出差异表达的重要基因和信号通路。
  研究结果:
  分析65对中国人前列腺癌组织的RNA-seq数据发现存在显著差异的肿瘤相关lncRNA表达谱,按照临床分期、Gleason评分及进展转移三个标准筛选出lncAPP。前列腺癌患者尿渣和血浆中可检测到lncAPP,且前列腺癌患者体液中的表达水平高于良性前列腺增生患者。按摩后尿液lncAPP可以作为早期诊断分子标志物,能够区分穿刺阳性和穿刺阴性患者,且能区分高级别和低级别前列腺癌。
  通过外源性过表达和RNAi敲减的功能实验,证实lncAPP能够维持前列腺癌肿瘤细胞的增殖能力,促进肿瘤细胞迁移和侵袭。动物皮下荷瘤模型证实lncAPP能够维持前列腺癌肿瘤细胞的增殖能力,且能够促进肿瘤的转移。尾静脉注射稳转细胞系的体内转移模型,证实lncAPP能够促进肿瘤细胞的转移能力。
  应用miRDB和Target Scan数据库分析预测可能与lncAPP结合的miRNA,qRT-PCR检测外源性表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系中miRNA表达水平。运用MS2-RIP实验验证lncAPP能够与miR218/646结合,构建包含lncAPP与miR218/646结合位点及结合位点突变的荧光素酶质粒,明确其具体结合位点。证实lncAPP通过结合miR218/646,调节miR218/646靶向的下游mRNA发挥调节作用。Micro-array芯片分析外源性高表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系的转录谱,发现显著差异表达的基因和重要信号通路。
  研究结论:
  本研究基于中国人前列腺癌组织的RNA-seq测序数据,筛选出肿瘤相关的lncRNA分子,证实lncAPP能够作为早期诊断前列腺癌和区分高级别前列腺癌的分子标志物。体外和体内实验证实lncAPP可维持前列腺癌肿瘤细胞增殖和迁移侵袭能力。机制实验证明lncAPP结合miR218/646,阻断miR218/646对下游关键分子的抑制作用。lncAPP不但能作为早期诊断标志物应用于前列腺癌的早期诊断和分子分型,提高前列腺穿刺的阳性率,减少过度穿刺带来的痛苦和经济负担有着重要的转化医学意义;还可作为肿瘤治疗和抗转移的新靶点,从而为研发新型药物、优化临床诊治方案提供可靠的理论依据。
[硕士论文] 张春雷
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:作为男性生殖系统最常见的恶性肿瘤,前列腺癌(PCa)发病率随年龄增长而增加,一项最新研究报告表明PCa在美国男性癌症发病率中排在第1位,病死率中排在第2位。近年来我国男性前列腺癌发病率持续升高,在上海地区,前列腺癌发病率已位列男性常见肿瘤第5位和泌尿系统肿瘤第1位,因此研究PCa发生发展的分子机制,为肿瘤的治疗提供理论依据显得越来越重要。
  环状RNA(Circular RNA,circRNA)是一种通过反向剪接机制由线性RNA前体的5'端和3'端共价相接形成的非编码RNA,与基因的转录及后转录表达调控有关。近年,circRNA逐渐被发现不仅存在于细菌、真菌、植物中,也大量存在于哺乳动物中。作为一种竞争性内源RNA(CeRNA),circRNA与miRNA、lncRNA及蛋白之间具有相互作用的关系。随着研究的不断深入,circRNA先后被证明与多种疾病及肿瘤进程有关,因其表达量丰富、具有独特的稳定结构和组织表达特异性,有望为相关疾病及肿瘤发生发展机制提供新的理论依据。
  首先我们对三种细胞系的测序结果进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR,以下简称qPCR)验证,得到了与测序结果一致的结论,然后利用qPCR及琼脂糖凝胶电泳检测circRNA CDR1as特性,并选取表达相对较高的两种细胞系PC3及C4-2进行细胞功能学验证,在两种高表达细胞系中通过siRNA干扰方法下调CDR1as表达量后进行CCK8检测、Edu增殖实验、流式细胞术周期及凋亡实验、transwell迁移及侵袭实验等,结果表明CDR1as可以影响前列腺癌细胞的增殖、周期、迁移和侵袭功能。核质分离实验、miRIP实验表明CDR1as主要存在于细胞质中,并可能通过miR-23a/b等调节下游基因的表达,mRNA高通量测序以及qPCR结果证明CDR1as表达下调后CCND1及CXCL5表达量发生变化,并得到Western blot实验的证明,多个数据库预测软件表明miR-23a/b与CCND1及CXCL5具有结合位点,相关报道表明CCND1和CXCL5与肿瘤细胞周期及转移能力有关。
