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[硕士论文] 程小玲
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:目前长链非编码RNA H19对于宫颈癌Hela细胞生物学功能的作用及其作用机制尚缺乏相关研究。本文主要探讨了LncRNA H19在宫颈癌Hela细胞中的生物学功能研究。
  方法:本研究选择在3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)和正常上皮细胞株(H8)中来检测LncRNA H19的表达。构建含H19基因的重组真核表达载体pCDNA3.1-GFP-H19,经双酶切及基因测序等鉴定构建成功,并合成siRNA的LncRNA H19干扰序列,同时设置空白对照组、pCDNA3.1-GFP组及si-NC组。各组细胞转染48h后采用RT-qPCR法检测LncRNA H19mRNA相对表达水平;采用CCK-8法检测在转染后24h、48h、72h及96h细胞的增殖率;采用流式细胞仪分别检测各组24h和48h细胞凋亡率;采用细胞划痕实验检测各组细胞转染后的迁移数,评估细胞迁移能力;采用Transwell细胞体外侵袭实验检测各组细胞转染后的侵袭能力;采用Western blotting的方法检测LncRNAH19对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达。
  结果:3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)中LncRNA H19的表达明显高于正常上皮细胞株(H8)中LncRNA H19的表达。首先,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外增殖和抑制其凋亡,沉默LncRNA H19可以显著抑制Hela细胞体外增殖和促进其凋亡。其次,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外迁移、侵袭,沉默LncRNA H19可以抑制Hela细胞体外迁移、侵袭,该效应直接与EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达相关。
  结论:上调LncRNA H19可以显著促进宫颈癌细胞增殖和抑制宫颈癌细胞凋亡,下调LncRNA H19表达则反之;上调LncRNA H19促进宫颈癌细胞迁移、侵袭,下调LncRNA H19表达则反之,同时可以引起EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达发生改变。LncRNAH19在宫颈癌的发生、发展及预后中充当了重要角色,有可能作为一个发现及判断其预后的潜在生物标记物。
[博士论文] 耿朝辉
护理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  本课题立足于体力活动(Physical Activity,PA)对乳腺癌患者化疗期及长期康复产生的积极作用,旨在充分了解乳腺癌患者化疗期体力活动水平与亚人群特质,获悉患者体力活动纵向变化轨迹的前提下,结合乳腺癌患者及医务人员对体力活动的体验及认知,初探乳腺癌患者化疗期体力活动规律,基于此,构建乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案,并完成干预依托的移动手机应用程序(Application,App)开发,进而检验其干预效果,以期达到增强患者活动意识,改善体力活动行为现状,进一步提升患者化疗期体验,提高生活质量的目的。
  研究方法:
  本研究共分为三部分:
  1、乳腺癌患者化疗期体力活动规律的研究
  (1)乳腺癌患者化疗期体力活动的现状调查及人群特质研究
  基于前期文献及理论研究,确立横断面研究纳入的变量,进而对435名乳腺癌患者进行问卷调查,了解其化疗期体力活动水平现状,并通过潜在类别分析(Latent Class Analysis,LCA)探究患者体力活动行为的亚人群特征。
  (2)乳腺癌患者化疗期体力活动纵向变化轨迹的研究
  采用纵向研究设计,分别对153名乳腺癌患者化疗前、化疗第一疗程后、化疗6周后及化疗3个月后T1-T4四个时间点体力活动进行问卷调查,运用增长混合模型(Growth Mixture Model,GMM)识别样本子总体的体力活动随时间变化的不同轨迹类型。
  (3)乳腺癌患者及医务人员对化疗期体力活动体验与认知的质性研究
  采用质性研究方法,分别对18名乳腺癌患者及14名医务人员进行质性访谈,了解患者化疗期体力活动的体验,并探究医务人员对化疗期体力活动的认知,收集体力活动相关临床照护实践经验,探究影响体力活动的有益因素或阻碍,进而探讨开展体力活动移动干预的必要性及可操作性建议。
  2、基于体力活动规律的乳腺癌患者化疗期移动医疗干预方案的构建
  基于前期挖掘出的化疗期体力活动规律,在社会认知理论、自我效能理论、计划行为理论的框架指导下,结合文献研究起草体力活动干预文稿及配套管理方案,召开专家工作组会议并进行专家一对一咨询,修订并确定干预方案的细节、后期技术开发要点,最终确立干预方案终稿。
  3、基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与应用
  (1)基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与测试
  依据前期阶段性研究结果明确的乳腺癌患者移动医疗干预需求,应用敏捷开发模式,由技术人员与研究者通力合作进行iOS系统、Android系统及PC端后台数据管理系统的研发与测试。3名研究人员在开发过程中对不断交付的分模块进行功能检测,软件开发完成后纳入4名乳腺癌患者对App测试版进行功能测试并完成研究后系统可用性评估问卷调查及反馈,对应用程序进行初步评价。
  (2)基于App的乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案的适用性检验
  以成功研发的“乳腺康”手机应用程序为主要技术手段,采用混合研究方法,对20名乳腺癌化疗期患者开展为期三个月的体力活动干预,对移动医疗干预方案进行适用性检验,通过量性研究确认该方案对提升乳腺癌患者化疗期体力活动水平的作用效果,通过质性访谈了解患者对干预方案及App使用的感受及体验。
  研究结果:
  1、乳腺癌患者化疗期体力活动规律的研究
  (1)乳腺癌患者化疗期体力活动的现状调查及人群特质研究
  横断面调查结果显示乳腺癌患者化疗期总体力活动平均水平为1441.94±1880.703MET-min/w,每周静坐时间约为5小时,完全静坐人数达43.7%,研究对象中仅有15例有重体力活动,176例报告了有中等体力活动,总体体力活动达标人数为40.9%。LCA结果显示研究对象被识别为三类亚人群:体力差、睡眠情绪障碍组(N=69),体力中低等、疲乏组(N=108)与体力中低等、无明显症状组(N=258)。
  (2)乳腺癌患者化疗期体力活动纵向变化轨迹的研究
  153名乳腺癌患者化疗期T1-T4体力活动纵向数据描述性结果显示,除T4外,患者的T1-T3体力活动三个时间点的总体力活动平均水平均比横断面调查平均水平低,T2即化疗第一疗程结束后,体力活动水平下降至最低水平。该样本体力活动等级水平分类结果显示:T1与T2时间点静坐人数比例最大,分别占到44.7%与68.8%;T3与T4时间点体力活动活跃者人数比例较大,分别为44.4%与56.8%。增长混合模型将该人群识别为两类:类别1(N=99)的个体体力活动起始值较高同时随时间总体呈上升趋势;类别2(N=54)的个体体力活动值起始较低在化疗第一疗程下降至最低点,随即缓慢上升。
  (3)乳腺癌患者及医务人员对化疗期体力活动体验与认知的质性研究
  通过对18名乳腺癌患者的质性访谈分析得出四个主题:化疗扭转生活常态,体力活动动机不足;治疗相关副作用应接不暇,体力活动步履维艰;躯体心智遇折磨,社交经济遭挑战;化疗适应促成长,社会支持添动力。通过对14名医务工作者的质性访谈分析得到的主题如下:患者体力活动需求凸显,潜在益处逐步感知;体力活动相关指导匮乏,连续专业性照护支持待加强;推荐个性化安全的体力活动干预,多角度增强患者依从性及参与度。
  2、基于体力活动规律的乳腺癌患者化疗期移动医疗干预方案的构建
  经专家工作会议及专家一对一咨询后确立的干预方案终稿包含以下内容:拟实现的干预目标、干预核心内容、其它干预要素(干预时间、地点、对象、手段、流程、策略及效果评价工具等);确立的软件开发功能要点包括移动用户终端及后台数据管理平台两部分。
  3、基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与应用
  (1)基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与测试
  经过三名软件工程师系统开发及研究者与用户的多轮软件测试及修正,“乳腺康”手机应用程序客户端最终锁定为以下五个主页面:首页、日历、圈子、运动、个人中心。后台数据管理系统可实现用户管理、知识库管理、动态管理、评论管理、短信发送、数据Excel导出等功能。4名乳腺癌患者就App的系统有用性、信息质量、界面质量与总体评价等方面做出初步评价,问卷测评得分分别为4.5,4.33,4.78与4.5。
  (2)基于App的乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案的适用性检验
  纳入干预的20名研究对象,有12名患者表示其运动习惯或兴趣为散步或快走,根据其基线测评结果进行群组差异化干预,分为活跃组(N=12)及静坐组(N=8)。三个月后观察结果显示,用户累计使用App的时间平均每人每周达40min,每人每周登录App的次数为3次。量性研究结果表示患者的总体体力活动有所改善,总体体力活动平均增长了945.70MET-min/w。干预前后患者在交通有关、闲暇时间、步行及总体力活动水平有统计学差异。质性研究结果提示患者对干预方案及App的认可度高,在有用性及易用性方面评价较好。
  研究结论:
  乳腺癌患者化疗期体力活动总体水平偏低,体力活动达标人数严重不足;横断面调查识别出的体力活动三组潜类别人群、纵向研究探究到的两组潜类别发展轨迹,合并患者及医务人员的质性访谈共同为构建乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案提供依据与理论支撑,该方案对促进患者化疗期体力活动行为的改变,提高其活动意识、改善化疗期体验具有重要作用,研发的手机App具有较高的接受度,易用性、可用性及有效性效果突出。
[硕士论文] 房蒙
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  乳腺癌作为女性所罹患恶性肿瘤中最常见的病种之一,约占所有恶性肿瘤的30%。尽管包括手术、放疗、化疗和内分泌治疗在内的综合治疗显著降低了早期死亡率,但乳腺癌仍然是女性癌症死亡最常见原因中的第二位。恶性肿瘤的发生是由多种致癌因素引起的,其特点是细胞增殖失控和远处转移。骨是晚期乳腺癌最常见的转移部位,据报道发生率约为60-80%,骨转移大大增加了病理性骨折和脊髓压迫等并发症,严重影响生活质量。鉴于晚期乳腺癌患者发生骨转移的后续治疗策略及疗效较为有限。故探明乳腺癌骨转移的分子生物学机制,寻求新的药理学靶点,对患者的预后意义重大。
  微纤维相关蛋白5(Microfibrillar-associated protein5,MFRP5)也称为微纤维相关糖蛋白2(microfibril-associated glycoprotein2,MAGP2),是细胞外弹性微纤维的一个组成部分,在骨骼生长、心血管发育、肺泡弹性发育和马凡综合征中发挥重要作用。研究表明,MFAP5由骨髓间充质基质细胞(Bone marrow mesenchymal stromal cell,BMSC)分泌,并在造血和免疫系统中发挥作用,而MFAP5的缺失可预防小鼠骨质疏松。这些结果表明MFAP5在骨微环境中的关键作用。最近的研究进一步表明,MFAP5在头颈部恶性肿瘤、胰腺癌、肺癌和舌癌中过度表达,但是MFAP5在这些肿瘤中的作用仍有待阐明。已有研究表明,血清MFAP5水平与卵巢癌患者预后负相关,而癌细胞分泌的MFAP5能够促进肿瘤增殖,内皮细胞迁移,肿瘤血管生成和化疗药物耐药。然而,课题组成员经过文献检索,发现关于MFAP5在乳腺癌骨转移中作用机制的文献尚属少数。
  由于MFAP5在恶性肿瘤和骨微环境中的重要作用,设计实验,想进一步了解MFAP5在乳腺癌骨转移中的作用。在本研究中,首先验证了MFAP5在乳腺癌骨转移灶中的高表达,并探究了MFAP5对乳腺癌肿瘤细胞增殖和迁移的影响,并进一步探讨了可能的分子机制,特别是ERK/MMP信号通路。
  方法:
  我们的研究采用在海军军医大学附属长征医院收集的乳腺癌原发病灶、癌旁正常组织及骨转移组织。首先,进行MFAP5的免疫组化染色,随后通过western blot及qR-T PCR实验,分别在蛋白水平和mRNA水平验证MFAP5的表达。
  第二部分的实验中,首先构建MFAP5过表达质粒,并通过PCR扩增的MFAP5的密码序列插入pcDNA3.1+质粒中。一方面进行CCK8实验:在含10%胎牛血清的DMEM培养基中常规培养两珠乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231,细胞用DNA转染试剂或siRNA转染质粒。用过表达质粒或siRNA转染的MCF7和MDA-MB-231细胞以每孔5×103的起始密度接种在96孔板中,48h后使用细胞计数试剂盒进行计数,使用酶标仪在450nm处测量吸光度来测量结果。随后,使用8-μm孔径的transwell室进行transwell迁移试验。消化并计数用过表达(OE)质粒或siRNA转染的MCF7和MDA-MB-231细胞。
