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[博士论文] 薛涛
细胞生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:植物离体器官诱导是目前植物干细胞领域的一个研究热点,指植物外植体材料(包括根、下胚轴、子叶及种子等)在适宜的离体培养环境中诱导离体苗、根等器官形成的生物学过程。目前,植物离体器官的再生体系相对成熟,一般包括愈伤组织形成和离体苗分化两个过程。研究人员在此基础上发掘了一些调控愈伤组织形成和离体器官再生的相关基因,然而离体器官再生的调控机制仍不清楚,尤其是表观遗传调控子在植物离体器官再生中的功能有待系统研究。
  MicroRNAs(miRNAs)作为小分子非编码RNA,主要通过转录后水平剪切抑制靶基因的表达或翻译,进而表观调控植物的形态建成及逆境胁迫响应等生物学过程。目前,部分研究揭示了miRNAs参与调控植物的离体苗再生,进而揭开了植物离体器官再生过程中miRNAs的功能研究,因而,为了解析miRNAs在离体苗再生中的调控机制,更多的功能miRNAs有待挖掘。
  本实验室前期通过分析拟南芥胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织miRNAs的表达谱芯片,发现miR159、miR165/6在两类愈伤组织中表达差异明显,推测其在离体苗再生中起作用。
  本论文利用mir159ab双突变体材料,分析了miR159在离体苗诱导过程中的功能,并进一步明确了miR159调控愈伤组织形成和离体苗再生过程中的靶基因。鉴于离体器官诱导所用外植体为拟南芥的根,因而进一步开展了miR159对拟南芥主根生长及根尖分生组织区发育的调控研究。另外,miRNAs对靶基因的表观调控离不开AGO家族蛋白的参与,而AGO10可与AGO1竞争结合miR165/6进而减少沉默复合体的形成,因此本论文拟开展miR165/6及其调控子AGO10在离体苗诱导过程中的功能,并对其调控离体苗再生的机制进行了初步研究。
  主要研究结果如下:
  1)mir159ab双突变体根外植体形成的愈伤组织团数目明显增多,Real-time PCR分析表明,MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab的CIM培养物中表达均显著提升。通过比较pMYB65:159-GFP和mir159ab×pMYB65:159-GFP株系外植体在CIM培养阶段的GFP信号,发现mir159ab×pMYB65:159-GFP外植体诱导的愈伤组织中GFP信号显著增强,进一步证明了愈伤组织形成过程中miR159对MYB65表达的抑制模式。分析MYB65的抗剪切系pMYB65:mMYB65及myb33myb65myb101三突变体的愈伤组织形成能力,发现pMYB65:mMYB65形成的愈伤组织团数目显著提升,而myb33myb65myb101三突变体形成的愈伤组织数目明显减少。结果表明miR159通过抑制靶基因MYB33、MYB65和MYB101的表达抑制CIM阶段愈伤组织的形成。
  2)mir159ab双突变体根外植体离体苗分化的数目明显减少,Real-time PCR分析表明,MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab的SIM培养物中的表达均显著提升。通过比较pMYB6:159-GFP和mir159ab×pMYB65:159-GFP株系外植体在SIM培养4-10d的GFP信号,发现mir159ab×pMYB65:159-GFP外植体形成的细胞团中GFP信号显著增强,进一步证明了离体苗再生过程中miR159对MYB65表达的抑制模式。分析pMYB33:mMYB33、pMYB65:mMYB65、pMYB101:mMYB101(靶基因MYB33/65/101的抗剪切系)及myb33myb65myb101三突变体的离体苗再生表型,发现3个靶基因的抗剪切系的离体苗再生数目均显著减少,而靶基因的三突变体的离体苗再生数目未见显著变化,表明MYB33、MYB65和MYB101均抑制离体苗的再生。Real-time PCR分析表明,WUS、CLV3和STM在pMYB65:mMYB65系SIM培养物中的表达均显著降低。GFP信号检测表明pTCSn:GFP信号在pMYB65:mMYB65系SIM培养物中减弱,而pDR5:GFP信号增强。上述结果表明miR159为离体苗再生的促进子,通过抑制靶基因(MYB33、MYB65和MYB101)的表达,进而促进WUS、CLV3和STM的表达和细胞分裂素的响应并降低生长素信号响应实现对离体苗再生的表观调控。
  3)mir159ab双突变体的主根长度及其根尖分生组织区大小显著高于野生型。Real-time PCR分析表明,MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab主根中的表达量显著增强,同时pMYB33:mMYB33、pMYB65:mMYB65和pMYB101:mMYB101系的主根长度明显增加,表明miR159通过抑制靶基因的表达进而抑制拟南芥主根的生长。通过检测pMYB65:mMYB65×pCYCB1;1:GUS、pMYB65:mMYB65×pPIN1:PIN1-GFP、pMYB65:mMYB65×pWOX5:GFP、pMYB65:mMYB65×pPLT1:PLT1-GFP和pMYB65:mMYB65×pSCR:GFP株系的GUS及GFP信号,发现MYB65促进CYCB1;1的表达,EMSA实验进一步证明MYB65可直接结合促进CYCB1;1基因的表达进而促进根尖分生组织区细胞的分裂,并促进主根的生长。
  4)利用实验室建立的成熟种子的液体诱导体系分析了AGO10在离体苗再生中的功能。发现p35S:AGO10离体苗再生比率低于野生型,而ago10(功能缺失突变体)离体苗再生比率显著升高,同时p35S:AGO10转化ago10可明显降低其离体苗再生频率,表明AGO10为离体苗再生的抑制子。通过观察离体苗再生过程中pAGO10:GUS及pAGO10:GFP报告基因的信号,发现AGO10表达于形成的突起结构及原分生组织(pro-SAM)的起始部位。通过比较离体苗再生过程中,pU2:MIR165/6-GFP在野生型与ago10中的GFP信号,发现ago10×pU2:MIR165/6-GFP的培养物中GFP信号显著降低,表明miR165/6在ago10中的表达明显增强。RNA原位杂交结果显示,AGO10表达部位集中于突起结构的pro-SAM部位,并与miR165/6的表达部位重叠,抑制miR165/6的表达,从而促进HD-ZIPⅢ的表达。分析MIM165/6(artificial miR165/6target mimics)及men1(miR166a-ox)的离体苗再生表型,发现MIM165/166的离体苗再生频率降低而men1的离体苗再生频率增高,表明miR165/166为离体苗再生的促进子。进一步分析ago10×MIM165/6杂交系的表型,发现ago10×MIM166的离体苗再生数目显著低于ago10外植体分化的离体苗数但高于MIM165/6的再生数,表明AGO10可能部分通过抑制miR165/6成熟体的表达进而抑制离体苗的再生。
  综上,本论文鉴定了表观遗传调控子miR159和miR165/6及其调控子AGO10在离体苗再生过程中的功能,并对其调控离体苗再生的分子机制做了初步研究,为进一步深入解析表观遗传调控植物离体再生的机理奠定了基础。
