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[硕士论文] 李青梅
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:橘小实蝇是一种危害严重的实蝇类害虫,CRISPR/Cas9技术作为近年来发展迅速的遗传改造新技术,在实蝇类害虫的防治中具有很大的应用前景。CRISPR/Cas9技术在果蝇、家蚕以及蚊类等昆虫中研究应用比较广泛,包括该技术的建立与优化、功能基因的探索、转基因品系的研究等;而在实蝇类昆虫中的研究则仅限于技术体系的建立,其相关应用鲜有报道。Doublesex(dsx)基因作为昆虫性别决定关键基因,在昆虫性别分化以及生殖中具有重要作用。本研究通过对CRISPR/Cas9系统靶标位点的筛选、比较分析Cas9mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA RNP复合体两种方法的敲除效率,我们建立了橘小实蝇CRISPR/Cas9技术体系,并以此为基础敲除橘小实蝇dsx基因,明确了dsx基因在橘小实蝇生殖发育中的作用。本研究有利于建立橘小实蝇在内的实蝇类害虫的CRISPR/Cas9技术与平台,并证明了dsx基因作为遗传改造的靶标基因在生物防治应用中的潜力,为橘小实蝇的遗传改造及绿色防控提供了理论和技术基础。
  1.Bddsx基因克隆与分析
  我们通过对Bddsx基因的克隆,补充了Bddsx基因组序列,增补的序列范围在NW_011876346.1:1203133-1203607(475bp)内。通过分析Bddsx与其近缘物种的进化关系,发现橘小实蝇dsx基因与橄榄果实蝇同源性最高,同源性高达98%。对Bddsx基因剪接模式分析,发现Bddsx基因有2个雄特异性区域和1个雌特异性区域,BddsxF以第3外显子进行跳跃式剪接;BddsxM在5'端以第2外显子进行跳跃式剪接,在3'端则以第3外显子5'端剪接方式进行剪接;同时还找到了与剪接识别相关的A5SS识别位点、PRE序列以及4个tra/tra-2结合位点。此外,Bddsx基因表达模式研究分析表明,BddsxF在雌成虫阶段高表达,在胸部、头部、肠道以及脂肪体等组织中表达较高;BddsxM则是在雄成虫阶段高表达,且在精巢中表达最高。
  2.靶标位点设计与筛选
  利用在线工具,我们在Bddsx基因的雌特异性区域设计了7个候选靶标位点,分别对其方向、靶标位置、sgRNA转录效率及切割效率进行了分析。在靶标位置方向上,位于正义链与反义链的靶标位点分别有4个(sg-f2、sg-f4、sg-f5和sg-f6)和3个(sg-f1、sg-f3和sgf7);其sgRNA切割位点的位置顺序(距离)依次为sg-f1(+1)、sg-f3(+127)、sg-f4(+152)、sg-f2(+182)、sg-f5(+330)、sg-f6(+365)和sg-f7(+405)。对sgRNA转录效率分析结果表明:sg-f7转录效果最好,电泳条带灰度值为94.0;sg-f3次之,灰度值为81.9;其次为sg-f4,灰度值为42.3;sg-f1,sg-f2和sg-f5转录效果较差,灰度值分别为6.4,16.7和5.4;sg-f6没有成功转录。对sgRNA体外酶切活性检测结果表明:sg-f1和sg-f4切割效率最高,分别为74.3%和72.9%;sg-f3和sg-f5效率分别是28.9%和28.3%;sg-f7效率为15.1%;sg-f2没有检测到切割活性。综合考虑上述4个方面的因素,我们选择了sg-f4和sg-f7作为后续研究的靶标位点。
  3.基于Cas9mRNA和蛋白的CRISPR/Cas9系统效率评估
  通过对橘小实蝇胚胎注射Cas9mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA复合体,统计分析其存活率、突变个体比例,评估BddsxF基因删除效率以及sgRNA脱靶效应,研究比较Cas9mRNA/sgRNA和蛋白/sgRNA两种方法基因编辑的效率。结果表明:注射Cas9mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA的胚胎最终存活率分别是7.7%和2.0%;Cas9蛋白/sgRNA介导的基因片段删除效率高于Cas9mRNA/sgRNA(Student's t检验,P<0.05),平均删除效率分别为47.8%和28.1%;注射Cas9mRNA/sgRNA F0中突变个体占56.2%,注射Cas9蛋白/sgRNA F0中突变个体占67.7%。此外,通过对脱靶位点的检测分析,并没有发现明显地脱靶现象,说明在橘小实蝇中CRISPR/Cas9系统基因编辑特异性很高。综合考虑胚胎存活率、基因删除效率以及橘小实蝇突变个体比例,确定了Cas9mRNA/sgRNA是研究Bddsx基因的最适方法。
  4.Bddsx基因功能研究
  利用上述建立的橘小实蝇CRISPR/Cas9技术体系敲除BddsxF基因,研究Bddsx基因在生殖系统发育以及性特征维持中的作用,结果表明:BddsF基因敲除(dsxF-)后,橘小实蝇生殖力显著降低,dsxF-雌虫后代平均孵化率为5.9%,dsxF-雄虫后代平均孵化率则是28.2%;部分dsxF-个体(如M2)后代出现雄性化的倾向(雌雄比小于1∶1),但没有显著性差异(卡方测验,P(x2c<x20.05,1=3.84)>0.05)。与野生型相比,dsxF-蛹壳颜色较浅,少数雄虫腹部4~5节颜色加深,腹侧呈现黄色斑点;正常雌虫有2个大小相近的贮精囊,而dsxF-则出现2个以上,且比正常贮精囊小,贮精囊异常雌虫占雌虫总数的25.0%。
[博士论文] TAMSILA NAZIR
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:5-羟色胺是单胺类神经递质,它是植物和动物许多行为和生理过程重要的调节子,主要存在于中枢神经系统中。研究表明,尽管使用改进的杀虫剂、实施害虫综合治理措施、改变耕作方式,褐飞虱仍然很难受到控制。
  在以蔗糖饲喂褐飞虱的过程中,使用刺探电位技术得到五个不同的波形。100ppm(26.97±6.07mm)和1000ppm(89.90±28.97min)剂量的5-羟色胺的添加延长了褐飞虱将口针插入食物的时间。而饲喂5-羟色胺时,平均摄入时间和总摄入时间无明显差异。
  在100ppm剂量下,5-羟色胺受体拮抗剂酮色林、盐酸米安色林和盐酸育亨宾显著增加了褐飞虱非进食持续时间。在25ppmand100ppm剂量下,酮色林显著增加了褐飞虱平均和总非进食持续时间。盐酸米安色林和盐酸育亨宾显著地降低了平均进食比例。在200ppm的剂量下,盐酸米安色林和盐酸育亨宾分别降低了25%和31%进食量。
  甲基多巴是一种芳香L-氨基酸脱羧酶抑制剂。添加200ppm浓度时,饲喂过程中的平均总非进食时间延长,总进食时间缩短。与对照相比,总非进食时间增长了29%。
  当饲喂5-羟色胺(1000ppm),酮色林(25ppm,100ppm),盐酸米安色林(200ppm,400ppm),盐酸育亨宾(200ppm,400ppm)和甲基多巴(100ppm,200ppm)时,褐飞虱将口针插入食物的时间显著延长。盐酸米安色林的饲喂结果显示,只有25%的褐飞虱在200ppm和400ppm浓度时进食。
  用刺探电位技术分析褐飞虱的进食行为,结果显示5-羟色胺系统对褐飞虱的进食有抑制作用。鉴于此,我们认为5-羟色胺系统在褐飞虱进食中扮演着重要作用。
[博士论文] 王丽君
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:光是昆虫生长发育的重要因子之一,与昆虫自然生境不同的光源可对其造成光胁迫。棉铃虫Helicoverpa armigera(H.armigera)是典型性的夜行趋光昆虫,但是夜间人工光源会对其产生胁迫作用,对其寿命、繁殖力和抗氧化酶系都产生了影响。截至目前对于昆虫响应光胁迫的相关研究还少有报道,昆虫的趋光机理亦不明确。本研究解析了棉铃虫对长期光胁迫的生物学响应,构建了棉铃虫的头部转录组并解析了其响应光胁迫的差异表达基因,鉴定了棉铃虫响应光胁迫的神经肽基因并明确其表达特征,比较了棉铃虫和模式昆虫果蝇响应光胁迫时热激蛋白的表达特点,这些研究对阐明棉铃虫响应光胁迫的特点及分子机制具有重要意义,为阐明昆虫趋光机理提供理论基础。主要结果如下:
  1.棉铃虫对光胁迫的生物学响应
  本研究测定了长时间的紫外光胁迫对棉铃虫寿命、产卵、幼虫及蛹的发育历期,研究结果表明,棉铃虫在长期的光胁迫下,成虫、幼虫和蛹的发育历期都比对照组显著延长,总产卵量并无显著差异。光胁迫组蛹的过冷却点明显上升。
  2.棉铃虫头部转录组数据库的构建及响应光胁迫的差异表达基因研究
  棉铃虫雌成虫在UVA、白光及黑暗对照的头部混合样品构建转录组,共拼接52,513个Unigene,在7个不同数据库中功能注释成功的Unigene个数为:27,958(NR:53.24%)、17,105(NT:32.57%)、18,347(SwissProt:34.94%)、19,031(KOG:36.24%)、19,797(KEGG:37.70%)、143(GO:0.27%)以及19,167(InterPro:36.50%)。差异基因分析显示,UVA组与黑暗组相比,表达下调基因为33761条,上调基因17087条,总差异基因为50848条。其中,注释为p450、热激蛋白、神经肽的差异基因的数量分别为117、62、13条。这些数据提供了棉铃虫在转录水平上响应光胁迫的重要信息库,有助于解析棉铃虫光胁迫相关通路和生物过程。
  3.棉铃虫响应光胁迫的神经肽基因的鉴定及表达
  获得了34、17和58个编码神经肽、前体酶以及受体基因的unigenes。雄虫IMFamide、leucokinin和sNPF基因在响应光胁迫的过程中发生了转录水平的显著改变,其中sNPF上调表达,IMFamide,leucokinin下调表达。但雌虫神经肽基因并无改变。
  4.棉铃虫和模式昆虫果蝇热激蛋白响应光胁迫的表达
  鉴定出11个棉铃虫热激蛋白基因Hsp19.5(KX845558)、Hsp19.7(KX845559)、Hsp20.0(KX845560)、Hsp20.7(KX845561)、Hsp20.8(KX845562)、Hsp21.4(KX845563)、Hsp22.0(KX845564)、Hsp27.2(KX845565)、Hsp60(KX845566)、HSC70(KX845566)和HSC90(KX845566),结合模式昆虫果蝇已报到的11个热激蛋白基因,研究了他们在响应光胁迫后的表达模式,发现热激蛋白家族基因互相作用共同抵御光胁迫。光胁迫诱导高水平上调表达的果热激蛋白基因的起始密码子的上游区域存在的与抗性相关的转录因子结合域。
[硕士论文] 张臻
