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[博士论文] 刘卫敏
动物学 山西大学 2014(学位年度)
摘要:蚧虫在分类上属昆虫纲Insecta,半翅目Hemiptera,蚧总科Coccoidea。全世界已记录49科7500余种。在进化上它们与蚜虫的关系最为近缘,是重要的经济昆虫,大多数是农林、果树、花卉的重大害虫。蚧虫的最大特点是体壁具有多种蜡腺,能够分泌蜡质,在虫体表面形成固定形状的蜡层或蜡壳,对虫体起保护作用,化学杀虫剂不易渗入,防治十分困难。
  为探索利用病原真菌感染蚧虫,使其致病死亡,以减少虫口密度和危害,实现生物防治的新途径。本文选择专门危害松林的松干蚧科Matsucoccidae,松干蚧属Matsucoccus的日本松干蚧Matsucoccus matsumurae(Kuwana)作为古蚧类Archaeococcoids的代表,选择分布范围广、寄主多、虫体表面具有厚蜡壳保护的蚧科Coccidae蜡蚧属Ceroplastes的日本龟蜡蚧Ceroplastes japonicus Green作为新蚧类Neococcoids的代表。选择从蚧虫和褐飞虱上分离的病原真菌蜡蚧霉Lecanicillium lecanii V3.4504菌株和V3.4505菌株、镰孢霉Fusarium incarnatum-equiseti HEB01菌株和HEB02菌株作为试验菌种,研究病原真菌对这两种蚧虫的感染过程,引起的病理学症状和生化反应。
  日本松干蚧部分研究结果如下:
  1、日本松干蚧形态特征、泌蜡特点与发育进度的研究
  日本松干蚧雌雄两性变态复杂,不同龄期的形态结构变化很大,泌蜡特性不同,同时,日本松干蚧在我国东部地区从东北到南方都有分布,气候差异很大,虫体发育出现时间各地都有不同,以往的研究资料不太充分,对于应用病原真菌开展生物防治不能提供科学指导。本研究选择辽宁省抚顺市(LNFS)、山东省青岛市(SDQD)和浙江省金华市(ZJJH)作为三个气候区的代表,在日本松干蚧危害的林区布点,通过野外观测和室内显微观察拍照等方法,详细观察研究日本松干蚧的各龄期的发育、形态特征变化、泌蜡特点、出蛰、越冬、交配、产卵等生物学特性。结果表明,日本松干蚧在上述三个气候区都是一年发生两代,但三个气候区各虫态发育历期明显不同。ZJJH种群春季3月上旬开始出蛰、SDQD种群4月下旬-5月上旬出蛰,LNFS种群5月中旬-下旬才出蛰,LNFS种群在10月份进入越冬期,而ZJJH种群在12月才开始越冬。并发现这些差异与各地的温度变化直接相关。研究发现了日本松干蚧一些新的生物学特性和规律,特别是掌握了二龄珠形期若虫在春季的显露过程、三龄雄若虫分泌蜡丝和结茧行为、雄成虫的羽化、求偶与交配行为、雌成虫的羽化、交配、分泌蜡丝、形成卵囊和产卵行为。这些结果都为开展日本松干蚧的病理学研究和生物防治应用提供了基础。
  2、日本松干蚧雌性生殖系统的显微和超微结构研究
  日本松干蚧成虫期是一个交配和繁殖的时期,雌成虫的体腔内主要由卵巢占据,病原菌在这个阶段对日本松干蚧的侵染必然涉及到卵巢的病理变化,但是以往对雌成虫的生殖系统的结构还没有研究报道。本文采用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜技术研究雌成虫生殖系统的构造,为组织病理学研究提供基础知识。
  结果表明,日本松干蚧的雌性生殖系统由一对卵巢、一个主输卵管、一对侧输卵管、一个储精囊和两对副腺构成。每一个卵巢具有大约50个端滋式卵巢管,卵巢管无端丝,占据体腔大部分空间。每个卵巢管包括一个端部的滋养室,一个生长区和一个末端的卵柄,卵柄与侧输卵管相连。滋养室包含8-10个滋养细胞和2个早期的卵黄发生前卵母细胞。卵成熟后,滋养细胞退化,停滞卵母细胞能够继续发育。生长区包含3-6个处于不同发育阶段的卵母细胞:卵黄发生前、卵黄发生和绒毛膜发生三个阶段。生长区的表面有多边形网状结构花纹,花纹中央具有一个圆形突起。卵母细胞内有大量的卵黄球和脂滴,外部被一单层滤泡细胞包围。首次在蚧虫中观察到滤泡细胞在卵黄发生的开始具有双核细胞;在卵黄发生过程中,卵母细胞质的外围具有副核。本研究结果首次提供了日本松干蚧雌成虫生殖系统的细微结构,为日本松干蚧的分类提供了新性状,为理解整个松干蚧科昆虫的进化地位提供了新的资料,具有重要意义,并为研究病原菌对日本松干蚧卵巢的感染和病理学症状分析提供基础。
  3、昆虫病原真菌蜡蚧霉和镰孢霉对日本松干蚧的致病性研究
