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[硕士论文] 王丽云
细胞生物学 聊城大学 2013(学位年度)
摘要:鉴于近年对弹尾纲(Collembola)动物(跳虫)在土壤生态系统中的重要地位以及其毒理生态学研究价值的新认识,对跳虫生物学的系统研究成为目前特别重要的一项内容。本文以华北地区优势跳虫类群为实验材料,详细研究了它们的实验室种群培养、活体胚胎培养以及它们的胚胎发育过程,探索并解决了长期以来被认为是跳虫生物学研究瓶颈的一些问题。主要工作如下:
  第一,实验材料(各类跳虫)分别采自沂蒙地区、泰山地区以及鲁西地区的京杭运河沿岸,通过筛取活虫土样选择所需物种,在实验室条件下进行活体培养,成功完成多种跳虫的实验室繁殖,从中选取了四个有代表性的优势类群:原虫兆目(Poduromorpha)球角虫兆科(Hypogastruridae)四刺泡角虫兆属(Ceratophysella)、长角虫兆目(Entomobryomorpha)长角虫兆科(Entomobryoidea)长角虫兆亚科(Entomobryidae)刺齿虫兆属(Homidia)、长角虫兆科长角长虫兆亚科(Orchesellinae)长角长虫兆属(Orchesellides)以及等节虫兆科(Isotomidae)抱等虫兆属(Vertagopus)。
  实验表明,长角跳亚科跳虫弹跳能力极强,对生活空间要求较高,适宜在容积较大的培养瓶内培养;长角长跳亚科跳虫活动能力一般,但对环境温度和空气湿度要求较苛刻,适宜在室温22±2℃,湿度为不低于70%的条件下培养;球角跳科跳虫个体小、对生活空间要求不高,但弹跳能力极强,培养过程中易逃离,适宜在密封性较好的培养瓶内培养。
  第二,通过实验和探索,总结出一种适于绝大多数跳虫活体胚胎培养和显微镜下活体观察的活体制片方法——盖片搭建制片方法,使用这种方法,不仅可以在显微镜下长时间观察跳虫活体胚胎的发育过程,而且便于在跳虫胚胎发育的各阶段进行拍照记录。此外,这项技术和方法也适于许多其他小型节肢动物以及其他小型至微型动物的显微镜下的培养和观察。
  第三,使用体视显微镜(Olympus SZX12)和透视显微镜(Olympus BX51),对四个代表物种的繁殖、胚胎发育过程和特征及孵化过程进行了系统的显微观察和拍摄记录。根据其胚胎形态变化特征可以把跳虫的整个胚胎发育分为初产卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、组织分化期、孵化前期至孵化幼虫期等7个阶段。实验结果显示:
  (1)研究的所有跳虫种类都具有以下特征:1)卵为均黄卵,2)卵裂方式为完全均等卵裂,3)原肠胚形成方式为内陷式,4)卵壳内的胚胎发育整个阶段形态变化相似。
  (2)四个类群在一些方面又有明显不同:1)四刺泡角虫兆属(Ceratophysella duplicispinosa)的初产卵中央具有边缘清晰的较大的细胞核,核的直径约105μm,约为卵细胞直径的3/5,其它几个代表物种没有发现有此现象。胚胎发育持续时间为220小时。2)本研究涉及的4个物种的初产卵中,不仅只有四刺泡角虫兆卵在刚产出后中央有一大细胞核,且该核在数分钟之后并逐渐消失,直至第一次卵裂前期未发现有细胞核出现;其他几个物种初产卵细胞质是均匀分布,但在数小时后,在显微镜下可观察到不同类型的多核现象。3)研究中涉及的几个物种胚胎发育的各时间段持续时间存在差异,球角虫兆科在胚胎分裂的早期持续时间最长,相当于其它物种所花费相对时间的近两倍甚至更多;而它的囊胚期发育时间又特别短,约为其它物种花费相对时间的1/2甚至更少。其他3个物种时间比例相近。以上结果显示了原虫兆类与长角虫兆类的亲缘关系更远一些。
  此外,在长角虫兆目的抱等虫兆属(Vertagopus sp.)、刺齿虫兆属(Homidiasimilis)以及长角长虫兆属(Orchesellides sp.nov.)之间,亦有较为复杂的差异关系。
  综上结果显示,弹尾纲原跳目和长角跳目的胚胎发育具有均黄卵、完全均等卵裂、内陷形成原肠胚以及卵壳内的胚胎发育整个阶段形态变化相似等多个共同特征,而这些特征与狭义昆虫纲的类群明显不同,从胚胎发育特征上显示了弹尾纲与昆虫纲的重要差别。这与近年的一些相关形态学、分子生物学研究的结果是一致的。但本文所研究的四个类群之间又有一些不同,这些不同对于重新认识跳虫各类群之间的关系是有帮助的。当然,由于研究时间的限制,要得出确定的结论,有待于之后的更多的研究。
[博士论文] 姚香梅
农业昆虫与害虫防治 南京农业大学 2012(学位年度)
摘要:基因的外源表达是研究基因功能的一种重要方法。通过普通分子生物学技术和基因组测序技术,目前已经从很多种昆虫中鉴定了烟碱型乙酰胆碱受体亚基的基因,但是在外源表达时并不能表达出有功能的受体。
   本文用分子生物学方法和电生理学方法,对昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)β亚基进行了克隆,并对几种昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)β亚基重要功能环和环上氨基酸变化进行了毒理学特性分析,以期探明几种昆虫nAChRsβ亚基的结构与功能,进一步探索新烟碱类杀虫剂选择作用的分子机制。由于昆虫单亚基表达或少数几个亚基共表达均不能在外源表达系统中表达出功能受体(一般认为是β亚基的问题),说明需要更多的烟碱型乙酰胆碱受体亚基共表达,或者需要与一些附属蛋白共表达,这样就要求在外源表达系统中转染或者注射更多的受体mRNA,需要提高外源细胞的接受量。根据非洲爪蟾卵母细胞表达外源受体的特点,考虑到中华大蟾蜍卵母细胞的体积优势,本文在开发中华大蟾蜍卵母细胞表达系统方面开展了一些探索。成功组建了电生理实验室,掌握了中华大蟾蜍的室内饲养方法、室内饲养对中华大蟾蜍生殖的影响因素和人工条件下获得中华大蟾蜍成熟卵母细胞的方法,最后对中华大蟾蜍成熟卵母细胞内源受体进行了分析,对可表达的外源蛋白进行研究,取得了部分有价值的进展和成果。
