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[硕士论文] 贺国园
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:葡萄孢属真菌的寄主范围十分广泛,能侵染1400多种植物,引起重要的灰霉病,造成重大的经济损失。本文主要研究了灰葡萄孢HBstr-470的生物学特性,对其中的真菌病毒进行了分子鉴定,并研究了病毒的传播特性和对灰葡萄孢生物学特性所造成的影响。此外,本文通过RNA-seq初步筛选分析了菌株HBstr-470菌落分生孢子产生阶段的差异表达基因。
  菌株HBstr-470在PDA上生长速度缓慢,菌落形态表现异常,形成大量的气生菌丝并产生丰富的分生孢子。分生孢子正常萌发,且形成的菌落再次无性繁殖形成分生孢子的性状稳定,分生孢子的产生不受光照条件限制且早于强毒菌株B05.10。但分生孢子在本氏烟叶片上的致病力与竞争性致病力都弱于强毒菌株B05.10。
  菌株HBstr-470由5种真菌病毒复合侵染,分别为Sclerotinia sclerotiorum hypovirus2/HBstr-470(SsHV2/HBstr-470)、Botrytis cinerea hypovirus1/HBstr-470(BcHV1/HBstr-470)、Botrytis cinerea victorivirus1/HBstr-470(BcVV1/HBstr-470)、Botrytis cinerea RNA2/HBstr-470(BcRV2/HBstr-470)和Botrytis cinerea partitivirus2/HBstr-470(BcPV2/HBstr-470)。其中,SsHV2/HBstr-470、BcHV1/HBstr-470属于Hypoviridae病毒科,BcVV1/HBstr-470属于Totiviridae病毒科中的Tctorivirius;BcRV2/HBstr-470与RnQV1/W1075的同源关系较近,但并未发现编码CP的dsRNA片段,可能为Quadrivirade的一个新成员;BcPV2/HBstr-470在系统进化上与Partitiviridae病毒科中成员构成一大支,是Partitiviridae中的一个新成员。菌株HBstr-470中的真菌病毒能通过分生孢子稳定地垂直传播给后代。通过对水平传播后获得的衍生菌株中真菌病毒种类及相关生物学进行分析发现:SsHV2/HBstr-470、BcVV1/HBstr-470可能与分生孢子产量增加有关;BcHV1/HBstr-470与致病力衰退有关;BcRV2/HBstr-470与生长速率的降低、分生孢子产量的增加和致病力的衰退有关;BcPV2/HBstr-470与致病力衰退和分生孢子产量的增加有关。
  菌株HBstr-470分生孢子产生阶段(48~72h)中的368个DEGs富集在氧化还原、氧化还原酶活性、血红素结合和四吡咯结合进程,表明氧化还原相关基因参与菌株HBstr-470分生孢子产生过程;KEGG分析表明基因显著富集在核糖体和氨基糖与核糖代谢通路。此外,比较转录组分析发现:菌株HBstr-470特异性表达的DEGs中涉及病毒的传播、转录和质膜的融合,可能与菌株HBstr-470中真菌病毒通过分生孢子的形成垂直传播到后代有关。
[硕士论文] 文栋
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大气CO2浓度的不断升高使农业生态系统受到一定程度的影响,不仅农作物的生长和营养结构发生改变,以农作物为食的农业害虫也受到间接影响。本研究以水稻刺吸式害虫褐飞虱(Nilaparvata lugens St(a)l)为研究对象,设置3个CO2浓度,即380μL/L(当前大气CO2浓度)、550μL/L(中间浓度)、750μL/L(倍增浓度),利用两性生命表对连续饲养多代后褐飞虱的生长发育、繁殖、存活率、种群动态进行分析,然后结合16S rDNA测序,对三个CO2浓度下褐飞虱共生菌的多样性和丰富度进一步比较分析,并通过COG功能预测和KEGG代谢途径分析,比较3个CO2浓度下代谢差异,从微生物角度揭示不同CO2浓度下褐飞虱的适应机制。实验结果如下:
  1.高CO2浓度对连续饲养多代后褐飞虱的生活史和种群动态的影响
  以三个CO2浓度下连续饲养到第32代的褐飞虱为对象,研究高CO2浓度对连续饲养多代后褐飞虱的生长发育、繁殖、种群动态的影响。分析发现550μL/LCO2浓度下褐飞虱若虫发育历期和总产卵前期较当前CO2浓度显著缩短(P<0.05),而750μL/L CO2浓度下除5龄若虫历期缩短外,其它龄期和总产卵前期无显著差异(P>0.05)。CO2浓度升高提高褐飞虱若虫的存活率,中间浓度550μL/L的雌雄成虫寿命较其他浓度显著延长(P<0.05)。中间浓度550μL/L下褐飞虱的产卵量显著高于当前大气CO2浓度和倍增CO2浓度(P<0.05),而当前CO2浓度和倍增CO2浓度之间无显著差异(P>0.05),可见中间浓度提高褐飞虱的繁殖率。对种群动态进行模拟,发现中间浓度下褐飞虱内禀增长率、周限增长率和净繁殖率均显著高于其他浓度(P<0.05),而当前浓度和倍增浓度之间无显著差异(P>0.05),平均世代周期3个CO2浓度之间也无显著差异(P>0.05)。
  2.长期倍增CO2浓度对褐飞虱种群演化的影响
  本实验以倍增浓度下连续饲养到49代的褐飞虱为主要研究对象,当前大气CO2浓度下连续饲养到第49代的褐飞虱为对照。通过两性生命表理论分析发现,倍增浓度下褐飞虱5龄若虫历期显著缩短(P<0.05),其它若虫期无显著差异(P>0.05),成虫产卵前期和总产卵前期也无显著差异(p>0.05)。倍增CO2浓度使成虫寿命显著缩短(P<0.05)。两种浓度各龄期若虫存活率无显著差异(P>0.05),但倍增CO2浓度下雌虫存活率高于雄虫,而当前大气CO2浓度却相反。对种群动态进行模拟发现,两种CO2浓度内禀增长率、周限增长率和净繁殖率上无显著差异(P>0.05),但倍增浓度平均世代周期显著缩短(P<0.05)。3.高CO2浓度对连续饲养多代后褐飞虱体内共生菌多样性的影响
  通过16S rDNA测序,对3个CO2浓度下连续饲养多代褐飞虱体内共生菌进行多样性分析,发现中间CO2浓度550μL/L下褐飞虱共生菌OTU(operational taxonomic units)数值略高,说明该浓度下共生菌丰富度较其它浓度高。3个浓度下褐飞虱共生菌优势菌门相同,分别是变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes);优势菌属也相同,分别是不动杆菌属(Acmetobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、气单胞菌属(Aeromonas)、节细菌属(Arthrobacter)和微杆菌属(Microbacterium)。3个浓度下褐飞虱共生菌各分类单元丰度存在一定差异,但种类无显著差异。通过COG功能预测和KEGG代谢途径分析,褐飞虱共生菌参与了其体内绝大部分生理代谢过程,其中中间CO2浓度550μL/L各代谢通路的丰度值最高,说明中间浓度对褐飞虱的生理代谢有一定促进作用。
  4.高CO2浓度下褐飞虱体内优势菌的定量及不动杆菌属功能初探
  选取了3个CO2浓度下褐飞虱4种优势菌属不动杆菌属Acinetobacter、杀雄菌属Arsenophonus、节细菌属Arthrobacter和金黄杆菌属Chryseobacterium进行荧光定量分析,发现不动杆菌属相对含量在当前大气CO2浓度下最低,而杀雄菌属相对含量在3个浓度下均无显著差异(P>005)。节细菌属相对含量在中间CO2浓度下显著低于当前CO2浓度和倍增CO2浓度(P<0.05),而当前浓度和倍增浓度之间无显著差异(P>0.05)。金黄杆菌属的相对含量在倍增浓度下最高,当前CO2浓度和中间CO2浓度下无显著差异(P>0.05)。同时在当前大气CO2浓度下,进行不动杆菌属共生菌饲喂实验,对褐飞虱饲喂后生长发育和繁殖进行比较。通过两性生命表分析,发现饲喂不动杆菌属菌株组和空白对照在不同龄期的发育历期、成虫寿命、成虫繁殖率和种群参数等方面均无显著差异(P>0.05),不动杆菌属对褐飞虱其它方面生物学意义还有待采用分子生物学技术去研究和验证。
[博士论文] 宋杰辉
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:稻曲病已发展成为我国水稻的三大病害之一,不仅引起水稻产量损失,还产生毒素污染谷物,对我国粮食安全及食品安全造成严重威胁。随着稻曲病人工接种技术的改善,国内外对稻曲病菌的侵染机制进行了大量研究,极大地提高了对稻曲病菌侵染的认识。本研究使用GFP标记的菌株接种感病水稻品种晚籼98,在接种后逐日观察病菌的侵染进程及水稻各花器的发育情况,对稻曲病菌的侵染机制进行了探讨,同时对侵染阶段的稻曲病菌效应子进行了鉴定,最后评价了种子带菌不是稻曲病的主要初侵染来源,取得了如下研究结果:
  (1)使用GFP标记的菌株G2接种感病水稻品种晚籼98,在接种后逐日观察稻曲病菌的侵染进程及水稻各花器的发育情况,初步揭示了稻曲病菌对水稻的侵染是一种逐步侵染模式。使用体视荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜,分别观察到稻曲病菌在水稻花器发育成熟前通过内外颖壳的缝隙进入谷粒,首先侵染水稻花丝,随后侵入柱头和花柱,偶尔能通过花柱到达子房。病菌侵染过程中,没有观察到吸器、侵染钉等侵染结构,且病菌只在寄主细胞间隙中生长。KI-I2染色试验和DAPI染色试验证明被侵染的水稻小穗中花粉发育明显受到抑制,子房受精受阻,无法继续发育且不能被KI-I2染色。然而,实时荧光定量PCR显示水稻中一些灌浆相关基因包括bZIP转录因子、淀粉代谢相关基因和种子储藏蛋白基因在稻曲病菌侵染后被大量诱导表达,表现出与子房受精后类似的表达模式,表明病菌阻止水稻受精的同时,能模拟水稻的受精,以便获取水稻营养形成稻曲球。使用G2接种温敏雄性不育系品种Hua9s,在接种后第3d用晚籼98的花粉对接种的稻穗进行人工授粉,探究病菌与受精子房之间的竞争。结果发现绝大多数授粉以后的子房都能继续发育成幼嫩的种子,表明稻曲病菌无法与成功受精的子房竞争,阐释了稻曲病菌侵入水稻小穗后首先侵染花丝,抑制花粉成熟的原因。本研究揭示的稻曲病菌逐步侵染模式以及病菌模拟水稻受精来劫持营养供应形成稻曲球的方式,代表了一种较新颖的病原菌与植物互作的生物学过程。