  为进一步研究MFAP5调控乳腺癌骨转移的分子机制,进行western blot实验,研究MFAP5与MMP2,MMP9,p-FAK,FAK,p-Erk1/2,Erk1/2,p-cJun(Set63),p-cJun(Set73),cJun之间表达的相互影响及关系。
  实验中,均使用SPSS19.0统计软件进行统计分析。数据格式为平均值±平均值的标准误差,数据比较使用独立样本t检验。所有实验均重复3次,并纳入代表性结果。p<0.05被认为是有统计学意义的。
  结果:
  IHC显示MFAP5主要在细胞间隙中表达,并且在骨转移灶中的表达显著高于原发灶。western blot检测进一步证实MFAP5在骨转移中的表达高于原发灶。此外,qRT-PCR检测结果显示,在乳腺癌骨转移灶中MFAP5的mRNA水平显著高于原发灶(p<0.05)。MFAP5在MDA-MB-231细胞中MFAP5的表达水平最高,在MCF7细胞中最低。
  Western blot实验证实了过表达质粒和siRNA分别对MFAP5的表达起到促进及抑制作用。MCF7和MDA-MB-231细胞中进行的CCK8实验显示,MFAP5过表达后细胞活力明显增强,而抑制MFAP5后细胞增殖明显下调,表明MFAP5介导乳腺癌的细胞增殖。Transwell实验显示,MFAP5过表达的细胞迁移能力明显增强,而抑制MFAP5后,细胞迁移能力显著降低。这些结果提示MFAP5可能通过增强细胞的迁移能力而促进乳腺癌的转移。
  在MCF7和MDA-MB-231细胞中,MFAP5过表达时MMP2和MMP9的mRNA水平显着增高,而MMP7和MMP14的mRNA水平几乎不变。Western blot进一步表明,与OE-Ctrl质粒相比,转染OE-MFAP5质粒的MMP2和MMP9的表达显著上调,相反,siRNA对MFAP5的抑制则明显抑制了MMP2和MMP9的表达。这些结果表明MFAP5可能通过调节MMP2和MMP9的表达在乳腺癌骨转移中发挥作用。MFAP5的过表达对FAK,Erk1/2和cJun的表达无明显影响,但MFAP5明显激活了FAK,Erk1/2和cJun的磷酸化。相反,通过siRNAs抑制MFAP5的表达则明显抑制了p-FAK,p-Erk1/2和p-cJun的表达。这些结果提示MFAP5可能通过ERK信号通路调控MMP2和MMP9的表达。
  结论:
  通过本研究,首先报道了乳腺癌骨转移灶中MFAP5表达水平相比原发灶的明显上调,并进一步发现MFAP5过表达加速了乳腺癌细胞的增殖和迁移,而当MFAP5被抑制时则呈现相反的效果。此外,MFAP5能够能激活ERK信号通路,增加MMP2和MMP9的表达,相反,抑制MFAP5的表达后,MMP2、MMP9、p-FAK、p-Erk1/2和p-cJun的表达也受到抑制。这些结果表明MFAP5作为癌基因在乳腺癌骨转移中发挥作用,希望通过我们的研究能够找到乳腺癌骨转移新的诊断和治疗方法。
[博士论文] 鲍一
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肾癌是人类常见的恶性肿瘤,近年来发病率逐年上升。约有20%的患者在初次诊断时就已经发生转移,而近30%的局限性肾癌在手术切除肿瘤后仍会出现复发转移。索拉非尼(Sorafenib)早在2006年就被国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准作为肾癌的一线治疗,然而,约有20%的患者在初次用药时即表现出对索拉非尼的先天耐药,而剩余的绝大多数患者在6-15个月左右也会出现继发性耐药,这些因素导致患者在使用索拉非尼治疗后总生存期延长有限。目前肾癌靶向治疗的难点在于耐药机制不明,缺乏有效的生物学标志物来预测索拉非尼的疗效,在出现耐药后没有很好的方法逆转耐药。血管生成素类似物(ANGPTL)在肾癌靶向耐药过程中所起到的作用以及机制尚未见报道。本研究拟探讨血管生成素类似物在肾癌索拉非尼耐药过程中所起到的作用,寻找相关的分子标志物以及逆转耐药的联合治疗靶点,为提高肾癌靶向治疗的效果、进一步延长患者的总生存期提供依据。
  方法:
  1.选取7种常见的肾癌细胞系,测定索拉非尼对其的半数抑制浓度(IC50);同时测定这些细胞中ANGPTL家族8个成员(ANGPTL1-8)的mRNA表达量,结合IC50筛选可能与肾癌索拉非尼耐药相关的成员。
  2.选取20例接受索拉非尼治疗的肾癌患者肿瘤组织标本,其中对索拉非尼耐药和敏感的各10例。测定其中ANGPTL1-8的mRNA表达量,进一步筛选与肾癌索拉非尼耐药相关的成员。结合1的结果,发现ANGPTL3与肾癌索拉非尼耐药关系最大,于是选择ANGPTL3为进一步验证的对象。
  3.进一步扩大样本量验证ANGPTL3mRNA表达量和肾癌索拉非尼耐药的关系。在一个有68例肾癌样本的队例中研究ANGPTL3mRNA表达量和其对索拉非尼反应性之间的关系。
  4.在蛋白层面验证ANGPTL3表达量和肾癌索拉非尼耐药的关系。选择32例肾癌(16例耐药和16例敏感)组织标本进行Western blot检测,比较ANGPTL3表达量和对索拉非尼敏感性之间的关系。收集136例肾癌患者的肾癌资料(70例术后索拉非尼治疗,66例术后无辅助治疗),免疫组化检测ANGPTL3表达量并进行生存分析。
  5.使用两条独立的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)敲低肾癌细胞株中ANGPTL3的表达量,使用CCK-8增殖实验、Western blot测定凋亡蛋白和流式细胞检测测定细胞凋亡等方法检测肾癌细胞对索拉非尼敏感性的变化。
  6.使用慢病毒转染肾癌细胞株,构建稳定过表达ANGPTL3的肾癌细胞株,使用CCK-8增殖实验、Western blot测定凋亡蛋白和流式细胞检测测定细胞凋亡等方法检测肾癌细胞对索拉非尼敏感性的变化。
  7.将稳定过表达ANGPTL3的OS-RC-2细胞注射于裸鼠皮下构建皮下荷瘤模型。裸鼠予以索拉非尼灌胃(80mg/kg/day)模拟临床给药。每周测量肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线,并通过小动物活体成像检测肿瘤大小。
  8.使用人类蛋白组芯片筛选和ANGPTL3结合的蛋白,并通过siRNA缩小筛选范围,最后用蛋白质免疫共沉淀和激光共聚焦验证获得与ANGPTL3相结合的蛋白。并通过构建ANGPTL3的截短体明确ANGPTL3发挥作用的结构域。
  9.利用Rescue方法,证明上述筛选的蛋白在ANGPTL3促进肾癌索拉非尼敏感性过程中发挥作用,并进一步明确其介导调控肾癌索拉非尼敏感性的具体机制。
  结果:
  1.肾癌细胞株中ANGPTL3和ANGPTL7的mRNA表达量与索拉非尼对肾癌的半数抑制量相关。
  2.小样本的肾癌组织筛选发现ANGPTL3的mRNA表达量和肾癌索拉非尼耐药性相关。结合1的结果发现ANGPTL3和肾癌索拉非尼耐药性可能有关,于是选择ANGPTL3作为进一步的研究对象。
  3.扩大样本量验证上述结论:在对索拉非尼耐药的组织和细胞系中ANGPTL3低表达,而在对索拉非尼敏感的组织和细胞系中ANGPTL3高表达。
  4.蛋白水平的验证同样证实ANGPTL3表达量和肾癌索拉非尼敏感性相关。ANGPTL3的表达量和预后相关:ANGPTL3高表达组中,服用索拉非尼的肾癌病人预后要好于未服用索拉非尼的肾癌病人;但是ANGPTL3低表达组中服用索拉非尼无效。
  5.敲低ANGPTL3后肾癌细胞对索拉非尼的敏感性下降:IC50升高,凋亡减少。
  6.过表达ANGPTL3提高肾癌细胞对索拉非尼的敏感性:IC50降低,凋亡增加。
  7.体外实验证实过表达ANGPTL3提高肾癌细胞对索拉非尼的敏感性:过表达ANGPTL3的肾癌移植瘤在索拉非尼作用下肿瘤生长更慢。
  8.ANGPTL3的FBG-like结构域和Focal adhesion kinase(FAK)相互结合。
  9.过表达FAK可以促进肾癌细胞对索拉非尼的耐药,而过表达ANGPTL3可以逆转此效应。敲低ANGPTL3可以提高肾癌细胞对索拉非尼的耐药性,同时敲低FAK可以抵消此效应,而使用FAK的激酶抑制剂PF-562271则并不能逆转ANGPTL3敲低所导致的耐药性提高。进一步研究发现索拉非尼可以抑制FAK的磷酸化,并且促进FAK的入核,进而导致了p53的降解;而过表达ANGPTL3可以抑制FAK的入核,从而抑制p53的泛素化降解,提高p53的表达量。
  结论:
  ANGPTL3在肾癌索拉非尼敏感的组织中高表达,在索拉非尼耐药的组织中低表达,并且索拉非尼在治疗ANGPTL3高表达的肾癌时有着较好的疗效。在索拉非尼作用下FAK进入细胞核促进p53的泛素化降解,导致细胞的耐药;ANGPTL3通过结合FAK,影响了FAK的入核,抑制了p53的泛素化,从而促使p53保持在一个较高的水平,促进了细胞的凋亡等过程,提高了索拉非尼的治疗效果。因此,ANGPTL3可能作为预测肾癌索拉非尼敏感性的生物学标志物,其下游FAK的入核以及p53的泛素化降解也有望成为肾癌靶向治疗的新靶点,有着较好的临床转化前景。
[硕士论文] 楼棪
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨转移是乳腺癌患者肿瘤发展的终末期。多达70%的BC患者在尸体解剖时可见骨转移灶。骨转移病灶主要是溶骨性的,因为BC细胞可以调节骨肿瘤微环境。乳腺癌细胞分泌的细胞因子可以进一步促进破骨细胞分化成熟,促进破骨活动,破骨细胞活动增强可释放更多的因子刺激乳腺癌细胞,进一步促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,进一步促进转移病灶的发展。形成一个“恶性循环”。目前治疗BC骨转移的策略主要集中在打破这种“恶性溶骨循环”。绝大多数乳腺癌产生溶骨性骨转移。该过程的特征在于过度活化的破骨细胞形成和随后的骨破坏。BC细胞在定植于骨之后,甚至之前,可形成一个复杂的多基因程序性“恶性溶骨循环”,重塑骨微环境,促进癌症发展。IL-6,PTHRP(甲状旁腺激素相关蛋白)和TNFα(肿瘤坏死因子α)等BC细胞分泌的细胞因子可刺激成骨细胞,上调RANKL/OPG(骨保护素)比例,从而进一步刺激髓系破骨细胞前体细胞的分化。同时其他细胞因子如IL-11(白细胞介素11)和OPN(骨桥蛋白)也能直接促进其向破骨细胞分化。活化的破骨细胞降解骨基质,并释放主要储存在骨基质中的TGFβ(转化生长因子β),BMPs(骨形态发生蛋白)和IGFs(胰岛素样生长因子),反过来,促进BC进展。
  有研究已经证明了乳腺癌细胞系中PAF及其受体PTAFR的表达。在肿瘤微环境中,PAF由浸润的炎症细胞和肿瘤细胞本身分泌和积累,形成自分泌循环。PTAFR是G蛋白偶联受体(GPCR)。PAF/PTAFR信号通路激活导致复杂的细胞反应,包括细胞运动的增加,IL-6(白细胞介素6)和MMP(基质金属蛋白酶)表达的上调以及NF-κB信号的激活。迁移能力的增加是癌细胞形成转移性病变的重要特征,包括骨转移。已发表的文献和我们的结果都揭示了PAF处理后乳腺癌细胞的迁移能力增加。
  在本实验中,我们首先通过生物信息学分析提供了PAF/PTAFR信号通路在调节BC骨转移和破骨细胞生成中起重要作用的线索。
  在目前的研究中,我们证明PAF可以促进BC细胞迁移并诱导BMMs分化。海风藤酮可以减弱这两个过程,并且表现出很小的细胞毒性,可以被认为是BC骨转移的潜在治疗剂。与“恶性溶骨循环”相比,PAF能够通过两种平行方式促进BMMs分化为破骨细胞。一方面,PAF能刺激BC细胞上调IL-6,IL-11,MMPs和NF-κB等下游信号,进一步激活破骨细胞生成。另一方面,PAF也可以直接激活BMMs分化成破骨细胞。另一方面,PAF也可以直接激活BMMs分化成破骨细胞。在目前的研究中,我们证明了海风藤酮可以抑制BC诱导或PAF直接刺激破骨细胞生成。海风藤酮处理后破骨细胞分化标记的表达均下调。这个过程主要是由于NF-κB激活的抑制。
  总之,海风藤酮可能是一种有效的策略,通过阻断PAF/PTAFR信号通路,减弱乳腺癌形成的溶骨性骨转移。
[硕士论文] 夏清明
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:前列腺癌是目前西方发达国家中男性肿瘤发病率和死亡率最常见的肿瘤之一。近年来我国前列腺癌发病率也在逐年攀升。雄激素剥夺治疗一直以来是前列腺癌最经典的治疗方式,但随着治疗的前行,前列癌晚期几乎都会发展为雄激素非依赖性,传统的治疗方式对雄激素非依赖性前列腺癌疗效不佳。肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤的一种新型治疗手段,在肿瘤临床治疗上已取得了较好的疗效。本课题选用含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的脱氧核寡核苷酸(Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs,CpG ODN)免疫激活剂,通过穿膜肽修饰的多壁碳纳米管为介导,研究其抗雄激素非依赖性前列腺癌的体内外作用。
  本课题第一部分报道了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体的构建和表征。通过多肽固相合成法合成含有3个组氨酸和6个精氨酸的多肽H3R6,利用制备液相进行纯化以及高效液相色谱和质谱进行纯度分析,检测其纯度符合实验要求。用浓硫酸和浓硝酸对多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)进行羧基化,然后再和多肽反应形成载体MHR。利用核磁共振氢谱,红外光谱、透射电镜和热比重分析鉴定复合物合成成功。利用MHR载体中精氨酸富含正电荷,CpG是核酸类物质带负电荷,通过静电作用形MHR/CpG纳米复合物。在N/P=6时,MHR载体能够有效负载CpG免疫激活剂,当N/P=20时电位处于一个较稳定的状态,电位约=25±2.62mV。通过HEK293转染实验,得出MHR载体在N/P=20转染效率较高。