   一、昆虫nAChRsβ亚基D、E、F环上氨基酸对新烟碱类杀虫剂选择性影响本文对模式昆虫果蝇和农业昆虫桃蚜的nAChRsβ1亚基D、E、F环及环上氨基酸变化对乙酰胆碱和吡虫啉的影响进行了双电极电压钳检测。检测结果发现,把模式昆虫果蝇和农业昆虫桃蚜的nAChRsβ1亚基D、E、F环单独或整体引入到大鼠的β2亚基中与褐飞虱α1亚基共表达,与野生型(褐飞虱α1亚基和大鼠的β2亚基,N1α1-β2)相比,电生理检测发现构建的嵌合体对新烟碱类杀虫剂吡虫啉的敏感性上升,而对乙酰胆碱的影响基本上没有变化。同时把发生在loopE S131 Y(R)、D133N和loopFT191W、P192K氨基酸变化引入到大鼠β2亚基中与褐飞虱α1亚基共表达,与野生型N1α1-β2相比,电生理检测发现对新烟碱类杀虫剂吡虫啉的敏感性上升,而对乙酰胆碱的影响基本上没有变化。电生理记录结果显示昆虫nAChRsβ亚基D、E、F环上氨基酸对新烟碱类杀虫剂选择性有重要的影响。
   二、褐飞虱nAChRsβ1亚基的克隆和A-to-I RNA编辑位点的发现采用简并引物PCR和RACE技术首次从水稻害虫褐飞虱中克隆了具有典型结构烟碱型乙酰胆碱受体β亚基,同源性比对发现此基因具有烟碱型乙酰胆碱受体亚基的典型特征,如位于胞外区氨基端与配基结合密切相关的保守氨基酸残基形成的环loopD-F、由13个氨基酸残基隔开的含有两个二硫键的半胱氨酸环、4个保守的跨膜片段、以及TM3和TM4之间可变的胞内区等。因此,根据系统进化关系,将这个基因命名为N1β1。同时发现在这个β亚基的氨基端有6个A-to-I RNA编辑位点,其中四个引起了氨基酸变化,位点2和位点5分别位于loopD和loopE上,引起了氨基酸天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)变化。在不同的褐飞虱品系中发现,位点2在敏感品系中发生频率较高,而位点5在抗性品系中发生频率较高,其他几个位点在两种褐飞虱品系中发生频率是没有变化的。
   三、A-to-I RNA编辑在褐飞虱中对新烟碱类杀虫剂敏感性的作用把在褐飞虱烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基loopD和loopE上发现的RNA编辑引起的氨基酸天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)变化引入到大鼠的β2亚基中,构建成突变体β2N73D、β2loopD-N73D以及β2N133D、β2loopE-N133D与褐飞虱α1亚基共表达,与野生型即褐飞虱α1亚基和大鼠的β2亚基(N1α1-β2和N1α1-β2loopD)相比,电生理检测发现,发生在D环上的RNA编辑引起的N73D变化,降低了激动剂乙酰胆碱(ACh)和吡虫啉(IMI)的敏感性,但是对乙酰胆碱的影响大于吡虫啉;而发生在E环上的RNA编辑引起的N133D变化仅对吡虫啉的敏感性有影响,对乙酰胆碱的影响是没有变化的。由此认为,发生在褐飞虱烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基loopD和loopE上RNA编辑引起的氨基酸天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)变化,对新烟碱类杀虫剂的敏感性是有关的,但是不同环上氨基酸的变化起的作用不同。
   四、中华大蟾蜍生物学特性研究本文研究了中华大蟾蜍的室内饲养方法、室内饲养对中华大蟾蜍卵母细胞成熟的影响因素和人工条件下获得成熟卵母细胞的方法。研究发现,中华大蟾蜍在环境温度<15℃时,处于冬眠期,这时室内饲养只要保持足够的湿度和通风即可,而环境温度>15℃时,中华大蟾蜍开始取食,每周在清晨或黄昏喂食2%3次活体黄粉虫,每周换水3~4次,保证中华大蟾蜍的排泄物及时清除,室内饲养的适宜温度是18~22℃。长期生长在高温或昏暗环境下的中华大蟾蜍是不能产生成熟卵母细胞的。中华大蟾蜍必须经过足够时间的低温处理,体内一种被称为“冬眠因子”的生长调控因子才能发挥作用,从而引发生发泡的破裂,使中华大蟾蜍卵母细胞成熟。4~6℃环境中处理一周至一个月时间的中华大蟾蜍,注射4000IU/千克绒毛膜促性腺激素(CG)或8个/千克脑垂体(PG),经过3~5天,可产生成熟的卵母细胞。
   五、中华大蟾蜍卵母细胞内源性离子通道的表达分析对中华大蟾蜍卵母细胞内源性基因表达进行了研究。实验用双电极电压钳技术在具有滤泡膜和无滤泡膜的中华大蟾蜍卵母细胞上记录由乙酰胆碱(ACh)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)激活的配基门控离子受体超家族受体引起的电流,并与非洲爪蟾卵母细胞和先前在中华大蟾蜍卵母细胞中的表达进行了比较。结果显示,在具有滤泡膜的中华大蟾蜍卵母细胞上,乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、甘氨酸受体均有不同程度的表达,表达对1mM乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、甘氨酸引起的电流值分别是87.1±4.9nA、45.4±13.8nA、36.6±22.0nA;而无滤泡膜的中华大蟾蜍卵母细胞上,对乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、甘氨酸的刺激检测不到任何电流信号。本工作的一个目的是探讨两种蟾蜍卵母细胞内源性神经递质受体和离子通道的表达,探索中华大蟾蜍卵母细胞作为外源表达工具的可能性。
   六、中华大蟾蜍卵母细胞表达外源通道的研究本章主要是对中华大蟾蜍卵母细胞的外源表达进行了研究。分别将美洲大蠊神经索和秀丽隐杆线虫的mRNA注射到中华大蟾蜍的卵母细胞中,利用双电极电压钳检测发现,在去除滤泡膜的中华大蟾蜍卵母细胞上记录到由乙酰胆碱(ACh)、γ-氨基丁酸(GABA)刺激引起的电流信号。在注射美洲大蠊神经索mRNA的卵母细胞上,1mM/L乙酰胆碱、γ-氨基丁酸引起的电流值分别是98.1±4.9nA、329.5±6.3nA;在注射秀丽隐杆线虫的mRNA的卵母细胞上,1mM/L乙酰胆碱、γ-氨基丁酸引起的电流值分别是84.1±13.8nA、89.5±7.9nA。作为隐性对照,在未注射mRNA的去除滤泡膜的卵母细胞上,没有检测到任何由乙酰胆碱、γ-氨基丁酸刺激引起的电流信号。结果显示,注射了外源mRNA的去除滤泡膜的中华大蟾蜍卵母细胞上,乙酰胆碱受体和γ-氨基丁酸受体均有表达。本工作的一个目的是探讨中华大蟾蜍卵母细胞作为外源性神经递质受体和离子通道表达系统的可行性。根据得到的结果认为中华大蟾蜍卵母细胞也可以作为一个表达工具,对配基门控离子受体超家族受体基因的外源表达研究。
  
[博士论文] 王书平
农业昆虫与害虫防治 南京农业大学 2012(学位年度)
