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[博士论文] 张旭峰
环境科学与工程 大连海事大学 2017(学位年度)
摘要:本文通过研究中国沿海地区(辽宁、河北、山东、江苏和福建)海洋底栖动物刺参和扇贝(虾夷扇贝和栉孔扇贝)的稳定同位素和脂肪酸组成特征,包括碳、氮稳定同位素组成、脂肪酸含量组成及单分子脂肪酸碳同位素组成,分析和比较不同地区刺参和扇贝的稳定同位素和脂肪酸组成的差异,并结合统计学分析方法,如主成分分析和判别分析,区分不同产地来源的刺参和扇贝。同时,通过研究刺参和扇贝潜在食源的贡献、食物来源组成以及脂肪酸碳稳定同位素的分馏,评价食物来源和脂肪酸代谢对刺参和扇贝稳定同位素和脂肪酸组成的影响,为深入分析和研究海洋底栖动物稳定同位素和脂肪酸组成的地域性差异提供理论依据。
  不同地区刺参和扇贝的碳、氮稳定同位素组成存在显著性差异,不同产地来源的刺参和扇贝能通过碳、氮稳定同位素组成得到有效区分;不同季节刺参和扇贝的碳、氮稳定同位素组成存在显著性差异,秋季刺参的δ13C、δ15N值相对于春季均偏正(δ13C:0.066~2.310‰;δ15N:0.527~1.246‰),而秋季虾夷扇贝和栉孔扇贝的δ13C值相比于春季偏负(分别为0.081~1.861‰和0.201~1.566‰)。
  海洋底栖动物的脂肪酸组成存在明显的物种特异性,不同食性海洋底栖动物的脂肪酸组成差异较大;不同地区刺参和扇贝的脂肪酸组成存在显著性差异,结合统计学分析方法能有效对不同地区的刺参和扇贝进行区分;不同季节刺参和扇贝的脂肪酸组成存在显著性差异,同时不同养殖方式也能导致刺参脂肪酸组成的差异。
  刺参和扇贝饱和脂肪酸的δ13C值普遍高于不饱和脂肪酸;不同地区刺参和扇贝的脂肪酸碳稳定同位素组成存在显著性差异,结合统计学分析方法能有效对不同地区的刺参和扇贝进行区分;刺参和扇贝的脂肪酸碳稳定同位素组成存在显著的季节性差异,秋季刺参单分子脂肪酸的δ13C值高于春季,而秋季虾夷扇贝和栉孔扇贝单分子脂肪酸的δ13C值低于春季,与全样δ13C值的季节性变化规律一致;不同养殖方式刺参的脂肪酸碳稳定同位素组成也存在明显差异,圈养刺参单分子脂肪酸的δ13C值高于底播刺参。
  不同地区刺参潜在食源的碳、氮稳定同位素组成存在显著性差异,同时,4种潜在食源对刺参生长的贡献存在显著性差异,莱州地区贡献率大小依次为大型藻类、紫贻贝、浮游生物和SOM,担子岛地区为SOM、浮游生物、大型藻类和紫贻贝,獐子岛地区为SOM、大型藻类、紫贻贝和浮游生物。潜在食源碳、氮稳定同位素组成的差异及对海洋底栖动物生长贡献的差异是导致海洋底栖动物碳、氮稳定同位素组成存在地域性差异的主要原因。
  不同食性海洋底栖动物食物来源组成不同,沉积食性刺参食物来源主要为硅藻,而滤食性扇贝食物来源主要为硅藻和鞭毛藻,2种扇贝之间也存在略微差异,虾夷扇贝的食物来源以硅藻为主,而栉孔扇贝的食物来源以鞭毛藻为主。不同地区刺参和扇贝的食物来源组成不同,导致刺参和扇贝的脂肪酸组成存在显著的地域性差异。
  刺参脂肪酸碳稳定同位素的分馏为-1.588~7.403‰,其中,饱和脂肪酸碳稳定同位素的分馏为1.098~7.403‰,单不饱和脂肪酸碳稳定同位素的分馏为-1.588~2.778‰,多不饱和脂肪酸碳稳定同位素的分馏为-1.559~5.614‰,饱和脂肪酸碳稳定同位素的分馏程度大于不饱和脂肪酸。刺参不同脂肪酸的来源及代谢不同,饱和脂肪酸主要来源于食物,刺参能利用20碳以下偶数碳饱和脂肪酸通过去饱和、碳链延长合成其他脂肪酸;20碳以下单不饱和脂肪酸主要来源于食物,20碳以上单不饱和脂肪酸主要来源于其他脂肪酸的转化合成;多不饱和脂肪酸18∶3n-3、20∶5n-3和20∶3n-6主要来源于食物,其中18∶3n-3和20∶5n-3参与了代谢反应,用于合成其他脂肪酸或激素,20∶4n-6主要来源于18∶2n-6的转化合成,22∶6n-3同时来源于食物和18∶3n-3的转化合成。
  海洋底栖动物食物来源的稳定同位素组成及脂肪酸的代谢过程都受到环境因子的影响,因此,环境因子是海洋底栖动物稳定同位素和脂肪酸组成呈现地域性差异的最终决定因素。
[硕士论文] 缪栋
农用海洋资源 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:海参养殖业是我国特色海水养殖产业之一,主要分布在辽宁和山东沿海。海参养殖业发展迅速,2010年全国海参养殖面积已达到万公顷,产量达万吨,产值接近亿元。然而,相对于其迅速发展的规模,与海参养殖技术相关的基础研究还比较滞后。因此,相关基础研究越来越受到人们的重视。
  海参养殖环境中微生物有着十分重要的地位,大部分微生物以生产者或分解者作用参与水生生态系统,部分寄生或共生型病原微生物会造成海参疾病爆发,与海参的健康生长有着十分紧密的联系。而在人工养殖过程中,不规范的投放饵料、药物滥用等造成池底物质堆积,往往会导致水体微生态平衡受到严重破坏,水质恶化、缺氧等,造成海参免疫力下降或死亡;另外,水体富营养化也会造成水体优势青苔与养殖生物饵料藻类竞争,造成底质腐败等,进而给海参养殖造成直接或间接的负面影响。因此,海参养殖环境的健康状况与微生物群落的丰度、群落结构有着紧密的联系,探究养殖环境中微生物群落的组成与动态变化对于海参养殖业具有重要的理论和实践意义。
  基于以上背景,本工作对海参养殖池塘中的微生物多样性和年度动态变化进行了研究,采用流式细胞术检测水体中浮游微生物丰度;通过高通量测序检测真菌、古菌、细菌等不同类型的微生物多样性及其丰度变化;利用连续流动分析仪对海参养殖水体的环境因子进行测定;综合群落结构和环境因子寻找影响微生物群落变化的制约性因素。另外,针对青苔爆发频繁的实际性问题,利用特异性引物设计和定量PCR技术相结合,探讨检测海参养殖池中青苔孢子的分子检测方法,以期达到对青苔爆发的早期预警。本研究旨在为海参养殖池塘环境微生物生态调控模式的建立提供一定的基础资料。主要研究结果如下:
  1.海参养殖池浮游微生物的分布
  利用流式细胞仪技术研究了海参养殖池塘水体环境浮游微生物丰度变化及其与环境因子的关系。
  结果表明:
  (1)浮游微生物检测出聚球藻、皮微级浮游植物、纳微级浮游植物、隐藻、高低核酸异养细菌几大类型,其中细菌数量级非常大,几乎达到106/mL,而浮游植物的数量级较小,只有102/mL~103/mL。
  (2)浮游微生物一般都是3月开始生长,到6月份处于爆发顶峰期,9月份的时候已经处于衰退期。
  (3)浮游微生物数量与环境中的溶解氧,盐度、pH、可溶性总氮具有一定的相关关系,其中,溶解氧和pH对于浮游微生物的影响是最大的。
  2.海参养殖池微生物多样性分析
  水样过滤膜提取DNA,并进行高通量测序,再结合环境因子对比,研究海参养殖池微生物多样性。
  结果表明:
  (1)细菌中变形菌门是重要组成部分,其中α-变形菌(Alphaproteobacteria)是主要类群。CCA分析结果显示,原核生物类群受pH、亚硝态氮、硅、氨态氮、温度控制。
  (2)古菌生物中,大部分样品优势类群是DHVEG-6。而且大部分古菌如DHVEG6、MHVG、GroupC3、MBGB等都与各种形态可溶性氮元素有着显着甚至是极显著相关性。CCA分析的结果显示出微生物群落受盐度和硅控制。
  (3)真核微生物中泛植物界占据主要组成部分,而在泛植物界中绿藻门是最主要的。CCA结果显示生物类群受盐度、温度、pH、溶解氧、亚硝态氮、氮磷比控制影响。
  3.海参养殖池三种藻类孢子/配子qPCR检测
  对海参养殖池三种爆发性青苔进行了18S和ITS区间测序,设计了以核糖体转录间隔区(ITS)为靶区域的种类特异性PCR引物,通过藻类和环境水样DNA对照实验检验其特异性和适用性。
  结果如下:
  (1)所得三种藻类ITS引物均具有一定种类或类群特异性。
  (2)三对引物在qPCR方法中呈现一定的灵敏度,三株藻类最低检出限度:缘管石莼约1.66×10-4 ng/μL,200个ITS基因拷贝数;未能鉴定到种约6.6×10-6 ng/μL,200个ITS基因拷贝数;萱藻1.66×10-4 ng/μL,400个ITS基因拷贝数。
  (3)使用qPCR方法对烟台海参养殖水体6个季度环境水样中的萱藻孢子/配子进行定量检测,发现样品中萱藻孢子/配子ITS拷贝数的季节变化与青苔爆发规律呈现较高的吻合度,萱藻爆发前期伴随水体中孢子/配子量的增高,初步显示藻类爆发可被qPCR方法预测。
[硕士论文] 刘帅军
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:转座子(Transposon,Tn),存在于生物界的各种生物基因组中,是一段可以在基因组上自由移动并改变其位置的DNA序列。转座子天然具有基因转移特性,可作为基因载体用于基因组遗传修饰。Sleeping Beauty(SB)、PiggyBac(PB)和Tol2等三种转座子目前被广泛应用于脊椎动物转基因研究构建基因突变体库,研究基因表达调控机理及表达特性。本研究利用自行构建的SB、PB和To12介导的增强子捕获载体制备了增强子捕获斑马鱼,比较报告基因和捕获的增强子及内源基因时空表达模式,以期获得调控组织发育或细胞分化的特异性增强子。主要获得以下研究结果:
  1、根据不同荧光表型将SB、PB及To12介导的增强子捕获转基因斑马鱼F1代进行分类,选择具有典型表达模式的个体建立7个品系,分别为SK-1、SK-3、SK-6、SK-12、TK-1、TK-4及PK-0。将7个品系分别与野生型交配产生F2代,观察其胚胎早期不同发育阶段绿色荧光蛋白表达模式,结果表明7个品系荧光表型主要分为:脑、躯干、眼睛、心脏、下颌等。以F2代基因组为模板进行SP-PCR及测序结果表明,捕获载体分别插入整合在基因组不同位点分布在5个不同染色体;共捕获了7个不同的内源基因(slc9a8、ednraa、mettl22、wdr33、dlx1a、rps26和itgav),其中4个插入位点位于内含子,1个位于外显子,2个分别位于基因上游20Kb和下游10bp处。
  2、利用内源基因反义RNA作为探针进行斑马鱼胚胎原位杂交,结果表明在24hpf和48hpf两个发育阶段,内源基因与报告基因绿色荧光蛋白表达模式大体一致。脑、眼及全身等荧光信号强的组织其杂交后着色也较深。
  综上所述,本研究表明,三种转座子介导的增强子捕获载体均能有效应用于增强子捕获。报告基因和内源基因可能在相同增强子调控下表达,绿色荧光信号基本可代表内源基因的时空表达特性。本研究可为增强子注解提供重要参考,为进一步研究增强子表达调控功能及基因活性奠定基础,对后基因组时代的研究具有重要的意义。
