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[硕士论文] 金承玲
渔业 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)属于气单胞菌科,气单胞菌属,是人类-畜类以及水生动物类共同患病的条件致病菌。嗜水气单胞菌属于革兰氏阴性菌、短杆形状,无芽孢,也无荚膜,在0~41℃都可以生长,该菌在营养琼脂和血琼脂平板上极易生长。大多研究者普遍认为嗜水气单胞菌分泌的毒素是导致发病的主要原因,临床上主要表现为细菌性的出血病症状。最近几年,我国水环境被严重破坏,随着集约化养殖技术发展、养殖密度增加,嗜水气单胞菌造成的团头鲂等淡水养殖鱼类暴发性流行性的病害频频发生,加重经济损失。目前,水产上主要用抗生素治疗由嗜水气单胞菌引发的疾病,喹诺酮类药物疗效最好,但大量抗生素也导致很多耐药菌株的产生。本论文开展了对南京地区团头鲂出血性病鱼流行病学调查,通过病原分离及人工回感试验证明,嗜水气单胞菌是引起该疾病暴发的主要病原菌,之后开展了嗜水气单胞菌的分离、鉴定及药敏试验等实验,并对其菌株的耐药性进行了研究,为基层水产养殖业中的科学用药提供有价值的理论依据,以确保水产品的质量安全。
  1、团头鲂出血病的流行病学调查
  经过实地走访、调查发现,南京地区暴发的团头鲂大多是由嗜水气单胞菌引起的,但危害程度有所不同。江宁、浦口等重点养殖区域发病比较严重,具有来势凶猛、涉及范围广、流行速度特别快等特点。根据调查数据发现,嗜水气单胞菌全年均有检出,由嗜水气单胞菌病引起的疾病一般从6月份出现,疾病随着气温水温的升高呈加重趋势,7、8月份为疾病流行的高峰季。在浅水河口、高密度塘和单养池中,多数病例为急性,发病迅速,发病后2-3d内死亡加重,10d左右则出现死亡的高峰期。在面积较大,养殖密度低的池塘或混养池塘团头鲂发病较为缓慢,每天的死亡数量并没有明显变化,但是发病过程较长,经常会持续到10月份左右。发病初期鱼的摄食没有什么影响,发病后期出现不摄食、乱游、乱窜等现象。发病鱼体体表充血,腹部、腹鳍基部充血明显,有的头部充血严重,眼球外凸,肛门肿大,体内多脏器发炎充血,消化道炎症明显,腹腔内有腹水。发病鱼体有严重贫血症状,鳃丝发白,鳍条末梢、肝脏、肾脏有贫血症状。由于发病过程长短不一、年龄大小不一、疾病的发展程度不同,病鱼的症状表现为多种多样性。
  2、团头鲂出血病病原的分离鉴定及人工回感实验
  在无菌环境下,从病鱼肾脏取材,用LB固体培养基分离培养细菌。培养基上的菌落呈淡黄色、圆形、中部凸起、不透明、光滑。结果表明,NO3、TRP、Glu、ADH、ESC、GEL、PNPG、GLU、ARA、MNE、NAG、MAL、GNT、CAP、MLT均为阳性,被鉴定为嗜水气单胞菌。实验结果表明,在LB固体培养基上提取的菌落,具有较强的致病性,记为JNYK1702。菌液密度高低直接影响试验组鱼的存活率,当密度为1×106cfu/尾时试验组鱼死亡率最高,当菌液密度为1×103cfu/尾时试验组的鱼只有一部分死亡。人工感染团头鲂的鱼体症状与自然发病鱼体病症相同,因此得出结论经细菌学分离鉴定得到的菌株JNYK1702-1与供试菌株JNYK1702一致,为同一种菌。
  3、致病性嗜水气单胞菌药敏实验及耐药性试验
  药敏试验采用KB纸片法进行,在无菌环境下用已经灭菌过的棉签蘸取密度调整为1×107~1×108cfu/尾的菌悬液,在LB培养基上均匀涂布。将测试的药敏试纸贴在LB培养基表面,然后将平板置于28℃培养箱中24h,观察各药物敏感纸抑菌圈的直径。从测试结果可知,菌株对青霉素、氨苄西林、四环素、阿莫西林、苯唑西林表现出耐药性。对氧氟沙星、庆大霉素、链霉素、诺氟沙星、罗红霉素、氟苯尼考、头孢曲松药物敏感。
  根据日本化学治疗学会(1975)的方法,测定硫酸链霉素、氨苄西林、土霉素、盐酸金霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、诺氟沙星和诺氟沙星确定致病菌株的药物敏感性。制备液体,经膜过滤器过滤,然后灭菌后用BHI培养基稀释,最后将试管制成双稀释抗菌剂。结果表明:盐酸金霉素、氟苯尼考、硫酸链霉素恩诺沙星的抑菌效果最佳,最小抑菌浓度分别为2、4、4、5μg/mL,其次效果为土霉素和诺氟沙星2种药物,最小抑菌浓度均为15μg/mL;7种药物中,氨苄西林的效果最差,最小抑菌浓度高于40μg/mL。
[硕士论文] 朱江煜
营养与食品卫生学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:微藻,作为一类营养丰富,而且可以循环再生的新兴资源,有着非常广阔的开发和应用前景。其中,雨生红球藻,钝顶螺旋藻以及纤细裸藻,是三种常见的经济类藻株。在生长过程中,它们分别能够产生虾青素,藻蓝蛋白,副淀粉等营养代谢产物,对人体具有极高的营养保健作用。然而,在其自然生长过程中,因为生长条件如光照,pH,温度等因素的限制,这些代谢产物的天然产率较低。如何有效地促进微藻的生长,提高营养代谢产物的含量,是微藻研究领域的热点。本试验以雨生红球藻,钝顶螺旋藻以及纤细裸藻为试验材料,选取农业废弃物米麸提取的植酸和阿魏酸作为生长调节剂,研究了它们在三种微藻生长过程中对细胞生长,细胞形态,光合色素含量,特征代谢产物如虾青素,藻蓝蛋白,副淀粉含量,以及细胞内抗氧化酶活性的影响,并分析了不同藻株之间的差异,为大规模利用天然植物添加剂来提高微藻生物量及营养代谢产物的产率奠定了基础。具体结果如下:
  (1)植酸对雨生红球藻的影响:不同浓度的植酸对雨生红球藻细胞密度,生物量,细胞大小,细胞内叶绿素含量,虾青素含量及抗氧化酶活性影响显著。在0.001%(v/v)的植酸浓度的情况下,雨生红球藻的细胞密度和生物量分别提高了16.5%和12.0%,但随着植酸浓度升高,生长逐渐受到抑制,在0.05%(v/v)浓度下,细胞密度及生物量分别下降47.37%和32.80%;此外,植酸还加速了细胞变大的过程和增加了细胞的最终大小;在0.001%(v/v)和0.01%(v/v)浓度的植酸处理下,细胞内叶绿素及虾青素的含量(占细胞干重的百分比)变化均不显著,在0.05%(v/v)浓度植酸处理下,叶绿素的含量比对照组中下降了20.21%,但虾青素的含量增加了33.83%;超氧化物歧化酶(SOD)的活性随着植酸浓度的升高先上升然后下降,在0.01%(v/v)浓度下达到最高165U/mg·DW,过氧化氢酶(CAT)的活性不断下降,在0.05%(v/v)浓度时下降到31U/g·DW。
  (2)阿魏酸对雨生红球藻的影响:阿魏酸的共溶剂二甲基亚砜(DMSO)对雨生红球藻的生长具有抑制作用,溶剂对照组中细胞密度及生物量分别下降16.67%和47.48%,细胞变大过程加速,细胞内叶绿素下降37.89%,虾青素含量变化并不显著;阿魏酸的加入缓解了DMSO的生长抑制作用,相对于溶剂对照组,500mg/L的阿魏酸处理组中细胞密度和生物量分别上升了45.45%和103.65%,最终细胞大小缩小了16.35%,细胞内叶绿素含量上升了72.11%,但虾青素含量下降32.47%。SOD活性在溶剂对照组中略有上升但并不显著,在500mg/L的阿魏酸处理组中下降到88U/mg·DW,CAT活性在DMSO作用下显著下降,但在500mg/L阿魏酸组中恢复到空白对照组水平。
  (3)植酸对钝顶螺旋藻的影响:植酸对于钝顶螺旋藻生长,细胞形态,叶绿素和藻蓝蛋白含量,SOD及CAT活性的影响因浓度而异。当植酸浓度低于0.05%(v/v)时,钝顶螺旋藻的生物量,藻丝体长度,藻丝体宽度,藻螺旋数,细胞内叶绿素含量,藻蓝蛋白含量,SOD和CAT酶活性均未发生显著变化;当植酸浓度上升至0.05%(v/v)时,螺旋藻生物量相对于对照组下降24.35%,细胞缠绕成团状,形态发生显著变异,藻丝体长度变成对照组的3.93倍,藻丝体宽度并无显著差异,细胞螺旋数上升到对照组的3.63倍,细胞内藻蓝蛋白的含量变化并不显著,叶绿素的含量下降14.08%,SOD活性与CAT活性分别下降到8.3U/mg·DW和6.3U/g·DW。
  (4)阿魏酸对钝顶螺旋藻的影响:本研究中各浓度的阿魏酸对钝顶螺旋藻的细胞干重,藻丝体长度,藻丝体宽度,藻螺旋数,细胞内叶绿素和藻蓝蛋白含量,SOD和CAT酶活性的影响均不显著。
  (5)植酸对纤细裸藻的影响:植酸对于纤细裸藻的生长具有显著的促进作用,且呈浓度依赖的关系,当植酸浓度为0.05%(v/v)时,纤细裸藻的细胞密度及生物量分别提高67.68%和52.94%,纤细裸藻细胞长度的中位值在光暗周期下也均得到延长,表示了更活跃的细胞状态,细胞内叶绿素a的含量提高了76.88%,叶绿素b和类胡萝卜素含量变化并不显著,副淀粉含量变化也不具有显著性,但因为细胞密度的提升,最终得到的副淀粉的总产量相比对照组提高了37.83%。植酸浓度继续升高到0.2%(v/v)时,生长促进作用略有下降,但相对于对照组,细胞密度及生物量仍分别增长了48.17%和33.33%,细胞长度的中位值相对于0.05%(v/v)中有所下降,类胡萝卜素的含量相对于对照组增加了60.59%。SOD活性随着植酸浓度而下降,在0.05%(v/v)浓度时降到41U/mg·DW,但在0.2%(v/v)回升到51U/mg·DW,CAT活性变化变化趋势与SOD活性类似,但并不显著。