摘要:植物在生长发育和腐烂过程中均产生大量甲醇。植食性的昆虫势必会受到甲醇的潜在毒害。因此,这些昆虫在进化过程中应该建立了对甲醇的解毒代谢机制及行为逃避机制。然而迄今为止,在昆虫中仅报道了亚洲玉米螟对甲醇的解毒代谢。
   本论文中,我们初步探讨了黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)对甲醇的解毒代谢途径、以及包括醉酒行为、雄蝇同性求偶行为和产卵选择行为在内的多种行为反应机制。研究结果可为昆虫进化的研究和害虫治理措施的开发提供借鉴。
   1.细胞色素P450单加氧酶参与幼虫对甲醇的解毒代谢以黑腹果蝇2龄幼虫为试虫,分别测定了细胞色素P450单加氧酶(CYP)、过氧化氢酶、醇脱氢酶(ADHs)、谷胱甘肽-S-转移酶和酯酶的抑制剂增效醚(PBO)、3-氨基-1,2,4-三氮唑(3-AT)、4-甲基吡唑(4-MP)、顺丁烯二酸二乙酯(DEM)和磷酸三苯酯(TPP)对甲醇和甲醛的增效作用。发现TPP、DEM、3-AT和4-MP与甲醇的联合作用为1.02、0.98、0.98和1.00,与甲醛的联合作用为1.15、1.05、1.08和1.14。表明甲醇或甲醛与这4种酶抑制剂是相加作用。甲醇或甲醛与PBO混用时的联合作用分别为0.28和0.18,显著低于1,表明甲醇或甲醛与PBO之间是增效作用,CYP参与了黑腹果蝇幼虫对甲醇的解毒代谢。2龄幼虫取食含有浓度为22.6、27.9和34.5 mg/g甲醇的饲料后,多功能氧化酶系的活力分别提高了3.0、3.9和2.7倍,甲醇处理也显著上调了cyp304a1、cyp9f2、cyp28a5、cyp4d2和cyp4e2基因的表达水平。表明这些基因编码的CYP可能参与了幼虫对甲醇的解毒代谢。
   2.黑腹果蝇成虫对甲醇的解毒代谢分别测定了甲醇和5种酶抑制剂对果蝇雌虫和雄虫的联合作用CI。发现PBO和3-AT对甲醇增效作用十分明显;TPP和4-MP对甲醇24 h之内为相加作用,48 h和72 h后表现出显著的增效作用;而DEM与甲醇混合使用是相加作用。甲醇处理诱导了成虫多功能氧化酶系的活力,上调了数个cy基因mRNA表达。测定了几个黑腹果蝇突变品系对甲醇的耐受能力,结果表明,ADH、α-Est7编码基因被突变后,黑腹果蝇对甲醇耐受性下降;细胞色素P450单加氧酶基因cyp4e2、cyp9f2或cyp318a1分别被突变后,并不显著影响黑腹果蝇成虫对甲醇的敏感性。醛脱氢酶/辛醇脱氢酶突变品系接触甲醇最初24 h之内,对甲醇的耐受能力明显增加。随后则与CS野生品系的耐受能力相似。以上结果表明,雌蝇和雄蝇对甲醇的解毒代谢过程相似,细胞色素P450单加氧酶和过氧化氢酶在甲醇的解毒过程中发挥了重要的作用;羧酸酯酶和羟脱氢酶需经甲醇长时间持续诱导才发挥其最大的解毒能力;谷胱甘肽S-转移酶不参与甲醇的解毒代谢。醛脱氢酶/辛醇脱氢酶降解甲醇的活性仍需进一步研究。
   3.甲醇多代筛选对黑腹果蝇的影响黑腹果蝇CS品系累代饲养于含有浓度为25 mg/g甲醇的饲料上。经40代长期筛选,果蝇对甲醇的LC50值从27.93增加到40.71 mg/g。现实遗传力(h2)值在筛选的前2代、3-10代和11-40代分别为0.4956、0.0315和0.0087。黑腹果蝇从卵到成虫的发育历期随筛选代数的增加而延长,筛选0、2、10和40代后,在无甲醇饲料上的发育历期分别为8.33 d、9.78 d、12.01 d和12.51 d;在有甲醇饲料上的发育历期分别为12.59 d、14.08 d、17.37 d和18.10 d。其中胚胎和幼虫发育期的延长尤为显著,而蛹的发育历期没有显著变化。长期的甲醇筛选导致果蝇幼虫和成虫中数个编码细胞色素P450单加氧酶和酯酶的基因表达量明显升高。同时,这两种酶的活力也显著上升。以上结果表明,甲醇耐受性的提高具有一定的适合度代价。
   4.甲醇对黑腹果蝇醉酒行为的研究当缓慢接触气体甲醇时,果蝇表现出一系列的行为变化:放入的最初几分钟,黑腹果蝇过度兴奋,运动显著增加;接着出现定向困难,协调能力下降,行动迟缓,失去平衡能力,表现出人类相似的醉酒状态;并最终背部朝天,进入完全静止的醉倒状态。每天1次接受甲醇熏蒸,可诱导雄蝇对甲醇的醉倒抗性,但不诱导雌蝇的抗性。酶抑制剂TPP、DEM、3-AT、4-MP和PBO预处理后,可缩短雄蝇和雌蝇对甲醇的平均醉倒时间,但对平均醉倒时间随筛选天数的变化趋势无影响。可见,代谢酶本身不是醉酒抗性形成的机制,而仅仅微调抗性的幅度。取食含酶抑制剂的黑腹果蝇雌蝇和雄蝇若每天接受甲醇熏蒸处理,死亡率显著提高。雄蝇死亡率从空白对照和取食含丙酮饲料的约2%提高到10%以上,雌蝇死亡率也从对照的约5%提高到10%以上。据此我们推论,甲醇代谢酶也可能存在于神经系统周边组织甚至神经系统内,移除甲醇,从而降低甲醇的神经毒性。
   5.醇类诱导的雄蝇同性求偶行为黑腹果蝇雄虫经历每天1次的甲醇或乙醇重复诱导后,解除了性抑制,表现出积极的同性求偶行为。选择了果蝇神经营养信号途径相关的8个基因的果蝇突变品系。发现Shc、drk、csw、Pi3k21B和RhoGDI编码基因被突变后,即使在甲醇的诱导下,突变品系果蝇也不表现出同性求偶行为;然而Rho1编码基因被突变后,果蝇表现出了较高的同性求偶行为。可见,Shc、drk、csw、Pi3k21B、Rho1及RhoGDI介导了甲醇诱导的黑腹果蝇雄虫同性求偶行为。据此我们认为,每天1次的甲醇重复诱导通过神经营养信号途径重塑了神经回路,从而导致了雄蝇行为的改变。
   6.黑腹果蝇对甲醇的趋性水果发酵过程中,碳水化合物分解产生醇类挥发物,而蛋白质分解产生一系列挥发性的含氮化合物。利用Y型嗅觉仪分别测试了黑腹果蝇雌虫和雄虫在饥饿/饱食状态、交配/不交配状态下对甲醇、乙醇和氨的嗅觉行为反应。结果显示,交配和饥饿并不显著改变果蝇对甲醇和乙醇的趋性,而明显增加了果蝇对碳酸氢氨的选择偏好性。交配和饥饿也促进了黑腹果蝇成蝇的扩散行为。双向选择性产卵实验结果表明,野生CS品系雌虫避免在含有甲醇和乙醇的饲料上的产卵,而偏爱在含有碳酸氢氨和硫化钾的饲料上产卵。基因突变品系实验结果显示,Or83b和Nc73EF编码基因被突变的雌虫不表现产卵偏好性,在醇类和胺类物质上的产卵量没有显著差异。而lush基因被突变后,产卵果蝇失去了对醇类的忌避反应,但保留了对氨类和硫化氢的偏好;CaM编码基因突变后,果蝇失去了对甲醇的忌避反应,而对乙醇却表现出了选择偏好。这些结果暗示,交配后的雌雄蝇增强了扩散行为,通过醇类和含氮挥发物搜寻食物和产卵基质,到达后避开含醇食物源而选择含氮较高的食物源。嗅觉相关基因参与了果蝇对产卵基质的选择。
  
