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[硕士论文] 吕亚妮
细胞生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:小麦(Triticum aestivum L.)颖果腹部韧皮部筛分子(sieve element,SEs)的主要功能是运输有机营养物质,木质部导管(tracheary elements,TEs)的主要功能是运输水分和无机盐。前期研究表明,小麦颖果腹部韧皮部筛分子的发育经历了特殊的PCD过程,发育成熟的SEs仍具有细胞活性,能将营养物质运输并储存于小麦胚乳中。本实验采用生物电镜、超微细胞化学与免疫荧光等技术手段,比较观察了筛分子和导管发育过程中超微结构的特征,并对细胞骨架的动态变化及ACPase分布的时空变化进行观察,进而探讨它们与PCD的关系。主要结果如下:
  1.显微与超微结构观察表明,筛分子呈对称性半圆形分布于导管的两侧,其细胞质主要通过液泡膜内陷包裹细胞器,形成自噬体进行降解,最终仍保留了部分细胞器碎片,筛分子仍然存活;而在导管分化中,主要是液泡破裂后,胞内形成自噬泡发挥自噬功能,最后细胞质被完全降解,导管最终死亡,形成管状分子,且在花后6-7d时,导管细胞壁多处发生溶解,形成了端壁孔。
  2.通过吖啶橙/碘化丙啶荧光染色结果显示,筛分子和导管细胞壁均被染成黄绿色,细胞核被染成红色。多数筛分子细胞核降解主要发生在花后3-5d,而导管发育过程中细胞核的降解主要发生在花后2d,在花后3d时,细胞核已被完全降解。
  3.间接免疫荧光标记微管结合透射电子显微镜观察发现,随着分化的进行,筛分子和导管内微管主要靠近细胞壁周围分布,尤以细胞壁加厚的位置分布较多。亚细胞水平观察发现微管周围有很多小囊泡。筛分子内靠近细胞壁周围的微管从花后5d开始减少直至降解,而导管中微管在花后4d出现横向微管,但在花后6-7d时,有的导管分子细胞壁上的微管增多。微丝蛋白的免疫荧光结果显示,花后2d,筛分子与导管内微丝均呈网络状。随着分化进行,微丝均在细胞壁加厚的位置分布较多。筛分子内靠近细胞壁周围的微丝从花后5d开始减少直至降解。而导管中微丝在花后4d出现横向微丝,花后6-7d时,导管细胞内横向微丝减少。
  4.ACPase定位结果表明,在导管液泡膜破裂后,ACPase活性多位于线粒体内自噬空泡内、内质网等发生降解的细胞器上。在筛分子发育初期,仅在液泡内检测到ACPase活性,且液泡内包裹少量细胞质。随着发育的进行,不仅在发生降解的线粒体等细胞器上检测到了ACPase活性,在成熟筛分子胞间连丝上也检测到了ACPase活性。
  综上所述,小麦筛分子和导管分化过程中均出现了细胞核降解,内含物缺失等典型的细胞程序性死亡现象,但二者降解细胞质的方式不同,筛分子中主要是微自噬的过程,而导管中则是形成自噬泡来降解细胞质,且导管内含物的降解要比筛分子快。从形态变化来看,导管细胞壁发生了溶解,形成了端壁孔。更重要的是,分化成熟的筛分子是活细胞,而导管是死细胞。筛分子和导管中细胞骨架的动态变化可能对细胞壁的发生具有调控作用。ACPase不仅与胞内物质的降解有一定相关性,自噬泡内ACPase活性也介导了细胞器的消亡过程,同时,分布于胞间连丝上的ACPase可能还与细胞间的物质运输和信息传递有关。
[硕士论文] 李榆杨
免疫组化与分子生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物细胞壁是由不同多糖组成的复杂结构。储藏于植物细胞壁中的含量丰富的木质纤维素(生物质)可以通过各种物理化学预处理和生物酶解方法转化为生物乙醇等能源产品,纤维素酶解在生物质酶解中是至关重要的一步。在生物质降解过程中,细胞壁的抗降解性是阻碍生物能源产业化的最重要因素,因此,研究生物质原料的细胞壁结构对于改进生物质降解工艺流程及定向培育可高效利用的能源作物具有重要意义。本课题分为两个部分:
  免疫荧光法检测芒草细胞壁降解中的多糖变化部分主要利用细胞壁多糖特异抗体检测直接酶解过程中或酸、碱预处理加酶解过程中,芒草茎秆细胞壁中纤维素、半纤维素、果胶多糖的变化,结合吸光度法测定己糖、戊糖、糖醛酸的含量以及气相质谱测定单糖含量的变化,揭示细胞壁各组分之间的联系和对预处理酶解的影响度,为深入理解芒草细胞壁结构和芒草的定向能源作物育种的研究提供一定依据。本课题取得的主要结果如下:
  1.在预处理及酶解过程中,基本组织及薄壁细胞最先被降解,其次是维管束的韧皮部,维管束中原生木质部是最难降解的组织;
  2.碱预处理对纤维素基本不起作用,而酸预处理能去除少量纤维素;
  3.酸处理酶解释放戊糖、己糖均低于碱处理酶解释放量,而且酸碱预处理后酶解戊糖、己糖释放量显著高于直接酶解;
  4.酸碱预处理不能去除XyG(木葡聚糖),但XyG是酶解中最先被去除的成分;酸碱预处理对部分甲酯化的HG(同聚半乳糖醛酸)的降解效果明显,对半纤维素多糖的作用并不明显;
  5.本实验所用材料中,芒的戊糖、己糖、糖醛酸释放量在预处理酶解过程中始终高于荻,单糖释放量也有相同的规律;
  6.半纤维素主要成分Xylan不易去除,随着预处理酶解的进行,戊糖释放量(比色法)及xylose单糖含量(GC-MS)始终呈增长趋势。
  第二部分是关于微生物中近期发现的一种新型氧化酶真菌多糖单氧化酶(PMO),该酶在高等植物中的研究尚为空白。纤维素酶解在生物质降解中是至关重要的一步。传统的纤维素酶通过加水脱氢切断纤维素链,得到寡聚糖,最终被降解成单糖。近期发现的新型氧化酶PMO改变了传统纤维素酶解的模式,通过对C1端或C4端的氧化切断糖苷键。这种类型的酶具有平滑的底物结合表面和Cu离子活性中心,与纤维素晶体区结合,氧化酶切作用还需要电子供体和O2。随着研究的深入发现PMO的底物十分多样化,除了纤维素,半纤维素、淀粉等多糖都能被其氧化降解,从而揭示了PMO在细胞壁降解中扮演着重要的角色。PMO在细菌和真菌中的研究已十分广泛,但在高等植物中的功能未知。本文将红色面包霉中的PMO基因NcPMO-2转入高等植物拟南芥和水稻中,试图研究真菌纤维素氧化酶PMO在高等植物中发挥的作用及对生物质降解效率的影响。主要结果如下:
  1.人工合成NcPMO-2 cDNA序列,构建PMO-pD1301S与PMO-pUBI超表达载体,分别转入拟南芥和水稻,得到超表达转基因植株;
  2.拟南芥超表达植株表现出分支位置降低的表型,水稻超表达植株表现出分蘖增多、结实率降低、秸秆生物量增加的表型;
  3.拟南芥超表达植株成熟茎秆细胞壁成分中,纤维素含量显著升高,晶体纤维素比例降低;水稻超表达植株纤维素及晶体纤维素含量均显著降低;
  4.拟南芥与水稻超表达植株酶解糖化效率均显著升高,升高幅度达12%-25%。
[硕士论文] 樊彪
遗传学 浙江师范大学 2017(学位年度)
摘要:根作为植物的主要器官之一,其作用主要包括固定和吸收无机营养物质等。植物根的生长发育主要依赖于根尖分生组织(Root apical meristem,RAM)。RAM主要由一些未分化的干细胞组成,干细胞的分裂和分化对于维持分生组织的形态建成和生理功能有着重要的作用。
  细胞分裂素(cytokinin,CK)是一类主要的内源植物激素,研究表明,其可以通过控制细胞分裂调控RAM的形态建成;同时,细胞分裂素也可以通过与生长素之间的互作影响着这一进程。但细胞分裂素和根生长发育的具体调控机制仍未清晰。
  AtABCG14作为细胞分裂素的转运蛋白,在根部合成的tZ类细胞分裂素的向顶长距离运输中发挥着重要作用。当植物缺失AtABCG14时,根中的tZ类细胞分裂素会过度积累,导致突变体出现短根表型。针对这一表型,通过分子生物学、遗传学、细胞学以及转录组分析等试验方法去解析细胞分裂素对根部生长发育的影响及其分子机理。获得的实验结果如下:
  (1)atabcg14突变体较野生型植株相比,根部表现出明显的细胞分裂素的积累,说明atabcg14突变影响了细胞分裂素的长距离运输。
  (2)atabcg14突变体的根部明显缩短,证明过量的细胞分裂素抑制根的生长发育。
  (3)GUS染色表明CYCB1;1∷GUS在atabcg14突变体中的表达量与在野生型植物中比较明显降低,与用6-BA外源处理CYCB1;1∷GUS/WT相一致。此外,atabcg14突变体的RAM的细胞数目明显减少,证明细胞分裂素影响了RAM的细胞数目,进而影响RAM的分裂活性。
  (4)在atabcg14突变体中,生长素相关基因DR5驱动的GUS基因表达量与野生型相比同样明显降低;同时,生长素运输相关基因的GFP荧光强度出现变化,显示为PIN1,PIN2的信号明显下调,PIN7的信号明显上调。证明细胞分裂素能够影响生长素在根中的运输,从而影响生长素在RAM的分布。
  (5)RNA-seq结果分析表明,atabcg14突变体中生长素氧化相关基因DAO2的表达量明显上调,后期qPCR的结果对该结果进行了确认。说明细胞分裂素能够激活DAO2的表达,促进生长素的氧化过程。
  同时,有研究证明AtABCG14是细胞分裂素长距离运输中的关键组件,但是关于AtABCG14基因的转录调控机制的研究尚未清晰。因此,对AtABCG14的启动子进行研究,同时尝试筛选能够调控AtABCG14在不同组织表达的转录因子。获得的实验结果如下:
  (1)当截短AtABCG14的启动子时,其驱动GUS基因表达部位发生了明显变化。同时,当在atabcg14突变体中转入不同长度启动子驱动的AtABCG14进行回复实验时,发现atabcg14突变体的回复情况各不相同,证明在AtABCG14的启动子中含有关键作用元件调控其在不同组织中表达。
  (2)通过酵母单杂交和荧光双分子分析,筛选到7个候选转录因子。
[硕士论文] 赵婷婷
植物学 合肥工业大学 2017(学位年度)
摘要:细胞程序性死亡(PCD)在植物应对非生物和生物胁迫的反应中起着至关重要的作用。其中,超敏反应是植物中最典型的PCD事件之一,并且这一过程往往是由活性氧(ROS)介导。大量的研究报道过氧化氢酶2(CAT2)负调控拟南芥叶片H2O2诱导的PCD,但是植物体内调控CAT2且介导叶片PCD的关键因子还不清楚。最近的研究发现NCA1作为分子伴侣对于维持细胞内CAT活性至关重要。
  因此,本研究利用遗传学,生理学和生物化学等多种手段,比较分析了NCA1,CAT2和细胞死亡之间的关系。我们的结果发现,与cat2突变体类似,nca1突变导致了细胞内CAT活性急剧下降、氧化还原状态紊乱及生长抑制,但是却显著地抑制了拟南芥H2O2诱导的PCD。而且,进一步分析发现nca1中的水杨酸明显积累但水杨酸信号途径和PCD却没有明显被激活。此外,遗传学证据表明cat2nca1双突变体激活了水杨酸信号通路,并恢复了叶片细胞死亡的表型。综上所述,我们推测NCA1通过调控H2O2稳态和信号多重途径介导H2O2诱导的PCD。
  拟南芥中含有CAT1、CAT2及CAT3三个基因家族,为了全面分析CAT对H2O2诱导的PCD的影响,为此,本文第二部分利用CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除CAT1,CAT3基因的多靶点双元载体,并转化到cat2突变体中,以期获得cat1 cat2 cat3三突变体。该突变体将会为深入分析CAT调控H2O2的信号转导机理提供重要的遗传材料。
[硕士论文] 丁炳莉
遗传学 浙江师范大学 2017(学位年度)
摘要:细胞分裂素是一类调控植物生长发育的重要激素,与叶片衰老、植物抗病及非生物胁迫等方面有着密切的联系。相对于其合成代谢及信号转导方面的研究,人们对于细胞分裂素转运的分子机制研究尚不够深入。有研究报道,AtABCG14和AtPUP14两个转运蛋白能够在植物体内转运细胞分裂素,其中,AtABCG14主要负责细胞分裂素的向顶运输,AtPUP14负责细胞分裂素的胞内运输。AtABCG14作为首个参与细胞分裂素长距离运输的转运蛋白,在植物体内调控根部产生的细胞分裂素向顶运输。AtABCG14基因主要在拟南芥的根部表达强烈,在地上组织(主要在叶脉和花序部位)也有明显的表达。于是推测AtABCG14在地上组织也可能具有一定的生物学功能。
  本研究主要利用野生型Co1-4与atabcg14突变体嫁接植物的表型分析,结合AtABCG14基因在地上组织的组织表达定位,同位素示踪,综合运用遗传学、分子生物学和发育生物学等研究手段,阐明AtABCG14基因在地上组织的生物学功能。具体研究结果如下:
  (1)Col-4与abcg14突变体嫁接,abcg14突变体作为接穗,Col-4作为砧木时,地上组织的表型并不能恢复,说明AtABCG14在地上组织具有生物学功能。
  (2)对嫁接体地上组织细胞分裂素响应基因的相对表达量分析以及ARR5∷GUS报告基因的表达量的检测,结果表明,在abcg14突变体作为接穗,Col-4作为砧木时,AtABCG14在地上组织缺失显著降低细胞分裂素响应基因的表达水平,进一步证明AtABCG14在地上组织具有生物学功能。
  (3)AtABCG14在地上组织的组织表达:通过对ABCG14P(ro)∷GUS转基因植株的叶片进行树脂切片以及组织特异性启动子转基因材料的互补实验,说明AtABCG14在地上组织主要在韧皮部表达。
  (4)利用C13-tZ和C14-tZ外源吸收实验,分别检测嫁接体地上组织中同位素标记的细胞分裂素含量和类别。该结果充分说明abcg14突变体作为接穗,Col-4作为砧木时,细胞分裂素能够通过维管组织运输到地上组织。
  (5)观察ARR5∷eGFP/WT与ARR5∷eGFP/abcg14的嫁接体根部荧光强度以及根部ARR5的表达量的检测。该结果表明突变体作为接穗,野生型作为砧木时,地上组织细胞分裂素无法分配而达到饱和状态,根部细胞分裂素积累,导致嫁接体荧光强于野生型。
  综上所述,本研究证明AtABCG14在拟南芥地上组织参与细胞分裂素的分配。此外,当地上组织积累的细胞分裂素无法分配时,地下组织会积累细胞分裂素,初步推测其在地上组织的功能影响细胞分裂素的向顶运输。
[硕士论文] 仝贝
生物工程 西北大学 2017(学位年度)
摘要:在动物细胞凋亡的内源途径中,线粒体处于中心位置,当其中的细胞色素C释放到细胞质后,细胞发生凋亡现象。在植物的叶绿体中,存在着具有相同电子传递功能的蛋白—细胞色素C6和功能相似的质体蓝素PC。推测,在植物细胞中,PCs和Cytc6可能是植物程序性细胞死亡的重要影响因子。本研究通过构建多个稳定型和诱导型两类表达载体,以野生型拟南芥Columbia为研究背景,通过转基因技术使PCs和Cytc6在细胞质中定位表达,观察比较植株表型来研究PCs和Cytc6在植物程序性细胞死亡中的功能。主要取得以下结果:
  (1)成功构建12种稳定型表达载体。从Tair数据库中找到PC1、PC2和Cytc6三个蛋白的CDs全长序列,设计引物并获得基因片段后构建在质粒载体pB003上的组成型启动子35S后。其中表达目的基因全长的重组载体有3种,表达产物在前导肽的作用下进入叶绿体;表达目标蛋白成熟肽的重组载体有3种,表达产物因为缺乏前导肽而定位于细胞质中。另外,在所有目的基因后加上GFP构建融合蛋白,便于后续分析蛋白定位。经测序验证正确后即成功获得12种稳定表达载体。
  (2)成功构建7种诱导型表达载体。从Tair数据库中找到PC1、PC2和Cytc6三个蛋白的CDs全长序列,设计引物并获得相应目的基因的成熟肽,构建在质粒载体pTA7002上的诱导型启动子GAL4后(Pind),在诱导剂DEX的作用下使目的蛋白定位于细胞质中表达;另外,在所有目的基因后加上GFP构建融合蛋白,便于后续分析蛋白定位;用空载体pTA7002EV作为对照。经测序验证正确后即成功获得7种诱导型表达载体。