[硕士论文] 钟继汉
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:Tc1转座子超家族广泛分布于细菌、真菌及昆虫等各种生物中,有些Tc1转座子超家族成员已经被开发为重要的遗传育种操作工具,如SB转座子已经作为基因治疗和转基因的介导载体得到广泛应用。pogo转座子是Tc1转座子超家族的重要成员,但对其分布、进化和活性研究报道很少。本研究通过硬骨鱼转座组注释,并在脊椎动物中针对Tc1转座子超家族的重要成员pogo转座子进行分布、进化和活性研究,以挖掘活性pogo转座子,研发自主知识产权的遗传操作工具,为动物转基因和基因治疗等研究提供技术支撑。主要研究内容如下:
  (1)通过生物信息学手段对9种硬骨鱼转座组进行注释。结果表明9种硬骨鱼类转座组大小和构成差异显著,其转座组含量从高到低分别为斑马鱼、矛尾鱼、青鳉鱼、花斑剑尾鱼、大西洋鳕鱼、三刺鱼、金娃娃、罗非鱼和红鳍东方纯,转座子含量和基因组大小呈正相关。DNA转座子在硬骨鱼类中具有多样性高和含量差异大的特点(0.50%-38.37%),是硬骨鱼类转座组差异的主要决定因素,其中hAT和Tc/Mariner超家族是硬骨鱼类主要的DNA转座子。RNA转座子在硬骨鱼类中也具有多样性高的特点,其中LINE转座子占硬骨鱼类基因组0.53%-5.66%,共检测到12个(I、CR1、L1、L2、R1、R2、Jockey、 RTE和Rex)超家族分布,其中L1、L2、RTE和Rex转座子扩增较为明显,LTR转座子除了在斑马鱼和三刺鱼中含量达到5.58%和2.51%,在大多硬骨鱼类基因组中的含量低于2%,在硬骨鱼类中共检测到6个LTR转座子(Copia、DIRS、ERV、Gypsy、 Ngaro和Pao)超家族分布,其中扩增最为明显的是Gypsy。而SINE转座子在硬骨鱼类中扩增最弱,仅在斑马鱼和矛尾鱼中分别达到3.28%和5.64%,在其它7个品种中低于1%。SINE中tRNA、5S和MIR三个超家族在部分硬骨鱼类中有一定程度扩增。本研究表明硬骨鱼类转座组具有多样性丰富、差异大的特点,转座组差异与硬骨鱼基因组大小有很强的相关,转座组是决定硬骨鱼基因组大小的重要因素。
  (2)通过TBLAST程序对NCBI数据库中脊椎动物基因组比对发现pogo转座子主要分布在鱼类基因组中,其中在28个鱼物种中发现了pogo转座子的分布,在2种两栖动物(西方爪蛙和高山蛙)和4种爬行动物中发现了pogo转座子的分布,在鸟类和哺乳动物未能发现者典型的pogo转座子结构。pogo转座子在进化中衍生出POGK和POGZ功能基因,POGZ在脊椎动物中分布广泛,而POGK主要分布在哺乳动物中。POGK和POGZ功能基因含有保守的pogo转座酶DBD和DDE结构域,且DDE氨基酸残基高度保守,提示POGK和POGZ可能具有DNA酶活性。
  (3)为验证人源POGK和POGZ在哺乳动物细胞上的活性,构建了pogo转座子介导的新霉素报告基因表达质粒pPG-PGK-NEO,及转座酶表达质粒pT2-CMV-POGK和pT2-CMV-POGZ,同时构建斑马鱼pogo转座酶表达质粒pT2-CMV-Pgase。将pPG-PGK-NEO与分别上述三个转座酶表达质粒共转染Hela细胞,通过G418筛选获得稳定表达Neo基因的阳性细胞,阳性细胞克隆数比较表明,pT2-CMV-POGK和pT2-CMV-POGZ组显著高于对照组,而pT2-CMV-Pgase组显著高于POGK、POGZ和对照组,提示pogo转座酶、POGK、POGZ基因均具有转座活性。
  (4)为了进一步明确斑马鱼pogo转座酶PGase转座子时空表达特性,以PGase正、反义RNA为探针,对不同发育阶段的斑马鱼胚胎进行原位杂交,结果表明,PGase在胚胎早期发育各阶段具有表达活性,正向表达水平明显高于反向,且表达无明显组织特异性,
  本研究表明,pogo转座子主要分布在鱼类、两栖类和爬行类动物中,具有较高的转座活性,且其衍生基因POGK和POGZ也具有转座活性。
[硕士论文] 贾雪卿
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:肠道菌群是一个受遗传、营养和环境因子影响的动态生态系统,复杂的肠道菌群因其对宿主生长、健康等方面的影响而日益受到研究学者的关注,是宿主体内不可缺少的“器官”之一。花鳗鲡,是鳗鲡类中体型较大的一类,广泛地分布在热带和亚热带的海水与淡水水系里,是一种珍贵的鱼类资源,为中国国家二级保护动物。随着养殖集约化的增加和养殖技术的限制,花鳗鲡养殖水平参差不齐。在花鳗鲡养殖过程中,因为营养不良和管理不当等因素,会出现一些养殖时间长却生长极缓慢的个体。它们通常头大尾小,体色多呈棕黄色或黑色,被称为僵鳗。
  本研究中,运用传统培养手段和高通量测序技术揭示不同生长程度花鳗鲡肠道菌群结构,并结合饲喂实验初步探讨花鳗鲡肠道关键菌群对其生长的影响。实验设计三组鳗鲡肠道样品(快速生长组Am-R、缓慢生长组Am-S和僵滞生长组Am-F)和两组环境样品(养殖水体组Am-W和饲料组Am-B),本研究结果如下:
  1、利用传统培养手段分离Am-R组和Am-F组的鳗鲡肠道细菌共包括14个属,分别为乳球菌属、肠球菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、肠杆菌属、变形菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、不动杆菌属、邻单胞菌属、柠檬酸杆菌属、埃希氏菌属、爱德华氏菌属,和微杆菌属。其中,仅在Am-R组中分离得到了乳球菌属和肠球菌属。
  2、利用高通量测序技术分析花鳗鲡样品菌群结构,经过滤和去冗余处理,11个样品共获得625,583有效读段和36,863个可操作分类单元(OTU)。所有样品中,Shannon指数平均值Am-W>Am-B>Am-F>Am-R>Am-S,Simpsom指数平均值Am-W<Am-B<Am-F<Am-R<Am-S,ACE和Chao指数平均值Am-B>Am-W>Am-S>Am-R>Am-F。其中,Am-W组菌群微生物多样性最高,Am-B组菌群丰度最高,而在肠道样品中Am-S组菌群多样性最低、丰度最高。花鳗鲡肠道样品中Am-R组和Am-S组菌群结构相似,共有核心菌群为鲸杆菌属、梭菌属、乳球菌属和拟杆菌属。而Am-F组核心菌群为螺原体属。Am-W组核心菌群为黄杆菌属、新鞘氨醇菌属和假单胞菌属。Am-B组核心菌群为棒状杆菌属。此外,在快速生长和僵滞生长的花鳗鲡肠道中,主要差异菌群为鲸杆菌属、梭菌属、乳球菌属、拟杆菌属、爱德华氏菌属、邻单胞菌属、魏斯氏菌属、肠杆菌科和螺原体属等。
  3、三组饲料添加剂均对僵鳗生长产生了促进作用,其中以拟杆菌属与梭菌属添加组(BC组)促生长效果最好,乳球菌属与肠球菌属添加组(LE组)的促生长效果与甘露寡糖添加组(MO组)的促生长效果没有显著差异。
  本研究结果阐明了养殖花鳗鲡肠道菌群基本组成,分析了影响鳗鲡生长的关键菌群,对几种潜在益生菌能否促进僵鳗生长进行了初步探索,为后续关于鳗鲡保护和养殖的研究提供了基础,并丰富了肠道微生物和饲料添加剂方面的研究。
[博士论文] 赵君
水产品加工及贮藏 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,我国鲍鱼养殖规模不断扩大,产量逐年递增,鲍鱼加工业发展迅速。在加工过程中,产生了大量的低值副产物,如鲍鱼脏器、鲍鱼壳等,其中脏器约占鲍鱼体重的20~30%,在加工过程中多数被直接丢弃,不仅造成了资源浪费,还带来环境污染。鲍鱼脏器中生殖腺所占比例很大,富含蛋白质、多糖等功能成分,对其进行有效利用十分必要。
  本文以皱纹盘鲍生殖腺(Haliotis discus hannai Ino)为研究对象,通过生物酶法获得生殖腺中的多糖和多肽,对其进行构效关系方面的研究。主要研究内容及结果如下:
  (1)采用碱性蛋白酶/胃蛋白酶复合水解技术及离子交换、凝胶排阻柱层析技术对皱纹盘鲍生殖腺多糖进行提取及分离纯化,并对多糖组分进行化学组成对比分析。结果表明,皱纹盘鲍生殖腺粗多糖(Abalone GonadPolysaccharides,AGP)经分离纯化得到三个均一的多糖组分,分别命名为AGP-31、AGP-32和AGP-33,分子量分别为37.8、32.2和27.5 kDa。三个组分均为非糖胺聚糖类的硫酸化多糖,主要化学组成及含量为:蛋白质0.68~1.04%,中性糖53.10~58.82%,硫酸基8.30~9.48%,糖醛酸17.02~18.26%。其中,AGP-32的中性糖含量显著高于另外两个组分,糖醛酸含量显著低于另外两个组分,而AGP-33的硫酸基含量显著高于另外两个组分(p<0.05)。三个多糖组分均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖8种单糖组成。
  (2)采用部分酸水解、甲基化、红外光谱及核磁共振波谱分析确定皱纹盘鲍生殖腺多糖AGP-33的主链结构。结果表明,对AGP-33进行部分酸水解后得到皱纹盘鲍生殖腺多糖的主链部分BAGP-33,经高效液相色谱法检测为均一多糖,分子量为17.0kDa。主链结构中只包含甘露糖、葡萄糖和半乳糖,比例为1∶1∶3,主要采取三种连接方式,即1→3连接,1→4连接和1→6连接。经综合分析得出,皱纹盘鲍生殖腺多糖AGP-33的主链核心结构为[→4)-α-Galp-(1→6)-α-Glcp-(1→]n。
  (3)采用体外实验研究皱纹盘鲍生殖腺多糖的促胆囊收缩素(CCK)释放活性和抗凝血活性。以小鼠肠道内分泌肿瘤细胞STC-1为工具细胞,评价皱纹盘鲍生殖腺多糖促进CCK释放活性,并对主要信号通路进行初步研究。结果表明,在浓度达到2mg/mL以上时,三种皱纹盘鲍生殖腺多糖均可显著诱导STC-1细胞释放CCK(p<0.05)。Ca2+/钙调蛋白/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/CaM/CaMKⅡ)、环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)-p38这3条信号通路都参与了AGP-32诱导的CCK释放。通过体外抗凝血试验对皱纹盘鲍生殖腺多糖的抗凝血活性进行评价。结果表明,三种多糖在浓度为25μg/mL以上时,均具有显著的抗凝血活性(p<0.01),且均通过内源性凝血途径和抑制血浆纤维蛋白原酶来发挥抗凝血作用。浓度为50μg/mL时,AGP-33及其主链部分(BAGP-33)、脱硫产物(AGP-33-deS)中AGP-33的抗凝血活性最强,表明分子量、硫酸基含量及取代位点对多糖组分的抗凝血活性均有一定影响。