  总之,circRNA之前的研究重点在于对其形成机制的阐明,目前研究较多的是其在疾病中的功能作用,因circRNA具有稳定性好、保守性高、表达特异性强等特点,无论对于研究疾病发生机制还是作为诊断的生物标记物都有重要的研究价值。我们的结果证实了CDR1as作为ceRNA通过吸附miR-23a/b抑制其功能,进而增加CCND1和CXCL5的表达,促进PCa的进展。我们首次报道CDR1as作为ceRNA在PCa发生发展中的作用机制,并可能作为PCa治疗的一个潜在靶点以及可能作为诊断PCa的生物标志物。
  第一部分 前列腺癌相关细胞系circRNA表达谱分析
  目的:探索circRNA在前列腺癌相关RWPE-1、22RV1和PC3三种细胞系中的表达谱。
  方法:(1)通过circRNA的特异性测序法富集circRNA。(2)通过高通量测序对正常前列腺上皮细胞RWPE-1、前列腺癌上皮细胞22RV1和前列腺腺癌细胞骨转移细胞PC3的circRNA表达谱进行检测。(3)对测序结果进行生物信息学分析。(4)对测序结果进行qPCR验证。
  结果:(1)三种细胞系共识别出9545种circRNA。(2)三种细胞系差异表达的circRNA有数百种。(3)GO分析和KEGG通路分析表明差异表达circRNA的宿主基因与前列腺癌疾病进展密切相关。(4)与RWPE-1相比,PC3中CDR1as上调近200倍。(5)CDR1as有多个miRNA结合位点,如miR-7-5p等。
  结论:CircRNA在前列腺癌细胞系中表达量十分丰富,差异表达circRNA较多,与前列腺癌的发展可能存在密切关联,CDR1as在PC3中表达量增加,且与miRNA关系密切,可能影响前列腺细胞的增殖和转移能力。
  第二部分 CircRNA-CDR1as在前列腺癌细胞系及组织中的表达量分析
  目的:在前列腺癌细胞系及组织中对CDR1as测序结果进行检测、验证及表达量分析。
  方法:(1)通过前期的高通量测序,我们获得了CDR1as的序列结果,并与Circnet数据库进行了对比,最终确定了我们测序结果的准确性。(2)对CDR1as表达量的测序结果我们在测序的三个细胞系中利用qPCR进行了验证。(3)对扩增片段进行了sanger测序,来验证我们结果的可靠性。(4)增加三个前列腺癌细胞系(LNCaP、DU145和C4-2)以及肾癌细胞系786O和膀胱癌细胞系T24,验证CDR1as表达特异性。(5)通过cDNA及gDNA的反、对向引物扩增以及琼脂糖凝胶电泳验证其cbcRNA的特性。(6)利用RNA酶R消化来验证其circRNA的稳定性。(7)利用核质分离的方法进行分子在细胞中的分布定位。(8)CDR1as在65对癌与癌旁组织中表达量分析。
  结果:(1)CDR1as是一条X染色体上反义链来源circRNA,含有1485个碱基,其circRNA ID为has-circ-0001946chrX:139865339-139866824。(2)CDR1as在PC3中表达量是RWPE-1中的近1000倍,是22RV1中的近30倍。(3)Sanger测序的序列经匹配确定扩增片段准确无误。(4)CDR1as在前列腺癌细胞系PC3中特异性表达,并且在C4-2中表达量也较高,约为RWPE-1的200倍。(5)反向引物只在cDNA中有扩增结果,而对向引物在两者中均有扩增产物,说明在基因组中不存在与其序列相类似的环状DNA分子。(6)RNA酶R消化后对照线性分子的表达量下降程度显著高于对CDR1as的表达量影响。(7)核质分离结果表明CDR1as主要分布于细胞质中。(8)癌与癌旁CDR1as的表达量差值与PSA值呈正相关关系,r=0.30。
  结论:CDR1as是一条X染色体上反义链来源circRNA,主要分布于细胞质中,在前列腺癌细胞系PC3及C4-2中特异高表达。
  第三部分 CircRNA-CDR1as的功能鉴定
  目的:探索CDR1as对前列腺癌细胞功能的影响。