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:小麦赤霉病(Wheat Head Blight)是小麦生产上常见的病害,其发生对我国小麦生产造成了巨大的损失。禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)是该病的主要病原菌之一,由于抗病品种的缺乏,在生产上较难控制该病的发生,在小麦扬花期喷施化学农药能够在一定程度上控制该病的发生,也是目前防治小麦赤霉病最有效的方法。小麦茎基腐病(Wheat crown rot)是一种在世界范围内广泛流行的土传真菌病害,该病的病原菌具有多样性,禾谷镰孢菌是其主要病原之一。目前,在生产上防治小麦茎基腐病的主要方法是在小麦返青-拔节期喷施化学农药,但是化学农药的大量使用造成的环境问题,如土壤污染、水体污染等也日益突出。另外,由于禾谷镰孢菌抗药性的产生,使人们加大了化学农药的使用,从而形成恶性循环。生物防治以绿色无污染等优势受到了国内外相关研究人员的关注。本文针对白囊耙齿菌(Irpex lacteus)和解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)对小麦赤霉病和小麦茎基腐病的防治效果进行了研究,其结论如下:
  1.利用室内平板对峙试验发现白囊耙齿菌DK6在PDA平板上与禾谷镰孢菌PH-1之间没有出现抑菌带,但是DK6可以覆盖到PH-1上继续生长,而在靠近DK6一侧的由PH-1产生的红色色素被降解。20%浓度的DK6发酵液对PH-1菌丝的生长抑制率为24.87%。在双皿对扣试验中,DK6发酵液释放的挥发性气体对PH-1菌丝的生长抑制作用较弱,通过显微观察发现,被抑制的PH-1菌丝尖端出现了分叉。
  2.从小麦植株内分离得到的解淀粉芽胞杆菌HZ-25在与禾谷镰孢菌PH-1平板对峙试验中,其对PH-1的菌丝生长抑制率达到69.92%,HZ-25的发酵液对PH-1的菌丝生长也具有抑制作用,在含20%HZ-25发酵液的培养基上,HZ-25发酵液对PH-1的菌丝生长抑制率高达69.21%。HZ-25产生的挥发性气体对PH-1的菌丝生长抑制率为40.04%,其效果低于发酵液的效果。经过形态鉴定及分子鉴定得出芽胞杆菌HZ-25为一株解淀粉芽胞杆菌。
  3.采用室内盆栽试验探究了白囊耙齿菌DK6和解淀粉芽胞杆菌HZ-25对小麦茎基腐的防治效果,以及对小麦生长的促生作用。结果显示DK6和HZ-25都能有效地防治小麦茎基腐病,且与50%多菌灵可湿性粉剂防治效果相当。在预防试验中,菌株HZ-25对小麦茎基腐病的防效可达51.11%,略高于菌株DK6的46.67%;而抑病试验中,菌株DK6的防效为43.78%,低于菌株HZ-25的46.15%。分析两株菌株发酵液对小麦幼苗生长的影响,与清水对照中小麦苗相比,白囊耙齿菌DK6发酵液处理后的小麦苗株高增加6.23cm,而解淀粉芽胞杆菌HZ-25的发酵液处理后的小麦苗株高增加5.08cm。
  4.田间试验探究了菌株DK6和菌株HZ-25对小麦赤霉病的防治效果,结果显示HZ-25菌悬液对小麦赤霉病的相对防效为42.42%,而DK6发酵液对小麦赤霉病的相对防效为37.88%,略低于HZ-25菌悬液,且两种处理的相对防效在0.05水平上比较时不存在显著性差异。另外,DK6发酵液对小麦的产量有一定的促进作用,相对于清水对照,经过DK6发酵液处理后的小麦千粒重增加了4.36g。
  本文发现了具有生防潜力的禾谷镰孢菌PH-1拮抗菌株白囊耙齿菌DK6和解淀粉芽胞杆菌HZ-25,以期可以替代化学农药,为小麦赤霉病和茎基腐病提供一种简单有效的生物防治方法。另外,本文关于白囊耙齿菌DK6防治小麦赤霉病和茎基腐病的研究,弥补了该菌在防治赤霉病和茎基腐病方面的空白,为后期的深入探究提供了重要的理论依据。
[硕士论文] 花翔旻
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:镰刀菌(Fusarium spp0)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight)是一种世界性分布的小麦真菌病害,严重影响小麦产量和品质。小麦赤霉病在我国长江中下游冬麦区、东北春麦区以及华北南麦区发病严重。板栗疫病菌中发现的CHV1在欧洲栗疫病防控中成功应用,以及在核盘菌中发现的DNA病毒SsHADV-1可在田间降低菌核病发病率,表明真菌病毒防控植物病害是生物防治的重要策略之一。本研究通过高通量测序技术对亚细亚镰刀菌携带的病毒多样性进行了初步分析,为病毒用于赤霉病的防治提供潜在的病毒资源。本研究获得以下主要研究结果:
  对采集自湖北省的孝感市、随州市广水和随县,以及江苏省南京市感染镰刀菌的罹患小麦赤霉病菌的397个病穗进行病原菌分离,最终获得纯化的菌株350株,且均为亚细亚镰刀菌(Fusarium asiaticum)。对分离的这些菌株进行宏病毒组测序,共获得68个与病毒具有同源性的contigs序列信息,是潜在的病毒基因组序列。同源性分析表明,这些病毒的核酸类型有正单链RNA病毒、负单链RNA病毒、双链RNA病毒。其中正单链RNA病毒比例占63%,主要隶属于减病毒科、裸露病毒科、甲型线性病毒科、镰刀菌病毒科以及未分类的病毒;负单链RNA病毒占10%,主要隶属于真菌负义链病毒科、布尼亚病毒目;双链RNA病毒占27%,主要隶属于双分病毒科、灰葡萄孢双节段病毒科及未分类的病毒。以上结果表明分离的亚细亚镰刀菌菌株中含有丰富的病毒资源。
  对亚细亚镰刀菌布尼亚病毒Fusarium asiatieum bunyavirus1(FaBV1)的分子特性及其对寄主的影响进行了分析。利用宏病毒组测序获得病毒FaBV1的部分eDNA序列,结合RACE的方法获得FaBV1基因组的L(Large)和S(Small)片段的全长eDNA序列,但没有获得M(Middle)片段的序列信息。L片段全长含有6468个核昔酸,其互补链包含一个开放性阅读框(ORF),推定编码含有布尼亚病毒复制酶保守结构域的L蛋白。S片段的cDNA全长含有1420个核苷酸,其互补链包含一个ORF,推定编码病毒的核衣壳蛋白。FaBV1基因组的L和S片段末端有11个核苷酸序列高度保守(3’-UGUGUUUCUGG--CCAGAAACACA-5’),且5’和3’端保守序列反向互补。基于病毒L蛋白和核衣壳蛋白序列进行多重比对分析,并与已知的布尼亚目病毒进行聚类分析,表明FaBV1隶属于布尼亚病毒目中,但与布尼亚病毒目中其他病毒科病毒不聚在一支,具有独立性;结合病毒自然寄主的差异,建议以FaBVI作为一个模式种,建立一个新病毒科镰刀布尼亚病毒科(Fusarbunyaviridae)和新属亚细亚镰刀菌布尼亚病毒属(Fusarbunyavirus)。分离获得100个被病毒FaBV1感染菌株XG-7的单分生孢子分离物中,仅有2个分离物中携带病毒FaBV1,分生孢子携带病毒率为2%,表明FaBV1经分生孢子传播效率低。比较分析不携带FaBV1的分离物xg-7-001vf和携带病毒的分离物xg-7-022的生物学特性,携带病毒FaBV1的菌株生长速度缓慢,致病力降低,但产赤霉菌毒素无显著性差异,表明病毒FaBV1与寄主亚细亚镰刀菌低毒特性具有相关性,但与毒素产生无关。本研究分析了亚细亚镰刀菌中真菌病毒存在丰富的多样性,为布尼亚病毒在真菌中的起源和进化提供了新的研究材料。
[硕士论文] ANUM BASHIR
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是一种已被深入研究的革兰氏阴性植物病原细菌,但该菌对动物如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的致病性最近也已被研究证实。铁是自然环境中最丰富的元素之一,但其生物利用率一直相对较低。多种不同的微生物类群已经发展出具有对铁具有高亲和性能的铁吸收系统,包括血红素摄取系统、铁载体系统和细胞膜受体等。假单胞菌属(Pseudomonas)的主要铁载体是pyoverdine。它是一种低分子量、高亲和力的铁清除荧光分子,仅在铁限制条件下由荧光假单胞细菌群产生。除了具有对铁的吸收性能,铁载体pyoverdine也可以作为细菌毒素。本学位论文主要研究了基于液体培养条件下的线虫致病模型中,在铁限制条件下丁香假单胞菌野生菌株MB03和秀丽隐杆线虫之间的相互作用,以及铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌致病性中的作用。
  鉴于铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aerugionosa)PAO1菌株已经鉴定出几乎所有与pyoverdine生物合成和分泌相关的基因,使用PAO1菌株的pyoverdin基因簇作为参考序列,利用在线工具Anti-SMASH对丁香假单胞菌MB03基因组中pyoverdine编码基因簇进行了预测和定位分析。结果发现,发现丁香假单胞菌MB03中缺少5个与PAO1中的直系统同源基因(pvdX,pvdY,pvdA,pvdF和fpvI)。在这些基因中,pvdX和pvdY编码调节蛋白;pvdA和pvdF编码合成N5-甲酰基-N5羟基鸟氨酸残基所需的酶,这些残基存在于PAO1的pyoverdine的肽链中。但在MB03的pyoverdine基因簇中也存在一种为PAO1中所没有的基因,即syrP。推测syrP的编码产物可能参与存在于MB03-PVD肽链中的羟基天冬氨酸残基的β-羟基化作用此外,在PAO1中,两个Sigma因子编码基因pvdS和fpvI分别参与pyoverdine生物合成和pyoverdine受体FpvA的激活,但是,在丁香假单胞菌MB03的基因组中不存在fpvI,而是在fpvA基因的前面有一个pvdS IS基因框,表明在丁香假单胞菌MB03中的pvdS可能参与fpvA基因的转录。
  Pyoverdine在结构上由3个不同的结构域组成,即生色团(最保守的部分)、肽链(最可变部分)和侧链(羧酸衍生物)。在MB03的铁载体pyoverdine基因簇中的非核糖体基的多肽合成酶(NRPS)基因编码参与pyoverdine的肽链和发色团部分合成的一种大分子量酶。通过NRPS预测因子对丁香假单胞菌MB03的5个推定的NRPS基因进行计算机模拟表征表明,MB03-PVD的肽链呈线性形式并且由L-1ys,D-Asp,L-Thr,L-Thr,L-Ser,D-Asp和L-Ser。经测定铁载体pyoverdine特定光吸收值,发现MB03产生的pyoverdine与培养基中的Fe3+浓度成反比,而铁对于pyovidine生产的临界抑制浓度约为20μmol/L。
  通过使用RecTE重组系统来进行pyoverdine生物合成2个相关基因的中断,获得了相应基因中断突变株ΔpvdD和ΔpvdJ。由于pyoverdine是一种分泌的非核糖体多肽,所以可通过LC-MS和荧光光吸收测定来鉴定中断菌株是否丧失产铁载体pyoverdine的活性。结果发现,两株突变株的破碎细胞滤液均缺乏pyoverdine特征性的黄绿色荧光,表明突变株未能产生pyoverdine。经质谱鉴定,2株突变株也缺乏pyovine的特征峰,而野生型MB03产生了具有1123.412m/z和1142.4165m/z的两类pyovidine。
  为调查铁在MB03对线虫致病性中的作用,在添加或不添加铁的M9培养基中来培养MB03菌株,然后进行对秀丽隐杆线虫的杀虫生物测定。由于Pyoverdine也有助于在丁香假单胞菌中发现的几种常见致病因子(如AHL,EPS和Tabtoxin)的产生,因此,pyoverdine有可能在培养过程中由于铁在培养基浓度的不同从而调节了细胞毒性、并导致对线虫杀虫效果的差异性。为验证这一假设,将过夜MB03培养物产生的滤液分成两半,其中之一添加额外的100μmol/L铁并培养过夜。生物测定结果发现,野生菌株MB03导致供测线虫的显著性致死(p=0),但通过在M9中添加外源铁(100μmol/L)或通过在MB03过夜培养物中直接添加外源铁的细胞滤液可在一定程度上减小致死率。此外,液相生物测定的致死效应通常发生在培养30h之后,因此,足够的培养时间对于细菌的致死作用也是进行生物测定时要考虑的。