  (4)以中性蛋白酶为工具酶,对皱纹盘鲍雄性生殖腺(Abalone MaleGonad,AMG)脱脂粉和雌性生殖腺(Abalone Female Gonad,AFG)脱脂粉进行酶解,考察水解效果。结果表明:雌、雄生殖腺冻干粉经丙酮脱脂后,蛋白含量分别达到50.46±0.53%和58.44±0.44%。中性蛋白酶对雌、雄皱纹盘鲍生殖腺酶解效果均较好,且对雌性生殖腺的水解效果优于雄性。酶解3h后,肽得率分别为51.20%和44.56%,水解度分别为37.12%和35.78%。雌性生殖腺酶解物(Abalone Female Gonad Hydrolysates,AMGHs)中分子量在3kDa以下的组分占酶解物的90%以上。氨基酸组分分析表明,雌、雄皱纹盘鲍生殖腺氨基酸种类齐全,必需氨基酸和呈味氨基酸约占总氨基酸的77%以上,是制备生物活性肽的良好来源。
  (5)针对水解过程中皱纹盘鲍雄性生殖腺酶解物(Abalone Male GonadHydrolysates,AMGHs)呈凝胶状的现象,对其功能特性进行进一步研究。结果表明,水解过程中AMGHs的弹性模量(G')均大于黏性模量(G"),表明AMGHs是以弹性为主的体系。酶解物的凝胶性随着酶解时间的延长而增强,呈现明显的剪切稀化现象,为非牛顿流体中的假塑性流体。水解后,AMGHs的理化特性同AMG相比有所改善。酶解50min后,溶解性显著提高,在pH值2~10范围内,氮溶指数达65%以上。持水性和持油性显著提高(p<0.05)。起泡性、泡沫稳定性及表面疏水性随着水解度增大先显著增加,50min后变化不大。同时,AMGHs的乳化性随水解度增大而降低。
  (6)以中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶水解皱纹盘鲍雌性生殖腺脱脂粉制备酶解物,并利用凝胶柱层析及ESI-QTOF-MS/MS质谱技术对皱纹盘鲍雌性生殖腺抗氧化肽进行分离鉴定。结果表明,中性蛋白酶对皱纹盘鲍雌性生殖腺酶解效果较好,1 kDa以下的组分占酶解物的65%以上,其中富含与抗氧化活性相关的氨基酸。对其进一步分离纯化得到5个抗氧化组分,其中组分4(F4)的抗氧化活性最高,对F4进行质谱分析,鉴定出一个序列为His-Gly-Asp-Gly-Trp-Trp-Gln的七肽(P1)。P1对DPPH和羟基自由基均有明显清除能力,其半抑制率浓度分别为6.50mmol/L和7.48mmol/L。
[博士论文] 姜丹莉
特种经济动物饲养 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:以四种不同食性的温水性鱼类草鱼Ctenopharyngodon idella、银鲫Carassius auratus gibelio、青鱼Mylopharyngodon piceus和大口黑鲈Micropterus salmoides为研究对象,分析了捕捞应激后鱼类下丘脑-垂体-肾间组织轴(Hypothalamic-pituitary-interrenal axis,HPI axis)、血浆和肝脏生理指标以及肝脏糖代谢酶活性的变化,并探讨了鱼类种类及食性、血浆葡萄糖水平和营养史(饥饿或正常摄食)对应激反应的影响。主要研究结果和结论如下:
  1、捕捞应激对草鱼HPI轴的影响:采用同源克隆方法获得草鱼HPI轴关键基因,包括促肾上腺皮质激素释放因子(Corticotropin releasing factor,CRF)、急性固醇调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、11β-羟化酶(11β-hydroxylase,CYP11C1)和糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)部分cDNAs序列:CRF部分片段长209bp,编码69个氨基酸;StAR部分片段长314bp,编码104个氨基酸;CYP11C1部分片段长347bp,编码115个氨基酸;GR部分片段长259bp,编码85个氨基酸。草鱼CRF、StAR、CYP11C1和GR与其它已知物种对应氨基酸序列的同源性分别为69%-99%、73%-86%、73%-89%和86%-98%。检测草鱼捕捞应激后1h时下丘脑CRF、肾脏StAR和CYP11C1、脑垂体阿黑皮素原(Proopiomelanocortin,POMC)和肝脏GR mRNA水平。结果显示应激后1h时草鱼下丘脑CRF、肾脏StAR和肝脏GR mRNA表达水平较应激前显著升高(P<0.05),而肾脏CYP11C1和脑垂体POMCmRNA表达量与应激前相比无显著差异(P>0.05)。
  2、捕捞应激后草鱼血浆生理指标、肝糖原含量及肝脏糖代谢酶活性的变化:测定草鱼在应激后5min、30min、1h、4h和24h血浆皮质醇、葡萄糖和乳酸水平、肝脏糖原含量以及肝脏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase,G6Pase)、己糖激酶(Hexoxinase,HK)和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)活性。结果显示:与应激前0h(对照组)相比,血浆皮质醇水平在应激后5min显著升高(P<0.05),在1h达到最高值(P<0.05)。血浆葡萄糖和乳酸水平在应激后30min显著升高(P<0.05),在1h升至最高(P<0.05)。应激后1h肝脏糖原含量显著降低(P<0.05),在24h恢复至应激前的水平(P>0.05)。应激后1h肝脏PEPCK活性显著高于对照组(P<0.05);应激后30min肝脏G6Pase活性显著高于对照组(P<0.05)。
  3.1、捕捞应激对草鱼(草食性鱼类)、银鲫(杂食性鱼类)和青鱼(肉食性鱼类)血浆皮质醇、葡萄糖和乳酸浓度、肝糖原含量以及肝脏HK和PK活性的影响:结果显示草鱼、银鲫和青鱼捕捞后血浆皮质醇、葡萄糖和乳酸浓度均显著升高(P<0.05);草鱼和青鱼捕捞后2h时肝糖原含量呈下降趋势(P<0.05),但银鲫捕捞前、后肝糖原含量未出现显著变化(P>0.05);捕捞前、后青鱼血糖浓度显著高于草鱼和银鲫(P<0.05)。银鲫肝糖原含量显著高于草鱼和青鱼(P<0.05),其捕捞后血浆葡萄糖和乳酸浓度增加幅度较小。草鱼和银鲫捕捞后肝脏HK和PK酶活性未发生显著变化(P>0.05),青鱼捕捞后2h时HK酶活性显著下降(P<0.05)。
  3.2、血浆葡萄糖水平对草鱼血浆和脑生理指标及肝脏糖代谢应激反应的影响:对草鱼按浓度0、0.2、0.5和1.0mg/g体重(Body mass,BM)分别腹腔注射葡萄糖溶液(命名为0G、0.2G、0.5G和1G组)。注射后1h进行捕捞应激(命名为0G-S、0.2G-S、0.5G-S和1G-S组)或不捕捞(命名为0G-NS、0.2G-NS、0.5G-NS和1G-NS组),检测草鱼应激前0h,应激后1h、2h和4h血浆生理指标[皮质醇、葡萄糖和乳酸浓度、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)活性],脑生理指标(葡萄糖、糖原和乳酸浓度)以及肝脏糖代谢指标(糖原含量和PEPCK、G6Pase、HK和PK酶活性)的变化。结果显示,1)血浆生理:在应激前,1G-S组血浆皮质醇浓度显著高于0G-S、0.2G-S和0.5G-S组,且1G-NS组血浆皮质醇浓度显著高于0G-NS、0.2G-NS和0.5G-NS组(P<0.05)。在应激后1h,0.5G-S组血浆皮质醇浓度显著低于其它三个应激组(P<0.05)。在应激前和应激后1h,应激组和不应激组血浆葡萄糖浓度都随着注射葡萄糖浓度的增加而升高(P<0.05)。在应激前、应激后1h、2h和4h,1G-S组血浆葡萄糖浓度显著高于其它三个应激组(P<0.05)。在应激后4h,血浆乳酸浓度和LDH酶活性都随着注射葡萄糖浓度的增加而升高(P<0.05)。2)脑生理:在应激前,0.5G-NS和1G-NS组脑葡萄糖浓度显著高于0G-NS和0.2G-NS组,且0.5G-S和1G-S组脑葡萄糖浓度显著高于0G-S和0.2G-S组(P<0.05)。在应激后1h和2h,1G-S组脑葡萄糖浓度显著高于其它三个应激组(P<0.05)。0.5G-S组脑糖原含量在应激后1h显著高于0G-S和0.2G-S组(P<0.05)。在应激后2h,0.5G-S组脑乳酸浓度显著高于0.5G-NS组(P<0.05)。3)肝脏糖代谢:在应激后2h和4h,1G-S组肝糖原含量显著低于其对应不应激组(P<0.05)。在应激后1h,0G-S组肝脏G6Pase酶活性显著高于其它应激组(P<0.05)。在应激后2h,0G-S组肝脏G6Pase酶活性显著高于1G-S组(P<0.05)。0G-S组肝脏G6Pase酶活性在应激后1h和2h显著高于其对应不应激组(P<0.05)。0.2G-S和1G-S组肝脏HK酶活性在应激后1h显著高于其对应不应激组(P<0.05)。
  根据上述结果得出以下结论:
  1、捕捞应激后草鱼HPI轴中CRF、StAR和GR途径被激活,肝脏糖原分解和糖异生活动加强。
  2、与草鱼和青鱼相比,捕捞后银鲫应激反应强度相对较低。捕捞后血糖升高未导致草鱼、银鲫和青鱼的肝脏糖酵解酶活性增强。
  3、腹腔注射1.0mg/g BM的葡萄糖可以在短时间内刺激草鱼血浆皮质醇浓度升高,而注射0.5mg/g BM的葡萄糖会抑制应激后血浆皮质醇浓度的升高。应激和血浆葡萄糖浓度都会促使草鱼脑葡萄糖浓度的升高。外源葡萄糖处理抑制了应激后的肝脏生糖作用,表现为应激后早期血糖浓度升高趋势慢,乳酸堆积加剧以及肝脏G6Pase酶活性升高受到抑制。
  4、营养史影响银鲫和大口黑鲈血浆生理、脑生理和肝脏糖代谢的应激反应。饥饿抑制银鲫应激后血浆皮质醇和血浆葡萄糖浓度的升高,抑制大口黑鲈应激后血浆葡萄糖和脑葡萄糖浓度的升高,表明饥饿在一定程度上降低应激反应。饥饿对银鲫应激后肝脏糖异生途径产生抑制作用,而在大口黑鲈中则作用相反。
  5、无论短期还是长期饥饿均会降低银鲫应激后血浆皮质醇和葡萄糖浓度。短期和长期饥饿后银鲫脑糖原含量显著降低,表明饥饿导致其脑糖原分解。短期和长期饥饿都会抑制银鲫应激后肝脏糖异生能力的增强。
[硕士论文] 谢彬月