  方法:(1)转染siRNA以干扰CDR1as表达。(2)利用CCK8法检测CDR1as干扰表达的细胞PC3和C4-2的增殖能力。(3)通过流式细胞术实验检测CDR1as干扰表达的细胞PC3和C4-2细胞的周期和凋亡情况。(4)使用transwell小室检测CDR1as干扰表达的细胞PC3和C4-2细胞的迁移和侵袭能力。(5)利用病毒转染的方式构建CDR1as敲低表达的稳转株。(6)采用CDR1as敲低表达的稳转株进行小鼠皮下荷瘤模型的构建,进而探究其对成瘤能力的影响。
  结果:(1)SiRNA效率较高,转染后CDR1as表达下调80%以上。(2)CDR1as干扰表达后两种细胞增殖受到抑制。(3)CDR1as干扰表达后细胞周期阻滞在G1期,对凋亡无影响。(4)CDR1as干扰表达后细胞的迁移和侵袭能力减弱。(5)稳转株的CDR1as敲低效率在90%以上。(6)CDR1as敲低表达的稳转株成瘤能力降低。
  结论:CDR1as通过周期影响前列腺癌细胞增殖,不影响凋亡,CDR1as促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力,CDR1as敲低表达后可降低癌细胞的成瘤能力。
  第四部分 CircRNA-CDR1as在前列腺癌细胞中作用机制分析
  目的:探索环状RNA CDR1as促进前列腺癌细胞增殖、迁移的作用机制。
  方法:(1)采用miRIP方式探索与CDR1as结合的miRNA。(2)采用mRNA测序的方式对CDR1as干扰表达的细胞系进行测序以寻找下游的靶点mRNA。(3)RT-qPCR方式验证测序结果。(4)采用多组数据库对靶点mRNA与miRNA结合位点进行预测。(5)双荧光素酶报告基因检测筛选的miRNA是否与CDR1as结合。(6)采用miRNA mimics转染方式和miRNA抑制剂转染补救实验方式进一步验证CDR1as、miRNA、mRNA三者之间的关系。(7)Western blot方式对EMT marker进行验证。
  结果:(1)CDR1as可吸附miR-183、miR-23a、miR-23b等miRNA。(2)CDR1as表达干扰后CCND1和CXCL5基因表达下调。(3)CCND1与miR-183、miR-23a/b存在结合位点,CXCL5与miR-183、miR-23a/b、miR-200b/c存在结合位点。(4)双荧光素酶报告基因检测实验证明CDR1as与miR23a/b之间存在相互作用。(5)MiR23a/b过表达后CCND1和CXCL5基因表达量下调,CDR1as干扰表达后miRNA23a/b抑制剂转染补救可使CCND1和CXCL5表达量恢复。(6)Western blot结果表明,CDR1as干扰表达后CCND1和CXCL5蛋白水平表达下降,Ncadherin和Snail在PC3的两干扰组中表达量下调,Ecadherin在C4-2两干扰组中明显上调而Snail在C4-2两干扰组中明显下调。
  结论:CDR1as通过miR-23a/23b调节CCND1的表达,进而促进前列腺癌细胞周期进程,同时也通过miR-23a/b调节分泌因子CXCL5的表达,改变EMTmarker表达量,提高前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力。
[博士论文] 鲍一
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肾癌是人类常见的恶性肿瘤,近年来发病率逐年上升。约有20%的患者在初次诊断时就已经发生转移,而近30%的局限性肾癌在手术切除肿瘤后仍会出现复发转移。索拉非尼(Sorafenib)早在2006年就被国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准作为肾癌的一线治疗,然而,约有20%的患者在初次用药时即表现出对索拉非尼的先天耐药,而剩余的绝大多数患者在6-15个月左右也会出现继发性耐药,这些因素导致患者在使用索拉非尼治疗后总生存期延长有限。目前肾癌靶向治疗的难点在于耐药机制不明,缺乏有效的生物学标志物来预测索拉非尼的疗效,在出现耐药后没有很好的方法逆转耐药。血管生成素类似物(ANGPTL)在肾癌靶向耐药过程中所起到的作用以及机制尚未见报道。本研究拟探讨血管生成素类似物在肾癌索拉非尼耐药过程中所起到的作用,寻找相关的分子标志物以及逆转耐药的联合治疗靶点,为提高肾癌靶向治疗的效果、进一步延长患者的总生存期提供依据。
  方法:
  1.选取7种常见的肾癌细胞系,测定索拉非尼对其的半数抑制浓度(IC50);同时测定这些细胞中ANGPTL家族8个成员(ANGPTL1-8)的mRNA表达量,结合IC50筛选可能与肾癌索拉非尼耐药相关的成员。
  2.选取20例接受索拉非尼治疗的肾癌患者肿瘤组织标本,其中对索拉非尼耐药和敏感的各10例。测定其中ANGPTL1-8的mRNA表达量,进一步筛选与肾癌索拉非尼耐药相关的成员。结合1的结果,发现ANGPTL3与肾癌索拉非尼耐药关系最大,于是选择ANGPTL3为进一步验证的对象。
  3.进一步扩大样本量验证ANGPTL3mRNA表达量和肾癌索拉非尼耐药的关系。在一个有68例肾癌样本的队例中研究ANGPTL3mRNA表达量和其对索拉非尼反应性之间的关系。
  4.在蛋白层面验证ANGPTL3表达量和肾癌索拉非尼耐药的关系。选择32例肾癌(16例耐药和16例敏感)组织标本进行Western blot检测,比较ANGPTL3表达量和对索拉非尼敏感性之间的关系。收集136例肾癌患者的肾癌资料(70例术后索拉非尼治疗,66例术后无辅助治疗),免疫组化检测ANGPTL3表达量并进行生存分析。
  5.使用两条独立的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)敲低肾癌细胞株中ANGPTL3的表达量,使用CCK-8增殖实验、Western blot测定凋亡蛋白和流式细胞检测测定细胞凋亡等方法检测肾癌细胞对索拉非尼敏感性的变化。
  6.使用慢病毒转染肾癌细胞株,构建稳定过表达ANGPTL3的肾癌细胞株,使用CCK-8增殖实验、Western blot测定凋亡蛋白和流式细胞检测测定细胞凋亡等方法检测肾癌细胞对索拉非尼敏感性的变化。
  7.将稳定过表达ANGPTL3的OS-RC-2细胞注射于裸鼠皮下构建皮下荷瘤模型。裸鼠予以索拉非尼灌胃(80mg/kg/day)模拟临床给药。每周测量肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线,并通过小动物活体成像检测肿瘤大小。
  8.使用人类蛋白组芯片筛选和ANGPTL3结合的蛋白,并通过siRNA缩小筛选范围,最后用蛋白质免疫共沉淀和激光共聚焦验证获得与ANGPTL3相结合的蛋白。并通过构建ANGPTL3的截短体明确ANGPTL3发挥作用的结构域。
  9.利用Rescue方法,证明上述筛选的蛋白在ANGPTL3促进肾癌索拉非尼敏感性过程中发挥作用,并进一步明确其介导调控肾癌索拉非尼敏感性的具体机制。
  结果:
  1.肾癌细胞株中ANGPTL3和ANGPTL7的mRNA表达量与索拉非尼对肾癌的半数抑制量相关。
  2.小样本的肾癌组织筛选发现ANGPTL3的mRNA表达量和肾癌索拉非尼耐药性相关。结合1的结果发现ANGPTL3和肾癌索拉非尼耐药性可能有关,于是选择ANGPTL3作为进一步的研究对象。
  3.扩大样本量验证上述结论:在对索拉非尼耐药的组织和细胞系中ANGPTL3低表达,而在对索拉非尼敏感的组织和细胞系中ANGPTL3高表达。
  4.蛋白水平的验证同样证实ANGPTL3表达量和肾癌索拉非尼敏感性相关。ANGPTL3的表达量和预后相关:ANGPTL3高表达组中,服用索拉非尼的肾癌病人预后要好于未服用索拉非尼的肾癌病人;但是ANGPTL3低表达组中服用索拉非尼无效。
  5.敲低ANGPTL3后肾癌细胞对索拉非尼的敏感性下降:IC50升高,凋亡减少。
  6.过表达ANGPTL3提高肾癌细胞对索拉非尼的敏感性:IC50降低,凋亡增加。
  7.体外实验证实过表达ANGPTL3提高肾癌细胞对索拉非尼的敏感性:过表达ANGPTL3的肾癌移植瘤在索拉非尼作用下肿瘤生长更慢。
  8.ANGPTL3的FBG-like结构域和Focal adhesion kinase(FAK)相互结合。
  9.过表达FAK可以促进肾癌细胞对索拉非尼的耐药,而过表达ANGPTL3可以逆转此效应。敲低ANGPTL3可以提高肾癌细胞对索拉非尼的耐药性,同时敲低FAK可以抵消此效应,而使用FAK的激酶抑制剂PF-562271则并不能逆转ANGPTL3敲低所导致的耐药性提高。进一步研究发现索拉非尼可以抑制FAK的磷酸化,并且促进FAK的入核,进而导致了p53的降解;而过表达ANGPTL3可以抑制FAK的入核,从而抑制p53的泛素化降解,提高p53的表达量。
  结论:
  ANGPTL3在肾癌索拉非尼敏感的组织中高表达,在索拉非尼耐药的组织中低表达,并且索拉非尼在治疗ANGPTL3高表达的肾癌时有着较好的疗效。在索拉非尼作用下FAK进入细胞核促进p53的泛素化降解,导致细胞的耐药;ANGPTL3通过结合FAK,影响了FAK的入核,抑制了p53的泛素化,从而促使p53保持在一个较高的水平,促进了细胞的凋亡等过程,提高了索拉非尼的治疗效果。因此,ANGPTL3可能作为预测肾癌索拉非尼敏感性的生物学标志物,其下游FAK的入核以及p53的泛素化降解也有望成为肾癌靶向治疗的新靶点,有着较好的临床转化前景。
[硕士论文] 夏清明
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:前列腺癌是目前西方发达国家中男性肿瘤发病率和死亡率最常见的肿瘤之一。近年来我国前列腺癌发病率也在逐年攀升。雄激素剥夺治疗一直以来是前列腺癌最经典的治疗方式,但随着治疗的前行,前列癌晚期几乎都会发展为雄激素非依赖性,传统的治疗方式对雄激素非依赖性前列腺癌疗效不佳。肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤的一种新型治疗手段,在肿瘤临床治疗上已取得了较好的疗效。本课题选用含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的脱氧核寡核苷酸(Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs,CpG ODN)免疫激活剂,通过穿膜肽修饰的多壁碳纳米管为介导,研究其抗雄激素非依赖性前列腺癌的体内外作用。
  本课题第一部分报道了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体的构建和表征。通过多肽固相合成法合成含有3个组氨酸和6个精氨酸的多肽H3R6,利用制备液相进行纯化以及高效液相色谱和质谱进行纯度分析,检测其纯度符合实验要求。用浓硫酸和浓硝酸对多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)进行羧基化,然后再和多肽反应形成载体MHR。利用核磁共振氢谱,红外光谱、透射电镜和热比重分析鉴定复合物合成成功。利用MHR载体中精氨酸富含正电荷,CpG是核酸类物质带负电荷,通过静电作用形MHR/CpG纳米复合物。在N/P=6时,MHR载体能够有效负载CpG免疫激活剂,当N/P=20时电位处于一个较稳定的状态,电位约=25±2.62mV。通过HEK293转染实验,得出MHR载体在N/P=20转染效率较高。
  本课题第二部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂进行体外细胞学评价,RAW264.7细胞明显对负载CpG纳米免疫制有较高的摄取,CpG能够和胞内内吞体膜上的TLR9受体结合。CCK8细胞毒性实验中,MHR载体对DU145、RM-1和RAW264.7细胞的毒性较低。体外免疫活性ELISA和PCR实验结果显示,MHR/CpG对RAW264.7细胞刺激促进IL-6和TNF-α促炎因子的分泌明显高于单体CpG组,和LPS(10ng/ml)刺激效应具有可比性。
  本课题第三部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂体内的抗前列腺癌效应和免疫活性。我们成功构建了DU145前列腺癌BALB/c裸鼠和RM-1前列腺癌BALB/c小鼠模型,通过小动物活体成像系统观察结果显示,MHR/CpG可以有效的在肿瘤和肿瘤引流淋巴结部位蓄积,有靶向效果。体内药效结果表明MHR/CpG对前列腺癌的增殖有较强的抑制作用,从小鼠脾脏淋巴细胞流式分析看出MHR/CpG可以在体内有效刺激CD4和CD8T细胞的分化增殖。同时从小鼠的肾脏和肺肺脏的HE染色图看出,MHR/CpG的体内用药安全性较高。
  本课题成功构建了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体,为去势抵抗性前列腺癌治疗提供了新策略,同时也为其它肿瘤的治疗提供了好的参考和借鉴。
[硕士论文] 戴利和
