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[硕士论文] 金承玲
渔业 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)属于气单胞菌科,气单胞菌属,是人类-畜类以及水生动物类共同患病的条件致病菌。嗜水气单胞菌属于革兰氏阴性菌、短杆形状,无芽孢,也无荚膜,在0~41℃都可以生长,该菌在营养琼脂和血琼脂平板上极易生长。大多研究者普遍认为嗜水气单胞菌分泌的毒素是导致发病的主要原因,临床上主要表现为细菌性的出血病症状。最近几年,我国水环境被严重破坏,随着集约化养殖技术发展、养殖密度增加,嗜水气单胞菌造成的团头鲂等淡水养殖鱼类暴发性流行性的病害频频发生,加重经济损失。目前,水产上主要用抗生素治疗由嗜水气单胞菌引发的疾病,喹诺酮类药物疗效最好,但大量抗生素也导致很多耐药菌株的产生。本论文开展了对南京地区团头鲂出血性病鱼流行病学调查,通过病原分离及人工回感试验证明,嗜水气单胞菌是引起该疾病暴发的主要病原菌,之后开展了嗜水气单胞菌的分离、鉴定及药敏试验等实验,并对其菌株的耐药性进行了研究,为基层水产养殖业中的科学用药提供有价值的理论依据,以确保水产品的质量安全。
  1、团头鲂出血病的流行病学调查
  经过实地走访、调查发现,南京地区暴发的团头鲂大多是由嗜水气单胞菌引起的,但危害程度有所不同。江宁、浦口等重点养殖区域发病比较严重,具有来势凶猛、涉及范围广、流行速度特别快等特点。根据调查数据发现,嗜水气单胞菌全年均有检出,由嗜水气单胞菌病引起的疾病一般从6月份出现,疾病随着气温水温的升高呈加重趋势,7、8月份为疾病流行的高峰季。在浅水河口、高密度塘和单养池中,多数病例为急性,发病迅速,发病后2-3d内死亡加重,10d左右则出现死亡的高峰期。在面积较大,养殖密度低的池塘或混养池塘团头鲂发病较为缓慢,每天的死亡数量并没有明显变化,但是发病过程较长,经常会持续到10月份左右。发病初期鱼的摄食没有什么影响,发病后期出现不摄食、乱游、乱窜等现象。发病鱼体体表充血,腹部、腹鳍基部充血明显,有的头部充血严重,眼球外凸,肛门肿大,体内多脏器发炎充血,消化道炎症明显,腹腔内有腹水。发病鱼体有严重贫血症状,鳃丝发白,鳍条末梢、肝脏、肾脏有贫血症状。由于发病过程长短不一、年龄大小不一、疾病的发展程度不同,病鱼的症状表现为多种多样性。
  2、团头鲂出血病病原的分离鉴定及人工回感实验
  在无菌环境下,从病鱼肾脏取材,用LB固体培养基分离培养细菌。培养基上的菌落呈淡黄色、圆形、中部凸起、不透明、光滑。结果表明,NO3、TRP、Glu、ADH、ESC、GEL、PNPG、GLU、ARA、MNE、NAG、MAL、GNT、CAP、MLT均为阳性,被鉴定为嗜水气单胞菌。实验结果表明,在LB固体培养基上提取的菌落,具有较强的致病性,记为JNYK1702。菌液密度高低直接影响试验组鱼的存活率,当密度为1×106cfu/尾时试验组鱼死亡率最高,当菌液密度为1×103cfu/尾时试验组的鱼只有一部分死亡。人工感染团头鲂的鱼体症状与自然发病鱼体病症相同,因此得出结论经细菌学分离鉴定得到的菌株JNYK1702-1与供试菌株JNYK1702一致,为同一种菌。
  3、致病性嗜水气单胞菌药敏实验及耐药性试验
  药敏试验采用KB纸片法进行,在无菌环境下用已经灭菌过的棉签蘸取密度调整为1×107~1×108cfu/尾的菌悬液,在LB培养基上均匀涂布。将测试的药敏试纸贴在LB培养基表面,然后将平板置于28℃培养箱中24h,观察各药物敏感纸抑菌圈的直径。从测试结果可知,菌株对青霉素、氨苄西林、四环素、阿莫西林、苯唑西林表现出耐药性。对氧氟沙星、庆大霉素、链霉素、诺氟沙星、罗红霉素、氟苯尼考、头孢曲松药物敏感。
  根据日本化学治疗学会(1975)的方法,测定硫酸链霉素、氨苄西林、土霉素、盐酸金霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、诺氟沙星和诺氟沙星确定致病菌株的药物敏感性。制备液体,经膜过滤器过滤,然后灭菌后用BHI培养基稀释,最后将试管制成双稀释抗菌剂。结果表明:盐酸金霉素、氟苯尼考、硫酸链霉素恩诺沙星的抑菌效果最佳,最小抑菌浓度分别为2、4、4、5μg/mL,其次效果为土霉素和诺氟沙星2种药物,最小抑菌浓度均为15μg/mL;7种药物中,氨苄西林的效果最差,最小抑菌浓度高于40μg/mL。
[硕士论文] 张庆庆
生物学 集美大学 2018(学位年度)
摘要:溶藻弧菌(Vibrio aliginolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是水产养殖环境中比较常见的条件致病菌,它们分布广泛,致病率高,可以感染多种水产养殖动物,对世界各地的水产养殖产业造成巨大的经济损失。而对溶藻弧菌和哈维氏弧菌进行快速检测和监控则是对其疾病进行预防和治疗的前提和基础。核酸适配体,是一种具有高亲和力和特异性的核酸分子,在微生物检测方面显示出巨大的优势和应用潜力。
  本研究以溶藻弧菌及其灭活菌和哈维氏弧菌及其灭活菌为靶目标,对其核酸适配体进行了亲和特异性研究和亲和常数的测定。结果显示,6个适配体(#7、#9、#37、I22、S27、S35)对其目标菌均有较好的亲和特异性,相应的亲和常数分别为13.56±5.01、34.55±11.34、40.28±13.39、33.42±13.24、26.21±8.73和29.42±7.91nM,其中,溶藻弧菌的#37适配体和哈维氏弧菌的S35、S27适配体对非目标菌(嗜水气单胞菌、大肠杆菌和迟钝爱德华氏菌)的亲和力较弱,表现出对目标菌更好的亲和特异性。并采用高保真度的碱基配对策略对适配体二级结构进行了模拟与分析。
  定性检测结果显示,#7适配体能检测出102CFU/mL以上的灭活溶藻弧菌,#9和#37适配体能检测出102和103CFU/mL以上的溶藻弧菌。I22适配体能检测出102CFU/mL以上的灭活哈维氏弧菌,S27、S35适配体则能检测出102CFU/mL以上的哈维氏弧菌,初步建立了针对溶藻弧菌和哈维氏弧菌的基于适配体的定性检测技术。
  定量检测研究表明,#9和I22适配体的标准曲线线性拟合效果较好。利用适配体定量检测弧菌,不需要细菌基因的提取与纯化,不需要PCR扩增,具有特异性强、简易和高效等特点,但在稳定性和准确性方面还需进一步改善。
[博士论文] 杨阳
水产 集美大学 2018(学位年度)
摘要:食物过敏作为食品安全的热点问题在全球引起了广泛关注,甲壳类水产品是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一。拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国重要的水产资源,但其产量和消费量的增加,也伴随着越来越多的食物过敏问题。对拟穴青蟹引起的食物过敏反应流行病学调查和拟穴青蟹过敏原结构、表位及其致敏性的系统分析是开发低致敏食品和甲壳类水产食物过敏性疾病控制的基础。
  本研究于2010年至2017年对集美大学在校生发放食物过敏流行病学调查问卷共17324份,对收回的13361份有效问卷统计结果显示,蟹类是该群体中主要的过敏食物,进一步对调查对象中14164名学生的血清学分析表明蟹类过敏比例为4.31%,而拟穴青蟹的肌浆蛋白能够被65.14%的蟹类过敏患者血清中的特异性免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)E识别。精氨酸激酶(arginine kinase,AK)是拟穴青蟹肌浆蛋白中的主要过敏原,本文首先通过X射线衍射获得了分辨率为3.0(A)的AK晶体结构,基于蛋白质结构的对比分析结果表明,节肢动物中的AK具有保守的一级结构、二级结构和高级结构。基于抗原表位的对比分析结果表明,不同物种中AK线性表位区域呈现高度的一致性,主要分布于氨基酸序列(amino acid,AA)25-44、AA130-155和AA308-321;而构象表位则主要分布于AK高级结构保守区。此外,本研究完成了对拟穴青蟹肌浆蛋白中新型过敏原磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,TIM)和肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)的分离纯化,并首次发现细丝蛋白C(filamin C,FLN c)是存在于拟穴青蟹肌浆中的新型过敏原。对拟穴青蟹肌浆中四种过敏原的血清学分析结果表明,AK和FLNc能被较多的蟹类过敏患者血清识别,而识别TIM和SCP的患者血清数量较少。目前这四种过敏原已被世界卫生组织/国际免疫学会联盟(world health organization/international union of immunological societies,WHO/IUIS)的过敏原命名系统收录,AK、SCP、TIM和FLN c分别被命名为Scyp2、Scyp4、Scyp8、和Scyp9。