  将基因中断突变株ΔpvdD和ΔvdJ与野生菌株MB03在贫铁的M9培养基中生长后进行液相杀虫生物测定,另外,使用纯化铁载体pyoverdine进行相应生物测定,因为推测pyoverdine可能是具有杀虫活性的MB03滤液中的一种作用导致线虫死亡的活性因子。在液相生物测定中使用的纯化pyoverdine的浓度与在MB9中在48h内在M9培养基中产生的pyoverdine的浓度相当。测量暴露于各种滤液的线虫的相对死亡率,结果如预期相符:与M9和大肠杆菌(Escherichia coli OP50滤液相比,MB03滤液显示显着的杀死作用(p=0),而两种突变株的杀虫试验都没有发现线虫死亡。
  为了证实突变体的减毒活性是由于缺乏pyoverdine产生的,将纯化的pyoverdine加入突变体中以测量与野生型相当的相对死亡率,结果证实pyoverdine是导致线虫死亡的细菌滤液中的活性因子。通过pyoverdine生物合成缺陷的突变株的减毒活性、以及两突变株在添加纯化的pyoverdine后又可杀线虫的实验结果可以证实,pyoverdine在MB03介导的液相杀虫实验中是决定杀虫活性的重要因素。此外,通过测量MB03和两种突变株的生长曲线,发现突变株在贫铁M9培养基中生长缓慢。因此,这表明pyoverdine对丁香假单胞菌MB03生长也是至关重要的。
  总之,本研究结果表明,丁香假单胞菌MB03具有产生pyoverdine的遗传潜力。通过RecTE重组系统构建获得2株pyoverdine生物合成缺陷的基因中断突变株。铁载体pyoverdine在MB03菌株对秀丽线虫的杀虫活性中发挥重要作用。同时,pyoverdine也是影响宿主细胞生长的重要因素。就我们所知,本项研究是研究丁香假单胞菌铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌与动物宿主之间相互作用的第一例研究。
[硕士论文] 张敏
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:光环境作为自然环境条件中对生物体影响最为重要的可变因素之一,其对昆虫生长发育、呼吸代谢和繁殖能力等方面的影响已为人们所关注。近年来,随着可持续发展和绿色环保概念的不断提出,利用灯光技术防治害虫在现阶段农业中发挥着重要作用。作为新型灯源,LED灯做为诱虫灯的诱捕光源研究较多,但其对昆虫生长发育的研究较少,探索LED灯对昆虫生物学特性的影响将有利于明确昆虫适应生长的光环境条件,解释光环境作为选择压力下昆虫的进化方式,同时也可以作为昆虫生理调节器,用于资源昆虫的生产和害虫的防治,具有重要的理论和应用价值。
  本研究以家蝇Musca domestica、大头金蝇Chrysomyia megacephala、绿盲蝽Apolygus lucorum、黄粉虫Tenebrio molitor和菜粉蝶Pieris rapae为供试昆虫。这5种昆虫属于不同的目,亲缘关系远、具有不同生活习性和取食倾向,具有进化上的代表性。以LED光的波长因素作为变量,确定了12种光环境条件对试虫进行处理,研究不同光环境处理对5种昆虫生长发育的影响制作了昆虫在不同光环境中的种群生命表,为以后物理防治研究的学者提供一些有价值的参考资料。主要结果如下:
  1.不同光环境对家蝇生物学特性的影响
  家蝇成虫羽化率影响最显著的波长是435nm,575nm处理中卵孵化率最低,645nm处理中卵孵化历期最短,幼虫存活率和化蛹率最低的波长分别是460nm和435nm,蓝绿光对家蝇各阶段生长发育和历期存在显著影响,蓝光对家蝇全世代生长发育作用显著;对家蝇雌虫产卵影响最显著的波长是375nm,家蝇在365nm处理中种群趋势指数为1.51,说明该处理下下一代种群增长速度缓慢。
  2.不同光环境对大头金蝇生物学特性的影响
  大头金蝇成虫羽化率影响最显著的波长是435nm。435nm中卵孵化率最低,420nm处理中卵孵化历期最短,幼虫存活率和化蛹率最低和历期最短的波长均为435nm,说明蓝光会降低大头金蝇各阶段的存活情况并缩短幼虫和蛹阶段的发育历期,蓝紫光作用使卵的孵化历期明显降低;大头金蝇在375nm处理下平均产卵量最低,综合分析可知,435nm处理对大头金蝇种群繁殖的限制作用明显。
  3.不同光环境对绿盲蝽生物学特性的影响
  575nm是对绿盲蝽成虫羽化率影响最显著的波长,575nm处理中绿盲蝽卵孵化率和若虫存活率最低,说明黄橙光不利于绿盲蝽卵和若虫的存活发育;435nm和420nm处理中绿盲蝽各阶段发育历期均比较低,说明蓝光降低绿盲蝽的发育历期;435nm对绿盲蝽雌虫产卵量的影响效果显著,种群趋势指数以420nm处理最低,为4.26,说明在不同光环境中绿盲蝽种群均呈现增长趋势,增长最慢的为原来的4.26倍。
  4.不同光环境对黄粉虫生物学特性的影响
  黄粉虫卵期在600nm处理中孵化历期最短,幼虫在575nm处理中发育历期最短,蛹期在600nm处理中发育历期最短,而黄粉虫蛹期处理所得成虫羽化率以365nm最低,说明黄粉虫的存活发育受紫外光和黄橙光的影响显著;全世代处理在435nm中成虫羽化率最低,且存在畸形情况,以短波长较明显,435nm畸形率最高;365nm处理中黄粉虫雌虫产卵量最低,种群趋势指数以375nm处理最低,为24.92,说明在不同光环境中黄粉虫种群均呈现增长趋势,增长最慢的为原来的24.92倍。
  5.不同光环境对菜粉蝶生物学特性的影响
  菜粉蝶幼虫和蛹的存活发育在不同光环境处理下差异显著(P<0.05)。菜粉蝶幼虫在435nm和575nm处理中化蛹率较低,575nm处理中羽化率最低,说明菜粉蝶幼虫阶段受蓝光和黄光影响明显;435nm处理下发育历期最低,说明蓝光可以缩短菜粉蝶蛹期的发育历期。
  6.不同光环境对5种昆虫生物学特性的比较分析
  不同光环境对5种昆虫生物学特性的影响情况存在差异,但生长发育均显著受蓝光影响:对家蝇和大头金蝇生长发育的影响效果最显著,且幼虫和蛹的发育历期明显缩短;不仅对黄粉虫的生长发育影响显著并且出现缺翅等畸形率最高;对绿盲蝽发育和繁殖的影响效果均较显著;对菜粉蝶幼虫阶段发育影响显著,且明显缩短其蛹的发育历期。另外,紫外光降低家蝇和大头金蝇产卵量甚至不产卵;黄橙光不利于绿盲蝽卵和若虫的存活发育;菜粉蝶幼虫阶段发育受黄光影响显著。
[硕士论文] 周玲玲
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:茶轮斑病是危害茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]生产的重要病害,严重时可导致叶片大量脱落,影响茶叶品质和产量,目前在我国茶园中广泛发生。茶拟盘多毛孢(Pestalotiopsis theae)是引起茶轮斑病的优势种。我们前期在田间分离获得了一株致病力丧失的茶拟盘多毛孢菌株LI-41,其较正常菌株表现出菌落形态异常,菌丝生长速度缓慢。本研究是针对菌株LI-41生物学性状发生变化的原因进行了探索,所得结果如下:
  对菌株LI-41和正常菌株(TP-2-2W)的菌丝进行双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)的提取,发现LI-41菌株中含有4条dsRNA片段(dsRNA1-4),随机克隆以及末端克隆测序显示,其大小分别为3387、2831、2599和932nt,分析推测每一条dsRNA分别编码一个独立的开放阅读框(Open-Reading Frame,ORF),依次命名为ORF1、ORF2、ORF3和ORF4。将获得的4条dsRNA序列编码蛋白采用BLASTp与登录在NCBI中的序列比对,显示该病毒ORF1-3编码蛋白与金色病毒属的胶孢炭疽菌金色病毒-1(Colletotrichum gloeosprioides chrysovirus1,CgCV-1)编码蛋白相似性最高,相似率分别为65%、48%和54%,而ORF4编码蛋白未搜到任何病毒的同源序列,我们将其命名为茶拟盘多毛孢金色病毒-1(Pestalotiopsis theae chrysovirus1,PtCV-1)。根据与已知蛋白的相似性推测,PtCV-1的ORF1编码依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase,RdRp),ORF2编码外壳蛋白(Coat protein,CP),ORF3编码甲基转移酶,ORF4所编码的蛋白功能未知。
  采用蔗糖梯度超速离心法提纯PtCV-1的病毒粒体,分别从蔗糖各梯度层的病毒粒子提取核酸,结果显示在20%-50%蔗糖层均存在4条核酸链,大小与从菌丝中提取的4条dsRNA大小一致,其中50%蔗糖层中病毒含量最高。将50%蔗糖层纯化的病毒粒子进行铜网吸附后负染,经透射电镜观察,观察到了球形病毒粒子,其直径为30.1~39.8nm。
  将LI-41诱导产孢,挑选42个分生孢子培养后,进行PtCV-1的dsRN检测,结果显示67%分生孢子再生后代仍含有PtCV-1。将LI-41与分生孢子再生无毒菌株(LI-41-1)对峙培养,在LI-41-1菌落边缘挑取50个菌丝块进行dsRNA检测,结果显示有6个传毒后代检测结果呈阳性,表明PtCV-1可以水平传毒给遗传背景相同的菌株。用PEG介导病毒粒子和核酸转染单孢无毒后代菌株(LI-41-1)的原生质体,然后对转染原生质体的后代菌株进行培养,分别筛选150个原生质体再生后代菌株进行dsRNA检测,结果显示,仅有5个病毒粒子转染后代菌株检测到了PtCV-1的dsRNA条带。由此推测,该病毒的核酸可能不具有侵染性,但可以通过病毒粒子和水平传毒的方式传染给无毒的分生孢子后代菌株中。
  比较分生孢子后代无毒菌株(LI-41-1、LI-41-2、LI-41-3)、原始带毒菌株(LI-41)、分生孢子后代带毒菌株(LI-41-V1、LI-41-V2)、病毒粒子传毒后代菌株(LI-41-1T1、LI-41-1T2、LI-41-1T3)和对峙培养传毒后代菌株(LI-41-1P-1、LI-41-1P-2、LI-41-1P-3)生物学性状表明,带毒菌株和无毒菌株菌落形态和致病力表现显著差异:带毒菌株较无毒菌株均色素增多,菌丝轮纹圈消失;菌落畸形;生长速度降低,正常菌株为6.5-6.7mm/d,带毒菌株为2.0-2.8mm/d;致病力减弱,在来源于云南和广西本地种茶叶上,无毒菌株接种引起的病斑大小分别为11.9-14.1mm和17.5-21.5mm,而带毒菌株没有引起明显的病斑。以上结果表明:PtCV-1侵染茶拟盘多毛孢可引起其菌丝畸形,生长速度减弱和致病力显著降低。
  本研究报道了侵染茶拟盘多毛孢的金色病毒属新成员PtCV-1,并明确该病毒可以引起茶拟盘多毛孢生长异常、生长速度和致病力减弱。据我们所知,这是国际上茶拟盘多毛孢内报道的首例真菌病毒。PtCV-1能够显著改变寄主的致病力,可望进一步应用于茶拟盘多毛孢的生防研究;PtCV-1的发现也是国际首例真菌病毒-茶拟盘多毛孢研究系统,为采用反向遗传学深入研究茶拟盘多毛孢基因功能奠定基础。
[硕士论文] 阳纯