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  在中国,膀胱癌(Bladder cancer,BC)发病率居泌尿系统恶性肿瘤之首。依据生长方式的不同,膀胱癌可以分为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),前者占初诊膀胱癌患者的70%左右,主要采用经尿道膀胱恶性肿瘤电切术(TURBT),5年生存率达90%,NMIBC患者术后易复发进展,约15%术后会进展为MIBC,患者预后变差;后者占30%左右,主要采用根治性膀胱切除术,术后约50%发生转移,发生转移后5年生产率仅为5%。膀胱癌侵袭进展对人类健康造成很大的威胁,明确膀胱癌侵袭进展的机制,对改进膀胱癌现有治疗和预后判断具有重要作用。
  癌蛋白Gankyrin在众多恶性肿瘤的形成中发挥促癌作用。Gankyrin最初在肝癌研究中被发现,近来研究表明Gankyrin在结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肺癌和食道癌等多种恶性肿瘤发挥促癌作用,且与肿瘤恶性程度有关。目前,Gankyrin在膀胱癌发生、发展中的具体作用和分子机制尚未明确。
  前期对10例膀胱癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织进行转录组测序,结果显示Gankyrin在膀胱癌组织中表达高于癌旁正常组织,根据膀胱癌经典分子起源学说及最新膀胱癌组织高通量测序结果,P53信号通路与膀胱癌侵袭性高度相关,而根据文献检索,Gankyrin为P53分子的上游调控分子,因此推测Gankyrin在膀胱癌的侵袭进展过程中发挥重要作用。
  目的:
  研究Gankyrin在膀胱癌中的表达情况,探讨其在膀胱癌侵袭进展中的作用及机制,以期为膀胱癌靶向治疗和预后判断提供新依据。
  方法:
  1.对10对膀胱癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织进行转录组测序,根据膀胱癌发生分子机制假说及文献报道,筛选出Gankyrin作为研究对象。
  2.提取90对膀胱癌组织及癌旁正常组织的RNA及20对膀胱癌组织及癌旁正常组织的总蛋白,分别通过qRT-PCR和western blot验证Gankyrin在膀胱癌中的表达情况。
  3.通过公共数据库Oncomine挖掘数据,验证Gankyrin在膀胱癌患者的肿瘤组织中存在高表达。
  4.通过免疫组化,对3例肌层浸润性膀胱癌病理大切片行Gankyrin染色,分析肿瘤侵犯粘膜层、浅肌层、深肌层时的表达情况,研究其和膀胱癌侵袭性的关系;分析130例膀胱癌患者肿瘤组织中Gankyrin的表达量,探讨其与膀胱癌临床病理资料和预后的关系。
  5.通过western blot和qRT-PCR检测Gankyrin在正常尿路上皮、2种非肌层浸润性膀胱癌、2种肌层浸润性膀胱癌细胞系中的表达量。
  6.利用慢病毒载体构建Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞系和Gankyrin稳定敲减的UMUC3细胞系,通过EdU细胞增殖试验和NOD/SCID小鼠的皮下成瘤实验,研究Gankyrin过表达和敲低对膀胱癌细胞增殖、成瘤能力的影响。通过细胞划痕实验和Transwell小室迁移侵袭实验,检测Gankyrin对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响。通过流式细胞术检测Gankyrin对膀胱癌细胞凋亡的影响。
  7.利用BBN诱导小鼠自发产生膀胱癌,通过免疫组化检测Gankyrin在小鼠自发膀胱癌模型中的表达情况并探讨其意义。
  8.通过连续切片免疫组化染色,分析32例膀胱癌组织中Gankyrin和MDM2表达的相关性,利用western blot检测Gankyrin过表达和敲低后MDM2的表达水平,通过免疫荧光检测Gankyrin和MDM2在膀胱癌中的亚细胞定位,利用蛋白免疫共沉淀检测Gankyrin与MDM2在膀胱癌中的相互作用,以探讨Gankyrin调控膀胱癌侵袭进展的可能机制。
  结果:
  1.转录组测序结果表明Gankyrin表达量在9例膀胱癌组织中高于对应癌旁正常尿路上皮组织,对10对癌及癌旁组织RPKM值进行统计分析,Gankyrin在膀胱癌组织中表达显著上调(P<0.05),差异表达倍数为1.21倍。