[硕士论文] 黄小玲
动物学 江西农业大学 2012(学位年度)
摘要:小菜蛾(Plutella xylostella L.)属鳞翅目菜蛾科,主要危害十字花科蔬菜,几乎在十字花科种植的地区都可能分布,是一种世界性害虫。小菜蛾发生世代多,世代重叠现象严重;繁殖速度快,对农药的抗性产生迅速,因此小菜蛾的防治难度很大。本文选用四种昆虫生长调节剂(氟虫脲、虱螨脲、灭幼脲、虫酰肼)对小菜蛾生长发育及化学生态方面产生的毒物兴奋效应进行研究。
   小菜蛾生长发育观察试验,使用四种昆虫生长调节剂(氟虫脲、虱螨脲、灭幼脲、虫酰肼)分别处理小菜蛾1龄幼虫,观察其生长发育情况。结果表明:氟虫脲对小菜蛾的幼虫,蛹和成虫各阶段的生长发育产生了毒物兴奋效应。虱螨脲对小菜蛾的幼虫生长发育表现出明显的抑制作用,仅对小菜蛾蛹及成虫表现出毒物兴奋效应。灭幼脲与虱螨脲类似,对小菜蛾的幼虫和成虫的生长发育表现出明显的抑制,对小菜蛾蛹表现出毒物兴奋效应。虫酰肼对小菜蛾幼虫和蛹的生长发育有刺激生长的现象,但却抑制了成虫的生长。
   昆虫生长调节剂对小菜蛾生长繁殖观察试验用氟虫脲、虱螨脲、灭幼脲、虫酰肼分别处理小菜蛾1龄幼虫,待其自然生长为成虫后,观察其交配繁殖行为。结果表明:小菜蛾取食氟虫脲处理的叶片之后,出现了毒物兴奋效应,LC30和LC40处理的小菜蛾的化蛹率、羽化率和交配成功率最高。虱螨脲处理的小菜蛾也表现出毒物兴奋效应,其化蛹率和羽化率在低浓度(LC10和LC20)受到刺激升高,在高浓度被抑制而下降。灭幼脲LC70处理的小菜蛾交配成功率达到最高。虫酰肼处理的小菜蛾交配率在低浓度LC20,较高浓度LC60、LC70都出现了高峰。
   昆虫生长调节剂对小菜蛾与寄主植物化学通讯影响试验结果表明,昆虫生长调节剂对小菜蛾寄主植物定向选择行为表现出明显的抑制;影响小菜蛾雌虫对寄主植物挥发性物质的选择行为更明显,对雄虫的影响比雌虫小。但除灭幼脲外,氟虫脲、虱螨脲和虫酰肼都对小菜蛾成虫对植物挥发物正确定向产生了毒物兴奋效应。试验中还发现灭幼脲处理后的雄虫对植物挥发物定向选择成功率几乎都高于各浓度处理的雌虫。
   昆虫生长调节剂对小菜蛾性信息化学通讯的影响试验中,昆虫生长调节剂对小菜蛾性信息素的定向选择行为表现出明显的抑制;但氟虫脲和虫酰肼都对小菜蛾成虫对性信息素的正确定向产生了毒物兴奋效应。此次试验用的昆虫生长调节剂都出现某特定浓度处理的雌虫定向正确率高于雄虫的现象。在试验中还发现,灭幼脲高浓度处理竟提高小菜蛾对性信息素的正确选择率。
[硕士论文] 张楠
病原生物学 河北医科大学 2012(学位年度)
摘要:目的:研究石家庄地区优势蝇种肥须亚麻蝇(Parasarcophagacrassipalpi)在不同的环境温度和不同浓度的盐酸吗啡作用下的生长发育情况,探索温度和毒物对肥须亚麻蝇幼虫口钩和咽骨的影响,积累石家庄地区尸源性蝇类的法医昆虫毒理学(forensic toxicologic entomology)资料,从而为死后间隔时间(postmortem interval,PMI)的推断提供科学依据。
  方法:在河北医科大学校园内以大鼠内脏诱捕肥须亚麻蝇,带回实验室,在培养箱内连续饲养,以第三代作为母代观察其在盐酸吗啡影响下的生长发育。设定培养箱的温度依次为28℃、32℃、36℃,相对湿度为75%,光照周期为12h:12h,保持温度和光照周期恒定。本实验共使用家兔4只,随机分为对照组和3个实验组。对照组家兔经耳缘静脉注射生理盐水1ml/kg,实验组家兔经耳缘静脉依次注射0.5倍、1.0倍、2.0倍致死剂量的盐酸吗啡,给药30min后将4只家兔处死,处死方法均为重击其枕部迅速致死。取家兔的肌肉组织分别保存,对照组标记为M0,实验组依照给药浓度从小到大依次标记为M1、M2、M3。用新鲜猪肝诱肥须亚麻蝇产幼虫,产幼虫时间记为零时,将幼虫移至家兔的肌肉组织上饲养。幼虫产出12小时后,每隔12小时留取标本一次,每组每次留取10头幼虫,直至幼虫达到离食期。将幼虫用80℃热水烫死,然后放入浓度为70%的甘油酒精中保存。
  头咽骨形态学观察及测定从保存液中取出幼虫标本后,吸干表面液体,放在培养皿上,用大头针在幼虫腹部一侧扎几个小孔,放入10%的KOH溶液中消化内部组织,24h后将幼虫从KOH溶液中取出,放在培养皿上用镊子轻轻按压幼虫,直至将体内已消化的组织排出。幼虫在清水中洗净数遍后,在体视显微镜下分离出幼虫的头节,然后将头咽骨进行对称分离。标本依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精、100%酒精与二甲苯的混合液(比例1:1)逐级脱水,最后用二甲苯透明,显微镜下整姿后滴加拿大树胶封片,置于阴凉处风干。光学显微镜下观察、拍照。利用计算机图像分析系统对头咽骨的口钩及咽骨的面积、骨化面积和平均光密度等多项指标进行测定。
  结果:
  1.在温度恒定时,随着盐酸吗啡浓度的增高,肥须亚麻蝇幼虫的生长速度在一定程度的加快;同样,当盐酸吗啡浓度恒定时,随着温度的升高,肥须亚麻蝇幼虫的生长发育速度加快。
  2.在恒定的温度和药物浓度时,随着时间的延长,肥须亚麻蝇幼虫头咽骨的颜色从浅棕黄色逐渐加深直至变为黑褐色,同时,骨化程度逐渐加强,骨化面积不断加大。附口骨,形似点状,在三龄期可以观察到。
  3.肥须亚麻蝇幼虫的口钩面积和咽骨面积均随时间的延长不断加大,在叠龄期时变化较剧烈,直至进入三龄期后很快达到最大值,并进入平台期,维持基本恒定。由此可见,两者并不能有效地适用于推测PMI。
  4.肥须亚麻蝇幼虫口钩的骨化面积和平均光密度的变化趋势是一致的;同样,咽骨的骨化面积和平均光密度的变化趋势也是一致的。其均为推测PMI的指标。这是由于:肥须亚麻蝇幼虫口钩的骨化面积和光密度及咽骨的骨化面积和光密度在三个龄期中均随时间的延长而逐渐增高,直至三龄期结束。肥须亚麻蝇幼虫的口钩和咽骨的骨化面积和光密度达到最大值的时间明显滞后于二者面积达到最大值的时间。
  结论:
  1.在盐酸吗啡浓度恒定时,随着温度的升高,肥须亚麻蝇幼虫的生长发育加快;在温度恒定时,随着盐酸吗啡浓度的增高,幼虫的生长速度亦在一定程度的加快。
  2.在恒定温度恒定药物浓度时,从一龄期到三龄期,幼虫头咽骨颜色由浅棕黄色逐渐加深至黑褐色,几丁质化程度随时间延长而逐渐加强,骨化面积也随时间延长而不断增大。在三龄期开始出现点状的附口骨。
  3.随时间的延长,肥须亚麻蝇幼虫口钩面积和咽骨面积逐渐增加,叠龄期增长显著加快,而进入三龄期后很快达到最大值,并维持不变,故幼虫口钩面积和咽骨面积不是推断PMI的理想指标。