  本文试验了昆虫病原真菌蜡蚧霉Lecanicillium lecanii V3.4504菌株和V3.4505菌株,镰孢霉Fusarium incarnatum-equiseti HEB01菌株和HEB02菌株对日本松干蚧四个龄期的致病性。结果表明,四个菌株都能引起日本松干蚧染病和死亡。蜡蚧霉的两个菌株比镰孢霉的两个菌株对日本松干蚧表现出更强的毒力,其中以蜡蚧霉V3.4505菌株的毒力最强,它的感染引起二龄若虫和雌成虫的死亡率分别为61.33%和100%。不同龄期的日本松干蚧对蜡蚧霉V3.4505菌株的敏感性不同,最敏感的阶段出现在雌成虫期和雄性三龄若虫期,但是雌成虫(LD50=1.96)比雄性三龄若虫(LD50=5.67)更容易感病。根据对日本松干蚧在不同发育阶段虫体的形态特征、体表结构、表皮层厚度和蜡壳的研究结果,分析了对病菌侵染敏感性不同的原因。确定了雌成虫和雄性三龄若虫为应用真菌进行生物防治的最佳虫期。这是首次关于病原菌感染日本松干蚧的报道。
  4.日本松干蚧受蜡蚧霉感染的组织病理学和糖代谢变化研究
  以日本松干蚧雌成虫作为研究对象,利用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜技术,研究了病原真菌蜡蚧霉对日本松干蚧的感染过程和组织病理学。结果表明,蜡蚧霉能够快速的侵染日本松干蚧,主要通过体壁侵染。分生孢子在虫体表面附着后萌发很快,染菌12h后,在虫体表面就观察到菌丝。虫体的节间褶、背疤、足的基部和阴门处是病菌最易附着和分布的地方。染菌24h后,观察到菌丝已经穿透体壁,菌丝的入侵导致表皮层的蛋白质和几丁质嵌合结构变形。菌丝进入血腔后,首先侵染血细胞,导致血细胞的细胞膜破裂,细胞器消失,然后侵染其他内部组织。菌丝对肌肉的附着和入侵,导致菌丝周围的肌肉组织发生扭曲变形,肌纤维变得疏松;大量菌丝侵入脂肪体,导致脂肪细胞膜消失,多个脂肪细胞的脂滴融合在一起。卵巢管占日本松干蚧体腔的大部分,观察到菌丝附着和侵染卵巢管表面的滤泡细胞,使滤泡细胞和卵母细胞分离。菌丝在虫体内大量繁殖,耗尽虫体内的营养,菌丝又向虫体外扩散。本研究还发现病原菌可以直接通过阴门侵入虫体内部,对卵巢和相邻器官造成感染。
  利用生化反应和酶标仪测定了日本松干蚧感染蜡蚧霉后,血淋巴中糖代谢指标的变化。结果显示,染菌后,虫体内海藻糖酶的活性呈现先升高后降低的趋势,在染菌后12h,染菌组虫体内的海藻糖降解酶活性就比对照组的高,36h后,其酶活性升高到最大值(0.480±0.020)U/mg,约为对照组的1.5倍。随后海藻糖酶的活性很快下降。同时,染菌后,蚧虫血淋巴内海藻糖的含量逐渐降低,24h后,处理组的海藻糖含量已低于对照组,到96h,其含量只有(0.623±0.047)mM。葡萄糖含量在12h到36 h期间快速上升,36h后达到最高值(0.704±0.029)mM。随后其含量逐渐降低。这三项指标的变化说明,由于病原真菌的感染,引起虫体内海藻糖酶活性的增加,促进了海藻糖降解,转化成葡萄糖,形成了海藻糖酶—海藻糖—葡萄糖的连环反应,最终虫体内的营养被耗尽,虫体死亡。
  本研究结果从组织病理学和血糖平衡两方面揭示了蜡蚧霉如何感染和致死日本松干蚧。
  日本龟蜡蚧部分研究结果如下:
  5.病原真菌对日本龟蜡蚧蜡壳的入侵机制研究
  为了研究病原菌对蚧虫蜡壳的作用机理,选择蜡蚧霉Lecanicillium lecanii V3.4504菌株和V3.4505菌株,镰孢霉Fusarium incarnatum-equiseti HEB01菌株和HEB02菌株,以泌蜡量大的日本龟蜡蚧雌成虫作为对象进行研究。结果显示,蜡蚧霉能够成功的穿透日本龟蜡蚧的蜡壳侵入虫体,但是,病原菌在带有蜡壳的蚧虫上的生长、繁殖和入侵速度明显的比在没有蜡壳的虫体上慢,说明蜡壳对病原菌的入侵有阻碍作用;以蚧虫的完整蜡壳、单独蜡质、蜜露分别作为唯一碳源,制备成三种培养基,试验发现4个菌株在这三种培养基上都能萌发生长,形成菌落,说明真菌可以降解蚧虫蜡壳,并利用蚧虫蜡壳成分作为营养物质。4个菌株对完整蜡壳的降解率17.23%-18.70%显著大于对单独蜡质的降解率7.15%-12.78%,说明病原真菌在对蜡壳的降解过程中除了利用蜡质成分,还利用蜜露作为碳源营养。GC/MS分析显示,病原菌主要降解日本龟蜡蚧蜡壳中的酯醇和短链的羧酸酯。生化技术测定菌株代谢的酯酶活性的变化,结果显示酯酶参与了蜡壳的降解,酯酶活性与病原菌对蚧虫的致死率之间呈显著正相关,回归方程:y=0.0127x-0.6605,R2=0.9431。本研究结果揭示了病原真菌降解蚧虫蜡壳的机制。
  6.病原真菌对日本龟蜡蚧体壁的穿透及胞外酶的作用
  本文研究病原真菌对日本龟蜡蚧体壁的穿透过程及胞外酶的作用,采用了麦胚凝集素/卵类黏蛋白-胶体金细胞化学标记技术,将胶体金颗粒成功地结合到日本龟蜡蚧原表皮的几丁质上,利用透射电镜首次观察到几丁质的片层结构,发现几丁质纤维丝呈螺旋状排列,并观察到病原菌穿刺进入体壁,导致表皮几丁质片层结构断裂的组织病理学症状,在菌丝周围标记几丁质的颗粒减少,说明几丁质已被病原菌分泌的胞外酶降解。