  (6)阿魏酸对纤细裸藻的影响:阿魏酸不仅可以缓解共溶剂DMSO的生长抑制作用,且能显著促进纤细裸藻的生长。纤细裸藻的细胞密度及细胞干重在溶剂对照组中分别下降30.64%和12.90%,在光照和黑暗条件下细胞中值长度也均有所下降,细胞内叶绿素a的含量下降29.47%,副淀粉的含量上升77.37%;随着阿魏酸的加入生长抑制作用逐渐减弱,且纤细裸藻的生长有所促进。当阿魏酸浓度为500mg/L时,细胞密度及生物量相比空白对照组分别提高了149.65%和116.13%,相比溶剂对照组分别提高了259.93%和148.15%,细胞长度在光照和黑暗条件下均得到延长,光合色素含量,特别是叶绿素a含量也显著增加。细胞内的副淀粉含量变化并不显著,但因为细胞数量的增加,副淀粉的总产量增加了69.05%。SOD和CAT活性在溶剂对照组显著上升,但在500mg/L阿魏酸的处理下两种抗氧化酶的活性均发生下降。
  米麸提取的植酸和阿魏酸对于微藻生长及高营养价值产物的影响因藻株的种类而异。在本研究中,我们首次发现,植酸及阿魏酸对于雨生红球藻和纤细裸藻的生长均有一定的促进作用,尤其是纤细裸藻,这是一种绿色而高效的促进微藻产率的方法,为大规模利用农业废弃物,促进微藻生长及高营养代谢产物的生产提供了理论基础,此外,在钝顶螺旋藻的研究中,我们还发现高浓度的植酸会导致螺旋藻细胞聚集成团,这项发现在钝顶螺旋藻的收获方面也具有应用潜力。
[硕士论文] 刘延
食品科学与工程 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:我国淡水鱼产量大且种类丰富,但大多地区以鲜销为主,在低温保鲜条件下贮藏,加工水平较低,这导致了淡水鱼在死后易腐败,对淡水鱼产业造成了巨大的经济损失,以及极大的资源浪费。前人研究表明淡水鱼的腐败变质变主要由腐败菌造成,大部分革兰氏阴性腐败菌的生长及腐败能力由其自身分泌的群体感应AHLs信号分子调控。本文以内蒙古地区常见的鲫鱼、鲤鱼、鲈鱼为研究样品,揭示其在4℃腐败过程中品质变化,并结合高通量测序手段探究鱼体在新鲜点、鲜度终点、腐败点的菌相变化。分离筛选内蒙古淡水鱼的特定腐败菌(SSO),接种鱼汁模型模拟腐败,并构建了以RBL-2H3为生物识别元件的丝网印刷电化学传感器,用于监测、评价AHLs水平变化,为淡水鱼的腐败监测提供新的、高效的技术与手段,为淡水鱼在低温贮藏过程中的腐败预防研究提供理论依据与基础。本文主要的方法与结果如下:
  (1)淡水鱼于4℃贮藏,随着低温腐败的进行,淡水鱼的pH值、电导率、菌落计数、TVB-N值和感官QI分数显著上升(P<0.05),其中腐败速度最快的为鲈鱼,其次是鲤鱼,鲫鱼最慢。鲫鱼鲜度终点选定为第12d,鲤鱼和鲈鱼为第8d,三种淡水鱼腐败点均为第16d。高通量测序表明鲜度终点菌相构成比新鲜点和腐败点更具有多样性,内蒙古淡水鱼新鲜点优势菌属包括Aeromonadaceae、Ochrobactrum、Shewanella、Acinetobacter、Rhodococcus等;鲜度终点优势菌属包括Aeromonadaceae、Pseudomonas、Shewanella、Vagococcus、Carnobacterium、Moraxellaceae等;腐败点优势菌为Aeromonadaceae、Pseudomonas、Shewanella、Vagococcus等;整个贮藏过程中,Aeromonadaceae占比减少,Shewanella与Pseudomonas比重逐渐增加,Pseudomonas和Shewanella为4℃冷藏下内蒙古淡水鱼腐败过程中的优势腐败菌。
  (2)从内蒙古地区三种淡水鱼的腐败样品中,通过4℃生长测试与菌落形态观察结合生理生化鉴定,共分离筛选到候43株选菌株。提取菌株DNA,进行16S rDNA测序,发现候选菌株中气单胞菌属、希瓦氏菌属、假单胞菌属占据主要构成部分。其中气单胞菌属有11株,希瓦氏菌属13株,假单胞菌属8株,另外得到嗜冷杆菌4株,热杀索氏菌2株,肉食杆菌2株,类香味菌属2株以及芽孢杆菌属1株。判断Pseudomonas fluorescens strain L228荧光假单胞菌与Shewanella baltica OS678希瓦氏菌是内蒙古鲫鱼、鲈鱼、鲤鱼在4℃腐败过程中的特定腐败菌。
  (3)选用8mg/mL多壁碳纳米管(MWNTs)修饰丝网印刷电极(SPCE),扫描电镜以及电化学表征证明MWNTs修饰后SPCE电极基础电阻大幅降低,灵敏度提高。优化氧化石墨烯(GO)在海藻酸钠(NaAlg)凝胶中比例,结果表明最优浓度为0.1mg/mL。多晶体X射线衍射和傅里叶红外光谱检测发现GO和NaAlg形成凝胶后良好融合,扫描电镜观察到凝胶呈3D网状结构,能稳固的包裹高浓度的RBL-2H3细胞。传感器的电化学表征结果中CV、DPV和EIS测试结果证明细胞传感器的构建成功。电极上细胞在1×103~1×108cells/mL浓度范围内的电阻值线性上升,线性方程为y=720.04x+397.35,R2=0.9853,选择1×107cells/mL作为最优细胞浓度进行后续的实验。
  (4)经过CCK-8细胞活力检测、Ca2+荧光探针检测以及流式细胞术检测,发现5种AHLs对RBL-2H3细胞均有着不同程度的损伤作用,并诱导细胞凋亡。透射电镜以及扫描电镜观察到AHLs对细胞损伤主要为细胞膜破损,细胞释放内容物伴随颗粒脱出,损伤严重的细胞皱缩甚至破碎,细胞核消融。使用RBL-2H3细胞构建电化学传感器检测Pseudomonas以及Shewanella的主要信号分子3OC12-HSL与C4-HSL标准品,3OC12-HSL浓度在0.1~1.0μM范围内,ΔRet与3OC12-HSL浓度具有线性关系,线性方程为y=-1530.5x+3789.6,R2=0.9904;C4-HSL浓度在0.2~1.0μM范围内,线性方程为y=-1321.5x+4340.5,R2=0.9755,两者检测限均在0.1μM左右。结果表明该电化学细胞传感器可以用于AHLs水平评价。
  (5)将特定腐败菌Pseudomonas以及Shewanella,分别接入无菌鱼汁中于4℃条件下模拟腐败,随着时间的延长,鱼汁中细菌浓度及TVB-N值逐步上升,蛋白质浓度下降。电化学细胞传感器检测细胞电阻值变化表明,Pseudomonas以及Shewanella产生的AHLs浓度在0~6d逐步增加,并在第6d到达最高后下降,菌株腐败能力也随之降低,表明AHLs对腐败能力具有调控作用。
[硕士论文] 何旺泉
水产 集美大学 2018(学位年度)
摘要:为探讨饲料中添加精油与有机酸复合包被物(AviPlus(R)AP)对凡纳滨对虾生长和非特异性免疫力的影响,本研究设计了两个试验。
  1.不同水平梯度的AP对凡纳滨对虾生长、肠道健康和抗副溶血弧菌感染力的影响
  本试验选取525尾均重为0.2g的试验虾苗进行为期8周的养殖试验。在基础组饲料上分别添加0、0.3、0.6、0.9和1.2g/kg AP,形成Con组、AP0.3组、AP0.6组、AP0.9组和AP1.2组。每组设置3个平行,每个平行35尾虾。结果:各组凡纳滨对虾的存活率差异不显著(P>0.05),且各组平均存活率均在94.29%以上。除AP0.3组外,其他添加组的血清总蛋白含量均显著高于Con组(P<0.05)。AP0.9和AP1.2组的血清碱性磷酸酶和酚氧化酶活性均显著高于Con组(P<0.05)。AP0.6组血清谷胱甘肽过氧化氢酶活性达到最大值,并且显著高于Con组(P<0.05)。AP添加组的促炎因子(TNF-α、LITAF和Rab6a)的表达量均下调。AP0.6和AP1.2组肠道菌群OTUs值均高于Con组。AP0.9和AP1.2组中的厚壁菌门丰富度高于Con组,而变形菌门丰富度趋势相反,AP1.2组中的乳酸杆菌数量显著高于Con组(P>0.05)。副溶血弧菌感染48h后,AP0.3组凡纳滨对虾的存活率显著高于Con组,AP添加组的免疫相关因子(溶菌酶、对虾素和过氧化氢酶)表达量均显上调(P<0.05)。表明,添加AP有益于肠道健康和提升凡纳滨对虾的免疫力。
  2.低鱼粉饲料中添加AP对凡纳滨对虾生长、消化率以及肝胰腺和肠道健康的影响