  本课题第二部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂进行体外细胞学评价,RAW264.7细胞明显对负载CpG纳米免疫制有较高的摄取,CpG能够和胞内内吞体膜上的TLR9受体结合。CCK8细胞毒性实验中,MHR载体对DU145、RM-1和RAW264.7细胞的毒性较低。体外免疫活性ELISA和PCR实验结果显示,MHR/CpG对RAW264.7细胞刺激促进IL-6和TNF-α促炎因子的分泌明显高于单体CpG组,和LPS(10ng/ml)刺激效应具有可比性。
  本课题第三部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂体内的抗前列腺癌效应和免疫活性。我们成功构建了DU145前列腺癌BALB/c裸鼠和RM-1前列腺癌BALB/c小鼠模型,通过小动物活体成像系统观察结果显示,MHR/CpG可以有效的在肿瘤和肿瘤引流淋巴结部位蓄积,有靶向效果。体内药效结果表明MHR/CpG对前列腺癌的增殖有较强的抑制作用,从小鼠脾脏淋巴细胞流式分析看出MHR/CpG可以在体内有效刺激CD4和CD8T细胞的分化增殖。同时从小鼠的肾脏和肺肺脏的HE染色图看出,MHR/CpG的体内用药安全性较高。
  本课题成功构建了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体,为去势抵抗性前列腺癌治疗提供了新策略,同时也为其它肿瘤的治疗提供了好的参考和借鉴。
[硕士论文] 王卫平
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  临床上mTOR抑制剂应用于多种肿瘤的治疗,以依维莫司在转移性肾癌治疗中的应用较为广泛。但实际应用中疗效个体差异较大,耐药现象较为常见,大大限制了其疗效。在mTOR抑制剂耐药机制中,肿瘤的遗传学改变与之关系密切。现有相关研究多局限于从有限差异疗效病例中寻找耐药相关基因靶点,尚缺乏从全基因组水平评估基因的功能改变与mTOR抑制剂药敏之间相关性。而CRISPR/Cas9技术的发展应用为研究基因功能提供了巨大的便捷。将采用CRISPR/Cas9文库筛选的方法,从全基因组水平筛选mTOR抑制剂耐药相关靶点,并进行靶点功能验证及临床相关性分析,以期为逆转mTOR抑制剂耐药提供新的理论和依据。
  方法:
  1、通过质粒文库扩增、病毒文库制备、筛选条件摸索、耐药筛选等过程建立肾癌依维莫司耐药靶点CRISPR/Cas9筛选模型,并进行高通量测序。
  2、利用MAGeCK等一系列生物信息学方法,进行测序数据的质控和分析,结合体外耐药细胞株转录组测序分析,筛选若干潜在耐药靶点;
  3、利用CRISPR敲除、质粒转染方法,结合药敏实验、平板克隆和凋亡实验等,对靶点进行进一步的功能验证;
  4、利用实时定量PCR的方法,在接受依维莫司治疗的肾癌组织标本中验证耐药靶点表达水平与临床疗效的相关性;
  5、利用组织芯片的方法,结合临床数据库数据,分析新型靶点在评价肾癌预后中的临床价值。
  结果:
  通过CRISPR/Cas9耐药基因筛选、生信分析、临床疗效相关性分析以及药敏功能验证,发现,靶向敲除MAGIX后能够介导肾癌依维莫司耐药,而过表达则能逆转该过程。较正常肾癌细胞肾,在同样浓度依维莫司作用下,靶向敲除MAGIX后,细胞克隆形成能力明显增强,而凋亡细胞比例明显减少。同时,组织芯片分析和TCGA数据库分析发现,在肾癌患者整体人群中,MAGIX表达水平越低提示患者预后越差。
  结论:
  MAGIX的差异表达水平与肾癌依维莫司治疗药物反应性相关,可作为指导肾癌依维莫司个体化治疗的生物标记物。在临床病理标本中发现,MAGIX在依维莫司耐药组中表达水平低于敏感组。此外,MAGIX的低表达提示肾癌患者预后差,具有预测肾癌预后的潜在临床价值,相关作用机制尚需进一步探讨明确。
[硕士论文] 沈吉子
妇产科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  通过对妊娠滋养细胞疾病患者的临床资料进行回顾性分析,研究分析可能影响疾病预后的相关因素,总结临床诊治经验和不足。
  研究方法:
  1.回顾性分析2009~2016年海军军医大学附属第一医院妇产科收治的55例妊娠滋养细胞疾病病历资料,滋养细胞肿瘤按妊娠滋养细胞肿瘤解剖学2015FIGO分期及FIGO/WHO预后评分系统进行分组、评分。
  2.用卡方检验分析葡萄胎患者清宫次数与血HCG转阴时间的关系;
  3.用卡方检验分析妊娠滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic neoplasiaGTN)患者单纯化疗、化疗联合手术治疗对血HCG转阴时间的影响;
  4.统计分析低危组及高危组妊娠滋养细胞肿瘤(GTN)患者初治采用不同化疗方案的治疗效果;
  5.用Kaplan Meier生存分析及Cox回归分析GTN患者临床特征与治愈时间的关系;
  研究结果:
  1.比较葡萄胎患者清宫1次与清宫2~3次的血HCG转阴时间,清宫1次者血HCG在4周内转阴者有1例,>4周转阴者为10例。而清宫2~3次组中有2例在4周内转阴,余13例均>4周趋于阴性,两者差异无统计学意义(P=0.453,P>0.05)。
  2.比较GTN患者单纯化疗及化疗+手术治疗患者的血HCG转阴时间,单纯化疗患者中血HCG转阴时间≤4周7例,>4周8例,而化疗+手术患者血HCG转阴≤4周4例,>4周7例,两组差异无统计学意义(P=0.599,P>0.05)。
  3.低危组初治治疗采用单药方案有效率为66.7%(2/3),多药联合有效率为100%(7/7)。高危组GTN化疗患者初治治疗采用单药有效率为75%(3/4),联合用药有效率为83.3%(10/12)。
  4.Cox回归单因素分析发现足月产史、流产史与化疗完全缓解时间有关(均P<0.05),年龄接近有统计学意义(P=0.051);多因素分析显示足月产史(P=0.020)是影响GTN化疗完全缓解时间的独立因素。Kaplan-Meier生存分析发现GTN化疗完全缓解时间与年龄(P=0.043)、足月产史(P=0.016)、流产史(P=0.026)有关。
  5.除外年龄>40岁且无生育要求的患者后,葡萄胎患者治疗后再次妊娠率为31.8%,GTN患者的再次妊娠率为6.9%,均为化疗后患者。
  研究结论:
  1.增加清宫次数并不能缩短血HCG的转阴时间,故葡萄胎患者一经诊断及时行清宫术,但如果没有持续性出血,一般不必要行二次清宫。
  2.手术联合化疗与单纯化疗相比并不能显著缩短GTN患者血HCG转阴时间,故GTN患者仍首选化疗,手术可能会对部分患者有益,但不适用于全部患者,临床上需严格掌握手术指征。
  3.对于年龄大、有过足月产史及流产史的妇女化疗完全缓解时间较无以上危险因素患者时间长。治疗期间及治疗后需密切监测血HCG的动态变化,避免耐药及复发影响预后。
  4.妊娠滋养细胞肿瘤患者症状不典型,临床表现形式多样,除考虑妊娠相关疾病外,要警惕妊娠滋养细胞疾病,避免漏诊、误诊。
  5.不足:本研究为回顾性分析,病例数少,部分化疗不规范,有可能影响统计分析,结果需进一步扩大样本量分析验证。
[硕士论文] 戴利和
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  在中国,膀胱癌(Bladder cancer,BC)发病率居泌尿系统恶性肿瘤之首。依据生长方式的不同,膀胱癌可以分为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),前者占初诊膀胱癌患者的70%左右,主要采用经尿道膀胱恶性肿瘤电切术(TURBT),5年生存率达90%,NMIBC患者术后易复发进展,约15%术后会进展为MIBC,患者预后变差;后者占30%左右,主要采用根治性膀胱切除术,术后约50%发生转移,发生转移后5年生产率仅为5%。膀胱癌侵袭进展对人类健康造成很大的威胁,明确膀胱癌侵袭进展的机制,对改进膀胱癌现有治疗和预后判断具有重要作用。
  癌蛋白Gankyrin在众多恶性肿瘤的形成中发挥促癌作用。Gankyrin最初在肝癌研究中被发现,近来研究表明Gankyrin在结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肺癌和食道癌等多种恶性肿瘤发挥促癌作用,且与肿瘤恶性程度有关。目前,Gankyrin在膀胱癌发生、发展中的具体作用和分子机制尚未明确。
  前期对10例膀胱癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织进行转录组测序,结果显示Gankyrin在膀胱癌组织中表达高于癌旁正常组织,根据膀胱癌经典分子起源学说及最新膀胱癌组织高通量测序结果,P53信号通路与膀胱癌侵袭性高度相关,而根据文献检索,Gankyrin为P53分子的上游调控分子,因此推测Gankyrin在膀胱癌的侵袭进展过程中发挥重要作用。
  目的:
  研究Gankyrin在膀胱癌中的表达情况,探讨其在膀胱癌侵袭进展中的作用及机制,以期为膀胱癌靶向治疗和预后判断提供新依据。
  方法:
  1.对10对膀胱癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织进行转录组测序,根据膀胱癌发生分子机制假说及文献报道,筛选出Gankyrin作为研究对象。
  2.提取90对膀胱癌组织及癌旁正常组织的RNA及20对膀胱癌组织及癌旁正常组织的总蛋白,分别通过qRT-PCR和western blot验证Gankyrin在膀胱癌中的表达情况。
  3.通过公共数据库Oncomine挖掘数据,验证Gankyrin在膀胱癌患者的肿瘤组织中存在高表达。
  4.通过免疫组化,对3例肌层浸润性膀胱癌病理大切片行Gankyrin染色,分析肿瘤侵犯粘膜层、浅肌层、深肌层时的表达情况,研究其和膀胱癌侵袭性的关系;分析130例膀胱癌患者肿瘤组织中Gankyrin的表达量,探讨其与膀胱癌临床病理资料和预后的关系。
  5.通过western blot和qRT-PCR检测Gankyrin在正常尿路上皮、2种非肌层浸润性膀胱癌、2种肌层浸润性膀胱癌细胞系中的表达量。
  6.利用慢病毒载体构建Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞系和Gankyrin稳定敲减的UMUC3细胞系,通过EdU细胞增殖试验和NOD/SCID小鼠的皮下成瘤实验,研究Gankyrin过表达和敲低对膀胱癌细胞增殖、成瘤能力的影响。通过细胞划痕实验和Transwell小室迁移侵袭实验,检测Gankyrin对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响。通过流式细胞术检测Gankyrin对膀胱癌细胞凋亡的影响。
  7.利用BBN诱导小鼠自发产生膀胱癌,通过免疫组化检测Gankyrin在小鼠自发膀胱癌模型中的表达情况并探讨其意义。
  8.通过连续切片免疫组化染色,分析32例膀胱癌组织中Gankyrin和MDM2表达的相关性,利用western blot检测Gankyrin过表达和敲低后MDM2的表达水平,通过免疫荧光检测Gankyrin和MDM2在膀胱癌中的亚细胞定位,利用蛋白免疫共沉淀检测Gankyrin与MDM2在膀胱癌中的相互作用,以探讨Gankyrin调控膀胱癌侵袭进展的可能机制。
  结果:
  1.转录组测序结果表明Gankyrin表达量在9例膀胱癌组织中高于对应癌旁正常尿路上皮组织,对10对癌及癌旁组织RPKM值进行统计分析,Gankyrin在膀胱癌组织中表达显著上调(P<0.05),差异表达倍数为1.21倍。
  2.通过qRT-PCR检测90例膀胱癌患者中Gankyrin mRNA的表达情况,发现其中66例患者肿瘤组织中Gankyrin mRNA表达量高于癌旁正常组织,24例患者中肿瘤组织Gankyrin表达量低于癌旁组织,Gankyrin高表达比例为73.3%。对20对膀胱癌组织及癌旁正常组织进行western blot检测,发现其中17例样本的肿瘤组织中Gankyrin蛋白的表达量明显高于癌旁正常组织。
  3.公共数据库Oncomine检索发现Dyrskjot Bladder3数据集中,Gankyrin mRNA在膀胱癌患者肿瘤组织中的表达含量高于正常尿路上皮组织(P<0.01)。
  4.在3例膀胱癌病理大切片中,Gankyrin表达量从粘膜、浅肌层到深肌层逐渐升高;130例免疫组化的结果显示,Gankyrin表达量在肌层浸润性膀胱癌中显著高于非肌层浸润性膀胱癌(P<0.01)、在高级别膀胱癌组织中显著高于低级别组织(P<0.01),Gankyrin高表达患者总体生存期、疾病特异性生存期和无进展生存期显著低于低表达患者(均P<0.001),多因素分析显示,Gankyrin为膀胱癌不良预后的独立危险因素。
  5.western blot和qRT-PCR结果显示,Gankyrin在膀胱癌细胞系中的表达量高于正常尿路上皮细胞系,Gankyrin在NMIBC细胞系BIU87和SW780中表达量低,而在MIBC细胞系UMUC3和J82中存在高表达。
  6.成功构建Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞株和Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞株,EdU细胞增殖实验表明Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞增殖能力显著强于对照组(P<0.01),而Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞的增殖能力显著降低(P<0.001);Gankyrin稳定过表达后的BIU87细胞小鼠皮下肿瘤增殖能力明显强于对照组(P<0.001),而Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞小鼠皮下肿瘤增殖能力显著弱于对照组(P<0.001);划痕实验和Transwell小室迁移实验显示,Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞迁移能力显著增强,Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞迁移能力显著下降;Transwell小室侵袭实验显示,Gankyrin过表达可显著增强膀胱癌细胞的侵袭能力,而Gankyrin敲低可显著抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。流式细胞术检测结果显示Gankyring过表达或敲低并不影响BIU87或UMUC3细胞的凋亡。