  用酶标仪测定病原菌分泌的类枯草杆菌蛋白酶(Pr1)、几丁质内切酶、几丁质外切酶(β-乙酰-N-葡萄糖苷酶,NAG)和脂肪酶活性,结果显示这四种酶都参与了蚧虫表皮的降解,其中脂肪酶的活力最高值出现的最早,在培养2d后即达到最大值,蛋白酶活性次之,培养3d后达到最大值,而几丁质内切酶和几丁质外切酶的活性在培养4-5d天后才达到最大值。说明这几种酶在降解体壁成分中作用的先后顺序,病原菌在入侵体壁过程中首先接触到上表皮,分泌脂肪酶降解上表皮中的脂肪,然后侵染原表皮,诱导蛋白酶降解蛋白质,几丁质骨架暴露出来,几丁质酶再发挥作用,降解几丁质。在这些酶的联合作用下将表皮降解,以利菌丝穿透体壁。而菌丝周围标记几丁质的颗粒减少,印证了几丁质内切酶和几丁质外切酶的降解作用。日本龟蜡蚧的致死率与NAG酶活性之间呈显著正相关(R2=0.9109)。
  7.病原真菌对日本龟蜡蚧血淋巴的感染作用研究
  采用透射电镜技术观察了蜡蚧霉进入日本龟蜡蚧血腔后对血细胞的感染作用,在蜡蚧霉侵染初期的样本上,观察到蚧虫血淋巴中的浆细胞和粒细胞将病原菌吞噬并消化的现象;在侵染后期的样本上,观察到大量病原菌侵入血细胞,使细胞膜破裂,细胞器消失;在受损的血细胞中还发现很多髓样小体。
  用酶标仪测定血淋巴中酚氧化酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性,结果显示,这四种酶在蚧虫感染后的2-3d活性值都最高,在后期,血淋巴内的酶活力逐渐下降。同时测定了海藻糖酶活性、海藻糖和葡萄糖含量的变化,它们也呈现前期高后期低的变化规律,揭示出海藻糖和葡萄糖含量的变化与海藻糖酶活性呈显著的相关性,说明蜡蚧霉的入侵,对蚧虫免疫系统和糖代谢造成影响,是其致病的重要原因。该研究首次为蜡蚧霉感染蚧虫血淋巴的作用提供了新证据。
[博士论文] 高英
动物学 山西大学 2014(学位年度)
摘要:白蜡绵粉蚧(Phenacoccus fraxinus Tang)是白蜡树上一种刺吸性害虫,该虫体表具有多种蜡腺,在生长发育过程中可分泌大量对虫体具有保护作用的蜡质。现已在我国多个省市危害猖獗,严重影响了树势和城市景观。化学防治效果不理想,且严重污染环境。对白蜡绵粉蚧的生物防治尚未见报道。在生物防治中,蜡蚧霉(Lecanicilliurn lecanii)和布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)是应用广泛的两种昆虫病原真菌,其代谢物在对昆虫的致病过程中发挥了重要作用。真菌代谢物成分复杂,以往分离纯化代谢物的步骤繁琐且不易得到纯品。高速逆流色谱技术是一种新型的分离技术,已经广泛应用于天然产物的分离纯化,但利用高速逆流色谱技术分离纯化病原真菌代谢物的报道很少。
  本文研究了L.lecanii3.4505对白蜡绵粉蚧的致死率,通过光学显微镜、扫描电镜与透射电镜研究了蜡蚧霉对白蜡绵粉蚧的侵染过程以及白蜡绵粉蚧被感染后的组织病理变化。同时,利用高速逆流色谱对L.lecanii3.4505和B.brongniartii2382菌株的代谢产物进行分离纯化,利用GC/MS分析检测分离产物。这些研究可为昆虫病原真菌的杀虫机制研究和利用该菌防治害虫提供理论依据。
  研究结果如下:
  1.L.lecanii3.4505菌株对2龄白蜡绵粉蚧雌、雄若虫生物测定结果显示:L.lecanii3.4505菌株对2龄白蜡绵粉蚧雌、雄若虫有较高的感染致死率,2d后雌、雄若虫的死亡率就达到40%以上,5d后的死亡率达到90%。该菌能在短时间内完成对白蜡绵粉蚧虫的侵染,这可能是由于白蜡绵粉蚧2龄若虫本身虫体弱小和分泌的粉状干蜡尚不能够阻止蜡蚧霉入侵。
  2.采用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜技术,系统地观察研究了L.lecanii3.4505菌株孢子在白蜡绵粉蚧若虫体表附着、萌发、菌丝穿透体壁的过程和对内部组织的侵染及其引起的组织病理学变化。研究发现:L.lecanii3.4505分生孢子感染蚧虫后,分生孢子主要附着虫体节间褶、体表的凹陷处、与寄主植物接触的体缘部位,这些地方成为蜡蚧霉侵染蚧虫的重要途径,这表明蜡蚧霉孢子可冲破蚧虫蜡质的疏水性和抑菌作用在虫体某些部位附着。孢子随后萌发,一端膨大形成附着胞,紧紧固着在体表。芽管继续生长形成菌丝,菌丝沿寄主体表在蚧虫分泌的蜡质中穿过,有些菌丝前端特化形成锥状侵入钉,并寻找合适的入侵位点穿透寄主表皮。孢子或菌丝在生长过程中分泌大量的粘液,这些粘液会对寄主表皮造成明显的物理性破坏。染菌2d后,菌丝已经将寄主体壁结构破坏完全进入其体内。进入血腔之后,菌丝利用寄主血腔中的物质作为生长所必需的营养物质迅速生长,生成大量的芽生孢子。血细胞中的各种细胞器都被破坏,内质网扩张、聚集成指纹状;线粒体变形、肿胀、膜破裂、嵴突变形。肌肉中肌细胞内的线粒体同样遭到严重破坏,肌原纤维界限不清,成不规则状态,部分肌丝断裂甚至溶解。气管、脂肪体、马氏管、肠和神经节等多种内部器官均受到不同程度的破坏,最后菌丝完全占据了寄主的整个血腔,整个虫体被白色的菌丝体包裹,菌丝成辐射状向外延伸。