林学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:我国竹质种类繁多,分布范围广泛。崇阳县作为湖北省主要竹产品生产地之一,以雷竹(Phyllostachys praecox)、楠竹(Phyllostachys edulis)、高节竹(Phyllostachys prominens)等为主要经济竹种。近些年,三星竹笋象(Otidognathus sp.)成为危害日益严重的竹类害虫,严重制约当地的经济发展。因此,充分认识三星竹笋象,可为有效地综合防控提供理论基础。但迄今为止,有关三星竹笋象寄主定位的研究尚缺乏报道。本课题以三星竹笋象为研究对象,采用林间观察和室内饲养,借助SEM(扫描电子显微镜)、GC-MS(气相色谱一质谱联用仪)及转录组分析等技术手段,研究了三星竹笋象的生活习性,明确了三星竹笋象感器类型、数量和分布特征及高节竹竹笋挥发物的主要成分,同时,对三星竹笋象触角中参与嗅觉的相关蛋白进行分析,发现昆虫不同嗅觉基因对寄主选择机制行为的影响,以期为害虫防控策提供新的思路。主要结果如下:
  (1)三星竹笋象生活习性
  通过野外观察与室内饲养发现,三星竹笋象成虫和幼虫均危害竹笋,该虫在崇阳县1年发生1代。成虫4月中旬出土,7月下旬林中终见。成虫出土后即刻取食、交配产卵,卵2~3天孵化,幼虫共5龄,3龄期幼虫食量大增。5月下旬老熟幼虫入土,翌年7月上旬羽化成成虫越冬。
  三星竹笋象雌虫的过冷却点为-12.80℃,冰点为-9.22℃。雄虫的过冷却点为-12.46℃,冰点为-8.24℃。雌虫过冷却点和冰点都要低于雄虫,差异不显著性。
  不同恒温条件下饲养三星竹笋象的卵与幼虫,试验发现:15~30℃下,卵、幼虫均能正常发育。卵与1~4龄幼虫的发育起点温度分别为:8.28、12.44、15.42和12.28℃,有效积温分别为:68.05、26.93、36.05和93.58日·度。用线性日度、Logistic及指数模型分别描述三星竹笋象卵、幼虫发育速率与温度的关系,结果表明Logistic模型拟合的效果最优。
  (2)三星竹笋象的种群动态变化研究
  三星竹笋象在崇阳县高节竹竹林的危害高峰期为4月底至5月初,活动时间基本与高节竹竹笋出笋时间保持一致,呈单峰型。分析发现,三星竹笋象种群动态消长主要限制因子为平均气温(X1),主要决策因素为最高气温(X2)。5种拟合函数结果表明平均虫口密度与每周平均气温(X1)和最高气温(X1)建立的Logistic模型拟合效果最好。
  (3)三星竹笋象对寄主挥发物趋向行为反应
  运用Y型嗅觉仪测定三星竹笋象气味源的选择性差异,结果表明:高节竹竹笋气味对三星竹笋象表现出极显著的引诱效应,引诱率为72.5%。通过GC-MS在高节竹竹笋挥发物中共鉴定48种物质,主要以烷烃类(40种)为主,占挥发物总量的86.38%。其次是萜类(9.55%,6种)和醛类(4.08%,2种)。萜类和醛类物质在高节竹竹笋挥发物中相对含量较低,但这两种成分是主要的活性物质,具体是哪一种成分对三星竹笋象行为起调控作用,有待进一步研究。
  (4)三星竹笋象超微结构的观察
  电镜扫描观察发现三星竹笋象共有9种感器类型,26种亚型。分别是毛形感器(ST,3种)、刺形感器(SC,8种)、锥形感器(SB,4种)、芽形感器(SG,4种)、柱形感器(SCY,3种)、叉形感器(SF)、手形感器(SH)、勺形感器(SD)和B(O)hm氏鬃毛(BB)。雌雄成虫感器的类型、数量和分布上均无显著性差异。以触角的感器类型和数量最为丰富。其次是足,足上的感器主要集中在第3附节的跗垫上,感器形态呈勺型。头、前胸背板及鞘翅上均匀地分布芽形感器,在这些部位的外缘都绕有一圈刚毛,感器形态更丰富。
  (5)三星竹笋象成虫触角嗅觉基因的转录组分析
  通过Illumina HiSeqTM2000平台对三星竹笋象成虫触角转录组高通量测序,共获得25982条unigenes,平均长度628bp。有17247条unigenes注释成功,占总数的66.38%。同源性分析显示:三星竹笋象unigenes与中欧山松大小蠹(Dendroctonus ponderosae)序列相似度最高,为56.46%。
  在三星竹笋象触角转录组中共预测到72个嗅觉相关基因,其中,27个OBPs,8个CSPs,16个ORs,18个IRs和3个SNMPs。将预测的嗅觉相关基因与其它物种构建系统发育树,对三星竹笋象的嗅觉基因功能进行分析与预测,为后续对三星竹笋象嗅觉行为机制的研究奠定理论基础。
[博士论文] 彭威
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)是一种危害250多种果实和蔬菜的重要农业害虫,给我国果蔬生产带来严重经济损失。昆虫具有多种多样的性别决定机制,不仅不同昆虫通过不同的基因和调控机制决定性别分化,甚至在同种昆虫不同品系之间性别决定机制也不尽相同。昆虫中决定性别的初始染色体信号差异较大,其中最典型的是Y染色体连接的雄性决定因子(M factor)决定雄性性别发育。但是,在包括橘小实蝇在内的多种昆虫中,假定的M因子还是未知的。本研究以橘小实蝇为研究对象,利用RNA干扰(RNAi)、CRISPR/Cas9编辑系统和高通量测序技术等分子生物学手段,研究了橘小实蝇性别决定关键基因transformer的功能;鉴定出一种小分子microRNA作为雄性决定因子调控橘小实蝇早期胚胎性别分化;鉴定和研究了多种橘小实蝇性别偏向性microRNAs在两性发育中的作用;验证了保守性Let-7调控橘小实蝇发育过程。对橘小实蝇性别决定分子机制的研究,不仅为探索昆虫性别分化通路上类似基因的功能,以及确定新的性别决定基因提供参考,而且为昆虫的遗传操作提供理论和实践基础。本研究为发展不依赖辐射处理的不育害虫防治技术(SIT)提供了新的策略。
  1.Transformer基因是昆虫性别决定级联系统中的一个双开关基因,通过选择性剪切来实现性别分化。为阐明性别决定关键基因在调控雌雄分化和雌虫繁殖力中的功能,我们分离鉴定了橘小实蝇transformer和transformer-2,Bdtra经过选择性剪切转录产生两种雄特异和一种雌特异的亚型,雌特异的亚型能翻译成有功能的TRA蛋白,而雄特异的亚型由于终止密码子不能翻译成有功能的TRA蛋白。Bdtra上存在的TRA/TRA-2结合位点表明,TRA和TRA-2作为剪切调控因子通过Bdtra反馈调节来维持和促进雌性的性别发育。早期胚胎发育过程中雌特异tra的表达模中tra-f在15小时达到高表达。通过RNA干扰对Bdtra进行了功能研究,发现胚胎期敲除Bdtra基因能导致雌虫雄性化,表明橘小实蝇在胚胎早期实现性别分化;成虫期敲除Bdtra基因能降低雌虫卵黄蛋白基因yolkprotein gene(Bdyp1)的表达,进而降低雌虫产卵量,表明Bdtra基因能正向调控卵黄蛋白基因Bdyp1的转录。这些结果表明利用性别决定关键基因构建转基因性别品系,通过释放竞争力更强的不育雄虫后代,能够提高昆虫不育技术对橘小实蝇的防治。
  2.MicroRNAs(miRNAs)是一类小的内源非编码RNAs,能够调控包括两性异形在内的多种生理过程。然而,至今没有对橘小实蝇雌雄成虫和生殖腺中miRNAs进行鉴定以及对miRNAs在性腺分化中的作用进行阐述。我们通过对橘小实蝇性成熟雌虫、雄虫、卵巢和精巢构建small RNA文库,测序数据分析鉴定出183个已知和120个新miRNAs。对4个文库中miRNAs表达量进行比较分析,发现18个雌性偏向表达和16个雄性偏向表达miRNAs,这些性别偏向性miRNAs可能参与性别分化。通过靶标基因软件预测分析,发现雌偏向性miR-989-3p靶向实蝇科昆虫性别决定关键基因doublesex(dsx),这表明miR-989-3p可能参与调控橘小实蝇性别分化。对雌成虫饲喂miR-989-3p、miR-994-5p、miR-309-3p和miR-6-3p抑制剂促进产卵量的增加,对雄成虫饲喂miR-8-3p、miR-34-5p、miR-1-3p和miR-12-5p抑制剂使得雄虫交配竞争力下降,对雌雄成虫饲喂以上抑制剂都降低了成虫存活寿命。这些结果表明性别偏向性miRNAs在维持雌雄生殖力和寿命中起着重要作用。本研究首次揭示了橘小实蝇性别分化相关的miRNAs的表达模式,发现miRNAs在性别间差异表达,这将促进生殖器官特异表达miRNAs的功能研究。
  3.在一些实蝇科昆虫中,Y染色体连接的雄性决定因子(M factor)启动性别决定途径中的基本信号。然而,橘小实蝇中M因子及其性别决定分子机制还尚不明确。在本研究中,我们鉴定到橘小实蝇早期胚胎雄性性别发育关键时期是产卵后5、6和7小时,对5、6和7小时胚胎构建small RNA文库,鉴定出65个胚胎差异表达miRNAs。在这些miRNAs中,有8个和Bdtra基因3’非编码端(3'UTR)序列有碱基互补配对结合位点,其中结合自由能最低的是miR-1-3p。在HEK293T细胞中进行的双荧光素酶实验表明miR-1-3p能抑制Bdtra的表达。胚胎注射miR-1-3p类似物和抑制剂分别下调62%和上调109%的Bdtra表达量,体外和体内实验表明Bdtra是miR-1-3p的靶标基因。另外,胚胎注射miR-1-3p类似物导致后代雄性化(92%的雄性后代表型),注射miR-1-3p抑制剂能导致后代雌性化(77%的雌性后代表型)。利用CRISPR/Cas9技术敲除miR-1-3p导致突变雄性个体完全逆转为雌性表型,且Bdtra和Bddsx基因进行雌性特异剪切表达,这些结果表明miR-1-3p对橘小实蝇早期胚胎雄性性别决定是必需的,miR-1-3p作为雄性决定因子中间体,可能受到Y染色体连接的基本信号的激活,参与性别调控。
  4.MicroRNAs(miRNAs)调控昆虫发育中多种生理过程,但是miRNAs在橘小实蝇幼虫至蛹期发育中的作用还是未知的。在本研究中,利用在HEK293T细胞中的双荧光素酶实验,我们发现Bdo-Let-7作用于BdE75基因的3’非编码端(3'UTR),抑制BdE75基因的表达。Bdo-Let-7和BdE75在幼虫至蛹期发育过程和不同组织中是共表达的。对三龄幼虫注射Bdo-Let-7类似物和抑制剂分别下调62%和上调94%的BdE75表达量。对第五天幼虫注射20-羟基蜕皮酮(20E)3、12、24和48小时后,Bdo-Let-7表达量分别上调82%、91%、110%和144%。另外,注射Bdo-Let-7抑制剂后观察到幼虫异常的化蛹和羽化现象。依据以上结果,我们证实Bdo-Let-7调控蜕皮激素信号途径基因BdE75的正常剂量表达,从而维持橘小实蝇幼虫至蛹期的正常发育。
[硕士论文] 赵婉莹
农药学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:千金子(Leptochloa chinensis(L)Nees)为一年禾本科杂草,具有很强的分蘖能力、成株率高,且对逆境环境(水涝、干旱)具有很好的适应能力,在我国湖北、湖南、江西、广东、浙江等地水稻田危害严重。氰氟草酯(Cyhalofop-butyl)是乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂类除草剂,被广泛用于水稻田防除千金子等一年生禾本科杂草。本研究采用整株生物测定法,测定了荆门、荆州、武穴、咸宁、襄阳、南昌、长沙13个千金子田间种群对氰氟草酯的敏感性水平,研究了抗氰氟草酯千金子种群(TCGD16)对其他除草剂的交互抗性,探究了TCGD16种群对氰氟草酯的靶标抗性及代谢抗性机理,为氰氟草酯的科学合理使用和千金子的抗性治理提供理论依据。