  采用蟹类过敏患者特异性识别的过敏原对过敏患者进行嗜碱性粒细胞激活试验(basophil activation test,BAT),以进一步确定患者的过敏反应,结果发现嗜碱性粒细胞表面抗原CD63和CD203c的表达上调与患者自诉的过敏症状严重程度呈现正相关。以经过BAT验证的过敏患者血清IgE为靶蛋白,对噬菌体展示肽库进行亲和淘选,结合生物信息学分析鉴定了AK的5个线性表位区域和8个构象表位区域、TIM的4个线性表位区域和2个构象表位区域、FLN c的6个线性表位区域和6个构象表位区域、SCP的6个构象表位区域。利用Balb/c小鼠建立的四种肌浆蛋白过敏原的动物模型表明,AK在机体内的致敏性最强,能够引起B淋巴细胞的增殖,同时产生高水平的抗原特异性IgE;TIM也能够使B淋巴细胞增殖并产生较高水平的特异性抗体,但其致敏性较AK弱;SCP虽然具有较强的免疫原性,但其免疫反应性较弱;相反FLN c虽然在体内的免疫原性较弱,但其具有较强的免疫反应性,从而能够引起效应细胞较强的激活。
  综上,本研究确定了蟹类是常见的过敏食物,而肌浆蛋白是引起蟹类过敏的重要组分;完成了拟穴青蟹主要过敏原AK的结构解析、肌浆蛋白中新型过敏原的纯化并获得了WHO/IUIS审批的系统命名;对肌浆蛋白中的四种过敏原进行了血清学分析和抗原表位定位分析,并结合动物模型比较分析了四种过敏原在机体内的作用方式和致敏性,这些结果为开发低过敏食物、甲壳类水产品过敏性疾病控制提供了理论基础。
[硕士论文] 吴少坤
水产 集美大学 2018(学位年度)
摘要:本文为研究沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)、甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)和氟苯尼考(Florfenicol,FFL)三种抗菌药物在大菱鲆(Scophthalmus maximus)体内的代谢动力学特征和残留消除规律,选择高效液相色谱串联质谱法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrum,HPLC-MS)检测SAR、TAP和FFL分别混饲口灌后在大菱鲆血浆、肌肉、肝脏、肾脏等样品中的时间-浓度变化。三种抗菌药物均以30mg/kg的剂量单次混饲口灌,采集给药后48h内的药时数据,并以DAS3.0软件非房室模型进行分析,结果显示,沙拉沙星、甲砜霉素和氟苯尼考在大菱鲆血浆中的达峰浓度(Cmax)分别为2.600、21.968和26.503mg/L;它们的达峰时间(Tmax)分别为4、9和9h,沙拉沙星的Cmax和Tmax两个参数同甲砜霉素和氟苯尼考差距较大,而后两者同属酰胺类药物,达峰时间相同,达峰浓度也较为接近。这三种抗菌药物在大菱鲆血浆中的药时曲线下面积[AUC(0-∞)]分别为540.133、319.754和992.256mg/L·h;表观分布容积(Vz/F)分别为27.954、6.206和1.130L/kg。三者在大菱鲆血浆中的平均滞留时间[MRT(0-∞)]分别为495.053、33.984和38.763h;消除半衰期(T1/2z)分别为348.788、45.841和25.521h。
  沙拉沙星在大菱鲆肌肉、肝脏和肾脏组织中的达峰浓度(Cmax)分别为3.500、10.155和3.867μg/g。在给药后肝脏在2h后迅速达峰,而在肌肉和肾脏组织中达峰时间分别为4和3h。沙拉沙星在肝脏中的达峰浓度(Cmax=10.155μg/g)和药时曲线下面积[AUC(0-∞)=363.718mg/L·h]最大,且在肝脏中的平均滞留时间[MRT(0-∞)=169.658h]最长,结合消除半衰期(T1/2z=129.514h),表明肝脏对沙拉沙星的吸收能力最强,但消除能力最弱。沙拉沙星在肌肉中的表观分布容积(Vz/F=10.211L·kg-1)最小,总清除率[CLz/F=0.214L·(h·kg)-1]最大,说明了沙拉沙星在肌肉组织当中的分布最少,并且清除速度最快。
  甲砜霉素在大菱鲆的肌肉、肝脏和肾脏组织中的达峰浓度(Cmax)分别至22.346、27.127和47.178μg/g。除了肝脏中达峰时间较快(4h),在肌肉和肾脏组织中均在9h时达峰。甲砜霉素在肾脏中的达峰浓度(Cmax=47.718μg/g)和药时曲线下面积[AUC(0-∞)=517.768mg/L·h]最大,表明肾脏对甲砜霉素的吸收能力最高;在肝脏中的平均滞留时间[MRT(0-∞)=36.565h]最长,结合消除半衰期(T1/2z=42.370h),说明给药后48h内甲砜霉素在肝脏中的消除较慢。
  氟苯尼考在大菱鲆的肌肉、肝脏和肾脏组织中的达峰浓度(Cmax)分别至27.215、30.756和32.455μg/g。肌肉中达峰时间较慢(9h),在肝脏和肾脏组织中达峰较快,均在4h时。氟苯尼考在肾脏中的达峰浓度(Cmax=32.455μg/g)和药时曲线下面积[AUC(0-∞)=860.410mg/L·h]最大,且肾脏的平均滞留时间[MRT(0-∞)=46.775h]最长,结合消除半衰期(T1/2z=32.466h),表明肾脏对氟苯尼考的吸收能力最强,但消除能力最弱。氟苯尼考在肌肉中的表观分布容积(Vz/F=1.203L·kg-1)最小,总清除率[CLz/F=0.038L·(h·kg)-1]最大,说明了氟苯尼考在肌肉组织当中的分布最少,并且清除速度最快。
  在残留消除实验中,沙拉沙星、甲砜霉素和氟苯尼考三种抗菌药分别以60mg/kg的高剂量单次给药后,采集30d内的药时数据并以WT1.4药物残留程序进行计算,结果显示三种抗菌药在大菱鲆血浆中的理论休药期分别为19.64、8.90和10.90d;在肌肉中的理论休药期为24.09、10.64和19.02d;在肝脏中的理论休药期分别为25.69、18.19和18.64d;在肾脏中的理论休药期分别为25.32、23.95和25.51d。本文研究结果可为SAR、TAP和FFL在大菱鲆中的合理应用提供科学依据。
[硕士论文] 何洁
基础兽医学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:目前,罗非鱼是世界第三重要养殖鱼类,其养殖产量预计于2025年达世界水产养殖总产量的六成。无乳链球菌(Group B Streptococcus,GBS)是危害罗非鱼养殖的重要细菌性病原之一,GBS可造成罗非鱼患严重疾病,故GBS病是我国亟需净化水生动物第三类疾病。目前,罗非鱼GBS病的应用研究已得到足够重视和支持,也取得了一定成果,头肾是鱼类重要的免疫造血器官,也是GBS主要侵袭的部位。然而,对GBS对头肾造成的病理损伤鲜有报道。因此本论文对感染GBS罗非鱼的头肾开展动态病理损伤研究,以期丰富罗非鱼链球菌病的基础研究,为后续的应用研究奠定基础,本研究选用(250±10)g健康吉富罗非鱼20尾,对头肾进行大体、组织学和超微结构观察;160尾,随机分为5组,使用剂量为1.0×107cfu GBS对罗非鱼进行攻毒,于注射GBS后第0、4、8、24和72h采集头肾。用光镜、电镜技术、流式细胞术和SABC免疫组化染色等方法研究头肾正常结构和GBS动态分布规律,建立病理评分体系,对感染进行分期,探讨GBS量对各头肾病理分期的影响,为揭示头肾病理损伤机制和GBS的致病机制提供新思路。结果如下:
  1:罗非鱼头肾位于心腹腔隔膜背前方,分左右两瓣,成年罗非鱼头肾组织内无肾单位,组织学上,可分为2区,中央区和外周区,中央区由淋巴样组织和血窦构成,含黑色素巨噬细胞中心,淋巴组织排列成索状,围绕血管呈放射状分布,淋巴索之间由血窦隔开,外周区则以弥散性淋巴组织为特征,血窦较少也较小,是典型的造血淋巴组织。
  2:感染无乳链球菌后,鱼体大体动态病理变化主要体现在内脏器官的充血、出血、肿大,角膜浑浊和脑软化,头肾主要体现在颜色和头肾体指数,表现为0-4h,颜色变暗,4-24h,明显肿大,颜色变暗,呈不同程度的紫红色,24-72h,头肾肿大和颜色变暗的程度虽比4-24h减轻,但仍然肿大和颜色变暗;头肾体指数在攻毒后0-4h,极显著增大,8-24h,显著增大,24-72h,极显著增大。主要的组织动态病理学变化为:攻毒后4-8h,黑色素巨噬细胞中心数量明显减少,体积缩小,成分少,着色浅,结构松散,动脉内皮细胞脱落,开始出现炎性细胞边移、贴壁;8-24h,数量减少甚至消失,仅存少量棕色颗粒,内皮细胞肿胀、脱落,中膜平滑肌变性、坏死,内膜、中膜、外膜各层均有水肿及炎性细胞浸润,淋巴索排列紊乱,血窦淤血严重,血管通透性升高,血管旁出现均质红染的炎性渗出物和炎性细胞,24h时,头肾内成团聚集大量GBS,GBS表面有荚膜,在淋巴细胞、巨噬细胞和红细胞内存活;24-72h,黑色素巨噬细胞中心大量增加,体积小,成分消失,不能着棕褐色或黑色颗粒,结构松散呈空泡,间质变成境界不清条团状无结构红染物质,淋巴细胞和巨噬细胞减少,充血严重,黑色素巨噬细胞中心坏死溶解,见大量坏死区。细胞主要的动态病理变化为:攻毒后0-24h,活细胞数量无显著差异;24-72h,活细胞数量极显著减少,组织中细胞发生大量凋亡坏死。细菌在攻毒后4-8h,GBS量显著增多,24-72h,GBS量极显著增多。
  结合典型动态病理变化和GBS含量,可诊断出感染1.0×107cfu GBS的罗非鱼头肾患急性细菌性化脓性炎症,病程分3期,反应期(0-4h):大体正常,头肾体指数增大,黑色素巨噬细胞中心和血管正常,无GBS,无坏死区;缓滞期(4-8h):大体正常,头肾体指数显著增大,黑色素巨噬细胞中心和淋巴细胞减少,头肾血管损伤,组织内开始出现少量GBS,无坏死区;危亡期(8-24h):鱼体出现典型症状,头肾体指数显著增大,黑色素巨噬细胞中心和淋巴细胞减少,头肾血窦内大量红细胞充盈、淤血,有大量炎性渗出和GBS,无坏死区;危亡期(24-72h):鱼体出现典型症状,头肾体指数显著增大,黑色素巨噬细胞中心增多,充血,有大量GBS,有坏死区。