水产养殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:鱼类的生殖发育及调控机制一直都是生命科学研究的重要课题之一,不仅有重要的理论意义,而且在指导鱼类品种改良上有重要应用。精子活力作为雄性生殖能力的重要指标,直接影响着受精率的高低和后代品质,提高雄性精子活力是鱼类品种改良的重要方向。本研究分别以黄颡鱼为研究对象,鉴定并分析了与其性别相关的基因;以斑马鱼为研究对象,寻找到一个对其精子活力有调控功能的miRNA。
  为了探索黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)性别分化和性腺发育的分子机制,我们在黄颡鱼性腺转录组数据中筛选到13个相关基因。表达谱分析表明,雄性相关基因中,piwi-1和amhr2在XY雄鱼和YY超雄鱼中的表达量明显高于XX雌鱼,amh在XY雄鱼中的表达量高于XX雌鱼和YY超雄鱼。雌性相关基因中,cyp19a和foxl2在XY雄鱼和YY超雄鱼中几乎不表达,但在XX雌鱼中有一定表达。从中选取amh和amhr2两个基因作进一步研究,在一龄黄颡鱼下丘脑-垂体-性腺轴和肝脏中,amh和amhr2均在雌雄性腺中的表达量最高;amh在雄鱼性腺和垂体中的表达量显著高于雌鱼,而在雌鱼肝脏中的表达量高于雄鱼;amhr2在雌、雄黄颡鱼性腺中表达差异不显著,而在雄鱼下丘脑、垂体和肝脏中的表达水平显著高于雌性。XY雄鱼腹腔注射EE2(17α-ethinylestradiol,17α-乙炔雌二醇)后,amh和amhr2的表达量呈现先上升后下调的趋势。XX雌鱼腹腔注射MT(17α-methyltestosterone,17α-甲基睾酮)后,amh的表达量在48和72 hpt时均低于正常水平,120 hpt恢复正常;amhr2的表达量在48 hpt显著下调,72和120 hpt时约为正常水平的一半。本研究鉴定了黄颡鱼性别相关基因并分析了其表达模式,为进一步研究黄颡鱼性别决定和分化机制提供了借鉴意义。
  精子活力受到体内和体外多重因素的影响,精子发生中每一个过程都会影响到最终精子的活力,miR-34家族在很多研究中都被报道与性腺发育和精子发生相关。为了探究miR-34a对斑马鱼精子活力的作用,我们使用改造的CRISPR/Cas9系统构建了miR-34a-/-(miR-34a纯合突变体)斑马鱼,经过精子活力测量和比对分析,发现miR-34a-/-斑马鱼精子活力高于WT(wild type,野生型)斑马鱼,激活精子的VAP(average path velocity,平均路径速度)、VSL(straight line velocity,直线运动速度)、VCL(curvilinear velocity,曲线运动速度)等参数显著性高于WT斑马鱼(P<0.05),前进性运动精子的VAP、VSL、VCL等参数极显著性高于WT斑马鱼(P<0.01)。通过文献检索,我们知道哺乳动物中Gsk3a、Foxa3、Foxo1a、 Hmga1、Hmgb2、Wt1等任一基因的突变或缺失都会对精子发生或精子活力造成某种伤害;与二倍体鲤鱼相比,foxk1、foxk2在异源四倍体鲤鲫中表达上调,而异源四倍体鲤鲫精子活力高于二倍体鲤鱼;上述发现都直接或间接证明了上述基因对精子活力的上调作用,而我们通过生物信息学方法发现,斑马鱼中上述基因或其等位基因的3' UTR区均存在与miR-34a种子区域(5'-…GGCAGU…-3')互补配对的序列,这说明miR-34a可能靶向调控上述基因,从而影响斑马鱼精子活力。检测miR-34a-/-斑马鱼肝脏、精巢、脑中上述miR-34a预测靶基因的表达量,发现每个基因的表达量都在一个或多个组织显著性升高。本研究证实了miR-34a对斑马鱼精子活力和上述预测靶基因具有负调控作用,miR-34a与其预测靶基因是斑马鱼精子活力基因调控网络的重要组成部分。
[硕士论文] 王雪薇
畜牧学;动物遗传育种与繁殖 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:本研究以二倍体(2n)和三倍体(3n)雌性虹鳟为实验对象,选取体质量相近,无病无伤、体质健壮、不同规格的二、三倍体雌性虹鳟,应用形态学、营养分析评价、组织学以及荧光定量PCR技术,探讨了随体质量增加二倍体雌性虹鳟和三倍体雌性虹鳟肌肉生长的差异及变化规律,对比研究了肌肉营养成分、骨骼肌肌纤维直径和密度及与肌肉生长相关基因的mRNA水平表达量等问题。本研究能够明确二、三倍体雌性虹鳟的肌肉生长和营养差异,以期为三倍体虹鳟的合理利用提供理论依据,并为多倍体分子遗传育种深入研究提供基础数据及科学的推广方向。对二、三倍体虹鳟骨骼肌肌纤维的对比研究,有助于为不同倍性鱼类生物进化、组织学、以及遗传育种等方面的研究提供基础理论依据,并合理利用现有资源。
  主要研究结果如下:
  (1)采用AOAC国际标准方法,对比分析二、三倍体雌性虹鳟背部肌肉中水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白及氨基酸含量。结果表明,与二倍体雌性虹鳟相比,三倍体水分含量低,但差异不显著。各组三倍体雌性虹鳟肌肉中粗蛋白和粗脂肪总含量均高于同组二倍体(P<0.05)。二、三倍体雌性虹鳟肌肉中的谷氨酸含量均为最高,且三倍体雌性虹鳟含量高于二倍体。随体质量的增长,二、三倍体雌性虹鳟的氨基酸含量均呈降低趋势,三倍体雌性虹鳟的氨基酸含量始终高于二倍体(P<0.05)。在二、三倍体雌性虹鳟中4种鲜味氨基酸(Glu、Gly、Asp、Ala)的含量比较高,均达到氨基酸总量的35%以上,且三倍体雌性虹鳟含量略高于同组二倍体。二、三倍体雌性虹鳟背部肌肉的氨基酸构成比例均高于FAO/WHO的评分标准。随体质量增加,二、三倍体雌性虹鳟的必需氨基酸指数(EAAI)逐渐降低,而三倍体的EAAI均高于二倍体雌性虹鳟。同时,各组虹鳟的化学评分(CS)和氨基酸评分(AAS)均较高。
  (2)应用石蜡组织切片方法,分析了二、三倍体雌性虹鳟背鳍下方肌肉肌纤维横切面的密度和直径。结果表明,背部肌肉肌纤维横切面直径与倍性呈正相关。三倍体雌性虹鳟肌纤维长径和短径均大于二倍体(P<0.05),而肌纤维密度则均小于二倍体(P<0.05),即三倍体雌性虹鳟背部肌肉肌纤维比二倍体更粗、更稀疏。二、三倍体雌性虹鳟背部肌肉肌纤维密度随体质量增加呈降低趋势,肌纤维直径随体质量增加呈升高趋势,表明随着虹鳟体质量的增加,肌肉嫩度降低,二倍体虹鳟的肉质比三倍体细嫩。
  (3)通过荧光定量PCR方法,比较了二、三倍体雌性虹鳟肌肉中肌分化因子(MyoD1)、肌肉生长抑制素(MSTN2)以及肌肉和肝脏中生长激素受体(GHR)和胰岛素样生长因子(IGF-1)mRNA水平的相对表达量。检测结果表明,三倍体雌性虹鳟肌肉中MyoD1表达量高于二倍体雌性虹鳟(P<0.05),而MSTN2相较二倍体雌性虹鳟则呈低表达(P<0.05)。同时,三倍体雌性虹鳟肌肉和肝脏组织中GHR表达量和IGF-1的表达量都显著高于二倍体雌性虹鳟(P<0.05)。
  综合上述结果表明,三倍体雌性虹鳟具有比二倍体雌性虹鳟营养价值高,肌肉蛋白质品质优,肌纤维更粗、面积更大,生长潜力更大的特点,而且肌肉生长的正向调控因子MyoD1基因的高表达与肌肉生长负向调控因子MSTN2基因的低表达,以及生长轴中GHR和IGF-1基因在肌肉和肝脏中的高表达与三倍体雌性虹鳟生长迅速及生长性能强存在一定的相关性,为基因调控肌肉生长提供了证据。
[硕士论文] 李宗栋
渔业资源 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:本研究于2013年7、8、12月到2014年2-6月采集滇池红鳍原鲌(Cultrichthyserythropterus)样本940尾,对其年龄、生长、繁殖和食性等四个方面的生物学特性进行了研究,分析其能够成为滇池优势种的主要原因,并就其对浮游植物产生的下行效应进行相关探讨。主要研究结果如下:
  1.共采集红鳍原鲌微耳石、鳞片、鳃盖骨和匙骨4种年龄材料。微耳石3龄及以下年轮特征明显,4龄及以上微耳石磨片以后年轮特征清晰。同一年龄鉴定者两次独立读龄的吻合率耳石最高(98.2%),鳞片(91.7%)和匙骨(66.5%)次之,鳃盖骨最低(59.8%);平均变异系数(CV)耳石(0.5%)最低,鳞片(2.1%)和匙骨(10.7%)次之,鳃盖骨最高(13.4%);耳石、鳞片、匙骨和鳃盖骨的可判读力分别为100%、98.7%、97.3%和90.0%;以耳石为基准判定鳞片、匙骨和鳃盖骨的吻合率分别为92.7%、77.2%和61.3%。综合分析认为耳石为最适宜的年龄鉴定材料,鳞片也是较为适宜的鉴定材料,鳃盖骨和匙骨不适宜作为红鳍原鲌的年龄鉴定材料。根据耳石边缘增长率(MIR)分析,红鳍原鲌耳石一年只形成一个年轮,年轮生成的时间主要集中在4-6月份,红鳍原鲌群体年龄组成为1-5龄,分别占总体的比例为6.8%,59.7%,27.8%,4.9%,0.8%。
  2.红鳍原鲌的体长范围为42-267mm,优势体长为70-160mm,占比83.6%;体重范围为0.5-329.1g,主要集中在40g以下,占总体的73.8%。拟合的体长体重关系为:雌性:W=7.001×10-6SL3.136,雄性:W=8.912×10-6SL3.073,性别未辨:W=5.154×10-6SL2.908。雌性为正异速生长,雄性为匀速生长,幼鱼为负异速生长。拟合出的体长von Bertalanffy生长方程为:雌鱼:Lt=316.6(1-e-0.200(t+0.7362)),雄鱼:Lt=299.6(1-e-0.250(t+0.5925));体重von Bertalanffy生长方程为:雌鱼:Wt=486.1(1-e-0200(t+0.7362))3136,雄鱼:Wt=363.4(1-e-0.250(t+0.5925))3.073。雌性的拐点年龄为4.9龄,此时的体长体重分别为214.1mm和142.5g,雄性的拐点年龄为3.8龄,此时的体长体重分别为145.6mm和39.6g。
  3.红鳍原鲌的雌雄性比为1.78∶1,体长100mm以下雄性个体占优势(0.86∶1),体长100mm以上雌性个体占据优势(2.27∶1),繁殖期间产卵群体性比比种群性比明显增大(3.12∶1)。初次性成熟体长雌性为88.7mm,雄性为69.1mm;初次性成熟年龄雌性为2.0龄,雄性为1.3龄。根据性成熟系数(GSI)的变化趋势图和性期的百分比变化图推测滇池红鳍原鲌的繁殖期为4-8月,主要集中在5-7月。卵径范围为0.5-1.6mm,主要集中在0.9-1.2mm(82.7%),根据卵径的变化趋势推测产卵类型为分批产卵类型。繁殖力计数样本的体长范围为111-238mm,体重范围为20.7-214.1g,绝对繁殖力为2100-51196粒,平均绝对繁殖力为11488±9636粒;相对繁殖力为86.1-352.3粒/g,平均相对繁殖力为202.9±73.8粒/g。绝对繁殖力与体长体重为显著线性关系,最佳拟合方程为:F=0.006SL2.826,F=198.5GW-1762.8。