  3.利用高速逆流色谱技术,通过两相溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶5∶4∶5)从蜡蚧霉发酵液的乙酸乙酯粗提物中可一步分离纯化得到苯酚、二甲苯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异丁酯。其中邻苯二甲酸二丁酯的含量较高,面积归一法计算纯度为98%。
  4.利用高速逆流色谱技术,通过两相溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3.5∶5∶3.5∶5)从白僵菌发酵液的乙酸乙酯粗提物中可一步分离纯化得到2-香豆满酮、间甲基苯甲酸甲酯、对甲基苯甲酸甲酯和邻苯二甲酸二丁酯。GC检测其纯度分别为81%、89%、80%和78%。
  5.白僵菌代谢物测定结果表明,间甲基苯甲酸甲酯和对甲基苯甲酸甲酯均对油松毛虫产生不同程度的毒性。间甲基苯甲酸甲酯对油松毛虫幼虫的死亡率分别是饲喂法34.44%、接触法35.56%、注射法87.78%,而对甲基苯甲酸甲酯对油松毛虫幼虫的死亡率分别是37.78%、38.89%、91.11%。
[硕士论文] 岳素红
森林保护 河北农业大学 2014(学位年度)
摘要:白僵菌Beauveria bassiana是一种重要的广谱虫尘真菌。然而在研究和应用过程中出现的菌株退化问题严重影响了应用白僵菌进行害虫生物防治的应用效果,也是许多科研工作者多年来致力于解决的问题。本研究采用紫外线诱变的方法筛选桑天牛高毒力株及耐吡虫啉突变株,并采用PFLP分子标记、ITS序列分析及酯酶同工酶技术研究白僵菌退化的遗传学原因,主要结果如下:
  (1)桑天牛幼虫高毒力白僵菌菌株紫外线诱变选育
  利用紫外线对前期筛选出的白僵菌菌株Bb00进行诱变选育,选出高几丁质酶突变株,再利用该突变株测定其对桑天牛幼虫的致病力,获得毒力高于出发菌株的突变株Bb00-3和Bb00-4。其中突变株Bb00-3经继代培养6次后,每代的产孢量始终高出相应代数出发菌株的2倍以上,继代过程中亦没有出现致病力的明显降低,表现出较好的遗传稳定性。
  (2)球孢白僵菌耐吡虫啉突变株的紫外线诱变选育
  在含吡虫啉的含药培养基上,利用紫外线对前期筛选出的白僵菌菌株Bb00进行诱变选育,分离筛选到抗吡虫啉的突变菌株Bb00-UVY1、Bb00-UVY4和Bb00-UVY7,三个菌株对吡虫啉的敏感性明显降低,EC50分别为原始菌株的13.35、12.40和8.84倍。四种常用杀虫剂阿维菌素、毒死蜱、灭幼脲和氯氰菊酯与突变株Bb00-UVY1和Bb00-UVY7的交互抗性更好,抑制率分别在3.08~12.10%和2.80~10.21%之间。抗药稳定性分析表明,突变菌株Bb00-UVY1和Bb00-UVY7经连续6次转接后,对吡虫啉的敏感性变化不大,表明随着传代培养其耐药性能够稳定遗传。
  (3)白僵菌菌株退化的RFLP及ITS序列分析
  对本实验用真菌的通用引物ITS4,ITS5对经过继代培养的第1、4、6、8、10、12、14、16、18和20代菌株进行特异性扩增,10代菌株均扩增出长度约580bp左右的目的片段,然后用限制性内切酶AluⅠ、BstⅪ、EcorⅠ和DraⅡ对扩增产物进行限制性酶切,产生酶切图谱,发现酶切rDNA-ITS序列的RFLP图谱差异很小,不适宜用来作为鉴定白僵菌早期退化的标准。将PCR扩增产物委托上海生物有限公司进行测序,发现球孢白僵菌不同传代菌株的ITS序列具有多态性,菌株的rDNA-ITS序列在第0~80bp和第559~570 bp有碱基替换,序列的一致性达97.12%。可利用ITS-RFLP技术和扩增产物测序结果相结合的方法进行球孢白僵菌菌株退化的早期遗传检测。
  (4)白僵菌菌株退化的酯酶同工酶比较分析
  本实验利用酯酶同工酶技术分析各代白僵菌株在蛋白质水平的变异情况,结果表明:随着传代次数的增加,主要酶带一直存在且酶谱类型未变,但其酶的活性在不断减弱,尤其是几条主要酶带(A、E、C)的活性变化更为明显。从聚类图中各菌株排列次序来看,各代菌株按照传代顺序排列。与第1代菌株比较,继代次数越多其间的类间距越大,变异越大。
[硕士论文] 刘子瑜
生物化学与分子生物学 江苏科技大学 2012(学位年度)
摘要:随着昆虫杆状病毒分子生物学研究的不断深入,昆虫杆状病毒得到了广泛的应用。昆虫杆状病毒载体表达系统以杆状病毒作为载体,在虫体内和昆虫细胞表达外源基因。在昆虫杆状病毒的级联复制中,极早期基因ie-1所编码的IE-1蛋白对病毒的复制具有多功能的调节作用。其既是早期基因的反式激活因子,又是晚期表达的激活因子。极晚期的多角体启动子(Polyhedrin Promoter,简称polh启动子)受其调控激活。在杆状病毒基因表达调控中,晚期和极晚期基因表达是在病毒DNA复制后发生的,在晚期和极晚期启动子转录过程中,加入IE-1蛋白后,可以激活polh启动子的转录。因此,多角体启动子需要极早期基因表达的产物才能激活,这使其具备了诱导特异性。