  (2)对水稻晚籼98接种稻曲病菌后第1d、5d和9d的样品,以及相应对照用PSB接种的样品,共6个样品进行转录组测序分析。在3个侵染时期分别鉴定出89、308和3545个差异表达基因,并对其进行了GO富集分析和KEGGPathway富集分析。GO富集分析结果显示接种后第9d,上调基因主要富集在糖类代谢过程和一些调控相关过程。KEGG Pathway富集分析结果显示差异表达基因主要富集在糖类代谢和能量代谢这两大类,其中参与糖酵解和糖异生途径的差异表达基因在接种后第5d和第9d同时显著上调表达。另外,水稻糖转运蛋白OsSWEET家族中大部分基因在病菌侵染后都有不同程度的上调表达,尤其是接种后第9d,OsSWEET1a、OsSWEET1b、OsSWEET4、OsSWEET、OsSWEET6a、OsSWEET14、OsSWEET16和OsSWEET11-like都显著上调表达。选取OsSWEET5作进一步的研究,利用酵母单杂交技术筛选到3个与OsSWEET5启动子互作的稻曲病菌效应子Uv33、Uv46和Uv48,对候选效应子的转录组分析表明它们在稻曲病菌侵染过程中大量表达。此外,用酵母单杂交试验对效应子Uv33、Uv46和Uv48与OsSWEET5启动子的互作进行了体内验证。为了验证候选效应子是否具有分泌功能,采用pSUC2酵母分泌系统进行信号肽分泌功能验证,结果表明效应子Uv33、Uv46和Uv48的信号肽具有分泌功能。
  (3)为了研究种子带菌是否是稻曲病的一种主要初侵染来源,在2014、2015和2017年分别使用药剂多菌灵、三唑酮、福美双和生石灰对被田间稻曲球污染的水稻种子进行处理,随后在水稻苗期、分蘖期和孕穗期分别对水稻各组织取样,用稻曲病菌特异性PCR检测样品中是否携带稻曲病菌,并且在水稻成熟期调查田间稻曲病的发生情况。在苗期对水稻的芽和根进行PCR检测,发现处理组与对照组相比,稻曲病菌的检测率显著降低。然而,在水稻分蘖期对叶片、茎和根进行PCR检测,以及孕穗期分别对叶片、茎、穗和根进行PCR检测,发现各处理之间没有显著差异,最后在水稻成熟期的田间稻曲病调查分析也发现各种处理之间没有显著差异。结果说明种子带菌不是主要的初侵染来源。
[硕士论文] 赵飞飞
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来我国南方梨区早期异常落叶的发生普遍,造成的损失十分严重。本实验室前期对造成梨早期落叶的病原菌进行系统鉴定,证实该病系由果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)侵染所致,同时发现,该菌在田间的症状表现存在有两种类型,Ⅰ型产生不扩展的黑色斑点症状,Ⅱ型产生可扩展的坏死斑症状。本研究选取来源于两种不同症状类型的代表菌株F J-85(产生黑点症状)和菌株FJ-11-2(产生坏死斑症状),比较两个菌株有性态与无性态的症状表现,并利用荧光标记和组织染色方法显微观察这两种不同致病型菌株的侵染过程,为探讨果生炭疽菌的致病机制和解析果生炭疽菌在我国梨上的致病多样性提供新的实验依据。取得的主要研究结果如下:
  1.两个不同致病型菌株子囊孢子单孢菌系的生物学特性及致病性研究。以梨果生刺盘孢的两种致病型菌株FJ-85(产生黑点症状)和菌株FJ-11-2(产生坏死斑症状)为材料,研究发现这两个菌株的子囊孢子单孢培养均可产生正、负两种类型的单孢菌系,正型单孢菌系菌落浅白色,其上形成的子囊孢子再培养,可形成正、负两种类型的单孢菌系。负型单孢菌系菌落深灰色,其上形成的子囊孢子再培养,只形成负型一种单孢菌系。两个菌株的单孢菌系中,负型的比例明显多于正型。两种类型的单孢菌系对峙培养,在菌落内及菌落交界处均可形成子囊壳,而同种类型的单孢菌系对峙培养仅在菌落内产生子囊壳。结果表明同种类型的单孢菌系可同宗配合,而正、负两种类型的单孢菌系还可异宗配合。正型单孢菌系的致病力与原始菌株相近,而负型单孢菌系较原始菌株弱。两个菌株的单孢菌系在翠冠梨上引起的症状差异与其原始菌株相同。
  2.两个不同致病型菌株GFP转化体系的建立。利用ATMT法对两个致病型菌株F J-85和FJ-11-2进行GFP标记,选取并测定转化子的荧光稳定性和潮霉素B抗性,并通过分子方法检测转化子中的hph和gfp基因。通过比较野生型菌株和转化子的菌落形态、生长速率和和致病力,筛选出与野生型较一致的转化子FJ-85-24和FJ-11-2-39。
  3.两个不同致病型菌株GFP转化子对梨叶侵染的显微观察。用转化子菌株FJ-85-24和FJ-11-2-39的分生孢子悬浮液,在翠冠梨叶上无伤和针刺接种后定期进行显微观察。结果显示,接种菌株FJ-85-24后,在黑点症状部位可以看到附着胞附着在叶片表面,黑点症状周围细胞出现明显的防卫反应,但未看到明显的侵染菌丝在叶片内部的扩展,怀疑黑点症状可能是由附着胞在侵染中产生的某种次生代谢产物与寄主进行非亲和互作而引起过敏性坏死反应。而菌株FJ-11-2-39的附着胞在叶片上并未显症而是以附着胞形式潜伏侵染。在发病后期两个菌株均会在叶片角质层下形成大量子囊壳。通过两个转化子的分生孢子液无伤和针刺接种丰水梨叶后发现,症状出现明显较早,且坏死部位可以看到菌丝的扩展。荧光显微镜下观察到叶片栅栏组织与海绵组织之间的组织坏死,但并未观察到菌丝在病组织内的扩展情况。
  4.两个不同致病型菌株侵染梨叶的组织染色法观察。在梨叶上接种菌株FJ-85和FJ-11-2的分生孢子,观察发现二者具有相同的萌发率,但萌发后形成的附着胞数量与类型,在接种初期存在显著性差异,菌株FJ-85的附着胞数量较菌株FJ-11-2多,前者多为短芽管末端形成的附着胞,后者则多为芽管伸长形成的附着胞。但接种24h后,二者差异不明显,均可观察到在芽管末端及周围芽生分生孢子,产生大量的附着胞。
[博士论文] MUHAMMAD IRFAN WARIS
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:复杂敏锐的嗅觉系统在草食性昆虫寄主定位行为中起着重要的作用,如果能够探明昆虫嗅觉感受的机制,则可以为基于昆虫嗅觉机制发展害虫行为调控手段奠定重要的理论基础。目前虚的许多研究表明,多种蛋白在昆虫嗅觉感受过程中起着重要的功能,其中的化学感受蛋白(CSPs)被证明可参与昆虫的嗅觉感受过程,但也许多研究发现CSPs也可能参与昆虫的发育等其他生理过程,CSPs确切的功能目前仍不清楚。褐飞虱Nilaparvata lugens(Stal)是为害水稻上重要的害虫,每年给水稻产量造成巨大的损失。本课题组在前期对褐飞虱触角转录组测序中发现了多个CSPs,但对于这些CSPs在褐飞虱嗅觉中的功能不明确。因此,我们在对褐飞虱几个CSPs基因克隆的基础上,对其CSPs的时空表达谱、重组CSPss与水稻挥发物的结合特性及机制进行了研究,并通过RNA干扰技术分析了CSPs在褐飞虱行为选择中的功能,以期为基于嗅觉感受机制发展褐飞虱的防治技术奠定理论基础。主要结果如下:
  1.褐飞虱化学感受蛋白NIugCSP3的功能分析
  在本研究中,为了更好的理解化学感受蛋白在褐飞虱中的生理功能,我们在体外克隆了NIugCSP3基因。荧光定量PCR结果显示NIugCSP3在3天交配短翅雌虫触角和三天未交配雄虫腹末和触角中高表达。通过体外荧光竞争性结合、荧光猝灭,我们提供了筛选行为活性物质的一种可行有效的方法。在25种配基中,体外结合和行为选择实验表明十九烷和2-十三酮与NIugCSP3表现出很强的结合活性而且能很好地吸引褐飞虱。NIugCSP3与水稻挥发物有很好的结合活性表明其可能参与水稻普通气味物质的接受过程中。结合机制分析表明NIugCSP3与配基相互作用的很多信息。参与与配基相互作用的关键性氨基酸残基被揭示。鉴于热力学方程和联合相互作用,疏水作用是NIugCSP3与配基相互作用的主要作用力。荧光猝灭实验也表明,十九烷和2-十三酮能使NIugCSP3发生静态猝灭,而且两者的结合是自发进行的,相互作用力主要为疏水性作用。此研究提供了一种从荧光猝灭的角度进行行为活性物质筛选的方法。
  2.褐飞虱化学感受蛋白NIugCSP8的功能分析
  在此研究中,我们从褐飞虱中成功克隆了NIugCSP8基因序列。蛋白序列分析表明NIugCSP8与其他昆虫CSPs具有很高的保守性并且含有4个保守的半胱氨酸残基。基因表达分析表明NIugCSP8基因特异性表达于3天交配短翅雌虫的翅中,表达量是3天未交配短翅雌虫翅的175倍。此外,NlugCSP8也高表达于5天未交配短翅雄虫腹末中,与年龄、性别、成虫翅型和交配状态有关。荧光竞争性结合表明,具有较长碳链的配基如橙花叔醇、己醛和反-2-己烯醛与NIugCSP8具有很强的结合能力。通过利用生物信息学的同源建模与分子对接等方法,我们预测了NIugCSP8与具有良好结合活性的气味物质的结合位点数。此外行为选择实验表明,与NIugCSP8具有较强结合活性的气味物质中有四种气味物质能引起褐飞虱显著的行为活性。NIugCSP8的功能进一步被RNAi验证。RNA干扰实验结果表明,干扰NIugCSP8之后褐飞虱对具有吸引作用的物质的吸引效果明显降低。此研究表明NIugCSP8可能会成为褐飞虱环境友好经济的防治靶标。