  本试验以含有25%鱼粉的饲料作为对照组(HFM),用豆粕分别替代对照组饲料20%和40%的鱼粉形成饲料SM1和SM2,分别向SM1和SM2组饲料中添加0.6g/kg添加剂AP,形成饲料ASM1和ASM2组,共计5种试验饲料,进行为期8周的摄食生长试验。每组设置4个平行,每个平行50尾虾(初始重:0.56±0.01g)。结果:各组凡纳滨对虾的成活率无显著差异(P>0.05),且均在88%以上。HFM和ASM1组凡纳滨对虾的增重率均显著高于SMA、SM2和ASM2组(P<0.05)。与HFM组相比,SM1和ASM1组的饲料系数无显著变化(P>0.05),而SM2和ASM2组的饲料系数均显著上升(P<0.05)。与SM1组相比,ASM1组饲料的粗蛋白表观消化率显著升高(P<0.05)。与HFM组相比,ASM1组血清总蛋白和谷草转氨酶含量显著升高(P<0.05);血清中白蛋白、葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、谷丙转氨酶和丙二醛含量均无显著变化(P>0.05);SM1和ASM1组血清酚氧化酶活性显著升高(P<0.05),而SM2和ASM2组的血清酚氧化酶活性无显著变化(P>0.05);SM1组血清谷胱甘肽过氧化氢酶活性无显著变化(P>0.05),而ASM1组血清谷胱甘肽过氧化氢酶活性显著升高(P<0.05);ASM1和ASM2组血清总抗氧化能力无显著变化(P>0.05),而SM1和SM2组血清总抗氧化能力显著下降(P<0.05)。肝胰腺切片观察显示,随着替代水平增加,肝胰腺中B细胞逐渐变小,ASM1和ASM2组肝小体中R细胞数量高于其他组,SM2组中肝小体基底膜破损较为严重。各组肝胰腺中过氧化氢酶、Pen-3a和碱性磷酸酶的基因表达量均无显著差异(P>0.05)。与HFM组相比,ASM1组肝胰腺中溶菌酶和C型凝集素3的基因表达量无显著变化(P>0.05),而SM2和ASM2组显著下调(P<0.05)。HFM和ASM1组肠道中厚壁菌门的丰富度均高于其他组。ASM1和ASM2组肠道中假交替单胞菌的数量均低于SM1和SM2组。与HFM组相比,ASM1和ASM2组肠道中TNF-α的基因表达量无显著变化(P>0.05),而SM1和SM2组上调;SM1和SM2组肠道中Rab6a的基因表达量均无显著变化(P>0.05),而ASM1和ASM2组均显著下调(P<0.05);ASM1组肠道中溶菌酶的基因表达量无显著变化(P>0.05),而SM1、SM2和ASM2组均显著下调(P<0.05)。各组肠道中超氧化物歧化酶的基因表达量无显著变化(P>0.05)。SM2组肠道中一氧化氮合酶的基因表达量显著高于其他组(P<0.05)。表明:高豆粕饲料会降低南美白虾的生长、消化和非特异性免疫力。饲料中添加0.6g/kg AP可以提高凡纳滨对虾的生长和免疫力,改善肠道菌群环境,解肠道炎性,降低肝胰腺组织损伤缓。
[博士论文] 栾兰兰
食品科学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:冷冻保藏是水产品最普遍最有效的保藏方式,能够有效抑制水产品的腐败变质。但是,在冷冻保藏过程中冰晶的形成过程及其形成后的状态对于食品的品质如持水性、蛋白质变性、脂肪氧化等都有本质的影响,另外直接影响了食品货架期和商品价值。冷冻过程及其冷冻保存过程中冰晶的形成机制研究对于冷冻技术的完善和冷冻技术在水产领域乃至食品领域的推广具有极其重要的理论意义。基于此,本课题以带鱼为原材料,针对带鱼冷链物流中存在的贮藏温度波动、贮藏时间不固定以及多次解冻后再冻结(冻融循环)等不同因素,对冰晶观测方法学进行了全面系统的研究,建立了冰晶生长预测模型,并研究了壳寡糖作为抗冻剂对冰晶的抑制及抗冻保水作用,同时完善了分形维数作为带鱼品质指标的评价体系。得到的主要结论如下:
  (1)针对于不同冻结方式下带鱼冰晶观测的方法学进行了研究,主要包括冰冻切片法、冷冻替代法、扫描电子显微镜法和X射线断层扫描法。冰冻切片法与冷冻替代法所观察到的冰晶痕迹性状没有明显差异(p>0.05),且与冷冻替代法相比,样品前处理时间大大缩短,可将冷冻替代所需的3-5天缩短为20-30分钟。另外,几种观测手段结论一致,即液氮浸渍冻结与其他冻结方式相比,产生更小更规则的胞内冰晶,其肌肉纤维保持较好的完整性,排列紧密,具有较高的持水力。而传统慢速冻结样品,生成的为大的胞外冰晶,对肌肉纤维造成分离和破坏,肌肉具有较低的持水力。慢冻对冷冻食品的最终品质造成不可逆转的破坏。
  (2)随着贮藏时间的延长,4组样品均呈现肌肉间空隙增大的趋势,冰晶的体积逐渐增大,肌肉纤维被挤压,导致它们的分离;当贮藏温度越低时,相同时间下形成的冰晶越小,冰晶增长越不明显,组织破坏越小,保存后的食品品质与鲜品质地越接近。此外,在重结晶的过程中,冰晶的圆度和拉伸度没有显著变化,冰晶是在初始形态的基础上均匀向四周扩增的。通过一阶动力学模型和阿伦尼乌斯方程的运用,得出冰晶大小的预测模型为:D=D0 exp(0.5624t exp(-7745.45/RT)。通过对模型的验证,预测值和测定值的误差均保持在10%以内,因此,建立的该模型较好地预测了在不同贮藏温度以及不同贮藏时间下的冷冻带鱼的冰晶大小。
  (3)水分活度、色差值、弹性、硬度、咀嚼性等指标均随贮存时间的延长而呈现不同程度的下降,而K值则随着贮存时间的延长逐渐上升,同时,贮藏温度越低,水分活度、色泽、质地等指标下降速度越慢,K值上升速度越慢,越有益于保持食品原有品质。另外,分形维数FD值随着贮藏时间的增加呈现下降的趋势,也就意味着带鱼在贮藏期间组织的不规则程度增加;同样贮藏温度越低,越能够抑制FD值的下降。通过对比FD值与K值结果,得出:一级鲜度的FD值1.9565~1.9175,二级鲜度的FD值1.9175~1.7705,初级腐败的FD值1.7705~1.5302。鲜度设定FD值临界值的求取,实现了通过求取FD值就可以直接对鱼肉新鲜度进行评价。最后建立了FD值与各项理化性质在不同贮藏温度下的函数模型,所建立的函数模型相关系数较好,拟合度较高,建立了基于分形维数的冷冻带鱼品质评价方法。
  (4)在反复冻融处理的过程中,冰晶不断消失又重新生成,肌纤维发生径向收缩,肌纤维间出现较大孔隙,冰晶的生成和生长会对鱼体肌肉细胞产生一定的损伤。通过多孔微观结构分形维数的分析,分形维数随着冻融循环次数的增加而减小,说明冰晶的形成使得肌肉组织的不规则程度增加。同时持水力和质构在冻融循环过程中不断降低,挥发性盐基氮(TVBN)值、硫代巴比妥酸(TBA)值以及菌落总数值均呈上升趋势。在较低的温度冷冻时,能够一定程度上抑制分形维数、持水力和质构的下降,以及抑制TVBN、TBA和菌落总数的上升。说明在带鱼的冷冻贮藏过程中,要尽量减少冻融循环次数,同时应该在较低的冷冻温度下冷冻贮藏,才能较好地保持带鱼的原有新鲜品质。此结果进一步证明了分形维数在评价带鱼冷冻过程中的品质变化的可行性。
  (5)壳寡糖浸泡处理能有效降低冷冻带鱼的解冻汁液损失,且在维持带鱼质构品质、延缓肌原纤维蛋白含量的下降以及保护巯基、Ca2+-ATPase活性等方面均具有较好的效果。另外,壳寡糖对冷冻带鱼的冰晶生长具有抑制作用,能够延缓冷冻贮藏过程中分形维数的降低,对冷冻带鱼微观结构的保持作用较好,同时较高浓度的壳寡糖处理效果更佳。因此,壳寡糖可作为一种优良的抗冻保水剂应用于冷冻水产品中,其含有的大量羟基能够有效抑制冰晶的形成,防止蛋白质变性,有效起到抗冻保水的作用,保证产品品质。
  本研究有利于全面理解带鱼冷冻过程中的冰晶及相关品质变化机理,有利于优化产业结构,分形维数理论推动逐渐完善冷冻带鱼品质分析技术,同时也为其他冷冻水产品和肉类的品质研究提供新的思路和科学依据。
[硕士论文] 鲍诗源
生物学 集美大学 2018(学位年度)
摘要:本研究根据实验室转录组数据库利用PCR技术克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)转化生长因子-β激活激酶1(LcTAK1)和TAK1结合蛋白1(LcTAB1)、TAK1结合蛋白2(LcTAB2)的cDNA序列,对其氨基酸序列及蛋白结构进行了预测和分析。研究了它们在大黄鱼各组织中的表达情况;检测了经病原相关分子模式(PAMP)刺激后,TAK1和TAB1、TAB2基因在大黄鱼肾细胞系(LCK)中转录水平的时空表达谱;并对三个基因进行亚细胞定位分析。此外,本研究还构建了它们的过表达重组载体,将TAK1与其结合蛋白TAB1/TAB2分别或共转染人胚胎肾细胞系293T(HEK293T),检测不同PAMPs刺激后对NF-κB的激活及下游细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α),白细胞介素(IL)IL-6、IL-1β、IL-8和Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)等基因转录水平表达的调控。主要结果如下:
  (1)LcTAK1与其结合蛋白TAB1、TAB2的克隆、表达分析及定位
  LcTAK1基因ORF为1725bp,编码574个氨基酸(aa),预测分子量(Mw)64.2kDa,理论等电点(pI)6.69;包括一个典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(S_TKc),属于保守的TAK1家族。LcTAK1遍布于大黄鱼多个组织,其中在脑和脾脏中表达量较高,肌肉中表达量最低;亚细胞定位表明其主要存在于细胞质;LPS、flagellin和poly I:C刺激可诱导LCK细胞系中LcTAK1转录水平显著上调(p<0.05)。
  LcTAB1基因ORF为1521bp,编码506aa,预测Mw54.6kDa,理论pI5.35;包括一个PP2Cc结构域和一个TAB1家族保守的C末端基序(PYVDFSQFYLLWGSDH),属于保守的TAB1家族。LcTAB1遍布于大黄鱼多个组织,其中脑和脾脏中表达量较高,肌肉中表达最少;亚细胞定位表明LcTAB1主要在细胞浆中表达;LPS和poly I:C刺激后LCK细胞系中LcTAB1表达量显著增加(p<0.05)。