  (1)通过整株生物测定法测定了13个千金子田间种群对氰氟草酯的敏感性,研究表明千金子田间种群对氰氟草酯产生了不同程度的抗药性。田间种群T CGD16对氰氟草酯的抗性水平最高,LD50为58.64g a.i.ha-1,相对抗性指数(RI)为6.58;千金子田间种群WX15和NC16对氰氟草酯较敏感,LD50分别为8.91和9.79g a.i.ha-1;其它种群对氰氟草酯的LD50在18.94g a.i.ha-1-52.92g a.i.ha-1之间,RI在2.13-5.93之间。13个稻区的千金子田间种群中有2个田间种群WX15和NC16对氰氟草酯RI低于2,处于敏感水平,10个田间种群CB17、GA16、GA15、CS16、WX16、GA17、TC16、JM17、XY14和WX14的RI在2-6之间,为低水平抗性;1个田间种群(TCGD16)的RI为6.58,表现为中等水平抗性。测定了抗氰氟草酯千金子种群TCGD16的交互抗性,结果表明,抗性种群(TCGD16)对ACCase类抑制剂(噁唑酰草胺)、ALS类抑制剂(五氟磺草胺、双草醚)和激素类抑制剂(二氯喹啉酸)都存在交互抗性风险。
  (2)扩增、测序千金子抗性种群TCGD16和敏感种群NC16的ACCase CT功能域基因,通过比对发现TCGD16种群在已报道的引起靶标抗性的7个位点(Ile1781,Trp1999,Trp2027,Val2041,Asp2078,Cys2088,Gly2096)均没有发生突变,表明TCGD16种群对氰氟草酯产生的抗性不是由已报道的7个靶标位点突变引起的,其抗性的产生可能与非靶标机理有关。
  (3)通过测定四种酶抑制剂(PBO、NBD-C1、马拉硫磷、三聚氯氰)对氰氟草酯的增效作用,发现GST抑制剂(NBD-Cl)能明显逆转抗性种群的抗性。添加NDB-C1时,抗性种群TCGD16植株对氰氟草酯的LD50为13.38g a.i.ha-1,没有添加NDB-Cl,抗性种群对氰氟草酯的LD50为38.77g a.i.ha-1,可见NDB-C1对氰氟草酯具有明显的增效作用,可明显逆转抗性种群TCGD16对氰氟草酯的抗性。测定千金子抗性和敏感种群代谢酶GST酶活,发现抗氰氟草酯千金子种群的GST活性高于敏感种群。因此,抗性种群TCGD16对氰氟草酯抗性与GST活性的增强有关。
  (4)测定了酶抑制剂NBD-C1与氰氟草酯联合作用对水稻的生长的影响,研究结果显示,在氰氟草酯同一剂量处理下,添加和不添加NBD-C1(270g a.i.ha-1)对水稻的株高和地上部分干重影响无显著性差异。当氰氟草酯和NBD-C1联合使用剂量超过氰氟草酯的推荐剂量(90g ai ha-1),对水稻的株高和地上部分干重都有一定影响。
[硕士论文] 强翠翠
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:盾壳霉(Coniothyrium minitans)作为防治菌核病的生物制剂已经被大量研究。本论文主要研究盾壳霉与田间两种灭生型除草剂草甘膦和草铵膦共同施用问题,并针对试验过程中出现的现象,主要研究了除草剂草铵膦的靶标基因在盾壳霉生长过程中的功能。试验结果如下:
  1.盾壳霉对两种除草剂敏感性评价:草甘膦和草铵膦对盾壳霉菌丝均有较强抑制作用,EC50分别为714.3μg/mL和574.5μg/mL;对孢子抑制作用相对较弱,草甘膦EC50为1019.8μg/mL,而草铵膦对盾壳霉孢子的萌发基本没有抑制作用;对核盘菌菌丝均有较强的抑制作用,EC50分别为1695.8μg/mL和223.5μg/mL,草铵膦较草甘膦抑制作用更为显著;两种除草剂存在下会延迟盾壳霉孢子的萌发时间,但是对盾壳霉孢子没有杀灭作用;两种除草剂存在下,会影响盾壳霉对核盘菌菌核的寄生,草铵膦较草甘膦抑制作用更为显著。但结合两种除草剂的性质,草铵膦在田间能快速被降解且不能杀灭孢子,草甘膦也不能杀灭孢子且在较高浓度下仍对盾壳霉寄生核盘菌菌核没有太大影响。所以,在田间正常条件下盾壳霉孢子均可以和两种除草剂进行混合施用。
  2.盾壳霉在含草铵膦的PDA平板上生长异常,推测草铵膦的靶标对盾壳霉的生长起重要作用,为了探究生长异常原因,了解草铵膦的作用机理,为研究抗药性材料提供依据,我们研究了草铵膦对盾壳霉的作用。盾壳霉中存在三个含有谷氨酰胺合成酶保守结构域的基因,其中一个为FluG蛋白,另外两个为谷氨酰胺合成酶类似蛋白,将其分别命名为GlnA1(CmZS1_02675)和GlnA2(CmZS1_07614)。基因GlnA1敲除会使盾壳霉致死,加入一定量谷氨酰胺之后,敲除转化子可以恢复生长和产孢,但是菌落偏白,疑似黑色素产量降低,且加入其它类氨基酸不能恢复其生长和产孢。耐药性试验表明,草铵膦对GlnA1敲除转化子无抑制作用。GlnA2敲除转化子与菌株ZS-1相比,在菌落形态、菌丝尖端、生长、产孢、生物学产量和对草铵膦的抗药性方面均无显著差异。因此可以确定,在盾壳霉中GlnA1为除草剂草铵膦的靶标,而GlnA2不是。
[硕士论文] 牛炳棵
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)是我国新近发现的危害柠檬的重要病毒,目前对其致病机制的研究较少。本研究以1年生柠檬实生苗为寄主植物,对嫁接接种CYVCV和模拟接种的柠檬植株叶片分别进行了转录组及小RNA测序,利用生物信息学技术挖掘CYVCV侵染诱导差异表达的基因和miRNA,研究这些基因和miRNA在柠檬应答CYVCV胁迫中的功能。取得的研究结果如下:
  1.将接种后第30d、60d和90d三个时间点收集的CYVCV侵染及对照柠檬植株叶片样品分别进行等量混合后进行转录组测序。测序结果显示,受CYVCV侵染的柠檬样品中有679个基因上调表达,637个基因下调表达,这些基因中分别有1114个和453个注释到GO功能和KEGG通路。GO功能主要集中在生物学过程和分子功能,其中细胞间信息传递、氧化还原过程、对真菌的防御反应、酶激活和酶抑制等功能富集最为显著。KEGG通路主要集中在代谢通路,其中光合作用、叶绿素生物合成与代谢、碳代谢和光合作用中的碳固定途径富集最为显著,共包含68个差异表达基因,推测这些代谢途径的基因表达量变化可能与柠檬受CYVCV侵染后叶片表现的叶片褪绿及黄化等症状相关。
  2.选取与光合作用、叶绿素生物合成与代谢以及碳代谢等通路相关的16个差异表达基因进行qRT-PCR分析,结果显示这些基因存在时间动态变化,其中有6个基因为先下调后上调表达,4个为先上调后下调表达。同时选取5个AGO同源基因和3个DCL同源基因进行qRT-PCR分析,结果显示有7个基因存在差异表达变化。分析这些基因的时间动态变化发现多数基因在第60d的表达量变化明显与30d和90d不同。根据qRT-PCR结果筛选出6个差异显著的基因,分析其在CYVCV侵染的甜橙和小梾檬植株中表达量变化,结果显示同一基因在柠檬、甜橙和小梾檬植株中的表达模式相似。此外采用qRT-PCR方法对接种CYVCV的柠檬植株叶片样品进行检测,发现柠檬接种CYVCV后第30d可检测到该病毒,至第60d病毒含量最高而第90d略有降低。
  3.从接种CYVCV(CY)和对照(MC)柠檬植株叶片样品中获得包含miRNA的Clean read各17170461条和18472346条,接种CYVCV和对照样品中分别有5360339条和6043365条read可比对到甜橙基因组。从2组样品共预测到159个miRNA,包括56个甜橙中已知的保守miRNA和103个从柠檬中新预测的miRNA。其中有13个保守的miRNA和20个新预测的miRNA受CYVCV侵染诱导差异表达。
  4.对20个新预测miRNA进行了miRNA茎环引物法RT-PCR扩增,其中12个扩增产物的序列与预测序列一致。测序结果显示,12个新鉴定的miRNA中,仅有两个下调表达,其余均为上调表达。差异表达的4个保守miRNA和4个新鉴定miRNA的qRT-PCR结果显示,miRNA的表达水平在接种CYVCV后第30d至第90d呈时间动态变化,其中保守miRNA均下调表达,新鉴定miRNA先下调后上调表达。以转录组测序数据作为参考,对25个差异表达miRNA进行靶基因预测,其中2个新鉴定miRNA和6个已知miRNA共预测到靶基因52个。靶基因功能分析表明,靶基因涉及应激反应和代谢等生物过程。此外,在甜橙基因组预测差异表达miRNA靶基因,靶基因功能分析表明,这些miRNA大部分与植物对非生物和生物逆境响应相关,保守miRNA靶基因的KEGG通路显示这些基因在植物逆境反应及光合作用和能量代谢相关通路中具有明显的富集现象。
[博士论文] 哈米德
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:真菌病毒是寄生真菌的病毒,其中一些病毒可以引起植物病原真菌致病力的衰退,具有控制作物病害的潜力。引起菌核病的核盘菌在自然界中广泛存在,可感染450多种或亚种植物。在此研究之前,实验室已经从核盘菌中发现了一些对核盘菌具有显著影响的真菌病毒,它们显著地降低了致病性。从中国湖北省、江西省和安徽省等地方分离获得了2000株核盘菌菌株,获得了173株生长异常菌以期从中筛选新的真菌病毒。分别从173个菌株中提取获得了总RNA并等量混匀,之后对总RNA样品进行了RNA_Seq分析。经过拼接,获得了247个具有显著病毒序列特性的contig,这些contig预示测定的173个菌株中存在多种多样的真菌病毒。对contig所推定编码的蛋白序列在NCBI数据中进行比对,发现247个contig可能代表了48种真菌病毒,其中35种ssRNA(+)病毒,7种ssRNA(-)病毒,5种dsRNA病毒和1种ssDNA病毒,其中线粒体病毒是主要类型。
  对四个Contig(contig3,contig50,contig71和contig1178)所代表的新RNA病毒进行了确认,其中contig3和contig50代表的为负链RNA病毒,contig3所代表的病毒命名为Sclerotinia sclerotiorum bunya-like virus1(SsB1V1),隶属于Bunyaviridae科;contig50所代表的病毒命名为Sclerotinia sclerotiorum negative-stranded RNA virus9(SsNsRV9),与一些分类地位待定的病毒具有较近的亲缘关系。contig71和contig1178代表的为新的(+)ssRNA病毒,均为Tymovirales目的病毒,分别命名为Sclerotinia sclerotiorum mycotymovirus1(SsMTV1)和Sclerotiniasclerotiorum deltaflexivirus2(SsDFV2)。
  对SsDFV2进行了详细的研究,发现该病毒与Botrytis porri RNA virus1(BpRV1)共同侵染低毒菌株228。228菌株在PDA上生长缓慢,产生菌核少,而且产生时间延迟,几乎不能诱导油菜差生病斑。建立在Contig序列的基础上采用5'-和3'-RACE等对SsDFV2的基因组进行了全长测定。发现SsDFV2的基因组全长为6711nt,含有Poly(A)尾。SsDFV2的基因组只含有一个推定的大开放阅读框架,编码一个假定的病毒RNA复制酶,包括典型的甲基转移酶、RNA解旋酶和RdRp等三个功能域。SsDFV2与核盘菌上的另外一种病毒
  Sclerotinia sclerotiorum deltaflexivirus1(SsDFV1)具有较高的同源性,复制酶中氨基酸相同性达到446/1185(38%),相似性达到625/1185(52%)。它们在系统上聚为一支,同属于拟建立的Deltaflexiviridae科。SsDFV1的基因组编码4推定的蛋白,而SsDFV2的基因只编码RNA复制酶,推定SsDFV2在核盘菌中可能丢失了其它的基因。