  (3)筛选得到T2代转基因植株。将所有重组质粒转入农杆菌GV3101中,通过转基因技术转入野生型拟南芥中获得转基因植株,对其进行抗性筛选、DNA水平、蛋白水平等一系列鉴定,得到转基因株系T2代。
  (4)地塞米松DEX对pTA7002相关转基因植株的诱导。DEX是一种糖皮质激素,用DEX诱导pTA7002系列转基因植株后,运用pTA7002载体具有的GVG系统的特性,使目的基因在特定组织特定时期表达蛋白。本实验所用DEX浓度为15μM。
  (5)水杨酸SA对col和突变体pete1、pete2中单线态氧的验证。SA可以使植物叶片中的单线态氧含量升高,导致程序性细胞死亡。用5mM SA处理拟南芥叶片后观察表型,三种植株的程序性死亡程度是:col>pete2>pete1,重复三次对植物死亡率进行统计,结果显著。表明这三种植物在受到SA胁迫后活性氧的增加可能和PC含量有关。
  (6)观测各种转基因植株的表现型,记录它们的死亡状态。将目的蛋白定位于叶绿体中表达和定位于细胞质中表达蛋白的各种转基因植株的死亡数没有明显的差别,但它们死亡的比例都高于野生型,初步认为将Cytc6、PC1和PC2在叶绿体或细胞质的高表达可能会提高植物细胞死亡的频率。但引起细胞死亡的因素很多,由于时间关系,不能排除各种环境因素以及表达系统本身的影响,需要更为细致的研究。
  (7)鉴定得到基因Cytc6T-DNA插入的突变体种子。从拟南芥突变体资源中心(NASC)购买了三种Cytc6T-DNA插入的突变体种子Salk_060652、Salk_060643和Salk_011266c,种植后对杂合子植株从DNA、RNA水平鉴定后,得到纯合子植株,分别是插在外显子上的Salk_060652和插在内含子上的Salk_011266c。
  (8)Cytc6蛋白抗体的制备。通过基因工程技术将Cytc6的成熟肽目的基因构建在带有GST标签的诱导型表达载体pGEX4T.3上,通过诱导GST基因的表达,产生GST融合蛋白,利用亲和纯化的方法将融合蛋白提取纯化后即获得目的蛋白,后续进行免疫抗原设计、兔免疫抗体制备等实验。
  综上,发现不论是在叶绿体中还是细胞质里,过表达PC1、PC2和Cytc6,会提高植物细胞死亡的频率,但其作用机制需要更为细致及深入的研究。另外,还鉴定了Cytc6纯合敲除突变体植株,纯化了Cytc6蛋白,为后续制备Cytc6抗体及研究Cytc6生物学功能和作用机制奠定了基础。
[博士论文] 于倩倩
细胞生物学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:植物根尖干细胞微环境对于植物根的生长发育具有重要作用,其中根尖干细胞是产生根中不同组织细胞的源泉,而位于干细胞中间的静止中心(QuiescentCenter,QC)细胞对于干细胞活性的维持具有十分重要的调控作用。目前研究发现的参与根尖干细胞微环境维持的调控途径主要包括SCR/SHR调控途径、PLT调控途径、WOX5调控途径、各种激素(生长素、细胞分裂素、乙烯、脱落酸以及赤霉素等)参与的调控途径。然而,参与根尖干细胞微环境维持的其它调控因子目前仍不清楚。因此,我们的研究致力于发现新的参与维持根尖干细胞微环境的调控元件,这对于进一步阐明根尖干细胞微环境维持的调控机制网络具有十分深远的意义。
  本研究以模式植物拟南芥为研究对象,通过Lugol染色,从T-DNA插入突变体库中特异的筛选具有根尖干细胞发育缺陷表型的突变体材料,进行后续研究。在此,通过筛选我们获得了一个新的参与根尖干细胞微环境维持的功能基因APP1(A-P-loop NTPase superfamily Protein)。采用分子生物学、细胞生物学、遗传学及生理学等技术方法,对APP1参与调控根尖干细胞微环境维持的分子机制进行了深入的研究分析。
  Lugol染色的结果发现,app1功能缺失突变体根尖QC细胞发生了明显的纵向分裂,并且远端干细胞(Distal stem cell,DSC)处出现了明显的能够被KI染色的淀粉粒积累,表明失去了干细胞活性。此外,QC特异标记基因QC184在app1突变体中的表达量明显低于野生型,这表明app1突变体中QC的特性受到了破坏。
  为了阐明其作用机理,我们进一步检测APP1表达模式及其编码蛋白的亚细胞定位。对pAPP1∷GUS转基因系的GUS染色结果表明,APP1主要在拟南芥的根中表达,而且主要集中在根尖处;此外,激光共聚焦观察pAPP1∷APP1-GFP转基因株系的结果发现,APP1蛋白也是主要在根尖处表达,暗示APP1可能参与根尖生长发育的调控。激光共聚焦观察结果显示,pAPP1∷APP1-GFP绿色荧光蛋白和红色荧光MT-Red标记的线粒体能够重叠,说明APP1蛋白定位于线粒体;另一方面,western blot结果显示,在pAPP1∷APP1-GFP转基因植株的线粒体蛋白中能够同时检测到APP1蛋白和线粒体特异标记COXⅣ蛋白,进一步说明APP1蛋白定位于线粒体。这也暗示APP1可能通过影响线粒体的功能参与根尖干细胞微环境的维持。
  体外ATP酶活测定结果说明,APP1具有ATP水解酶活性。为了阐明线粒体定位且具有ATP水解酶活性的APP1是否影响ROS稳态的维持。我们通过荧光染料H2DCFDA和化学染料DAB以及NBT检测app1突变体中ROS的水平。结果显示,在app1中的荧光强度或化学染色水平要明显低于野生型,表明app1中的ROS水平显著降低;此外,与野生型相比,app1突变体中线粒体O2-的标记marker Mito-cpYFP也明显低于野生型对照。并且H2O2含量的测定结果显示app1-1和app1-2突变体中H2O2的含量明显低于Col-0对照。这些结果说明APP1能影响根尖ROS的含量,包括H2O2含量和O2-含量。
  进一步分析APP1影响根尖ROS水平的机制,我们发现在app1突变体中第Ⅲ类过氧化物酶(Peroxidases,PER)家族中的PER11和PER55基因的表达受到明显诱导,说明app1突变体中较低的ROS水平可能与高表达的过氧化物酶PER11和PER55参与ROS的清除有关。此外,app1突变体中线粒体复合体Ⅰ的活性,即NADH-CoQ还原酶的活性与野生型相比明显降低,这与app1突变体中ROS水平低是相一致的。
  为了进一步验证app1突变体中QC细胞分裂和DSC分化的加快是否是由于app1突变体中较低的ROS水平引起的,我们对app1突变体进行外源施加H2O2及O2-的供体。结果显示,无论是通过MV处理升高O2-的水平,还是通过直接外源施加H2O2,都能够恢复app1突变体中QC细胞分裂和DSC分化加快的表型。此外,通过外源施加ROS的合成抑制剂DPI和清除剂catalase降低ROS的水平,则能够模拟app1突变体中的低ROS水平导致的QC细胞分裂和DSC分化的表型,破坏根尖干细胞微环境功能的维持。
  为了深入了解ROS稳态是如何影响根尖干细胞微环境的,我们对高ROS水平下QC细胞和根尖DSC细胞的表型进行了研究。我们发现高浓度的H2O2也会促进QC细胞的分裂以及DSC的分化;此外,APP1的超表达转基因株系35S∷APP1中ROS含量明显升高,并且表现出较高的QC分化率和DSC分化率的表型。以上结果说明,无论是内源升高ROS水平还是外源升高ROS水平都会加速QC细胞的分裂和DSC的分化,对根尖干细胞功能造成一定程度的破坏。
  GRAS转录因子家族的SCR(SCARECROW)和SHR(SHORTROOT)以及PLETHORA转录因子家族的PLT1和PLT2对于维持QC细胞的功能、干细胞的稳定具有重要的调控作用。为了研究APP1参与调控根尖干细胞的机制,我们对app1中SCR、SHR、PLT1以及PLT2的表达量进行了检测。qRT-PCR、细胞生物学以及western blot的结果均显示app1变变体根尖中SCR和SHR在转录水平和蛋白水平的表达量都明显降低,而PLT1和PLT2的表达量无明显变化,暗示SCR和SHR可能作为APP1的下游基因共同参与APP1对于根失干细胞微环境维持的调控。