  综上:GBS感染吉富罗非鱼后,头肾结构受到明显损伤,过度炎症反应可能是导致鱼体急性死亡的重要原因。
[硕士论文] 容川
环境科学与工程 广西大学 2018(学位年度)
摘要:在海产养殖水中氯化消毒和抗生素添加是两个必不可少的环节,添加的消毒剂在杀灭病原体的同时,难以避免的与水体中其他成分反应生成新的产物,称之为消毒副产物(DBPs)。残留的抗生素不仅会污染水体,而且也会作为一种特殊的前体物与具有强氧化性的消毒剂发生反应,生成新的消毒副产物。本文主要研究了诺氟沙星、磺胺甲基异恶唑和罗红霉素这三种在养殖水体中残留量较高的抗生素在经NaClO氯化消毒后的环境归趋,包括反应动力学、反应中心、生成产物和形成机理,研究表明:
  (1)三种抗生素均被NaClO消毒剂氧化,在不同水环境中的反应速率都遵循了咸水>半咸水>淡水的趋势;反应速率的差异主要归因于水体中含有的Br-会对反应起到促进作用;Br-浓度越高,反应活化能越低,表明了在Br-存在时反应越容易发生,反应更迅速;总有机卤素分析也表明了,在含有Br-的海产养殖水中会生成溴代的消毒副产物(Br-DBPs)比淡水中的消毒副产物毒性更强。
  (2)诺氟沙星主要的反应位点包括哌嗪环上的N4原子和萘啶环上的C8原子,以及当Cl-和Br-存在时,萘啶环上的羧基变成了另一个主要的反应位点。磺胺甲基异恶唑主要的反应除了在苯胺基团的部分而非酰胺氮基团上发生的卤素取代,另外在含Br-的水体中,SMX上的S-N键和S-C键很容易被氧化物攻击而断裂,并且连接磺胺N的3,5-二甲基异噁唑基团上的甲基被氧化成了羧基。罗红霉素的反应包括脱氧糖胺基团部分断裂和整个基团损失后发生的卤素取代,以及当Cl-和Br-存在时,克拉定糖基团也会被氧化物攻击导致C-O键断裂,整个克拉定糖基团从母体ROX上脱离后在该位点发生了溴取代,其中可能的反应位点还包括在C2、C8和C10。
  综上,在氯化消毒时,NaClO和抗生素不应同时添加,避免形成毒性更强的消毒副产物。同时,今后研究应提出新型的消毒工艺,控制消毒副产物的形成。
[硕士论文] 李聪
水产动物医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:血红素加氧酶1(Heme Oxygenase-1,HO-1)是催化血红素分解产生一氧化碳、胆绿素和亚铁离子的限速酶,具有抗氧化、抗炎症和抗凋亡等作用。近来的研究表明,HO-1能抑制多种病毒的复制,如猪繁殖和呼吸综合征病毒、乙型肝炎病毒、埃博拉病毒,但对水生动物病毒复制的影响尚无报道。鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)是鲤春病毒血症(Spring Viremia of Carp,SVC)的病原,尚缺乏有效的抗病毒药物及防控措施。前期研究表明核转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor E2related factor2,Nrf2)是HO-1上游的重要调控因子,可能抑制SVCV感染。SVCV感染后HO-1显著下调,且敲降HO-1后病毒复制显著上升,提示HO-1同SVCV复制密切相关。
  为此,本研究详细探究了HO-1拮抗SVCV的作用及其机理。结果表明,在EPC细胞中,钴原卟啉(Cobalt Protoporphyrin,CoPP)可显著上调HO-1的表达,以剂量依赖性方式抑制SVCV复制,且在病毒入侵后阶段发挥作用。特异性siRNA敲降HO-1后,激活剂CoPP的抗病毒作用受到显著抑制。结合先前的研究结果,确认了ROS/Nrf2/HO-1轴在EPC细胞中的抗病毒活性。此外,HO-1的酶促产物CO,而不是胆绿素可显著抑制SVCV复制,通过激活cGMP/PKG信号通路发挥抗病毒作用。上述结果表明靶向诱导Nrf2/HO-1/CO/cGMP/PKG信号通路的药物或措施或可应用于SVC的防控。
[硕士论文] 李青彬
水产养殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本研究建立了一种克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)活体检测方法,然后对湖北省七个主要养殖区域的克氏原螯虾群体进行了白斑综合征病毒流行病学调查,最后,比较了携带白斑综合征病毒对克氏原螯虾部分免疫指标的影响。主要研究结果如下:
  1.克氏原螯虾活体检测白斑综合征病毒方法的建立
  本实验通过设计白斑综合征病毒检测的特异性引物,对PCR反应条件的优化以及比较克氏原螯虾触角、螯肢、游泳足、附肢、尾扇等不同取样组织对检测结果的影响,优化出一种适用于克氏原螯虾遗传育种的活体检测白斑综合征病毒的方法。结果显示,该检测方法可以比较准确地检测到白斑综合征病毒,并且在不影响检测结果的前提下,选取附肢组织作为取样组织可以将取样造成的伤害降到最低,对克氏原螯虾的存活影响最小。
  2.湖北省不同克氏原螯虾群体携带白斑综合征病毒情况调查
  本实验在2015年10月~2017年8月间主要通过临床调查、采集克氏原螯虾样本等方式对湖北省七个养殖地区的克氏原螯虾白斑综合征流行情况进行了调查。调查结果显示,湖北省潜江市、监利县等主要养殖地区与洪湖市新堤地区克氏原螯虾群体中,携带白斑综合征病毒的比率均为65%以上;湖北省鄂州市、随州市和洪湖市螺山镇的克氏原螯虾群体中,携带白斑综合征病毒的比率均为40%左右;2015年、2016年和2017年克氏原螯虾白斑综合征病毒检测的阳性率分别为49.6%,61.5%,40.2%。在调查中发现,有部分样品中检测到白斑综合征病毒的特征序列发生碱基A/T的突变。通过系统发育树分析可以发现,发生碱基A/T突变的白斑综合征病毒与NCBI上17个已公布的白斑综合征病毒地区亚种的亲缘关系都比较远,而未发生A/T碱基突变的白斑综合征病毒与澳大利亚株(MF161441)、孟加拉株(KJ719075)亲缘关系更近。
  3.携带白斑综合征病毒个体与正常个体的血清免疫相关酶的活性比较
  本实验分别以过氧化氢酶,超氧化物歧化酶,酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性为指标,比较了携带白斑综合征病毒的克氏原螯虾个体与不携带白斑综合征病毒的克氏原螯虾个体血清中四种酶的活性差异以及养殖过程中的存活情况。结果发现,携带白斑综合征病毒组的克氏原螯虾个体血清中的过氧化氢酶的活性均值高于不携带白斑综合征病毒组,两组间有显著的差异(P<0.05);携带白斑综合征病毒组的克氏原螯虾血清中超氧化物歧化酶活性水平均值低于不携带白斑综合征病毒组,两组间有显著的差异(P<0.05);携带白斑综合征病毒组的克氏原螯虾血清中酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性水平均值都低于不携带白斑综合征病毒组,但是两组间两种酶的活性没有显著的差异(P>0.05)。携带白综合征病毒组的克氏原螯虾存活率小于不携带白斑综合征病毒组。推测携带白斑综合征病毒组中克氏原螯虾体内可能有氧化胁迫反应,导致血清中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性发生一定程度的显著变化。而酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性水平在病毒感染后没有显著性变化。
[博士论文] 汪环
自然保护区学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,由蛙病毒引起的两栖类、鱼类和爬行类动物疾病已在全球范围内普遍流行,由于其宿主种类广泛、发病率和死亡率高,蛙病毒也是造成多种两栖动物的种群数量突然下降,甚至灭绝的重要原因。蛙病毒属可感染的宿主类型广泛,可感染鱼类、爬行类以及两栖类动物等多种经济及药用动物,给这些动物的野外种群和养殖产业带来了严重的危害,并且,蛙病毒感染后发病迅速、病程短,一旦发病死亡率可达到100%,值得注意的是,目前世界上还尚未开发出针对蛙病毒有效的治疗办法。
  鉴于蛙病毒感染的严重危害,世界动物卫生组织(OIE)已将蛙病毒感染列入必须通报的名单中。而中国作为世界上两栖类资源最为丰富的国家之一,目前已经在大鲵、东北林蛙等一些珍贵物种中检出蛙病毒的感染病例,因此在蛙病毒引起全球两栖类种群数量急剧下降的国际背景下,中国两栖类种群防治蛙病毒的防治工作也亟待更加广泛地发展起来。
  本研究利用病理学、细胞学、分子生物学以及高通量测序等技术手段,针对中国黑龙江地区东北林蛙所携带的蛙病毒开展了一系列的研究,从病毒的分离培养等特性研究,到东北林蛙感染蛙病毒后体内发生的转录组学分析,最后有针对性地对两种抗病毒中药制剂对于蛙病毒感染的体内外作用进行了研究;不仅充分了解了中国黑龙江地区东北林蛙携带的蛙病毒特性,并为研究蛙病毒感染引起的宿主免疫反应补充了转录组学研究,为诊断、防治蛙病毒奠定了基础,对于保护本地区冷血脊椎动物种群的生态健康具有重要的意义。
  1.东北林蛙野外种群携带的蛙病毒分离及培养