  LcTAB2基因ORF为2271bp,编码756aa,预测Mw为81.7kDa,理论pI8.26;包括一个N末端CUE结构域和一个ZnF_RBZ结构域,属于保守的TAB2家族。LcTAB2在多个组织中都有表达,其中在血、脑和脾脏中表达量较高,在肝脏中表达量最低;主要定位于细胞质;在LCK细胞系中LPS、flagellin和poly I:C刺激可诱导LcTAB2的显著上调(p<0.05)。
  (2)LcTAK1与LcTAB1对NF-κB及下游免疫反应的激活
  LcTAK1或LcTAB1单独过表达均不能激活NF-κB启动子转录,但LcTAK1与LcTAB1共同过表达可以显著激活NF-κB活性,并诱导HEK293T细胞中IL-8表达量增加(p<0.01)。LPS刺激可以增强LcTAK1和LcTAB1共同过表达对NF-κB启动子的激活(p<0.05),进而诱导细胞因子TNF-α,IL-6和IL-8的表达(p<0.01)。在LcTAK1和LcTAB1共同过表达细胞中,poly I:C刺激也能增强NF-κB启动子的活性,但不能诱导TNF-α,IL-6和IL-8转录。以上结果显示LcTAK1和LcTAB1的相互作用可能在NF-κB活化中起关键作用,并且在鱼类抗细菌和抗病毒免疫防御中发挥不同的功能。
  (3)LcTAK1与LcTAB2对NF-κB及下游免疫反应的激活
  LcTAB2单独过表达可激活NF-κB和大黄鱼炎症细胞因子TNF-α、IL-1β启动子活性(p<0.05)。LcTAK1单独过表达可激活大黄鱼NF-κB-P65、TNF-α、IL-1β和干扰素IFNⅠ的启动子活性(p<0.05);其中大黄鱼TNF-α启动子活性与HEK293T细胞中TNF-α转录表达的结果不同,表明不同物种的TAK1在NF-κB信号通路中可能发挥不同的激酶功能。而LcTAK1与LcTAB2共同过表达会显著抑制NF-κB及其亚基P65、TNF-α、IL-1β和IFNⅠ的启动子活性(p<0.05);表明TAK1与TAB2的相互作用参与了NF-κB介导的炎症反应及抗病毒免疫应答,并且LcTAB2可能对LcTAK1存在负调控作用。
[硕士论文] 张庆庆
生物学 集美大学 2018(学位年度)
摘要:溶藻弧菌(Vibrio aliginolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是水产养殖环境中比较常见的条件致病菌,它们分布广泛,致病率高,可以感染多种水产养殖动物,对世界各地的水产养殖产业造成巨大的经济损失。而对溶藻弧菌和哈维氏弧菌进行快速检测和监控则是对其疾病进行预防和治疗的前提和基础。核酸适配体,是一种具有高亲和力和特异性的核酸分子,在微生物检测方面显示出巨大的优势和应用潜力。
  本研究以溶藻弧菌及其灭活菌和哈维氏弧菌及其灭活菌为靶目标,对其核酸适配体进行了亲和特异性研究和亲和常数的测定。结果显示,6个适配体(#7、#9、#37、I22、S27、S35)对其目标菌均有较好的亲和特异性,相应的亲和常数分别为13.56±5.01、34.55±11.34、40.28±13.39、33.42±13.24、26.21±8.73和29.42±7.91nM,其中,溶藻弧菌的#37适配体和哈维氏弧菌的S35、S27适配体对非目标菌(嗜水气单胞菌、大肠杆菌和迟钝爱德华氏菌)的亲和力较弱,表现出对目标菌更好的亲和特异性。并采用高保真度的碱基配对策略对适配体二级结构进行了模拟与分析。
  定性检测结果显示,#7适配体能检测出102CFU/mL以上的灭活溶藻弧菌,#9和#37适配体能检测出102和103CFU/mL以上的溶藻弧菌。I22适配体能检测出102CFU/mL以上的灭活哈维氏弧菌,S27、S35适配体则能检测出102CFU/mL以上的哈维氏弧菌,初步建立了针对溶藻弧菌和哈维氏弧菌的基于适配体的定性检测技术。
  定量检测研究表明,#9和I22适配体的标准曲线线性拟合效果较好。利用适配体定量检测弧菌,不需要细菌基因的提取与纯化,不需要PCR扩增,具有特异性强、简易和高效等特点,但在稳定性和准确性方面还需进一步改善。
[博士论文] 白晓东
港口、海岸及近海工程 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:随着社会发展和生活水平的提高,人们对水产品的消费在不断增加,为满足人们日益增长的海洋水产品的需求,拓展水产品发展空间大力开发和利用海洋渔业资源成为必然选择。近些年来,传统海洋渔业资源开发多围绕着近岸区域发展,渔业资源的养殖、增殖和捕捞受到近岸海洋污染等众多因素的限制;同时过度的捕捞和开发利用,可利用的近岸海洋渔业资源也在不断较少,渔业水产品的养殖捕捞量也逐渐下降。为进一步开发海洋渔业资源和保护近岸生态环境,发展深远海养殖牧场已成为全球渔业发展的趋势。深海养殖牧场是将网箱安装在深远海,利用海洋优质水质进行规模化人工养殖的主要方式。经过过去几十年的发展,对深远海养殖牧场的开发在挪威和美国等发达国家已经初具规模,但国内网箱养殖产业的发展依然滞后。关于网箱水动力特性及安全性能研究已取得一些进展,但相关研究基础还比较薄弱,很多基础性科学问题需要进一步的深入研究。本文主要对深水网箱浮架结构的水动力特性及安全疲劳进行分析研究。
  本文通过曲线梁法和有限元模型,对网箱浮架系统的弹性响应和应力应变分布进行了分析;并利用疲劳估算时域法和频域法对浮架疲劳寿命进行了估算。主要研究内容如下:
  (1)采用曲线梁理论对网箱浮架结构弹性响应进行了分析。通过模态叠加法和曲线梁法建立浮架弹性响应分析模型,利用牛顿第二定律分析网箱和浮架运动响应;通过物理模型实验结果和数值结果对比验证了浮架运动分析和变形分析模型的有效性;对比分析了浮架变形的各阶模态、不同波浪入射角等因素对浮架变形的影响,并对浮架变形最大位置进行了分析;分析了随机波浪作用下浮架变形的频域响应,计算了浮架平面内变形和外变形与波浪的传递函数、相干数和相位差。
  (2)联合利用有限元模型和水动力学模型对浮架系统应力响应进行了研究。通过将计算浮架受力的水动力学模型和计算浮架应力的有限元模型交替迭代求解,实现水流作用下网箱系统柔性浮架结构的应力计算。通过与模型实验结果比较,验证了数学模型。分析了单点系泊双体和三体组合式网箱浮架系统水流作用下的应力分布情况。同时,分析了波浪作用下浮架的应力分布情况,并计算得到浮架应力的历时曲线及浮架应力与波高之间的相关性和相位差。
  (3)利用疲劳寿命估算的时域方法和频域方法,对浮架的疲劳寿命进行了估算。时域疲劳寿命分析中,利用线性疲劳损伤理论和浮架材料疲劳SN曲线,建立简化疲劳分析时域模型,求解出浮架疲劳损伤和寿命;研究了不同材料疲劳性能曲线,波浪入射角,锚碇形式和极端海况等因素对浮架疲劳寿命的影响。频域疲劳寿命分析中,利用Weibull分布,Rayleigh分布,Gamma分布和广义极值分布等分布函数拟合浮架应力范围的短期和长期分布,建立浮架疲劳分析频域模型,探究分布模型估算浮架疲劳寿命的适用性;分别基于应力范围的短期分布和长期分布估算浮架疲劳寿命;并将简化时域方法和频域方法估算得到疲劳寿命进行对比分析。
[硕士论文] 苏红
水产品加工及贮藏工程 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:河豚鱼味道鲜美,营养丰富,因其体内含有河豚毒素在国内长期被禁食。目前中国关于河豚鱼的研究主要集中在无毒养殖技术及中毒护理方面,深加工技术及保鲜技术的研究很少,随着河豚鱼市场的开放,研究出有效的保鲜技术是河豚鱼产业发展的迫切需要。本研究以红鳍东方鲀为研究对象,探索了红鳍东方鲀在冰温下的特定腐败菌,并建立了特定腐败菌(假单胞菌)的动力学模型和货架期方程;选择了可以显著抑制特定腐败菌生长的生物保鲜剂,研究了复合生物保鲜剂对红鳍东方鲀的保鲜效果,主要研究结果如下:
  1.分离鉴定了红鳍东方鲀的特定腐败菌。利用选择性培养基研究了冰温下红鳍东方鲀鱼块的菌相,在比例占优势的选择性培养基上挑取单菌落进行分离纯化,通过菌落形态的观察,致腐能力的测定,部分生理生化实验和16S rDNA分子鉴定,确定了冰温下红鳍东方鲀的特定腐败菌为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
  2.建立了荧光假单胞菌动力学模型和货架期方程。采用修正的Gompertz模型拟合了冰温贮藏期间红鳍东方鲀鱼块中假单胞菌的生长曲线,建立了荧光假单胞菌的动力学模型和货架期方程,经验证,模型拟合效果较好,货架期预测方程可靠。
  动力学模型为:lg N(t)=3.38+3.87×exp{-exp[0.4949×(12.4311-t)+1]};货架期方程为:SL=12.431-7.25-lgN0/1.915×[ln(-ln5.20-lgN0/7.25-lgN0)-1]
  3.研究了生物保鲜剂对红鳍东方鲀的保鲜效果。针对冰温下红鳍东方鲀的特定腐败菌种类,以菌落总数、挥发性盐基氮(TVB-N)、汁液流失率为指标,选择了对其抑制作用较好的海藻酸钠、柠檬酸、植酸及百里酚4种生物保鲜剂对其进行保鲜效果的研究,并且根据协同效应原理,选择海藻酸钠、柠檬酸及百里酚进行复配,以菌落总数为响应值,通过响应面优化了其配比。结果表明,4种生物保鲜剂均能抑制腐败菌的生长,减缓TVB-N值的增长,并且柠檬酸较植酸对红鳍东方鲀的保鲜效果更好。复合生物保鲜剂的最佳配比为:柠檬酸浓度0.68%、百里酚浓度1.45%、海藻酸钠浓度1.94%。