[硕士论文] 焦琦
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:土壤盐碱化是影响农作物质量和产量的非生物胁迫之一。在盐胁迫条件下液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白对植物的生存具有重要的作用,可以将细胞质中过多的Na+区域化至液泡中,以减轻对细胞质的离子毒害,并维持细胞中离子与渗透势的平衡,提高植物的耐盐性。因此,克隆液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因并对其功能进行研究变得非常有必要。
  本文以甜菜(Beta vulgaris L.)为材料,克隆甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因BvNHX的全长cDNA,构建其超表达载体和RNAi载体,初步探讨该基因在甜菜Na+区域化中的功能,取得了如下结果:
  (1)在200~300mmol/L NaCl处理下,相比与四倍体(TY03410)二倍体(TY03209)地上部与根部积累较多Na+,而K+的含量没有显著性差异,在50~300mmol/L NaCl处理下两者的K+/Na+没有显著性差异,100mmol/L NaCl处理使二倍体(TD85ms)的鲜重相对生长率高于四倍体(TY03410),但两者K+/Na+在50~300mmol/L NaCl处理下没有显著性差异,可见四倍体与二倍体的耐盐性没有显著性差异;在100mmol/L NaCl处理下,四倍体(TY03410)和二倍体(TD85ms)地上部与根部干重、鲜重和Na+含量随着处理时间的增加呈递增趋势,但根部在处理72h、地上部处理120h后两者K+/Na+没有显著性差异。
  (2)根据已知其它植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因设计简并性引物,利用RACE方法,克隆得到甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX基因的全长cDNA,其全长为2284bp,包括1653bp的开放阅读框(ORF),19bp的5'非翻译区(5'UTR),以及612bp的3'非翻译区(3'UTR),其中包含25bp的poly(A)尾巴,编码552个氨基酸,推测分子量为61.34kD,等电点为6.609。含有12个跨膜结构域,位于第三个跨膜区的氨氯吡嗪咪(Amiloride)结合位点LFFYLLPPI与其它物种有高的同源性。
  (3)通过对甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因BvNHX全长序列的分析,选取大小为1653bp的一段序列做为目的序列,设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT-PCR的方法克隆得到该片段,成功构建BvNHX超表达载体pCAMBIA1302-BvNHX,利用冻融法转化至农杆菌GV3101。
  (4)通过对23种植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白编码基因核苷酸序列比对,选择保守性高的、长度为500bp的片段作为RNAi片段,设计带有酶切位点的特异性引物,用于扩增构建甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX基因干扰载体的正、反义片段,以中间载体pHANNIBAL和表达载体pART27为基础,利用酶切连接法成功构建BvNHX基因的干扰载体PARB。
  (5)采用实生苗侵染法,获得阳性干扰植株,利用PCR法检测pARB是否整合至植物基因组中,采用RT-PCR分析BvNHX基因是否沉默,结果表明,12株苗的BvNHX不同程度受到干扰。
[硕士论文] 杨甲辰
林业 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:干旱是限制植物生长的主要环境因素之一,它诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量积累,影响植物的生长发育。植物叶绿体是ROS产生的主要部位之一,叶绿体中ROS的有效清除,对于保护生物膜及光合机构、维持胁迫条件下光合作用的正常运行极为重要。抗坏血酸(ascorbate, AsA)是叶绿体ROS清除系统的重要组分之一,它的有效再生是维持植物抗氧化能力的关键。叶绿体单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)是叶绿体AsA再生的关键酶,它将单脱氢抗坏血酸还原生成AsA,维持叶绿体AsA水平。本研究以野生型(WT)和转反义SlMDAR番茄(Solanum lycopersicum)株系为试材,测定并分析了AsA在AsA-Glu循环回补途径中的比例,MDAR酶的活力与干旱胁迫前后叶绿素荧光参数、光合速率、活性氧积累量、膜脂过氧化程度等指标的关系,研究SlMDAR的表达与植物抗干旱胁迫能力的关系,主要结果如下:
  (1)与野生型植株相比,转基因株系的番茄叶片MDAR在信使核糖核酸(Messenger RNA, mRNA)水平上和蛋白水平上均明显低于野生型。同时,荧光定量PCR实验表明SlMDAR的表达明显受聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)诱导。
  (2)PEG模拟干旱胁迫处理前后,测定了转基因及野生型番茄植株的MDAR酶活、总AsA、脱氢抗坏血酸(Dehydroascorbate, DHA)含量及AsA/DHA,结果发现反义抑制SlMDAR的表达降低了转基因番茄株系的MDAR酶活性和AsA含量。
  (3)与WT野生型番茄植株相比,转基因番茄株系在干旱胁迫下相对含水量降低、MDA含量和相对电导率增高,细胞膜受到的损害更大,反义抑制SlMDAR的表达降低了转基因番茄植株的干旱胁迫抗性。
  (4)转基因番茄株系中H2O2和O2·?含量比野生型高,而ROS清除关键酶抗坏血酸过氧化物酶(APX)及超氧化物岐化酶(SOD)的活性差别不大,表明转基因番茄株系具有较低的ROS清除能力,可能与较低的AsA含量相关。
  (5)胁迫处理后,相对于野生型,转基因番茄植株光合能力明显降低,F0明显升高,PSⅡ的光抑制程度较重,转基因番茄株系的D1蛋白降解速率比野生型高。
  综上,反义抑制SlMDAR的表达降低了MDAR酶活性和AsA的再生能力,从而抑制了ROS的清除,增加了转基因番茄植株光系统受到的氧化损伤,降低了转基因番茄对干旱胁迫的抗性。
[硕士论文] 苗瑞英