  利用本研究建立的蛙病毒PCR和LAMP快速检测方法,对中国黑龙江地区蛙病毒曾出现过的区域进行了东北林蛙野外种群蛙病毒的分布调查,选取了鹤北、黑河和东方红林场共3个采样地,检测了林蛙肝脏组织样本511份,得到了5份蛙病毒阳性样本。再根据OIE标准推荐的蛙病毒分离及鉴定方法,对检测到的蛙病毒进行了鉴定和分离:针对阳性样本的测序结果,利用蛙病毒MCP基因进行了多序列比对及系统发育进化树分析,发现检测得到的阳性样本与FV3序列一致性为99%,在分类地位上更近,确认该阳性样本属于蛙病毒属病毒;利用EPC细胞系对该病毒进行了分离和研究,经细胞培养和病毒滴度测定,得到了滴度为107.231TCID50的蛙病毒;在电镜下观察到了大量蛙病毒粒子,镜下蛙病毒粒子呈六边形,大小在140~190nm之间,并且在细胞中可观察到蛙病毒粒子复制中的形态:在细胞质中可见其病毒装配区,其中可见等待装配的病毒囊膜,装配完成的病毒粒子在细胞中呈整齐的晶格状排列,并可观察到部分成熟的蛙病毒粒子以出芽方式从细胞中释放。
  2.蛙病毒胁迫下东北林蛙肝脏的转录组研究
  利用高通量转录组测序和De Novo转录本拼接技术,首次得到了东北林蛙肝脏的转录本信息,共153,979条基因序列,并对这些基因进行了基因注释及对应的生物功能分类;通过比较转录组学,对蛙病毒胁迫下东北林蛙体内的差异表达基因及其参与的信号通路进行了分析,共得到了58个差异表达的基因,包括了部分重要的免疫相关基因MHC-Ⅰ、TGFBR2和PARP等,以及这些差异基因参与的41条信号通路,其中包括MARP通路、TGF-β通路、抗原加工和递呈通路等重要的免疫相关通路;在实验室独立感染实验中,利用qPCR的方法对蛙病毒胁迫下东北林蛙肝脏转录组的结果进行了验证,选取了6个差异表达基因,对其mRNA的表达变化进行了验证,结果符合转录组的结论,证明本研究的转录组结果可信;并且,对发现的3个免疫相关基因在蛙病毒感染的不同时间点和不同组织中的mRNA表达变化进行了研究和分析。通过上述研究,对东北林蛙感染蛙病毒后体内发生的免疫应答及信号通路变化情况有了深入的了解,为研究蛙病毒感染宿主的机制以及引起的免疫反应提供了研究思路和基础。
  3.两种常用抗病毒中药制剂的抗蛙病毒作用研究
  由于目前尚未发现有效的防治蛙病毒的药物,本研究利用建立的蛙病毒体内和体外感染模型,对两种抗病毒中药制剂(黄芪多糖和板蓝根注射液)的抗蛙病毒效应进行了评估。在蛙病毒感染EPC细胞的体外模型中,利用CCK8和细胞凋亡流式检测的方法,对两种药物的不同浓度及不同方式(预防和治疗)的抗病毒效应进行检测,结果发现,较高浓度(30mg/mL)的板蓝根注射液以预防和治疗两种方式干预后,EPC细胞的存活数增加,并且凋亡率明显下降,而黄芪多糖注射液干预后,EPC细胞的存活数量未增加,细胞凋亡率增加;而在实验室动物感染实验中,利用qPCR检测林蛙体内的蛙病毒载量变化以及相关免疫基因的mRNA变化,结果发现,板蓝根注射液在治疗蛙病毒感染中,显著降低了组织内蛙病毒的感染载量,而黄芪多糖注射液在预防组和治疗组都显著降低了蛙病毒的感染载量;在免疫基因mRNA表达检测中,板蓝根使得大多数的免疫因子表达增加,而黄芪并未出现增强免疫因子表达的作用。
[硕士论文] 王玉青
水产动物医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:草鱼(Ctenopharyngodon idellus)作为我国最大的淡水鱼类养殖品种,在湖北省以至全国都有很大的养殖规模,随着养殖密度和养殖规模的增加,疾病暴发在所难免。其中由柱状黄杆菌(Flavobacterium cloumnare)引起的草鱼烂鳃病是危害草鱼养殖产业的重要疾病,每年都会给草鱼的养殖业造成很大的经济损失。过去几年,使用抗菌药物防治柱形病已经导致多重耐药菌株的出现。免疫增强剂具有副作用小、可引起特定的细胞反应和预防某些特定的病原体等优点,在水产养殖中已有部分应用。相关研究表明,细菌胞外多糖(exopolysaecharides,EPS)可以增强鱼类抵抗病原感染的能力,提高其免疫应答水平,是亟待开发的新型多糖类免疫增强剂。目前开发较多的是海洋和极地微生物的胞外多糖,水产动物致病菌的胞外多糖因其特殊的免疫原性,有望成为新型的免疫增强剂。因此,本研究以草鱼为研究对象,探究柱状黄杆菌的EPS作为免疫增强剂对草鱼免疫功能的影响。主要的研究结果如下:
  1.柱状黄杆菌EPS的制备。用本实验室前期从黄颡鱼病鱼上分离的一株柱状黄杆菌Pf1,发酵培养得到含大量胞外多糖的上清液,经三氯乙酸除蛋白、乙醇反复沉淀、蒸馏水透析、PEG20000浓缩后得到纯度较高的EPS。用苯酚硫酸法测得EPS的浓度为1.2mg/mL。
  2.EPS对草鱼血清酶及免疫保护率的影响研究。采用酶标仪检测草鱼血清中酶的活力,注射EPS的草鱼与对照组相比,用柱状黄杆菌浸泡感染前,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性显著降低,细菌感染后,AKP酶活性显著升高,并在第4天时,酶活性最大;实验组在感染的第2d,超氧化物歧化酶(Super oxide Dismutase,SOD)活性显著高于对照组,达到最大;草鱼注射0.2mg EPS一周后,与对照组相比,在浸泡感染柱状黄杆菌的第14d,注射EPS的草鱼存活率为85%,远高于对照组的55%,草鱼的免疫保护率为67%。该结果表明,柱状黄杆菌产生的EPS可作为免疫增强剂使用。
  3.EPS对草鱼免疫相关基因影响的研究。实时荧光定量PCR检测结果表明,草鱼注射0.2mg EPS一周后,与对照组相比,在浸泡感染柱状黄杆菌的第4d,在肝脏、脾脏、头肾中,注射组的白介素1(IL-1)、组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达水平显著提高;短链五聚素(PTX)在草鱼的肝脏中,表达无显著差异;在感染第4d,PTX在脾和头肾中的表达量显著提高;四个基因在体肾的表达变化呈现不同的规律。该结果表明,柱状黄杆菌产生的EPS可以加强机体的炎症反应、体液免疫和抗原提呈能力。
  结果表明:柱状黄杆菌的EPS能够增强草鱼对柱状黄杆菌的抵抗力,提高草鱼的免疫应答水平。EPS注射后的草鱼,在柱状黄杆菌感染时可产生和分泌更多的AKP、SOD。EPS可以使IL-1、MHCⅠ、PTX和TNF-α等免疫相关基因表达量升高,增强草鱼的免疫功能,显著提高草鱼的存活率。
[硕士论文] 崔剑斌
水产养殖 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:牙鲆是一种具有经济价值的海洋鱼类,在亚洲许多国家的水产养殖业中都具有重要的地位。然而,日益增加的工业化养殖使牙鲆对多种病原菌(细菌、病毒和寄生虫)敏感,各种传染病的频发造成了严重的经济损失。这其中淋巴囊肿病的暴发,已成为限制牙鲆养殖发展的瓶颈。为了减少淋巴囊肿病的影响,通过研究相关的免疫系统来探索淋巴囊肿病毒的防御机制,对建立抗病品种或开发有效的疫苗和抗微生物药物都具有重要的意义。本文主要实验结果如下:
  (1)对患淋巴囊肿病(S)和抗淋巴囊肿病(R)的牙鲆头肾进行了转录组重测序,所得到的原始数据经过质控后,我们在抗病组获得了平均序列条数为50712071条,包含5056521585bp的clean data;患病组获得了平均序列条数为53221069条,包含5307450541bp的clean data,碱基质量值超过20的在96.91%以上。并且所得到的clean data与牙鲆参考转录组mapping比率超过了82.73%。
  (2)以p<=0.05&FC>=2作为筛选条件,将所有样本两两之间进行了比较,共得到了1024个差异表达基因,其中患病组相对抗病组表达上调的有430个,表达下调的有594个。在经过GO富集分析后,这些差异表达基因显著富集在与代谢相关的生物过程(BP)和与转运蛋白活性相关的分子功能(MF)中。经KEGG的pathway分析后,所有的差异表达基因注释到了260条pathway,其中有40条pathway显著差异(P≤0.05),我们挑选出了12条与免疫相关的pathway,并从中筛选出了在多个payhway中起关键调控作用的几个表达差异显著的基因进行进一步分析。
  (3)在本课题组前期,曾对牙鲆患淋巴囊肿病和抗淋巴囊肿病的个体头肾进行了转录组测序。在无参转录组条件下,通过序列拼接,组装和注释后,获得了3个在抗病组高表达的基因:thbs2、tbc1d25和efhd2。利用RACE-PCR技术,从牙鲆组织总RNA中克隆了3个基因的全长序列,结果显示:thbs2的基因全长3991bp,含长度为3558bp的ORF,编码1185个氨基酸。其中5'UTR的长度为443bp;tbc1d25的基因全长3254bp,含长度为2604bp的ORF,编码867个氨基酸。其中5'UTR的长度为265bp,3'UTR的的长度为385bp;efhd2的基因全长1588bp,含长度为702bp的ORF,编码233个氨基酸。其中5'UTR的长度为433bp,3'UTR的长度为453bp。氨基酸同源序列比对中,牙鲆的这3个基因,均与尖吻鲈的同源性较高。并且氨基酸同源比对和系统进化分析都表明牙鲆的thbs2、tbc1d25和efhd2这3个基因与各种脊椎动物保持较高的同源性(71%到95%)。
  (4)利用qRT-PCR检测了,thbs2、tbc1d25和ethd2这三个基因在患淋巴囊肿病和抗淋巴囊肿病的牙鲆不同组织中的表达情况,结果显示:这3个基因在抗病组的血液中表达量均表现出上调,并且tbc1d25的表达差异显著,而thbs2在患病组的血液中几乎不表达;thbs2在大多数抗病组组织中,均表现出表达上调,并且在肝脏、鳃、心脏和肌肉中表达差异显著。