  4.红鳍原鲌空肠率6月最低,3月最高,在繁殖期具有较高的摄食强度,冬季因环境变化摄食强度降到最低。根据相对重要指数百分比(IRI%),滇池红鳍原鲌最重要的饵料食物为溞属(30.76%)、虾类(14.22%)、象鼻溞属(13.35%)和小型鱼类(12.20%)。红鳍原鲌大小个体间具有明显的食性转变,体长130mm以下的红鳍原鲌主要摄食枝角类,体长160mm以上小型鱼类和虾类在红鳍原鲌的食物组成中占有更重要的比重。红鳍原鲌食物组成的季节变化不明显,雌雄不同性别个体间未见有明显的食物组成差异。
  综上所述,性成熟时间早,繁殖周期长,分批产卵等繁殖策略是红鳍原鲌成为滇池优势种的主要原因。红鳍原鲌主要摄食浮游动物,不利于浮游植物的控制,应控制其种群数量。
[博士论文] 郑侠飞
特种经济动物饲养 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:通过微生物操纵改善养殖环境是近十多年来水产养殖研究的热点。目前水产养殖生产中采用的微生物调控手段包括添加外源微生物(微生物制剂)或外源营养(碳)。有关微生物制剂改善养殖水质的效果,特别是降解无机氮的方面的作用尚存在分歧,原因之一是对微生物制剂影响环境的作用途径缺乏了解。添加微生物制剂不仅增加外源微生物,同时增加了有机碳,其对水环境的影响究竟是通过外源微生物在环境中定植、生长和相应的功能表达,还是通过改变原有微生物群落和功能?回答这一问题有助于正确评价微生物制剂改善水产养殖环境的作用。本研究利用原位实验系统探讨了添加微生物制剂和碳源对鱼类混养系统和蚌鱼综合养殖系统中土著细菌、浮游植物群落以及水中无机氮转化的影响,并分析了微生物制剂和碳源对养殖环境的交互影响。主要研究结果如下:
  1)采用16S rDNA测序分析了青鱼(Mylopharyngodon piceus)、加州鲈(Micropterus salmoides)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)养殖池塘中的细菌多样性。从12个池塘水体和底泥中分别获得了3701和11150个OTU。底泥中的OTU数目、ACE指数、Chao1指数、香农多样性指数均高于水层,表明底泥细菌的多样性和稳定性高于水层;水体中细菌优势门为Proteobacteria、Actinobacteria、Baeteroidetes,包括26个优势属,底泥中细菌优势门为Proteobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes、Acidobacteria、Nitrospirae,包括25个优势属。不同类型养殖池塘细菌组成在门水平上相似,在属水平上表现出较大的差异。池塘中细菌群落与水体硬度、氨氮、总氮显著相关。青鱼、加州鲈、黄颡鱼池塘中的氨氧化细菌(Nitrosomonadaceae_uncultured)相对丰度高于三角帆蚌池塘中,但池塘中氨氮浓度高于后者;青鱼、加州鲈、黄颡鱼池塘中的亚硝酸盐氧化细菌(Nitrospinaceae_uncultured)相对丰度高于三角帆蚌池塘中,但池塘中亚硝氮浓度高于后者。上述结果表明养殖种类和管理方式对养殖池塘细菌多样性具有显著的影响。
  2)通过80天的池塘原位实验评价诺碧清生物氨硝净、碧沃丰生物BZT清污、华元谷纳豆芽孢杆菌、EM微生物环境改良剂四种商业微生物制剂对三角帆蚌,草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和鲫鱼(Carassius gibelio)综合养殖系统产量和水质的影响。添加微生物制剂后蚌产量下降,对鱼产量无显著影响,对水质无明显的改善作用,但影响水体中细菌和浮游植物群落。水中细菌主要以Actinobacteria,Chlorobi,Verrucomicrobia,Proteobacteria为主。总氮、总磷、CODMn、蓝藻生物量对细菌群落具有显著影响。上述结果表明微生物制剂对改善蚌鱼综合养殖的效果不明显。
  3)通过30天室外水槽实验评价了碳氮比(6,8,10,12,14)对三角帆蚌、草鱼、鲫鱼和鲢(Hypophthalmichthys molitrix)综合养殖系统水质和细菌群落的影响。实验期间,每天投喂鲫鱼配合饲料。第0天、10天、20天、30天采样分析水质指标,第30天采集水体和底泥样品分析细菌群落。实验中总氮、总磷、总有机碳逐渐积累。氨氮和亚硝氮随着碳氮比升高而降低。水体和底泥中的细菌群落无论在门还是属的水平上均随着碳氮比升高而改变,导致水体和底泥中细菌群落明显变化的碳氮比分别是10和12。碳氮比升高有利于潜在益生菌和致病菌的生长。高碳氮比提高了水体和底泥细菌中化能异养和碳水化合物降解功能团的相对丰度,降低了硝化和反硝化功能团的相对丰度。上述结果表明添加外源碳改变水中碳氮比可显著影响蚌鱼综合养殖系统中的细菌群落和水质。
  4)比较了添加碳源、添加微生物制剂、联合添加碳源和微生物制剂对鱼类混养系统环境和细菌群落的影响。实验利用设在养殖池塘中的2000L原位水槽进行,每个水槽中放养2尾草鱼、2尾鲫、1尾鲢。每天投喂配合饲料。当实验进行到40天时将水槽分为四组,一组作为空白对照,一组每6天添加葡萄糖60g,一组每6天添加诺碧清净水剂和氨硝净各2g,一组每6天添加葡萄糖60g、诺碧清净水剂和氨硝净各2g。实验结果表明:添加碳源能显著降低氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐,添加微生物制剂不能降低无机氮,添加碳源和微生物制剂对降低无机氮无协同作用。添加处理前后,各处理组中无论在门或属水平上的优势种均未发生变化。碳源和微生物制剂影响Bacillus和hgcI_clade属细菌的相对丰度且两者存在交互效应。
  5)分析了蚌鱼综合养殖池塘中铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)和血红裸藻(Euglena sanguinea)水华中大型聚集物(直径>10μm)结合细菌、小型聚集物(直径1-10μm)结合细菌、浮游细菌(直径0.22-1μm)。两种水华中优势细菌门为Proteobacteria和Bacteroidetes,而Actinobacteria门细菌的相对丰度在两种水华水体中都有所降低。Gemmatimonadetes门细菌主要集中在大型聚集物上,Bacteroidetes门细菌主要集中在小型聚集物上,Candidate_division_TM7门细菌主要聚集在浮游细菌群落中。蓝藻水华中细菌优势种为Chlorobi,Chloroflexi,Fusobacteria门细菌;裸藻水华中细菌优势种为Deinococcus-Thermus门细菌。化能异养功能团主要集中在小型聚集物上和浮游细菌中,而需氧氨氧化,硝化反应、人体疾病相关功能团主要集中在蓝藻水华中大型聚集物上。上述结果表明藻际环境提供了不同的细菌生态位,不同的细菌表现出功能分化。不同浮游植物种类水华中存在各自的特异性细菌群落。
  6)在单种培养小球藻(Chlorella variabilis)中添加微生物制剂诺碧清(两株活性菌种为Bacillus licheniformis和Bacillus sp.),在有光照和无光照的情况下分别监测初级生产力和群落呼吸。结果表明添加外源细菌后显著提高小球藻初级生产力和群落呼吸,增加了小球藻丰度和藻液中细菌丰度,但对小球藻藻液中细菌群落未产生显著影响。该研究表明外源细菌可以通过提高小球藻初级生产力和细菌丰度改善水质,但未改变细菌群落组成。
  7)分析了外源碳调控鱼类混养系统中无机氮途径及浮游植物和细菌对无机氮转化的作用。利用2000L聚乙烯水槽构建中型混养实验系统,每个水槽中放养1公斤草鱼,3条鲫,1条鲤鱼(Cyprinus carpio),1条鲢。每天投喂配合饲料。实验进行30天后,按照氨氮与外源碳1∶3和1∶6的比例设低碳源组和高碳源组,另设一组空白对照。实验结果表明,对照组、低碳源组、高碳源组中氨氮均显著下降,对照组中以硝化作用为主,低碳组中兼有硝化作用和同化作用,高碳组中以同化作用占主导。低碳组中细菌群落内差异程度显著低于对照组和高碳组的组内细菌群落差异。细菌Chloroflexi门及其门下的Roseiflexus属相对丰度随着碳源增加而增加。此外,利用500mL蓝盖玻璃瓶构建原位微型实验系统。一组不添加任何东西作为空白对照;一组按氨氮∶外源碳=1∶6添加碳源;一组先将浮游植物过滤后再添加碳源;一组添加碳源同时添加抗生素抑制细菌生长。实验结果表明,碳源丰富情况下细菌和浮游植物对氨氮存在竞争关系,细菌同化作用不但能利用氨氮还能利用亚硝酸盐和硝酸盐,浮游植物同化作用以氨氮为主,细菌同化作用很大程度上被浮游植物抑制。在碳源丰富的情况下细菌Proteobacteria门存在着竞争优势,而细菌Bacteroidetes和Spirochaetae门存在竞争劣势。碳源丰富情况下,Planctomycetes、Acidobacteria、Firmicutes门细菌的生长受浮游植物抑制。
  根据本研究结果,得出如下结论:
  1)在三角帆蚌,草鱼和鲫鱼综合养殖系统中添加诺碧清生物氨硝净、碧沃丰生物BZT清污、华元谷纳豆芽孢杆菌、EM微生物环境改良剂等四种商业微生物制剂不会明显改善养殖产量和水质。
  2)在三角帆蚌、草鱼、鲫鱼和鲢综合养殖以及草鱼,鲫,鲤鱼和鲢混养系统中添加碳源可在一定程度上改善养殖水质,并且随着碳氮比变化养殖水体和底泥中细菌群落发生明显的变化。
  3)将硝化菌剂灭菌后其功能与未灭菌的作用无明显变化,表明添加微生物制剂影响环境中无机氮转化的原因可能是其本身发挥了碳源的作用。
[硕士论文] 刘宏星
生物学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)是我国南方海区重要的养殖贝类。课题组经过多年选育,于2014年成功培育出富含类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝“南澳金贝”新品种。尽管,课题组从遗传、环境、生理等方面对“南澳金贝”富集类胡萝卜素的机制都做了一定的探讨,然而,随着研究的深入,更多的科学问题也越来越引起了我们的注意,如有大量报道指出肠道菌群在宿主的营养代谢等方面发挥着重要的作用,是否肠道菌群与“南澳金贝”类胡萝卜素的代谢之间也存在密切的联系?