  4.肥须亚麻蝇幼虫的口钩骨化面积、平均光密度,及咽骨的骨化面积和平均光密度,上述指标均随时间的延长呈现持续性增加的趋势,并一直维持到三龄期后,故此四项指标是推测PMI的理想指标。
  
[硕士论文] 郭湛
环境科学 东北师范大学 2011(学位年度)
摘要:生物毒理学实验中采用的生物有鱼、大型蚤、绿藻、海洋生物发光菌、酶、细胞等,其中梨形四膜虫是目前生物毒理学实验中最广泛使用的基本生物模型。本文收集了970种有机污染物对梨形四膜虫的抑制生长毒性数据,该数据包含325个脂肪烃和645个芳香烃,根据化合物官能团和结构特征将其分为55组,对毒性与化合物的疏水性、极性、电离参数进行构效关系分析后,得出以下结论:1、非极性麻醉型和极性麻醉型化合物的毒性与疏水性具有良好的线性关系,并建立了非极性麻醉型与极性麻醉型化合物的毒性与辛醇/水分配系数的相关方程。2、极性麻醉型化合物比非极性麻醉型化合物毒性大,但二者的区分目前还没有统一的标准,认为高疏水性的极性麻醉型可以被看做是非极性麻醉型有机物,因为化合物的极性不仅与其分子上的取代基团有关,还与化合物的总的疏水性相关,在此基础上,引入了分子极性参数S,建立了两种麻醉型化合物的毒性数据与辛醇/水分配系数(logP)和极性参数(S)的相关方程。3、可离子化合物的生物毒性随着其离子化程度的增大而增加,但当离子化达到一定程度时,其毒性反而降低,认为这是由于其生物吸收能力较低所致,在此理论基础上,继续研究了离子化率对毒性的影响,建立了可电离化有机物的毒性与离子化率的相关方程。4、构筑了毒性与化合物疏水性、极性、电离程度的构效关系模型(n=822,R2=0.83),成功的将非极性麻醉型、极性麻醉型、离子化型和反应性化合物囊括在一起。本文构建的构效关系模型使用参数较少,模型透明度较高,从疏水性、极性、离子化等不同层次探讨了各类有机化合物对生物的致毒效应及毒性反应机理。
[硕士论文] 肖丽莎
农业昆虫与害虫防治 西南大学 2010(学位年度)
摘要:本文在国家自然科学基金(30871631)和教育部博士点基金(20080635009)的资助下,以危害严重的储藏物害虫嗜虫书虱Liposcelis entomophila和嗜卷书虱L. bostrychophila为研究对象,采用亲和层析法分离纯化了两种书虱体内的乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE),并系统比较了嗜虫书虱和嗜卷书虱不同地理种群AChE生化毒理学特性的差异。主要研究结果如下:
   ㈠嗜虫书虱和嗜卷书虱不同地理种群AChE的纯化。
   采用普鲁卡因胺Procainamide亲和层析法纯化了嗜虫书虱和嗜卷书虱不同地理种群体内的AChE。其中,嗜虫书虱四川广汉种群AChE的纯化倍数最高(786倍),湖北武汉种群AChE次之(700倍),重庆北碚种群AChE纯化倍数最低(587倍);广汉、武汉和北碚种群AChE的回收率分别为48.8%、29.8%和61.4%。嗜卷书虱重庆北碚种群AChE纯化倍数为497倍,回收率为61.2%;四川绵阳种群AChE纯化倍数为616倍,回收率为48%。纯化产物经SDS-PAGE检测,其纯度达到电泳级。嗜虫书虱和嗜卷书虱AChE蛋白分子量分别为55 kD和56 kD。
   ㈡嗜虫书虱和嗜卷书虱不同地理种群AChE生化毒理学特性研究:
   ⑴嗜虫书虱AChE生化毒理学特性研究。对纯化后AChE酶促反应的最适pH值和最适温度研究发现,嗜虫书虱3个地理种群AChE活性均在pH=7.0时最高。经模型拟合,3个地理种群AChE理论最适pH分别为:北碚种群AChE7.36、广汉种群AChE7.21、武汉种群AChE7.22;嗜虫书虱3个地理种群AChE活性均在温度37.0℃时最高。经模型拟合理论最适温度分别为:北碚种群AChE37.3℃、广汉种群AChE38.0℃、武汉种群AChE39.2℃。采用药膜法测定了嗜虫书虱不同地理种群对马拉硫磷、氧乐果、涕灭威和残杀威四种药剂的敏感性差异。比较嗜虫书虱不同地理种群AChE生化及毒理学特性发现,嗜虫书虱3个地理种群的AChE动力学常数存在显著性差异,其中广汉种群AChE的Km和Vmax值均高于北碚和武汉种群,说明嗜虫书虱广汉种群的AChE对底物ATChI的亲和力最低,但对底物的水解催化活性最高。离体抑制作用结果表明,5种抑制剂(毒扁豆碱、BW284C51、残杀威、涕灭威和氧乐果)对嗜虫书虱不同种群AChE均有明显的抑制作用。比较双分子速率常数ki值发现,毒扁豆碱对嗜虫书虱AChE的抑制作用最强,而氧乐果对AChE的抑制作用最弱。除氧乐果外,广汉种群AChE相比北碚和武汉种群AChE对抑制剂的抑制作用最不敏感。上述研究结果说明AChE可能介导了嗜虫书虱对常用杀虫剂的不敏感性,而且与湖北武汉、重庆北碚种群相比,嗜虫书虱四川广汉种群具有更大的抗性风险。
   ⑵嗜卷书虱AChE生化毒理学特性研究。对纯化后AChE酶促反应的最适pH值和最适温度研究发现,嗜卷书虱北碚和绵阳种群AChE在pH=7.0时活性达到峰值。经模型拟合,其理论最适pH值分别为:北碚种群AChE7.33、绵阳种群AChE7.27。嗜卷书虱2个地理种群AChE活性均在37.0℃时最高,且经模型拟合其理论最适温度均为36.8℃。比较嗜卷书虱北碚和绵阳种群AChE生化及毒理学特性结果发现,北碚和绵阳种群AChE的动力学常数差异显著,其中绵阳种群AChE的Km和Vmax值分别是北碚种群AChE的1.32倍和1.14倍,说明绵阳种群AChE对底物ATChI的亲和力较北碚种群AChE低,但对ATChI的水解活性高于北碚种群AChE。离体抑制作用结果表明,嗜卷书虱2个种群AChE对选用的6种抑制剂的敏感性从高到低依次为:毒扁豆碱>乙基对氧磷>BW284C51>残杀威>涕灭威>氧乐果,且绵阳种群AChE的双分子速率常数ki值均小于北碚种群AChE。
   综合来看,嗜虫书虱和嗜卷书虱不同地理种群AChE生化和毒理学特性差异的原因可能在于书虱不同地理种群AChE对药剂的敏感性不同以及各地施药水平的差异。
[硕士论文] 何学松
生物化学与分子生物学 华南师范大学 2010(学位年度)