  3.褐飞虱化学感受蛋白NIugCSP10的功能分析
  在此研究中,我们成功将NIugCSP10在大肠杆菌进行原核表达,并在体外进行荧光竞争性结合实验、荧光猝灭以及RNAi研究其可能具有的生理功能。结果显示与雌虫相比,NIugCSP10显著高表达于雄虫,可能参与交配的生理过程。荧光竞争性结合实验表明NIugCSP10与顺-3-己烯酯、二十烷和(+)-β-派烯具有很强的结合特性。为了证实NIugCSP10与配基的结合机制,通过同源建模和分子对接,我们发现其与配基相互作用的主要作用力为疏水性作用和范德华力。在这三种pH7.4条件下具有很强结合能力的配基中,二十烷对褐飞虱具有很强的吸引作用,顺-3-己烯乙酸酯和(+)-β-派烯表现出很强的驱避作用。本研究通过RNA干扰技术也证NIugCSP10参与褐飞虱识别顺-3-己烯乙酸酯的过程。总之,我们的发现NIugCSP10能特异性结合寄主植物的挥发物质,而且这些特异性结合的挥发物能作为引诱剂和驱避剂进行褐飞虱的生物防治。
[硕士论文] 史佳阳
蔬菜学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:晚疫病菌通过释放效应子进入植物体内来调节植物的免疫应答反应,从而帮助病原菌更易侵染寄主植物。基因组测序发现晚疫病菌中至少含有500多个具有RxLR-dEER保守结构域的效应子。本实验在前期晚疫病效应子研究基础上,选取了其中11个效应子,运用农杆菌介导的瞬时表达系统在本氏烟上对这些效应子的基础功能进行鉴定。首先对效应子的表达模式进行了检测,并对效应蛋白在植物体内的表达情况进行了验证,对效应蛋白的亚细胞定位进行了观察,然后进行接种鉴定确认效应子是否对病原菌侵染及扩展有影响,最后通过效应子与PTI及ETI途径激发物的共注射了解这些效应子是否会抑制激发物诱导的HR反应。得到的主要结果如下:
  1.在本氏烟上接种晚疫病菌优势菌株“88069”后,在病菌侵染后0,24,48和72h对效应子的表达水平进行检测,结果显示11个效应子均在侵染早期显著上调表达。
  2.通过Western-blot确认效应蛋白瞬时表达载体的有效性。在本氏烟叶片注射1d后取样,提取蛋白后进行Western-blot,结果显示11个蛋白都可以正常表达,条带大小与预测一致。
  3.为了确定效应子的亚细胞定位,在信号肽切除位点的上游融合了GFP标签。通过在本氏烟上的瞬时表达,结果显示四个效应子Pi08278,Pi15972,Pi19617和Pi07555定位在细胞质中;Pi16195,Pi17063和Pi00582定位在细胞膜上;Pi07550和Pi21388定位在细胞核和核仁中;Pi09732定位在细胞膜和类细胞骨架上。
  4.为了确认这些效应子是否会促进晚疫病菌的侵染及扩展,在本氏烟上进行了接种鉴定,结果显示Pi15972,Pi19617,Pi16195和Pi09732显著地促进了晚疫病菌的侵染及扩展;Pi08278,Pi17063,Pi00582,Pi07550,Pi21388和Pi01934对晚疫病菌的侵染及扩展无影响;而Pi07555抑制病菌的扩展。
  5.将效应子与PTI途径激发物INF1和XEG1,ETI途径的激发物Avr3a/R3a和Avr4/Cf4共注射后,对其诱导产生的HR进行了统计,11个效应子中没有发现可以抑制INF1,XEG1,Avr3a/R3a和Avr4/Cf4诱发HR的效应子。
[硕士论文] 张冉
农药学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:油菜菌核病是由核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]引起,核盘菌是世界上最具毁灭性和分布最广泛的植物病原真菌之一,对其防治仍然以化学防治为主。在我国,2007年咪鲜胺首次正式登记用于防治油菜菌核病,但目前尚未有核盘菌对咪鲜胺敏感性基线的报道。本论文研究了核盘菌对咪鲜胺的敏感性、咪鲜胺的盆栽防效以及咪鲜胺和菌核净混配对核盘菌的低剂量刺激作用,这些研究对科学、合理地使用咪鲜胺防治油菜菌核病具有重要意义。
  通过测定咪鲜胺对2008年(N=73)和2014年(N=76)采集于安徽省油菜田菌株的抑制中浓度(EC50),建立了核盘菌对咪鲜胺的相对敏感性基线。2008年和2014年菌株的EC50平均值分别为0.0463μg/mL±0.0190(SD)和0.0434μg/mL±0.0193(SD),EC50值分布均为单峰型,两年之间没有显著差异(P=0.348)。20μg/mL咪鲜胺对盆栽油菜上菌核病的保护作用为98.7%,90μg/mL咪鲜胺对其治疗作用为78.97%。在含0.01和0.04μg/mL咪鲜胺的PDA上生长的菌丝,其细胞膜通透性显著(P<0.05)降低,透射电镜观察发现菌丝细胞壁不规则增厚。在含0.01μg/mL咪鲜胺和不同浓度刚果红的PDA上,菌丝生长的实际抑制率小于理论抑制率,说明菌丝对刚果红的敏感性降低,表明咪鲜胺处理降低细胞壁中几丁质含量。菌丝在含0.03μg/mL咪鲜胺的PDA上生长后,其细胞中甘露聚糖含量显著(P=0.041)提高。
  咪鲜胺、菌核净、及其混配对菌核净抗性菌株的生长和致病力具有低剂量刺激作用。PDA中0.0002~0.004μg/mL咪鲜胺对菌株HLJ4生长的刺激率为5.44%~11.09%,1~100μg/mL菌核净对菌丝生长的刺激率为6.4%~19.25%,同时含有咪鲜胺和菌核净(比例1∶5000),浓度(咪鲜胺/μg/mL+菌核净/μg/mL)为0.0002+1~0.004+20对菌丝生长的刺激率为2.91%~9.34%。喷施0.0004~0.04μg/mL咪鲜胺对菌株HLJ4在油菜离体叶片上致病力的刺激率为18.9%~30.19%,10~200μg/mL菌核净对菌丝致病力的刺激率为23.03%~45.91%,喷施咪鲜胺和菌核净混剂(配比为1∶5000),浓度(咪鲜胺/μg/mL+菌核净/μg/mL)为0.0004+2~0.04+200对菌丝致病力的刺激范围为10.04%~48.33%。在含咪鲜胺、菌核净、及其混剂的PDA上生长48h的菌丝转接至空白PDA和离体油菜叶片上,与对照相比,其生长速率和致病力提高。咪鲜胺显著(P<0.05)降低而菌核净显著提高(P<0.05)了菌丝细胞膜通透性,咪鲜胺和菌核净混剂(配比1∶5000)对细胞膜通透性的影响与对照处理无显著差异(P>0.05)。咪鲜胺、菌核净、及其混剂(配比1∶5000)可以提高核盘菌对H2O2的耐受力。
[硕士论文] 夏婵
生理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:水稻(Oryza sativa)是世界上约一半以上人口的主食,在可耕地面积减少的形势下,理想株型对提高水稻单产尤为重要,而水稻叶夹角是理想株型的主要特征之一。很多研究表明,油菜素甾醇(Brassinosteroid,BR)在调控水稻叶夹角过程中起重要作用,而赤霉素(Gibberellin,GA)对水稻叶夹角的调控机理尚不清楚。本试验利用GA合成受阻突变体(d18)、GA信号减弱突变体(d1、slr-D3)、GA信号增强突变体(slr1)、BR合成受阻突变体(d2-1)和BR信号减弱突变体(d61-2)材料,探索了GA对水稻叶夹角的调控机制,主要试验结果如下:
  1.GA促进水稻叶夹角增大。与野生型相比,GA合成受阻突变体及GA信号减弱突变体的第二叶夹角减少,GA信号增强突变体的第二叶夹角增大;与对照相比,外源GA3处理的水稻叶夹角增大,GA合成抑制剂PP333处理下的水稻叶夹角减小。
  2.GA可以与BR协同调控水稻叶夹角。与野生型相比,GA合成受阻突变体及GA信号减弱突变体对BR的敏感性降低,BR合成受阻突变体及BR信号减弱突变体对GA的敏感性减弱;与对照相比,GA3+BR处理下水稻叶夹角增加值大于GA3、BR单独处理时水稻叶夹角增加值之和。
  3.GA还可以不依赖于BR调控水稻叶夹角增大。外源GA3、BR处理下水稻叶枕细胞形态观察结果表明GA减少了水稻叶枕远轴厚壁组织细胞层数和细胞大小,而不改变叶枕近轴细胞层数;BR不改变叶枕近轴、远轴细胞层数,而是促进叶枕近轴伸长和扩张。转录组数据和qRT-PCR结果证实BR促进叶枕近轴细胞膨胀素基因的表达上调,而GA降低远轴细胞的细胞周期蛋白和细胞壁纤维素合成酶基因的表达。
  综上所述,本研究结果证实GA能够促进水稻叶夹角增大。GA可以与BR协同促进水稻叶夹角的增大;GA还可以不依赖于BR调控水稻叶夹角增大。BR主要是促进水稻叶枕近轴细胞膨大,GA主要是减少叶枕远轴细胞数目和细胞大小来促进水稻叶夹角增大。
[博士论文] ZAHOOR AHMAD
MOLECULAR PLANT PATHOLOGY 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近几年,随着世界人口以及对粮食生产需求的增加,开发出新的能够提高农作物品质抗性及产量的方法变得越来越重要。而传统化学药剂的过量使用对人类健康及环境产生了巨大的危害,所以,开发绿色环保生物防治的方法逐渐成为世界的焦点。其中,使用植物生长促生细菌(PGPB)就是最好的方法之一。PGPB能够引发植物对生物/非生物胁迫耐受性的增强,在植物生长过程中发挥重要作用。
  本研究分离了具有广谱抑菌能力和生理活性的植物生长促生菌-芽胞杆菌。通过研究共分离得到了277株菌株,并与纹枯病菌AG1-IA对峙,进行了抑菌检测。经过筛选,发现70株优良菌株能够抑制纹枯病菌的生长,特别是有5株能够高度抑制其生长。本研究的目的是分离出高效的枯草芽胞杆菌菌株,并研究其生防机制。所以,在分离到的菌株中选择了一株内生枯草芽胞杆菌330-2,对其增强农作物玉米的生长、对非生物胁迫和叶片的耐受性以及抗纹枯病的作用等方面进行了深入的研究。菌株330-2可以产生IAA,嗜铁素,水解酶,有机/无机磷酸盐和锌。此外,该菌株能够强烈抑制纹枯病菌AG1-IA,灰葡萄孢菌,尖孢镰刀菌,链格孢及玉米小班病菌等的生长。该菌株还显着提高了水稻和玉米的幼苗生长(14-37%)。