  已有的研究表明,生长素参与根尖干细胞微环境的维持。我们发现DR5rev∷GFP和DR5∷GUS在app1-1和app1-2突变体中的表达量与野生型Col-0中相比无明显变化,说明app1突变体中生长素信号没有发生明显改变,暗示APP1对于根尖干细胞微环境的调控机制可能是独立于生长素调控途径的。
  进一步研究ROS稳态参与根尖干细胞微环境维持的分子机制,我们分析了不同ROS浓度下调控干细胞功能的转录因子SCR、SHR、PLT1以及PLT2表达量的变化。结果显示,在高ROS浓度时,PLT1和PLT2的表达量受到明显下调,而SCR和SHR的表达量没有明显变化;而在低ROS浓度时,SCR和SHR的表达量明显降低,PLT1和PLT2的表达量无显著变化,这与app1突变体中转录因子的表达情况是相一致的。这暗示高ROS水平和低ROS水平对于根尖干细胞微环境的调控可能是通过调控不同转录因子的表达,通过不同的信号通路实现的。
  综上所述,我们的研究发现APP1主要是通过影响根中ROS稳态的维持,从而下调SCR和SHR的表达,参与根尖干细胞微环境的维持。此外,我们还发现植物体内存在一个最适的ROS浓度,维持根尖干细胞的正常功能,过高的ROS水平或过低的低ROS水平都可能导致根尖干细胞微环境的破坏。
[博士论文] 马春丽
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2016(学位年度)
摘要:钙(Calcium,Ca)是植物生长发育的大量元素,也是重要的第二信使。本实验以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana,At)为实验材料,研究Ca2+分布和Ca2+信号相关的两方面内容。第一部分研究内容是:在高钙环境下,缺失环核苷酸门控离子通道2(Cyclic nucleotide-Gated Channel2,CNGC2)基因cngc2突变体的叶片质外体Ca2+积累对其生理功能的影响。第二部分研究内容是:拟南芥短肽受体2(AtPeptide Receptor2,AtPEPR2)介导拟南芥短肽(AtPeptide1,AtPep1)诱导的根中细胞质Ca2+升高,进而抑制谷氨酰胺外排基因(GlutamineDumper,GDU)表达。
  (1) Ca是所有细胞生长发育的必需矿质元素,对于植物细胞而言,植物根细胞吸收Ca2+,并通过木质部向上运输到叶片中,进而在叶片中分布,对其分布机理的研究甚少。我们对缺失CNGC2基因的cngc2突变体进行研究,发现在0.1 mM Ca2+浓度下,cngc2与野生型植物(Columbia ecotype,Col-0)长势一样。在10mM Ca2+浓度下,当cngc2从根系吸收更多的Ca2+后,cngc2叶片细胞外空间Ca2+外溢,而后导致活性氧积累,成熟叶片边缘黄化,出现死亡斑点和生长受抑制的现象,并且死亡斑点主要分布在小叶脉周围区域。通过构建启动子连接β-葡萄糖苷酶报告基因(Glucuronidase,GUS)进行组织特异性分析,发现拟南芥CNGC2基因主要表达在叶片小叶脉周围区域。通过原子吸收方法测定总Ca含量,发现cngc2突变体比Col-0野生型叶片总Ca含量低,但细胞壁中与果胶结合的Ca含量高于Col-0,这也说明cngc2更多的Ca2+积累在质外体。当前的报道表明cngc2突变体在非毒力病原菌侵染下没有超敏反应(HypersensitiveResponse,HR),我们使用OD600=0.02的avrDC3000 RPM1+菌液侵染生长在不同Ca2+浓度的水培液中的植物,发现在0.1 mM Ca2+浓度下cngc2有HR反应;10mM Ca2+浓度处理3天,cngc2没有HR反应,表明cngc2没有HR反应是由于Ca2+外溢积累在质外体导致的。Ca2+外溢还导致了cngc2暗周期结束后淀粉的积累,说明Ca2+外溢影响了光合作用暗周期淀粉的降解。
  (2)拟南芥新型短肽受体1(AtPeptide Receptor1,AtPEPR1)和AtPEPR2是富集亮氨酸受体蛋白激酶家族的成员,能够结合一组由短肽前体(AtPROPEP)基因编码的内源肽AtPeps。前人的研究发现AtPEPR2在AtPep1介导的拟南芥叶片初级免疫反应中扮演着重要角色。在本研究中,我们发现缺失AtPEPR基因的缺失型突变体atpepr1和atpepr2有短根表型,AtPEPR1和AtPEPR2部分介导了AtPep1抑制根生长的表型,且在此过程中AtPEPR2的作用强于AtPEPR1。AtPep1引起的细胞质Ca2+浓度的升高部分由AtPEPR1和AtPEPR2介导,AtPEPR2在介导Ca2+浓度升高的过程起主要作用。为了研究AtPEPR2参与的受AtPep1诱导而转录的基因,我们对Col-0和atpepr2进行含有AtPep1处理一个小时和不含有AtPep1处理的根转录组表达谱分析,结果显示AtPep1诱导表达的基因其中75%是由AtPEPR2介导的,2个显著诱导的基因部分依赖于细胞外Ca2+的升高。在筛选基因过程中,谷氨酰胺外排基因引起了我们的重视,拟南芥基因组编码7个AtGDUs,该基因编码氨基酸外排转运体。AtPep1完全依赖AtPEPR2调控的下调基因程度最大的10个基因中,AtGDU2,3,5占其中3个。通过AtGDU3 GUS活性分析,AtPep1处理强烈抑制了根中AtGDU3的活性,螯合细胞外Ca2+能够缓解AtPep1对AtGDU3的抑制作用。过量表达AtGDU3拟南芥具有短根表型,但对AtPep1抑制短根现象不敏感。总体来说,本研究揭示了AtPEPR2在AtPep1根延伸以及根信号转导作用中扮演着重要角色。
  综上所述,本实验一方面研究植物叶片对Ca2+的分布,为Ca2+分布与Ca2+吸收的关系研究打下基础;另一方面,AtPep1是从拟南芥体内提取出来的内源短肽,外源加入纳摩尔级浓度的AtPep1通过AtPEPR2抑制拟南芥根生长,说明AtPep1可能是一种新型激素,参与植物生长和发育。
[硕士论文] 秦亚娟
林学 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:植物的维管组织是从原形成层和形成层分化而来,分生组织的干细胞向外分化为韧皮部,向内分化为木质部。CLE41多肽通过受体激酶PXY的作用,促进维管干细胞增殖。TDIF-PXY途径在维管发育过程中起重要作用,本实验主要针对PXY及其同源基因的表达分析,探究多种基因的关联作用对维管发育的影响。
  拟南芥PXY和PXL3、PXL4编码与CLV1相似的LRR-RLK,他们可能存在着功能上的重叠或冗余。研究PXL3、PXL4的过表达株系发现PXL基因对维管组织中分生组织细胞的分化有一定影响,抑制形成层细胞分化为木质部细胞。PXL4在影响分生组织分化的途径中可能依赖于PXY。虽然PXY和PXL3、PXL4同属于一个亚家族,但PXL3、PXL4的过表达都不会对pxy突变体的表型有促进或弥补的功能。
  拟南芥中有许多的基因在维管组织表达,并与分生组织的细胞命运相关。除了上述的PXY和PXL基因,还有ATHB-8、WOX4、WOX14,都与分生组织的分化相关。ATHB-8调节(原)形成层促进分化,影响木质部细胞的产生;ATHB-8能响应TDIF的调节,施加TDIF能促进ATHB-8的表达。本文研究发现,ATHB-8的表达需要PXY和PXL3、PXL4的协作,而且PXY和PXL3、PXL4间还存在着共同作用。WOX4、WOX14作为TDIF-PXY途径的下游元件调节形成层细胞的分化,在pxy突变体中WOX4、WOX14表达量只有少量下降。本文研究发现WOX4的表达对PXL3、PXL4有依赖性,但WOX14没有。