  4.验证了复合生物保鲜剂对红鳍东方鲀的保鲜效果。采用最佳配比的复合生物保鲜剂处理红鳍东方鲀鱼块,贮藏在冰温及冷藏条件下,以pH、汁液流失率、TVB-N、TBA、菌落总数及假单胞菌数为指标,验证复合生物保鲜剂的保鲜效果。结果表明,该复合生物保鲜剂可以产生协同效应,扩大抑菌范围,比单一生物保鲜剂对红鳍东方鲀的保鲜效果更佳,冰温下可将红鳍东方鲀的货架期由13d左右延长至30d,冷藏条件下将货架期由5d延长至11d左右。
  本论文确定了冰温下红鳍东方鲀的特定腐败菌为荧光假单胞菌,为后续有效的保鲜技术研究提供了理论依据,研究了复合生物保鲜技术对红鳍东方鲀的保鲜效果,为红鳍东方鲀以后的市场流通条件提供了技术理论。
[硕士论文] 孙莎
生物学 集美大学 2018(学位年度)
摘要:鱼类在动物进化中处于承前启后的地位,不仅数量多而且性别决定类型也多种多样,是研究性染色体进化和性别决定机制很好的材料。多数鱼类具有性别二态性,性别特异分子标记的开发和应用对开展性别控制育种和解析鱼类的性别决定机制具有重要的意义。本研究以黄姑鱼(Nibea albiflora)为研究对象,成功开发出可以鉴别其遗传性别的特异分子标记,并克隆了黄姑鱼Dmrt1、Gsdf和Amh三个性别相关基因,分析了这三个基因在黄姑鱼中的表达特性,初步探讨了黄姑鱼的性别决定机制。主要研究结果如下:
  1、从分析黄姑鱼Dmrt1基因的结构差异入手,发现该基因的第1个内含子在X和Y染色体上存在45bp插入缺失片段。针对Y染色体上的45bp缺失设计了两对特异引物用于其遗传性别鉴定,通过验证不同的黄姑鱼群体发现该分子标记稳定性良好、鉴别结果可靠,可用于黄姑鱼遗传性别的鉴定。
  2、黄姑鱼Dmrt1基因cDNA序列全长2457bp,其中ORF为906bp,编码301个氨基酸。该基因的3'UTR区域同其他物种中的Dmrt1基因一样含有11bp的蛋白结合基序。黄姑鱼Dmrt1基因在雄性的精巢中特异性高表达(P=0.0016)。孵化后第49天(49day past hatch)的雄鱼性腺中检测到有明显表达,104dph表达量达到高峰,之后表达量开始下降,稳定后的表达量约为104dph时的20%左右。在整个发育过程中Dmrt1基因在卵巢中几乎检测不到其表达,表明该基因的表达与黄姑鱼精巢的分化和发育有重要联系。
  3、黄姑鱼Gsdf基因在精巢中高表达(P<0.001),除性腺以外的其他组织中也有检测到该基因的表达,但表达量远低于精巢。Gsdf基因在40dph的雄鱼性腺中开始表达,在120dph表达量达到高峰,整个发育过程中Gsdf基因在卵巢中几乎检测不到其表达,表明Gsdf基因的表达与黄姑鱼精巢的发育密切相关。
  4、黄姑鱼Amh基因在黄姑鱼雄性的精巢中特异性高表达(P=5.35×10-6)。Amh基因在40dph的雄鱼性腺中开始检测有微量表达,78dph表达量达到高峰,390dph之后表达量基本保持稳定,约为78dph时的10%左右。整个发育过程中Amh基因在卵巢中的表达量相对极低,该基因在黄姑鱼精巢分化时期高表达,预示着Amh基因参与了黄姑鱼精巢的分化和发育过程。
[硕士论文] 高玉雪
生物学 集美大学 2018(学位年度)
摘要:大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国特有的最重要的海水经济鱼类之一,在生长上存在性别二态性,但是目前对其性别决定机制的了解还比较欠缺。对大黄鱼性别决定关键基因的研究,有助于今后繁殖生产和育种工作的开展。本研究从在大黄鱼精巢特异性表达的Dmrt1基因入手,克隆了其全长cDNA及X和Y染色体上Dmrt1基因(分别称为LcDmrt1X和LcDmrt1Y)的启动子序列,构建了该基因的表达载体注射到青鳉受精卵观察其表达和对青鳉性别发育的影响,并通过构建荧光素酶报告基因载体,对启动子活性区域进行了初步分析。主要研究结果如下:
  1、通过RACE技术获得了大黄鱼Dmrt1基因(LcDmrt1)的全长cDNA序列,共3037bp,其中包括918bp的ORF,132bp的5'UTR和1932bp的3'UTR。以大黄鱼BAC文库中包含Dmrt1基因的X和Y染色体片段的单克隆为模板扩增了Dmrt1基因启动子区的核苷酸序列,发现两者之间存在许多SNP和插入缺失变异。生物信息学软件预测的结果表明,LcDmrt1的启动区存在多个转录因子结合位点,包括TATA结合蛋白(TBP)、SMAD2以及性别相关蛋白SOX家族成员(SOX5、SOX10、SOX17)和SRY等结合位点;其中,LcDmrt1Y在-1375bp处含有1个特异的TBP结合位点,LcDmrt1X在-1813bp处和在-2416bp处分别有一个特异的SOX5结合位点和SRY结合位点。此外,LcDmrt1Y在启动子区还含有2个DMRT1结合位点,分别位于-1040bp和-287bp处,而LcDmrt1X有3个DMRT1的结合位点,分别位于-1820bp,-1048bp和-298bp处,其中-1820处的DMRT1结合位点是X染色体特异的。
  2、利用克隆的大黄鱼Dmrt1全长cDNA成功构建了PCS2-LcDmrt1过表达载体,利用显微注射技术导入模式鱼青鳉受精卵中,观察LcDmrt1在青鳉体内的基因整合、表达和对青鳉性别发育的影响。结果表明,注射48h后,Lc Dmrt1基因在青鳉胚胎内大量表达,孵化后40d的稚鱼中LcDmrt1的整合率为24.3%,并观察到1尾遗传型为XX的青鳉发育成了雄鱼,表明LcDmrt1具有诱导青鳉雌鱼性腺分化发育成精巢的作用。
  3、构建了含有LcDmrt1X和Lc Dmrt1Y不同长度启动子序列的双荧光素酶报告载体ProD2K-X(-1983,+133)、Pro-D2K-Y(-1975,+133)、Pro-D700-X(-615,+133)和Pro-D700-Y(-607,+133)。分别共转染人胚胎肾细胞系(HEK-293)检测其表达活性。结果表明,LcDmrt1X和LcDmrt1Y启动子都有活性,LcDmrt1Y的启动子活性高于LcDmrt1X的启动子。将上述4种启动子活性分析质粒分别与PCS2-LcDmrt1共转染,观察LcDmrt1是否有自我反馈的调节机制。结果表明,过表达LcDmrt1会降低启动子活性,说明大黄鱼DMRT1具有具有负反馈调节作用,结合LcDmrt1Y启动子的表达活性明显高于LcDmrt1X的结果分析,表明LcDmrt1的抑制程度可能与其启动子区DMRT1结合位点数目有关,其中包含3个DMRT1结合位点的LcDmrt1X的启动子活性受到抑制的程度明显高于2个结合位点的LcDmrt1Y启动子。此外,LcDmrt1Y的这种自我抑制作用具有剂量效应,具有2个DMRT1结合位点的Pro-D2K-Y启动子活性受到抑制的程度显著高于只有1个DMRT1结合位点的Pro-D700-Y的启动子活性(p<0.05);而LcDmrt1X的结果正好相反,共转染后Pro-D700-X表达活性下降幅度极显著大于Pro-D2K-X,暗示(-615bp,0)区域中的结合位点可能是该启动子接受DMRT1的负反馈调节的主要位点。
  本研究获得了大黄鱼Dmrt1基因cDNA全长序列和X与Y染色体上该基因的启动子序列,并成功构建了一系列表达质粒,初步揭示了DMRT1的功能及X、Y染色体上LcDmrt1启动子的表达特性,研究结果为阐明大黄鱼性别决定与分化的分子机制,提供了良好的基础和有价值的研究资料。
[硕士论文] 郭芮
水产品加工及贮藏工程 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:2016年中国有条件放开红鳍东方鲀的加工经营,这必然会带动国内市场对红鳍东方鲀的需求,推动红鳍东方鲀养殖与加工产业的发展。本论文以红鳍东方鲀为主要研究对象,分析了包括水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分、总糖、氨基酸、脂肪酸等主要成分含量;确定了制备红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白的适宜工艺;探究了不同分子量的胶原蛋白肽与Ca2+的螯合效果;结合Box-Benhnken中心组合优化原理,建立了螯合温度、肽钙质量比以及pH值的响应面试验,对胶原蛋白肽螯合钙工艺进行优化,确定了适宜的螯合条件,并对胶原蛋白肽螯合钙的理化指标进行了分析。研究结果如下:
  1.分析了红鳍东方鲀主要营养成分。红鳍东方鲀肌肉必需氨基酸(EAA)含量占总氨基酸(AA)含量的42.49%,占非必需氨基酸(NEAA)总量的73.89%,符合FAO/WHO推荐的理想蛋白模式氨基酸组成,属于优质蛋白的来源。鱼皮中的蛋白质含量达到27.93%,其氨基酸组成中鲜味氨基酸含量达到55.06%,胶原蛋白含量丰富。鱼肝中的粗脂肪含量显著高于肌肉和鱼皮中的粗脂肪含量(P<0.01),达到60.82%,单不饱和脂肪酸含量占其脂肪酸总含量的49.39%,多不饱和脂肪酸含量占其脂肪酸总含量的24.59%,其中DHA的含量较高达到15.49%。
  2.制备了红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白肽。从五种蛋白酶中筛选出效果较适宜的蛋白酶为酸性蛋白酶,胶原蛋白肽的适宜制备条件为:酶解时间为3h,加酶量为5%,料液比为1∶40。对酶解液超滤分离得到Mr<1000Da、1000<Mr<3000Da、3000<Mr<5000Da、5000<Mr<10000Da的五个不同分子质量的胶原蛋白肽,经试验验证分子量越小和CaC12的螯合效果越好。