  据我们所知,基因消除PCR(R-PCR)是用于研究基因组DNA片段差异表达的简单且成本较低的方法之一。在本研究中,利用R-PCR技术从枯草芽胞杆菌330-2中分离和鉴定了147个差异表达的基因。这些差异表达的基因大部分能够参与到生物和非生物胁迫的过程中。结果显示R-PCR效率为92.52%。其中有10%,32%和11%的基因分别参与了抗生素生产(srfAA,bae,fen,mln,dfnI等),代谢(gltA,pabA,ggt等)和营养物质运输(fhu,glpT,gltT等)的过程。总而言之,这些结果清楚地表明了枯草芽胞杆菌菌株330-2在增强植物生长以及对生物/非生物胁迫耐受性等方面的有效性和机制,表明该菌株作为重要的生物防治菌株具有巨大的商业潜力。
  秀丽隐杆线虫是一种营自由生活的土壤线虫。由于其生物学特性简单,产卵数目大,生活史较短,因此常被用作毒理学研究的模型。在秀丽隐杆线虫生存的自然环境中存在各种细菌,包括无毒食源和致病菌食源。线虫取食这些致病菌后会影响线虫的行为和生理特性。芽胞杆菌可以作为秀丽隐杆线虫的食源,并可诱导次生代谢产物及其它一些生物活性物质的产生,然后会影响秀丽隐杆线虫的寿命。秀丽隐杆线虫能够感知细菌食源的特性,并通过趋避行为尽量减少和致病菌的直接接触。研究表明,秀丽隐杆线虫与环境之间的相互作用可能会影响线虫的老化和寿命。本研究构建了枯草芽胞杆菌330-2的基因组文库,宿主菌为大肠杆菌DE3,可用IPTG诱导基因表达。为了研究这些基因表达产物对线虫的摄食行为的影响。最初选择80个含基因的菌株作为线虫的食源。其中,筛选到了8个基因进行下一步研究。结果表明,当秀丽隐杆线虫取食了诱导表达的宿主菌后,生长速率和产卵数量显着降低,并且线虫的寿命显著减少或增加。基因spoⅢE显著降低了后代数量,低至27%。取食含基因yqeK和spoⅢE的菌株后,秀丽隐杆线虫的寿命分别增加了33%和30%,而取食含基因ltaS1和bmr的菌株后秀丽隐杆线虫的寿命分别比对照组(大肠杆菌OP50和DE3)降低了11%和9%。实验结果表明,枯草芽胞杆菌330-2的基因通过不同的机制影响线虫的衰老和寿命。这项研究首次对枯草芽孢杆菌330-2新的潜在基因进行了抗线虫评估。
  在本项研究中也对本实验室以前建立的基因消除PCR技术进行了优化和改进,使得R-PCR的效率从73.6%提高到了92%。优化后的详细方案被放置在附录中。
[博士论文] MUHAMMAD WAQAR ALI
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:橘小实蝇,Bactrocera dorsalis(Hendel),作为一种东南亚普遍存在的毁灭性害虫,能危害超过250种水果蔬菜,造成严重的经济损失。相对于化学农药防治,雄性不育技术(Sterile insect technique,SIT)防治橘小实蝇具有特异性高、环境友好的显著优势。传统的SIT方法通过辐射或化学不育剂实现,但由于其降低雄虫交配能力、生存力、免疫力等生物性能而限制了害虫防控效果。近期出现的基于遗传干扰技术(例如RNAinterference(RNAi))的SIT却展现出巨大的害虫防治应用潜力。RNAi是一种由dsRNA启动的保守基因表达抑制机制,已成功应用于功能基因组、医药、农业,以及害虫防控研究领域。虽然RNAi技术已经在众多农业害虫中成功实现,但在田间实际应用之前仍需要克服诸多使用技术问题。为了开发基于RNAi的SIT技术用于防控橘小实蝇,本研究首先筛选了精子形成关键基因,并验证了其RNAi的雄性不育效果。为了进一步提高dsRNA稳定性和干扰效果,本研究开发了关键基因(Boul)的dsRNA的纳米颗粒包装技术,筛选出最佳的物质配比和pH值条件,并验证其对基于RNAi的雄性不育技术的改进效果。最后,我们应用Sf9细胞系在细胞水平上研究了最佳制备条件(pH=6.5,Chitosan∶dsRNA=1∶4)下纳米材料包装的dsBoul对昆虫细胞的影响。
  1.诱导橘小实蝇雄虫不育的RNAi靶标基因
  第一部分研究中,我们通过RNA干扰橘小实蝇雄虫候选生殖细胞分化和精子缺失相关基因,再检测其与正常雌虫交配产卵等繁殖力,研究筛选了诱导雄虫不育的RNAi靶标基因。结果表明在喂食dsRNA处理后,橘小实蝇雄虫中靶基因(Boul,ZPG,dsxM,FZO and Gas8)的表达水平显著降低,并严重影响雄性的生殖能力,与对照组(dsEgfp)相比,卵孵化率降低60%-75%。不同基因dsRNA进行不同组合(Boul+ZPG,Boul+dsxM and ZPG+dsxM)干扰试验表明,发现其RNAi可以进一步提升雄性不育效果,其中最佳组合Boul+ZPG可造成86%的雄性不育。最佳的Boul+ZPG dsRNA组合不同使用浓度试验结果表明250,500,750和1000ng/ul分别造成了20.1%,39.63%,59.24%和86.28%的雄性不育;不同日龄的雄虫RNAi处理后表明1、5、7、10日龄雄虫的不育比例分别为86.28%,34.14%,22.60%和10.83%。这些结果表明在最佳dsRNA组合下进行RNAi,可显著减少雄虫的精子和活精子的数量。我们的研究有助于在B.dorsalis中发展基于RNAi的新型SIT技术用于防控橘小实蝇。
  2.橘小实蝇dsboul壳聚糖纳米颗粒包装释放技术
  在第二部分研究中,我们进一步开发了dsRNA的纳米颗粒包装释放技术。针对雄性不育效果最好的Boul基因,我们比较了两种纳米颗粒制备方法:1)嵌入法,2)吸收法;同时比较了三种pH值(6.5,7.5和8.5)条件。qRT-PCR结果表明,pH的变化可以显著影响dsBoul的RNAi效率。RNAi处理后持续25d的观察结果表明在pH=6.5条件下嵌入法制备的dsRNA纳米颗粒的RNAi效率最高,尤其是在第5天的Boul基因表达水平仅为对照组的0.22倍。而吸收法制备的dsBoul纳米颗粒处理15,20,25天后的基因表达水平与嵌入法制备的无显著差异。在此之后,我们分别使用嵌入法和吸收法,在pH6.5条件下使用了不同质量比(1∶1,1∶2,1∶3,1∶4)的壳聚糖:dsRNA组合进行纳米颗粒制备用于RNAi喂食处理。嵌入法制备条件下,质量比为1∶4的壳聚糖:dsRNA组合制备纳米颗粒处理25天后基因表达水平显著低于处理组(0.6倍),而吸收法制备条件下,不同壳聚糖:dsRNA组合制备的纳米颗粒处理后皆与对照组无显著性差异。在最适pH6.5条件下,我们进一步比较了物质配比(Chitosan∶dsRNA)为1∶1,1∶2,1∶3,1∶4条件下的效果,发现在两种包装技术条件下,1∶4物质配比的效果皆优于其它配比条件,且嵌入法效果优于吸收法。两种包装技术方法对chitosan纳米颗粒尺寸的影响研究结果表明:嵌入法产生的纳米颗粒尺寸约为80nm,优于吸收法(约为110nm)。因此在pH6.5和1∶4物质配比条件下嵌入法被进一步用于后面一系列生物测定并验证SIT相关基因的功能。与对照组(Chitosan/dsEgfp)和无纳米材料包装的dsBoul相比,处理组导致卵孵化减少77%以上,而产卵量差异不显著。在处理14天后进行雄性橘小实蝇精囊中精子总数的定量,发现进行Chitosan/dsBoul处理的雄性橘小实蝇的精子平均数目显著减少;而精子活力测定则显示处理组的活精子百分比仅为约20%,显著低于对照水平。这些结果表明纳米材料处理显著提高了dsRNA的稳定性和RNAi效率。
  3.纳米材料包装的dsBoul对昆虫细胞的影响
  最后,我们检测了嵌入法制备的dsBoul纳米颗粒材料(Chitosan∶dsRNA=1∶4)对sf9细胞系的影响。通过流式细胞分析技术发现Chitosan/dsBoul处理导致细胞凋亡,且细胞周期停滞在G2期。此外,通过多种细胞死亡率分析和透射电子显微镜(TEM)技术证明Chitosan/dsBoul可诱导Sf9细胞畸形。这些结果表明dsBoul可显著影响sf9细胞系,使细胞停滞于G2期。
[硕士论文] 王天义
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:黄萎病给我国棉花生产带来了严重的威胁。落叶型黄萎病菌能导致棉花迅速落叶,因而造成更为严重的棉花减产和品质下降。抑制发病棉株落叶是一种增强棉花对黄萎病耐性,减少产量损失的有效方式。乙烯可以促进植物衰老、成熟和离层形成并导致脱落。本研究探讨了乙烯信号路径在棉花与黄萎病菌互作中的作用,取得的主要结果如下:
  1.接种落叶型黄萎病菌‘V991’第7天、9天和11天时,棉株的乙烯产生量明显升高,达到119.49μl/kg、126.82μl/kg和148.83μl/kg,显著高于接种非落叶型黄萎病菌‘lcd3-2’棉株的乙烯产生量,分别达到1.60、1.33和1.51倍。接菌时外施0.5μg/ml、2.5μg/ml和12.5μg/ml乙烯利可以加重棉株发病,相对于水处理对照在接种‘V991’第16天时病指增加18%-23%。
  2.分离到参与棉花乙烯合成的基因家族GhACOs。利用基因家族的保守序列构建VIGS载体以抑制棉花GhACOs的表达。研究发现接种‘V991'7天时抑制GhACOs表达的棉株乙烯生成量显著下降。
  分离到棉花乙烯信号路径的正调控基因GhEIN2s并根据基因家族的保守序列构建了VIGS载体。研究发现利用VIGS抑制GhEIN2s的表达可降低‘V991’接种棉株后导致的落叶,增强棉株对黄萎病的抗性。
  3.构建了拟南芥乙烯信号路径负调控基因AtCTR1的超量表达载体并转化棉花。研究发现超量表达AtCTR1可以削弱棉株对乙烯的敏感性。且超量表达AtCTR1的棉花材料增强了对黄萎病的抗性,减少了发病过程中的落叶率。