[硕士论文] 豆津
微生物学 厦门大学 2016(学位年度)
摘要:高等植物的地上部分主要来源于茎尖分生组织的干细胞区,拟南芥茎端分生组织的组织中心区表达的WUS(WUSCHEL)蛋白决定其上面临近的中央区域细胞为干细胞,并能够抑制干细胞的分化和维持干细胞的数量。WUS-CLV反馈调节环对于维持干细胞的动态平衡起着重要的作用。拟南芥中能够影响WUS表达的蛋白,也将影响WUS蛋白对干细胞动态平衡的调控过程。
  本文通过酵母双杂交实验,以WUS蛋白作诱饵蛋白,从拟南芥cDNA文库找到可以与其相互作用的AT1G62970基因编码的WBP蛋白。通过酵母双杂交回复验证实验和双分子荧光互补实验,证明WUS蛋白和WBP蛋白在酵母和植物细胞内存在着相互作用。我们的研究表明WBP蛋白定位于细胞核中,WBP蛋白表达水平降低后,会导致WUS基因转录水平的上调和蛋白表达水平的下调,CL V3基因转录水平和表达水平都发生下调。推测WBP蛋白可能是与WUS蛋白相互作用后来调控WUS蛋白的翻译和WUS蛋白的活性,进而抑制CL V3基因表达,CLV3对WUS抑制作用的减弱又导致WUS转录水平的进一步增强。
  本研究结果有助于进一步完善WUS维持茎尖干细胞动态平衡的信号调控网络。
[博士论文] 王家刚
细胞生物学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:植物细胞中存在着复杂的内膜系统,细胞内蛋白的分拣发生在内吞和分泌途径中,反式高尔基网络/早期内吞小泡(TGN/EE)是内吞途径和分泌途径的交汇点。在拟南芥中,TGN/EE是一个自主和高度动态变化的细胞器,货物蛋白到达了TGN/EE后,会在小囊泡上进行进一步的分拣。有一些会和PVC/MVB融合进入液泡降解途径,有一些会进入分泌途径而运输到质膜上。因此,TGN/EE是内吞途径和分泌途径中至关重要的货物分拣中心。
  胞内蛋白的分拣依赖于货物蛋白自身的分拣序列和识别这一序列的分子机制。衔接蛋白(AP)复合体在识别分拣序列的过程中起着至关重要的作用。衔接蛋白复合体是异源四聚体,包括两个大亚基(γ和β),一个中间亚基(μ)和一个小亚基(σ)。其中中间亚基主要负责货物的识别。在拟南芥中,最近Park和Teh等人鉴定了AP1复合体的μ亚基AP1M2的功能。AP1M2之前被命名为HAPLESS13(HAP13),它的突变体hap13表现出雄性不育的表型。最近的研究结果表明HAP13定位在 TGN上并且可以和AP1复合体别的亚基相互作用,这证明了HAP13/AP1M2确实就是AP1的μ亚基。ap1m2-1是新发现的HAP13/AP1M2突变体,KNOLLE的定位在突变体中出现了异常从而导致了突变体细胞分裂的异常。但是,HAP13/AP1M2是否还参与别的生物学过程还不是很清楚。本论文的主要结果和结论如下:
  (1)HAP13参与了细胞的形态建成。
  为了研究 HAP13在孢子体发育中的功能,我们利用新获得的等位突变体 hap13-1(ap1m2-1)来做研究,其还有部分的转录本编码前面的229个氨基酸。hap13-1表现出多方面生长发育的表型,植株矮小,主根变短,在土中很难完成成花转变。叶片表皮细胞变小而且失去了七巧板状的拼图结构。表皮毛分支数减少,大多数只有一个分支。根和下胚轴表皮细胞发育异常,呈现出鼓包状。根毛细胞膨大或者很难起始发育。
  (2)HAP13参与后高尔基体的膜泡运输。
  为了探究HAP13参与哪些囊泡运输途径,我们利用荧光染料FM4-64和BFA处理的方法检测内吞和囊泡运输的过程。在hap13-1中,我们发现FM4-64的内吞明显增加,BFA处理后,突变体中仍然有很多FM4-64存在于BFA小体以外,BFA洗脱以后,突变体中的BFA小体仍然有部分残留。
  (3)HAP13参与了调控生长素信号途径和类受体激酶信号途径。
  为了进一步研究HAP13参与的囊泡运输途径,把HAP13可能的货物连接上荧光蛋白,利用杂交的方法引入到突变体中,看这些货物蛋白的亚细胞定位是否受到影响。生长素外运蛋白PIN2在质膜上的不对称定位受到了破坏,油菜素内酯的受体BRI1在胞质小囊泡中的定位明显增加。BFA处理后,两种蛋白在突变中都可以形成 BFA小体。但是当BFA洗脱以后,两种蛋白在突变体中都仍然有部分残留。
  (4)HAP13介导液泡融合的功能在进化上保守。
  为了进一步验证HAP13是AP1的中间亚基,我们利用拟南芥中的HAP13来互补酵母AP1的μ亚基突变体amp1-的表型,HAP13可以互补amp1-在渗透胁迫下液泡融合异常的表型。
  综上所述,拟南芥μ1衔接蛋白对于TGN/EE上的蛋白分拣起着非常重要的作用。
[硕士论文] 白晶月
植物学 西北师范大学 2016(学位年度)
摘要:三磷酸腺苷(ATP)不仅以能量货币的形式存在于细胞内部,也可作为信号分子广泛存在于动物和植物细胞的细胞外基质中。细胞外ATP(eATP)可与细胞膜表面的受体结合,并激发细胞内的第二信使(Ca2+、H2O2),从而调节植物细胞的多种生理活动。本文主要以烟草悬浮细胞(Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2)为实验材料,研究了eATP在水杨酸、铜离子、盐诱导细胞死亡中的作用及可能的机制。主要有以下发现:
  (1)细胞外ATP可以缓解植物激素水杨酸(SA)引起的细胞死亡。高浓度的SA处理可引起细胞死亡,而加入外源ATP,可缓解SA引起的细胞死亡。同时发现, SA可以降低NADPH氧化酶的活性,而加入外源ATP则使得NADPH氧化酶的活性升高。为了进一步探究eATP的调节机制,并验证其作用途径是否与NADPH氧化酶有关,使用NADPH氧化酶的抑制剂——二亚苯基碘(DPI)处理细胞。结果显示,DPI可抑制eATP对SA诱导细胞死亡的缓解作用,因此其调节的信号通路可能与NADPH氧化酶有关。
  (2)细胞外ATP可以影响铜离子诱导的细胞死亡和H2O2的产生。高浓度的Cu2+处理可引起细胞死亡,且胞内外H2O2含量均有所上升。加入H2O2的清除剂—DMTU后,Cu2+引起的细胞死亡回复至对照水平,这说明Cu2+引起细胞死亡的最主要原因是H2O2的产生。Cu2+处理同时提高了NADPH氧化酶的活性,加入DPI抑制NADPH氧化酶后,缓解了Cu2+引起的细胞死亡和细胞内外H2O2含量的上升,但并未恢复至对照水平,这说明Cu2+引起细胞死亡和H2O2的产生与NADPH氧化酶有关。加入外源ATP进一步增加了细胞死亡、细胞内外H2O2的产生、NADPH氧化酶的活性。而DPI预处理后,外源ATP并未引起上述变化。综上可知,Cu2+引起的细胞死亡主要与细胞内外H2O2的含量有关,也与NADPH氧化酶的活性有关,而eATP可通过刺激NADPH氧化酶影响Cu2+引起的细胞死亡和细胞内外H2O2的产生。
  (3)细胞外ATP可以影响NaCl诱导的细胞死亡和呼吸。高浓度的NaCl处理可引起细胞死亡和呼吸的抑制,并降低eATP的含量水平。研究也表明,eATP水平的大量下降,也会导致细胞的死亡。为了探究这两者之间是否相关,实验在NaCl处理细胞的同时,加入外源ATP处理,结果显示,细胞死亡、呼吸的抑制、eATP含量的降低较之单独使用NaCl处理均有所缓解。这说明,eATP可以调节NaCl胁迫诱导的细胞死亡和呼吸作用的降低。
  综上可知,eATP作为一种重要的信号分子,通过调节细胞内NADPH氧化酶、H2O2,进而调节植物的细胞活性,这对环境变化下植物正常生理活动的维护与细胞抗性的调节有重要的生理意义。
[硕士论文] 李自然
生物化学与分子生物学 上海师范大学 2016(学位年度)