  3.优化了红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白肽螯合钙工艺。选用Mr<1000Da的胶原蛋白肽为原料制备胶原蛋白肽螯合钙,响应面优化的最适宜螯合工艺为:pH值9.18,肽钙质量比为20.55∶1,反应温度为45.26℃,模型预测螯合率达到89.98%,考虑到实际条件将温度设为45.3℃来验证模型预测条件,螯合率达到91.02%,相对偏差为1.18%,响应面优化的优化工艺可靠。纯化后的胶原蛋白肽螯合钙蛋白质含量为77.06%,钙含量为2.15%。
  通过紫外光谱扫描发现胶原蛋白肽在226nm处有最大吸收波长,而胶原蛋白肽螯合钙的最大吸收波长迁移至208nm处,最大吸收峰发生了明显的移位。红外光谱图对比发现胶原蛋白肽的-NH2在3275.13cm-1有吸收峰,胶原蛋白肽螯合钙的-NH2移至3408.22cm-1处,胶原蛋白肽在1654.92cm-1处具有吸收峰,而胶原蛋白肽螯合钙的C=O吸收峰移至1624.06cm-1,根据紫外光谱和红外光谱谱图分析可以推断胶原蛋白肽中的-NH2和-COOH与Ca2+发生了螯合反应。
  本研究为红鳍东方鲀的加工利用提供了理论依据,对促进红鳍东方鲀产业化的发展具有重要指导意义。
[硕士论文] 王小龙
生物学 集美大学 2018(学位年度)
摘要:超氧化物歧化酶(SOD,EC1.15.1.1)是一种关键的酶类抗氧化物质,筑起了生物体针对氧毒性的第一道防线,将氧自由基快速歧化为普通分子氧(O2)和过氧化氢(H2O2)。本研究从已构建的黄姑鱼(Nibea albiflora)转录组数据库中筛选出三种SOD基因:胞质型铜锌SOD(IcSOD,MG208871)、胞外型铜锌SOD(EcSOD,MF974567)和锰SOD(MnSOD,MG208872),并对它们的分子特征及功能进行了研究,结果如下:
  (1)在氨氮和亚硝态氮急性毒性实验中,黄姑鱼表现出对氨氮胁迫更为敏感,其氨氮和亚硝态氮的96小时半致死浓度(LC50)分别为20.23mg/L(换算成非离子氨0.57mg/L)和99.08mg/L,安全浓度分别为2.02mg/L(换算成非离子氨0.06mg/L)和9.91mg/L。
  (2)黄姑鱼IcSOD(NaIcSOD)cDNA全长793bp,包括58bp的5'非编码区(UTR)、270bp的3’非编码区(UTR)和465bp的开放阅读框(ORF),编码154个氨基酸。NaIcSOD不具有信号肽和跨膜区。NaIcSOD mRNA在所检测的11个组织或器官(心脏、肝、脾脏、头肾、中肾、鳃、肠、胃、脑、肌肉和鳔)中均有表达,在头肾中表达量最高,其次为脑、肝脏、心脏和鳃,在肌肉中表达量最低。黄姑鱼经氨氮/亚硝态氮急性攻毒后,其肝脏、鳃和头肾组织的NaIcSOD mRNA均不同程度上调。此外,通过原核表达获得了具有生物活性的NaIcSOD,研究表明该酶具有良好的温度和pH稳定性。
  (3)黄姑鱼EcSOD(NaEcSOD)cDNA全长1101bp,包括224bp的5'UTR、229bp的3'UTR和648bp的ORF,编码215个氨基酸。氨基酸序列分析表明,NaIcSOD不具有跨膜区,含有1条信号肽序列(0-26aa)。NaEcSOD mRNA在所检测的11个组织或器官中均有表达,肝脏中表达量最高,其次为脑、鳔和胃,在肌肉中最低。黄姑鱼经氨氮/亚硝态氮急性攻毒后,其肝脏、鳃和头肾组织的NaEcSOD mRNA均有不同程度上调。通过原核表达,获得了具有生物活性的NaEcSOD,测得该酶具有良好的温度和pH稳定性。此外,GST pull-down实验表明NaEcSOD蛋白与膜联蛋白A4(annexin A4)存在相互作用。
  (4)黄姑鱼MnSOD(NaMnSOD)cDNA全长949bp,包括38bp的5'UTR、233bp的3'UTR和678bp的ORF,编码225个氨基酸。NaMnSOD无跨膜区,含有1条信号肽序列(0-27aa)。NaMnSOD mRNA在所检测的11个组织或器官中均有表达,心脏中表达量最高,其次为脑、肝脏和鳃,在脾脏中最低。黄姑鱼经氨氮/亚硝态氮急性攻毒后,其肝脏、鳃和头肾组织的NaMnSOD mRNA均不同程度上调。
  上述研究结果表明,黄姑鱼对氨氮和亚硝态氮的耐受力差,在黄姑鱼的集约化养殖过程中,对养殖水体中氨氮和亚硝态氮的实时监控尤为重要。IcSOD、EcSOD和MnSOD在黄姑鱼抵抗氨氮/亚硝态氮污染中均发挥重要作用,可以作为水体污染监测的早期生物标志物。NaIcSOD和NaEcSOD蛋白均表现出良好的酶活力以及温度/pH稳定性,具有较大的应用前景。
[硕士论文] 邱昌亮
水产 集美大学 2018(学位年度)
摘要:高密度、高分辨率的遗传连锁图谱作为一种关键的、必不可少的工具已经被广泛地应用到数量性状的精细定位、候选基因的图位克隆、标记辅助育种、基因组共线性的比较分析和基因组染色体水平的组装等一系列遗传学和基因组学的研究中。黄姑鱼(Nibea albiflora)是一种具有重要经济价值的海水鱼类,然而对其遗传学方面的研究极为有限,对其遗传图谱的研究更未见报道,严重影响了黄姑鱼相关的遗传与育种研究的进展。本研究利用从1个黄姑鱼家系的基因组重测序数据中挖掘得到的SNP标记,构建了黄姑鱼的高密度遗传连锁图谱,随后利用该图谱对黄姑鱼的参考基因组序列进行了染色体水平的组装,与青鳉、斑马鱼的基因组进行了共线性比较分析,对黄姑鱼的若干生长相关性状和性别进行了QTL定位。主要的研究结果如下:
  1、利用黄姑鱼1个家系的1对亲本及111个子代个体的全基因组重测序(父母本测序深度分别为34.2×和32.8×,子代个体平均测序深度为6.5×)数据进行了SNP标记挖掘。经过滤(SNP calling rate>95%;MAF>5%),共得到约120万个SNP,经过滤偏分离(P<0.01)标记,最终获得158,825和153,722个分别只在父母本中杂合的SNP标记。
  2、采用双拟测交策略分别构建了雌、雄性别特异遗传连锁图谱,再通过锚定标记构建了整合图谱。该图谱由24个连锁群组成,与黄姑鱼单倍体染色体数目相一致,图谱总长3,818.24cM(预期长度为3,843.02cM),平均标记密度为0.47cM,包含了8,094个SNP标记,包括3,826个雌性特异标记、3,735个雄性特异标记和533个共有标记,图谱覆盖度达99.4%。
  3、借助构建的高密度遗传图谱对黄姑鱼的参考基因组序列进行了染色体水平的组装,最终组装了1,457个scaffold共计435.2Mb的基因组序列,组装率为80.7%。
  4、对黄姑鱼与青鳉、斑马鱼的基因组进行了共线性比较分析,揭示了黄姑鱼与青鳉基因组在染色体水平上相对较高的共线性,黄姑鱼和斑马鱼在分化过程中可能发生了较频繁的染色体间重排。
  5、对黄姑鱼的体重、体长、体高和体宽4个生长相关性状进行了QTL定位和关联分析,定位了22个染色体水平显著的QTL,鉴定了PLA2G4A,BRINP3和P2RY1等调控这些生长性状的候选基因。
  6、对黄姑鱼的性别进行了QTL定位和关联分析,将黄姑鱼的性别QTL定位在LG9上,在最显著的QTL区域注释到了一系列调控性别的候选基因,如DMRT1,DMRT2和DMRT3等。
[硕士论文] 王健
水产 集美大学 2018(学位年度)
摘要:本实验室在前期的研究中,从牛蛙肠道中筛选并分离出一株具备产植酸酶能力的酵母菌ZR1(Pseudozyma aphidis strain),本实验拟在此基础上,研究该菌种发酵特性,再以豆粕为发酵基底,以植酸磷降解情况为指标探究最优发酵条件组合,并在后期使用最优发酵条件组合发酵的豆粕,不同比例替代牛蛙饲料中的鱼粉、普通豆粕饲喂牛蛙,研究发酵豆粕对牛蛙生长性能、血清氨氮含量、营养物质消化率、肠道消化酶活力及肠道组织结构的影响。主要研究结果如下:
  1.蛙源酵母菌ZR1生长特性及产酶特性的探究
  蛙源酵母菌ZR1为兼性厌氧菌,但在有氧条件下显更强产植酸酶能力;最适生长温度为33℃,活化三代后培养13h达到对数生长中期,最高耐受温度为45℃,pH耐受范围为pH4~8,对数中期发酵种子液显蛋白酶活和脂肪酶活性,分别为39.71U/dL和10.34U/dL。
  2.使用蛙源酵母菌ZR1发酵豆粕对植酸磷的降解情况
  发酵实验设置3个因素,每个因素3个水平,分别为接种菌量(1×106CFU/mL、5×106CFU/mL、1×107CFU/mL)、料水比(1∶0.6、1∶0.8、1∶1)和发酵周期(24h、48h、72h),研究不同发酵条件对发酵豆粕中植酸磷含量的降解情况。结果显示,综合最优发酵条件为接种菌量为1×107CFU/mL,料水比为1∶0.8,发酵周期为48h,在此条件下豆粕植酸磷降解率为41.68%;通过SDS-PAGE力法对发酵豆粕的大豆球蛋白和β-大豆伴球蛋白含量进行测定,结果显示使用蛙源酵母菌ZR1发酵能完全降解豆粕中β-大豆伴球蛋白和大豆球蛋白酸性基团,能降解80.56%的大豆球蛋白碱性基团;发酵后的豆粕营养价值有所提高,其中粗蛋白提高4.71%,粗脂肪提高0.17%,总氨基酸含量提高3.1%。