摘要:人类的核磷蛋白NPM基因定位于染色体5q35。全长约23kb,含12个外显子,编码蛋白的分子量约为38kDa。它是一种多功能蛋白,在肿瘤细胞和干细胞等不断增殖的细胞中表达量较正常细胞多。它具有核定位信号,可以作为分子伴侣在细胞核与细胞质、核质之间穿梭,参与前核糖体颗粒的转运和核糖体的形成。它通过调节中心体的合成以及与p53相互的作用,参与细胞周期调控。在低氧、细胞毒性药物、紫外辐射、病毒蛋白等存在的情况下,过表达NPM,会促使细胞抑制凋亡,促进细胞在逆境下存活。本实验将NPM蛋白与HIV-1病毒TAT蛋白的蛋白转导结构PTD连接,使NPM蛋白具有穿膜结构,利用这个融合蛋白来研究NPM蛋白与p53基因之间的相互作用。实验通过真核昆虫病毒表达体系Bac-to-Bac系统,成功表达出TAT-NPM和TAT-NPM△C蛋白,并优化了蛋白表达体系,发现用5μl/ml培养基的病毒感染细胞,D61收集细胞,蛋白表达量最高。western blot检测时发现,昆虫Sf21细胞内也存在NPM蛋白以及蛋白的二聚体。在原核表达体系中表达出TAT-NPM和TAT-NPM△C蛋白,并且与真核表达体系比较。发现真核表达蛋白的表达量与纯化量均与原核表达蛋白量与纯化量相当,但真核表达的蛋白比原核表达的蛋白大约1kDa。推测该蛋白在真核表达时,蛋白进行了翻译后的修饰,使得蛋白的分子量加大。因此本实验利用真核系统表达的蛋白,并纯化TAT-NPM和TAT-NPM△C蛋白,将这两个重组蛋白作为外源的药物,分别加入到体外培养的人胚肺成纤维细胞(HLF)中,发现重组蛋白在1h时进入细胞并且保持稳定,重组蛋白进入细胞后,24h仍然保持稳定。用H2O2处理HLF细胞,氧化应激使HLF细胞内p53基因产生应激反应,后检测在这些重组蛋白存在情况下细胞周期的变化。发现相对于对照组来说,在有血清存在的情况下TAT-NPM可以促使HLF细胞从G1期进入S期,在无血清的情况下TAT-NPM和TAT-NPM△c都可使HLF细胞从G1期进入s期。
[硕士论文] 王建峰
基础兽医学 南京农业大学 2008(学位年度)
摘要:红火蚁属节肢动物门昆虫纲,是一种外来入侵害蚁,被认为是严重卫生公害。被红火蚁螫伤后,一些红火蚁毒素蛋白能引起人的过敏反应甚至死亡。本文用重组表达的红火蚁毒素蛋白Sol iⅣ注射兔子做为动物模型,来研究重组红火蚁毒素蛋白Sol iⅣ致病机理。 本实验在国内首次利用大肠杆菌表达红火蚁重组毒素蛋白Sol iⅣ。诱导表达菌经超声波破碎,表达产物存在于上清液,红火蚁重组毒素蛋白Ⅳ在表达工程菌BL-21中为可溶性表达。用镍层析树脂纯化超声波破菌后的上清液,得到的高纯度蛋白。 通过注射小鼠和兔子进行蛋白活性试验,选出合适的动物模型,发现兔子要比小鼠敏感,有40%左右的兔子出现过敏。再通过蛋白皮试试验选择敏感动物,进行蛋白免疫治疗试验,发现通过小剂量多次注射该蛋白,能起到免疫治疗效果。 通过分离兔外周血淋巴细胞进行培养,经不同浓度的重组红火蚁毒素蛋白Sol iⅣ分别和细菌脂多糖(LPS)、刀豆蛋白(ConA)共同刺激后,MTT法测定淋巴细胞的增殖情况,重组红火蚁毒素蛋白Sol iⅣ浓度为25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和LPS共刺激时,与草独LPS刺激的对照组比较,淋巴细胞增殖活性显著增高(P<0.05);浓度为15μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和ConA共刺激时,与单独ConA刺激的对照组比较,淋巴细胞增殖活性显著增高(P<0.05)。 通过兔子的致敏实验,观察受试兔子的皮肤、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、等组织的组织病理变化,皮肤:真皮层发生坏死,坏死灶周围出现大量的嗜酸性粒细胞和炎性细胞。肝脏:肝细胞内可见水泡变性和颗粒变性,肝窦内出现大量嗜酸性粒细胞。肺脏:肺泡壁毛充血,肿胀,肺泡壁内有多量嗜酸性粒细胞。进一步通过ELISA和荧光定量RT-PCR方法检测过敏兔子血清和组织中的IgE和细胞因子,IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-10变化。结果显示血清中IL-4、总IgE和IL-10的水平升高,IL-4和IL-10在14 h左右达到最高值,总IgE在20 h达到峰值。IFN-γ的水平降低,在20 h达到最低值,IL-6的水平没有显著的变化.重组毒素蛋白Sol iⅣ注射后32 h,实验组兔脾脏和淋巴结中除IL-6 mRNA外,IL-4和IL-10 mRNA量均极显著高于对照组兔(P
[硕士论文] 唐建锋
动物学 贵州大学 2006(学位年度)
摘要:本文主要通过点滴法首次测定了贵州省九个县市区(独山县、花溪区、兴义市、黄平县、天柱县、湄潭县、遵义县、思南县和威宁县)白背飞虱种群对有机磷类的甲基对硫磷(Parathion-methy)、氨基甲酸酯类的西维因(Carbary)和异丙威(Isoprocarb、MIPC)、拟除虫菊类的高效氯氰菊酯(alpha-Cypermethrin)和溴氰菊酯(Deltamethrin)以及杂环类杀虫剂吡虫啉(Imidacloprid)和抑制几丁质杀虫剂扑虱灵(Buprofezin)七种药剂的抗性指数和六个县区的(独山县、花溪区、黄平县、天柱县、思南县和威宁县)褐飞虱种群对甲基对硫磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊类以及吡虫啉和扑虱灵等六种的抗性指数,同时,监测独山县和花溪区白背飞虱种群在三个月份抗性水平的发展变化。并依据测定结果提出抗性治理的策略及具体方案。主要研究如下: 1.独山县和花溪区白背飞虱种群对5种药剂在三个不同月份有增加趋势对独山县和花溪区两地白背飞虱种群的LD50和抗性指数进行测定发现,甲基对硫磷、西维因、异丙威、高效氯氰菊酯、和吡虫啉的LD50抗性指数均有增大。 2.两种飞虱对几种药剂的抗性整体水平不高两种飞虱对多数药剂还处于敏感阶段或敏感下降阶段(RI<3或3<RI<5),而两种飞虱对扑虱灵均达到了中等抗性水平(10<RI<40)。 3.在各地种群对各药剂的抗性中,一般是贵州西北地区和中部稍低于南部和东部种群 从整体来看,位于贵州东北部低海拔的天柱县和思南县的白背飞虱和褐飞虱抗性较高。 4.白背飞虱种群对多数杀虫剂的抗性指数较褐飞虱种群高 异丙威、吡虫啉和扑虱灵对白背飞虱的LD50明显大于褐飞虱对三种杀虫剂的LD50,甲基对硫磷和西维因对白背飞虱和褐飞虱的LD50差别不大,而溴氰菊酯对白背飞虱的LD50小于其对褐飞虱的LD50。 5.异丙威与吡虫啉复配共毒系数有显著的增效作用,斑蝥素对两种飞虱有明显杀虫活性 异丙威与吡虫啉以16∶1比例的复配剂共毒系数达178.086,有显著的增效作用;在测定斑蝥素对两种飞虱的触杀毒力中,斑蝥素对两种飞虱有一定杀虫活性。 6.根据贵州省稻飞虱的发生,抗性水平、抗性分布提出适合本地的适合度和多点攻击的治理策略 根据两种飞虱对杀虫剂的抗性水平、分布不同,结合贵州省稻飞虱发生情况,前期可以选用部分氨基甲酸酯类,中期两种飞虱混合发生时再用以吡虫啉为主的杀虫剂进行防治,最后再用褐飞虱敏感的扑虱灵进行防治。