摘要:拟南芥叶绿体中存在RNA编辑的现象。目前认为RNA编辑主要由PPR蛋白以及其他非PPR蛋白共同参与。MORF家族蛋白是一类非PPR蛋白,能影响几乎所有位点的编辑,且与很多PPR蛋白互作。因此,人们推测在RNA的编辑过程中存在一个“编辑体”,其中MORF蛋白作为编辑体的核心,但是对于编辑体的了解目前还十分有限。本论文中,我们直接针对叶绿体定位的三个MORF蛋白(MORF2,MORF8和MORF9)进行了一系列的研究,从整体的角度对编辑体有了一个较为全面的认识。首先,我们构建了MORF2、MORF8和MORF9融合MYC标签的转基因植株。我们通过分离转基因植株的叶绿体基质和类囊体,对这三个MORF蛋白进行了精细定位分析,Western结果显示MORF2主要定位在叶绿体基质中,少量定位于类囊体膜上;而MORF8和MORF9主要定位在类囊体膜上。通过Blue Native实验,我们首次明确了叶绿体定位的MORF蛋白在体内形成复合物的大小。MORF2和MORF9都主要存在于一个67kDa~140kDa的复合物中,而MORF8分布的比较广,存在于大于232kDa的复合物中。其次,我们利用蛋白质免疫共沉淀并结合质谱实验研究了MORF蛋白所在复合物的具体组分。对MORF2,MORF8,MORF9的质谱结果运用MapMan软件进行了分析,选取一些RNA加工相关蛋白,通过酵母双杂验证这些蛋白与MORF2,MORF8以及MORF9之间的相互作用。结果显示这些蛋白与MORF蛋白之间并不存在直接互作。MORF2和MORF9蛋白在体内形成复合物的大小一致,且我们发现MORF9能够免疫共沉淀MORF2;同时MORF2和MORF9都能够参与ndhD位点的编辑,因此MORF2和MORF9在RNA编辑中联系紧密,其可能构成一个编辑体的核心。通过RNA-EMSA实验我们发现在编辑过程中MORF2和MORF9并不能直接结合RNA,所以MORF2和MORF9可能只是在编辑过程中起到稳定编辑体的作用。
[硕士论文] 王宁
海洋生物学 烟台大学 2016(学位年度)
摘要:本实验以在本实验室培养的蓝隐藻(Chroomonas placoideaT13)的藻蓝蛋白PC645作为材料,探索了藻蓝蛋白的存在状态与镁离子浓度的关系,并对在不同硫酸铵饱和度下所得的各级藻蓝蛋白样品的亚基组成、比例及疏水特性进行了定量研究。
  采用蔗糖密度梯度离心方法,分离并观察到了比异二聚体分子量更大的PC645复合物的存在,该复合物在以往的文献中未曾报道。
  对纯化后的藻蓝蛋白聚合条件的研究结果表明,在加入的镁离子浓度在0~50mmol/L时,藻蓝蛋白基本集中于0.4mol/L~0.5mol/L蔗糖梯度范围,以异二聚体形态为主;但在100mmol/L以上时,随着镁离子浓度的提高,出现一定比例的解聚的藻蓝蛋白单体形式,证实高浓度镁离子不利于藻蓝蛋白的聚合。
  利用变性IEF、SDS-PAGE电泳技术对70%、80%、90%、100%的硫酸铵分级沉淀法所得各级藻蓝蛋白纯化样品(A645/A280>7)的亚基进行定性、定量分析。确定了纯化后的藻蓝蛋白至少含有四种发光亚基,即α1(9kDa,pI≈9.1)、α2(8.3kDa,pI≈7.1)、β1(20.3kDa,pI≈6.0)、β2(16.7kDa,pI≈5.7)。且不同硫酸铵饱和度下所得的PC645沉淀样品中β2亚基的相对含量与硫酸铵饱和度的增加(水溶性增加)呈负相关。说明蓝隐藻中PC645的存在形式不是单一的,并且β2亚基所占比例的不同可能会导致其疏水性差异。
  对不同硫酸铵饱和度下所得的PC645沉淀样品进行疏水性分析的实验结果表明,70%沉淀样品可以产生3种疏水性不同的洗脱峰(大峰、肩峰、小峰),说明沉淀物是由不同的疏水性混合组分构成;而80%、90%、100%沉淀样品的洗脱组分中疏水性最弱的大峰组分的相对含量有逐渐增加的趋势,疏水性较强的肩峰和小峰组分的相对含量逐渐减少,甚至消失。分析显示,三种疏水性不同的组分都是异二聚体PC645,且光谱特性没有明显区别。
  我们由上述结果推测,PC645在叶绿体中的存在状态可能是不均一的;不同硫酸铵饱和度下得到的疏水程度不同的PC645样品可能是由至少两种以上的异二聚体形式按不同比例混合而成的,分别为(α1α2)(β1β2)和(α1β)(α2β)形式,PC645组分的疏水性差异与其异二聚体形式以及内β1和β2亚基的含量有关。
[硕士论文] 何晓芳
生物化学与分子生物 上海师范大学 2016(学位年度)
摘要:细胞器基因表达(OGE)对植物光合作用、呼吸作用及生长发育十分重要,但是其调控的机制仍然不清楚。在哺乳动物中,线粒体转录终止因子家族(mTERF)成员在细胞器基因表达过程中发挥重要作用,然而光合生物中mTERFs的功能研究较少。在本研究中,我们获得了拟南芥叶绿体定位的14个mTERFs蛋白编码基因的T-DNA插入植株。通过T-DNA插入位点鉴定,mTERF3及mTERF12基因的T-DNA插入位点均位于启动子区域,mTERF4基因的T-DNA位于3'UTR区域,mTERF16基因的T-DNA位于内含子区域,其余10个mTERF基因的T-DNA均位于基因的外显子区域。通过观察14个叶绿体定位的mTERFs蛋白编码基因的T-DNA插入纯系的表型,我们发现mterf3,4,7,8,10,11,12,27没有明显可见的突变表型。我们对其进行各种逆境处理发现mterf10,11,12植株对强光敏感。mterf1,2,16的突变表型最为严重,呈现胚胎致死现象。微分干涉差显微镜观察发现mterf1,2,16胚胎发育停滞在晚期心形胚时期。收集mterf2,16的突变体胚胎分离RNA并进行叶绿体基因表达分析,QRT-PCR及RT-PCR实验结果显示在mterf2突变体中,叶绿体基因psbA的通读转录本增加,petB基因的内含子剪接效率下降。在mterf16突变体中,叶绿体基因psbA的通读转录本增加,petB和trnL基因的内含子剪接效率下降。该结果显示定位叶绿体的mTERF蛋白广泛参与到拟南芥逆境响应及叶绿体基因的转录及转录后加工的各个过程。
[硕士论文] 郭凝
生物化学与分子生物学 烟台大学 2016(学位年度)
摘要:本研究以海生红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)为材料,通过层析与密度梯度离心两种不同解离条件的方法,分离、纯化制备藻胆体与藻胆蛋白-连接多肽复合体,并使用二维电泳的方法对藻胆体与藻胆蛋白-连接多肽复合体中的连接多肽成分进行分离纯化与分析。在高浓度与低浓度磷酸缓冲液条件下分别浸泡提取完整的藻胆体(PBS)与解离的藻胆蛋白。藻胆体经过密度梯度离心纯化后,稀释磷酸盐浓度,使藻胆体发生部分解离,再次经过密度梯度离心分离得到六聚体藻红蛋白(R-PE)、大于六聚体的R-PE与两种藻蓝蛋白(R-PC)、别藻蓝蛋白(AP)等多种部分解离产物。低浓度磷酸缓冲液条件下制备的解离的藻胆蛋白选用凝胶过滤、离子交换分离得到纯化的各藻胆蛋白组分,并建立了依次使用Middle Fine Sephadex G-150(MFG-150)、Fine Sephadex G-150(FG-150)、DEAE Sepharose-Fast Flow纯化分离制备R-PC、AP与依次使用MFG-150、Sephacryl S-300(S-300)、DEAE Sepharose-Fast Flow分离、纯化制备R-PE的两种技术方法。依次使用液相等电聚焦、尿素变性等电聚焦、SDS-PAGE、二维电泳,对层析与密度梯度离心所制备的藻胆体与藻胆蛋白-连接多肽组分进行分析、制备,分离得到各个组分中所含有的连接多肽条带,测得其等电点(pI)分布在7~9之间,相对分子质量分布在94.0kDa~66.2kDa与35.5kDa~28.8kDa之间。将二维电泳结果进行对比并对所得连接多肽条带进行质谱分析,结果表明在完整藻胆体中含有~85kDa、~75kDa、~65kDa三种不同类型的无色连接多肽和五种pI不同的~35kDa的γ1亚基连接多肽与三种pI不同的~28kDa的γ2亚基连接多肽。~85kDa的连接多肽可能是R-PC、AP之间和R-PC、R-PE之间的连接多肽;~75kDa的连接多肽可能是AP组分内部的连接多肽;~65kDa的连接多肽可能是R-PC、R-PE之间连接多肽;γ亚基为R-PE组分内部的连接多肽。由以上推论可以得出PBS中R-PE、R-PC、AP与各个连接多肽之间的连接模型可能为(此处公式省略)。