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:锌(Zn)、铁(Fe)及钙(Ca)是维持植物正常生长发育所必需的元素,Zn和Fe是微量元素,Ca是大量元素。当Zn、Fe和Ca含量过高或过低时,都会影响植物的生长发育。因此越来越多的科研工作者关注植物体内Zn、Fe、Ca等离子的稳态调控机制。我们对拟南芥Zinc Nutrition Essential1(ZNE1)基因缺失突变体进行纯合鉴定并获得两种纯合突变体,分别命名为zne1-1和zne1-2。对这两种突变体进行表型分析发现,在高锌(150μM Zn2+)、低铁(0.5μM Fe2+)、低钙(0 mM Ca2+)培养条件下,突变体叶片发黄、根短,长势显著弱于野生型(Col-0),具有高锌敏感、低铁敏感和低钙敏感表型;随后将ZNE1基因互补zne1-1和zne1-2突变体后,突变体的表型恢复至野生型表型。为深入研究ZNE1基因是否影响植物对Zn、Fe、Ca等矿质元素的吸收和积累,通过电感耦合等离子体光谱仪(Inductively Coupled Plasma,ICP)对植物中Zn、Fe、Ca的总含量进行测定。结果显示,在用不同浓度的Zn2+、Fe2+、Ca2+处理zne1与野生型Col-0植物的条件下,二者的Zn、Fe、Ca含量均无显著差异,表明ZNE1基因不参与植物体Zn、Fe、Ca等矿质元素的吸收和积累,可能参与这些元素的分布。通过台盼蓝染色检测受损或死亡细胞,发现在高锌条件下zne1-1、zne1-2和Col-0相比,成熟叶片叶脉呈现较深蓝色,由此推测可能维管束细胞周围的细胞因积累较多的Zn2+而受损。我们利用GUS组织化学染色法研究ZNE1基因的表达模式,结果显示ZNE1在拟南芥的根和叶上均有表达。本研究发现ZNE1在拟南芥中系统性表达可能参与植物Zn2+、Fe2+、Ca2+的稳态调控。基于ZNE1基因具有重要的生理功能,本研究为后续优化农作物Zn、Fe、Ca含量提供一定的理论基础。
[硕士论文] 王耀辉
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:拟南芥At3g08650被预测编码锌转运蛋白,但是没有直接的实验证据。我们将At3g08650命名为ZINC NUTRITION ESSENTIAL1(ZNE1)。为了确定ZNE1蛋白的亚细胞定位,在烟草表皮细胞内瞬时表达ZNE1-GFP(绿色荧光蛋白)融合基因。
  本研究在激光共聚焦显微镜下,通过对比发射红色荧光的细胞器标记蛋白位置,证明ZNE1定位在高尔基体。进一步将ZNE1在哺乳动物细胞HEK293T中表达,利用免疫荧光证明ZNE1存在于细胞质中。为了确定ZNE1在植物锌依赖生长中的生理功能,纯合鉴定到两个拟南芥T-DNA插入缺失突变体zne1。进一步在水培条件下,对比拟南芥野生型Col和zne1锌依赖生长表型,发现zne1在高锌水培液中表现叶片发黄的敏感表型。将完整的ZNE1编码序列整合到zne1突变体基因组可以使zne1对高锌环境的反应恢复到野生型,证明ZNE1是拟南芥适应高锌环境的必需基因。为了探索质外体Zn2+在活体叶片中的分布,我们利用离体叶片叶柄浸泡法和膜不通透性Zn2+特异性荧光染料FluoZin-3,发现在高锌处理条件下,拟南芥zne1一、二级叶脉中Zn2+浓度显著高于野生型,证明ZNE1是调节拟南芥叶子内Zn2+分布的重要基因。
[硕士论文] 张芳蜞
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本研究以野生黄花苜蓿(Medicago falcata L.)为材料,克隆获得了MfNAC3基因的ORF序列,全长990 bp。MfNAC3基因含有2个内含子,编码329个氨基酸。MfNAC3分子量为36.9 kDa,等电点为6.981,含有NAC转录因子特有的NAM结构域,与已报道的MfNAC3(AMB51752.1)的同源性为99%。MfNAC3氨基酸序列的生物信息学分析结果显示:MfNAC3蛋白属于定位于细胞核不含跨膜结构域和信号肽的亲水性蛋白,二级结构主要由无规则卷曲组成。MfNAC3的相对表达量在叶中最大,根中最少,且受盐、干旱、ABA胁迫上调。以植物双元载体pPZP221(35S-NOS)为骨架,成功构建了超表达载体pPZP221(35S-MfNAC3-NOS),为后续获得抗逆性增强的苜蓿资源奠定了基础。
[硕士论文] 郭秀
植物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:兴安落叶松(Larix gmelinii)为松科落叶松属的落叶乔木,是大兴安岭地区荒山造林和森林更新的主要树种。兴安落叶松木材蓄积丰富,材质优良,可为土木、建筑、装饰、装潢、造纸和化纤工业等提供原料,体现了广泛的应用价值。UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH)是植物多糖代谢途径中的关键酶,它催化UDP-葡萄糖(UDP-Glc)氧化生成UDP-葡萄糖醛酸酯(UDP-GlcA)进而转化生成半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖、芹菜糖等半纤维素和果胶合成的前体物质。UGDH的表达丰度影响细胞壁的生物合成,进而影响植物的生长发育及材质,所以研究UGDH基因的表达调控机理具有重要意义。
  本研究利用兼并PCR和RACE-PCR技术分离了兴安落叶松UDP-葡萄糖脱氢酶基因(命名为LgUGDH2),并对该基因的功能和表达特性进行了分析。LgUGDH2基因的cDNA全长为1795bp,包含1449bp的开放阅读框(ORF)、108bp的5'-UTR和238bp的3'-UTR,编码482个氨基酸。实时荧光定量PCR检测结果显示,LgUGDH2在兴安落叶松的根、茎、叶中均稳定表达,茎中表达量高于叶和根。为深入调查LgUGDH2的表达调控机理,利用Tail-PCR技术克隆了2091bp的LgUGDH2启动子序列,并利用GUS报告基因深入分析了LgUGDH2的表达模式。序列分析显示,该基因的启动子区域包含赤霉素、乙烯、生长素、细胞分裂素和脱落酸等植物激素应答原件,光诱导原件以及与低温、干旱等非生物胁迫相关的应答元件。GUS染色实验显示,LgUGDH2基因主要表达在茎、叶的维管组织中,与其功能相对应。为了深入研究LgUGDH2的功能和异源表达特性,构建了pBI101-LgUGDH2双元表达载体,并通过农瘤杆菌介导的花序浸染法获得了转基因拟南芥。RT-PCR和酶活性检测结果证实了LgUGDH2在转基因拟南芥中的稳定表达。超表达LgUGDH2基因拟南芥的表型分析结果显示,LgUGDH2的过量表达促进了转基因拟南芥的营养生长,提高了植株中可溶性糖的含量,增加了半纤维素和果胶的积累。结果表明,可通过对半纤维素和果胶合成路径中的关键酶UGDH进行遗传修饰调控植物的生长发育,进而有目的地改良材质。该研究成果亦为深入研究兴安落叶松LgUGDH2基因的表达调控机制,并利用该基因进行木本植物的材质改良奠定了基础。
[硕士论文] 高子奇
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:植物在生长发育的过程中会遭受各种各样的非生物胁迫,如UV-B、干旱、盐胁迫等。植物能通过积累多种小分子次生代谢产物,帮助其抵抗各种胁迫,花青素就是其中重要的一类。花青素具有良好的活性氧自由基(ROS)清除能力,能减轻非生物胁迫带来的氧化损伤。二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol4-reductase,DFR)是花青素合成途径下游的关键酶,决定植物积累花青素的种类,这对植物通过积累花青素来抵抗逆境胁迫具有十分重要的意义。唐古特白刺生长于自然环境恶劣的干旱和半干旱地区,对严峻条件下的各种非生物胁迫具有极强的耐受力和抵抗力。