  7.成功利用BBN诱导小鼠自发形成膀胱癌,免疫组化结果显示,Gankyrin在膀胱癌中的表达量高于正常尿路上皮组织,在NMIBC、MIBC及肺转移组织中表达量逐渐升高。
  8.32例膀胱癌连续切片免疫组化显示,Gankyrin和MDM2呈正相关(R=0.583,P<0.001)。上调BIU87细胞Gankyrin表达量,MDM2表达相应上调,下调UMUC3细胞Gankyrin表达量,MDM2表达相应下调,免疫荧光显示Gankyrin和MDM2在BIU87细胞及膀胱癌组织中存在共定位,蛋白免疫共沉淀显示Gankyrin和MDM2在BIU87细胞中相互结合。
  结论:
  癌蛋白Gankyrin在膀胱癌组织中显著上调,Gankyrin的表达水平升高与膀胱癌的分期分级升高密切相关,且是膀胱癌不良预后的独立危险因素。上调Gankyrin的表达可以增强膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,下调Gankyrin的表达显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Gankyrin在膀胱癌中与MDM2直接结合,为调控膀胱癌侵袭进展的潜在分子机制。
[硕士论文] 吉应征
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,在全球肿瘤致死性疾病中位居第二,近年来其发病率不断上升。乳腺癌最常见的转移部位是骨,乳腺癌骨转移患者在晚期会发生骨痛、病理性骨折、神经压迫等骨相关症状,严重影响患者生存质量和预后。乳腺癌的骨转移是一个复杂的过程,目前针对乳腺癌骨转移尚没有特效的药物治疗方法。找到可以预防和治疗骨转移的靶点成为肿瘤治疗的首要任务。
  KISS1基因是是1996年由Lee JH等在恶性黑色素瘤细胞中作为抑癌基因发现的,1997年,Lee JH等再次报道了KISS1转染人乳腺癌MDA-MB-435细胞对细胞转移的抑制作用。KISS1基因编码含145个氨基酸的肽链,可水解成不同长度的肽片段,总称为Kisspeptins,其中Kisspeptins-10(KP-10)是最短且活性最强的多肽。
  Kisspeptins的受体被命名为GPR54,和大多数的G蛋白偶联受体一样,GPR54由398个氨基酸组成,形成7次跨膜结构。G蛋白偶联受体是目前市场上许多药物的治疗靶点。研究KISS1/GPR54在乳腺癌骨转移过程中的作用机制有可能为治疗乳腺癌骨转移找到一个靶点。
  方法:
  在该实验中,通过对从癌症基因组图谱数据库(TCGA)获得的大量的乳腺癌患者样本数据进行生物信息学分析,发现了在Luminal型乳腺癌中GPR54的表达明显升高。对来自TCGA的乳腺癌样本数据中ER,PR,Her2的表达情况进行分类对比,并对取自临床的118例原发性乳腺癌标本进行免疫组化染色方法检测GPR54的表达情况,结果表明ER、PR阳性与GPR54的表达高度相关。同时对乳腺癌骨转移和原发乳腺癌标本中进行GPR54免疫组化染色对比,发现乳腺癌骨转移标本中GPR54高度表达所占比例比原发乳腺癌标本中的更高。GPR54的这种表达情况表明GPR54可能是乳腺癌,尤其是Luminal型乳腺癌骨转移的潜在治疗靶点。
  培养不同的乳腺癌细胞并利用蛋白免疫印迹实验发现GPR54在BT474细胞中高表达,因此选用BT474细胞进行下一步细胞和动物实验。在Transwell细胞迁移试验中,KP-10对乳腺癌BT474细胞的迁移具有明显的促进作用。利用小鼠单核细胞破骨细胞分化模型发现Kp-10可以促进乳腺癌细胞诱导的破骨细胞分化。利用不同浓度的Kp-10刺激培养的BT474细胞发现,Kp-10可以促进乳腺癌骨转移协同基因OPN,MMP1,CTGF,IL-11,RANKL的表达。
  进一步利用小鼠左心室注射模型和胫骨注射模型进行动物体内实验,通过注射BT474细胞,尾静脉注射Kp-10,并进行生物发光分析及胫骨X线摄片及Micro CT三维重建,结果显示Kp-10可以明显的促进乳腺癌细胞BT474的骨转移和骨破坏。
  结果与结论:
  发现了GPR54在Luminal型乳腺癌高表达,与ER、PR阳性表达正相关,GPR54高表达于乳腺癌骨转移患者。通过实验证实了Kp-10可以促进乳腺癌细胞BT474的迁移和促进乳腺癌细胞诱导的破骨细胞分化,以及KP-10可以促进BT474细胞转移协同基因OPN,MMP1,CTGF,IL-11,RANKL的表达。通过小鼠左心室乳腺癌细胞注射骨转移模型和骨髓腔乳腺癌细胞注射模型证实了Kp-10可以明显的促进小鼠体内乳腺癌细胞BT474的骨转移和引起的骨破坏。提示有可能通过控制或调整KISS1基因的表达来治疗Lumianl型乳腺癌的骨转移和骨破坏作用。
[博士论文] 李骁
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:越来越多的断层扫描检查导致偶然发现的小肾肿瘤(small renal masses,SRMs)日益增加,这些小肾肿瘤已成为很常见的临床问题。目前小肾肿瘤的定义为影像检查中最大直径不超过4cm的强化肿瘤。这些小肾肿瘤中80%为肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC),从临床角度出发,最重要的有三种肾细胞癌:肾透明细胞癌(clear cell RCC,ccRCC)最多见,占肾细胞癌总数的80-90%;乳头状肾细胞癌(papillary RCC,pRCC),可分为Ⅰ型和Ⅱ型,占肾细胞癌总数的10-15%;肾嫌色细胞癌(chromophobe RCC,chRCC),占肾细胞癌总数的4-5%。余下的20%小肾肿瘤为良性肿瘤,其中肾血管平滑肌脂肪瘤(angiomyolipoma,AML)最常见。当影像检查偶然发现小肾肿瘤时,对临床的挑战包括肾脏良恶性肿瘤之间的鉴别以及肾脏恶性肿瘤的最佳治疗选择。传统的肾脏肿瘤影像检查方法包括超声检查,电子计算机断层扫描(computed tomography,CT)检查以及核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)检查。大多数的肾脏肿瘤可以通过影像学检查正确诊断,但是CT和MRI并不能可靠地鉴别乏脂肪AML(fat-poor angiomyolipoma,fp-AML)和肾脏恶性肿瘤,同时也无法预测肾脏恶性肿瘤的生物学侵袭性。肾脏穿刺活检术在一定程度上可以认为是鉴别诊断肾脏肿瘤组织学类型的金标准,但其作为有创检查,可能会对患者造成一定程度的危险并增加患者额外的经济负担。考虑到目前传统影像学检查方法和肾脏活检穿刺术的局限性,开发一种全新的能够准确且无创的对肾脏肿瘤病理组织学类型进行预测的技术将具有很大的临床价值。
  深度学习,作为机器学习的一个分支,最近在计算机视觉、图像分类、语音识别、自然语言处理和游戏开发等多个领域取得了显著的进步。卷积神经网络是深度学习方法中最典型的人工神经网络系统,它的架构由许多“层”组成,每层有大量类似神经元的节点相连接。众所周知,卷积神经网络中的卷积层中有多种类型的卷积核,它对图像特征的识别极其有效。传统的机器学习算法在学习之前需要先从图像中提取特征,而深度学习中卷积层是在学习过程中自动挖掘图像数据的特征。因此,同传统的机器学习受限于人类特定领域知识设计的手工特征不一样的是,基于卷积神经网络的深度学习方法能够使用图像本身包含的所有信息,这是深度学习方法的核心优势。通过这种学习方式,基于卷积神经网络的深度学习方法很快被医学影像领域所采用,并应用在分类,探测和分割等多种影像学图像处理任务中。因此这一方法具备在动态增强CT图像上鉴别肾脏肿瘤病理分类的潜能。
  第一部分 基于MSCT的深度卷积神经网络鉴别乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌
  目的:使用基于卷积神经网络的深度学习方法,通过四期动态增强CT图像,构建卷积神经网络模型用于鉴别乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌,并评价模型的性能。
  方法:这一回顾性单中心研究由医院伦理委员会批准。所有乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌患者均在我院病理科电子档案库中查询得到,时间为2013年1月至2017年7月。共200位患者纳入研究中,其中包括42名乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤患者,158名肾癌患者。这200位患者由124位男性患者与76位女性患者组成,平均年龄55.07岁,年龄范围20-83岁。所有患者均使用设备320排容积CT进行肾脏四期规范化扫描,流程包括:平扫期、皮髓质期、实质期和排泄期。
  预处理的第一步就是对每张CT图像中的肿瘤区域进行分割以及分割后的非肿瘤区域的背景去除。该研究采用人工的肿瘤整体分割法,所有患者的分割工作由一位影像科医师进行,该医师对所有患者信息均不知情。平扫图像上的肾脏肿瘤边界由该医师与另外一名医师使用相应层面的三期增强图像共同商量后决定。所有去除非肿瘤背景后的肿瘤图像将用于卷积神经网络模型的构建。200位患者的12317张分割图像(平扫期786张,皮髓质期3854张,实质期3900张,排泄期3777张)用于实验研究。预处理的第二步是在上一步得到的肿瘤分割图像中截取肿瘤部分,将图像改为96×96像素大小。第三步是将所有图像整理放入文件夹中,六个文件夹分别对应平扫期、皮髓质期、实质期、排泄期、后三期合并和四期合并。每个文件夹下设两个训练用子文件夹包含小肾肿瘤的两种不同类别。这两个文件分别命名为:0(所有fp-AML的图像),1(所有RCC的图像)。
  论文中构建的卷积神经网络包括十一层,其中四个卷积层,每一个卷积层后面紧跟一个最大池化层即四个最大池化层,最后面三层为一个扁平层和两个全连接层。模型建立过程包含两个阶段:训练阶段,采用十折交叉验证的方法,采用有监督的基于卷积神经网络模型的深度学习方法,类别作为学习数据;测试阶段,采用未用于训练的剩余数据作为测试集,用以评价模型性能。应用平扫期、皮髓质期、实质期和排泄期图像单独四期期相的图像,三期增强期相的图像以及四期所有期相的图像构建出六组模型。卷积神经网络模型分别预测该图像为两种类别的概率,二者概率和为1,最终概率大者作为模型的输出结果。应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析来评估卷积神经网络模型对于鉴别乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌的诊断效能。计算受试者工作特征曲线下面积(area under curve,AUC)。六组不同模型的平均AUC值间的比较应用DeLong检验(DeLong's test)得到。P值小于0.05认为差异有统计学意义。
  结果:model unenhanced鉴别乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌的平均AUC值为0.64,95%可信区间为(95%confidence interval,CI):0.58-0.69;model corticomedullary为0.83,95%可信区间:0.81-0.85;model nephrographic为0.83,95%可信区间:0.81-0.85;model excretory为0.81,95%可信区间:0.79-0.83;model enhanced为0.85,95%可信区间:0.84-0.86;model quadruple为0.84,95%可信区间:0.83-0.85。
  结论:除model unenhanced外,其余五组卷积神经网络模型能够稳健的鉴别出乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌,接下来的研究可以应用这个方法去鉴别其它良性肿瘤与肾癌。
  第二部分 基于MSCT的深度卷积神经网络预测肾透明细胞癌Fuhrman分级
  目的:使用基于卷积神经网络的深度学习方法,通过四期动态增强CT图像,构建预测T1a期肾透明细胞癌病理分级的卷积神经网络模型,并评价诊断模型的性能。
  方法:这一回顾性单中心研究由医院伦理委员会批准。所有肾透明细胞癌患者均在我院病理科电子档案库中查询得到,时间为2013年1月至2017年7月。共97位患者纳入研究,由72位男性患者与25位女性患者组成,其中69例低级别肾透明细胞癌;28例高级别肾透明细胞癌。这97位患者平均年龄55.64岁,年龄范围28-83岁。所有患者均使用设备320排容积CT进行肾脏四期规范化扫描,流程包括:平扫期、皮髓质期、实质期和排泄期。
  预处理的第一步分割与第二步方法同第一部分一致。97位患者的4936张分割图像(平扫期390张,皮髓质期1499张,实质期1547张,排泄期1500张)用于实验研究。第三步是将所有图像整理放入文件夹中,六个文件夹分别对应平扫期、皮髓质期、实质期、排泄期、后三期合并和四期合并。每个文件夹下设两个训练用子文件夹包含肾透明细胞癌的两种不同类别。这两个文件分别命名为:0(所有低级别ccRCC的图像),1(所有高级别ccRCC的图像)。