  营养体不亲和性反应严重限制了真菌病毒在寄主真菌间的扩散,严重制约了真菌病毒防治病害的效果。我们研究发现SsDFV2具有强的侵染能力,将菌株228与其营养体不亲和的菌株Ep-1PNA367和菌株1980进行对峙培养,发现病毒SsDFV2可以扩散到这两个菌株的菌落之中,而与SsDFV2共同感染菌株228的BpRV1却没有这种扩散能力。进一步将感染SsDFV2的Ep-1PNA367与菌株1980对峙培养,发现Ep-1PNA367同样可以扩散到菌株1980之中,进一步表明SsDFV2的扩散不受营养体不亲和性的限制。我们的发现表明真菌中存在高效突破寄主营养体不亲和性限制的RNA病毒,为利用真菌RNA病毒研究提供了新的思路。
[博士论文] 刘方舟
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:在不同外界环境条件的影响下,同一种生物可以发育成形态不同、生活习性不同的个体,即发育可塑性。发育可塑性是生物在自然选择的压力下,为适应不断变化的生态环境而形成的一种极其重要的生存策略。很多昆虫(如蜜蜂、蚂蚁、蝗虫、稻飞虱)具有发育可塑性现象。稻飞虱是水稻重要害虫,翅的发育具有可塑性。成虫具有长翅型和短翅型类型:在寄主营养恶化时,主要产生长翅型个体,长翅型成虫飞行能力强,前翅与后翅均长于身体,且前翅长于后翅,、但繁殖能力较弱;在寄主营养丰富时主要产生短翅型。短翅型个体不能飞行,前翅与后翅均短于身体,、且后翅非常退化,类似果蝇平衡棒,但繁殖能力强。多年来,稻飞虱的翅二型现象吸引了众多昆虫学者的兴趣,取得了大量研究进展。褐飞虱翅型转换的开关基因已经鉴定出来:胰岛素受体Insulin Receptor1/2(InR1/2)。然而,InR1/2是非常上游的调控因子,翅发育基因是翅发育调控的具体执行者,翅发育基因是否能够响应InR1/2的信号,启动长翅型或短翅型翅发育的进程,进而调控翅型分化,目前还没有相关相关报道。
  本论文克隆了Ultrabithorax(Ubx)、Decapentaplegi(Dpp)、Vestigial(Vg)、apterous-A(apA)4个翅发育基因,利用本室构建的长翅型与短翅型种群,通过同源比对、分子克隆、RNAi、荧光定量、原位杂交、Gal4-UAS转基因果蝇品系等技术研究了以上4个基因对长翅型和短翅型稻飞虱翅发育的调控作用,并初步研究了翅发育基因对InR1/2的应答,取得以下研究结果:
  褐飞虱Ubx(NlUbx)对翅发育及翅型分化的调控作用
  通过定量PCR、原位杂交实验,发现稻飞虱Ubx的表达模式与已知的昆虫Ubx不同,与甲壳纲动物更为相似。稻飞虱Ubx在前翅与后翅中均有表达,且短翅型种群表达量高于长翅型品系。无论是长翅还是短翅品系,若虫后翅翅芽表达量高于前翅翅芽。而昆虫已知的Ubx只在后翅表达,前翅不表达。
  稻飞虱Ubx蛋白在结构上也与已知的昆虫Ubx不同,与甲壳纲动物更为相似。稻飞虱Ubx的MXSXFE结构域序列为MMNSYFE,QA结构域序列为QAQAAK,Ploy-Ala结构域序列为AAALAASQAQ。而昆虫已知的Ubx,这三个结构域的序列分别为:MNSYFE,QAQAQK和AAAAAAAAAA。
  稻飞虱Ubx不但在前翅表达,而且对前翅的发育也承担着重要功能,并调控前翅与后翅的大小。通过RNAi干扰,降低稻飞虱Ubx表达量之后,产生以下表型:长翅和短翅成虫的前翅和后翅畸形且短翅型成虫前翅和后翅刚毛增多,长翅和短翅成虫后翅前翅化且短翅型成虫后翅变大程度尤为明显。稻飞虱Ubx在长翅种群与短翅种群中,对其靶标基因的调控模式不同。根据前人的研究,NlDp,NlVg,NlapA,NlASH等基因是Ubx的靶标基因。通过定量PCR,检测了褐飞虱长翅、短翅种群中Ubx被干扰之后,这些靶标基因的表达量。结果表明:NlUbx在长翅和短翅品系的前翅和后翅中对靶标基因的调控作用均有不同。
  考虑到NlUbx在短翅型、长翅型种群若虫翅芽表达量不同,且Ubx对翅的大小有调控作用,推测Ubx可能通过剂量效应调控褐飞虱翅的大小。为了验证这一推测,本文利用Gal4-UAS转基因果蝇品系使褐飞虱Ubx(NlUbx)、果蝇(Drosophila melanogaster)Ubx(DmUbxIa)、丰年虾(Acanthokara kaputensis)的Ubx(AkUbx)在果蝇前翅(Ubx空背景组织)异位表达,并通过三种不同强度的启动子(Nub-Gal4(强),Sd-Gal4(中);C765-Gal4(弱))使转基因果蝇前翅表达不同剂量的Ubx。结果表明:DmUbxIa在前翅表达高、中、低3个剂量下,果蝇的前翅仍然是平衡棒,而NlUbx与AkUbx在中等剂量下,果蝇前翅变成一个较小的翅,在低剂量下,果蝇前翅转换成一个相对完整的翅。因此,DmUbxIa剂量效应不明显,而NlUbx与AkUbx剂量效应明显,通过剂量的变化,可以使翅的大小灵活变化。同时也说明NlUbx与AkUbx对翅形成基因的压制作用弱于DmUbxIa。
  通过点突变技术使果蝇前翅表达突变后的DmUbxIa、NlUbx、AkUbx,证明NlUbx负责抑制翅形成相关基因的结构域的压制能力显著弱于DmUbxIa,压制能力与AkUbx相似。因此,稻飞虱Ubx蛋白保留或者半保留了原始物种Ubx结构,这是其存在灵敏的剂量效应的分子基础。在此基础上,我们也发现营养丰富的分蘖期水稻诱导稻飞虱InR2表达量上升,营养贫乏的黄熟期水稻诱导稻飞虱InR1表达上升。Ubx对寄主营养也存在响应,即营养丰富的分蘖期水稻诱导稻飞虱Ubx表达量上升,营养贫乏的黄熟期水稻导稻飞虱Ubx表达量下降。
  褐飞虱apA(NlapA)对翅发育的调控作用
  apA在褐飞虱二龄和四龄短翅种群若虫中的表达量显著高于长翅种群。NlapA被干扰之后,造成成虫前翅刚毛消失,翅卷曲,翅长变短。进一步研究发现,apA RNAi导致稻飞虱翅刚毛变少的原因是由于apA的表达量降低致使控制刚毛发育的关键基因Achaete-scute homolog(NlASH)表达量降低。NlapA是NlASH的上游调控因子。
  褐飞虱Dpp(NlDpp)和g(NlVg)对翅发育的调控作用
  Dpp和Vg在长翅和短翅稳定遗传系若虫中的表达量存在显著差异,在长翅若虫中的表达量显著高于短翅。干扰长翅和短翅稳定遗传系三龄若虫Dpp和Vg表达,发现Dpp被干扰后成虫翅的翅脉完全消失;Vg被干扰后,长翅型成虫的前翅和后翅臀田域顶角区出现水泡;但是短翅成虫的前翅臀田域顶角区并无水泡(后翅为翅芽状,无臀田域顶角区)。
  本论文以Ubx、Dpp、Vg、apA4个翅发育基因为对象,比较这些基因在长、短翅型种群中的表达差异,揭示翅发育基因对翅发育、翅型分化的调控作用。研究结果将丰富不完全变态昆虫翅型分化分子机制理论,对揭示褐飞虱灾变的内在原因、实现褐飞虱虫源迁出时间的精细化预测、在褐飞虱迁出地进行源头治理具有重要的意义。
[博士论文] 顾琼楠
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:由希金斯刺盘孢引起的炭疽病是十字花科蔬菜生产上的毁灭性病害之一。近年来,希金斯刺盘孢全基因组序列的公布和遗传转化体系的完善加速了希金斯刺盘孢致病相关基因的发掘和鉴定,同时也为从基因组水平上深入研究希金斯刺盘孢致病分子机制提供了新的平台。本研究对希金斯刺盘孢致病缺陷突变体Ch-1-G281的ChRgf基因和突变体Ch-1-E240的ChAcs基因的功能进行了研究,并观察了希金斯刺盘孢侵染荧光标记拟南芥植株寄主活体营养阶段的亚细胞反应,主要结果如下:
  (1)利用农杆菌介导的转化方法构建了希金斯刺盘孢Ch-1菌株的T-DNA插入突变体库,获得了2000个转化子。通过将突变体分生孢子接种拟南芥植株,观察接种第4天的发病症状及突变体侵染结构的形成情况,筛选得到了7株致病缺陷型突变体,分别为致病丧失突变体Ch-1-G281及致病减弱突变体Ch-1-G090、Ch-1-G256、Ch-1-G310、Ch-1-G323、Ch-1-G668、Ch-1-E240。通过Southern杂交验证了7株致病缺陷型突变体的T-DNA插入拷贝数,其中Ch-1-G256、Ch-1-G281、Ch-1-G310、Ch-1-G323、Ch-1-G668、Ch-1-E240为单拷贝插入,而Ch-1-G090为双拷贝插入。通过Inverse-PCR对致病缺陷型的侧翼序列进行扩增,分别获得了7个T-DNA插入突变体的侧翼序列。侧翼序列分析结果显示:突变体Ch-1-G281T-DNA插入破坏了RasGEF(Ch063_04179)基因,该基因全长3057bp,编码1018个氨基酸,有4个外显子,3个内含子。突变体Ch-1-G090T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_10682)基因,该基因全长543bp,编码180个氨基酸,有1个外显子;另一个插入位点破坏了RNA加工蛋白FCF1(Ch063_10671),基因全长324bp,编码108个氨基酸,有2个外显子,1个内含子。突变体Ch-1-G256T-DNA插入破坏了乳糖透过酶(Ch063_16024)基因,该基因全长477bp,编码159个氨基酸,有2个外显子,1个内含子。突变体Ch-1-G310T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_15059)基因,该基因全长243bp,编码80个氨基酸,有1个外显子。突变体Ch-1-G323T-DNA插入破坏了丝氨酸苏氨酸激酶cot-1(Ch063_12968)基因,该基因全长1983bp,编码660个氨基酸,有4个外显子,3个内含子。突变体Ch-1-G668T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_01887)基因,该基因全长645bp,编码214个氨基酸,有1个外显子。以及突变体Ch-1-E240T-DNA插入破坏了乙酰辅酶A合成酶(Ch063_08070)基因,该基因全长1275bp,编码424个氨基酸,有4个外显子,3个内含子。
  (2)T-DNA插入突变体Ch-1-G281在PDA上的菌落形态变化较大,其菌丝生长速度变慢,菌丝呈多分支状。突变体分生孢子产量降低,孢子液喷雾接种拟南芥叶片后,分生孢子不能在叶片表面正常萌发产生黑化的附着胞,推测该基因影响了分生孢子的萌发以及附着胞的形成。证实T-DNA插入破坏了Ras鸟氨酸交换因子(ChRgf),ChRgf基因全长为3276bp,编码1018个氨基酸。敲除ChRgf基因影响了希金斯刺盘孢的营养生长和菌丝形态,敲除转化子⊿ChRgf-42生长缓慢,菌丝呈现多分枝;产孢量显著下降,仅为野生型的8%;在塑料玻片上诱导孢子萌发,孢子萌发率明显降低,为野生型的50%,萌发的孢子不能正常形成附着胞,而附着胞产率约为野生型及互补突变体的5-10%,而附着胞膨压与野生型菌株并无明显差异。敲除转化子⊿ChRgf-42孢子液喷雾接种拟南芥叶片后,敲除转化子⊿ChRgf-42分生孢子不能在叶片表面萌发并产生黑化的附着胞。敲除转化子⊿ChRgf-42孢内cAMP含量显著降低,仅为野生型胞内cAMP含量的60%,外源加入cAMP以及IBMX可使敲除转化子⊿ChRgf-42对外界疏水信号产生响应。敲除转化子⊿ChRgf-42对外界胁迫如NaC1,KCl的耐受性增强。基因互补实验结果表明,基因敲除菌株的产孢、萌发、附着胞形成及致病性均恢复至野生菌株水平。表明希金斯刺盘孢ChRg基因作为cAMP,Ras等通路的上游调控因子在调控营养生长、产孢以及致病相关的侵染结构的发育等方面具有重要的生物学功能。