  本研究以贝壳、外套膜、闭壳肌、肠道均为橙色的“南澳金贝”为研究对象,以贝壳、外套膜为橙色,但闭壳肌、肠道均为白色的橙壳扇贝和贝壳为褐色、外套膜、闭壳肌、肠道均为白色的褐壳扇贝为对照,采用qPCR和Illumina高通量测序的方法,分别从肠道组织类胡萝卜素的吸收代谢和肠道菌群的组成多样性方面进行了研究。主要结果如下:
  一、肠道类胡萝卜素代谢相关指标
  1)肠道组织中的总类胡萝卜素含量:“南澳金贝”、橙壳扇贝、褐壳扇贝的值分别为86.5μg/g、27.4μg/g和6.5μg/g,“南澳金贝”显著高于后两者(P<0.05)。
  2)肠道组织中类胡萝卜素相关基因的表达:类胡萝卜素吸收相关的SRB1和SRB4基因在“南澳金贝”和橙壳扇贝的mRNA表达水平显著高于褐壳扇贝;转运相关的StAR3基因在橙壳扇贝和“南澳金贝”中也出现了显著的高表达;参与类胡萝卜素氧化裂解的BCMO2基因在褐壳扇贝中的mRNA表达水平显著高于其他两种扇贝。
  3)血液中类胡萝卜素相关基因的表达:“南澳金贝”的SRB1和StAR3基因显著的高表达;在褐壳扇贝中,除BCMO2的表达量显著高于其他扇贝外,SRB4基因也出现了显著的高表达;相比于其他两种扇贝,在橙壳扇贝中所有的基因显著的低表达。
  由此,我们推测:“南澳金贝”肠道组织中可能存在更为完善的类胡萝卜素富集机制;橙壳扇贝在肠道和闭壳肌表现出的低类胡萝卜素含量,可能与血液在不同组织间的运输有关;褐壳扇贝肠道中存在较低的类胡萝卜素积累机制。
  二、肠道菌群组成的多样性(Illumina测序分析)
  1)三种扇贝都具有相似的主要优势菌,然而主要优势菌的丰度却不尽相同。主要优势菌门可以分为五类,分别为变形菌门Proteobacteria(32.3%~84.1%),软壁菌门Tenericutes(3.4%~44%),拟杆菌门Bacteroidetes(3.1%~35%),厚壁菌门Firmicutes(0.4%~18.9%),和梭菌门Fusobacteria(0.2%~10%)。其中,弧菌属Vibrio(3.5%~71.1%),支原体属Mycoplasma(2.6%~55.4%),拟杆菌属Bacteroides(0.05%~20.1%)和盐单胞菌属Halomonas(0.02%~19.7%)为主要的优势菌属。并且,“南澳金贝”肠道中弧菌属Vibrio所占的比例显著低于其他两种扇贝(P<0.05)。
  2)Alpha多样性指标结果显示,“南澳金贝”肠道菌群的多样性和丰度指数均高于橙壳扇贝和褐壳扇贝,并且“南澳金贝”的Chao1指数和Shannon指数都显著的高于橙壳扇贝(P<0.05),橙壳扇贝和褐壳扇贝之间没有显著差异。
  3)通过非度量多维尺度法(NMDS)分析和聚类分析,我们发现“南澳金贝”各样品间的菌群组成较为相似,而橙壳扇贝和褐壳扇贝的各样品间的菌群组成较为散乱。
  4)LEfSe组间显著性差异分析结果显示:“南澳金贝”的肠道菌群中α变形菌纲Alphaproteobacter(Mean:16.1%)的红细菌目Rhodobacterales(Mean:12.9%)和红细菌科Rhodobacteraceae(Mean:12.9%)都存在显著性的高丰度;并且“南澳金贝”肠道中的拟杆菌在目Bacteroidales(Mean:15.1%)和科Bacteroidaceae(Mean:1.5%)水平上有都存在显著地高丰度。另外,一种未分类细菌bacteria在橙壳扇贝的肠道菌群中占有显著的高比例;γ变形菌Gamaproteobacter(Mean:47.3%)在褐壳扇贝的肠道菌群中占有显著的高比例。
  5)功能预测的PICRUSt分析结果表明:“南澳金贝”样品中,肠道菌群在氨基酸和脂肪酸代谢的功能基因出现显著的增加。另外,相比于橙壳扇贝,“南澳金贝”肠道菌群中类胡萝卜素合成的功能基因也出现显著的增加,说明肠道菌群可能与机体的类胡萝卜素富集机制有关。
  相比于低类胡萝卜素含量的橙壳扇贝,“南澳金贝”肠道菌群组成具有更为显著的多样性和丰度。并且较于其他两种扇贝,“南澳金贝”肠道菌群表现出更为稳定的组成结构。
  基于以上结果,我们认为肠道的类胡萝卜素环境可能与肠道菌群之间存在着密切的联系,肠道的类胡萝卜素环境可能在肠道菌群的多样性和稳态方面发挥着重要的作用。肠道的高类胡萝卜素环境可能有利于提高菌群的多样性和稳态。
  本研究从肠道微生态环境的角度,对三种不同颜色表型的华贵栉孔扇贝完成了肠道菌群组成的高通量测序分析,并结合肠道类胡萝卜素相应的代谢指标检测,较完善地直接证实了肠道菌群与类胡萝卜素之间可能存在密切的联系。为“南澳金贝”富集类胡萝卜素机制提供了一个新思路,并且为肠道菌群在类胡萝卜素代谢方面的进一步研究提供了理论依据。
[硕士论文] 孙海峰
水生生物学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,扬州市高邮区域部分罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)养殖塘口出现“生长缓慢”症状,虾农统称为“铁壳虾”,“铁壳虾”现象凸显,给虾农带来了一定的经济损失和巨大的精神压力。国内学者从多方面对其进行了研究,但是,迄今为止,对于引起罗氏沼虾生长阻滞现象的主要原因仍无定论。罗氏沼虾作为甲壳动物,其生长伴随着蜕壳的过程,而蜕壳受到蜕壳激素的影响,生长阻滞的罗氏沼虾有可能存在激素水平的异常,而与激素相关的基因表达也可能表现出不同。因此,本论文假定,生长阻滞罗氏沼虾的激素含量及其相关基因的表达完全不同于生长正常的罗氏沼虾。为了验证上述假说,本论文以高邮区域人工饲养的罗氏沼虾为研究对象,首先测定采集样本个体的形态学参数,采用不同的数学统计方法对各形态学参数进行分析,确定鉴定罗氏沼虾生长阻滞个体的最佳统计学方法和最佳度量的参数;然后按照以上确定的最佳参数对不同的样本进行分类,对分类个体进行蜕皮时期的判别,选择蜕皮间期的罗氏沼虾,通过酶联免疫法测定各类样本中蜕皮激素、蜕皮抑制激素和甲基法尼酯的含量,通过荧光定量PCR测定各类样本的肝胰腺和眼柄中生长相关基因的mRNA表达水平,通过Western Blot测定各类样本的肝胰腺和眼柄中EcR蛋白的表达,探讨各类激素及其相关基因在生长阻滞现象中的作用,揭示影响水生甲壳类动物生长的生理调控机制,为广大养殖户的健康养殖提供可能的新措施和新方法。研究结果如下:
  1)聚类分析中能够将样本划分为正常虾、正常幼虾和阻滞虾的参数有体重、肥满度和第一尾节宽度/体长;主成分分析中能够区分三类虾的参数有体长、腹尾长、螯长、第一尾节宽度、体长/体重、腹尾长/体重;相关性分析中能够区分三类虾的参数有体重、体长、腹尾长、第一尾节宽度、体长/体重、腹尾长/体重。综合分析认为,聚类分析是最佳统计学方法,体重、肥满度和第一尾节宽度/体长3个参数是最佳统计学参数。区分正常虾、正常幼虾和阻滞虾的参数标准为:雄性体重参数范围22.1668~25.1034、17.0517~17.6608和13.4706~14.214,雄性肥满度参数范围1.1598~1.2127、1.2541~1.2640和1.1274~1.1556,雄性第一尾节宽度/体长比值参数范围0.1294~0.1360、0.1363~0.1384和0.1435~0.1494;雌性体重参数范围18.1526~19.9768、13.2198~14.0242和11.1046~11.9157,雌性肥满度参数范围1.1332~1.1563、1.1873~1.2075和1.1010~1.1107;雌性第一尾节宽度/体长比值参数范围0.1327~0.1376、0.1392~0.1414和0.1415~0.1441。
  2)2015年8月采集的样本中,雄性阻滞虾20E水平显著低于正常虾(P<0.05),雌性阻滞虾20E水平显著低于正常虾和正常幼虾(P<0.05);雌性阻滞虾MIH水平显著高于正常虾和正常幼虾(P<0.05);雌雄阻滞虾MF水平均显著低于正常虾(P<0.05)。2016年6月采集的样本中,雄性阻滞虾20E水平显著低于正常虾和正常幼虾(P<0.05),雌性阻滞虾20E水平显著低于正常虾(P<0.05);雌雄阻滞虾MIH水平均显著高于正常虾和正常幼虾(P<0.05);雌性阻滞虾MF水平显著低于正常虾和正常幼虾(P<0.05)。
  3)2015年8月采集的样本中,雄性阻滞虾肝胰腺中的EcR mRNA表达量显著低于正常虾(P<0.05),MIH mRNA表达量显著高于正常虾和正常幼虾(P<0.05),RxR mRNA表达量显著低于正常虾和正常幼虾(P<0.05),雄性阻滞虾眼柄中的MIH mRNA表达量显著高于正常幼虾(P<0.05);雌性阻滞虾肝胰腺中的EcR mRNA表达量显著低于正常虾和正常幼虾(P<0.05),JHEH mRNA表达量显著高于正常幼虾,MIH mRNA表达量显著高于正常虾和正常幼虾(P<0.05)。2016年6月采集的样本中,雄性阻滞虾肝胰腺中的EcR和RxR mRNA表达量均显著低于正常虾和正常幼虾(P<0.05),GIH、 MIH和JHEH mRNA表达量均显著高于正常虾和正常幼虾(P<0.05),雄性阻滞虾眼柄中的GIH和MIH mRNA表达量显著高于正常虾和正常幼虾(P<0.05);雌性阻滞虾肝胰腺中的EcR和RxR mRNA表达量显著低于正常虾和正常幼虾(P<0.05),GIH和MIH mRNA表达量显著高于正常虾和正常幼虾(P<0.05),JHEH mRNA表达量显著高于正常幼虾(P<0.05),雌性阻滞虾眼柄中的GIH和MIH mRNA表达量显著高于正常虾和正常幼虾(P<0.05)。
  4)2015年8月采集的样本中,雌性阻滞虾和正常幼虾眼柄中的EcR含量显著低于正常虾(P<0.05)。2016年6月采集的样本中,雄性阻滞虾肝胰腺中的EcR含量显著低于正常虾(P<0.05);雌性阻滞虾眼柄中的EcR含量显著低于正常虾(P<0.05)。
  以上结果表明,聚类分析、主成分分析和相关性分析均可区分生长阻滞罗氏沼虾,聚类分析是区分的最佳统计学方法,而体重、肥满度和第一尾节宽度/体长是区分生长阻滞罗氏沼虾的最佳参数;生长阻滞虾中20E和MF的含量较低,而MIH的含量较高;生长阻滞虾中EcR和RxR基因表达量和蛋白水平较低,而MIH基因表达量较高。说明阻碍罗氏沼虾生长的原因可能是EcR和RxR的表达量下降和MIH表达量升高降低了20羟蜕皮激素和甲基法尼酯的水平、提高了蜕皮抑制激素水平所致。
[硕士论文] 刘鹏飞
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:丰富的海洋生物是新型抗肿瘤活性物质的重要来源。近年来,已从海洋生物中分离和鉴定出了许多具有抗肿瘤活性的天然物质,显示出诱人的研究开发前景。鲎是一种古老的海洋动物,生活了4亿多年,被称作是“活化石”,其体内含有特殊的活性物质。世界上仅存四种鲎,美洲鲎、蝎鲎、巨鲎与中华鲎。分布在我国海域的鲎称作中华鲎。我国中华鲎资源丰富,占世界上鲎资源的98%。本研究对中华鲎进行活性物质的分离纯化、鉴定及活性分析,其主要的研究结果如下:
  (1)对中华鲎进行部位分割,分为鲎壳、鲎脚、鲎内脏、鲎尾4个部分。分别用甲醇进行萃取,得到四个部位的粗提物,采用高效液相色谱技术(HPLC),对这四个部位进行化学成分的分析。确定最佳色谱条件为紫外检测波长220 nm,上样浓度为1 mg/mL,流速为0.2 mL/min,流动相为乙腈-0.1%甲酸超纯水溶液。相似度分析显示,鲎尾与鲎壳、鲎脚、鲎内脏的化学成分相似度在60%以下。在流动相为60%的乙腈水-95%的乙腈水条件下,鲎尾与其它部位存在大量色谱重合,但流动相为100%的乙腈时,鲎尾与其它部位的色谱差异很大,存在很多其它部位没有的色谱峰。因此,以化学成分差异最大的鲎尾作为实验材料,进行下一步的分离纯化。
  (2)通过凝胶柱层析、中压反相C18柱层析以及正相硅胶柱层析技术,从鲎尾的甲醇粗提物中分离纯化得到13种化合物。采用NMR核磁共振技术、ESI-MS电喷雾质谱技术,通过对一维和二维核磁谱谱图的解析,鉴定化合物最终的结构。鉴定出11种化合物分别为:胆甾醇、亚油酸甲酯、犬尿酸、矿油精、亚油酸、邻苯二甲酸二辛酯、2-十五烷酮、胆甾醇乙基碳酸酯、甲基丙烯酸月桂酯、胆甾醇苯乙酸酯、N-Cbz-甘氨酸乙酯。
  (3)对分离得到的11种化合物进行MTT细胞体外活性增殖试验。在24 h细胞毒性增殖试验中犬尿酸、亚油酸、2-十五烷酮、甲基丙烯酸月桂酯对人的肝癌HepG2细胞有较好的抑制活性,其中犬尿酸、亚油酸、2-十五烷酮对人的正常LO2细胞无细胞毒作用而甲基丙烯酸月桂酯对人的正常LO2细胞有较强的杀伤作用。对犬尿酸、2-十五烷酮和顺铂进行72h细胞毒性增殖实验,犬尿酸、2-十五烷酮和顺铂对HepG2细胞的IC50分别是75.50μg/mL、48.65μg/mL、19.39μg/mL,对LO2细胞的IC50分别是280.23μg/mL、250.61μg/mL、118.53μg/mL。结果表明,无论在24 h和72 h条件下,犬尿酸、2-十五烷酮对人的肝癌HepG2细胞都有较好的抑制活性,并且对人的正常LO2细胞无细胞毒作用,甲基丙烯酸月桂酯对人的正常LO2细胞有杀伤作用。
[硕士论文] 祝本强
渔业 浙江海洋大学 2017(学位年度)
摘要:于水温(30±1.0)℃、盐度17条件下,以水流为胁迫因子(时长1min),以黑鲷幼鱼(体长99.843±2.071mm)为实验对象,用自行设计并制作总流长为540cm抗流性能测定装置,以溢水口底部为起点,将该装置均匀划分为五个区段,A(0-90cm)、B(90-180cm)、C(180-270cm)、D(270-360cm)、E(360-540cm),以实验结束时依然有占实验鱼总数5%的黑鲷幼鱼能够位于A区段内为标准,经预实验确认该流速为39.7cm/s后,将其分为5个不同抗流性能的实验群体A、B、C、D、E。然后测量5个不同抗流性能群体的28项形态表型参数、背肌质构及鳃、肝脏抗氧化酶、消化酶活力和ATP酶活力。结果表明:
  (1)本实验测定的黑鲷幼鱼5个不同抗流性能群体间28项形态表型性状中,有6项有显著性差异。在C2(尾鳍两基点距离/鼻间距)、C4(背鳍周长/鼻间距)、C5(尾部长/鼻间距)、C16(背鳍周长/腹鳍前后缘的直线距离)中A与B、C、D、E具有显著性差异,C8(头宽/鼻间距)、C14(全长/腹鳍前后缘的直线距离)、C17(胸鳍点周长/腹鳍前后缘的直线距离)、C18(尾部长/腹鳍前后缘的直线距离)、C21(鳃盖背缘至背鳍基点距离/腹鳍前后缘的直线距离)、C22(背鳍部体高/腹鳍前后缘的直线距离)中A与B、D、E有显著性差异,C1(全长/鼻间距)、C3(胸鳍点周长/鼻间距)、C7(鳃盖背缘至背鳍基点距离/腹鳍前后缘的直线距离)、C9(体长/鼻间距)、C12(尾柄高/鼻间距)中A与B、C、E有显著性差异,C6(体高/鼻间距)、C13(体宽/鼻间距)、C19(体宽/腹鳍前后缘的直线距离)、C20(腹鳍后基点/腹鳍前后缘的直线距离)、C24(净体重/肝胰脏重)、C25(胃重/肝胰脏重)、C27(肠重/体重)、C28(肥满度)等8项中均存在两者之间的显著性差异,其中A与B具有显著性差异的是C9(体长/鼻间距)、C20、C27,A与C有显著性差异的是C24和C25,A与E有显著性差异的是C6和C13,仅有C28是A与D有显著性差异。对形态比例进行主成分分析,提取到5个主成分,其方差累计贡献率为81.87%。将第一组定义为抗流性能最强群,第五组定义为抗流性能最弱群,其它三组定义为抗流性能中间群。运用逐步判别分析法对形态比例性状进行分析,建立了自变量为C13、C16、C26的Fisher分类函数,能够将抗流性能最强群、抗流性能中间群和抗流性能最弱群个体较清楚的分辨出来,其综合判别准确率为88.76%。
  (2)质构差异,硬度、弹性、咀嚼性A组与D、E两组都存在显著性差异(P<0.05)。黑鲷幼鱼抗流性能越强,其弹性和硬度也越大,且B与D、E间的弹性及硬度存在显著性差异。凝聚性和恢复性均无显著性差异(P>0.05)。黏着性A与B之间有显著性差异。
  (3)耗氧率差异,6:00-18:00耗氧率A、B、D三者间均存在显著性差异,仅在18:00-22:00时段B与C间无显著性差异,且该时段各组耗氧率比其它时段对应各组都要低。5个不同抗流群体间窒息点均无显著性差异。排氨率,在6个时段中除6:00-10:00外,其余时段的排氨率A与B组间均存在显著性差异。在10:00-22:00之间B与C组间有显著性差异(P<0.05)。在02:00-06:00、14:00-22:00时段C与D有显著性差异。仅6:00-14:00时,D与E无显著性差异。
  (4)消化酶活力差异,胃蛋白酶活力A与E具有显著性差异(P<0.05),胃蛋白酶活力随着抗流能力的减弱而增大。胰蛋白酶活性C与A、B、D、E均有显著性差异(P<0.05),呈现出大致显现出先增加后减弱的趋势。脂肪酶活性,A与D、E有显著性差异(P<0.05),A、B、C三者之间无显著性差异(P>0.05)。其中抗流性能最强的A群体淀粉酶活性最大。A与B、C、D、E之间都有显著性差异(P<0.05)。
  (5)抗氧化酶酶活力差异,不同抗流性能群体间SOD活力呈现出下降趋势。A、B、C、D间无显著性差异(P>0.05)。A组与E组之间存在显著性差异。ATP酶活力差异,黑鲷幼鱼肝脏Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力均呈现出逐渐下降的趋势,且A与E组存在显著性差异(P<0.05)。
[博士论文] 张莹莹
水生生物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:双酚A(BPA)是一种重要的化工原料,广泛用于食品与饮料的包装、婴儿奶瓶、塑料水杯、眼镜等各种日常用品的制造过程中。由于具有和内源性雌激素(E2)类似的结构,BPA可以模拟E2的功能,干扰机体的正常生殖发育。研究表明生殖相关激素合成紊乱、精巢的发育异常以及精子的质量下降等均与BPA的暴露存在一定关系,但其具体的分子机制尚不十分明确。本研究以稀有鮈鲫为研究模型,通过高通量测序,在转录组水平上研究不同浓度BPA对精巢基因表达的影响,并以转录组数据为基础,在性激素合成、生殖细胞发育、精子形态功能以及生物标志物四个方面进行后续深入研究,主要研究进展如下:
  1.转录组结果表明暴露1周后,1,15和225μg/L BPA均可影响精巢的性激素合成、血睾屏障、蛋白质水解、脂质转运和代谢、细胞周期以及细胞凋亡相关基因的表达;1μg/LBPA主要影响肾素血管紧张素系统通路相关基因,并且可能激活mER通路;1和15μg/LBPA主要抑制tRNA加工相关基因的表达;15和225μg/LBPA主要抑制止血和血液凝固相关基因的表达。
  2.在转录组数据中发现性激素水平以及其合成相关基因的表达在BPA处理下显著变化。为探究其分子机制,我们克隆分析了性激素合成相关酶类(star、hsd3b、hsd11b2、cyp11a、cyp17a1及cyp19a1a)启动子,结果发现性激素合成相关基因启动子区存在性激素受体(Esrs及Ar)及转录因子(Nr5as及Foxl2)的潜在作用元件。并发现在5,15和50μg/L BPA作用2周和5周后,star与esr1,hsd3b与nr5a1a/hsd11b2/nr5a1a/esr2b,yp11a与nr5a1a/nr5a1b,cyp17a与esr2b/ar,cyp19a1a与foxl2/esrs的mRNA表达变化之间均存在显著相关关系。证实BPA对稀有鮈鲫性激素合成的影响可能包含改变性激素合成途径中的esrs/ar,以及改变转录因子nr5a1/foxl2的表达这两个途径。
  3.在鱼类上未有BPA诱导生殖细胞凋亡的报道,但转录组结果显示225μg/L BPA对精巢凋亡相关基因表达有显著影响。在225μg/L BPA处理雄鱼1、3和9周后,通过TUNEL染色以及超微结构观察发现BPA可以诱导精母细胞凋亡,并且随暴露时间的延长而加剧。WB检测发现在精巢抗凋亡蛋白Bcl2与促凋亡蛋白Bax比值的下降是BPA诱导精母细胞凋亡的主要原因;由bcl2、bax、casp9、cytc以及mcl1参与的内源的线粒体途径在在一过程有重要作用;与此同时,细胞分裂相关基因kpna7、wee2以及既参与细胞分裂又参与细胞凋亡的基因birc5、ccna1、gasa1a也都受到BPA影响,推测BPA所诱导的精母细胞凋亡与细胞周期阻滞可能存在一定关系。
  4.通过超微结构观察发现15和225μg/L BPA的暴露影响了稀有鮈鲫精子细胞质收缩以及细胞膜完整性;同时精子的运动时间受到影响,受精能力也被减弱,并且这些影响随着BPA暴露时间的延长、浓度增加(1、2和3周)而加剧,但是其机制并不明确。而转录组数据显示在BPA处理下,参与精子形变、运动以及渗透压调节的aqps基因表达被显著诱导。我们通过渗透压耐受性实验证实BPA暴露后的雄鱼排出精子的低渗透耐受力下降,提示aqps确实参与了BPA所诱导的精子形态异常及功能减弱。随后的IHC和WB结果表明Aqp3及8蛋白广泛分布在各阶段的生殖细胞中,并且在BPA的处理下,Aqp3及8的表达量显著升高,这可能是精子形态及功能发生改变的主要原因。最后ChIP试验证实BPA可以通过提高Esr在aqp3及8启动子区的募集来诱导其表达。
  5.转录组数据显示肝脏特异性环境雌激素标志物vtg在稀有鮈鲫的精巢中表达,其表达量随BPA浓度增加显著性下降。IHC结果发现Vtg蛋白存储于精原细胞及精母细胞细胞质中,暗示Vtg在精子发生过程中可能发挥重要作用。后续ChIP和CoIP试验证实BPA会抑制精巢Esr-Hsp90复合体的解离,减少了游离的Esr,从而减弱vtg的转录激活,抑制其在精巢合成。但肝脏中BPA诱导的Vtg可能补充到精巢,在长时间暴露后精巢Vtg蛋白水平有所恢复。精巢vtg1与vtg2基因的转录在BPA的处理下呈时间依赖性下降。因此在BPA处理下,精巢vtg基因有作为精巢组织特异性的生物标志物的潜力。
  综上所述,本研究证实BPA对稀有鮈鲫精巢影响是多方面的,BPA可以通过影响精巢性激素受体基因及转录因子的表达来影响性激素合成酶类的表达,进而影响精巢性激素合成;通过内源性线粒体途径诱导精母细胞凋亡,并与精母细胞减数分裂受阻有一定关系;通过诱导Aqps的表达影响精子形态异常和运动、降低其渗透压耐受性,从而降低其受精能力。此外,BPA可以降低精巢内源性Vtgs的合成,精巢vtgs基因有潜力作为精巢对BPA预警的特异性生物标志物。