  本研究利用RT-PCR和RACE技术,克隆唐古特白刺二氢黄酮醇4-还原酶(NtDFR)基因cDNA全长序列,该基因全长1392bp,其开放阅读框(ORF,Open Reading Frame)长度为1020bp,编码339个氨基酸。将扩增得到的ORF片段与pPZP221载体连接重组,得到pPZP221-NtDFR植物表达载体。农杆菌浸染拟南芥并筛选至T3代纯合子,得到了6个转基因拟南芥株系,并进行PCR验证,结果均有条带,无假阳性。选取L2、L3、L5三个株系的转基因拟南芥用于后续实验。
  对野生型和转基因型拟南芥进行0h、2h、4h和6h的UV-B胁迫,0d、10d和15d的干旱胁迫,以及0mM、75mM和150mM的NaCl胁迫。野生型和转基因型拟南芥的花青素含量,结果表明3种胁迫条件下转基因型拟南芥中的花青素含量高于野生型,证实了NtDFR的过表达能诱导转基因型拟南芥中花青素的大量积累。同时对拟南芥的其它一些生理生化指标经行了测量,包括鲜重、叶绿素含量、SOD、CAT活性和MDA、GSH含量。结果表明花青素的积累能改善拟南芥在胁迫条件下的生长状况,调节拟南芥的抗氧化系统,使其抗逆性增强。证实了NtDFR的过表达和花青素的积累对拟南芥在应对非生物胁迫的过程中发挥了积极的作用。
[硕士论文] 索雅飞
植物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:长叶红砂(Reaumuria trigyna)是东阿拉善-西鄂尔多斯特有的强旱生泌盐盐生植物,对盐渍荒漠环境具有极强的适应性。转录组深度测序结果显示,该植物在盐胁迫条件下,抗氧化系统相关基因差异表达明显,对植物响应逆境胁迫具有积极作用。研究表明超氧化物歧化酶SOD和谷氧还蛋白GRX参与了植物逆境肋、迫下的活性氧清除及蛋白质氧化还原状态的调节。本研究从长叶红砂中克隆了RtGR和RtSOD基因,对其进行组织特异性分析及不同胁迫下表达特性分析,将该基因转入拟南芥,验证其在不同胁迫条件下的功能,为深入了解RtGRX及RtSOD基因在植物抵抗逆境胁迫过程中的调控功能奠定了基础。主要结果如下:
  1.依据转录组数据库信息扩增得到长叶红砂谷氧还蛋白基因,命名为RtGRX;长叶红砂超氧化物歧化酶基因,命名为RtSOD。RtGRX基因的开放阅读框大小为807bp,编码268个氨基酸,预测分子量66.98kDa,理论等电点5.17。RtSOD基因的开放阅读框大小为663bp,编码220个氨基酸,预测分子量55.90kDa理论等电点5.11。氨基酸序列比对分析显示,RtGRX属于GRX蛋白家族,RtSOD属于Cu/Zn SOD蛋白家族。系统进化树分析显示长叶红砂的RtGRX与番茄和美花烟草的GRX亲缘关系较近,而RtSOD与刚毛柽柳的SOD亲缘关系最近。
  2.组织特异性分析结果显示,RtGRX和RtSOD基因在长叶红砂根、茎、叶中均表达,且在茎中表达量显著高于根和叶。基因表达特性分析结果显示,采用400mM NaCl、4℃、PEG、H2O2、ABA等胁迫处理长叶红砂,RtGRX和RtSOD基因的表达量均上调;在不同浓度NaCl胁迫下,两基因均在400mM NaCl下表达量最高。
  3.构建RtGRX和RtSOD真核表达载体,将其转化到拟南芥中,结果发现:盐、干旱胁迫条件下转RtGRX和RtSOD基因拟南芥的生长状况(根长、鲜重、叶绿素含量)均优于野生型,抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)和脯氨酸含量较野生型显著升高,H2O2及MDA含量较野生型显著降低,说明以上两基因提高了转基因植株的抗氧化酶活性,减少了体内活性氧含量,减轻了膜损伤程度,从而提高了转基因植物在盐和干旱胁迫环境下的生长发育、光合作用以及抵抗氧化胁迫的能力,增强了转基因植株的耐受性。
  4.qPCR检测转基因拟南芥中响应逆境肋、迫相关基因的表达量,如抗氧化系统相关基因AtSOD1、AtPOD1、AtAPX1、AtCAT1,脯氨酸合成关键基因AtP5CS1,离子转运蛋白基因AtSOS1,结果显示,转基因植株中以上基因的表达量均显著高于野生型,说明RtGRX和RtSOD基因在拟南芥中的超表达提高了转基因株系参与植物氧化平衡、渗透平衡以及离子平衡等方面的基因活性,进而提高其抗逆性。
[硕士论文] 王燕
植物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)为蒺藜科白刺属灌木,通常分布在中国西北部的沙漠地区,具有抵抗高温、干旱、严寒、盐碱化以及防风固沙的能力,对维持沙漠生态平衡和防止土壤盐碱化具有重要意义。已有研究表明茉莉酸作为新型植物激素在植物抗逆方面发挥积极作用。本研究克隆了唐古特白刺茉莉酸合成途径关键酶基因丙二烯氧化物环化酶NtAOC和丙二烯氧化物合酶NtAOS,分析其表达特性,同时构建真核表达载体,将其转入拟南芥中,通过模拟盐胁迫验证NtAOC基因在拟南芥盐胁迫应答中发挥的作用。开展本项研究对探究唐古特白刺中茉莉酸对植物抵抗盐胁迫的调控作用具有重要意义。
  本研究主要内容包括:⑴依据转录组数据信息克隆了唐古特白刺NtAOC和NtAOS基因ORF。生物信息学分析表明,NtAOC含有774 bp的开放阅读框,编码257个氨基酸,NtAOS含有1566 bp的开放阅读框,编码521个氨基酸。NtAOC与长春花、豌豆、蒺藜状苜蓿的AOC亲缘关系较近,NtAOS与甜橙、桑树以及野茶树的AOS亲缘关系较近。⑵定量RT-PCR结果显示,NtAOC和NtAOS基因在根、茎、叶、花、果实中均表达,且野外采集植物的根茎叶中的表达量均高于室内培养植物根、茎、叶中表达量。NtAOC在花中表达量最高,茎中最低,野外采集植物中表达量大小依次为:花>果实>叶>根>茎。而NtAOS在根中表达量最高,在果实中最低,表达量大小依次为:根>茎>花>叶>果实。低温、PEG、NaCl、H2O2、ABA、MeJA处理唐古特白刺幼苗,NtAOC和NtAOS基因的表达量均增加,证明各种非生物胁迫及ABA、茉莉酸激素本身都能诱导唐古特白刺NtAOC和NtAOS基因的表达。⑶将NtAOC和NtAOS基因转入拟南芥过表达,获得T3代转基因植株。对NtAOC功能验证结果显示,转基因植株对盐胁迫敏感性增加,随盐胁迫浓度增加,转NtAOC基因拟南芥植株的生长受到抑制的程度亦增加。150 mM NaCl处理下,转NtAOC基因拟南芥的鲜重、叶绿素、脯氨酸、ABA含量以及抗氧化酶(POD、CAT)活性均显著低于野生型,丙二醛含量显著高于野生型。⑷qPCR检测盐胁迫条件下转基因拟南芥中茉莉酸类合成相关基因AtAOC2、AtOPR3、AtJAZ1、抗氧化系统相关基因AtSOD1、AtCAT1、AtAPX1、脯氨酸合成关键基因AtP5CS1、离子转运相关基因AtSOS1、AtNHX1、抗逆相关转录因子AtABF4、AtDREB2A、AtMYB2的表达量,发现茉莉酸合成基因表达量显著升高,而各类胁迫相关基因及茉莉合成抑制蛋白基因在转基因植株中表达量均降低,且显著低于野生型。说明盐胁迫下NtAOC基因在拟南芥中的超表达诱导了拟南芥自身茉莉酸合成途径关键酶基因的表达,同时负调控了抗逆相关转录因子以及抗逆相关基因的表达,从而使转基因植株表现出对盐胁迫的敏感性。
[硕士论文] 石嵘
微生物 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:WRKY70和LRR-RLK在许多植物中都参与了植物的抗病反应, WRKY70是植物信号传导过程中的重要成员,在植物抗病过程中发挥着重要作用,主要参与了茉莉酸(JA)与水杨酸(SA)途径,LRR-RLK可以直接或间接的识别病原物,并将信号传递下去,使植物产生一系列抗病反应。本研究在利用黑胫病菌侵染油菜的转录组测序基础上,筛选高表达及差异表达基因,结合油菜全基因组测序数据,获得WRKY70和LRR-RLK两个基因全长,为了深入了解这两个基因的信息及验证其在油菜中的抗病功能,为鉴定油菜抗病通路中重要基因的功能提供数据信息,利用生物信息学进行了序列分析,然后采用VIGS技术,将携带外源基因的cDNA导入宿主,诱发宿主同源基因沉默,来达到验证基因功能的目的。