  (3)T-DNA插入突变体Ch-1-E240在菌丝生长、产孢、孢子萌发及附着胞形成等方面与出发菌株Ch-1相比没有显著差异。孢子液喷雾接种拟南芥植株后拟南芥植株发病严重度低于野生型,显微观察表明分生孢子在叶片表面正常萌发产生黑化的附着胞,能正常侵染产生初生菌丝,但次生菌丝产量明显降低,推测该基因影响了次生菌丝的产生。T-DNA插入破坏了乙酰辅酶A合成酶基因(ChAcs1),ChAcs1基因全长为1441bp,编码432个氨基酸。生物信息学分析发现,希金斯刺盘孢中有两个乙酰辅酶A合成酶编码基因,分别命名为ChAcs1(Ch063_08070)和ChAcs2(Ch063_00691),采用基因敲除和互补策略,分别对这两个基因进行了功能分析:ChA cs1基因敲除对希金斯刺盘孢的营养生长、产孢和附着胞的形成与野生型无明显差异;ChAcs2基因敲除无明显的表型改变。通过GFP融合表达及蛋白定位分析,发现ChAcs1蛋白、ChAcs2蛋白的表达分布于整个细胞质。⊿Chacs1不能利用乙醛、乙醇、乙酸等非发酵碳源,胞内脂质含量下降。⊿Chacs1敲除转化子接种拟南芥叶片4天后,植株发病严重度低于野生型,只有47%的初生菌丝能正常发育并形成次生菌丝;而⊿Chacs2敲除转化子对致病性无明显影响。对⊿Chacs1敲除转化子接种拟南芥活体营养阶段(侵染40小时后)进行全基因组RNA-seq分析,表明ChAcs1参与调控了一系列与致病、乙醇代谢、糖酵解、三羧酸循环以及乙醛酸循环相关的基因,致病相关基因如MAPK,STE7等基因下调表达,乙醇代谢、糖酵解、三羧酸循环中重要节点基因如乙醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶等基因下调表达。基因互补实验结果表明,基因敲除菌株的致病性恢复至野生菌株水平。以上结果表明ChAcs1可能参与调控了丙酮酸-乙醛-乙酸代谢途径,在调控脂类代谢、致病相关侵染结构如次生菌丝的形成等方面具有重要的生物学功能。
  (4)用希金斯刺盘孢侵染不同荧光蛋白标记的转基因拟南芥植株,以研究拟南芥与希金斯刺盘孢互作过程中的活体营养界面的膜区室的重分布。在活体营养寄生阶段,寄主细胞的质膜蛋白表现出不同的定位模式,肉豆蔻酰化和棕榈酰化蛋白MAP,异戊二烯蛋白PAP,低温诱导蛋白LTI6b均定位于活养寄生界面,突触融合蛋白PEN1与ABC转运蛋白PEN3定位于初级初生菌丝的活养寄生界面,质膜H+-ATP酶PMA与质膜固有蛋白PIP2定位于初生菌丝的基部。与此同时,寄主细胞细胞膜脂也在初生菌丝侵染阶段呈现出不同的定位模式:磷脂酰肌醇-4-磷酸PI4P定位于初生菌丝的基部,磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸PI(4,5)P2定位于活体营养界面,磷脂酰肌醇-3-磷酸PI3P定位于初生菌丝的活养寄生界面。同时磷脂酰肌醇-3-磷酸PI3P定位于初生菌丝的活养界面说明液泡也参与了活养界面的合成以及互作。后期由不同的液泡膜标记蛋白包括液泡膜水通道蛋白以及囊泡相关蛋白VAMP711均包裹初生菌丝界面,证明了液泡参与初生菌丝界面的互作过程。随着初生菌丝的发展,液泡逐渐变小,直至液泡膜破裂,与此同时,粗大的初生菌丝向细长的次生菌丝进行转化,说明寄主细胞死亡与液泡的破裂以及初生菌丝向次生菌丝转变是同一时间点发生的。此外,内吞囊泡ARA7/RABF2b单一定位于初生菌丝的活体营养界面说明寄主细胞的内吞性质发生了改变。上述研究结果表明,希金斯刺盘孢与拟南芥互作过程中存在特殊的活养寄生界面,这一活养寄生界面可能是通过细胞膜的分化或者通过囊泡运输而来,同时,液泡也参与了活养寄生界面的形成。
[硕士论文] 高翠珠
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:设施大棚草莓、番茄灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染引起的一种世界性病害。本文主要研究湖北省设施大棚草莓和番茄灰霉病的发生动态及影响因素分析。2016年在湖北省农业科学院草莓大棚种植基地及武穴市吴谷英村番茄大棚种植基地分别选取3个具有代表性的设施大棚。结合保湿培养法和特异性PCR法检测健康组织上灰霉菌带菌率,系统调查各生育期不同时间、不同组织的病害发生动态。选取与果实发病率具有显著相关性的因子建立线性回归方程,分析草莓和番茄灰霉病的发生与不同流行因子之间的关系,主要结果如下:
  (1)分析设施大棚中草莓灰霉病发生动态及影响因素结果表明:在12月下旬即可检测出草莓不同组织带菌,果实带菌率高峰期在3月下旬、4月中上旬和5月初,1月初、2月下旬和4月中上旬为花朵带菌率的高峰期,叶片带菌无明显高峰期。调查田间发生动态发现,在12月下旬即可在草莓不同组织上观察到灰霉病的发生,果实发病高峰期为3月上旬、4月下旬和5月上旬,3月上旬和5月中上旬为花朵发生灰霉病的高峰期,叶片无明显发病高峰期。基于对设施大棚草莓不同组织带菌率及发生动态的调查,选取其中两个设施大棚数据分析草莓果实发病率与花朵发病率、叶片发病率、果实带菌率、花朵带菌率、叶片带菌率、温度和相对湿度的相关性,结果表明:草莓果实发病率与花朵发病率、果实带菌率、花朵带菌率、叶片带菌率、温度显著相关。果实带菌率、花朵发病率和温度所建方程预测值与实际值拟合程度好。
  不同成熟度草莓果实影响灰霉病的发生,结果发现果实红熟期发病程度较绿熟期、白熟期和粉熟期重。
  (2)分析设施大棚中番茄灰霉病发生动态及影响因素结果表明:在3月中上旬即可检测到番茄叶片上的灰霉菌,4月上旬即可检测到花朵带菌;3月下旬、4月下旬和5月中下旬均为叶片带菌率的高峰期,4月下旬和5月中下旬为花朵带菌高峰期。对番茄不同组织灰霉病的田间发生动态进行调查,发现叶部灰霉病在3月中上旬开始发病,4月中上旬花朵发病,茎秆发病时间在4月中下旬,果实发病时间在4月底;叶片发病高峰期在4月上旬、4月下旬和6月中上旬,花朵发病高峰期在6月中上旬,茎秆发病高峰期在5月下旬和6月中上旬,果实发病高峰期在5月中下旬和6月中旬。基于对设施大棚番茄不同组织带菌率及发生动态的调查数据分析番茄果实发病率与花朵发病率、叶片发病率、茎秆发病率、花朵带菌率、叶片带菌率、温度、相对湿度相关性结果表明:花朵发病率、叶片发病率、花朵带菌率、叶片带菌率和相对湿度与果实发病率呈显著相关性。花朵发病率、花朵带菌率、叶片带菌率所建回归方程预测值和实际值拟合程度好。
  不同成熟度番茄果实与灰霉病的发生,结果发现果实白熟期和转色期发病程度较绿熟期和红熟期重。
  不同温湿度及保湿时间对灰霉病发生的影响显著;果实有伤情况下接种,10-25℃不同保湿时间灰霉病均会发生,保湿12h后,病斑扩展明显,30℃时需保湿12h后才会发病。无伤情况下接种,在最适温度20℃时,至少需要保湿36h才会发病,10℃和30℃下,均需要保湿4d以上才能发病。番茄灰霉病在20℃下随着相对湿度(RH)的增加病斑直径也随之增大。在果实有伤条件下RH需达到66%可发病,无伤条件下RH需达到92%可发病。不管接种果实有无伤口,在RH为100%时病斑直径最大,在RH为20%时,均无病斑产生。
  番茄叶片和茎秆病残体中的灰霉菌在不同土壤湿度中存活期为:干燥土壤>半湿润土壤>湿润土壤。在不同土壤深度中存活期为:土壤表面>土下10cm>土下20cm。
[硕士论文] 何有为
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:芽孢杆菌广泛存在于自然界中,可产生丰富的次生代谢物质,具有极强的抗逆能力和环境适应性,是一类具有实际用途和经济价值的微生物类群。本研究通过室内筛选获得对油菜根肿病菌(Plasmodiphora brassicae)具有较好抑制效果的生防芽孢杆菌F85和T113,此外还发现了一株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)具有很强拮抗效果的枯草芽孢杆菌BJ-1。本研究以此为材料,分别对生防菌株抑制油菜根肿病和稻瘟病的生防机理进行探讨,并综合评价生防芽孢杆菌的生防效果。主要研究结论如下:
  1.从湖北省当阳市油菜根肿病发生严重田块的健康油菜根际土壤先后分离微生物菌株667株,其中细菌323株,真菌253株,放线菌91株;以棉花枯萎病菌及稻瘟菌作为根肿菌指示菌进行平板对峙筛选,其中有54株分离菌株抑菌带宽度大于3mm;通过离体试验发现有20株生防菌株对根肿菌休眠孢子萌发抑制率达30-50%,16株可使根肿菌休眠孢子失活率达40-55%;通过盆栽防治试验发现有2株生防菌株F85和T113对根肿病防治效果达60%以上;两株生防菌处理后显著降低根肿菌的根毛侵染率,降低根肿菌休眠孢子初级原质团的分化,抑制次级游动孢子囊的形成。进一步对生防菌株F85和T113进行鉴定。生防菌株F85和T113菌体细胞均呈杆状,革兰氏染色反应显示阳性,16S rDNA分子鉴定且系统进化树分析都表明菌株F85和T113属于Bacillus,利用Biolog微生物快速鉴定系统鉴定结果也显示为芽孢杆菌属,但不能准确鉴定到种。
  2.通过传统的形态学,16S rDNA序列分析和Biolog微生物快速鉴定系统将对稻瘟菌具有强拮抗作用的菌株BJ-1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液经不同温度(4-100℃)和不同pH(2-12)处理后对稻瘟菌菌丝的生长抑制效果不变,表明枯草芽孢杆菌BJ-1分泌产生的抑菌成分具有热稳定性及耐强酸、碱能力。平板对峙试验结果表明,枯草芽孢杆菌B J-1具有较广的抑菌谱,对多种植物病原菌菌丝生长均有抑制作用,其中对稻瘟菌的抑菌带达22.7mm。显微观察发现,枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液(0.5%v/v)处理后的稻瘟菌菌丝尖端膨大畸形,有菌丝溢断现象。分生孢子经发酵液处理后萌发不正常,产生的芽管畸形膨大,对附着胞形成具有明显的抑制作用。在离体叶片上,浓度为1x108CFU/mL的BJ-1菌体悬浮液和浓度为5%的发酵液和发酵滤液已可完全防治稻瘟病。盆栽试验结果表明,10%枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液喷雾处理,防治效果达50.0%;BJ-1发酵液浸种处理防效更好,对稻瘟病防效可达74.3%,且对水稻植株生长有促生作用。通过实时荧光定量PCR检测,发现BJ-1发酵液处理种子后能诱导SA信号通路PAL、ICS1基因、JA信号通路AOS2基因以及抗性相关蛋白PR1a和PR10的上调表达。说明BJ-1发酵液处理种子可诱导水稻植株体内SA和JA信号通路相关基因的表达,激活水稻的防卫反应,诱导寄主产生系统抗性。
[硕士论文] 田甜