  论文中构建的卷积神经网络包括十二层,其中四个卷积层,每一个卷积层后面紧跟一个最大池化层即四个最大池化层,最后面四层为一个扁平层和三个全连接层,模型建立过程同第一部分一致。卷积神经网络模型分别预测该图像为两种类别的概率,二者概率和为1,最终概率大者作为模型的输出结果。应用ROC曲线分析来评估卷积神经网络模型对于鉴别T1a期肾透明细胞癌病理分级的诊断效能。计算AUC值。六组不同模型的平均AUC值间的比较应用DeLong检验(DeLong's test)得到。P值小于0.05认为差异有统计学意义。
  结果:模型unenhanced鉴别肾透明细胞癌病理分级的平均AUC值为0.55,95%可信区间为:0.49-0.61;模型corticomedullary为0.77,95%可信区间:0.74-0.79;模型nephrographic为0.76,95%可信区间:0.74-0.79;模型excretory为0.69,95%可信区间:0.66-0.72;模型enhanced为0.78,95%可信区间:0.76-0.79;模型quadruple为0.75,95%可信区间:0.74-0.77。
  结论:我们的结果表明除模型unenhanced外,其余五组卷积神经网络模型或许能够用于区分高低级别的T1a期肾透明细胞癌。这一结果需要在更大规模数据集上的得到验证后才能用于临床。
[硕士论文] 石伟林
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  表没食子儿茶素表没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶中含量最丰富的成份,前期研究报道,EGCG具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用,但其具体的作用机制还不明确。本研究旨在探讨EGCG抑制乳腺癌细胞迁移及炎症反应的分子机制,为EGCG的进一步开发及其在乳腺癌临床防治中的应用提供科学依据。
  方法:
  1.研究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响
  用不同浓度的EGCG(5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)分别处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,分别在24h、48h、72h采用Alarmar blue染色法检测细胞活性,确定EGCG最适的作用浓度和时间。按照上述实验确定EGCG作用于乳腺癌细胞的合适浓度和时间,依次处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,进行划痕和Transwell实验,进而探究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响。
  2.EGCG影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达
  EGCG处理乳腺癌细胞后,通过RT-qPCR和Western blot方法分别在mRNA水平和蛋白水平检测迁移相关基因E-cadherin、Vimentin的表达水平,同时检测肿瘤抑制基因SCUBE2的表达变化,分析SCUBE2与迁移相关基因表达的关系。
  3.证明EGCG是通过影响SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移
  首先,利用免疫组化技术,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2的蛋白表达水平,确定SCUBE2与乳腺癌发生发展的关系;然后,构建SCUBE2基因的shRNA重组慢病毒载体,筛选得到干扰SCUBE2的稳转乳腺癌细胞系,检测干扰SCUBE2对E-cadherin和Vimentin基因表达的影响;最后,EGCG处理敲降SCUBE2的稳转细胞,采用划痕和Transwell实验检测其对细胞迁移的影响。
  4.确定EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区DNA甲基化实现的
  利用重亚硫酸盐处理及克隆测序的方法,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2启动子区的DNA甲基化水平差异。EGCG处理乳腺癌细胞后,与对照组比较,分析SCUBE2基因启动子区甲基化程度的改变,同时通过RT-qPCR和Western blot检测E-cadherin和Vimentin基因的表达,证明EGCG能够影响SCUBE2启动子区DNA的甲基化,进而影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达。
  5.探究EGCG对乳腺癌细胞炎症因子释放的影响
  EGCG处理乳腺癌细胞后,通过ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6和MCP-1的表达水平;此外,采用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用含EGCG培养基培养,检测细胞因子的变化,分析参与EGCG抑制细胞因子释放的可能信号通路。
  结果:
  1.细胞活性检测结果显示,当EGCG浓度为20μM、作用时间达到24h时,乳腺癌细胞活力受到显著抑制(p<0.05),因此本研究随后以此条件开展实验。划痕和Transwell结果表明,EGCG能够显著抑制LPS诱导的乳腺癌细胞迁移(p<0.01)。
  2.EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用,伴随着迁移相关标志基因E-cadherin的上调和Vimentin的下调,此外,我们发现肿瘤抑制基因SCUBE2显著上调,由此我们推测SCUBE2基因可能与EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用有关。
  3.免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,SCUBE2在乳腺癌组织中的表达明显降低,说明SCUBE2的低表达能够促进肿瘤的发生发展。干扰SCUBE2基因后,E-cadherin的表达下调,Vimentin的表达上调,说明SCUBE2在E-cadherin和Vimentin的上游对其进行调控。用EGCG处理干扰了SCUBE2的稳转细胞系后,我们发现EGCG的抑制作用减弱,证明EGCG是通过上调SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移。
  4.SCUBE2启动子区的DNA甲基化程度在乳腺癌组织中显著高于癌旁组织(p<0.05),这与基因表达检测结果一致。EGCG处理乳腺癌细胞后,检测SCUBE2的甲基化变化,结果显示EGCG可以显著降低SCUBE2的甲基化比率(p<0.05),由此说明EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区甲基化实现的。
  5.ELISA结果显示,EGCG处理能够显著抑制炎症相关因子(IL-6和MCP-1)的表达。用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用EGCG处理,我们发现EGCG对炎症相关因子表达的调控作用与单独S3I-201处理组相比变化不显著,因此,我们推测EGCG可能通过STAT3信号通路来调控乳腺癌相关炎症因子的表达。
  结论:
  EGCG通过影响SCUBE2启动子区的甲基化水平来实现对其表达的调控,SCUBE2进而通过调节迁移相关基因(E-cadherin和Vimentin)的表达,最终抑制乳腺癌细胞迁移。此外,EGCG可能通过STAT3信号通路来抑制的乳腺癌相关炎症因子的表达。
[博士论文] 杨琦
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 前列腺癌相关细胞系及组织中环状RNA的表达谱
  目的:(1)通过高通量转录组测序的方法获取前列腺癌相关细胞系及组织中环状RNA(circRNAs)的表达谱。(2)筛选出前列腺癌相关细胞系及组织中差异表达的circRNAs。(3)对差异表达的circRNAs进行功能预测及分析。
  方法:选择3种前列腺癌相关细胞系(正常前列腺上皮细胞系RWPE-1、前列腺癌原发灶细胞系22RV1、前列腺癌骨转移细胞系PC-3)及65对前列腺癌与癌旁组织,进行高通量转录组测序,并结合生物信息学方法综合分析。
  结果:(1)3种前列腺癌相关细胞系中共识别出9,545个circRNAs,其中845个circRNAs在3种细胞系中均有表达,同时还发现了大量差异表达的circRNAs。GO功能分析和KEGG通路分析提示这些差异表达circRNAs的宿主基因具有重要的生物学功能并在许多重要的分子信号通路中发挥关键作用。(2)采用DCC、find circ和circRNA_finder这三种算法在65对前列腺癌与癌旁组织中共识别出277,122个circRNAs,其中三种算法共同识别出的circRNAs有82,797个。非监督聚类和PCA分析提示前列腺癌与癌旁组织中circRNAs的表达谱存在明显差异,其中有9个circRNAs在前列腺癌组织中表达显著上调,86个circRNAs在前列腺癌组织中表达显著下调。对这95个差异表达的circRNAs进行功能预测提示其与相应的miRNAs具有多个结合位点。
  结论:(1)circRNAs在前列腺癌相关细胞系及组织中均广泛存在,而且不同细胞系及组织之间具有显著表达差异;(2)生物信息学分析显示,前列腺癌中差异表达的circRNAs可能通过竞争性吸附miRNAs发挥相应生物学功能,或与其宿主基因一起参与前列腺癌的疾病进展,并可能具有潜在的诊断应用价值。
  第二部分 前列腺癌中差异表达环状RNA的验证及作用研究
  目的:(1)对前列腺癌相关细胞系及组织中circRNAs的测序结果进行验证。(2)结合细胞系测序及验证结果分析环状RNA-circFUT8在前列腺癌相关细胞系中的表达差异及意义;(3)结合组织测序及验证结果探讨环状RNA-circAMACR在前列腺癌诊断及进展过程中的作用及意义。
  方法:(1)选择测序结果中部分差异表达的circRNAs,采用qRT-PCR的方法分别在正常前列腺上皮细胞系与前列腺癌细胞系、前列腺癌与癌旁组织中对其进行表达量验证。(2)结合细胞系测序结果选择circFUT8(在正常前列腺上皮细胞系RWPE-1中低丰度表达,在前列腺癌原发灶细胞系22RV1和前列腺癌骨转移细胞系PC-3中表达逐渐升高)为研究对象,对其在前列腺癌细胞系与正常前列腺上皮细胞系中的表达差异进行qRT-PCR验证,并结合其宿主基因功能,分析circFUT8在前列腺癌细胞转移及雄激素非依赖转化过程中的作用及意义。(3)结合组织测序结果选择circAMACR(在前列腺癌组织中表达上调最为显著,fold change=6.19,P=1×10-13)为研究对象,对其在前列腺癌组织与癌旁组织、前列腺癌细胞系与正常前列腺上皮细胞系中的表达差异进行qRT-PCR验证,并通过siRNA干扰前列腺癌细胞中circAMACR的表达,观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响,探讨其在前列腺癌诊断及进展过程中的作用及意义。
  结果:(1)前列腺癌相关细胞系及组织中差异表达circRNAs的qRT-PCR验证结果与测序结果基本一致。(2)circFUT8在前列腺癌细胞系中的表达显著高于正常前列腺上皮细胞系,在前列腺癌转移细胞系(PC-3、DU145)中的表达显著高于前列腺癌原发灶细胞系(22RV1),在雄激素非依赖性前列腺癌细胞系(PC-3、DU145)中的表达也显著高于雄激素依赖性前列腺癌细胞系(LNCap)。(3)circAMACR在前列腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织,在前列腺癌细胞系中的表达也显著高于正常前列腺上皮细胞系。circAMACR主要表达于细胞质中,干扰前列腺癌细胞中circAMACR的表达后,细胞的增殖和迁移能力减弱。
  结论:(1)通过高通量转录组测序获取的前列腺癌相关细胞系及组织中的circRNAs表达谱是可靠的。(2)circFUT8在前列腺癌相关细胞系中具有独特的差异表达模式,可能参与了前列腺癌细胞转移及雄激素非依赖转化的生物学过程。(3)circAMACR在前列腺癌中具有肿瘤特异性并且在其进展过程中具有一定的肿瘤生物学作用。
  第三部分 环状RNA应用于前列腺癌血浆检测的初步研究
  目的:(1)提高前列腺癌患者血浆中circRNAs检测的稳定性;(2)筛选前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中qRT-PCR检测的最适内参基因数目及最适内参基因组合。(3)初步探讨circRNAs应用于前列腺癌血浆检测的临床意义。
  方法:(1)改进血浆样本总RNA提取方法,优化前列腺癌患者血浆中circRNAs检测的qRT-PCR反应条件。(2)利用前列腺癌和良性前列腺增生各10例患者的血浆样本,对β-Actin、GAPDH、18s rRNA、β2M、GUSB、HPRT1、PPIA、SDHA等8个候选内参基因进行qRT-PCR检测,并使用NormFinder和geNorm软件分析实验数据。(3)利用45例前列腺癌和30例良性前列腺增生患者的血浆样本,对组织测序结果中差异表达显著的29个circRNAs(表达上调9个,表达下调20个)进行qRT-PCR检测,并结合组织测序及验证结果进行分析。