[硕士论文] 张春草
渔业资源 浙江海洋大学 2017(学位年度)
摘要:本文基于2014年秋季和2015年春季的七星列岛海域的底拖网渔获物进行分析,研究七星列岛海域游泳动物的种类组成、两季物种更替率、生态类型、优势种、群落结构特征、多样性、受干扰程度及功能群多样性。
  本调查共捕获游泳动物共80种,隶属于3纲14目42科62属,其中鱼类52种,虾类13种,蟹类10种,头足类5种,渔获物两季种类变化,秋季(61种)>春季(52种),两季都出现的种类为30种,占总种数的37.5%,季节洄游性明显。其中暖水种共42种,暖温中为38种,没有发现冷温种,近海洄游种类为主,有58种,定居沿岸种为15种,河口洄游种类为7种。相对重要性指数表明两季一共有10种优势种,秋季有6种,底层种类3种,近底层种类2种,中上层种类1种,春季有4种,底层种类2种,近底层和中上层种类均为1种,优势种以底层种类为主。
  NMDS分析结果显示,秋季,标序图有一定的解释意义,而春季的标序图是一个好的排序。聚类分析表明,12站位在两季的聚类情况为,秋季在70%的相似性水平上可以分为4组,春季在60%的相似性水平上可以分为4组。SIMPER分析表明,秋季,群组之内的特征种与群组之间的分歧种差异不大,而春季的差异较大。ANOSIM分析表明,春季有2对组合有显著性差异,分别为G1、G4,而G2、G4组合的P值为0.008<0.01,有极显著差异性;春季有3对组合有显著性差异,分别为,G1、G2,G2、G3,G2和G4。
  多样性指数分析显示,两季游泳动物多样性均处于中等水平,秋季的3种多样性指数范围、均值均稍大于春季,这和物种数及均匀度有关,秋季物种数多于春季,站位分布也更均匀。秋季均匀度指数(J')>0.7的站位有6个,而春季只有3个站位。参考《水生生物检测手册》,H'=1~3,表明该海域水体受人为影响程度为中度影响。ABC曲线分析显示,秋、春两季W值为0.052和-0.059<0,均接近于0,表明七星列岛海域游泳动物群落处于中度干扰状态,且春季受干扰程度更严重,春季的丰度曲线在生物量曲线之上,表明春季物种个体体型更小。
  七星列岛海域两季游泳动物功能群构成没有特别明显的变化,两季均可分为7种食性功能群,表明群落功能群结构是稳定的。秋、春两季都以浮游生物食性功能群为主,分别为17、13种。秋季有明显优势功能群,即浮游生物食性功能群,其重量占比为62.89%,而春季以杂食性功能群为主,没有明显优势功能群。该海域的物质和能量主要通过以下两种途径进行传递:(1)浮游生物→浮游生物食性功能群→杂食性功能群→肉食性功能群;(2)浮游生物→浮游生物食性功能群→游泳动物/底栖动物食性功能群→肉食性功能群。功能群的Shannon-Wiener多样性指数H'变化范围为0.09~1.424,功能群H'和种类数、生物量百分比这两种因素有正向关联,春季的功能群H'较秋季的大。
[硕士论文] 张明
海洋生物学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:拟穴青蟹是我国东南沿海重要的养殖经济动物,蜕壳是青蟹个体生长发育过程中普遍存在的重要现象,是青蟹个体不连续性增长的重要标志。研究发现,在青蟹蜕壳过程中,其体内的微生物数量、群落结构及相关的生理生化往往都会发生动态变化,揭示了微生物组在青蟹蜕壳后期重建的过程,为后人进一步的研究提供宝贵数据、奠定研究基础。
  本研究在“蟹公寓”开展养殖实验,获得蜕壳后的青蟹。并对青蟹蜕壳前(重壳蟹)、蜕壳0天(即蜕壳后6h内取样)、蜕壳后3天、6天及15天的肠道、壳内皮、鳃组织样品及养殖水体、饲喂饵料进行取样。对样品中的微生物进行了荧光显微计数及高通量测序并对数据进行了研究分析。主要结果如下:
  1、使用荧光染料SYBR Green I对青蟹肠道、壳内皮、鳃组织样品及养殖水体、饲喂饵料进行荧光显微计数。发现肠道、壳内皮、鳃组织微生物数量在蜕壳前后均发生显著减少(P<0.05);在蜕壳后0-15天的养殖过程中,青蟹微生物含量呈现逐渐升高趋势;测得养殖水体微生物含量约为(4.03±0.45)×105~(4.94±0.36)×105个/ml,饵料中微生物含量约为(5.47±0.68)×107~(8.40±0.72)×107个/g。
  2、对高通量16S rRNA序列分析发现:青蟹各组织、养殖水体及饵料的共有优势菌主要为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria),其中变形菌门中的盐单胞菌属(Halomonas)占绝对优势,与青蟹适应水体盐度环境密切相关。饵料与青蟹各组织共有优势菌主要为梭菌门(Fusobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes);水体特有优势菌主要为蓝藻菌门(Cyanobacteria)。
  对不同蜕壳时期青蟹组织样品的微生物进行分析发现:青蟹体内有些常驻菌是定植于该组织的核心菌群,但其相对丰度会随不同蜕壳周期而发生变化。此类常驻菌在肠道样品中有39个属、壳内皮组织中有46个属、鳃组织中有74个属。
  3、青蟹各组织微生物组成及结构在蜕壳前后会发生较为明显的变化。
  肠道组织中,优势菌如盐单胞菌、Candidatus Hepatincola、弧菌(Vibrios)、弓形杆菌(Arcobacter)等在蜕壳后(0天)比蜕壳前相对丰度均升高,而在蜕壳后0-15天呈降低趋势。壳内皮组织中,盐单胞菌及涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia)蜕壳后相对丰度增加并在蜕壳后0-15天也为上升趋势,而弧菌、黄质菌(Flavobacterium)、黄杆菌(Tenacibaculum)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)及Leadbetterella等在蜕壳后一直呈下降趋势。鳃组织中,Albimonas、Leadbetterella、黄杆菌、假交替单胞菌、弧菌等在蜕壳后的相对丰度均因旧鳃的蜕去而下降至较低水平。Albimonas、Leadbetterella的相对丰度在蜕壳0-6天上升至较高水平后下降,而假单胞菌、弧菌等在蜕壳后3天相对丰度便开始下降,另外,黄杆菌的相对丰度在蜕壳间期又逐渐上升至蜕壳前水平。
  结合总细菌数计数发现,虽然蜕壳后部分菌的相对丰度增加,但由于微生物总量明显下降,使得各微生物的绝对数量也有所下降。
  综上所述,青蟹微生物组在蜕壳前后不仅数量上发生了动态变化,而且种类及结构也发生了明显的变化。微生物组在蜕壳后的重建过程中,也可能存在致病菌和益生菌的变化。论文数据为青蟹高密度工厂化健康养殖奠定了基础。
[硕士论文] 公月月
渔业 浙江海洋大学 2017(学位年度)
摘要:我国鱼类资源丰富,种类多达3000左右。为了有效地对鱼类资源进行开发利用、最大程度地发挥鱼类的经济价值以及加大对濒危鱼类资源的保护,因此,正确地对鱼类进行鉴定、分类显得尤为重要。传统鉴定鱼类的方法是以形态结构为主,结合行为、生理、遗传性状、地理、生态等特征对鱼类进行鉴定和分类。但是,由于鱼类表型特征的可变性,以及有些相同物种的外部特征在不同的生长发育阶段和不同的性别之间存在差异,单单根据鱼类外部形态特征对鱼类进行鉴定和分类的准确性不高。尤其是对于形态差异比较小、亲缘关系比较近的的不同物种之间的鉴定存在困难。另外,由于传统的形态学鉴定方法存在的缺陷,要求鉴定者要有丰富的鉴定经验以及对物种分类鉴定的知识储备。
  DNA条形码(DNA Barcoding)技术是指利用一段能够代表物种的、短的、相对保守、容易扩增的标准目的基因片段实现物种快速、准确的鉴定的技术。目前,线粒体细胞色素C氧化酶亚基(COI)基因被广泛用作DNA条形码的目的基因,从分子学角度为鱼类的鉴定分类和系统进化提供了可靠的依据。研究内容如下:
  1.线粒体COI基因在观赏鱼中物种鉴定与分类应用
  观赏鱼种类繁多,形态各异,市场上多是以商品名命名,在物种鉴定分类上存在一定的难度。本研究基于线粒体COI基因,探讨其在观赏鱼中物种鉴定与分类应用的可行性。通过PCR扩增,获取18种观赏鱼249个个体的COI基因序列。基于Kimura双参数模型,利用MEGA软件计算18种观赏鱼种间和种内遗传距离,并构建系统进化树。结果显示,观赏鱼类的种间遗传距离明显大于种内遗传距离,线粒体COI基因序列可以用于物种鉴定。在系统进化树中,系统进化关系跟传统分类方法所得数据一致性高。研究表明,观赏鱼线粒体COI基因序列,在物种鉴定与进化分类上具有一定的应用价值。
  2.COI基因DNA条形码在云南澜沧江鱼类物种中的鉴定与分类的应用
  云南澜沧江鱼类资源丰富,有许多特有种类,在幼鱼阶段、或形体不全的情况下以及一些相近种形态相似的情况下,仅仅依据传统的形态学鉴定方法,很难完全满足物种鉴定和分类的需求。本文从分子学角度,探讨了线粒体COI基因在澜沧江云南段鱼类中物种鉴定与分类应用的适用性。采用PCR技术,对采自澜沧江云南段的18种鱼共162个个体的COI基因片段进行了扩增和测序。利用MEGA软件,基于K2P模型计算18种鱼类的种间和种内遗传距离,并构建系统进化树。结果表明,种间遗传距离显著大于种内遗传距离,符合Hebert等人提出的COI基因能有效进行鉴定的前提;由系统进化树得知,COI基因在种属水平方面的鉴定与传统的分类学鉴定方法一致。因此,线粒体COI基因为澜沧江云南段鱼类鉴定和分类提供了分子学依据。
[硕士论文] 王周雷
渔业 浙江海洋大学 2017(学位年度)
摘要:西北太平洋是世界上高生产力渔区之一,渔获量一直排名世界前列,其中广泛分布在西北太平洋的亚热带至温带海域的秋刀鱼,它是一种具有巨大潜力的中上层鱼类。因为秋刀鱼资源丰富,渔获量较大,且符合公众的食用口味,也可作为金枪鱼钓上佳饵料,所以它是经济效益尚可的渔业之一。目前我国正大力实施“一带一路”、“农业走出去”等发展战略,这对促进远洋渔业的进一步发展具有强有力的助推作用。经过科研机构(高校)数年的探捕研究,已经形成一整套科研理论并产生初步应用成果,如中心渔场的找寻、环境影响因素、渔法的使用改进等。加之秋刀鱼渔场距离中国大陆沿海一带较为接近,且与北太平洋传统作业渔场相近,在渔获物运输转载等后勤配套方面亦可做到无缝对接,可以说秋刀鱼项目极具开发与利用潜力。
  本文通过笔者于2013年10~11月在舟山市普陀远洋渔业总公司“天祥”轮西北太平洋公海进行秋刀鱼作业的20天的生产调研期间,经调研测定所得的一手生产数据进行研究分析,对渔场资源生物学特征、秋刀鱼船舷提网网具结构、作业过程、集鱼灯优化配置及市场营销推广等方面进行详细阐述,结果显示:海水表面温度的高低及月相的变化是影响西北太平洋秋刀鱼每月产量的重要因素;秋刀鱼体长范围为100mm~360mm,优势体长组为280~300mm,性腺成熟度Ⅱ期和Ⅲ期为主,摄食等级以1、2、3期为主;秋刀鱼最喜集鱼灯光颜色为红色,红色集鱼灯可激励鱼群的活动,集鱼灯箱的角度在50°~60°相比较合适;网具的高度一般选择为30~45m,最适网目尺寸范围为18.9~25.76mm。
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