  3.蛙源酵母菌ZR1发酵豆粕对牛蛙生长、消化、全体成分和血清生化指标的影响
  实验设置4组等氮等脂的牛蛙膨化饲料,分别为FM组(含20%鱼粉和25%豆粕)、SM组(含55%豆粕)、SM+FSM(含25%豆粕和27.5%发酵豆粕)和FSM组(含50%发酵豆粕),研究发酵豆粕替代鱼粉及普通豆粕对牛蛙生长、消化、全体成分和血清生化指标影响。牛蛙初始体重为(35.23±0.03g),每组4个重复,每个重复12只牛蛙,每天2次饱食投喂,实验周期为8周。结果显示末均重(FBW)、摄食率(FR)、增重率(WGR)、特定生长率(SGR)及蛋白质效率(PER)最高值均出现在FM组(P<0.05),其余各组无显著差异;各组间肝体比(HSI)和腿体比(HLI)没有显著差异(P>0.05);干物质表观消化率最高值出现在SM组,显著高于FM组和FSM组(P<0.05),但与SM+FSM组差异不显著(P>0.05),表现出随饲料中发酵豆粕替代豆粕比例升高而降低的趋势;粗蛋白表观消化率最高值出现在FM组(P<0.05),并表现出随饲料中发酵豆粕替代豆粕比例升高而显著降低的趋势(P<0.05);钙的表观消化率最高值出现在FM组,最低值为SM组,磷的表观消化率最高值出现在FM组,最低值为SM组,钙与磷的表观消化率均表现出随饲料中发酵豆粕替代豆粕比例升高而显著上升的趋势(P<0.05);全体水分最大值出现在SM组(P<0.05),最低值为FM组,表现出随饲料中发酵豆粕替代豆粕比例升高而降低的趋势;全体粗蛋白FM组和SM组显著大于SM+FSM组和FSM组(P<0.05);全体粗脂肪和粗灰分四组没有显著差异(P>0.05),但均表现出随饲料中发酵豆粕替代豆粕比例升高而上升的趋势;SM+FSM组和FSM组血氨和尿素氮均低于FM组和SM组,其中FSM组显著低于FM组和SM组(P<0.05)。
  4.蛙源酵母菌ZR1发酵豆粕对牛蛙肠道消化酶及肠道结构影响
  肠道蛋白酶最低值出现在SM组(P<0.05),其余组间无显著差异;淀粉酶最高值出现在SM组(P<0.05),其余组间无显著差异;脂肪酶最低值出现在SM组,最高值出现在FM组(P<0.05),并表现出随饲料发酵豆粕替代豆粕比例升高而显著上升的趋势。SM组相比FM,肠绒毛短而稀疏,末端出现破损,杯状细胞减少,SM+FSM组和FSM肠绒毛长而密,末端未出现破损,杯状细胞增多,肠道健康得到改善。
[硕士论文] 吴瑞
渔业 集美大学 2018(学位年度)
摘要:本实验以均重5.77±0.03g的花鲈幼鱼为养殖对象,研究复合蛋白KT67替代鱼粉对花鲈生长、消化和肠道健康的影响。实验在室内循环水系统中进行,各实验组分别投喂含35%鱼粉的基础饲料(对照组)和分别以复合蛋白KT67替代20%、40%、60%和80%鱼粉配制的4种等氮等脂实验饲料,每个处理4个重复,每缸饲喂30尾花鲈,养殖为期70d。实验期间水温29.5±1.5℃,盐度29±1‰,溶解氧6.5±1mg/L。主要研究结果如下:
  1、复合蛋白KT67替代鱼粉对花鲈生长性能、体组成、消化酶活力和表观消化率的影响
  20%替代组花鲈生长性能与对照组无显著差异(P>0.05),然而,随着替代比例的升高,花鲈增重率、存活率、饲料效率以及蛋白质效率显著下降(P<0.05)。全体粗蛋白含量随KT67添加水平升高而下降,水分、粗脂肪和灰分含量差异不显著(P>0.05)。随着KT67替代水平的升高,花鲈肠道蛋白酶活力以及饲料干物质、粗蛋白与粗脂肪表观消化率皆显著降低(P<0.05)。以上结果表明:复合蛋白KT67替代鱼粉会导致花鲈肠道消化能力下降,从而使其生长性能受到影响。
  2、复合蛋白KT67替代鱼粉对花鲈后肠和肝脏组织形态的影响
  组织切片观察发现:各组肠道黏膜皱襞清晰,对照组花鲈后肠绒毛形态完整,整齐伸入肠腔内,无破损,脱落现象,杯状细胞正常。当替代水平达到40%时,可观察到肠道黏膜中杯状细胞开始增多,替代水平进一步升高,则肠道黏膜皱襞弯曲伸入肠腔内,固有层变宽,绒毛长度增加,肠上皮细胞出现空泡。各组花鲈肝细胞形态皆正常,结构完整,排列均匀,无偏移及空泡化,可观察到清晰肝细胞索。各实验组花鲈血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶活力和总抗氧化能力与对照组无显著差异(P>0.05)。以上结果表明:复合蛋白KT67替代鱼粉会损伤花鲈后肠黏膜组织结构,但对肝脏健康无负面影响。
  3、复合蛋白KT67替代鱼粉对花鲈肠道炎性因子基因表达量和肠道微生物菌群的影响
  当复合蛋白KT67高比例替代鱼粉时,花鲈肠道出现炎性反应,肠道促炎因子TNF-α、IL-1β基因表达量升高,抗炎因子基因IL-4、IL-10表达量相应降低。花鲈肠道菌群多样性不受替代所影响,但最优势菌变形菌门占比随替代水平上升而略有下降,次优势菌厚壁菌门显著增加。
[博士论文] 杨阳
水产 集美大学 2018(学位年度)
摘要:食物过敏作为食品安全的热点问题在全球引起了广泛关注,甲壳类水产品是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一。拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国重要的水产资源,但其产量和消费量的增加,也伴随着越来越多的食物过敏问题。对拟穴青蟹引起的食物过敏反应流行病学调查和拟穴青蟹过敏原结构、表位及其致敏性的系统分析是开发低致敏食品和甲壳类水产食物过敏性疾病控制的基础。
  本研究于2010年至2017年对集美大学在校生发放食物过敏流行病学调查问卷共17324份,对收回的13361份有效问卷统计结果显示,蟹类是该群体中主要的过敏食物,进一步对调查对象中14164名学生的血清学分析表明蟹类过敏比例为4.31%,而拟穴青蟹的肌浆蛋白能够被65.14%的蟹类过敏患者血清中的特异性免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)E识别。精氨酸激酶(arginine kinase,AK)是拟穴青蟹肌浆蛋白中的主要过敏原,本文首先通过X射线衍射获得了分辨率为3.0(A)的AK晶体结构,基于蛋白质结构的对比分析结果表明,节肢动物中的AK具有保守的一级结构、二级结构和高级结构。基于抗原表位的对比分析结果表明,不同物种中AK线性表位区域呈现高度的一致性,主要分布于氨基酸序列(amino acid,AA)25-44、AA130-155和AA308-321;而构象表位则主要分布于AK高级结构保守区。此外,本研究完成了对拟穴青蟹肌浆蛋白中新型过敏原磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,TIM)和肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)的分离纯化,并首次发现细丝蛋白C(filamin C,FLN c)是存在于拟穴青蟹肌浆中的新型过敏原。对拟穴青蟹肌浆中四种过敏原的血清学分析结果表明,AK和FLNc能被较多的蟹类过敏患者血清识别,而识别TIM和SCP的患者血清数量较少。目前这四种过敏原已被世界卫生组织/国际免疫学会联盟(world health organization/international union of immunological societies,WHO/IUIS)的过敏原命名系统收录,AK、SCP、TIM和FLN c分别被命名为Scyp2、Scyp4、Scyp8、和Scyp9。
  采用蟹类过敏患者特异性识别的过敏原对过敏患者进行嗜碱性粒细胞激活试验(basophil activation test,BAT),以进一步确定患者的过敏反应,结果发现嗜碱性粒细胞表面抗原CD63和CD203c的表达上调与患者自诉的过敏症状严重程度呈现正相关。以经过BAT验证的过敏患者血清IgE为靶蛋白,对噬菌体展示肽库进行亲和淘选,结合生物信息学分析鉴定了AK的5个线性表位区域和8个构象表位区域、TIM的4个线性表位区域和2个构象表位区域、FLN c的6个线性表位区域和6个构象表位区域、SCP的6个构象表位区域。利用Balb/c小鼠建立的四种肌浆蛋白过敏原的动物模型表明,AK在机体内的致敏性最强,能够引起B淋巴细胞的增殖,同时产生高水平的抗原特异性IgE;TIM也能够使B淋巴细胞增殖并产生较高水平的特异性抗体,但其致敏性较AK弱;SCP虽然具有较强的免疫原性,但其免疫反应性较弱;相反FLN c虽然在体内的免疫原性较弱,但其具有较强的免疫反应性,从而能够引起效应细胞较强的激活。
  综上,本研究确定了蟹类是常见的过敏食物,而肌浆蛋白是引起蟹类过敏的重要组分;完成了拟穴青蟹主要过敏原AK的结构解析、肌浆蛋白中新型过敏原的纯化并获得了WHO/IUIS审批的系统命名;对肌浆蛋白中的四种过敏原进行了血清学分析和抗原表位定位分析,并结合动物模型比较分析了四种过敏原在机体内的作用方式和致敏性,这些结果为开发低过敏食物、甲壳类水产品过敏性疾病控制提供了理论基础。
[硕士论文] 张树威
水产 集美大学 2018(学位年度)