  结果:(1)本研究实验体系下前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中qRT-PCR检测的最适内参基因数目为2个,最适内参基因组合为GAPDH和PPIA。(2)血浆qRT-PCR检测时,有9个circRNAs无扩增曲线,14个circRNAs的扩增产物电泳时无目的条带,3个circRNAs的扩增产物电泳时杂带明显,只有3个circRNAs(circAPLF、circLPAR1和circSLC45A4)在前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中稳定表达。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血浆中的总体表达水平显著低于良性前列腺增生患者,而circLPAR1在前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中的总体表达水平无显著差异。
  结论:(1)在前列腺癌患者血浆中进行circRNAs检测是可行的,但应根据具体实验体系做出适当优化。(2)GAPDH和PPIA的内参基因组合可作为均一化标准用于前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆样本的qRT-PCR检测。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血浆中稳定存在,且总体表达水平显著低于良性前列腺增生患者,提示其对于前列腺癌具有一定的诊断应用价值。
[硕士论文] 陈海虎
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 探究分段读出平面回波和单次激发平面回波成像序列对膀胱癌成像图像质量的影响
  目的:探究分段读出平面回波成像(RS-EPI)和单次激发平面回波成像(SS-EPI)序列对膀胱癌磁共振扩散加权成像(DWI)图像质量的影响。
  方法:前瞻性收集膀胱镜活检证实为膀胱癌的35例患者,均行膀胱3.0T磁共振RS-EPI和SS-EPI序列扫描。2名放射科诊断医师分别在两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检测性、运动伪影和图像模糊程度四个方面进行评分。由1名放射科诊断医师测量并计算两种DWI图像的信噪比(SNR)、对比度噪声比(CNR)、信号强度比(SIR)和表观扩散系数(ADC)值。采用Kappa检验评价2名医师评分的一致性,分别采用配对样本t检验和配对Wilcoxon秩和检验比较两种序列定性评分和定量评价指标的差异。
  结果:2名医师在RS-EPI和SS-EPI两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检出性、运动伪影和模糊程度的评分一致性较好,Kappa值分别为0.878、0.860、0.748、0.842。RS-EPI和SS-EPI的图像比较,磁敏感伪影、病灶检测性和图像模糊程度的评分差异具有统计学意义(P均<0.05),运动伪影评分无统计学差异(P>0.05),RS-EPI的图像质量明显优于SS-EPI。SS-EPI与RS-EPI序列上膀胱病变的SNR分别为96.65±51.59和85.79±43.41,CNR分别为3.54±1.26和3.91±1.21,SIR分别为5.03±1.26和5.51±1.35,ADC值分别为1239.09±253.73×10-6mm2/s和1230.16±239.60×10-6mm2/s,两者SNR和ADC值的差异无统计学意义,P值分别为0.085和0.627。两者CNR和SIR的差异具有统计学意义,P值分别为0.024和0.015。
  结论:3.0T磁共振中RS-EPI序列较SS-EPI序列明显提高了膀胱癌的DWI图像质量,且SS-EPI和RS-EPI图像中病灶ADC值无显著差异,RS-EPI序列可替代SS-EPI序列在膀胱癌的术前分期及分级中的应用并提供更高质量的诊断图像。
  第二部分 磁共振高分辨率T2WI联合分段读出平面回波成像鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的临床价值
  目的:评估磁共振高分辨率T2加权成像(HR-T2WI)、分段读出平面回波成像(RS-EPI)及两者联合鉴别非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)的临床价值。
  方法:本研究采用前瞻性研究方法,连续纳入95例膀胱镜活检证实为膀胱癌、最终行手术治疗并有明确手术病理分期的患者,均行3.0 T磁共振HR-T2WI和RS-EPI序列成像。2名放射科诊断医师分别在HR-T2WI、RS-EPI及HR-T2WI+RS-EPI上独立分析膀胱癌是否浸润肌层,以病理结果为金标准,绘制受试工作特征(ROC)曲线,计算灵敏度、特异度、准确度和AUC,并采用DeLong检验比较三种方法诊断效能的差异。
  结果:三种诊断方法在鉴别NMIBC和MIBC的诊断中,HR-T2WI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为95.5%、83.4%、88.5%和0.889; RS-EPI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为84.1%、94.1%、89.5%和0.891;HR-T2WI+RS-EPI的灵敏度、特异度为、准确度和AUC分别为93.1%、100%、96.8%和0.966。HR-T2WI联合RS-EPI的诊断效能明显优于两者单独诊断的效能。
  结论:HR-T2WI+RS-EPI可作为术前无创、精确鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的检查方法。
[硕士论文] 王晓宇
药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常见的恶性肿瘤,伴随着较高的致死率,BC的治疗引起人们的广泛关注。常规的治疗手段有手术、放疗和化疗,但是会引起各种不良反应,以及后续引发的多药耐药现象(multidrug resistance,MDR),对患者的身体健康和生活质量产生不良影响。中药治疗以其多靶点作用、辨证施治、整体调理等特点在BC的治疗过程中可以发挥重要的辅助作用,目前已经有一些中药单体或复方应用于BC临床治疗,但是仍旧主要依赖于广大医生的临床经验,发挥其抗乳腺癌药效的机制仍不清楚。因此,从中药中快速筛选出其中发挥药效的活性成分,并对其机制进行研究是十分重要的工作。
  细胞膜色谱(cell membrane chromatography,CMC)是从上世纪九十年代开始发展迅速的一种生物亲和色谱技术,以细胞膜和硅胶载体作为固定相,采用色谱分析的方法,可在体外模拟小分子化合物与细胞膜受体的相互作用过程。细胞膜色谱法将成分分离与活性筛选相结合,具有操作方便、快速稳定,灵敏度高等优点,尤其适用于中药等复杂成分体系的活性筛选。
  本课题的主要研究内容分为以下三个部分:
  1、P-gp高低表达的MCF7和MCF7/ADR全二维细胞膜色谱系统的构建
  以MCF7和MCF7/ADR两株细胞为研究对象,用流式细胞术和Western Blot方法验证MCF7细胞膜表面P-gp呈低表达水平,MCF7/ADR细胞株呈高表达水平,且无药培养两周后表达水平并没有发生显著变化。搭建了经APTES修饰的MCF7和MCF7/ADR-C18柱/TOF-MS全二维细胞膜色谱系统,同时构建硅胶色谱柱和经APTES修饰的硅胶色谱柱全二维分析系统作为参比,进行系统的有效性和专属性考察。系统有效性考察结果显示,吉非替尼在硅胶色谱柱和经APTES修饰的硅胶色谱柱上没有保留行为,但是在MCF7和MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有显著的保留行为;相应的,地塞米松在四种色谱柱上均没有表现出任何保留行为,证明该系统有效性良好。系统的专属性考察结果显示,Tariquidar在硅胶色谱柱、经APTES修饰的硅胶色谱柱和MCF7细胞膜色谱柱上没有显著的保留行为,但是MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有显著的保留行为,显示该系统有一定的专属性。可以用于筛选中药中抗乳腺癌潜在活性化合物。
  2、基于全二维乳腺癌细胞膜色谱法对中药抗乳腺癌活性成分的筛选
  首先选择了八种有抗乳腺癌作用的中药材作为对象,构建其化学成分库,制备了中药提取液,并用HPLC/TOF-MS系统对中药提取液进行了分离和分析,并且为后续的全二维分析提供第二维分离的优化条件。应用经APTES修饰-MCF7/CMC-C18/TOF-MS和经APTES修饰-MCF7/ADR/CMC-C18/TOF-MS全二维分析系统实现对八种中药中抗乳腺癌潜在活性成分的筛选,结果显示,大黄和黄芩保留成分较多,保留行为较好,因此继续以大黄和黄芩为研究对象,完成了保留成分全二维等高线图谱的绘制和TOF-MS初步鉴定结果表,并用标准品进行了验证。结果显示,大黄提取液在MCF7细胞膜色谱柱上共有14种保留成分,在MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有15种保留成分,其中在两株细胞都有保留的成分有10种,并对其中食用大黄苷、大黄酚、丹叶大黄素、大黄素甲醚、云杉鞣酚和大黄素六种成分进行了验证。黄芩提取液在MCF7细胞膜色谱柱上共有15种保留成分,在MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有14种保留成分,其中在两种细胞膜色谱柱都有保留的成分有10种,并对其中的汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A、黄芩素和汉黄芩苷五种成分进行了验证。为下一步潜在活性成分的药效验证研究和活性成分与P-gp之间关系研究奠定了良好的基础。
  3、潜在活性成分抗乳腺癌活性及其与P-gp的关系研究
  根据全二维MCF7和MCF7/ADR细胞膜色谱系统对中药大黄和黄芩的筛选结果,选择其中可获得11个化合物为对象。首先对其潜在抗乳腺癌的作用进行体外增殖抑制的药效验证,结果显示,大黄中丹叶大黄素、云杉鞣酚和大黄素,黄芩中汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A和黄芩素对MCF7和MCF7/ADR两株细胞均有一定杀伤作用,且对两株的敏感性不同。进而采用流式细胞术考察它们是否通过细胞凋亡这个途径发挥其杀伤作用。结果显示,丹叶大黄素、云杉鞣酚、汉黄芩素和黄芩素是通过凋亡途径对MCF7细胞产生杀伤作用,而其他化合物则不是。丹叶大黄素、汉黄芩素和千层纸素A是通过凋亡途径对MCF7/ADR细胞产生杀伤作用,而其他化合物则不是。之后,为了研究同一个化合物对两株细胞杀伤作用的差异是否与P-gp作用相关,考察了大黄中丹叶大黄素、云杉鞣酚和大黄素,黄芩中汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A和黄芩素对P-gp酶活的作用,结果显示黄芩苷是P-gp酶活性的抑制剂,而其他6种成分是P-gp酶活性的激动剂。进一步研究黄芩苷和P-gp之间关系,采用流式细胞术和Western blot检测不同浓度的黄芩苷对MCF7/ADR细胞中P-gp表达量的影响,结果显示黄芩苷并没有显著影响P-gp表达。黄芩苷和DOX之间的协同作用,结果显示黄芩苷可以逆转MCF7/ADR细胞对阿霉素的耐药性。
[硕士论文] 刘溪
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过研究PDLIM5在前列腺癌组织及细胞系中的表达水平,验证PDLIM5在前列腺癌中的异常高表达。筛选高表达PDLIM5细胞株进一步进行生物功能学实验,以探索PDLIM5介导肿瘤发生及转移的生物学功能及调控机制。
  方法:
  (一)PDLIM5在前列腺癌相关芯片数据库中表达分析及组织标本验证
  收集Oncomine、PROGGENE数据库中的前列腺癌样本中PDLIM5表达、转移及预后相关信息,验证PDLIM5在癌和正常腺体中的表达差异,明确高表达PDLIM5与PCa转移预后的相关性。进一步收集长征医院泌尿外科前列腺癌根治术后临床组织样本44例,运用免疫组织化学染色法检测癌和癌旁组织标本明确PDLIM5组织表达水平。
  (二)前列腺癌PDLIM5敲减细胞株筛选及构建与沉默效率验证
  在PCa常见细胞系中通过Western Blot和qPCR分析PDLIM5的表达情况,选取高表达PDLIM5的转移性PCa细胞株DU145和PC-3作为后续实验对象,构建包含靶向干扰PDLIM5的质粒的慢病毒进行细胞感染。观察质粒上的报告基因荧光强度,并分别在mRNA及蛋白水平验证PDLIM5的敲减效率,确认沉默PDLIM5的细胞株构建成功。
  (三)检测PDLIM5沉默后前列腺癌细胞株增殖、细胞周期凋亡水平变化及对侵袭转移能力影响
  在稳定沉默PDLIM5的DU145和PC-3细胞中,通过MTT比色法、克隆形成试验来评估肿瘤细胞增殖能力的变化;通过细胞流式术检测细胞周期及凋亡水平变化以明确PDLIM5敲减后对肿瘤细胞的周期阻滞及诱导凋亡作用;通过划痕愈合实验及TRANSWELL实验来检测PDLIM5对肿瘤迁移侵袭的影响。
  (四)PDLIM5对前列腺癌增殖转移调控机制的初步探究
  根据细胞表型相关实验结果及数据库信息分析,PDLIM5对肿瘤细胞的转移侵袭能力具有显著影响。首先在PDLIM5沉默状态下通过Western Blot和qPCR对上皮细胞-间充质转化(EMT)相关分子进行了检测,随后通过构建过表达质粒,在同种细胞株中过表达PDLIM5,检测EMT相关分子表达回复情况,并分别在PDLIM5敲减及过表达两种情况下对前列腺骨转移相关分析因子进行检测。最后通过免疫共沉淀,确定PDLIM5与AMPK的相互作用并对敲减PDLIM5后AMPK磷酸化水平进行检测,探索PDLIM5-AMPK-EMT的调控机制。
  (五)动物实验研究PDLIM5在体内功能作用
  使用沉默PDLIM5的DU145细胞进行裸鼠皮下成瘤实验,观察体内环境下PDLIM5敲减后对细胞成瘤及增殖能力的影响。随后将取瘤体组织进行裂解,通过Western Blot对PDLIM5蛋白表达水平进行检测,明确PDLIM5的沉默效率并检测AMPK、EMT相关信号通路分子表达变化,明确在动物实验中PDLIM5对细胞增殖转移的调控机制。