[硕士论文] 秦振阳
基础兽医学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:蛙类歪头病是一种以头部歪斜、眼球白内障、运动失调为典型症状的蛙类疾病,该病致死率高、传播迅速、连年发生、用药效果不佳,严重威胁蛙类养殖业。不同研究者从具有该类症状的病蛙中分离出至少9种具致病力的细菌,其中脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)最多见。本研究从湖南岳阳发生歪头病的黑斑蛙脑部、眼球、肝脏、卵巢等多处组织器官分离到一株革兰阴性杆菌,经回归试验确认其致病性,通过细菌形态、生理生化特性、16s rDNA基因构建系统发育树等传统方法,认为其为脑膜炎败血伊丽莎白菌,但经全基因组测序,比对物种鉴定相关的非冗余蛋白质数据库(NR,Non-Redundant Protein Database),证实其为米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)。
  扫描电镜显示,菌体表面常具一凹陷,不同菌体之间有桥状结构连接,菌体平均大小1.72±0.6μm×0.48±0.7μm,透射电镜下可见菌体明显分三层。病原菌在BHI液体培养基,28℃、160r/min的培养条件下,第17h起进入平台期。该病原对对美福仙、链霉素、强力霉素、阿奇霉素、麦迪霉素、氟苯尼考、利福平等7种药物敏感。
  自然发病蛙的组织病理学观察显示:肝细胞肿大,多空泡出现,变性坏死;有心外膜炎;脑细胞轻度水肿,有炎症灶;眼球视杆视锥层细胞变性溶解;其他组织未见明显异常。这是病蛙歪头、运动失调、出现白内障的组织病理学基础。
  最后,本研究对米尔伊丽莎白菌分离株HNW1681进行了全基因组测序和分析,概览了其基因组基本情况,挖掘了其基因组中关于病原生存、致病、抗性产生、进化等多方面的基因信息并选取重点做了初步解读。
  通过以上研究,证实米尔伊丽莎白菌为引起本次黑斑蛙歪头病的病原,传统鉴定手段不能清晰区别米尔伊丽莎白菌和脑膜炎败血伊丽莎白菌。首次报道了本菌的透射电镜和扫描电镜观察结果。通过大体症状和病理学观察的联合解读,描述了其心脏、肝脏、脑、眼等不同程度的病理变化,揭示了该病各类症状的病理基础。在基因组研究中揭示出的病原特性,进一步揭示了该病原的致病机理。
[博士论文] 饶友亮
水产动物医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ,RIG-Ⅰ)样受体(RIG-Ⅰlikereceptors,RLRs)在感知RNA病毒感染和启动抗病毒免疫应答中发挥着重要作用。RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化基因5(melanoma differentiation-associated gene,MDA5)是RLR家族两个重要成员,它们负责识别病毒双链RNA(double strand RNA,dsRNA)并通过与干扰素β启动子激活因子1(IFN-βpromoter stimulator1,IPS-1)互作和翻译后修饰来引起下游信号活化。但是对于RLR家族第三个成员遗传学和生理学实验室蛋白2(laboratory of genetics and physiology2,LGP2)来说,因缺少半胱天冬酶富集结构域(caspase recruitment domain,CARD),使得LGP2不能招募信号传导蛋白以引起下游信号的级联放大。到目前为止,关于LGP2的功能是有争议的,因为既有关于其正调控的报道也有关于其负调控的报道。但是对于LGP2发挥两种截然相反的功能的原因尚不清楚。尤其是在鱼类中,目前还没有充足的证据证明LGP2在RLR信号通路中的调节机制。
  高迁移率族蛋白(high-mobi1ity group box protein,HMGB)是一类保守的染色质相关蛋白,也是一类新的核酸识别分子。之前的研究表明,草鱼(Ctenopharyngodon idella)HMGB家族成员在草鱼呼肠弧病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染过程中发挥重要作用。由病毒感染和病原相关分子模式(pathogen-asociated molecular pattern,PAMP)刺激引起的HMGB动态亚细胞定位是受HMGB分子内不同结构域间相互作用调控的。然而,对于HMGB在抗病毒免疫中的调节机制尚不清楚。
  在本研究中,我们对GCRV感染过程中,LGP2在RIG-Ⅰ和MDA5调节的抗病毒免疫反应中的调节机制进行了研究。同时我们也鉴定了热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)作为HMGB1b的互作蛋白,并证明了HSP70在HMGB1b调节的抗病毒自噬中的正调控作用。
  1.在静息状态下和GCRV感染早期,LGP2在RIG-Ⅰ和MDA5调节的抗病毒信号传导中发挥负调控作用
  在本研究中,我们证明,在静息状态下或病毒感染早期,LGP2过表达抑制了干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)3和7的蛋白合成和磷酸化水平。同时,LGP2过表达也抑制了所有干扰素(interferon,IFN)家族成员(IFN1、IFN2、IFN3、IFN4、IFNγ1、IFNγ2)和核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)家族成员(NF-κB1、NF-κB2)的mRNA水平和启动子活性。敲降LGP2之后得到了相反的效应。双荧光素酶报告试验表明,LGP2在RIG-Ⅰ和MDA5上游发挥作用。同时,LGP2能与RIG-Ⅰ和MDA5相互作用,并且这种相互作用是不依赖于GCRV感染的。结构域互作试验发现,LGP2与MDA5的三个结构域都互作。但不与RIG-Ⅰ的CARD结构域互作。此外,LGP2对RIG-Ⅰ和MDA5的K63连接的泛素化有明显的抑制作用,但对RIG-Ⅰ和MDA5的CARD结构域来说,LGP2过表达只显著抑制了RIG-Ⅰ的CARD结构域K63连接的泛素化,而对MDA5CARD结构域的K63链接的泛素化没有影响。这种差异导致了LGP2在RIG-Ⅰ和MDA5调节的IPS-1和IRF3活化调节因子(mediator ofIRF3activation,MITA)活化中的不同抑制机制。有意思的是,LGP2对RIG-Ⅰ和MDA5的K48连接的泛素化也有抑制作用。我们推测这种抑制作用保证了RIG-Ⅰ和MDA5的基础蛋白水平,为随后信号的迅速活化提供了物质基础。以上结果表明,在静息状态下或病毒感染早期,LGP2在RLR信号通路中发挥负调控作用,这是机体维持稳态所必须的。
  2.GCRV感染后,HSP70通过与HMGB1b互作、引起HMGB1b的胞质转运、以及增强HMGB1b-Beclin1相互作用来促进HMGB1b调节的抗病毒自噬
  自噬在病理和生理过程中发挥着重要作用。然而,在鱼类中,人们对自噬在应对病毒感染中所扮演的角色及其调控机制的研究却很少。在本研究中,我们发现GCRV感染和双氧水(hydrogen peroxide,H2O2)处理引起了CIK(C.idella kidney,CIK)细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累以及随后的自噬活化。而ROS引起的自噬反过来抑制了病毒复制。进一步的研究表明HMGB1b是一个HSP70依赖的促自噬蛋白。在H2O2处理后,胞质定位的HSP70转运到细胞核并在细胞核中与HMGB1b互作,进而促进了HMGB1b的胞质转运。在胞质中,HSP70与HMGB1b协同增强ROS引起的自噬活化。而且,HSP70通过与Beclin1的直接相互作用来增强HMGB1b和Beclin1的相互关联以及自噬体团块化聚集。本研究揭示了鱼类抗病毒自噬的诱导过程,证明了HSP70在HMGB1b调节的自噬启动中的重要作用。这些发现启示我们可以通过激活自噬以及自噬信号通路来开发新的草鱼出血病治疗策略。
[硕士论文] 王方
水生生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)为单股负链RNA病毒,可引起鲤发生大规模死亡,给渔业带来巨大经济损失。SVCV基因组编码5种结构蛋白,即核蛋白N(Nueleoprotein)、磷酸化蛋白P(Phosphoprotein)、基质蛋白M(Marxprotein)、糖蛋白G(Glycoprotein)和RNA聚合酶L(Polymerase)。其中核蛋白N是组成核衣壳结构的关键蛋白,且表达量最大,在病毒的基因转录及调控中具有重要作用。哺乳动物Viperin具有抗病毒功能,鱼类Viperin在抗病毒过程中也具有重要作用,但其潜在机制尚不清晰。本实验制备了SVCV核蛋白N的单克隆抗体,为探究SVCVN蛋白的功能及病毒检测提供了有效工具;同时围绕SVCV对Viperin及其剪接异构体有何影响,Viperin及其剪接异构体如何影响SVCV感染展开深入研究,以期从天然免疫的角度揭示Viperin的选择性剪接与SVCV的关系,为解析SVCV的免疫与致病机制、防控产品的开发提供科学依据。主要内容如下:
  1.SVCV N单克隆抗体的制备
  以含有SVCV N的质粒N-RFP为模板,扩增N基因(1254bp),并将该基因连接至pGEX-KG载体,构建原核表达质粒。将重组蛋白在感受态BL21中诱导表达及纯化,并将其作为抗原免疫BALB/c小鼠,将血清中抗体效价较高的小鼠免疫B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。通过ELISA方法检测,筛选出杂交瘤细胞并命名为N-2。将杂交瘤细胞注射至BALB/c小鼠腹腔内制备大量单抗。间接免疫荧光(IFA)和免疫印记(Western blot)实验结果表明,制备的抗体可特异性识别SVCVN蛋白,且该抗体识别的靶点位于SVCV N的第227~336位氨基酸之间。
  2.Viperin及其剪接异构体抗SVCV功能研究
  选择性剪接是真核基因转录后的修饰的过程,存在于大多数免疫相关基因中。本研究在感染了SVCV的胖头觞肌肉细胞系(Fathead minnow muscle cell,FHM)中发现了一种Viperin的剪接异构体,命名为Viperin_sv1。实验表明SVCV可以诱导Viperin及Viperin_sv1mRNA的产生,Poly(I∶C)对Viperin具有诱导作用但对Viperin_sv1无明显影响。通过IFA实验发现,Viperin及Viperin_sv1部分定位在线粒体,且两者在FHM细胞质中具有共定位的现象。Viperin在SVCV感染早期对病毒具有抑制作用,但随着病毒不断的复制,其抗SVCV作用显著减弱。Viperin_sv1在FHM细胞感染SVCV的不同时间均发挥抗病毒的功能。Viperin_sv1可显著诱导IFN及ISG分子(包括Mxb和PKR)的mRNA产生,而Viperin无此作用。进一步实验发现,Viperin_sv1可以显著诱导IFN上游的RIG-Ⅰ,IRF3及IRF7的产生,而对NF-κB无明显影响。这表明鱼类Viperin_sv1而非Viperin可通过IRF3/7通路激活IFN进而抑制SVCV的复制。尽管SVCV可诱导Viperin_sv1mRNA表达,但可以下调其蛋白水平。蛋白酶抑制剂MG132可以保护SVCV引起的Viperin_sv1蛋白水平降解,且可以拯救Viperin_sv1的抗病毒功能。这表明SVCV可调控Viperin_sv1通过蛋白酶体途径降解进而抵消其部分抗病毒作用。
[硕士论文] 尹梦雅
水产养殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:中华鳖(Pelodiscus sinensis)是一种具有重要食用价值、药用价值和研究价值的两栖动物。中华鳖作为我国名优淡水养殖品种之一,具有较高的经济效益和市场需求。近年来,随着高密度、控温人工养殖产业的迅猛发展,细菌性疾病给我国中华鳖养殖业造成了惨重的经济损失。2015年,湖北地区若干中华鳖养殖场暴发群体死亡,发病高峰期死亡率可达100%。本研究针对湖北发生中华鳖暴发性死亡症的主养地区进行流行病情况调查,对病原菌进行分离鉴定,并研究其对中华鳖的致病力和耐药性,分析不同菌株的耐药差异性,主要研究结果如下:
  1.中华鳖暴发性死亡症流行病学调查研究
  通过对湖北中华鳖主养地区的暴发性死亡症进行流行病学研究调查得知:该病主要发生于高温季节,暴发高峰期为6-8月,水温28-32℃发病严重,集中于温室养殖和温室转移至露天池塘的200g以上成鳖,连续多年发病。病鳖浮于水面或趴于岸边,行动迟缓,少食少动,体表灰白色,有出血点,背腹甲出现溃疡状小坑。该病潜伏期长,死亡率高,病情难以控制,易造成大面积感染发病。病原检测未发现寄生虫和病毒,细菌性病原检出率最高的为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。气温波动,水质恶化,种质退化,养殖管理不当等因素均易引发鳖感染致病。
  2.病原菌的鉴定及致病性研究
  从病鳖体内分离得到3株革兰氏阴性短杆菌,观察菌落表型特征,采用传统生理生化鉴定方法结合分子生物学方法,鉴定分离菌的属种。用16S rRNA基因序列测定,通过系统发育学分析,探讨其进化地位。结果表明传统鉴定方法与分子生物学方法鉴定结果一致,分离菌的16S rRNA基因与相似菌的相应基因同源性均达到了99%以上,鉴定分离株为弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根氏菌、肺炎克雷伯氏菌。人工回归感染证实其对健康中华鳖有致病性,发病症状与群体死亡的鳖相似,取其病变组织分离到相同病原菌。摩氏摩根氏菌LD50为2.3×107CFU/mL,是三株分离菌中最低的,混合菌液致死率最高。上述结果表明此株弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根氏菌和肺炎克雷伯氏菌为病原菌,混合感染致病。
  3.病原菌的耐药性研究
  采用药敏纸片扩散法(K-B)检测分离出的3株细菌耐药性,实验选取23种常用抗生素进行试验。结果显示3株分离菌对23种抗生素的敏感性存在差异:弗氏柠檬酸杆菌对头孢他啶、头孢曲松、左氧氟沙星高度敏感,对万古霉素等17种药物高度耐药;摩氏摩根氏菌对头孢他啶、头孢曲松高度敏感,对克林霉素等17种药物高度耐药;肺炎克雷伯氏菌对头孢他啶、头孢曲松、复方新诺明、环丙沙星、多粘菌素B、左氧氟沙星、氟苯尼考等13种药物高度敏感,对万古霉素等6种药物耐药。比较分析发现,3株分离菌对万古霉素、克林霉素、青霉素、利福平、亚胺培南以及氨苄西林表现为高度耐药;对头孢类药物(头孢他啶、头孢曲松)表现为高度敏感;对其它类药物表现为不同程度的耐药性。不同分离菌株耐药趋势有差异,这主要与药物自身特性、用药时间及菌株耐药机制不同等因素相关。生产上可选用第三代和第四代头孢类药物进行疾病治疗,并通过加强养殖管理,定时消毒清塘,把控水温水质,达到此类疾病防控目的。
[硕士论文] 冯富
兽医 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)在自然界中广泛分布,可致水产动物如中华鳖产生败血症等疾病,甚至大规模死亡,普遍认为疫苗是防治此病最安全有效的手段。注射类疫苗会引起诸如组织炎症、局部坏死等副作用,因此,从动物福利和人力成本方面考虑,黏膜途径接种疫苗,特别是口服途径,将是疫苗接种的理想方式,而口服疫苗因免疫效果低下等诸多因素而发展缓慢。生物被膜是细菌为适应环境在固着表面相互吸附而形成的微生物聚合体,包裹着自身分泌的胞外聚合物,是对抗生素或机体免疫系统的一种抵御机制,生物被膜口服后能保护抗原免受胃部环境的破坏,诱导机体产生特异性免疫。本文研究了嗜水气单胞菌生物被膜(Biofilm,BF)形成的条件优化以及生物被膜疫苗诱导小鼠、中华鳖(Pelodiscus sinensis)的免疫应答水平,并与游离菌(Free Cell,FC)比较,为防治中华鳖嗜水气单胞菌病提供新思路。
  以微孔板结晶紫染色法研究了温度、葡萄糖、钙镁离子和人纤维蛋白原等对AH生物被膜形成的影响,优化了生物被膜的形成条件。结果显示,在25℃生物被膜形成量显著高于37℃(P<0.01);添加葡萄糖浓度至2%(w/v)时,生物被膜的形成显著升高(P<0.01),达到时6%时显著下降(P<0.05);添加CaCl2浓度至10mmol·L-1时,生物被膜显著上升(P<0.01);MgCl2不同浓度间(0.1、1、10mmol·L-1)生物被膜形成无显著差异(P>0.05),与对照组亦无显著差异(P>0.05);浓度为0.5、1.0、2.0和5.0mg·ml-1的人纤维蛋白原各组生物被膜形成量显著低于无添加组(P<0.05),说明人纤维蛋白原能抑制AH生物被膜的形成。
  用注射和口服两种途径研究生物被膜诱导小鼠的免疫反应,注射试验组分别接种蜂胶苗、BF苗和FC苗,0.2ml/只,疫苗浓度为2×109cfu/ml,对照组注射生理盐水(normal saline,NS),1周后加强免疫;结果显示,试验组蜂胶苗、BF、FC的血清抗体水平与对照组均有极显著差异(P<0.01),BF的抗体水平高于FC,但差异不显著(P>0.05),低于蜂胶苗但无显著差异(P>0.05);FC苗在免疫后35、42天抗体水平显著低于蜂胶苗(P<0.05);免疫后30天腹腔注射攻毒,蜂胶苗和BF苗的相对保护率同为91.7%,FC组为83.3%;以上说明生物被膜的免疫水平与蜂胶苗相当,而游离菌免疫水平则低于蜂胶苗。口服免疫试验分为BF、FC和对照组,BF、FC苗分别与颗粒饲料混合均匀,连续饲喂10天,对照组投喂普通饲料;结果显示,BF与FC的抗体水平显著高于对照组(P<0.05);BF的抗体水平显著高于FC(P<0.05),在免疫后14天和28天差异极显著(P<0.01);免疫后10天,实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA表达水平,BF组IL-10表达水平显著高于FC(P<0.05),IL-4、IL-12和IFN-γ的表达水平高于FC组,但无显著差异(P>0.05);免疫后10天,MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平,BF组ConA和LPS诱导的淋巴细胞增殖水平显著高于FC组和对照组(P<0.05);FC组与对照组在ConA刺激后增殖水平无显著差异(P>0.05),在LPS刺激后,FC组显著高于对照组(P<0.05);免疫后30天攻毒,BF组的保护率为63.6%,FC为45.5%;以上结果说明,口服免疫中生物被膜诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫水平高于游离菌。