摘要:磷是鱼类必需的矿物质元素,养殖鱼类磷的主要来源是饲料,饲料磷摄入不足会导致鱼体生长缓慢、死亡率升高、脂肪沉积增加等不利影响;饲料磷摄入过多鱼体会将多余的磷排到水体中,造成营养元素的浪费、增加饲料成本,此外还会导致养殖水体环境污染等。因此,研究鱼类对磷的适宜需要量非常重要。本实验以花鲈(Lateolabrax japonicus)为研究对象,以磷酸氢二钾(K2HPO4)和磷酸二氢钠(NaH2PO4)为磷源,研究淡水养殖花鲈对饲料磷的适宜需求量,为商业饲料磷的添加提供理论依据;此外,为探讨饲料磷水平对鱼体脂代谢的影响及途径,研究了摄食不同磷水平饲料鱼体的脂代谢酶的活性、肝脏组织学及脂代谢相关基因表达等变化。主要内容如下:
  1.饲料磷水平对花鲈生长、体组成及营养物质表观消化率的影响
  实验设有效磷水平分别为0.48%、0.69%、0.89%、1.10%、1.28%、1.51%、1.77%。用这7组饲料养殖花鲈[初重为(4.26土0.03)g]10周后,分析鱼体生长、体组成、表观消化率等指标。各组WGR、SGR、PER、PPV结果表明,0.89%磷水平的添加使生长和蛋白质沉积达到最大值;各组FCR、HSI、VSI、肝脏脂肪含量结果发现,0.89%磷水平的添加FCR显著低于其余各组(P<0.05),HSI在1.10%磷水平达到最小值,而肝脏脂肪含量、VSI在0.89%磷水平最小;体组成的研究中发现,随磷水平的增加全体粗脂肪含量降低,粗蛋白、灰分、钙磷含量则显著增加(P<0.05)。以上研究结果表明,磷能提高花鲈的生长性能,以WGR为判定指标,用折线回归模型确定花鲈有效磷的需求量为0.72%;以肝脏脂肪含量为判定指标,有效磷的需要量为0.89%。低磷饲料(0.48%)会导致鱼体脂肪的过度沉积。
  饲料0.89%的磷水平显著降低了血清AST、ALT的活性。肝脏磷含量随饲料磷水平的升高而显著升高(P<0.05)。表观消化率结果表明,随饲料磷水平的升高干物质表观消化率显著升高(P<0.05),而钙、磷表观消化率则显著降低(P<0.05);脊椎骨的矿物质元素含量结果发现,磷水平的升高导致钙、磷、铜的含量增加,在磷水平为0.89%时,钙、磷的含量显著高于0.48%组,1.10%组鱼体铜的含量显著高于0.48%组,而锌、铁、镁、锰的含量则显著降低(P<0.05);以上研究结果表明,饲料磷水平为0.89%时可降低鱼体肝脏损伤;随饲料磷水平的升高干物质的表观消化率、骨骼矿物质含量上升,表明骨矿化能力增强。
  2.饲料磷水平对花鲈肝脏酶活性、脂肪酸组成及组织学的影响
  饲料磷水平的升高显著降低TG与T-CHO的含量(P<0.05);HL、LPL、总脂酶的活性随磷水平的升高呈现先上升后下降的趋势。肝脏脂肪酸组成的数据表明,1.10%磷水平的添加显著提高了HUFA所占比例,显著降低了SFA和MUFA所占比例(P<0.05)。从鱼体肝脏组织学研究发现,0.48%磷水平的肝细胞分界不明显,细胞空泡化比较严重,含有较多脂肪滴,随着磷水平升高,肝细胞空泡化程度减轻。研究结果表明,适宜的磷水平可以缓解肝脏脂肪的过度沉积,增加肝脏HUFA的含量。综合考虑,当饲料磷水平为0.89%以上时,肝脏脂肪沉积减少。
  3.饲料磷水平对花鲈脂代谢相关基因表达的影响
  脂代谢相关基因表达量的结果表明,CYP2781、CYP24、HSL、FAS、ACC-2、SREBP-1的表达量随磷水平升高呈现先下降后上升的趋势(P<0.05);LPL、PPARα、CPT-1表达量则呈现相反的趋势(P<0.05)。VDR与AMPK的表达则随磷水平升高呈现上升的趋势(P<0.05)。本部分实验结果表明,饲料磷水平影响肝脏脂代谢相关基因的表达,当饲料磷水平为0.48%时,脂肪分解相关基因表达下调,脂肪合成相关基因表达上调。
  综上所述,0.89%磷水平有利于骨骼矿化;0.89%以上磷水平可增加HUFA的含量,缓解肝脏脂肪的沉积;0.48%磷水平饲料会导致鱼体脂肪分解相关基因表达下调,脂肪合成相关基因表达上调。以增重率为判定指标,淡水养殖花鲈对磷的适宜需求量为0.72%(有效磷)。以肝脏脂肪含量为判定指标,有效磷的需要量为0.89%。
[硕士论文] 胡梦君
生物学 集美大学 2018(学位年度)
摘要:蟹类作为一种营养价值高、肉质鲜美的水产品,广受消费者喜爱,但是随之引起的食物过敏发病率持续上升。本文以拟穴青蟹(Scylla paramamosain)为研究对象,对青蟹中的新型过敏原肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein,SCP)进行重组表达,对其抗原表位进行定位分析,探讨酶法交联反应、美拉德反应对重组SCP(rSCP)致敏性的影响,以期为过敏性疾病诊断和低致敏性食品开发提供理论依据。
  本研究首先从拟穴青蟹肌肉中纯化出分子量约20kDa的SCP,通过免疫新西兰大白兔获得兔抗青蟹SCP血清,纯化得到兔抗SCP-IgG多克隆抗体。构建表达载体pET-22b-SCP,在E.coli Rossetta菌株中诱导表达获得可溶性的rSCP。圆二色谱、抑制性ELISA、免疫杂交分析结果显示,rSCP与天然SCP(nSCP)均呈典型的α/β蛋白特征,在IgE结合活性方面能够相互抑制,在高温(60℃~100℃)、弱酸(pH2.0~5.0)、强碱(pH10.0~11.0)条件下均易发生聚合,表现出结构、免疫结合能力及理化特性的一致性。体内动物及体外细胞试验结果显示,rSCP使BALB/c小鼠的脾脏淋巴细胞Th2型相关细胞因子IL-4和IL-13分别升高至300pg/mL、250pg/mL,也能够上调蟹类过敏患者嗜碱性粒细胞的表面分子CD63和CD203c水平。不同甲壳类动物的SCP与rSCP可以竞争结合虾蟹类过敏患者血清中IgE,且rSCP的抑制效果最强,提示rSCP可以代替天然蛋白用于过敏原组分诊断。
  其次,采用嗜碱性粒细胞活化试验确定SCP过敏患者,并用鼠抗人anti-IgE富集SCP过敏患者血清中的IgE;以兔抗SCP-IgG多克隆抗体和SCP过敏患者血清IgE为靶蛋白,经过噬菌体展示技术亲和淘选共定位得到3个IgG抗原表位和6个IgE抗原表位,值得指出的是IgG表位的氨基酸组成均在IgE表位中存在。这些抗原表位主要分布在SCP的一级序列保守区域、二级结构的α-螺旋末端和无规则卷曲柔性区域、蛋白质空间结构的表面;其中Epitope1(N37T38L39I38E41G42R43Y51N54T112)为IgE与IgG所共同识别的抗原表位,在淘选到的克隆子序列中重复性最高,推测为SCP的关键表位。
  最后,通过分析食品加工处理对rSCP致敏性的影响,发现酪氨酸酶作用下的rSCP酶法交联反应产物(CL-SCP)、木糖与rSCP发生美拉德反应的产物(MR-SCP)致敏性均降低。圆二色谱分析显示,MR-SCP、CL-SCP的α螺旋含量分别降低至16.4%和16.2%,β折叠的含量分别升高至32.2%和31.3%。与rSCP相比,MR-SCP、CL-SCP激活患者嗜碱性粒细胞表达的CD63和CD203c比例下降。结合SCP抗原表位分析认为,酪氨酸酶可以催化交联SCP蛋白表位区域的酪氨酸残基,而美拉德反应可以修饰SCP蛋白的关键抗原表位区域,提示这两种加工方法可以改变过敏原结构与抗原表位,从而降低SCP的致敏性。
[硕士论文] 谭智蓉
渔业 集美大学 2018(学位年度)
摘要:随着水体的富营养化程度不断加剧,淡水水体中蓝藻水华的暴发也变得日趋频繁。微囊藻毒素是铜绿微囊藻等水华优势藻类死亡分解时能释放出的二级毒性代谢物,污染水环境,对水产养殖行业是一个巨大的挑战。微囊藻毒素的水溶性好、热稳定性高且能在生物体内蓄积,所以其造成的污染具有持续性、广泛性。MC-LR则是微囊藻毒素中一种毒性较强,分布较广,以肝脏为主要的靶器官的毒素。当前微囊藻毒素的污染已成为一个与人们生活息息相关的重大环境问题。
  欧洲鳗鲡是我国出口创汇的重要经济水产动物,但在淡水养殖过程中却容易受到蓝藻水华的影响。本研究主要利用转录组测序技术和荧光定量PCR技术,全面分析欧洲鳗鲡肝脏组织中受MC-LR影响的脂质代谢途径及其相关的重要基因。
  对健康欧洲鳗鲡分别注射相应浓度的MC-LR溶液与等量的生理盐水溶液24小时后,取出足够的肝脏样品,提取RNA后进行纯化和文库构建,转录组测序并数据分析。本次实验九个样品平均产出23.44M转录组数据,通过KEGG分析发现,14μg/kgMC-LR暴露24h后与欧洲鳗鲡肝脏脂质代谢相关的通路有15条会受到影响,140μg/kgMC-LR暴露24h后与欧洲鳗鲡肝脏脂质代谢相关的通路有13条会受到影响。MC-LR影响的脂质代谢基因涉及脂肪酸、丙酮酸、类固醇、肌醇磷酸盐、甘油磷脂、鞘脂、醚酯、亚麻油酸、花生四烯酸和酮体等物质的代谢。14μg/kgMC-LR处理组与对照组对比,其肝脏脂质代谢相关的差异基因片段一共有201个,其中上调的基因片段79个,下调的基因片段122个;140μg/kgMC-LR处理组与对照组对比,其肝脏脂质代谢相关的差异基因片段一共有92个,其中上调的基因片段64个,下调的基因片段28个。有53个基因片段在这两种不同MC-LR浓度处理后都出现了显著性差异变化,并且其中的52个基因片段上下调变化情况一致。荧光定量PCR检测结果验证了本次测序结果的可靠性。本实验结果可以为诊断和防治MC-LR毒素引发的代谢性疾病提供科学的判断依据。
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