  结果:
  1.发现PDLIM5在PCa组织中异常高表达,并且与PCa生化复发与生存期相关。通过免疫组化及生物信息学分析方法,确认PDLIM5在PCa中较正常前列腺组织表达水平升高,且深入分析数据库芯片资料发现异常高表达的PDLIM5与预后不良因素如:转移、高Gleason评分及TMN分期相关。同时,通过多因素分析及生存分析发现高表达PDLIM5是PCa生化复发的独立危险因素并导致患者总生存率下降。
  2.成功建立稳定沉默PDLIM5的DU145及PC-3细胞株,通过相关细胞学实验发现沉默PDLIM5可导致前列癌细胞恶性增殖、克隆形成、侵袭转移能力受抑制,并可诱导G2/M阻滞和细胞凋亡的发生。
  3.检测PDLIM5敲减后上皮-间质转化(EMT)相关分子表达水平,通过Western Blot及qPCR发现人紧密连接蛋白1(ZO1)、波形蛋白(Vimentin)、SNAIL等出现不同程度下调,而EMT关键分子E-cadherin表达量上升,证实EMT过程受到抑制。
  4.在DU145及PC-3细胞中过表达PDLIM5可以在一定程度上通过上调SNAIL的表达,从而使及关键分子E-cadherin表达量下降,证实PDLIM5对细胞侵袭和转移的影响与EMT密切相关。同时在细胞实验中检测已知促进前列腺癌骨转移的相关分子,如结缔组织生长因子(CTGF),甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)。qPCR结果显示,沉默PDLIM5后,PC-3细胞中这些促肿瘤转移因子的表达显着下调。当PDLIM5过表达时,这些分子的表达水平出现上调,且在DU145细胞中也观察到类似的结果,进一步证实PDLIM5在促进肿瘤转移中起作用
  5.免疫共沉淀确定PDLIM5可与AMPK相结合,敲减PDLIM5后AMPK蛋白及磷酸化AMPK蛋白水平下降。随后通过放线菌素阻断上游蛋白质合成,在给药后不同时间点检测AMPK蛋白水平,结果发现PDLIM5沉默组AMPK蛋白降解加快。即PDLIM5可通过维持AMPK的稳定性,使AMPK通路持续性激活,从而促进前列腺癌的恶性增殖及转移。
  6.裸鼠成瘤实验证明在体内条件下,沉默PDLIM5可抑制肿瘤细胞生长。通过组织蛋白水平检测,在动物实验中PDLIM5同样可通过AMPK-EMT相关通路对前列腺癌细胞增殖及转移进行调控。
  结论:
  本研究证实了PDLIM5表达水平在PCa组织中发生上调,表明PDLIM5可能是PCa形成中的致癌基因。通过生物信息学分析探索PDLIM5与PCa复发和转移的关系,表明高表达PDLIM5是前列腺癌预后不良的相关因素。此外,细胞和动物实验都表明,PDLIM5通过激活AMPK通路可以促进癌细胞的增殖并增强EMT介导的侵袭和转移。探索PDLIM5相关相关通路及作用靶点可能有助于丰富PCa的进展和转移机制,并为mCRPC患者带来新的治疗策略。
[硕士论文] 杨启维
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:临床上许多进展期肾癌患者已经失去手术机会,接受手术的患者将近有三分之一会发生复发和转移。抗血管治疗药物是针对血管内皮生长因子(VEGFR)受体的较为有效的治疗方法,抗血管药物同时阻滞络氨酸激酶受体(RTK),目前肾癌治疗一线靶向药物中舒尼替尼最为常用。令人惋惜的是有将近五分之一的肾癌患者对抗血管治疗不敏感,剩下的患者最终再接受一到多个疗程之后也会发展为耐药。许多患者因为中断了舒尼替尼的治疗最终导致快速的复发和转移,所以开发新型的抗肿瘤药物迫在眉睫。
  随着纳米科技的快速发展,各种纳米药物的药效学得到深入研究,其中一些甚至进入临床试验和临床治疗。在这些纳米药物中,无机纳米药物得到广泛研究,其中一些也在临床试验中得到理想效果。四氧化三铁纳米粒已经被美国FDA食品与药品监督局批准并认可应用于贫血的治疗。最近,四氧化三铁纳米粒显示出抗巨噬细胞的效应,这样就有潜能应用于肿瘤的生物免疫治疗。而且,银纳米粒已经在妇产科感染性疾病的治疗中取得一定疗效。其它无机纳米药物,例如:纳米氧化锌和纳米金,仍然有成为抗肿瘤药物的很大潜藏价值。在我们的前期研究中,氧化亚铜纳米粒(Cuprous Oxide Nanoparticles,CONPs)展示出理想的抗肿瘤效果和很低的生物毒性。铜伴侣蛋白调节细胞内铜离子转运和剂量,在肿瘤的进展中也扮演了重要角色。纳米药物和铜伴侣蛋白相互作用的机制尚未得到深入研究。
  目的:
  明确CONPs如何左右肾癌细胞的生物学行为,并在肾癌在体动物模型的实验中进行验证。在药效学实验阳性的基础上,迸一步探讨CONPs对抗肾癌进展的分子学机制,并寻找该药物抑制肾癌生长并诱导其凋亡的靶点。
  方法:
  1、通过CCK8法评估CONPs作用于肾癌细胞后,其细胞活力和增殖效应的变化,并通过TRANSWELL实验检测CONPs对肾癌细胞迁移和侵袭的影响,采用AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒在流式仪上对CONPs是否诱导肾癌细胞凋亡进行验证。通过流式仪并利用Cell cycle staining Kit检测CONPs对肾癌细胞周期的效应。
  2、RNA提取和qRT-PCR检测CONPs作用后肾癌细胞转录水平RNA变化情况,WB实验在蛋白水平检测CONPs对肾癌细胞蛋白质翻译有何影响,shRNA干扰靶蛋白寻找并验证CONPs的靶点。
  3、透射电子显微镜观察CONPs作用于肾癌细胞器的亚细胞结构,细胞内铜离子含量通过电感耦合等离子体质谱法的铜总量吸收实验所测定,通过对肾癌细胞内ROS和钙离子浓度的检测来检验细胞内氧化活性反应和内质网应激通路的激活。
  4、裸鼠皮下成瘤在体实验验证CONPs在动物体内是否能发挥抗肾癌效应。取裸鼠皮下瘤体标本TUNEL和KI67实验,进一步在体内实验中验证CONPs对肾癌增殖和凋亡的影响。
  结果:
  1、CONPs对肾癌细胞生长产生抑制,并且阻滞肾癌细胞周期于S和G2期。同时,CONPs抑制了肾癌细胞的侵袭和转移。
  2、透射电子显微镜观察到CONPs使肾癌细胞内质网肿胀,并且用流式细胞技术也检测到CONPs使肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度显著提高,并且与用药浓度和用药时间正相关,ROS水平和钙离子浓度的上升都是内质网应激的使动因素。
  3、CONPs诱导细胞内铜离子积聚,并且靶向作用铜伴侣蛋白发挥抗肿瘤效应。CONPs诱导肾癌细胞内质网应激并促进其细胞凋亡,WB实验验证了内质网通路和凋亡通路上关键蛋白的激活。
  4、CONPs在体内动物模型实验中抑制裸鼠皮下肾癌瘤体的生长。并且靶向AXL和MET蛋白,恢复肾癌耐药细胞对舒尼替尼的敏感性,体内实验的瘤体也同时验证内质网和凋亡通路的激活,以及对耐药蛋白的抑制。
  结论:
  我们系统性了CONPs的药理学效应,以及无机纳米药物在抑制肾癌和耐药肾癌模型的进展,多项研究表明CONPs在体内和体外实验中抑制了肾癌的生长。并且我们研究了CONPs作用于铜伴侣蛋白ATOX1和CCS的药理学效应。我们发现CONPs可以显著影响ATOX1和CCS的功能,干扰细胞内铜转运,并且释放铜元素,导致细胞内铜元素累积,CONPs提高肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度,从而导致内质网应激的发生,并在抑制其增殖的同时促进凋亡。CONPs在抗肾癌细胞的同时显示了极低的肝肾毒性,并且通过下调AXL、MET、AKT、ERK来抑制舒尼替尼耐药。这些研究都可以说明CONPs值得开发为新型抗肿瘤纳米药物从而应用到对进展期肾癌和舒尼替尼耐药肾癌的临床治疗中,这样可以极大程度上促进中晚期肾癌患者的预后。
[博士论文] 韩萍
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究分为以下四部分:1.蟾皮抑制卵巢癌细胞增殖有效成分的筛选;2.酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响;3.酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长作用研究;4.酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及影响顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的机制研究。
  第一章 蟾皮抑制卵巢癌细胞增殖有效成分的的筛选
  方法:
  5种蟾皮活性成分酯蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵、华蟾酥毒基、蟾蜍噻咛配置浓度梯度0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20、100、500μM作用于卵巢癌SKOV3细胞72小时,用In cell2000 analyzer统计存活细胞数目,计算细胞存活率。筛选出抑制作用较强的2种成分,进一步作用于人胸水来源的卵巢癌原代细胞72小时,计算细胞存活率。
  结果:
  5种蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它灵有较好的抑制卵巢癌SKOV3细胞活性作用,在浓度高于20μM时,有明显的量-效关系;72小时测定并计算酯蟾毒配基IC50=48.62μM,蟾毒它灵IC50=86.86μM;其余脂溶性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基和水溶性成分蟾蜍噻咛抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖活性作用较弱。酯蟾毒配基和蟾毒它灵在浓度高于20μM时,对人胸水来源的卵巢癌原代细胞抑制率均高于50%,能明显抑制人胸水来源的卵巢癌原代细胞增殖。
  结论:
  蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它灵有较好的抑制卵巢癌SKOV3细胞和人胸水来源的卵巢癌原代细胞增殖,为5种蟾皮有效成分中抑制卵巢癌细胞增殖活性的优势成分。
  第二章 酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响
  方法:
  酯蟾毒配基配置浓度梯度20、100、500μM单独或与顺铂5μM联合作用于卵巢癌SKOV3细胞24、48、72小时,用MTS方法检测细胞增殖情况。流式细胞术和Hoechst荧光染色法检测细胞凋亡。
  结果:
  1、各浓度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3细胞后,卵巢癌SKOV3细胞增殖活性降低。酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用,随着酯蟾毒配基浓度增加、作用时间的延长而增强。
  2、当不同浓度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,相对于空白对照组,酯蟾毒配基组的早期凋亡细胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)及死亡细胞(UL)比例均明显增加,并且这种变化呈现出了剂量依赖性。
  3、酯蟾毒配基给药处理后,随着酯蟾毒配基浓度(20μM、100μM、500μM)的增加,凋亡小体增多。
  4、在不同浓度(20μM、100μM、500μM)酯蟾毒配基和5μM顺铂联合作用72小时后,卵巢癌SKOV3细胞增殖活性发生不同的变化趋势。20μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性低于酯蟾毒配基20μM组(P<0.001),高于顺铂组(P<0.05);100μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性低于酯蟾毒配基100μM组(P<0.001),低于顺铂组(P<0.01);500μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性与酯蟾毒配基500μM组比较,无显著性差异(P>0.05),低于顺铂组(P<0.001)。
  5、当不同浓度酯蟾毒配基联合顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,相对于顺铂组,酯蟾毒配基20μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)比例明显减少,晚期凋亡(UR)比例变化不明显。酯蟾毒配基100μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)变化不明显,晚期凋亡(UR)比例有所增加。酯蟾毒配基500μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)比例均明显增加。
  6、当不同浓度酯蟾毒配基联合顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,Hoechst荧光染色法检测到的凋亡变化情况同流式检测结果一致。
  结论:
  酯蟾毒配基能明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,具有明显的浓度、时间依赖性。并能促进卵巢癌SKOV3细胞的凋亡。
  酯蟾毒配基20μM联用顺铂,抑制卵巢癌细胞增殖活性的效果不及单用顺铂;酯蟾毒配基100μM联用顺铂,抑制卵巢癌细胞增殖活性效果优于单用顺铂和单用酯蟾毒配基。不同浓度的酯蟾毒配基和顺铂联用后,对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用可产生增强或减弱的影响。
  第三章 酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长作用研究