  4.细胞学检测发现接种‘V991’后可诱导棉株叶柄离层的形成。而超量表达AtCTR1可以减缓棉株叶柄离层的形成;基因表达分析发现接种‘V991’导致的棉株落叶与离层形成相关基因,如GhBXL1等基因的表达有关,但超量表达AtCTR1后抑制这些基因的表达。
  以上结果表明黄萎病菌可诱导棉花乙烯的合成,并激活叶柄离层形成相关基因的表达促进落叶。在抑制棉花乙烯信号路径后可显著降低接种强致病力落叶型黄萎病菌导致的棉花落叶,显著提高棉花对黄萎病的耐性。以上研究结果为通过调控棉花乙烯合成或信号路径防控黄萎病的发生或降低黄萎病的危害提供了理论基础和技术支持。
[硕士论文] 李青梅
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:橘小实蝇是一种危害严重的实蝇类害虫,CRISPR/Cas9技术作为近年来发展迅速的遗传改造新技术,在实蝇类害虫的防治中具有很大的应用前景。CRISPR/Cas9技术在果蝇、家蚕以及蚊类等昆虫中研究应用比较广泛,包括该技术的建立与优化、功能基因的探索、转基因品系的研究等;而在实蝇类昆虫中的研究则仅限于技术体系的建立,其相关应用鲜有报道。Doublesex(dsx)基因作为昆虫性别决定关键基因,在昆虫性别分化以及生殖中具有重要作用。本研究通过对CRISPR/Cas9系统靶标位点的筛选、比较分析Cas9mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA RNP复合体两种方法的敲除效率,我们建立了橘小实蝇CRISPR/Cas9技术体系,并以此为基础敲除橘小实蝇dsx基因,明确了dsx基因在橘小实蝇生殖发育中的作用。本研究有利于建立橘小实蝇在内的实蝇类害虫的CRISPR/Cas9技术与平台,并证明了dsx基因作为遗传改造的靶标基因在生物防治应用中的潜力,为橘小实蝇的遗传改造及绿色防控提供了理论和技术基础。
  1.Bddsx基因克隆与分析
  我们通过对Bddsx基因的克隆,补充了Bddsx基因组序列,增补的序列范围在NW_011876346.1:1203133-1203607(475bp)内。通过分析Bddsx与其近缘物种的进化关系,发现橘小实蝇dsx基因与橄榄果实蝇同源性最高,同源性高达98%。对Bddsx基因剪接模式分析,发现Bddsx基因有2个雄特异性区域和1个雌特异性区域,BddsxF以第3外显子进行跳跃式剪接;BddsxM在5'端以第2外显子进行跳跃式剪接,在3'端则以第3外显子5'端剪接方式进行剪接;同时还找到了与剪接识别相关的A5SS识别位点、PRE序列以及4个tra/tra-2结合位点。此外,Bddsx基因表达模式研究分析表明,BddsxF在雌成虫阶段高表达,在胸部、头部、肠道以及脂肪体等组织中表达较高;BddsxM则是在雄成虫阶段高表达,且在精巢中表达最高。
  2.靶标位点设计与筛选
  利用在线工具,我们在Bddsx基因的雌特异性区域设计了7个候选靶标位点,分别对其方向、靶标位置、sgRNA转录效率及切割效率进行了分析。在靶标位置方向上,位于正义链与反义链的靶标位点分别有4个(sg-f2、sg-f4、sg-f5和sg-f6)和3个(sg-f1、sg-f3和sgf7);其sgRNA切割位点的位置顺序(距离)依次为sg-f1(+1)、sg-f3(+127)、sg-f4(+152)、sg-f2(+182)、sg-f5(+330)、sg-f6(+365)和sg-f7(+405)。对sgRNA转录效率分析结果表明:sg-f7转录效果最好,电泳条带灰度值为94.0;sg-f3次之,灰度值为81.9;其次为sg-f4,灰度值为42.3;sg-f1,sg-f2和sg-f5转录效果较差,灰度值分别为6.4,16.7和5.4;sg-f6没有成功转录。对sgRNA体外酶切活性检测结果表明:sg-f1和sg-f4切割效率最高,分别为74.3%和72.9%;sg-f3和sg-f5效率分别是28.9%和28.3%;sg-f7效率为15.1%;sg-f2没有检测到切割活性。综合考虑上述4个方面的因素,我们选择了sg-f4和sg-f7作为后续研究的靶标位点。
  3.基于Cas9mRNA和蛋白的CRISPR/Cas9系统效率评估
  通过对橘小实蝇胚胎注射Cas9mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA复合体,统计分析其存活率、突变个体比例,评估BddsxF基因删除效率以及sgRNA脱靶效应,研究比较Cas9mRNA/sgRNA和蛋白/sgRNA两种方法基因编辑的效率。结果表明:注射Cas9mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA的胚胎最终存活率分别是7.7%和2.0%;Cas9蛋白/sgRNA介导的基因片段删除效率高于Cas9mRNA/sgRNA(Student's t检验,P<0.05),平均删除效率分别为47.8%和28.1%;注射Cas9mRNA/sgRNA F0中突变个体占56.2%,注射Cas9蛋白/sgRNA F0中突变个体占67.7%。此外,通过对脱靶位点的检测分析,并没有发现明显地脱靶现象,说明在橘小实蝇中CRISPR/Cas9系统基因编辑特异性很高。综合考虑胚胎存活率、基因删除效率以及橘小实蝇突变个体比例,确定了Cas9mRNA/sgRNA是研究Bddsx基因的最适方法。
  4.Bddsx基因功能研究
  利用上述建立的橘小实蝇CRISPR/Cas9技术体系敲除BddsxF基因,研究Bddsx基因在生殖系统发育以及性特征维持中的作用,结果表明:BddsF基因敲除(dsxF-)后,橘小实蝇生殖力显著降低,dsxF-雌虫后代平均孵化率为5.9%,dsxF-雄虫后代平均孵化率则是28.2%;部分dsxF-个体(如M2)后代出现雄性化的倾向(雌雄比小于1∶1),但没有显著性差异(卡方测验,P(x2c<x20.05,1=3.84)>0.05)。与野生型相比,dsxF-蛹壳颜色较浅,少数雄虫腹部4~5节颜色加深,腹侧呈现黄色斑点;正常雌虫有2个大小相近的贮精囊,而dsxF-则出现2个以上,且比正常贮精囊小,贮精囊异常雌虫占雌虫总数的25.0%。
[博士论文] TAMSILA NAZIR
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:5-羟色胺是单胺类神经递质,它是植物和动物许多行为和生理过程重要的调节子,主要存在于中枢神经系统中。研究表明,尽管使用改进的杀虫剂、实施害虫综合治理措施、改变耕作方式,褐飞虱仍然很难受到控制。
  在以蔗糖饲喂褐飞虱的过程中,使用刺探电位技术得到五个不同的波形。100ppm(26.97±6.07mm)和1000ppm(89.90±28.97min)剂量的5-羟色胺的添加延长了褐飞虱将口针插入食物的时间。而饲喂5-羟色胺时,平均摄入时间和总摄入时间无明显差异。
  在100ppm剂量下,5-羟色胺受体拮抗剂酮色林、盐酸米安色林和盐酸育亨宾显著增加了褐飞虱非进食持续时间。在25ppmand100ppm剂量下,酮色林显著增加了褐飞虱平均和总非进食持续时间。盐酸米安色林和盐酸育亨宾显著地降低了平均进食比例。在200ppm的剂量下,盐酸米安色林和盐酸育亨宾分别降低了25%和31%进食量。
  甲基多巴是一种芳香L-氨基酸脱羧酶抑制剂。添加200ppm浓度时,饲喂过程中的平均总非进食时间延长,总进食时间缩短。与对照相比,总非进食时间增长了29%。
  当饲喂5-羟色胺(1000ppm),酮色林(25ppm,100ppm),盐酸米安色林(200ppm,400ppm),盐酸育亨宾(200ppm,400ppm)和甲基多巴(100ppm,200ppm)时,褐飞虱将口针插入食物的时间显著延长。盐酸米安色林的饲喂结果显示,只有25%的褐飞虱在200ppm和400ppm浓度时进食。
  用刺探电位技术分析褐飞虱的进食行为,结果显示5-羟色胺系统对褐飞虱的进食有抑制作用。鉴于此,我们认为5-羟色胺系统在褐飞虱进食中扮演着重要作用。
[博士论文] 王丽君
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:光是昆虫生长发育的重要因子之一,与昆虫自然生境不同的光源可对其造成光胁迫。棉铃虫Helicoverpa armigera(H.armigera)是典型性的夜行趋光昆虫,但是夜间人工光源会对其产生胁迫作用,对其寿命、繁殖力和抗氧化酶系都产生了影响。截至目前对于昆虫响应光胁迫的相关研究还少有报道,昆虫的趋光机理亦不明确。本研究解析了棉铃虫对长期光胁迫的生物学响应,构建了棉铃虫的头部转录组并解析了其响应光胁迫的差异表达基因,鉴定了棉铃虫响应光胁迫的神经肽基因并明确其表达特征,比较了棉铃虫和模式昆虫果蝇响应光胁迫时热激蛋白的表达特点,这些研究对阐明棉铃虫响应光胁迫的特点及分子机制具有重要意义,为阐明昆虫趋光机理提供理论基础。主要结果如下:
  1.棉铃虫对光胁迫的生物学响应
  本研究测定了长时间的紫外光胁迫对棉铃虫寿命、产卵、幼虫及蛹的发育历期,研究结果表明,棉铃虫在长期的光胁迫下,成虫、幼虫和蛹的发育历期都比对照组显著延长,总产卵量并无显著差异。光胁迫组蛹的过冷却点明显上升。
  2.棉铃虫头部转录组数据库的构建及响应光胁迫的差异表达基因研究
  棉铃虫雌成虫在UVA、白光及黑暗对照的头部混合样品构建转录组,共拼接52,513个Unigene,在7个不同数据库中功能注释成功的Unigene个数为:27,958(NR:53.24%)、17,105(NT:32.57%)、18,347(SwissProt:34.94%)、19,031(KOG:36.24%)、19,797(KEGG:37.70%)、143(GO:0.27%)以及19,167(InterPro:36.50%)。差异基因分析显示,UVA组与黑暗组相比,表达下调基因为33761条,上调基因17087条,总差异基因为50848条。其中,注释为p450、热激蛋白、神经肽的差异基因的数量分别为117、62、13条。这些数据提供了棉铃虫在转录水平上响应光胁迫的重要信息库,有助于解析棉铃虫光胁迫相关通路和生物过程。