  本研究主要内容包括:⑴根据前期用弱侵染型菌株NM-1侵染油菜得到的转录组测序结果中WRKY70和LRR-RLK基因的全长CDS序列,利用CLC SequenceViewer6推导WRKY70和LRR-RLK氨基酸序列,并对WRKY70和LRR-RLK氨基酸序列进行蛋白大小、等电点、结构域、磷酸化位点、N-糖基化位点以及疏水性分析。其中WRKY70基因CDS全长858bp,编码285个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域,属于Ⅲ类WRKY转录因子;LRR-RLK基因CDS全长2775bp,编码924个氨基酸,含有丝氨酸苏氨酸蛋白激酶活性位点。⑵克隆WRKY70和LRR-RLK基因部分CDS序列,WRKY70片段大小为308bp,LRR-RLK基因片段大小为394bp,测序后进行序列比对,与转录组序列100%一致。⑶将成功构建的VIGS沉默载体pTRV2-WRKY70和pTRV2-LRR-RLK,转入大肠杆菌MC1061中进行菌液PCR及单、双酶切验证后,提取质粒转化农杆菌GV3101,用于侵染油菜叶片。⑷农杆菌介导的沉默载体侵染油菜叶片14d后接种黑胫病病原菌NM-1,收集4h、12h、24h、36h、48h、96h叶片,提取RNA通过qPCR检测目的基因表达量,并观察植株发病情况。结果显示,沉默植株中目的基因的相对表达量低于未沉默植株,并且沉默植株叶片的病斑较大,叶片褪绿发黄较明显。
[硕士论文] 高策
环境科学 贵州师范大学 2017(学位年度)
摘要:铅是一种有毒的重金属元素,不仅对生态环境造成危害,也会通过食物链等途径进入人体,严重危害人体健康。利用重金属超富集植物对土壤中的重金属的超量吸收并向地上部分转运的特点,可以对被重金属污染的土壤进行修复。黑心菊是一种对铅转运系数较高的植物,通过添加1500mg/kg的醋酸铅溶液对黑心菊幼苗进行铅胁迫处理,6个月后采集整株黑心菊作为样品,通过高通量测序技术 Illumina HiSeq,对黑心菊进行转录组测序,获得了大量的测序信息。采用农杆菌介导法进行转基因实验,将选取的目的基因RhNRAMP1转入到受体植物拟南芥中,通过对转基因拟南芥进行PCR鉴定,初步证明了目的基因已经被整合到拟南芥的基因组中,拟南芥愈伤组织受体系统初步建立。研究结果如下:
  (1)黑心菊样品经过RNA提取、cDNA文库制备、Illumina HiSeq测序、过滤不合格序列及组装等步骤后,最终得到147131条黑心菊Unigene序列,总长度为86268038 bp,平均长度为586bp,其中长度在1000bp以上的Unigene有44653条。
  (2)获得的Unigene与Nr,Nt,Pfam,KOG,Swiss-prot,KEGG,GO七个库进行比对后,分别有51915、18447、36337、16381、36016、15455、36957条比对到以上数据库。
  (3)对Unigene进行GO和Pathway富集分析,得到46个不同功能分类和32条代谢通路。其中GO富集分析较多的是细胞过程、代谢过程等,Pathway富集分析较多的是转导、碳水化合物代谢、翻译等。
  (4)通过对Unigene进行CDS预测共得到111320个CDS,其中比对到公共数据库共得到了51853个CDS,用estscan软件预测获得59467个CDS。(5)6-BA浓度为1.0mg/L和NAA浓度为0.1mg/L的MS培养基较适合诱导拟南芥叶片愈伤组织;农杆菌介导法转化RhNRAMP1基因的拟南芥愈伤组织,6-BA浓度为2.0mg/L和NAA浓度为0.1mg/L的MS培养基利于芽分化、6-BA浓度为1.0mg/L和NAA浓度为0.1mg/L的MS培养基有利于根的分化。
[硕士论文] 张雨涵
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:胡麻枯萎病是一种由尖孢镰刀菌胡麻专化型引起的严重危害胡麻产量的土传真菌性维管束病害。本研究组在患病胡麻植株的根围土壤中分离得到了一株对尖孢镰刀菌胡麻专化型具有明显抑制效果的萎缩芽孢杆菌SF1。本文运用转录组测序技术,分别以尖孢镰刀菌胡麻专化型菌株和与生防菌SF1共培养的尖孢镰刀菌胡麻专化型菌株为研究对象,对尖孢镰刀菌胡麻专化型菌株的转录组学进行了测定并对测序数据进行分析。
  本研究主要内容包括:⑴对SF1发酵液及其无细胞滤液对G56的抑菌效果进行了比较,之后绘制了不同发酵时间SF1发酵液对G56的抑菌率变化曲线,从而确定了本次实验中实验组的处理方法。⑵以G56作为对照组,与SF1发酵液进行共培养后的G56作为实验组,对G56进行转录组测序,发现:可变剪切事件中属于SE类型的AS事件数量最多; A5SS、A3SS、RI三类AS事件数量相当,明显少于SE类型AS事件;同时,并无MXE类型AS事件发生;G56组、SF1_24h组、SF1_48h组分别有42.20%、41.25%、41.51%的基因不表达,对于表达的基因FPKM值处于16~60范围内的基因数量最多,之后依次是FPKM值处于3~15、>60、1~3范围内的基因;SF1_24h vs G56发现690个上调基因,581个基因下调。 SF1_48hvsG56发现584个上调基因,595个下调基因;其中882个在SF1_24h vs G56与SF1_48h vs G56均有差异表达;SF1_24hvsG56的全部1271个差异表达基因被注释到30个GO Term和55个涉及下调基因的KEGG通路,以及66个涉及上调基因的KEGG通路;SF1_48hvs G56的全部1179个差异表达基因被注释到25个GOTerm和52个涉及下调基因的KEGG通路,以及65个涉及上调基因的KEGG通路。
[硕士论文] 史安祺
图书情报 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  随着科学技术的进步,转基因技术的发展推广,公众对转基因作物的关注度逐渐提升,本研究对消费者进行问卷调查,挖掘与分析公众对转基因作物的认知情况;通过对2001-2015年Web of science数据库中有关转基因水稻的文献进行查找,发现出转基因水稻的研究热点和发展趋势;并进行可视化分析,为我国转基因水稻乃至转基因作物的发展提供研究依据,从而发现新的研究领域,更好的促进转基因事业的发展。
  研究方法:
  1.历史文献法。通过搜集与阅读转基因相关文献,查找与转基因有关的政策法规。对转基因作物与转基因水稻有了基本的了解与认识,为本研究提供了一个坚实的基础。
  2.问卷调查法。通过选取全国23个省(直辖市),共发放问卷4500份,经过问卷筛查与数据清洗,有效问卷4306份,有效回收率为95.69%。研究问卷,了解公众对转基因作物的态度、公众对转基因食品安全的态度等。
  3.文献计量分析法。运用文献计量分析方法,通过Citespace软件,对我国2001年至2015年转基因水稻相关文献进行分析,利用可视化软件发现研究热点与研究现状,从而总结出科研尖端与出现的潜在问题。
