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[硕士论文] 严海月
生物化学与分子生物学 安徽大学 2016(学位年度)
摘要:肾脏是哺乳动物渗透调节的重要器官,是人体最重要的排泄器官。肾脏同时还有内分泌功能,生成肾素、促红细胞生成素、活性维生素D3、前列腺素、激肽等,又为机体部分内分泌激素的降解场所和肾外激素的靶器官。肾脏的这些功能,保证了机体内环境的稳定,使新陈代谢得以正常进行。对于维持内环境的稳态起到重要的作用。哺乳动物肾脏有三个不同的细胞系来源:输尿管芽的上皮细胞,肾脏胚芽的间充质细胞,毛细血管内皮细胞。器官发生是建立在这些细胞群之间一连串的形态互动,在分支细胞和后肾间充质细胞之间的互惠的表皮-间质细胞之间的转换,同型的管间叶原基之间的相互作用,刺激血管的形成是由不同的芽基和间质-皮质细胞的相互作用指导毛细血管内皮细胞的迁移。虽然这些互动的生物学事件是众所周知的,但分子机制并没有得到很好的规划。
  胚胎肾脏发育的分子学基础哺乳动物肾脏发育起始于输尿管芽入侵后肾间质细胞。靠近芽的间充质细胞诱导和转换成上皮,这是构成肾脏的功能性过滤单位肾元。收集管系统由分支输尿管起源建立的它的生长依赖于后肾间质细胞的信号因子,输尿管和间质细胞的相互诱导在发育过程中多次发生,这也是产生肾脏的总体构架的关键步骤。在小鼠身上的基因研究让研究人员开始阐明控制这些早期发育事件的分子信号。这些实验结果表明一系列基础基因产物构成了肾脏发育过程中的关键。尽管涉及的因素,但远未达到能构建一个完全已知的,粗略的,控制胚胎肾发展开始出现分子级联的框架。我们回顾和总结这些分子起到的发育关键作用,特别是特定转录因子、生长因子和它们的受体。
  Wnt-β-catenin信号通路是胚胎发育中最重要的调控途径之一,对多细胞生物体轴的形成和分化、组织器官建成、组织干细胞的更新与分化等至关重要。Wnt信号通路的异常活化导致或参与多种人类疾病的发生发展,如肿瘤发生、神经系统退行性疾病(Alzheimer病)等。研究人员在发育不全的人类肾脏输尿管核心、基质细胞和间充质细胞中均检测到了高表达的β-catenin。
  敲除β-catenin基因的第3号外显子可使其过表达。过去很多研究主要通过基因表达谱分析β-catenin过表达对肾脏发育产生的影响,而且鉴定了多个起关键作用的基因。但相关通路以及相关通路间的共表达模式(co-expression pattern)很少被涉及研究到。本文将重点研究分析相关通路及相关性转录因子,深入开展β-catenin调控小鼠肾脏发育的转录组学研究。
  首先是微阵列数据的收集和整理。微阵列技术(Microarray)是近年来新兴的分子生物学技术,它对于人类基因组计划的实现、揭示疾病的本质和人类探索生命的奥秘有重要意义。DNA微阵列(DNA Microarray)也叫基因芯片(genechip),是分子生物学的迅猛发展及运用和人类基因组计划(Human GeneomeProject,HGP)的逐步实施的产物,它是生物学家受到计算机芯片制造和广为应用的启迪,融微电子学、生命科学、计算机科学和光电化学为一体,在原来核酸杂交(Northern、Southern)的基础上发展起来的一项新技术,它是第三次革命(基因组革命)中的主要技术之一,是生物芯片中的一种。该技术的原理是在固体表面上集成已知序列的基因探针,被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交,通过检测相应位置杂交探针,实现基因信息的快速检测。微阵列技术已经应用于医学研究,可以允许研究者同时监测成千上万个基因的表达水平,是生物技术变革的核心。
  基因芯片产生了大量的基因表达数据,这些数据为功能基因组的研究提供了重要的资源。基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus简称GEO)是目前最大的而且完全公开的高通量分子丰度数据库,主要储存基因表达数据。我们在公共数据库GEO中检索和β-catenin第3号外显子敲除相关的表达谱数据,从而研究其过表达对小鼠肾脏发育的调控作用。该数据库以一个灵活开放的设计理念,允许用户或科研人员来递呈,保存和检索多种不同类型的数据。登录GEO公用数据库的网址为:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/。