  本实验构建了具有极强诱导性的表达载体系统,并在转基因细胞系与转基因家蚕中进行了研究。该系统均利用杆状病毒在复制中激活 polh启动子为诱导条件,构建了具备该诱导条件的转入细胞的表达载体polH-sp-EGFP;在piggyBac转座子载体基础上,以家蚕肌动蛋白 A3基因为启动子启动 GFP作为筛选标记,构建了和转入家蚕的表达载体 polH/GFP。通过 G418筛选获得了转基因细胞系;通过家蚕早期胚胎的显微注射与筛选获得了转基因的阳性个体,最终获得目的转基因家蚕。实验结果显示,在转基因条件下,诱导性表达载体系统成功表达:在病毒侵染下,病毒复制产生的激活因子能够诱导激活了表达载体质粒中的polh启动子,从而使外源基因开始表达,即发生了荧光表达。
  同时,本实验尝试构建一种能够抑制病毒复制的病毒诱导性表达系统。即又尝试建立了具有多角体启动子及ie-1反向序列的细胞株。实验结果表明,当该细胞株受杆状病毒感染时,能够激活细胞内多角体启动子,转录其携带的ie-1的反向序列产生ssRNA,部分抑制病毒本身的复制。这为今后构建杆状病毒自身诱导性表达系统及农业抗病应用方面,提供理论借鉴。
[硕士论文] 颜珣
农业昆虫与害虫防治 中山大学 2005(学位年度)
摘要:  昆虫病原线虫(entomopathogenicnematodes,简写为EN)特指线虫动物门中专性寄生在昆虫体内并带有共生细菌的线虫类群。EN现已成为一类新型生物杀虫剂,已商品化并成功用于防治多种害虫。共生菌在EN对害虫的致病力中起关键性作用。昆虫病原线虫共生菌已成为一类亟待开发的生物资源,共生菌的准确分类鉴定是开展相关研究的基础。   本研究对在我国采集到的两个属共35株昆虫病原线虫共生菌的16SrDNA部分序列进行PCR扩增并测定其核酸序列,与GenBank中现有的昆虫病原线虫共生菌同源序列进行比对,构建系统发育树,初步确定了各个菌株的分类地位,其中GDc318、GDc328、GDc339、GDh7、YNb112、YNc214、YNc215、YNd37、YNd72等可能是Xenorhabdus属的新种。最近本实验室已完成了其中一些菌株的形态和生理生化的鉴定,两者所得结果一致,显示以16SrDNA作为分子标记对昆虫病原线虫共生菌进行初步鉴定是可行的。该研究为进一步开发利用这些共生菌打下了基础,对共生菌资源调查和分子系统学等方面的研究具有重要意义。
[博士论文] 陈春
农业昆虫与害虫防治 浙江大学 2005(学位年度)
摘要: 本研究以流行最广且不产休眠孢子的新蚜虫疠霉Pandoraneoaphidis的传播机制为突破口,以麦长管蚜Sitobionavenae和桃蚜Myzuspersicae作为具代表意义的寄主蚜虫,一是从空中大量诱捕迁飞性有翅蚜,带回室内单头饲养以观察统计它们的带菌种类及频率;二是通过严格的有翅蚜带菌模拟飞行试验,测定受侵染有翅蚜的迁飞能力、定殖能力、孤雌生殖力以及触染后代蚜群的传病能力。所获数据经统计与流行学模型模拟分析,提供有翅蚜迁飞传病的生物学证据。   研究结论:蚜虫流行病中以新蚜虫疠霉占支配地位的蚜虫专化性病原真菌,能够被空中迁飞性有翅蚜携带和传播,不同地点的传带率均为30﹪左右。新蚜虫疠霉接种麦长管蚜和桃蚜有翅蚜的模拟飞行试验及其后续单头饲养建群观察,有效地证明了带病有翅蚜在其发病死亡前具有飞行扩散和定殖繁殖能力。一旦定殖成功,病害即经有翅蚜传给后代蚜群,再经后代蚜相互间传染而引发流行。本研究结果完全支持虫霉流行病随寄主迁飞在蚜虫种群中扩散传播的科学假设。由于迁飞扩散是寄主蚜虫找到适合营养植物的高级适应策略,与蚜虫关系紧密的专性病原真菌可利用寄主迁飞行为而跨植被、跨地区传播和流行,因而很可能是包括新蚜虫疠霉、普朗肯虫霉、弗雷生新接霉及暗孢耳霉等蚜虫专性病害真菌在全世界传播流行的主要或基本途径。
[硕士论文] 李雪雁
农业昆虫与害虫防治 山东农业大学 2003(学位年度)
摘要:诺氏虫疠霉(Pandora nouryi Humber)隶属于接合菌亚门、接合菌纲、虫霉目、虫疠霉属,是蚜虫的专性寄生菌.该菌在春秋两季常引起蔬菜田蚜虫大面积流行病,能有效地控制菜蚜的发生数量和发生面积.诺氏虫疠霉致病力强,在自然条件下侵染率(感染率)可达到49.1﹪,是一种亟待开发的微生物资源.该文对分离得到的诺氏虫疠霉菌株进行了研究,主要的研究内容和结果有:1.系统地研究了该实验室分离获得的诺氏虫疠霉菌株的生物学特性.2.筛选出有利于诺氏虫疠霉(P.nouryi)生长的碳、氮源和培养基.3.明确了诺氏虫疠霉(P.nouryi)侵染桃蚜的致病机理.4.通过诺氏虫疠霉对桃蚜的生物测定证实了该虫疠霉对桃蚜若蚜具有较高毒力.用8个剂量处理每剂量接种80~121头若蚜,逐日记录感病死亡数并确证死因.5.研究了17种蔬菜田常用杀虫剂、杀菌剂对诺氏虫疠霉生长及产孢的影响.