  4.案例分析法。以“黄金大米”为案例,分析出现该现状的原因和需要解决的问题,从中发现公众对转基因水稻的认知误区、科普宣传对公众认识转基因的重要性。
  研究结果:
  1.问卷调查统计发现,参与本次问卷的公众,对于转基因食品的总体认知呈现较低水平,主要表现在以下几个方面,公众认为转基因生物技术的成熟度较低(40%),公众对转基因食品的安全性信赖度不高(30%),一半以上的消费者对转基因作物的认知度较低,公众对转基因食品感到担心的最主要的原因是对其安全性及科学性的疑问。
  2.“黄金大米”事件折射出来的问题在于媒体如何宣传,公众如何认知。转基因大米是否安全,转基因作物是否安全,重要的不是安全与否,而是如何正确的引导公众,如何将公众的恐慌消除。为何要研究转基因水稻,正因为存在多方不安全的声音,继续研究它才有必要。
  3.针对转基因水稻的五个特性进行可视化分析研究,近年来对转基因水稻的研究逐渐增多,对于其安全性和科学性的研究不断深入,且越来越贴近其本质研究,转基因水稻的研究重点已从是否安全可靠转移到转基因水稻本身以及虫害的主要种类、如何提高特性等方面。
  研究结论:
  本文通过转基因作物的争论、争论根源,以及公众风险认知的问卷调查,运用Citespace软件进行转基因水稻的可视化分析,得出以下结论:
  1.公众对转基因生物技术的成熟程度持悲观态度,公众对转基因技术并不是非常信任;公众对转基因食品的安全情况表示不放心的居多,且对转基因食品的认知尚浅。调查显示,公众对转基因食品担心最多的因素是其安全性和科学性。
  2.通过案例分析,发现政府加大科普力度,不单单是对转基因水稻的推广,更多的是对转基因作物及转基因本身进行宣传,让公众了解什么是转基因,转基因为什么被应用在作物上,减少公众对转基因的恐惧,降低对转基因的过分认知。
  3.针对转基因水稻的五个特性进行可视化分析,尤其以转基因水稻抗逆基因和转基因水稻抗病基因研究文献最多。转基因水稻的研究重点已从是否安全可靠转移到转基因水稻本身以及虫害的主要种类、如何提高特性等方面。
[博士论文] 武晓亮
细胞生物学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料作物和经济作物,以其扎根深、开花量大、花期长、无明显的需水临界期以及水分利用率较高等特点,具有较强的抗旱性,是发展旱作农业和旱薄地开发的理想作物。干旱往往伴随土壤荒漠化、盐渍化的加重,给农业生产带来多种因素的制约。在全球范围内,有2/3的花生分布在旱作地区,缺少灌溉条件加之瘠薄的砂质土壤,使干旱和高盐危害非常普遍,已成为花生生产上分布最广、危害程度最大的限制因素。在我国,常年有70%的花生遭受不同程度的干旱和高盐胁迫,干旱和高盐引起的荚果减产率平均在20%以上。
  植物对非生物逆境的响应伴随着对生长发育过程很多基因的调控。植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)能参与植物对许多环境胁迫如干旱、冷害、盐害等的生理反应和分子生物学效应。目前ABA已经公认为能够诱导植物产生对不良环境的抗性(抗旱性、抗寒性、抗病性、耐盐性等),是植物的“抗逆诱导因子”。目前公认的高等植物体内的ABA的生物合成主要为间接途径,反应过程中的玉米黄质环氧化酶(ZEP)、9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)、ABA醛氧化酶(AAO)及钼辅因子硫化酶(MCSU)是关键调控酶。
  本研究从花生栽培品种‘丰花1号’中克隆了钼辅因子硫酸化酶基因AhLOS5,进行了抗逆性鉴定和基因功能验证。构建了含AhLOS5基因的正义和反义植物表达载体,农杆菌介导分别转化三生烟草,获得了不同AhLOS5表达水平的转基因烟草植株,并对这些转基因株系的 T1代植株进行了生物学功能分析。通过生理分析、遗传鉴定、分子生物学和生物化学的研究确定AhLOS5应答非生物逆境的机制。具体结果如下:
  (1)选取了黄淮海花生产区4个主推品种,进行抗旱性鉴定。抗旱性能排名为‘花育20号’>‘丰花1号’>‘海花1号’>‘白沙1016’。
  (2)在黄淮海花生主产区种植面积较大,同时表现高抗旱性的花生品种‘丰花1号’中成功克隆花生AhLOS5基因。全长2731个碱基,包括2451bp的开放阅读框,115bp的5′非编码区,165bp的3′非编码区,ORF编码816个氨基酸。该基因编码钼辅因子硫酸化酶,属于MOSC超家族。同源性分析证明,我们克隆得到的‘丰花1号’AhLOS5与花生二倍体野生种 A.duranensis中的 AdLOS5同源性最高,达到94.7%,与 AiLOS5同源性为92.2%。与其他高等植物相比,AhLOS5与同属豆科的狭叶羽扇豆、矮沙冬青、木豆、同源性较高,分别为77.7%、73.7%和72.9%,与属十字花科的拟南芥同源性略低,为59.9%。
  (3)以AhLOS5 cDNA核苷酸片段制备探针对4个主推品种中AhLOS5的表达特性进行了分析。结果显示,AhLOS5在4个主推品种中表达量顺序为‘花育20号’>‘丰花1号’>‘海花1号’>‘白沙1016’。我们发现,4个品种间的AhLOS5基因表达量排序与其抗旱性排序一致。验证了该基因在花生中的抗旱性。
  (4)采用Northern杂交的方法对‘丰花1号’中AhLOS5的表达特性进行了分析。结果表明,AhLOS5在花生中组成型表达,花生各器官中表达量顺序为花>成熟叶>幼果>果针>根>茎,在叶片中的表达量随着叶龄的增加而增加,在叶片展开第50d达到峰值。AhLOS5的表达还受干旱和盐胁迫诱导,诱导作用明显。
  (5)构建了2种植物表达载体,即含正义 AhLOS5的载体 pBI-LOS5和含反义AhLOS5的载体pBI-R-LOS5。以三生烟草为转化受体,采用农杆菌介导的方法,将上述2种载体分别转化。转不同载体的转基因烟草当代(T0代)所结的种子,经卡那霉素筛选,并结合转基因株系的T1代植株PCR鉴定结果,初步确定,含反义AhLOS5的转基因植株有20株,含正义AhLOS5的转基因植株有52株,并选取部分不同类型的转基因植株进行了Northern杂交分析。
  (6)通过转基因烟草植株种子根长、叶绿素含量、相对含水量、相对电导率、丙二醛(MDA)、抗坏血酸(ASA)、抗氧化酶活性(SOD,POD,CAT,APX)、内源ABA、脯氨酸等生理生化指标检测发现,在干旱和盐胁迫下,过表达AhLOS5的转基因烟草转基因植株体内内源ABA含量显著升高,抗氧化酶活性明显升高,膜脂完整性好,渗透调节物质含量高。过表达AhLOS5能够明显的提高转基因株系对干旱和盐胁迫的抗性。
  (7)用Northern blot方法对转基因烟草中另外3个抗逆相关基因DREB2B,RD22, P5CS表达进行检测。结果显示,在干旱和盐胁迫下,正义转基因和野生型对照植株的3个基因 DREB2B,RD22,P5CS都诱导表达;而反义转基因植株中只有不依赖 ABA的抗逆基因DREB2B诱导表达,依赖ABA的抗逆基因RD22和P5CS都不诱导表达。这证明了AhLOS5参与的植物抗逆途径属于依赖ABA途径,过表达AhLOS5转基因烟草获得的抗逆性是由胁迫诱导产生的内源ABA调控的。
[硕士论文] 丛茹
生物学;植物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:干旱、高盐等环境因子严重影响作物的生长及产量,它们都影响着细胞的保水能力,使细胞因为缺水而面临危害,甚至会导致植物失去生命力,由此造成的作物严重减产已成为全球性的问题。随着人口数量的的不断增加、耕地面积的逐渐减少和生态系统的急剧恶化,粮食供求的矛盾日益凸现。因此提高作物抵抗非生物胁迫的能力,来增加粮食产量是一个亟待解决的问题。与传统的育种技术和分子标记辅助育种相比之下,通过基因工程手段导入较为少数的目的基因以提高植物抗逆性更具有前景。