[硕士论文] 亢春雨
生物化学与分子生物学 福建农林大学 2005(学位年度)
摘要:本文采用药膜法测定了龟纹瓢虫Propylaeajaponica(Thunberg)、四斑瓢虫Chilomenesquadriplagiata(Swartz)和稻红瓢虫Veraniadiscolor(Fabricius)对几种杀虫剂的敏感性,结果显示:(1)对龟纹瓢虫,埃玛菌素>阿维菌素、吡虫啉>多杀菌素>敌敌畏>氰戊菊酯>甲胺磷;(2)对四斑瓢虫,敌敌畏>埃玛菌素、甲胺磷、阿维菌素>吡虫啉、氰戊菊酯>多杀菌素>氟虫睛;(3)对稻红瓢虫,埃玛菌素>阿维菌素>氯氰菊酯>吡虫啉>敌敌畏>氰戊菊酯、氟虫睛>毒死蜱>甲胺磷。同时采用浸叶法测定了菜缢管蚜LipaphiserysimiKaltenbach对几种杀虫剂的敏感性,结果表明:埃玛菌素>阿维菌素>多杀菌素>吡虫啉>氟虫睛>氰戊菊酯>甲胺磷。   使用胡椒基丁醚(PB)、磷酸三苯酯(TPP)和马来酸二乙酯(DEM)三种酶抑制剂对龟纹瓢虫和菜缢管蚜对甲胺磷、氰戊菊酯和阿维菌素进行了增效测定,结果表明:PB的增效作用显著高于TPP和DEM。   PB、TPP和DEM对龟纹瓢虫和四斑瓢虫的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和乙酰胆碱酯酶(AChE)活体抑制实验表明:PB对两种瓢虫的GSTs、CarE和AChE活性均有明显抑制;TPP对CarE有明显抑制;DEM对GSTs有明显抑制,同时实验证实TPP和DEM对AChE有时也有抑制作用。   三种酶抑制剂PB、TPP和DEM对菜缢管蚜的CarE、GSTs和AChE活体抑制实验表明:PB对CarE和AChE有明显抑制;TPP对CarE和AChE有明显抑制;而DEM对CarE、GSTs和AChE均有抑制作用。     
[硕士论文] 张鹏飞
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2003(学位年度)
摘要:1:虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)是在中国西南地区发现的一蜘蛛新种,属于捕鸟蛛科(Theraphosidae).该蛛穴居地下,个体大,毒性强.其粗毒中含有多种成分.我们应用离子交换和反相高效液相色谱已经从中分离出多种神经毒素如(HWTX-Ⅰ,HWTX-Ⅱ,HWTX-Ⅲ,HWTX-Ⅳ ,SHL-1),并对这些毒素进行鉴定和研究.2:从雷氏大疣蛛(Macrothele raveni)粗毒中,结合阳离子交换和反相高效液相色谱分离到一种多肽神经毒素,命名为大疣蛛毒素-Ⅵ(Raventoxin-Ⅵ).经MALDI-TOF和ESI质谱分析,它的分子量为5371.6±0.4Da,利用Edman降解气相蛋白质测序仪测得其氨基酸列是NH2-NIIKGRVVKLCGGCAQKCCDREPRCDPCRTCVENVGTGGGY LSSNKKCNGS-COOH,其中八个Cys形成四对二硫键.Raventoxin-Ⅴ能阻断小鼠膈神经膈肌标本神经肌肉接头传递,脑室注射能使小鼠瘫软.但是对昆虫没有明显作用.从一级结构上没有发现与该毒素有相似的其他蜘蛛毒素.
[博士论文] 王联德
农业昆虫与害虫防治 福建农林大学 2003(学位年度)
摘要:烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)(Homoptera: Aleyrodidae)为目前温室大棚作物和露地蔬菜、花卉上的危险性害虫之一,已在中国22个省市发生为害,给农业生产造成严重损失.生物防治是持续控制烟粉虱最有效的手段,从虫生真菌代谢产物中提取防治烟粉虱等刺吸式害虫的杀虫毒素,丰富了生物防治的天敌资源,具有重要的理论和应用意义.该文对烟粉虱重要病原真菌——蜡蚧轮枝菌的筛选与培养,毒素的提取、分离与鉴定,及其对烟粉虱的生物活性进行研究,利用种群生命系统中生物控制论的原理和方法,探讨了利用蜡蚧轮枝菌毒素控制烟粉虱的可能性.
[硕士论文] 梁海鹰
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2003(学位年度)
摘要:第一部分.光温敏核不育水稻幼穗减数分裂期蛋白质组的初步分析.该文采用固相pH梯度-SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳对光温敏核不育水稻(培矮64 S)减数分裂期幼穗总蛋白进行了分离,在增溶样品,设定合适的电泳参数,选择适当的SDS-PAGE的凝胶浓度等电泳条件下,获得了分辨率和重复性较好的凝胶图谱.PDQUEST 2-D胶图象分析软件可识别约1000个蛋白质点.第二部分.虎纹镇痛肽的特殊毒理学研究.虎纹镇痛肽系从中国虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化的一种多肽类神经毒素.该毒素能可逆地阻断小鼠膈神经-膈肌的神经传导,作用位点在突触前膜.通过膜片钳技术进行药理学研究表明,HWAP-Ⅰ是一种N-型电压门控钙离子通道阻断剂,具有较好的镇痛作用.为了检测和了解虎纹镇痛肽的致突变性和过敏性,我们根据新药临床前研究指导原则的要求进行鼠伤寒沙门氏菌回复突变(Ames)试验、中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)染色体畸变试验、小鼠骨髓微核试验和过敏性试验.实验结果表明:无论有无活化系统S9混合液,不同浓度的HWAP-Ⅰ对TA97、TA98、TA100和TA102均不引起自发回变菌落数的显著增加;四个剂量的虎纹镇痛肽对CHL细胞染色体的畸变均为阴性,对CHL细胞无致畸作用;虎纹镇痛肽的剂量组与阴性对照相比,小鼠骨髓PCE的微核率变化无显著性意义,三个试验组间亦无显著性差异;虎纹镇痛肽涂豚鼠皮肤不引起皮肤红斑,也不引起水肿,无皮肤过敏反应;虎纹镇痛肽豚鼠全身给药无抓鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、休克等过敏反应症状.因此,虎纹镇痛肽无致突变作用,也不引起过敏反应.