[博士论文] 王津红
动物学 南开大学 2001(学位年度)
摘要:中国幅员辽阔具有独特而丰富的生物多样性.该文从全国27个省、自治区及4个直辖市采集1080份土壤、贮库粉尘、死虫体及植物叶片等样品,在其中的406份中分离到苏云金芽孢杆菌965株.镜检可观察到8种主要形态的伴孢晶体,其中菱形晶体的含量最高约占50﹪,其次为圆形、方形和长方形晶体;大部分Bt分离株含有多种晶体形态.采用特异引物PCR对221株Bt分离株进行了crylAc、crylC及crylE杀虫晶体蛋白基因检测,并进一步测定其中部分被检基因阳性菌株对棉铃虫和甜菜夜蛾的杀虫活性,筛选到一株具有优良基因组合(crylAa、crylAc、crylCa、crylD、crylI及cry2Ab基因)而且对棉铃虫、甜菜夜蛾、小菜蛾、美国白蛾等多种鳞翅目害虫具有高效广谱的生物活性的分离株Btl5A3,经鉴定属血清型H21,为colmeri亚种;其发酵条件及室内外毒力、毒效测定结果显示该菌株极具生产开发潜力并已申请专利.利用PCR方法对310株具有生态地域代表性的Bt分离株中cryl、cry2与cry9类基因及cry1各亚类(crylA-1K)基因的类型、组成与分布进行了检测与特性分析.
[博后论文] 黄武仁
中国科学院上海生命科学研究院;上海植物生理生态研究所;中国科学院大学;中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所 2016(学位年度)
摘要:无脊椎动物对胃肠道和皮肤的伤口修复分别存在着不同的作用机制。昆虫中肠是分泌消化酶、消化食物和吸收养分的最主要器官。胃肠道穿孔,既在胃肠道中产生一个孔洞,对哺乳动物来说是一种非常严重的疾病,进行外科手术是治疗穿孔、防止胃肠道脓肿和败血症的必要手段。本文研究报道了用针刺昆虫幼虫肠道,模拟昆虫肠道产生穿孔,研究中肠的修复机制。研究发现,家蚕肠道穿孔后,仅有微弱的免疫反应发生,在肠道产生穿孔6小时取其血清,发现其血清仅能微弱的抑制大肠杆菌作用,对枯草芽孢杆菌未发现抑制作用。在伤口修复过程中,血细胞在针刺伤口部位快速凝集,并形成结痂。伤口附近部位的中肠细胞未检测到细胞分裂和细胞凋亡反应。但针刺能显著的促进家蚕伤口附近的细胞进行DNA复制,同时发现伤口附近部位的细胞进行DNA复制对于伤口修复是必须的。由于针刺造成的中肠伤口能快速修复,并仅产生微弱的免疫反应,因此,这种方法改进之后,可采用针刺注射昆虫中肠的方法研究筛选对肠道起作用的的小分子药物等物质;本研究选用了不同浓度乙醇进行家蚕幼虫中肠注射,研究其对肠道的影响。发现使用这种方法可快速、准确和有效的获得实验结果,因此这种针刺注射法将来可以用来快速有效的筛选治疗肠道疾病的化学药剂。本研究通过对昆虫中肠物理伤口的修复进行研究,揭示出的昆虫中肠的修复机制和研究策略,可促进昆虫伤口修复的相关工作的展开,为高等动物胃肠道的研究以及药物筛选方面的应用研究提供了借鉴。
[硕士论文] 苏志坚
动物学 中山大学 2001(学位年度)
摘要:该文通过调节温度、湿度和虫口密度等因子以及用紫外线近距离照射携毒幼虫对潜伏病毒的激活作用,结果发现:在高温、高湿和高虫口密度条件下,有部分携毒子代幼虫发生病毒病而死亡,从而确定了高湿是一个能有效激 活潜伏病毒的压力因子;此外,通过紫外线近距离照射不能诱使当代携毒斜纹夜蛾幼虫发生病毒病.用含有SpltNPV的不同溶液饲喂斜纹夜蛾成虫,使成虫受到病毒污染,结果证明这种方法不仅影响成虫的生活周期,还造成寄主体表污染以及子代幼虫因食入受污染的卵壳而患病.利用PCR法检测SpltNPV的DNA,检测的最低量为5个病毒基因组拷贝.经碱解处理并用10U的DNase可以除去残留在卵表上的多角体及其所有的病毒DNA.利用这种方法可以除去污染昆虫卵表的杆状病毒,也为今后检测卵内是否存在SpltNPV DNA以及SpltNPV的垂直传播等流行病学问题研究奠定了良好基础.