[博士论文] 晏博
生物学·细胞生物学 兰州大学 2015(学位年度)
摘要:在真核生物中,蛋白质的入核转运对于维持细胞正常的生命活动具有极其重要的意义。Transportin1(TRN1)是核质转运蛋白importin家族一个成员,在酵母以及哺乳动物的研究中,TRN1能够识别一部分特殊的入核转运信号 PY-NLS,并且在酵母和哺乳动物中已经找到很多具有PY-NLS基序的TRN1的底物。最近的研究发现,人类TRN1蛋白的底物参与到多种的细胞活动中,包括RNA前体的可变剪切,RNA的跨核运输,基因转录的调控以及蛋白的合成。但Transportin1在植物细胞中底物及其功能研究却很少。
  1.研究筛选了AtTRNl的底物,获得了以下结果:
  1).以AtTRNl为诱饵筛选已建立的拟南芥cDNA酵母双杂交文库,寻找到18个与AtTRNl相互作用的蛋白,可能为AtTRNl的底物。通过对这些蛋白氨基酸序列的比对,我们没有发现PY-NLS基序。
  2).利用已知的kapβ2和kap104p的底物,找出其在拟南芥中的同源蛋白,测试这些同源蛋白是否与AtTRNl互作,找出7个蛋白可能为AtTRNl的底物。
  3).利用PY-NLS基序的公式在拟南芥蛋白组中比对出一些含有PY-NLS基序的蛋白,并验证了这些蛋白与AtTRNl之间的互作,发现了4个蛋白可能为AtTRNl的底物。
  4).酵母双杂和双分子荧光互补实验验证了以上29个蛋白与AtTRNl之间存在着相互作用。通过蛋白质截短实验,发现AtTRNl可识别具有PY-NLS基序的片段。
  2.研究了AtTRNl表达量下降的突变体sic1分枝增多的原因。主要的结果如下:
  1).sic1植株具有明显多于WT型的莲座叶分枝和茎生分枝,但是通过半薄切片和扫描电镜发现 sic1植株的顶端分生组织并没有什么特殊的变化,并且 sic1植株的莲座叶节数目与野生型差不多,这些结果表明sic1植株中腋芽的休眠被打破从而导致了分枝数目增多
  2).对sic1植株添加不同浓度的外源生长素,并且在sic1植株中过表达内源生长素合成基因YUCCA4,分别统计处理后和双突的分枝数目,发现这两种方法都可以有效的降低sic1植株莲座叶分枝和茎生分枝的数目,这说明生长素仍然能抑制sic1植株中分枝的向外生长,保持腋芽的休眠。
  3).细胞分裂素以及细胞分裂素合成抑制剂处理sic1植株,发现外源细胞分裂素处理 sic1植株能有效增加 sic1植株的茎生分枝数目,而细胞分裂素合成抑制剂处理则可以抑制 sic1植株茎生分枝的向外生长,但是这两种处理对于 sic1植株莲座叶分枝没有太大影响。表明相对于莲座叶分枝,sic1植株中茎生分枝对于细胞分裂素的含量更加敏感。
  4).嫁接实验证实 sic1植株砧木可以互补独脚金内酯合成缺陷突变体接穗的表型,这个结果说明 sic1植株可以合成独脚金内酯。同时 WT型砧木不能影响sic1植株接穗的表型,且sic1植株砧木也不能影响WT型接穗的表型,这说明造成sic1植株分枝增多的因素不能通过长距离运输影响地上部分表型。
  5).独脚金内酯处理实验中GR24处理的sic1植株莲座叶分枝数目明显减少,证实sic1植株可以感知独脚金内酯处理,独脚金内酯信号传导途径没有缺陷。
  6).基因芯片结果中,sic1植株叶腋部位大部分生长素响应基因表达量下调,表明这有可能是由sic1植株叶腋部位生长素含量下降引起的;独脚金内酯合成基因表达量下调,独脚金内酯信号传导基因表达量上调,表明有可能sic1植株叶腋部位由于其他因素影响引起了独脚金内酯含量的变化;细胞分裂素合成和激活基因表达量下调,细胞分裂素代谢和失活基因表达量上调,表明sic1植株叶腋部位处正在使细胞分裂素含量减少;核糖体相关基因表达量大部分都有所上调,表明sic1植株叶腋部位核糖体装配有可能要比野生型活跃。
  综上所述,AtTRNl通过介导多种蛋白的入核转运,参与多个细胞信号转导途径,共同调控了植物生长发育的各个阶段,在植株形态建成方面,发挥了重要的作用。本论文结果有助于阐明植物细胞中TRN1的功能,为全面了解植物核质转运及分枝发育提供理论基础。
[博士论文] 葛福荣
细胞生物学 山东农业大学 2015(学位年度)
摘要:根毛是根表皮细胞凸起形成的管状结构,是植物吸收水分和无机盐的主要部位,其形态的维持对植物的生长发育及响应外界胁迫具有重要意义。由于根毛培养周期较短,便于细胞学观察,与病原菌存在互作关系,并且是快速生长的极性细胞,而成为优良的研究系统。在此我们以根毛为研究体系,探索小G蛋白ROPs(Rho-related GTPases fromplant)极性定位的调控机制。已有研究表明植物细胞极性生长的维持依赖于活性ROPs的时空特异性定位。ROPs是植物中一类重要的小G蛋白,在植物生长发育、激素信号转导、抗逆和抗病过程中起重要的调控作用。ROPs具有“分子开关”的作用,分为GTP结合的活性形式和GDP结合的非活性形式,调控其形式转变的作用因子分为三类,鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs)、GTP酶活化蛋白(GTPaseactivating proteins,GAPs)和鸟苷酸解离抑制因子(guanine nucleotide dissociationinhibitors,GDIs)。其中GEF和GAP调控机理的研究相对清晰,GEF使非活性形式的ROPs转化为活性形式的ROPs,而GAP使活性形式的ROPs转化为非活性形式。目前关于GDI调控ROP的机制研究并不是很清晰,且主要集中于GDI从质膜上移除ROP进入胞质的负调控作用。然而,利用动物以及酵母系统进行的研究表明,GDI除了这种负调控外,还负责将Rho从内质网膜转运到质膜上,即对其定位具有正调控作用。植物中的GDI是否有类似的功能还不清楚。此外,动物及酵母Rho靶向质膜的途径除了GDI参与外,还通过特定的囊泡运输途径介导。这一方面在植物细胞系统中还尚未有报道。本研究旨在揭示GDI及囊泡运输对根毛中重要的小G蛋白ROP2动态定位的调控作用。研究结果和主要结论如下:
  (1)根毛中GDI1调控ROP2的顶端质膜定位
  GDI1功能缺失突变体scn1-1根毛中ROP2的顶端极性定位发生紊乱,造成根毛的多个起始。我们利用CITRINE-TUBBY-C标记scn1-1突变体中phosphatidyl inositol4,5-bisphosphate(PIP2)的定位,结果发现在scn1-1突变体根毛中确实存在多个PIP2聚集的生长点,并且PIP2在根毛顶端的分布范围扩大,暗示GDI1功能丧失干扰了单一顶端的形成和维持。为了研究GDI1是否介导ROP2靶向质膜的过程,我们通过荧光漂白恢复实验(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)对野生型和scn1-1突变体根毛顶端质膜上GFP-ROP的定位进行研究,在野生型根毛顶端质膜上的GFP-ROP被漂白后能够快速恢复,在scn1-1突变体中GFP-ROP的恢复速度明显慢于野生型。说明GDI1对于ROP2靶向质膜的过程具有关键作用。
  (2)反式高尔基网络(TGN/EE,trans-Golgi network/early endosomes)介导的囊泡运输参与调控ROP2的动态定位。