  方法:
  卵巢癌细胞SKOV3注射于裸鼠皮下进行移植瘤造模,造模成功后随机分为8组,分别给予低、中、高浓度酯蟾毒配基,低、中、高浓度酯蟾毒配基与顺铂合用进行干预,设置空白对照组和顺铂组,腹腔注射给药,酯蟾毒配基隔日1次,顺铂每周1次,比较各组裸鼠移植瘤体积、瘤重。
  结果:
  各组给药后裸鼠皮下移植瘤的生长均受到抑制。酯蟾毒配基低、中、高剂量组各组间抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率由低到高依次为酯蟾毒配基低剂量组(L)<酯蟾毒配基中剂量组(M)<酯蟾毒配基高剂量组(H),顺铂组(PT)、酯蟾毒配基低、中、高剂量和顺铂合用组四组间抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率由低到高依次为L+PT< PT< M+PT< H+PT。
  结论:
  酯蟾毒配基能抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长,低剂量酯蟾毒配基对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长有拮抗减效作用,中、高剂量酯蟾毒配基对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长有协同增效作用。
  第四章 机制研究
  方法:
  选择AffymetrixPrimeViewTMHuman Gene Expression Array表达谱芯片,用基因芯片筛查技术分析卵巢癌细胞SKOV3在接受酯蟾毒配基作用、酯蟾毒配基与顺铂联合作用处理后基因表达的变化,利用生物信息学分析差异基因,通过表达模式聚类分析、GO富集分析、KEGG富集分析,寻找有显著差异变化信号通路及关键分子,通过PCR、Western Blot方法检测关键基因的蛋白表达进行结果验证。
  结果:
  1、酯蟾毒配基可能通过调节PI3K/AKT/CREB通路,促进凋亡,抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,是酯蟾毒配基影响顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用的关键所在。
  2、PCR结果显示酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3细胞后,AKT1不表达;与空白对照组比较,酯蟾毒配基20μM组中CREB1水平无明显差异(P>0.05),酯蟾毒配基100μM组中CREB1水平明显增加(P<0.05)。与顺铂5μM组比较,酯蟾毒配基20μM+顺铂5μM组中CREB1水平无明显差异(P>0.05),酯蟾毒配基100μM+顺铂5μM组中CREB1水平明显增加(P<0.05)。
  3、Western Blot结果显示,酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3细胞后,与空白对照组比较,酯蟾毒配基20μM组、酯蟾毒配基100μM组中AKT水平均降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平均增高。与顺铂5μM组比较,酯蟾毒配基20μM+顺铂5μM组中AKT水平增高、Caspase3水平降低,磷酸化CREB水平降低;酯蟾毒配基100μM+顺铂5μM组中AKT水平降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平增高。
  结论:
  1、酯蟾毒配基通过PI3K/AKT/CREB通路,上调Caspase3水平,促进卵巢癌SKOV3细胞凋亡,可能是酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的机制。
  2、CREB可能是卵巢癌SKOV3细胞的抑癌转录因子。
  3、不同浓度的酯蟾毒配基和顺铂联用后,可能通过PI3K/AKT/CREB通路,调节Caspase3水平,通过凋亡途径对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞的作用产生协同或拮抗影响。
[硕士论文] 苏晓玲
妇产科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  卵巢癌是妇科致命的妇科恶性肿瘤,由于其发病隐匿,缺少特异可靠的筛查诊断指标,发现时往往已是晚期。转移是卵巢癌患者死亡的主要原因。应激与肿瘤的关系的研究越来越受到关注。应激包括患者因患肿瘤引发的心理应激被认为能促进肿瘤的进展。糖皮质激素(GC)是重要的应激激素,具有强大的免疫抑制、抗炎和维持内环境稳定的作用,并能在其受体(GR)的介导下调节细胞的新陈代谢、分化、增殖及存活。此外GC还是临床广泛使用的药物。除了治疗自身免疫性疾病和炎症外,还被作为实体肿瘤/癌症的化疗或放疗的辅助药物,用来减少放化疗的副反应,增加患者的耐受性。尽管GC与肿瘤的关系的研究一直受到关注,但结果一直不明确。研究证实GC可抑制一些实体肿瘤的增殖和进展,因此,有将GC单药或者联合细胞毒性药物(如5氟尿嘧啶)治疗乳腺癌和前列腺癌,并取得了一定的效果。反之近年来对多种肿瘤的研究表明,GC可以增强肿瘤细胞对放化疗的抵抗,减少放化疗诱导的细胞凋亡,促进肿瘤细胞存活,而这些作用加上GC的免疫抑制作用则有助于肿瘤的发生和发展。因此GC对肿瘤的作用还不清楚,其作用是否因肿瘤的不同类型而异需要进一步研究。
  缺氧是肿瘤常见微环境特征之一,低氧可诱导低氧诱导因子HIF-1的表达。HIF-1是重要的转录因子,由HIF-1α和HIF-1β组成,其中α亚基为氧调节亚基。HIF-1α表达增加被认为与临床上肿瘤患者预后不良相关。研究表明卵巢痛组织中HIF-1α的表达明显高于正常卵巢组织;并且HIF-1α在卵巢癌组织中的表达水平高与卵巢癌患者的预后差呈正相关。近年来研究认为HIF-1α的高表达促进多种肿瘤细胞的迁移和侵袭,因此HIF1-α已经成为几种类型肿瘤进展的关键预测因子。而HIF-1α对卵巢癌细胞侵袭和迁移的研究较少,现有的研究亦认为缺氧下HIF-1α促进卵巢癌细胞的侵袭转移。
  MUC1是一种跨膜黏蛋白,常过表达于一些上皮肿瘤,能够与膜上的多种蛋白相互作用,激活细胞内的PI-3K/AKT通路、Wnt通路等多条信号转导通路,从而调节细胞的侵袭转移等。近年来,MUC1被当作一种新的低氧诱导因子受到人们的关注,有报道MUC1与HIF-1α之间存在相互作用,但确切作用机制还不清楚。小G蛋白Rho激活的蛋白激酶ROCK2作为一个下游信号通路分子可通过调节细胞骨架进而调节细胞运动,与肿瘤细胞的转移密切相关。有国外学者在其研究中发现,Rho/ROCK途径可以调节HIF-1α信号转导。
  我校病生教研室前期的研究发现GC在体内和体外可以明显促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和转移,并且GC可以上调卵巢癌细胞中MUC1及ROCK2的表达。本课题在此基础上进一步探讨GC是否能影响卵巢癌细胞中HIF-1α信号通路进而促进卵巢癌细胞的迁移,并且探讨其可能的机制,主要观察了MUC1和ROCK2与GC增加HIF-1α蛋白进而促进卵巢癌细胞迁移中的作用的关系。
  研究方法:
  我们在细胞水平进行实验,以卵巢癌细胞系HO-8910、SKOV3为研究对象,实验过程中用含10%去激素血清的1640培养基培养细胞,去除血清中的激素对细胞的影响,用100nM DEX对细胞处理不同的时间。用Western Blot的方法检测HIF-1α蛋白的表达水平。siRNA干扰实验分别对HIF-1α、MUC1的表达进行干扰,继而使用Western Blot的方法验证MUC1、ROCK2及HIF-1α的表达。利用Transwell小室检测卵巢癌细胞的垂直迁移能力。
  研究结果:
  1.DEX可以明显上调卵巢癌细胞中HIF-1α蛋白的表达,干扰HIF-1α的表达明显阻断DEX促卵巢癌细胞迁移的作用。
  2.DEX能上调卵巢癌细胞中MUC1的表达,干扰MUC1的表达不仅可以明显阻断DEX促卵巢癌细胞迁移的作用,也能明显阻断DEX上调HIF-1α的作用;反之干扰HIF-1α却不影响DEX诱导MUC1表达的作用。
  3.干扰HIF-1α并不影响DEX上调ROCK2的表达。
  研究结论:
  DEX能明显增加卵巢癌细胞中HIF-1α蛋白的表达水平,该作用与Dex上调MUC1的表达密切相关。DEX上调MUC1进而增加HIF-1α在DEX促进卵巢癌细胞迁移中具有重要作用。
[博士论文] 马重
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:膀胱癌是世界范围内发病率和致死率都很高的一种恶性疾病,是我国泌尿系统中发病率第一的肿瘤。根据膀胱癌细胞侵袭下层组织的深度,可以分为非肌层浸润和肌层浸润性。这两种类型的膀胱癌生物学表型不同、预后不同,临床对应的治疗方法也不同。非肌层浸润性膀胱癌,约占所有膀胱肿瘤的75%,若能早期诊断和治疗,预后较好,但是容易复发。非肌层浸润性膀胱癌,治疗上以经尿道膀胱肿瘤切除术为标准,术后可辅助丝裂霉素等化疗药物或卡介苗膀胱灌注来预防复发和进展。肌层浸润性膀胱癌,对局部组织侵袭严重,转移风险高,预后不良。膀胱癌一旦确诊浸润肌层,在尚未转移时,应当采用更积极的根治性全膀胱癌切除+尿流改道术治疗;根据术中切缘情况,以及术后局部复发、远处转移情况,进行放疗或全身化疗。膀胱癌侵袭深度和临床预后的异质性,反映了膀胱癌细胞在基因、蛋白质水平的差异。研究不同类型膀胱癌的基因差异,探讨高恶性程度膀胱癌的进展机制,是实现膀胱癌早期诊断、精准治疗的前提。
  现有的膀胱癌诊断技术以尿脱落细胞检查和膀胱镜检查为主。尿脱落细胞检查是一项无创性诊断技术,特异性高,但总体敏感性低,诊断低级别膀胱癌的敏感性不到20%。膀胱镜检查是将膀胱内窥镜经过尿道插入被检者膀胱,通过医生肉眼观察,发现形态可疑的新生物后,用活检钳夹取组织样本,进行病理学检查。膀胱镜检查是一项有创性操作,镜检过程会造成尿道、膀胱粘膜的破损,引起出血;检查后尿路感染风险很高。不仅如此,膀胱镜检会造成被检者疼痛和心理不适,患者依从性不够高。鉴于现有膀胱癌诊断技术的不足,发现基于尿液的无创性诊断标志物,具有较高的临床应用价值。新一代测序技术的发展、生物信息学平台的完善,为寻找膀胱癌诊断和分子分型的标志物提供了丰富的资源。也为了解膀胱癌发生、进展机制,提供了强大的工具和线索。
  研究目的:
  为了解国人膀胱癌测序结果,寻找潜在的膀胱癌诊断标志物,探索膀胱癌进展中的分子机制,课题组收集了一系列不同恶性程度的膀胱癌组织样本和患者尿液样本,利用高通量测序技术、体外及活体的细胞分子实验技术,对膀胱癌诊断标志物和分子机制进行研究。
  研究方法:
  1.利用转录组测序技术和生物信息学分析,对膀胱癌组织样本和自身配对的正常尿路上皮样本进行测序和分析,发现差异化表达基因,筛选具有潜在膀胱癌诊断价值、可能调控膀胱癌进展的关键分子。
  2.扩大样本量,抽取组织RNA,通过定量PCR方法,对发现的差异化表达基因Endocan进行验证。
  3.检索生物信息学平台Oncomine,分析Endocan在其他膀胱癌研究中的结果。
  4.构建尿液中Endocan蛋白的检测体系。收集膀胱癌患者和对照人群的尿液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Endocan浓度,用尿肌酐浓度对检测结果进行标化、分析。
  5.制作含有不同恶性程度膀胱癌及正常尿路上皮的组织芯片。用免疫组织化学技术研究Endocan在组织芯片中的表达量。
  6.在膀胱癌细胞中用siRNA干扰Endocan表达,研究Endocan对增殖、迁移、侵袭等膀胱癌生物学表型的影响。
  7.利用慢病毒建立稳转的Endocan敲减膀胱癌细胞系,在裸鼠实验中,探索Endocan在膀胱癌发生、进展中的作用。
  8.通过流式细胞术,研究Endocan对膀胱癌细胞周期、凋亡的影响。
  9.用蛋白免疫印迹(Western-Blotting)研究Endocan与膀胱癌细胞自噬的关系,分析可能的分子机制。
  研究结果:
  1.在10对膀胱癌组织与自身配对的正常粘膜组织的转录组测序中,发现Endocan在膀胱癌组织中显著过表达。
  2.在扩大的组织样本中验证,Endocan在膀胱癌中的表达显著高于正常尿路上皮样本,并且Endocan表达量与膀胱癌恶性程度有关。
  3.在Oncomine数据库中,证实其他研究中Endocan在膀胱癌中也呈现过表达。
  4.在92例膀胱癌患者中检测经肌酐标化的Endocan含量为6.08±0.75,而37例对照人群的尿液中经肌酐标化的Endocan含量为0.75±0.18,差异显著。并且尿液中经肌酐标化的Endocan与膀胱癌恶性程度相关。
  5.在组织芯片研究中,Endocan在膀胱癌中总体表达高于正常尿路上皮,并且Endocan在肌层浸润性膀胱癌表达显著高于非肌层浸润膀胱癌。
  6.用siRNA干扰Endocan,可以显著降低T24、T921膀胱癌细胞系的增殖、迁移、侵袭等生物学表型。
  7.在裸鼠实验中,Endocan稳定敲减T24细胞系与对照细胞相比,成瘤率降低,瘤体增长速度受到抑制。
  8.用siRNA干扰Endocan,可抑制T24、T921膀胱癌细胞的早期凋亡,对膀胱癌细胞周期无显著影响。
  9.Endocan敲减可以上调膀胱癌细胞自噬。这一作用可能是通过mTOR介导的。
  研究结论:
  Endocan基因及编码蛋白膀胱癌组织中过表达,且表达水平与膀胱癌恶性程度相关。膀胱癌患者尿液中标化Endocan的浓度显著高于对照人群,Endocan具有潜在的膀胱癌无创性诊断标志物价值。Endocan参与膀胱癌发生、进展,干扰Endocan可以显著降低膀胱癌细胞的增殖、侵袭能力,并抑制细胞凋亡,这种作用可能是通过上调mTOR介导的细胞自噬引起的。
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