[博士论文] 郭海涛
生物学、微生物学 武汉大学 2001(学位年度)
摘要:该文构建了黑胸大蠊浓核病毒(PfDNV)基因组克隆载体以及系列缺失克隆,继而测定了PfDNV全基因组核苷酸序列.通过对其基因组结构分析,与其它细小病毒在基因组结构、核苷酸序列同源性、以及编码蛋白同源性的比较,证实这种病毒是一种新的浓核病毒,具有细小病毒基因组结构的普遍特征,并且拥有自身独特的特点.
[博士论文] 余健秀
动物学 中山大学 2000(学位年度)
摘要:近几十年来,苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)作为一种主要的生物杀虫剂,已广泛应用于害虫的防治,并取得了显著的经济效益、社会效益和生态效益.但Bt作为生物杀虫剂仍存在若干不足之处,例如:①对昆虫高毒力的Bt菌株不多;②现有Bt株系的杀虫谱比较窄等.此外,有些昆虫对常用Bt制剂已产生了抗性.为此,有必要继续大力开发新的Bt资源,并对现有Bt株系进行遗传改良.该论文围绕这一主题开展了如下研究.1、ICP基因的鉴定与克隆.2、苏云金杆菌分子伴侣基因及其功能的研究.3、苏云金杆菌表达载体的构建.4、高效杀虫Bt工程菌的构建.
[博士论文] 李充璧
动物学 中山大学 2000(学位年度)
摘要:该研究从甜菜夜蛾核多角体病毒和斜纹夜蛾多角体病毒基因组中分别克隆了gp37基因.分子生物学软件分析表明,gp37为病毒晚期表达的糖蛋白基因.通过GP37蛋白的同源性比较,绘制了以gp37基因为基础的杆状病毒进化树,发现与以多角体蛋白基因(polyhedrin)为基础所绘制的杆状病毒分子进化树有较大差异.以polyhedrin基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树将家蚕核多角体病毒与杆状病毒代表种-苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒分开,而论文则将二者归到同一分枝,这与以egt基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树结果一致.该研究进一步对E.coli系统中表达的GP37蛋白对昆虫的作用进行测试.该研究利用含有在多角体基因启动子控制下的SpltMNPV gp37的转移载体pBacPAKS137与线性化AcMNPV进行重组,构建了一株不产生多角体的重组病毒AcMNPV-PAKS137.生物测定表明,该重组病毒感染甜菜夜蛾的毒力超过野生型亲本毒株AcMNPV,特别是在感染幼虫后60小时之前,感染幼虫的平均死亡率高于亲本毒株26﹪.以上研究结果,预示杆状病毒GP37蛋白值得作为生物杀虫剂的一种增效协助蛋白而加以利用.
[硕士论文] 傅丽君
农业昆虫与害虫防治 福建农林大学;福建农业大学 2000(学位年度)
摘要:该文通过室内外试验,分析了温度对球孢白僵菌致病力的影响,对高毒力菌株进行了筛选,并围绕小菜蛾罹病后产生的生理病理变化展开了一系列的研究,从而对球孢白僵菌防治小菜蛾的可行性作出进一步的论证,为小菜蛾的生态控制提供理论依据.
[博士论文] 余学奎
动物学 中山大学 1999(学位年度)
摘要:质多角体病毒(CPV)属于呼肠孤病毒科胞浆多角体病毒属.CPV分布极为广泛,已200 多种昆虫中发现有CPV感染.与其它属于呼肠孤病毒成员一样,完整CPV基因组含有10条双链RNA和自已的转录酶活性,能在感染动物里或体外适当条件下,转录双链RNA生成mRNA.与动物呼肠孤病毒需经蛋白酶降解脱去外层衣壳形成亚病毒或核心颗粒才具有酶活性不同,完整CPV即能进行转录并释放新生的病毒mRNA.为了揭示CPV这一独特性质所具有的结构基础,作者采用蔗糖密度梯度超速离心方法分离和纯化了CPV完整病毒和空病毒并比较其生化组成, 然后用负染和冷冻电镜技术及计算机数据处理方法研究了完整病毒和空病毒的结构.其结果如下:1.生化分析表明完整病毒和空病毒具有相同的蛋白组成,都含有5种结构蛋白;2. 电镜负染结果表明CPV空病素为一单层蛋白质衣壳,结构上相当于完整病毒的外衣壳.3.作者 用冷冻电镜技术以及计算机数据处理方法测定了CPV完整和空病毒的三维结构;4.空病毒与 完整病毒具有相同的蛋白衣壳结构,但内部结构却不相同;5.据此,作者认为质多角体病毒是通过模板移动的方式进行转录.