  3.棉铃虫响应光胁迫的神经肽基因的鉴定及表达
  获得了34、17和58个编码神经肽、前体酶以及受体基因的unigenes。雄虫IMFamide、leucokinin和sNPF基因在响应光胁迫的过程中发生了转录水平的显著改变,其中sNPF上调表达,IMFamide,leucokinin下调表达。但雌虫神经肽基因并无改变。
  4.棉铃虫和模式昆虫果蝇热激蛋白响应光胁迫的表达
  鉴定出11个棉铃虫热激蛋白基因Hsp19.5(KX845558)、Hsp19.7(KX845559)、Hsp20.0(KX845560)、Hsp20.7(KX845561)、Hsp20.8(KX845562)、Hsp21.4(KX845563)、Hsp22.0(KX845564)、Hsp27.2(KX845565)、Hsp60(KX845566)、HSC70(KX845566)和HSC90(KX845566),结合模式昆虫果蝇已报到的11个热激蛋白基因,研究了他们在响应光胁迫后的表达模式,发现热激蛋白家族基因互相作用共同抵御光胁迫。光胁迫诱导高水平上调表达的果热激蛋白基因的起始密码子的上游区域存在的与抗性相关的转录因子结合域。
[硕士论文] 张臻
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:小麦赤霉病(Wheat Head Blight)是小麦生产上常见的病害,其发生对我国小麦生产造成了巨大的损失。禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)是该病的主要病原菌之一,由于抗病品种的缺乏,在生产上较难控制该病的发生,在小麦扬花期喷施化学农药能够在一定程度上控制该病的发生,也是目前防治小麦赤霉病最有效的方法。小麦茎基腐病(Wheat crown rot)是一种在世界范围内广泛流行的土传真菌病害,该病的病原菌具有多样性,禾谷镰孢菌是其主要病原之一。目前,在生产上防治小麦茎基腐病的主要方法是在小麦返青-拔节期喷施化学农药,但是化学农药的大量使用造成的环境问题,如土壤污染、水体污染等也日益突出。另外,由于禾谷镰孢菌抗药性的产生,使人们加大了化学农药的使用,从而形成恶性循环。生物防治以绿色无污染等优势受到了国内外相关研究人员的关注。本文针对白囊耙齿菌(Irpex lacteus)和解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)对小麦赤霉病和小麦茎基腐病的防治效果进行了研究,其结论如下:
  1.利用室内平板对峙试验发现白囊耙齿菌DK6在PDA平板上与禾谷镰孢菌PH-1之间没有出现抑菌带,但是DK6可以覆盖到PH-1上继续生长,而在靠近DK6一侧的由PH-1产生的红色色素被降解。20%浓度的DK6发酵液对PH-1菌丝的生长抑制率为24.87%。在双皿对扣试验中,DK6发酵液释放的挥发性气体对PH-1菌丝的生长抑制作用较弱,通过显微观察发现,被抑制的PH-1菌丝尖端出现了分叉。
  2.从小麦植株内分离得到的解淀粉芽胞杆菌HZ-25在与禾谷镰孢菌PH-1平板对峙试验中,其对PH-1的菌丝生长抑制率达到69.92%,HZ-25的发酵液对PH-1的菌丝生长也具有抑制作用,在含20%HZ-25发酵液的培养基上,HZ-25发酵液对PH-1的菌丝生长抑制率高达69.21%。HZ-25产生的挥发性气体对PH-1的菌丝生长抑制率为40.04%,其效果低于发酵液的效果。经过形态鉴定及分子鉴定得出芽胞杆菌HZ-25为一株解淀粉芽胞杆菌。
  3.采用室内盆栽试验探究了白囊耙齿菌DK6和解淀粉芽胞杆菌HZ-25对小麦茎基腐的防治效果,以及对小麦生长的促生作用。结果显示DK6和HZ-25都能有效地防治小麦茎基腐病,且与50%多菌灵可湿性粉剂防治效果相当。在预防试验中,菌株HZ-25对小麦茎基腐病的防效可达51.11%,略高于菌株DK6的46.67%;而抑病试验中,菌株DK6的防效为43.78%,低于菌株HZ-25的46.15%。分析两株菌株发酵液对小麦幼苗生长的影响,与清水对照中小麦苗相比,白囊耙齿菌DK6发酵液处理后的小麦苗株高增加6.23cm,而解淀粉芽胞杆菌HZ-25的发酵液处理后的小麦苗株高增加5.08cm。
  4.田间试验探究了菌株DK6和菌株HZ-25对小麦赤霉病的防治效果,结果显示HZ-25菌悬液对小麦赤霉病的相对防效为42.42%,而DK6发酵液对小麦赤霉病的相对防效为37.88%,略低于HZ-25菌悬液,且两种处理的相对防效在0.05水平上比较时不存在显著性差异。另外,DK6发酵液对小麦的产量有一定的促进作用,相对于清水对照,经过DK6发酵液处理后的小麦千粒重增加了4.36g。
  本文发现了具有生防潜力的禾谷镰孢菌PH-1拮抗菌株白囊耙齿菌DK6和解淀粉芽胞杆菌HZ-25,以期可以替代化学农药,为小麦赤霉病和茎基腐病提供一种简单有效的生物防治方法。另外,本文关于白囊耙齿菌DK6防治小麦赤霉病和茎基腐病的研究,弥补了该菌在防治赤霉病和茎基腐病方面的空白,为后期的深入探究提供了重要的理论依据。
[硕士论文] 花翔旻
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:镰刀菌(Fusarium spp0)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight)是一种世界性分布的小麦真菌病害,严重影响小麦产量和品质。小麦赤霉病在我国长江中下游冬麦区、东北春麦区以及华北南麦区发病严重。板栗疫病菌中发现的CHV1在欧洲栗疫病防控中成功应用,以及在核盘菌中发现的DNA病毒SsHADV-1可在田间降低菌核病发病率,表明真菌病毒防控植物病害是生物防治的重要策略之一。本研究通过高通量测序技术对亚细亚镰刀菌携带的病毒多样性进行了初步分析,为病毒用于赤霉病的防治提供潜在的病毒资源。本研究获得以下主要研究结果:
  对采集自湖北省的孝感市、随州市广水和随县,以及江苏省南京市感染镰刀菌的罹患小麦赤霉病菌的397个病穗进行病原菌分离,最终获得纯化的菌株350株,且均为亚细亚镰刀菌(Fusarium asiaticum)。对分离的这些菌株进行宏病毒组测序,共获得68个与病毒具有同源性的contigs序列信息,是潜在的病毒基因组序列。同源性分析表明,这些病毒的核酸类型有正单链RNA病毒、负单链RNA病毒、双链RNA病毒。其中正单链RNA病毒比例占63%,主要隶属于减病毒科、裸露病毒科、甲型线性病毒科、镰刀菌病毒科以及未分类的病毒;负单链RNA病毒占10%,主要隶属于真菌负义链病毒科、布尼亚病毒目;双链RNA病毒占27%,主要隶属于双分病毒科、灰葡萄孢双节段病毒科及未分类的病毒。以上结果表明分离的亚细亚镰刀菌菌株中含有丰富的病毒资源。
  对亚细亚镰刀菌布尼亚病毒Fusarium asiatieum bunyavirus1(FaBV1)的分子特性及其对寄主的影响进行了分析。利用宏病毒组测序获得病毒FaBV1的部分eDNA序列,结合RACE的方法获得FaBV1基因组的L(Large)和S(Small)片段的全长eDNA序列,但没有获得M(Middle)片段的序列信息。L片段全长含有6468个核昔酸,其互补链包含一个开放性阅读框(ORF),推定编码含有布尼亚病毒复制酶保守结构域的L蛋白。S片段的cDNA全长含有1420个核苷酸,其互补链包含一个ORF,推定编码病毒的核衣壳蛋白。FaBV1基因组的L和S片段末端有11个核苷酸序列高度保守(3’-UGUGUUUCUGG--CCAGAAACACA-5’),且5’和3’端保守序列反向互补。基于病毒L蛋白和核衣壳蛋白序列进行多重比对分析,并与已知的布尼亚目病毒进行聚类分析,表明FaBV1隶属于布尼亚病毒目中,但与布尼亚病毒目中其他病毒科病毒不聚在一支,具有独立性;结合病毒自然寄主的差异,建议以FaBVI作为一个模式种,建立一个新病毒科镰刀布尼亚病毒科(Fusarbunyaviridae)和新属亚细亚镰刀菌布尼亚病毒属(Fusarbunyavirus)。分离获得100个被病毒FaBV1感染菌株XG-7的单分生孢子分离物中,仅有2个分离物中携带病毒FaBV1,分生孢子携带病毒率为2%,表明FaBV1经分生孢子传播效率低。比较分析不携带FaBV1的分离物xg-7-001vf和携带病毒的分离物xg-7-022的生物学特性,携带病毒FaBV1的菌株生长速度缓慢,致病力降低,但产赤霉菌毒素无显著性差异,表明病毒FaBV1与寄主亚细亚镰刀菌低毒特性具有相关性,但与毒素产生无关。本研究分析了亚细亚镰刀菌中真菌病毒存在丰富的多样性,为布尼亚病毒在真菌中的起源和进化提供了新的研究材料。
[硕士论文] ANUM BASHIR
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是一种已被深入研究的革兰氏阴性植物病原细菌,但该菌对动物如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的致病性最近也已被研究证实。铁是自然环境中最丰富的元素之一,但其生物利用率一直相对较低。多种不同的微生物类群已经发展出具有对铁具有高亲和性能的铁吸收系统,包括血红素摄取系统、铁载体系统和细胞膜受体等。假单胞菌属(Pseudomonas)的主要铁载体是pyoverdine。它是一种低分子量、高亲和力的铁清除荧光分子,仅在铁限制条件下由荧光假单胞细菌群产生。除了具有对铁的吸收性能,铁载体pyoverdine也可以作为细菌毒素。本学位论文主要研究了基于液体培养条件下的线虫致病模型中,在铁限制条件下丁香假单胞菌野生菌株MB03和秀丽隐杆线虫之间的相互作用,以及铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌致病性中的作用。