  然后我们利用GSEA提取有效信息。目前在基因表达谱数据分析领域所面临的一个重要挑战,就是怎样在海量基因表达信息中挖掘到有用信息,并进行有效的生物学专业解释分析。这就要用到基因富集分析的方法,基因富集分析的方法有很多,常用的基因富集分析方法可概括为两大类,即bottom-up法和top-down法。本研究用到bottom-up中的GSEA基因集富集分析法。基因集富集分析能够基因集水平分析表达数据的协同性差异,从而确定出具体通路。
  它将芯片表达数据首先进行排序,然后与预先构建好的功能基因集进行比较,寻找芯片杂交检测的这些基因在选定的功能基因集中出现与否以及这些基因在整个表达数据中的排序位置,分析这些在特定功能基因集中出现的基因是否在某一位置有共同的表达趋势,即富集性质。GSEA关注的不是某几个表达发生显著改变的基因,而是整个杂交数据在特定功能基因集中的表达一致性,以此来解读数据中蕴含的生物学信息。
  本研究数据选自公共数据库GEO(Gene Expression Omnibus),研究对象选取其中和小鼠β-catenin过表达肾脏转录组密切相关微阵列(microarray)数据集,接下来我们利用GSEA(Gene set enrichment analysis)分析。GSEA是全基因组表达谱芯片数据分析工具,下载后可以免费使用。并通过KEGG进行功能注释,京都基因与基因组百科全书,KEGG,是系统分析基因功能、基因组信息的数据库,它整合了基因组学、生物化学以及系统功能组学的信息,有助于研究者把基因及基因表达信息作为一份整体进行研究。
  利用GSEA分析后的结果是:我们鉴定出了63条被β-catenin上调的通路如细胞周期信号通路、Notch信号通路(Notch signaling pathway)和mTOR信号通路,以及43条被下调的通路如Ⅰ型糖尿病信号通路和ABC转运体(ABCtransporters)等通路。经KEGG功能注释,这些显著性通路最终被划分到了6个KEGG功能类别中。分别是细胞进程(cellular processes)功能类别,环境信息处理(environmental information processing)类别,遗传信息处理(genetic informationprocessing)类别,人类疾病相关通路类别,新陈代谢(metabolism)和有机系统(organismal systems)类别。
  我们对其中代表性重要通路中的几个有重要相关性的转录因子如PAX2、SREBP1和PPAR_DR1等进行分析,对重要性相关通路如mTOR信号通路、JAK-STAT信号通路进行分析研究,并最终构建了相关通路的共表达网络,这个网络包含有核心基因和转录因子如STATs、PAX2等,我们的研究结果将帮助我们更好地在全基因组层面上了解β-catenin对于小鼠肾脏发育的调控作用。
[硕士论文] 何刚
免疫学 苏州大学 2014(学位年度)
摘要:皮肤是人机体最重要免疫器官之一,其损伤的修复是一个非常复杂的过程,由多种生长因子及细胞因子介导。人纤维细胞生长因子(FGF)超家族是参与结缔组织生长、皮肤愈合的主要因子,人角质细胞因子-2(KGF-2)是该超家族成员之一。KGF-2对多种因素如急慢性炎症、溃疡、物理化学烧伤等引起的组织器官损伤的修复过程发挥重要作用,并且在整个脊椎动物的胚胎发育过程中起着不可替代的作用,参与并调控多种组织和器官的形成和分化。因此KGF-2有着很好的应用前景,在临床上可以用于治疗多种表皮损伤相关疾病。
  本文的主要研究内容为成功构建了KGF-2重组高效表达载体;通过初步发酵条件优化,获得了稳定高表达的工程菌株;经过纯化工艺摸索及优化,得到稳定简便且获得高纯度蛋白的纯化工艺,具有极大的应用价值。纯化后的蛋白经过活性检测,具有一定的生物学活性,为以后的科研应用打下了坚实的基础。主要研究结果如下:⑴通过优化密码子,成功构建了pET-30a(+)-hKGF2重组表达载体,通过表达条件的优化获得高效、可溶性表达的KGF-2重组蛋白。⑵通过确定培养基配方、诱导温度、诱导时间、诱导pH等发酵主要条件进行工艺参数优化,在此基础上进一步确立了高密度发酵条件。⑶建立了适合放大的纯化工艺路线,确立了简便快捷可线性放大的纯化工艺,通过高压破菌、Heparin亲和层析、超滤脱盐及 DEAE阴离子层析方法,得到了高纯度的目标蛋白。⑷rhKGF-2对体外培养角质形成细胞的生长有非常显著的促进作用,在3D气液培养体系中亦可促进组织工程皮肤表皮中角质形成细胞的生长及分化。