[硕士论文] 刘中华
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2002(学位年度)
摘要:多肽毒素存在于自然界的很多生物物种中,生物学活性是多肽毒素研究一个极为重要的方面.综述了多肽毒素的生物学活性及相应的研究方法.通过离子交换和反相-HPLC从海南捕鸟蛛粗毒分离了海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ,MALDI-TOF测定其分子量为3988.70,通过氨基酸组成分析、Cys烷基化修饰、Lys-C酶水解后HPLC分离片段序列测定和羧肽酶-Y C-端测序确定了其氨基酸序列为:ECLGFGKGCNPSNDQCCKSSNLVCSRKHRWCK-YEI,该序列与从虎纹捕鸟蛛分离的HWTX-Ⅳ只相差7个氨基酸残基.其中6个Cys形成3对二硫键,在pH3的条件下利用TCEP对海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ进行了部分还原,收集RP-HPLC的洗脱峰,用碘乙酰胺烷基化修饰游离的-SH,经质谱鉴定后进行氨基酸序列测定,由此确定了Cys2-Cys17、Cys9-Cys24和Cys16-Cys31形成了1-4、2-5和3-6的二硫键配对方式.小鼠急性毒性实验确定海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ的LD<,5>0为0.20±0.07mg/kg,而对美洲蜚蠊却没有影响.海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ能使电刺激引起的大鼠输精管收缩产生先兴奋后抑制的作用,而对电刺激诱导的小鼠膈神经-膈肌收缩却只产生抑制作用,浓度为1.0×10<'-6>mo1/L时的阻断时间为1 8.1±0.2min(n=5),同时它对由去甲肾上腺素引起的输精管收缩和直接电刺激肌肉引起的膈肌收缩没有影响,推测其具有神经专一性.电生理实验表明海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ能完全阻断TTX-敏感型的钠通道,而对钠通道的激活和失活没有影响,从而推测其是一种位点-1毒素.
[硕士论文] 王美迟
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2002(学位年度)
摘要:虎纹镇痛肽-Ⅰ(HWAP-Ⅰ)是一种从虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)中分离得到的一种N-型钙离子通道阻断剂.在期前镇痛活性研究的基础上,该实验对其镇痛活性和毒性作用做了进一步研究.
[硕士论文] 肖玉成
生物化学 湖南师范大学 2002(学位年度)
摘要:虎纹捕鸟蛛(Selenocomia huwena)、海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana)和雷氏大疣蛛(Macrothele raveni)均是在中国近年来发现的蜘蛛新种,前两者属于捕鸟蛛科,而后者属于异仿蛛科.三种蜘蛛均能捕食昆虫和小型脊椎动物.该文利用小鼠神经细胞瘤×大鼠神经胶质细胞的杂交细胞NGl08-15,通过全细胞记录(whole-cell recording)模式的膜片钳技术,检验了虎纹捕鸟蛛、海南捕鸟蛛和雷氏大疣蛛的粗毒对NG108-15细胞膜上电压门控河豚毒敏感型(TTX-S)钠电流和延迟整流钾电流的作用.
[硕士论文] 易庭芳
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2002(学位年度)
摘要:该文报道从虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)毒液中纯化的一种新型肽类神经毒素,命名为虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅵ(Huwentoxin-Ⅵ,HWTX-Ⅵ)的生物学性质及基本生物学功能结果.该毒素由40个氨基酸残基组成,分子中含6个半胱氨酸残基,并形成三对二硫键,分子量为4440.18Da.其一级结构已测定为:NH<,2>-CIGEGVPCDE NDPRC CSGLV VLKKT LHGIW IKSSY CYKCK-COOH.该毒素经搜索SWISS-PROT蛋白质序列库,发现HWTX-Ⅵ的氨基酸序列与其它蜘蛛毒素的同源性较小.脑内注射实验表明该毒素对小鼠神经系统有可恢复性的致瘫作用.此外从虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)毒液中纯化的另一种新型肽类神经毒素,虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅶ(Huwentoxin-Ⅶ,HWTX-Ⅶ)的化学性质与基本生物学功能.该毒素由34个氨基酸残基组成,分子中含6个半胱氨酸残基,形成三对二硫键,分子量为3137.22Da.其一级结构为:NH<,2>-IICAP EGGPC VAGIG CCAGL RCSGA KLGLA GSCQ-COOH.脑内注射实验表明该毒素对小鼠神经系统有致瘫作用.
[硕士论文] 喻志强
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2002(学位年度)
摘要:虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(Huwentoxin-Ⅰ,简成HWTX-Ⅰ)是从中国捕鸟蛛新种虎纹捕鸟蛛(Selenocosnia huwena)粗毒中分离纯化的一种多肽类神经毒素.该毒素分子量为3750Da,由33个氨基酸残基组成,三对二硫键按1-4(C<,2>-C<,17>),2-5(C<,9>-C<,22>),3-6(C<,16>-C<,29>)方式配对.溶液构象研究表明,它采取自然界中其它蛋白质多肽普遍采用的一种紧凑、致密的抑制剂胱氨酸结模体(ICK).HWTX-Ⅰ的二级结构包含一段三链反平行β-折迭片和五个β-转角.该毒素是一种能可逆地阻断小鼠膈神经-隔肌的骨骼肌神经接头传递的N-型乙酰胆碱受体(nAChR)的神经毒素(N-型Ca<'2+>通道阻断剂),作用位点为突触前膜.通过实验证明,HWTX-Ⅰ的功能残基主要集中在第5β-转角,即lys25和lys27附近.ω-芋螺毒素MⅦA(ω-conotoxin MVIIA)是从芋螺属(conus)海底蜗牛毒液中分离提纯的一种活性多肽,属于N-型Ca<'2+>通道阻断剂中一种,含25个氨基酸残基,三对二硫键,其二硫键连接方式、分子的空间构象与HWTX-Ⅰ很相似,采取ICK结构模体.具有这种结构模体分子是蛋白质工程改造的一种适宜的模式分子.
[硕士论文] 罗卓敏
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2002(学位年度)
摘要:虎纹镇痛肽-I(Huwena analgesic peptide-I,HWAP-I),作为一种N-型钙离子通道阻断剂,已有研究表明它具有镇痛活性<'[1]>,为了进一步证明它的镇痛药效,我们建立了不同的动物疼痛模型,采用硬膜外给药方式进行研究,同时对其毒性进行了评价.
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