  用注射和灌胃途径研究生物被膜疫苗诱导中华鳖的免疫反应,注射免疫试验分为BF、FC和对照组,后肢肌肉注射0.3ml/只,2.4×109cfu/ml,对照组注射生理盐水,1周后加强免疫。结果显示BF、FC组血清抗体水平显著高于对照组(P<0.05),BF组抗体水平高于FC组,但无显著差异(P>0.05)。首免后32天进行免疫保护实验,BF组和FC组中华鳖相对保护率均为83.3%。灌胃免疫试验分为BF、FC和对照组,疫苗浓度为5×1011cfu/ml,0.3ml/只,对照组用生理盐水灌胃,间隔6天以同样方法加强免疫两次;BF组血清抗体水平显著高于FC组(P<0.05),首免后第30和36天差异显著(P<0.05);FC组血清抗体水平显著高于对照组(P<0.05),在第24和30天差异显著(P<0.05);首免后32天进行免疫保护实验,BF组为保护率为50%,FC组为33.3%。
  综上,优化嗜水气单胞菌生物被膜形成的条件后,可批量制备生物被膜用于动物试验;以小鼠为动物模型口服免疫嗜水气单胞菌生物被膜疫苗,抗体水平、保护率、淋巴细胞增殖水平和细胞因子表达水平皆高于游离菌;生物被膜灌胃免疫诱导中华鳖的抗体水平和保护率高于游离菌;以上结果表明生物被膜是一种很有前景的候选口服疫苗,其在中华鳖养殖的应用值得进一步研究。
[硕士论文] 刘露
水产养殖 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:本研究针对鱼类病毒检测中目前亟待解决的问题以及产业发展需求,以鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)、草鱼呼肠孤病毒(Grass carp virus,GCRV)及鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus-Ⅲ,CyHV-Ⅲ)为研究对象,基于其保守基因序列,设计引物,优化LAMP反应体系,探讨了LAMP反应产物在不同终端检测方法下的灵敏度及特异性;将优选的检测方法与实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)进行对比评价;另以2套引物进行LAMP反应,通过优化反应体系,对反应时间、特异性、灵敏度等方面与单套引物LAMP联合横向流动试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)检测技术(LAMP-LFD)进行对比,以期为鱼类病毒快速检测提供一定的理论基础和技术指导。主要研究结果分述如下:
  1.鲤春病毒血症病毒LAMP扩增产物三种终端检测方法的对比研究
  鲤春病毒血症病毒(SVCV)是一种重要的鲤科鱼类致病病毒,属弹状病毒科(Rhabdoviridae),水疱疹病毒属(Vesiculovirus),其可导致鲤鱼(Cyprinus carpio)出血性症状且具有高度传染性。本研究开发了一种LAMP体系,通过结合不同的终端检测方法,实现对SVCV的现场快速检测。以SVCV的糖蛋白(Glycoprotein,G)基因为检测靶标,设计6条特异性引物(FIP/BIP,F3/B3,LF/LB),并对LAMP方法的反应参数进行优化,应用SYBR GreenⅠ,LFD和琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel electrophoresis,AGE)三种终端检测方法对LAMP产物进行检测。将上游内引物FIP以生物素(Biotin,BIO)标记,同时设计1条羟基荧光素(Fluorescein amidite,FAM)标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果显示:LAMP最佳反应体系为8mmol/L Mg2+,320U/mL Bst DNA聚合酶,1.4mmol/L dNTP,1mol/L Betaine,最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为40min。本研究中,SVCV的LAMP-LFD体系最低检测限为860fg,与SYBR GreenⅠ检测灵敏度相同,AGE检测最低检测限为86fg,且3种检测方法均未与其他常见鱼类病毒发生交叉反应。在三种终端检测方法中,LAMP-LFD摆脱了对实验室条件的依赖,且不易出现假阳性现象,较SYBR GreenⅠ及AGE方法更适宜于现场检测,此外,本方法为基于PCR技术的检测提供了有效替代方法。
  2.草鱼呼肠孤病毒LAMP-LFD检测方法的建立
  草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株,本研究建立了一种GCRV的LAMP-LFD快速检测方法,并与qPCR技术进行了对比。以GCRV的S8片段为检测靶标,设计6条特异性引物(FIP/BIP,F3/B3,LF/LB),其中上游引物FIP以BIO标记,进行LAMP反应条件优化,同时设计1条FAM标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果表明:LAMP最佳反应温度为63℃,反应时间为40min。从LAMP扩增到LFD结果判读共需50min,与qPCR检测相比时间缩短近1h。LAMP-LFD与qPCR均可特异性检出GCRV,针对GCRV同一重组质粒的检测,LAMP-LFD的检测限为970fg,qPCR的检测限为97fg,虽然本研究所建立的GCRV的LAMP-LFD检测体系的灵敏度低于qPCR10倍,但LAMP-LFD操作简单,无需特殊仪器设备,可快速、特异地检测出GCRV,有望成为GCRV现场快速检测的常规技术手段。
  3.鲤疱疹病毒Ⅲ型LAMP-LFD技术的建立
  锦鲤疱疹病毒病(Koi herpes virus disease,KHVD)因具有高度传染性、致死性而被广泛关注,鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpes virus-Ⅲ,CyHV-Ⅲ)是引发该病的主要病原。本研究将LAMP-LFD应用于快速检测CyHV-Ⅲ,并与qPCR技术进行对比。以CyHV-Ⅲ的胸苷激酶(Thymidine kinase,TK)基因为检测靶标,设计3套4条特异性引物(FIP/BIP,F3/B3),通过对3套引物扩增效果对比,选取实验引物,并设计该套引物配套环引物(LF/LB),其中上游引物FIP以BIO标记,并进行LAMP反应条件优化,同时设计1条FAM标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果表明:单套引物LAMP最佳反应温度为63℃,反应时间40min,2套引物LAMP最佳反应温度为61℃,反应时间30min,且反应进行20min时即可检测到反应产物,比qPCR检测时间缩短近1h。LAMP、LAMP-LFD与qPCR均可特异性检出CyHV-Ⅲ,针对同一重组质粒的检测,单套引物LAMP-LFD的检测限为32.6fg,qPCR的检测限为32.6fg,2套引物LAMP检测限为3.26fg。在本研究中,因选取的2套引物设计位点所限,未能进行2套引物LAMP-LFD检测,而以AGE检测代替。本研究所建立的CyHV-Ⅲ的2套引物LAMP反应速度快,灵敏度高,可特异地检测出CyHV-Ⅲ,有望成为CyHV-Ⅲ现场快速检测的常规技术手段。
  综上所述,本研究建立了水产养殖鱼类常见病毒的LAMP-LFD检测体系,通过对反应组分及反应条件的优化,筛选了最佳反应体系,并成功应用于对SVCV,GCRV及CyHV-Ⅲ的检测。LAMP-LFD体系的建立,对水产病毒的现场快速检测,及病毒性疾病的防控具有重要意义。
[硕士论文] 赵武义
兽医 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:本研究从患病加州鲈体内分离出一株病原菌,命名为ZWY-1。通过表型和分子鉴定,确定ZWY-1为维氏气单胞菌。通过全基因组测序方法对ZWY-1进行测序,并进行与NCBI上已经公布的6株维氏气单胞菌同源比对分析。主要研究结果如下:
  1.发病加州鲈的主要症状为食欲断绝,个别离群间隙性旋转游动。病鱼双侧眼球微凸,吻部微微发红;鳍条轻微出血,病鱼体表的溃疡灶;鳃丝淡红,略显苍白,部分病鱼鳃丝附着异物;病鱼全身内脏器官发黄;肝脏发黄肿大,有片状或带状出血;脾脏肿大,有淤血;心脏淤血。组织病理学上,肝脏中央静脉扩张充血,脾脏严重充血、轻度坏死,肾脏充血、肾小管上皮细胞脱落、炎性细胞浸润,心肌膜水肿、心肌纤维溶解结构模糊,脑膜水肿,鳃小片增生。通过对菌株ZWY-1表型分析和分子鉴定,结果表明:菌株ZWY-1为革兰氏阴性短杆菌,具有鸟氨酸脱羧酶反应阳性等维氏气单胞菌特有的生理生化特性。将菌株ZWY-1的16SrDNA基因序列提交NCBI进行BLAST比对,菌株与维氏气单胞菌相似性99%,在系统发育分析中与维氏气单胞菌属聚为一支。人工感染实验中攻毒的加州鲈出现体表出血,肝、脾、肾肿大充血等原始症状,并成功在加州鲈体内分离出维氏气单胞菌。药敏试验结果显示:ZWY-1对药敏试验结果菌株显示对庆四环素、恩若沙星等9种抗生素敏感,卡那霉素、红霉素等10种抗生素耐药。