  为了探究ROP在根毛顶端质膜的极性定位是否还依赖于囊泡运输途径的调控,我们结合遗传学和药剂学的手段,阻断特定的囊泡运输途径,分析ROP的动态定位。我们的结果表明ROP2的动态定位依赖于ARF1(ADP-ribosylation factor1),布雷菲德菌素A(brefeldin A,BFA)敏感的高尔基后囊泡运输途径。高尔基后囊泡运输途径又分为两条,包括衔接蛋白AP1(Adaptin Protein1)介导的在TGN/EE上进行的外排途径和RabA4b介导的外排途径。我们进一步的研究结果表明AP1介导的TGN/EE上的外排途径参与ROP靶向质膜的过程。并且ROP2的动态定位不依赖于RAB5调控的液泡降解途径。
  (3) FRAP实验表明GDI1和囊泡运输共同调控ROP2顶端质膜的动态定位
  我们利用BFA处理及ARF1-DN(dominant-negative)干扰外排运输途径,发现在根毛顶端质膜定位的GFP-ROP2漂白后恢复速度与野生型的恢复速度没有明显区别。但是将ARF1-DN通过杂交引入到scn1-1突变体或用BFA处理scn1-1突变体,与scn1-1突变体相比GFP-ROP2漂白后的恢复速度显著降低了,暗示GDI1对ROP2的顶端质膜定位具有关键的调控作用,而囊泡运输同样参与调控ROP2的动态定位。
  结论:GDI1和囊泡运输协调控制根毛的极性生长。
  我们发现GDI1对ROP2在根毛极性生长过程中的动态定位具有快速调控的作用,且控制根毛单一极性生长点的建立与维持。而囊泡运输途径受到GDI1途径的影响,主要在根毛的快速生长中起调控作用。这些结果证明GDI1与TGN/EE介导的囊泡运输这两条途径决定了ROP在根毛极性生长过程中动态的顶端定位,以保证根毛的极性建立、极性维持和快速生长。
[硕士论文] 王慧敏
植物营养学 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:生长素(IAA/indole-3-acetic acid)作为植物重要的内源激素之一,广泛参与植物生长和发育的诸多过程,如根系形态建成、营养器官及生殖器官发育、维管束组织的形成和分化,应激反应和顶端优势等。生长素在植物中的功能实现需要依赖于其在植物体内的极性运输和浓度的动态平衡。植物GH3家族被证实能够参与植物体内激素的动态平衡通过调节,参与调控植物的生长发育过程。在植物中GH3基因家族可以分为三个亚家族(Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ),其中第二亚家族的部分成员被证实能够响应外源生长素诱导,主要编码生长素氨酰化合成酶,负责催化生长素与部分氨基酸结合,从而调节植物体内自由态(活性)生长素的动态平衡。目前对于GH3第一亚家族和第三亚家族成员的研究相对较少,部分基因被发现不能响应外源生长素诱导。
  迄今为止,对植物GH3家族的研究主要集中在拟南芥和水稻等模式植物中,而对于其它植物中GH3基因的表达模式和功能研究还相对较少。在本文中我们通过全基因搜索的方法,在茄科模式植物番茄的基因组中鉴定到15个GH3家族基因SlGH3.1-15,央中6个成员(SlGH3.2、SlGH3.3、SlGH3.4、SlGH3.7、SlGH3.9和SlGH3.15)属于GH3第二亚家族。生物信息学分析显示,这6个GH3的基因序列和基因结构之间相对比较保守,且存在着染色体共线性关系。进化分析还显示SlGH3.2与拟南芥AtGH3.1的进化关系较近。我们在此基础上采用荧光定量表达分析的方法对这些基因的组织表达特征以及对外源IAA、养分胁迫(低磷、低钾)和高盐胁迫下的响应特征进行了分析,并通过将lGH3.2转入到水稻中进行了功能分析。主要研究结果如下:
  1.采用荧光定量RT-PCR对番茄GH3家族中6个第二亚家族成员的组织表达模式进行了分析。研究结果显示,在正常培养条件下,SlGH3.2主要在根、花和成熟的果实中表达,在叶片中仅有微弱的表达,而在茎和未成熟的果实中几乎都不表达;SlGH3.3和SlGH3.4在所有检测的组织中几乎都不表达;SlGH3.7、SlGH3.9和SlGH3.1在所有的组织中都有不同程度的表达。相比较而言,SlGH3.2在根中的表达量要高于其它5个SlGH3同源基因。
  2.通过外源施加IAA的方法研究了6个SlGH3基因响应IAA的表达模式。研究结果显示,在外源IAA处理6个小时后,所有这6个SlGH3基因都能够显著响应外源IAA诱导上调表达,其中SlGH3.2和SlGH3.4在IAA处理的根系中表达最为强烈。
  3.对6个SlGH3基因响应缺磷、缺钾以及高盐胁迫处理的表达模式分析显示, SlGH3.2在缺磷处理的根系中表达水平被显著上调。对IAA处理和低磷处理植株中的生长素和磷浓度测定结果表明,与对照相比,IAA处理能够显著提高番茄植株根系和地上部的磷浓度,但低磷处理并没有显著增加IAA在根系中的积累。此外,IAA处理和低磷处理都能够显著提高番茄根系的侧根发育,暗示了SlGH3.2响应缺磷诱导与缺磷胁迫条件下侧根的增加有一定的相关性。
  4.在水稻中超表达SlGH3.2的研究结果发现,SlGH3.2在水稻中的表达强度与水稻中两个生长素诱导相关的Expansin基因(Exp5和Exp10)的表达水平呈负相关。转基因水稻与野生型相比明显矮化,结实率极低,且种子大小显著变小。
  5.对野生型和转基因水稻植株中IAA和全磷含量测定发现,在水稻中超表达SlGH3.2能够显著降低转基因水稻根系和叶片中的IAA浓度;与野生型植株相比,转基因水稻的叶片中磷浓度显著增加,但根系中的磷浓度没有显著差异。
[硕士论文] 荣伟琼
水生生物学 上海师范大学 2015(学位年度)
摘要:蓝藻是一类能进行光合放氧的原核生物,也是研究光合作用的模式生物之一。1991年,人们在类囊体膜上发现了除光系统II(PSII)、细胞色素b6f、光系统I(PSI)和ATP合酶之外的第五类光合膜蛋白复合体——NADPH脱氢酶复合体(NDH-1)。在结构上,该复合体类似于大肠杆菌和线粒体呼吸链上的NADPH醌氧化还原酶(复合体I),均呈“L-型”构造。然而,蓝藻基因组中不存在与大肠杆菌复合体I催化中心三个活性亚基同源的基因。在功能上,人们发现NDH-1复合体参与了多种能量反应,包括细胞呼吸、围绕PSI的循环电子传递和CO2吸收。进一步研究表明,NDH-1复合体对蓝藻细胞的生理活动,甚至生存起着至关重要的作用。因此,人们有必要对这一复合体展开深入的研究。
  在蓝藻细胞中,NDH-1复合体介导的循环电子传递(NDH-CET)是最主要的循环电子传递途径,能够大大地缓解细胞高光敏感的生长表型。因此,高光筛选策略可以帮助人们找出影响NDH-CET的蛋白因子。在此背景下,我们展开了本论文的研究,具体研究成果如下:首先,对转座子随机插入的集胞藻6803突变体库进行高光筛选,我们成功地获得了两个高光生长敏感,且NDH-CET受损的突变株。进一步研究发现,这两个突变株均为NdhQ缺失突变株(ΔndhQ)。其次,我们发现NdhQ的缺失削弱了NDH-1L复合体的组装效率,但不影响NDH-1复合体在类囊体膜上的积累。进一步的研究发现,NdhQ对于NDH-1L复合体在热下的稳定是必需的。因此NdhQ的缺失抑制细胞呼吸,但不影响CO2吸收。最后,在ndhP基因删除突变株(ΔndhP)的背景下缺失NdhQ,我们发现NDH-1L复合体几乎全部降解为了NDH-1M复合体,并且这一结果与突变株ΔndhD1/D2的结果类似。因此,NdhQ与NdhP共同稳定了NDH-1L复合体。综上所述,我们能够得出如下结论:NdhQ的缺失去稳定了NDH-1L复合体,损伤了NDH-CET和细胞呼吸活性,从而产生了高光敏感的生长表型。
  
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