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物寄生线虫(Plant Parasitic Nematodes)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫,主要寄生在植物根部,几乎可以感染所有的作物并造成作物减产,据统计可造成全世界每年1500多亿美元的经济损失。在长期的防控植物寄生线虫的实践中,人们逐渐认识到生物防治有着其它防治措施难以比拟的优势,而生防细菌在防控植物寄生线虫实践中发挥着独特作用,因此基于生防细菌的生物防治技术的研究开发受到世界各国普遍重视。丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)MB03是本实验室从感病植物组织中分离到的一株病原细菌,前期工作已证实该菌对模式线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和主要的作物虫害线虫南方根结线虫(Meloidogyne incognita)均呈现杀虫活性。本研究通过序列比对确定了一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA,对该蛋白的杀虫活性、抑制线虫生长、运动、产卵和取食偏好等的性能和在线虫体内的作用部位进行了观测;对该蛋白的作用结构域进行了分析;然后对其在线虫体内的可能受体进行了初步筛选。所获得的主要研究结果如下:
  基于MB03菌株的基因组序列构建了该菌毒性蛋白与毒性因子的预测数据库。数据库显示MB03中共有200多个潜在的具有直接或辅助杀虫的酶类或毒性蛋白,主要种类包括有Rhs家族、几丁质酶类、胶原蛋白酶类及溶血素类蛋白等。通过VirulentPred网站进行辅助序列分析从数据库中确定一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA作为研究对象。将PtxA基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a上,并表达和纯化获得PtxA纯蛋白。纯化PtxA蛋白对秀丽隐杆线虫显示具有较强的毒性,测得LC50值为65.955(41.032~125.246)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为Y1=-4.493+2.47X1;对南方根结线虫的生测LC50为139.825(30.139~264.375)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为:y2=-6.259+2.917X2,也呈现很强的毒性作用。对秀丽隐杆线虫L1期虫体生长抑制实验表明,PtxA蛋白具有很强的抑制生长作用,在315μg/mL作用浓度下,实验组线虫体长仅达到对照组线虫的50%。此外,PtxA蛋白能够抑制线虫产卵数,相同浓度下实验组线虫产卵数远低于对照组,在252μg/mL作用浓度下,实验组线虫平均产卵数仅为对照组的30%。取食偏好性实验表明相对重组菌来说线虫更偏向于取食含有空载的大肠杆菌。通过用绿色荧光标记秀丽隐杆线虫基因工程缺陷虫株FT63肠道和用FT63作为试虫,经PtxA作用3d后,观察到实验组线虫竹节状荧光结构遭到部分破坏,而对照组则很完整,说明PtxA蛋白可对线虫肠道造成物理伤害。利用pDS3.0系统将ptxA基因敲除,比较PG平板上△PtxA和野生菌株MB03对秀丽隐杆线虫的毒性,结果展示了二者毒性有一定的差异,△PtxA菌株平板上线虫死亡率要小于野生菌株MB03。
  为验证PtxA蛋白两个预测结构域的功能,将各自编码基因片段分别克隆到表达载体上,构建大肠杆菌重组菌MB772和MB773,经表达后得到纯化蛋白DUF和M10_C。利用秀丽隐杆线虫做试虫进行液体杀虫试验,结果显示两个截断的功能结构域片段均对线虫有一定的毒性,其中DUF蛋白的毒性强于M10_C,但是两个截断结构域的蛋白毒性弱于全长结构域的蛋白毒性,反映出PtxA蛋白的毒性要靠两者协作才能完全发挥。
  将PtxA作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交实验从秀丽隐杆线虫体内获取了20多个疑似受体蛋白,从中选取了rps9、rps25、daf-21和col-77等四个受体蛋白基因设计引物,以不同处理时间的线虫总RNA为模板,调查PtxA作用后不同时间线虫基因的表达量变化情况。结果显示相对于对照组来说,PtxA作用线虫12h和24h后,这4个基因表达量基本上都发生了下调,反映出PtxA蛋白影响了这些线虫基因的表达。
[硕士论文] 易时雨
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:灵敏的嗅觉系统在昆虫寄主定位、寻找配偶等行为过程中起着重要的作用。目前的研究表明,气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)等多种蛋白在对气味分子的识别过程中起着重要的功能,但对于OBPs或CSPs在昆虫中确切的生理功能及识别气味分子的机制并不是很清晰。前期在对林业重要害虫松褐天牛Monochamus alternatus Hope寄生性天敌松褐天牛肿腿蜂Sclerodermus sp.触角转录组测序中,鉴定了多个OBPs和CSPs基因,但对于OBPs和CSPs在其嗅觉感受中功能并未深入了解。为此,本课题以松褐天牛肿腿蜂为研究对象,分析了SspCSP2的时空表达特征及与气味分子的结合特性,探索了SspOBP7与寄主挥发物的结合特性及结合机制,以期为探明OBPs和CSPs在其嗅觉感受中的功能奠定理论基础。主要的研究结果如下:
  (一)松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的功能分析
  1.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因的克隆及时空表达特性
  通过PCR技术,克隆得到了1个CSPs(SspCSP2,GenBank登录号:ALG36155.1)的全长,其开放阅读框为360bp,编码120个氨基酸。qRT-PCR实验技术分析了SspCSP2在松褐天牛肿腿蜂不同虫态、不同组织的表达情况,结果表明,SspCSP2显著表达于幼虫、有翅雌虫的腹部及无翅雌虫的腹部,其中在有翅雌虫腹部的表达量最高。
  2.重组SspCSP2与气味物质的结合特性
  成功构建重组质粒SspCSP2-pET20b,并大量表达于大肠杆菌BL21(DE3)中,利用DE52阴离子交换柱成功获得纯净重组SspCSP2。以1-NPN为探针,利用荧光竞争性结合试验,分析SspCSP2在pH7.4和pH5.0条件下与24种气味分子的结合特性。结果表明,在酸性条件下,SspCSP2与大多数气味物质的结合能力高于中性条件,22种物质展现出与SspCSP2具有较强的结合能力(Ki<20μM),其中(-)石竹烯氧化物、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和壬醛3种气味物质与SspCSP2的结合能力最强(Ki<10μM);相反,SspCSP2与顺-3-己烯醇和(+)-α-长叶蒎烯这2种气味物质的结合能力则为在中性条件下的高于酸性条件;但pH对SspCSP2与反式-2-己烯醇的结合能力无影响。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的荧光猝灭分析
  Stern-Volmer方程分析SspCSP2与4种具有电生理活性物质(α-蒎烯、β-蒎烯、γ-异松油烯与(+)-α-长叶蒎烯)的猝灭类型,结果显示4种物质均为静态猝灭;结合位点分析发现,4种物质与SspCSP2的结合比例均为1∶1。热力学方法分析发现,4种物质与SspCSP2之间的相互作用力均为疏水性作用力。
  (二)松褐天牛肿腿蜂SspOBP7与气味分子的结合机制
  1.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的荧光猝灭分析
  SspOBP7与24种气味分子的猝灭类型和相互作用研究结果表明,SspOBP7与18种气味分子的猝灭类型属于动态猝灭,余下的6种物质属于静态猝灭;6种静态猝灭的物质中有3种物质属于非极性分子,分别为s-(-)柠檬烯、(+)-α-长叶蒎烯和异松油烯,与SspOBP7形成疏水性作用力;余下3种物质,反式-2-己烯醇、顺-2-戊烯-1-醇和癸醛则属于极性分子,与SspOBP7形成氢键作用;双对数方程分析结果显示,6种物质与SspOBP7的结合比例均为1∶1。
  2.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的结构分析
  利用圆二色谱法分析了SspOBP7在不同pH值、不同配体配比条件下的二级结构变化。结果表明,pH值的变化会引起SspOBP7的α螺旋含量的变化,其中pH7.4条件下SspOBP7的α螺旋数最多,其次是pH3.0,最少的为pH5.0;设定pH7.4,SspOBP7的α螺旋数会随着配体配比的增加而减少;当SspOBP7与配体按1∶1结合后,改变体系pH值,蛋白的α螺旋数变化规律与SspOBP7纯蛋白的一致。
  以意大利蜜蜂Apis mellifera的AmelOBP5(3R72)为建模模板,对SspOBP7进行同源建模。结果显示,SspOBP7具有6个α螺旋,3个二硫键,属于Classical OBP;分子对接结果显示SspOBP7中央具有一个结合腔,呈球状,结合腔的表面具有三处极性区域,分别为Thr86、Tyr105和Phe118。分析极性区域处形成的氢键作用,发现Thr86处与配体形成氢键作用时,需要Tyr105的参与,Phe118与配体形成氢键作用的位置为主链上的氧原子,Tyr105可以单独与配体形成氢键作用,且形成的位置为侧链羟基上的氧原子。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的定点突变及与气味分子结合机制
  针对Tyr105设计定点突变,突变成Phe105,目的是破坏氢键作用。表达、纯化出重组突变蛋白,测定了突变蛋白与6种静态猝灭物质的结合情况。结果显示,这6种物质与突变蛋白的结合能力均有一定程度的减弱,但结合比例没有改变。突变后的SspOBP7与极性分子葵醛的结合能力显著下降,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变之后氢键作用消失;而突变后的SspOBP7与其它2种极性分子,反式-2-己烯醇和顺-2-戊烯-1-醇,仍具有较强的结合能力,荧光猝灭和分子对接结果显示,蛋白突变之后,氢键作用还存在,只是位置发生改变;突变后的SspOBP7与3个非极性分子结合能力明显减弱,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变后仍为疏水性作用,但3个分子在结合腔内的取向均发生了改变。通过对比分析蛋白的结合腔,发现SspOBP7突变之后,结合腔的体积明显变大。
  综上,松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因主要分布在虫体腹部,SspCSP2对气味物质的选择性差,SspCSP2与电生理活性物质主要是通过疏水性作用力结合;SspOBP7与24种物质中的3种极性分子和3种非极性分子结合,结合力分别为氢键作用和疏水性作用力,环境中改变pH值和配体的浓度均会使蛋白的二级结构发生改变,极性区域的破坏会导致SspOBP7的结构发生转变,从而影响蛋白与气味分子的结合,相比之下,非极性分子结合力的改变更明显,疏水性作用力所受影响比氢键作用力更明显。
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