  2.对维氏气单胞菌ZWY-1进行全基因组测序,并选取参考菌株进行比较基因组分析。结果显示:ZWY-1基因组组装序列总长度为4.62M,CG含量为59.26%与参考菌株B565(58.70%)、TH0426(58.30%)、AVNH1(58.48%)、X11(58.80%)、X12(58.30%)和CB51(58.60%)相近。功能基因主要集中在KEGG蛋白数据库中环境信息处理、遗传信息处理和代谢三大类,COG蛋白数据库中糖类、氨基酸、辅酶等物质的转运和代谢三大类,GO蛋白数据库中代谢过程和细胞生理过程两大类。比较基因组分析中菌株ZWY-1特异性基因ExoA参与琥珀酰聚糖的生物合成、YjbF可能参与EPS分泌、Tar接受甲基趋化蛋白则可能与菌体粘附、泳动等相关基因的表达上调有关。本研究旨在通过菌株ZWY-1全基因测序、功能数据库注释、同源比得到可能本菌株与毒力因子相关的基因,为对维氏气单胞菌致病性和疫苗研究等提供基因层面的理论基础。
[硕士论文] 陈步鑫
水生生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:鲤春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus,SVCV)属于弹状病毒科鲤春病毒属,是一种严重危害鲤养殖安全的传染性病原,感染鱼后能引起典型的鲤春病毒血症(Spring Viraemia of Carp,SVC)。该病在欧洲、亚洲和北美洲的鲤养殖区是较为常见的流行性疾病,虽然该疾病在我国还未检测到大规模暴发,但作为鲤养殖大国,该病对我国的鲤养殖产业构成潜在的巨大威胁。SVCV感染能引起鱼体体表出血、腹水和泄殖孔发炎等症状,严重者导至死亡。目前,SVCV的致病机理和入侵机制尚不清楚。SVCV结构蛋白糖蛋白(Glycoprotein,G)位于病毒囊膜上,在病毒入侵细胞时的内吞过程中发挥作用,该蛋白可以决定病毒的血清型。研究表明,SVCV蛋白与宿主蛋白的相互作用对病毒的免疫逃逸和复制产生重要影响。因此,研究SVCVG蛋白与宿主蛋白的相互作用对揭示该病毒的入侵与致病机理、抗病毒药物和预防疫苗的开发具有重要的科学意义。
  首先,利用串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification,TAP)与质谱分析相结合的方法,在FHM细胞中筛选出可能与SVCV G蛋白相互作用的宿主蛋白。其次,用激光共聚焦和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)共同验证,实验结果表明了SVCV G可以与宿主14-3-3β/α-A蛋白发生相互作用。通过对14-3-3β/α-A蛋白序列进行比对和同源性分析,发现14-3-3β/α-A在哺乳动物、鸟类、两栖类和鱼类中高度保守,其同源性高达97%。FHM细胞在感染SVCV后,14-3-3β/α-A的蛋白和mRNA水平都显著下降。在FHM细胞中过表达14-3-3β/α-A会促进SVCV的黏附和入侵,然而,14-3-3β/α-A对SVCV在感染后期的复制没有影响。本文首次证明了宿主蛋白14-3-3β/α-A与SVCV G蛋白发生相互作用,并且能促进SVCV的入侵和黏附,为揭示SVCV的致病机理和抗病毒药物的研发提供了新的理论依据。
[博士论文] 吴霆
生物学;水生生物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:鲫鱼是我国最为常见的淡水养殖鱼类,广泛分布于全国各地,是我国大宗淡水鱼类养殖结构的重要组成品种。2012年,全国鲫鱼养殖产量近245万吨,居我国淡水鱼品种第五位,异育银鲫(C.auratus gibelio♀×Cyprinus carpio var.singuonensis♂)是近二十年来鲫鱼养殖推广最为广泛的品种,但自2012年以来,异育银鲫发生了一种严重的新型病害——鳃出血病,在主要养殖区广泛传播,给养殖生产造成巨大的经济损失。
  鳃出血病不同于鲫鱼的常规病害,它具有低水温发病、传染性强、发病迅速、致死率高、难以预防和控制等特征,更重要的是国内以前未有发病报道,发病原因不明,流行规律也不清楚,这严重威胁了异育银鲫养殖业发展。因此,迫切需要开展新型疫病的流行病学调查,查明发病规律;开展病原鉴定,查明病因;建立有效检测方法;同时阐明其致病机理,为下一步进行异育银鲫鲤出血病的防治奠定了基础。
  1.开展流行病学调查
  根据《江苏省水产养殖病害测报规范》,开展流行病学调查,得出鳃出血病的基本流行规律:(1)多发于春季和秋季,水温15~25℃是发病高峰期;(2)患病鱼鳃部出血明显,病鱼尾鳍、背鳍末端色素减退、明显发白,病鱼鳔上有明显出血性瘀斑;(3)具有明显传染性,主要危害一龄幼鱼与二龄成鱼;(4)病原具有较强的宿主专一性,不感染同一养殖环境内的其它淡水鱼类;(5)集中投喂方式引起更高的传染率。
  2.异育银鲫鳃出血病的组织与超微病理学研究及病原鉴定
  组织病理结果显示:病鱼鳃瓣处出现血细胞浸润,鳃小片融合,伴有上皮细胞坏死和脱落;鳃瓣内成团的吞噬细胞带有大小不一的胞浆空泡,显示具有弱嗜碱性;病鱼肾脏肾小球有局灶性坏死病变,毛细血管壁扩张;肾小球肥大细胞核固缩、碎裂,严重空泡化。患病鱼脾脏内血细胞和淋巴样细胞浸润,出现严重空泡化。许多脾脏细胞核染色质边缘化,有些出现核碎裂。患病鱼肝细胞核增大,有核内包涵体,细胞核肥大伴有核固缩,同时有严重的空泡化;肝内胆管显示有炎症,管壁细胞肿胀彼此融合,导致管壁粗糙和异常。患病鱼肠上皮细胞脱落,肠粘膜受损,结缔组织有增生。对病鱼的相应组织进行病理半定量评估,病理变化最显著的是肾脏,其次是鳃、脾脏和肝脏。超微病理观察发现,病鱼鳃、脾脏、肾脏有病毒感染,在细胞质内具包膜病毒粒子170-200nm。病毒在细胞质内有进行成熟加工过程,病毒粒子穿越高尔基网进入带有糖蛋白的囊泡,在囊泡内形成包膜病毒,通过细胞质衣壳的二次包裹,最终在细胞质中形成成熟病毒粒子。
  利用鲤科疱疹病毒聚合酶基因的特异性引物从病鱼鳃、肾脏和脾脏组织中PCR扩增出362bp的目的条带,测序后序列比对结果显示与金鱼造血器官坏死疱疹病毒(CyHV-2)具有99%相似性,病毒分子鉴定的结果为鲤科疱疹病毒Ⅱ型。
  利用柯赫氏法则开展病原验证,健康鱼人工回感后第3日开始出现死亡,濒死鱼具备自然发病鱼的鳃出血、尾鳍背鳍末端发白、鱼鳔上具出血性瘀斑等典型临床症状,至第5日,回感组鱼全部死亡。分子检测回感死鱼的鳃、肾、脾、肝等组织均为CyHV-2阳性,电镜检查肾、脾组织也观察到CyHV-2病毒颗粒,进而确证鲤科疱疹病毒Ⅱ型为异育银鲫鳃出血病的病原,与此前及此后相关报道一致。
  3.CyHV-2荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)检测方法的建立
  通过探针合成、荧光标记、原位杂交等过程,建立CyHV-2荧光原位杂交检测方法,结果表明:探针不与健康鱼组织结合,证明其具有特异性。在肾脏、脾脏、肝脏和鳃局部坏死病灶出现的荧光强度最大,这与HE染色的组织病理学分析结果一致。对于CyHV-2检测,荧光强度最大是在43℃。另外探针浓度在5ng/μL时即可以获得特异和足够的荧光,探针浓度过高(50ng/μL)导致荧光强度升高,但特异性降低。
  4.基于转录组和蛋白组学研究CyHV-2的致病机理
  为了进一步探究CyHV-2侵染异育银鲫的分子致病机制以及宿主相应的免疫机理,本章通过转录组测序和TMT(Tandem Mass Tag)标记定量蛋白质组学技术,筛选CyHV-2感染异育银鲫3天后出现典型症状时,头肾中具有差异表达的基因和蛋白,结果表明:通过转录组序列分析发现异育银鲫感染CyHV-2后,其头肾中有3090个显著上调基因,有3995个显著下调基因;而通过TMT蛋白组定量技术筛选得到197个蛋白表达显著上调,53个蛋白表达显著下调;转录组与蛋白质组联合分析结果表明,转录和蛋白表达都上调的有86个,转录和蛋白表达都下调的有42个。KEGG信号通路发现上调蛋白或基因主要富集在单纯疱疹病毒感染信号通路、RIG-I样信号通路、坏死性凋亡等免疫相关信号通路中。QPCR结果进一步显示这三条信号通路中的LGP2、RIG-I、MDA5、FAS、PKZ、PKR基因的转录水平在感染CyHV-2后的典型发病期显著上调,这与转录组和蛋白组的变化趋势一致。
  5.基于代谢组学研究CyHV-2对异育银鲫代谢的影响
  为了进一步探究CyHV-2侵染对异育银鲫代谢的影响,本章使用了基于LC-Q/TOF-MS分析平台的非靶向代谢组学方法,对异育银鲫感染CyHV-2的血清代谢组的变化进行了调查研究。通过代谢组数据一共鉴定到79种差异代谢物,其中几种碳水化合物(葡萄糖、甘露糖、核糖等)、脂肪酸(十五酸、花生四烯酸、棕榈酸、二十碳五烯酸、羟基二十碳四烯酸、亚油酸及其衍生物)、大部分的氨基酸及其衍生物浓度显著升高。同时鸟嘌呤、胞嘧啶、尿苷、VB2等物质显著下调。代谢通路分析结果显示患病鱼糖和氨基酸转运能力、tRNA及氨基酸合成能力增强。
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