  在本实验室前期研究的基础上,通过iTRAQ技术发现大豆GmMMK2,GmPP1和GmMLP蛋白在高盐胁迫下表达量增加。GmMMK2为MAPK类蛋白激酶,GmPP1为丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,GmMLP属于BetⅥ类蛋白,编码产物为胶乳蛋白。这三个基因在非生物胁迫下的功能目前知之甚少,由于GmMMK2,GmPP1和GmMLP在蛋白水平受盐胁迫诱导较为明显,我们推测这三个基因在非生物胁迫信号响应及转导过程可能执行了重要的生物学功能。
  本研究针对以上问题,克隆GmMMK2,GmPP1和GmMLP基因,构建三个基因的植物表达载体,并且转化烟草,经分子生物学检测获得了转基因植株;通过对转基因烟草T1代植株的生物学检测,初步分析了基因在于旱、高盐胁迫下的功能;为研究GmMMK2,GmPP1和GmMLP基因在干旱、高盐胁迫下的响应机理以及培育抗逆转基因作物新品系奠定了理论基础并提供了基因材料。
  本研究获得的主要研究结果如下:
  (1)克隆了GmMMK2,GmPP1和GmMLP基因,并分析三个目的基因在盐,碱和ABA处理下的表达模式,研究发现GmMMK2,GmPP1和GmMLP基因对三种胁迫处理均有不同的响应模式,同时发现三个基因在幼苗期大豆不同组织部位具有不同的表达模式。
  (2)构建了3个植物表达载体,pCAMBIA2300-GmMMK2,pCAMBIA2300-GmPP1和pCAMBIA2300-GmMLP,分别将构建的植物表达载体通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草中。获得了转化GmMMK2基因的PCR阳性植株34株,其中RT-PCR阳性29株;获得转化GmPP1基因的PCR阳性植株14株,其中RT-PCR阳性13株;获得转化GmMLP基因的PCR阳性植株35株,其中RT-PCR阳性23株。对T1代转基因植株进行Km筛选以及分子生物学检测,目前,获得转GmMMK2基因5个阳性株系,转GmPP1基因3个阳性株系,转GmMLP基因6个阳性株系。
  (3)对T1代转基因幼苗进行胁迫处理,结果表明,与非转基因烟草相比,在150 mM和175 mM NaCl处理下,转GmPP1和GmMLP基因的幼苗期烟草的根长明显增加;在200 mM甘露醇处理下,转GmMLP基因的幼苗期烟草的抗渗透胁迫能力较强;在干旱胁迫处理下,转GmMLP基因的成苗期烟草对干旱胁迫的耐受力明显提高。推测GmPP1基因具有提高植物耐盐性的功能,GmMLP基因具有提高植物耐盐性和抗旱性的功能。
[硕士论文] 王万鹏
作物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:大豆含有丰富的油份和蛋白质。在中国,大豆有着上千年的种植和食用历史。在20世纪初,中国是世界上最大的大豆生产国和出口国。然而,自上世纪末以来,国内大豆年进口总量迅速增长,2016年进口量达到8300万吨,对国内大豆产业造成严重影响。黑龙江省凭借其特有的黑土地优势,多年来一直作为我国重要的大豆生产基地之一。黑龙江省大豆生产经过了连续多年下滑。在国家政策影响下,2016年大豆生产有所好转,预计2017年全省大豆面积可达到4300多万亩。但是大豆产业依然面临严重挑战,培育遗传基础优良的高产稳产大豆新品种是一个主要的应对策略。大豆种质资源的挖掘和利用是大豆育种的工作基础。目前,我国大豆生产品种的遗传基础比较狭窄,品种遗传背景单一化程度越来越高。为了提高黑龙江省大豆产量和品质,对我省推广的主栽品种及资源遗传背景进行统计和研究,能够在选育综合性状优异的大豆新品种方面发挥重要的作用。大豆的生育期是与大豆产量联系最密切的农艺性状。优良大豆品质要充分利用生长阶段的气候条件,充分发挥产量潜力。那么,推广品种具有合适的生育期就显得尤为重要。
  近十余年来,分子辅助育种技术的广泛应用和推广是农作物生产发展的重要推进动力,已经成为国际农产品市场竞争的核心技术,大豆是分子育种领域最为成功的农作物之一。然而利用CAPS、dCAPS和FLP分子标记技术对黑龙江省生产上生育期基因型联系方面的研究不多,而该技术能够从等位基因水平上对大豆生育期性状进行系统研究,为黑龙江省大豆品种适应性提供有力的理论和材料支持。为此,本研究对筛选出的118份不同育种时期的大豆育成品种及资源进行生育期基因型遗传多样性分析,明确不同大豆品种更替时期生育期主要基因的等位基因型变化,能够为大豆广适性新品种培育提供新的基因型,拓宽育种思路,提高育种效率。本研究利用13对CAPS/dCAPS及FLP分子标记和10个限制性内切酶对118份参试材料的E1、E2、E3、E4、Dt1五个基因位点的等位变异进行分析。同时,结合田间多年生育期调查数据进一步分析熟期和生育期基因的联系。主要结论如下:
  (1)118份材料的E1位点共有4个不同的等位基因(E1,e1-as,e1-nl,e1-nl-as)。E2基因包括了2个等位基因(E2,e2); E3基因位点鉴定到4个等位基因(E3,E3-H,e3-tr,e3-fs);E4鉴定到2个等位基因和一个未扩增出的位点(E4,e4-tsu,0);Dt1只检测出一个等位基因和未扩增出的位点(Dt1,0);在整个资源群体中E3的基因多样性(h=0.5147)要高于 E1(h=0.5015)。E2和Dt1的等位基因个数较少,分别为2个(E2=0.0588,e2=0.9412;Dt1=0.9748,0=0.0252)。E4虽然有3个等位基因,但是E4基因的基因多样性最低(h=0.0332),说明有稀有基因存在。
  (2)遗传多样性分析结果表明,将所有参试材料作为一个整体,E3基因遗传多样性最高。按不同育成时期进行分组,各个位点的基因遗传多样性随着育成时期的不同有着明显的差异。等位基因e1-as、e2、e3-tr、E4、Dt1在四个分组内都占据着最高的基因频率。聚类分析结果表明国内品种遗传背景趋于狭窄。
  (3)按照大豆品种更替将参试材料分为四组。四组中各基因的等位基因的频率和基因多样性差异显著。e1-as、e2、e3-tr基因型在四个组内都存在,说明上述基因型被广泛利用。 e1-as基因型在4组中频率最高,分别是0.5556,0.6875,0.5926,0.7250。E4基因仅在第一组中发现了两个有别于E4的等位基因型e4-tsu和无扩增产物。Dt1在第三、第四组中出现了未扩增出的基因型,说明各个时期生育期基因型存在消失和新增现象,有稀有等位基因存在。
  (4) E1基因的多样性在四个分组中随着育成年代呈现先下降再上升的规律;E2多样性逐渐增加;E3在四个分组中多样性变化不明显;E4基因多样性降低。
  (5)各组的生育期基因组合基因型频率最高的依次是第一组(E1/e2/e3-tr/E4/Dt1,比率为0.33);篇二组为e1-as/e2/e3-tr/E4/Dt1,比例为为0.5;第三组为e1-as/e2/e3-tr/E4/Dt1,该基因型所占比率为0.49;第四组为e1-as/e2/E3-H/E4/Dt1,比例为0.275;e1-as/e2/e3-tr/E4/Dt1在四个组中都存在,而且在全部参试材料中,该基因型所占比例最高。在各个分组中,组合基因型的数量不同。第一组(70年代之前)有6种;第二组(1970-2000年)有5种;第三组(2000年至今)有11种;第四组混合种质资源有12种不同的基因型。e1-as/e2/e3-tr/E4/Dt1、E1/e2/e3-tr/E4/Dt1、e1-as/e2/E3/E4/Dt1在四个组内都有发现,说观这几种基因型在育种过程中一直被利用,和优异性状关联。