[博士论文] 闫庆生
昆虫学 中山大学 1998(学位年度)
摘要:斜纹夜蛾(Spodoptera litura)是中国和东海南亚地区粮、棉等经济作物及蔬菜上的 重要害虫.应用斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus,S1MNPV)防治余纹夜蛾目前已在一些地方推广.该文主要报道S1MNPV高 敏感克隆细胞株的筛选和建株、egt基因的克隆与序列分析及其不同基因型毒株非必需DNA片段的体外研究.该研究对斜纹夜蛾胚胎细胞系ZSU-SL-1进行克隆.从154孔单细胞繁殖的细 胞集落中,经多次传代后成为单克隆细胞株.不同的克隆细胞株的形态明显不同,且对S1MNPV的敏感性有很大的差异.其中两株克卫细胞株,分别命名为SL-1-1D11和SL-1-2H8,是高 敏感性的,约有80ˉ90%的细胞可以正常复制出多角体,而野生型的S1MNPV感染ZSU-SL-1细胞系,仅约5%左右的细胞自我帽出子代多角体.然而,在感染的这两株克隆细胞株中复制 的病毒其多角体其形态和数量都不同.SL-1-1D11第每个细胞中的多角体达40ˉ60个,形大 ;而SL-1-2H8则只有10ˉ20个,形小.用不同基因型的病毒S1MNPV-W579和S1MNPV-W46感染 这两株细胞,均得到相似结果,说明这种不同克隆细胞株中子代病毒的复制特性可能是由其本身性南所决定的.SDS-PAGE分析表明,SL-1-1D11和SL-1-2H8克隆株与ZSU-SL-1细胞系的 蛋白带型有明显不同,前两者至少有两条蛋白带(48KD和50KD)的含量明显增加.糖蛋白染色分析证明这两种蛋白为糖蛋白,可能与克卫细胞株SL-1-1D11和SL-1-2H8相对于亲本细胞系SL-1对病毒感染力的提高有关.该研究对S1MNPV蜕皮甾体尿苷二磷酸葡糖转移酶(Ecdysteroid UDP-glucosyl-transferase,EGT)基因进行了定位、克隆和全序列分析.
[硕士论文] 邱 琼
病原生物学 中国疾病预防控制中心;中国预防医学科学院 1998(学位年度)
[硕士论文] 史翠霞
病原生物学 中国疾病预防控制中心;中国预防医学科学院 1998(学位年度)
摘要:该研究论据莱姆病螺旋体独特的rRNA基因结构:-rrs(16S)-rrl(23S)-rrf(5S)-rrl(23S)-rrf(5S)-.rrs只有一个拷贝,rrl和rrf则各有二个拷贝并呈前后重复排列,此结构在真细菌中是独一无二的.选择保守的rrf3'端和rr15'端设计引物扩增高度多变的rrf-rrl间隔区,用限制性内切酶MseI和DraI进行RFLP分析,据带型进行基因种的判定.作者对42株中国菌株进行了分类学研究,并与6株国外菌株进行比较;对34份牡丹江林业中心医院和海林二十二林场的病人尿液标本进行PCR检测并对产物进行RFLP分析.
[博士论文] 张文成
昆虫学 南开大学 1998(学位年度)
摘要:为了全面系统在对中国粮仓及贮粮生境中苏芸金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称B.t.)的分布规律、杀虫特性及其多样性进行研究,对采集于中国22个省、市、自治区的178份粮食粉尘中的B.t.进行分离纯化,87份粉尘中含有B.t.,B.t.的出菌土样率为48.8%.在所镜检的1780个B.t.样菌落中,获得281个B.t.新分离菌株,B.t.的平均分离率为15.8%.比较中国南北方粮食粉尘中B.t.的分离率,有由北向南逐渐增高的趋势.123个B.t.分离株的H-血清型鉴定结果表明:粉仓及贮粮生境中B.t.的种群高度多样化.首次采用复合PCR(complex PCR)技术对60个B.t.及25个B.c.菌株中的肠毒素基因hb/A,bceT进行扩增分析.以B.c菌株做参比,对58株B.t.新分离株及46株B.t.标准株磷脂酶C进行了检测.
[硕士论文] 杨红珍
昆虫学 中国农业大学 1998(学位年度)
摘要:该文研究了红胫戟纹蝗和西伯利亚蝗痘病毒的形态特征、病理学、在寄主体内的成熟过程、DNA特性及病毒包涵体的碱解条件.1.电镜观察红胫戟纹蝗痘病毒(DkEPV)包涵体大多数为近方圆形或多角形,极小数为圆形,西伯利亚蝗痘病毒(GsEPV)包涵体大多数为圆形,极少为多角形.DkEPV包涵体的直径比GsEPV包涵体的直径要小,前者平均直径为3.77um,后者平均直径为5.33um.在DkEPV包涵体中,病毒粒子离包涵体边缘较远,而在GsEPV包涵体中病毒粒子离包涵体边缘分析.电镜观察DkEPV和GsEPV的病毒粒子均呈卵圆形,表面桑椹状.DkEPV和GsEPV病毒粒子髓核圆筒状,纵切面绳索结构折叠成2~3折,横切面均看到2~4个圆点;2.痘病毒在寄主体内的成熟过程.在脂肪体细胞的细菌质中首先出现病毒发生基质,在病毒发生基质周缘有许多不完整的弧形囊膜,当病毒发生基质以出芽方式向外伸出时,这些囊膜包围突出部分,囊膜完全形成,逐渐将部分病毒发生基质包围起来,形成球形颗粒,脱离原基质,成为双膜的不成熟病毒粒子,进一步发展成单膜的椭圆形的病毒粒子,病毒粒子逐渐被包涵体蛋白包围,发育成成熟的痘病毒;3.DkEPV-DNA经三种限制性内切酶EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ酶切,分别产生21、29、18个DNA片段,据此求得DkEPV-DNA分子量为155.50×10<'6>道尔顿.GsEPV-DNA经限制性内切酶EcoRⅠ酶切,产生29个片段,求得GsEPV-DNA分子量为158.54×10<'6>道尔顿;4.在相同的条件下,DkEPV包涵体的裂解速度比GsEPV包涵体裂解速度要慢.当温度恒定(37℃),在一定的pH值范围内(pH9.0~11.5),随着pH值的升高,包涵体裂解速度加快.在pH值恒定(pH11.2),在一定的温度范围内(25℃~40℃),随着温度的升高,包涵体的裂解速度加快.
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