  鉴于铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aerugionosa)PAO1菌株已经鉴定出几乎所有与pyoverdine生物合成和分泌相关的基因,使用PAO1菌株的pyoverdin基因簇作为参考序列,利用在线工具Anti-SMASH对丁香假单胞菌MB03基因组中pyoverdine编码基因簇进行了预测和定位分析。结果发现,发现丁香假单胞菌MB03中缺少5个与PAO1中的直系统同源基因(pvdX,pvdY,pvdA,pvdF和fpvI)。在这些基因中,pvdX和pvdY编码调节蛋白;pvdA和pvdF编码合成N5-甲酰基-N5羟基鸟氨酸残基所需的酶,这些残基存在于PAO1的pyoverdine的肽链中。但在MB03的pyoverdine基因簇中也存在一种为PAO1中所没有的基因,即syrP。推测syrP的编码产物可能参与存在于MB03-PVD肽链中的羟基天冬氨酸残基的β-羟基化作用此外,在PAO1中,两个Sigma因子编码基因pvdS和fpvI分别参与pyoverdine生物合成和pyoverdine受体FpvA的激活,但是,在丁香假单胞菌MB03的基因组中不存在fpvI,而是在fpvA基因的前面有一个pvdS IS基因框,表明在丁香假单胞菌MB03中的pvdS可能参与fpvA基因的转录。
  Pyoverdine在结构上由3个不同的结构域组成,即生色团(最保守的部分)、肽链(最可变部分)和侧链(羧酸衍生物)。在MB03的铁载体pyoverdine基因簇中的非核糖体基的多肽合成酶(NRPS)基因编码参与pyoverdine的肽链和发色团部分合成的一种大分子量酶。通过NRPS预测因子对丁香假单胞菌MB03的5个推定的NRPS基因进行计算机模拟表征表明,MB03-PVD的肽链呈线性形式并且由L-1ys,D-Asp,L-Thr,L-Thr,L-Ser,D-Asp和L-Ser。经测定铁载体pyoverdine特定光吸收值,发现MB03产生的pyoverdine与培养基中的Fe3+浓度成反比,而铁对于pyovidine生产的临界抑制浓度约为20μmol/L。
  通过使用RecTE重组系统来进行pyoverdine生物合成2个相关基因的中断,获得了相应基因中断突变株ΔpvdD和ΔpvdJ。由于pyoverdine是一种分泌的非核糖体多肽,所以可通过LC-MS和荧光光吸收测定来鉴定中断菌株是否丧失产铁载体pyoverdine的活性。结果发现,两株突变株的破碎细胞滤液均缺乏pyoverdine特征性的黄绿色荧光,表明突变株未能产生pyoverdine。经质谱鉴定,2株突变株也缺乏pyovine的特征峰,而野生型MB03产生了具有1123.412m/z和1142.4165m/z的两类pyovidine。
  为调查铁在MB03对线虫致病性中的作用,在添加或不添加铁的M9培养基中来培养MB03菌株,然后进行对秀丽隐杆线虫的杀虫生物测定。由于Pyoverdine也有助于在丁香假单胞菌中发现的几种常见致病因子(如AHL,EPS和Tabtoxin)的产生,因此,pyoverdine有可能在培养过程中由于铁在培养基浓度的不同从而调节了细胞毒性、并导致对线虫杀虫效果的差异性。为验证这一假设,将过夜MB03培养物产生的滤液分成两半,其中之一添加额外的100μmol/L铁并培养过夜。生物测定结果发现,野生菌株MB03导致供测线虫的显著性致死(p=0),但通过在M9中添加外源铁(100μmol/L)或通过在MB03过夜培养物中直接添加外源铁的细胞滤液可在一定程度上减小致死率。此外,液相生物测定的致死效应通常发生在培养30h之后,因此,足够的培养时间对于细菌的致死作用也是进行生物测定时要考虑的。
  将基因中断突变株ΔpvdD和ΔvdJ与野生菌株MB03在贫铁的M9培养基中生长后进行液相杀虫生物测定,另外,使用纯化铁载体pyoverdine进行相应生物测定,因为推测pyoverdine可能是具有杀虫活性的MB03滤液中的一种作用导致线虫死亡的活性因子。在液相生物测定中使用的纯化pyoverdine的浓度与在MB9中在48h内在M9培养基中产生的pyoverdine的浓度相当。测量暴露于各种滤液的线虫的相对死亡率,结果如预期相符:与M9和大肠杆菌(Escherichia coli OP50滤液相比,MB03滤液显示显着的杀死作用(p=0),而两种突变株的杀虫试验都没有发现线虫死亡。
  为了证实突变体的减毒活性是由于缺乏pyoverdine产生的,将纯化的pyoverdine加入突变体中以测量与野生型相当的相对死亡率,结果证实pyoverdine是导致线虫死亡的细菌滤液中的活性因子。通过pyoverdine生物合成缺陷的突变株的减毒活性、以及两突变株在添加纯化的pyoverdine后又可杀线虫的实验结果可以证实,pyoverdine在MB03介导的液相杀虫实验中是决定杀虫活性的重要因素。此外,通过测量MB03和两种突变株的生长曲线,发现突变株在贫铁M9培养基中生长缓慢。因此,这表明pyoverdine对丁香假单胞菌MB03生长也是至关重要的。
  总之,本研究结果表明,丁香假单胞菌MB03具有产生pyoverdine的遗传潜力。通过RecTE重组系统构建获得2株pyoverdine生物合成缺陷的基因中断突变株。铁载体pyoverdine在MB03菌株对秀丽线虫的杀虫活性中发挥重要作用。同时,pyoverdine也是影响宿主细胞生长的重要因素。就我们所知,本项研究是研究丁香假单胞菌铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌与动物宿主之间相互作用的第一例研究。
[硕士论文] 张敏
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:光环境作为自然环境条件中对生物体影响最为重要的可变因素之一,其对昆虫生长发育、呼吸代谢和繁殖能力等方面的影响已为人们所关注。近年来,随着可持续发展和绿色环保概念的不断提出,利用灯光技术防治害虫在现阶段农业中发挥着重要作用。作为新型灯源,LED灯做为诱虫灯的诱捕光源研究较多,但其对昆虫生长发育的研究较少,探索LED灯对昆虫生物学特性的影响将有利于明确昆虫适应生长的光环境条件,解释光环境作为选择压力下昆虫的进化方式,同时也可以作为昆虫生理调节器,用于资源昆虫的生产和害虫的防治,具有重要的理论和应用价值。
  本研究以家蝇Musca domestica、大头金蝇Chrysomyia megacephala、绿盲蝽Apolygus lucorum、黄粉虫Tenebrio molitor和菜粉蝶Pieris rapae为供试昆虫。这5种昆虫属于不同的目,亲缘关系远、具有不同生活习性和取食倾向,具有进化上的代表性。以LED光的波长因素作为变量,确定了12种光环境条件对试虫进行处理,研究不同光环境处理对5种昆虫生长发育的影响制作了昆虫在不同光环境中的种群生命表,为以后物理防治研究的学者提供一些有价值的参考资料。主要结果如下:
  1.不同光环境对家蝇生物学特性的影响
  家蝇成虫羽化率影响最显著的波长是435nm,575nm处理中卵孵化率最低,645nm处理中卵孵化历期最短,幼虫存活率和化蛹率最低的波长分别是460nm和435nm,蓝绿光对家蝇各阶段生长发育和历期存在显著影响,蓝光对家蝇全世代生长发育作用显著;对家蝇雌虫产卵影响最显著的波长是375nm,家蝇在365nm处理中种群趋势指数为1.51,说明该处理下下一代种群增长速度缓慢。
  2.不同光环境对大头金蝇生物学特性的影响
  大头金蝇成虫羽化率影响最显著的波长是435nm。435nm中卵孵化率最低,420nm处理中卵孵化历期最短,幼虫存活率和化蛹率最低和历期最短的波长均为435nm,说明蓝光会降低大头金蝇各阶段的存活情况并缩短幼虫和蛹阶段的发育历期,蓝紫光作用使卵的孵化历期明显降低;大头金蝇在375nm处理下平均产卵量最低,综合分析可知,435nm处理对大头金蝇种群繁殖的限制作用明显。
  3.不同光环境对绿盲蝽生物学特性的影响
  575nm是对绿盲蝽成虫羽化率影响最显著的波长,575nm处理中绿盲蝽卵孵化率和若虫存活率最低,说明黄橙光不利于绿盲蝽卵和若虫的存活发育;435nm和420nm处理中绿盲蝽各阶段发育历期均比较低,说明蓝光降低绿盲蝽的发育历期;435nm对绿盲蝽雌虫产卵量的影响效果显著,种群趋势指数以420nm处理最低,为4.26,说明在不同光环境中绿盲蝽种群均呈现增长趋势,增长最慢的为原来的4.26倍。
  4.不同光环境对黄粉虫生物学特性的影响
  黄粉虫卵期在600nm处理中孵化历期最短,幼虫在575nm处理中发育历期最短,蛹期在600nm处理中发育历期最短,而黄粉虫蛹期处理所得成虫羽化率以365nm最低,说明黄粉虫的存活发育受紫外光和黄橙光的影响显著;全世代处理在435nm中成虫羽化率最低,且存在畸形情况,以短波长较明显,435nm畸形率最高;365nm处理中黄粉虫雌虫产卵量最低,种群趋势指数以375nm处理最低,为24.92,说明在不同光环境中黄粉虫种群均呈现增长趋势,增长最慢的为原来的24.92倍。
  5.不同光环境对菜粉蝶生物学特性的影响
  菜粉蝶幼虫和蛹的存活发育在不同光环境处理下差异显著(P<0.05)。菜粉蝶幼虫在435nm和575nm处理中化蛹率较低,575nm处理中羽化率最低,说明菜粉蝶幼虫阶段受蓝光和黄光影响明显;435nm处理下发育历期最低,说明蓝光可以缩短菜粉蝶蛹期的发育历期。
  6.不同光环境对5种昆虫生物学特性的比较分析