  2.通过qRT-PCR检测90例膀胱癌患者中Gankyrin mRNA的表达情况,发现其中66例患者肿瘤组织中Gankyrin mRNA表达量高于癌旁正常组织,24例患者中肿瘤组织Gankyrin表达量低于癌旁组织,Gankyrin高表达比例为73.3%。对20对膀胱癌组织及癌旁正常组织进行western blot检测,发现其中17例样本的肿瘤组织中Gankyrin蛋白的表达量明显高于癌旁正常组织。
  3.公共数据库Oncomine检索发现Dyrskjot Bladder3数据集中,Gankyrin mRNA在膀胱癌患者肿瘤组织中的表达含量高于正常尿路上皮组织(P<0.01)。
  4.在3例膀胱癌病理大切片中,Gankyrin表达量从粘膜、浅肌层到深肌层逐渐升高;130例免疫组化的结果显示,Gankyrin表达量在肌层浸润性膀胱癌中显著高于非肌层浸润性膀胱癌(P<0.01)、在高级别膀胱癌组织中显著高于低级别组织(P<0.01),Gankyrin高表达患者总体生存期、疾病特异性生存期和无进展生存期显著低于低表达患者(均P<0.001),多因素分析显示,Gankyrin为膀胱癌不良预后的独立危险因素。
  5.western blot和qRT-PCR结果显示,Gankyrin在膀胱癌细胞系中的表达量高于正常尿路上皮细胞系,Gankyrin在NMIBC细胞系BIU87和SW780中表达量低,而在MIBC细胞系UMUC3和J82中存在高表达。
  6.成功构建Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞株和Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞株,EdU细胞增殖实验表明Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞增殖能力显著强于对照组(P<0.01),而Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞的增殖能力显著降低(P<0.001);Gankyrin稳定过表达后的BIU87细胞小鼠皮下肿瘤增殖能力明显强于对照组(P<0.001),而Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞小鼠皮下肿瘤增殖能力显著弱于对照组(P<0.001);划痕实验和Transwell小室迁移实验显示,Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞迁移能力显著增强,Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞迁移能力显著下降;Transwell小室侵袭实验显示,Gankyrin过表达可显著增强膀胱癌细胞的侵袭能力,而Gankyrin敲低可显著抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。流式细胞术检测结果显示Gankyring过表达或敲低并不影响BIU87或UMUC3细胞的凋亡。
  7.成功利用BBN诱导小鼠自发形成膀胱癌,免疫组化结果显示,Gankyrin在膀胱癌中的表达量高于正常尿路上皮组织,在NMIBC、MIBC及肺转移组织中表达量逐渐升高。
  8.32例膀胱癌连续切片免疫组化显示,Gankyrin和MDM2呈正相关(R=0.583,P<0.001)。上调BIU87细胞Gankyrin表达量,MDM2表达相应上调,下调UMUC3细胞Gankyrin表达量,MDM2表达相应下调,免疫荧光显示Gankyrin和MDM2在BIU87细胞及膀胱癌组织中存在共定位,蛋白免疫共沉淀显示Gankyrin和MDM2在BIU87细胞中相互结合。
  结论:
  癌蛋白Gankyrin在膀胱癌组织中显著上调,Gankyrin的表达水平升高与膀胱癌的分期分级升高密切相关,且是膀胱癌不良预后的独立危险因素。上调Gankyrin的表达可以增强膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,下调Gankyrin的表达显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Gankyrin在膀胱癌中与MDM2直接结合,为调控膀胱癌侵袭进展的潜在分子机制。
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