  (6)遗传距离和聚类分析的结果显示,最近更替的两个时期大豆遗传距离较近,和20世纪70年代前的推广品种遗传距离较远。和第四组种质资源的遗传距离最远。
[硕士论文] 陶婧芬
生物信息学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:基因组变异是生物多样性形成、发展和消失,以及物种进化的物质基础,主要由单核苷酸多态性和基因组结构变异两个方面构成。相比单个核苷酸位点突变,结构变异对于表型变化(如各种慢性疾病)和进化具有更显著的影响,因此基因组结构变异在人类遗传学研究中受到越来越多的关注。植物中结构变异相关的研究起步较晚,对于其发生和进化固定的机制更是知之甚少。已有研究结果表明染色质空间组织很有可能在基因组结构变异中发挥重要作用,为了在植物中验证这一假设,我们选择模式植物拟南芥为对象展开本研究。
  在本课题中,我们利用5组已发表的拟南芥高质量染色质空间交互数据,系统分析了由土壤农杆菌介导的外源T-DNA插入、减数分裂过程中发生的片段交叉互换以及在进化过程中的大规模染色质重排等三个层次的结构变异事件的特征,并整合交互与变异数据综合考察染色质空间组织和基因组结构变异之间的关系。结果显示,对于11,802个T-DNA插入的位点,它们有着更高的染色体间与染色体内交互比值,并且交互比值与T-DNA插入数量之间呈现显著性的正相关(R=0.869-0.906);同时,交互比值与T-DNA插入位点之间的距离也存在相关性(R=0.673-0.851)。对于375个减数分裂过程中发生交叉互换的片段,交叉互换频率越高的位点,交互比值也越高。而全基因组倍增事件中保留下来的两类印迹基因4,431对ohnologs和3,399对祖先相邻基因,相比随机基因对它们之间有着更强的交互,交互比值也高于其他的基因。综上所述,本研究考察的外源、内源及进化等三种不同驱动机制介导的,从干碱基、百万碱基到染色体级别多个层次的结构变异在基因组上均不是随机分布的,而是倾向于发生在基因组三维空间染色体间交互更高的位置,即局部染色体区域的边界。结合已有的相关研究,本课题的结果充分显示了染色质空间组织对于结构变异的影响作用,为更深层次挖掘结构变异产生及固定的内在机理和研究全基因组倍增后基因命运决定机制提供了理论基础和新的思路,也进一步佐证了三维基因组学在基因组进化研究中的重要性。
[硕士论文] 李志
遗传学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:培育稻瘟病抗性品种是控制水稻稻瘟病最环保和长效的途径。本研究通过分子标记辅助选择和回交育种的方法,将9个已克隆的稻瘟病抗性基因Pi37、Pit、 Pid3、Pigm、Pi36、Pi5、 Pikh、Pikm和Pb1分别单个导入或两两聚合于四个光温敏核不育系受体亲本Y58S、广占63-4S、C815S和HD9802S,在自然病圃中对这些改良家系的稻瘟病抗性进行考察鉴定,综合评价这9个基因在自然条件下的抗性效应。结果如下:
  1、得到31个单基因改良家系和22个双基因聚合家系,并对所有实验群体中的每个植株进行分蘖期叶瘟和成熟期穗颈瘟的表型考察。
  2、自然病圃诱发鉴定表明:相比轮回亲本,单基因改良家系中,携带基因Pid3的植株在4个不育系背景下两年间均表现出极显著的(P<0.01)叶瘟和穗颈瘟抗性改良;基因Pigm在不同不育系中均表现出一定的稻瘟病抗性改良,除2014年C815S遗传背景和HD9802S遗传背景以及2015年广占63-4S遗传背景的叶瘟抗性未达到显著以外,其它遗传背景的分蘖期叶瘟或成熟期穗颈瘟抗性改良均达到显著(P<0.05)或极显著水平;基因Pikh、Pi5和Pi37也有类似于基因Pigm的遗传效应,但抗性在苗期叶瘟抗性和穗颈瘟抗性以及不同年度间表现不稳定;基因Pi36和Pit仅在个别不育系遗传背景下表现出抗性;基因Pikm在分蘖期叶瘟表现出极显著抗性改良,而成熟期穗颈瘟则无抗性;基因Pb1由于群体少,未检测到其对稻瘟病的自然抗性。
  3、双基因聚合家系中,绝大多数家系的抗性都有明显改良。其中,包含Pi37/Pigm、Pid3/Pikh、Pigm/Pid3和Pi5/Pikh等基因组合的抗性有显著的增强且累加效应明显;而包含Pi37/Pikh、Pit/Pigm等基因组合的抗性则无累加效应。
  本研究综合评估了自然诱发条件下,9个抗性基因及其双基因组合在4个遗传背景下的稻瘟病抗性,对稻瘟病抗性育种具有重要应用价值。
[硕士论文] 崔婷婷
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:油菜是我国重要的油料作物之一。进一步提高油酸含量适当降低亚麻酸含量是油菜品质改良的重要内容,而获得高油酸和低亚麻酸资源是开展育种工作的基础。本研究利用CRISPR/Cas9技术,对控制油菜种子中油酸含量的FAD2及亚麻酸含量的FAD3基因进行定点编辑,并通过对转基因后代的连续自交和回交,获得了不带有转基因元件的高油酸低亚麻酸突变体。主要研究结果如下:
  1.对甘蓝型油菜FAD2与FAD3基因进行生物信息学分析,使用在线软件筛选出基因编辑靶点,构建了对油菜FAD2与FAD3基因靶点特异的CRISPR/Cas9植物表达载体。以农杆菌介导的下胚轴转化方法转化油菜品系J9707,获得了143株转FAD2靶基因和169株转FAD3靶基因转基因油菜。
  2.通过非变性PAGE胶检测了所有的转基因阳性植株,并挑选出部分突变单株进行了测序分析。本研究对FAD2靶基因的编辑效率为16%,而对FAD3的编辑效率为5%。FAD2突变体测序与靶基因核酸序列比对表明,单个碱基插入是主要的突变类型,占到各种突变类型的50%以上,同时还发现有2个至13个碱基缺失的多种突变类型。部分FAD3突变体测序结果检测到G-A碱基的替换和2个碱基AC的插入的突变。
  3.对FAD2基因在2个靶点各个拷贝突变效率进行了比较分析。针对第一个靶位点,BnaA.FAD2.a与BnaC.FAD2.a拷贝的突变效率为分别为53%和29%;而BnaA.FAD2.b与BnaC.FAD2.b拷贝虽然只在靶标序列的第一个碱基处有差异,前者的突变率为18%,BnaC.FAD2.b拷贝未检测到突变。统计结果还发现PAM序列对突变效率有较大影响。在第二个靶点位置,BnaA.FAD2.α拷贝的PAM序列为-GGG,突变效率为71%,然而PAM序列为-NGA的其他拷贝均未出现突变。
  4.突变单株自交及杂交后代基因型分析表明,杂合突变单株后代基因型的分离比符合孟德尔遗传规律。本研究在T0代没有编辑的阳性单株后代株系中检测到了突变单株,也观测到有些在T0代叶片中检测到突变不存在于种子的后代中;通过回交和自交能有效清除转化植株中的转基因成分。
  5.分析了转FAD2靶基因的突变单株在T1、T2和T3代种子各种脂肪酸含量。突变体种子中油酸含量显著提高,最高超过80%(野生型平均为66.43%),而亚麻酸含量显著下降。突变体中叶片的油酸含量与种子中油酸含量有显著的正相关。转FAD3靶基因的突变单株在T2代种子中亚麻酸含量显著下降。
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