  不同光环境对5种昆虫生物学特性的影响情况存在差异,但生长发育均显著受蓝光影响:对家蝇和大头金蝇生长发育的影响效果最显著,且幼虫和蛹的发育历期明显缩短;不仅对黄粉虫的生长发育影响显著并且出现缺翅等畸形率最高;对绿盲蝽发育和繁殖的影响效果均较显著;对菜粉蝶幼虫阶段发育影响显著,且明显缩短其蛹的发育历期。另外,紫外光降低家蝇和大头金蝇产卵量甚至不产卵;黄橙光不利于绿盲蝽卵和若虫的存活发育;菜粉蝶幼虫阶段发育受黄光影响显著。
[硕士论文] 周玲玲
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:茶轮斑病是危害茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]生产的重要病害,严重时可导致叶片大量脱落,影响茶叶品质和产量,目前在我国茶园中广泛发生。茶拟盘多毛孢(Pestalotiopsis theae)是引起茶轮斑病的优势种。我们前期在田间分离获得了一株致病力丧失的茶拟盘多毛孢菌株LI-41,其较正常菌株表现出菌落形态异常,菌丝生长速度缓慢。本研究是针对菌株LI-41生物学性状发生变化的原因进行了探索,所得结果如下:
  对菌株LI-41和正常菌株(TP-2-2W)的菌丝进行双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)的提取,发现LI-41菌株中含有4条dsRNA片段(dsRNA1-4),随机克隆以及末端克隆测序显示,其大小分别为3387、2831、2599和932nt,分析推测每一条dsRNA分别编码一个独立的开放阅读框(Open-Reading Frame,ORF),依次命名为ORF1、ORF2、ORF3和ORF4。将获得的4条dsRNA序列编码蛋白采用BLASTp与登录在NCBI中的序列比对,显示该病毒ORF1-3编码蛋白与金色病毒属的胶孢炭疽菌金色病毒-1(Colletotrichum gloeosprioides chrysovirus1,CgCV-1)编码蛋白相似性最高,相似率分别为65%、48%和54%,而ORF4编码蛋白未搜到任何病毒的同源序列,我们将其命名为茶拟盘多毛孢金色病毒-1(Pestalotiopsis theae chrysovirus1,PtCV-1)。根据与已知蛋白的相似性推测,PtCV-1的ORF1编码依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase,RdRp),ORF2编码外壳蛋白(Coat protein,CP),ORF3编码甲基转移酶,ORF4所编码的蛋白功能未知。
  采用蔗糖梯度超速离心法提纯PtCV-1的病毒粒体,分别从蔗糖各梯度层的病毒粒子提取核酸,结果显示在20%-50%蔗糖层均存在4条核酸链,大小与从菌丝中提取的4条dsRNA大小一致,其中50%蔗糖层中病毒含量最高。将50%蔗糖层纯化的病毒粒子进行铜网吸附后负染,经透射电镜观察,观察到了球形病毒粒子,其直径为30.1~39.8nm。
  将LI-41诱导产孢,挑选42个分生孢子培养后,进行PtCV-1的dsRN检测,结果显示67%分生孢子再生后代仍含有PtCV-1。将LI-41与分生孢子再生无毒菌株(LI-41-1)对峙培养,在LI-41-1菌落边缘挑取50个菌丝块进行dsRNA检测,结果显示有6个传毒后代检测结果呈阳性,表明PtCV-1可以水平传毒给遗传背景相同的菌株。用PEG介导病毒粒子和核酸转染单孢无毒后代菌株(LI-41-1)的原生质体,然后对转染原生质体的后代菌株进行培养,分别筛选150个原生质体再生后代菌株进行dsRNA检测,结果显示,仅有5个病毒粒子转染后代菌株检测到了PtCV-1的dsRNA条带。由此推测,该病毒的核酸可能不具有侵染性,但可以通过病毒粒子和水平传毒的方式传染给无毒的分生孢子后代菌株中。
  比较分生孢子后代无毒菌株(LI-41-1、LI-41-2、LI-41-3)、原始带毒菌株(LI-41)、分生孢子后代带毒菌株(LI-41-V1、LI-41-V2)、病毒粒子传毒后代菌株(LI-41-1T1、LI-41-1T2、LI-41-1T3)和对峙培养传毒后代菌株(LI-41-1P-1、LI-41-1P-2、LI-41-1P-3)生物学性状表明,带毒菌株和无毒菌株菌落形态和致病力表现显著差异:带毒菌株较无毒菌株均色素增多,菌丝轮纹圈消失;菌落畸形;生长速度降低,正常菌株为6.5-6.7mm/d,带毒菌株为2.0-2.8mm/d;致病力减弱,在来源于云南和广西本地种茶叶上,无毒菌株接种引起的病斑大小分别为11.9-14.1mm和17.5-21.5mm,而带毒菌株没有引起明显的病斑。以上结果表明:PtCV-1侵染茶拟盘多毛孢可引起其菌丝畸形,生长速度减弱和致病力显著降低。
  本研究报道了侵染茶拟盘多毛孢的金色病毒属新成员PtCV-1,并明确该病毒可以引起茶拟盘多毛孢生长异常、生长速度和致病力减弱。据我们所知,这是国际上茶拟盘多毛孢内报道的首例真菌病毒。PtCV-1能够显著改变寄主的致病力,可望进一步应用于茶拟盘多毛孢的生防研究;PtCV-1的发现也是国际首例真菌病毒-茶拟盘多毛孢研究系统,为采用反向遗传学深入研究茶拟盘多毛孢基因功能奠定基础。
[硕士论文] 阳纯
林学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:我国竹质种类繁多,分布范围广泛。崇阳县作为湖北省主要竹产品生产地之一,以雷竹(Phyllostachys praecox)、楠竹(Phyllostachys edulis)、高节竹(Phyllostachys prominens)等为主要经济竹种。近些年,三星竹笋象(Otidognathus sp.)成为危害日益严重的竹类害虫,严重制约当地的经济发展。因此,充分认识三星竹笋象,可为有效地综合防控提供理论基础。但迄今为止,有关三星竹笋象寄主定位的研究尚缺乏报道。本课题以三星竹笋象为研究对象,采用林间观察和室内饲养,借助SEM(扫描电子显微镜)、GC-MS(气相色谱一质谱联用仪)及转录组分析等技术手段,研究了三星竹笋象的生活习性,明确了三星竹笋象感器类型、数量和分布特征及高节竹竹笋挥发物的主要成分,同时,对三星竹笋象触角中参与嗅觉的相关蛋白进行分析,发现昆虫不同嗅觉基因对寄主选择机制行为的影响,以期为害虫防控策提供新的思路。主要结果如下:
  (1)三星竹笋象生活习性
  通过野外观察与室内饲养发现,三星竹笋象成虫和幼虫均危害竹笋,该虫在崇阳县1年发生1代。成虫4月中旬出土,7月下旬林中终见。成虫出土后即刻取食、交配产卵,卵2~3天孵化,幼虫共5龄,3龄期幼虫食量大增。5月下旬老熟幼虫入土,翌年7月上旬羽化成成虫越冬。
  三星竹笋象雌虫的过冷却点为-12.80℃,冰点为-9.22℃。雄虫的过冷却点为-12.46℃,冰点为-8.24℃。雌虫过冷却点和冰点都要低于雄虫,差异不显著性。
  不同恒温条件下饲养三星竹笋象的卵与幼虫,试验发现:15~30℃下,卵、幼虫均能正常发育。卵与1~4龄幼虫的发育起点温度分别为:8.28、12.44、15.42和12.28℃,有效积温分别为:68.05、26.93、36.05和93.58日·度。用线性日度、Logistic及指数模型分别描述三星竹笋象卵、幼虫发育速率与温度的关系,结果表明Logistic模型拟合的效果最优。
  (2)三星竹笋象的种群动态变化研究
  三星竹笋象在崇阳县高节竹竹林的危害高峰期为4月底至5月初,活动时间基本与高节竹竹笋出笋时间保持一致,呈单峰型。分析发现,三星竹笋象种群动态消长主要限制因子为平均气温(X1),主要决策因素为最高气温(X2)。5种拟合函数结果表明平均虫口密度与每周平均气温(X1)和最高气温(X1)建立的Logistic模型拟合效果最好。
  (3)三星竹笋象对寄主挥发物趋向行为反应
  运用Y型嗅觉仪测定三星竹笋象气味源的选择性差异,结果表明:高节竹竹笋气味对三星竹笋象表现出极显著的引诱效应,引诱率为72.5%。通过GC-MS在高节竹竹笋挥发物中共鉴定48种物质,主要以烷烃类(40种)为主,占挥发物总量的86.38%。其次是萜类(9.55%,6种)和醛类(4.08%,2种)。萜类和醛类物质在高节竹竹笋挥发物中相对含量较低,但这两种成分是主要的活性物质,具体是哪一种成分对三星竹笋象行为起调控作用,有待进一步研究。
  (4)三星竹笋象超微结构的观察
  电镜扫描观察发现三星竹笋象共有9种感器类型,26种亚型。分别是毛形感器(ST,3种)、刺形感器(SC,8种)、锥形感器(SB,4种)、芽形感器(SG,4种)、柱形感器(SCY,3种)、叉形感器(SF)、手形感器(SH)、勺形感器(SD)和B(O)hm氏鬃毛(BB)。雌雄成虫感器的类型、数量和分布上均无显著性差异。以触角的感器类型和数量最为丰富。其次是足,足上的感器主要集中在第3附节的跗垫上,感器形态呈勺型。头、前胸背板及鞘翅上均匀地分布芽形感器,在这些部位的外缘都绕有一圈刚毛,感器形态更丰富。
  (5)三星竹笋象成虫触角嗅觉基因的转录组分析
  通过Illumina HiSeqTM2000平台对三星竹笋象成虫触角转录组高通量测序,共获得25982条unigenes,平均长度628bp。有17247条unigenes注释成功,占总数的66.38%。同源性分析显示:三星竹笋象unigenes与中欧山松大小蠹(Dendroctonus ponderosae)序列相似度最高,为56.46%。
  在三星竹笋象触角转录组中共预测到72个嗅觉相关基因,其中,27个OBPs,8个CSPs,16个ORs,18个IRs和3个SNMPs。将预测的嗅觉相关基因与其它物种构建系统发育树,对三星竹笋象的嗅觉基因功能进行分析与预测,为后续对三星竹笋象嗅觉行为机制的研究奠定理论基础。
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