[硕士论文] 李清正
运动人体科学 广州体育学院;广州体育大学 2009(学位年度)
摘要:目的:研究不同温度、时间桑拿浴速降体重的效果及对机体的影响。方法:实验对象:健康成年男性8人。实验采用桑拿浴对受试者进行速降体重,实验按照温度条件60℃、70℃、80℃及各温度桑拿时间10min、15min进行分组,共分为共6组,分别为60℃-10min组、60℃-15min组、70℃-10min组、70℃-15min组、80℃-10min组、80℃-15min组。桑拿实验采用间歇式桑拿浴法,每次桑拿10min或15min,间歇5min,5次桑拿为一组。每组实验前、后测量受试者体重、力量指标、反应时、体成分、心血管系统机能、尿液指标、血液学指标,实验前测试结果作为对照组,实验后测试结果为实验组。实验中每次桑拿间歇即刻测量心血管系统机能、体重。
  结果:(1)各组实验后体重均非常显著下降(P<0.01),脱水百分数范围为1%-3%,受试者在70℃-15min组与80℃-15min组中,脱水百分数较大;
  (2)受试者在60℃,15min组实验后立定跳远成绩显著升高(P<0.05);70℃,10min组实验后坐姿蹬腿显著上升(P<0.05);70℃,15min组、80℃,15min组实验后立定跳远成绩显著升高(P<0.05);80℃,10min组实验后反应时显著下降(P<0.05),坐姿蹬腿显著上升(P<0.05);
  (3)受试者在60℃-10min组实验中,机体电解质代谢所受不利影响最小;
  (4)受试者在60℃-15min组、70℃-10min组、70℃-15min组实验中,机体心血管系统所受不利影响较小;
  (5)受试者在70℃-15min组实验中,机体所受不利影响最小;
  (6)受试者在80℃-10min组实验中,机体肝脏功能所受不利影响最小;
  (7)受试者在70℃-10min组实验中,机体肾脏功能所受不利影响最小。
  结论:(1)在本研究采用的6种间歇式桑拿方法中,从脱水百分数来看,70℃-15min、80℃-15min快速减体重效果较好。
  (2)60℃-80℃桑拿速降体重对肌肉力量、反射能力有轻微影响;
  (3)70℃-15min桑拿速降体重对生理机能不利影响最小。
  综合分析认为最适合的赛前桑拿浴速降体重方法为70℃-15min。
[硕士论文] 林喜秀
运动人体科学 湖南师范大学 2008(学位年度)
摘要:目的:通过采用不同持续时间低氧后训练的大鼠低氧训练模型,研究低氧、训练以及低氧训练对大鼠肾组织细胞凋亡相关因子的影响。 方法:60只SD大鼠按体重随机分为6组,每组10只,即:对照组(A)、低氧8h组(B)、低氧12h组(C)、常氧训练组(D)、低氧8h训练组(E)和低氧12h训练组(F)。D、E、F组大鼠每天在坡度为0的动物跑台上以25m/min的速度训练1h。训练完后,将B、E组和C、F组依次放入氧浓度为12.5%(相当于海拔4000m)的低氧舱内8h和12h。实验期为4wk,5d/wk。最后一次实验结束后24小时,大鼠均实施速眠新II腹腔麻醉,其理想后断尾取全血(检测RBC、HB、HCT值)后断头处死,取肾髓质外皮质部组织制备肾组织石蜡切片,HE染色检测肾组织细胞的形态学变化;免疫组化法检测大鼠肾组织细胞HIF-1a、B细胞淋巴瘤/白血病癌基因-2(B cell lymphoma/leukemia 2,Bcl-2)、Bax(Bcl-2 associated x,Bax)因子、EPO的蛋白表达以及TUNEL标记法在光镜下观察肾组织凋亡细胞核数目。 结果: 1.RBC、HB、HCT三个指标的结果显示:B组与E组比较均具有显著性差异(P<0.05);A组和D组比较亦均具有显著性差异(P<0.05)。 2.肾组织切片进行HE染色显示:A组和B组大鼠肾组织细胞结构完整,肾小管上皮细胞未见特殊改变;C组肾小管轻度肿胀,部分刷状缘脱落,管腔内偶可见脱落的细胞;D肾小管扩张,细胞扁平,轻度浊肿,刷状缘脱落,肾小球轻度淤血;E组较D组病变明显减轻,肾小管变性范围和程度均明显小于和轻于D组,胞核基本正常,肾小管轻度肿胀;F组肾小管上皮细胞水肿样变性,以近曲小管为重,表现为肾小管管腔扩张,管内可见管形和脱落细胞;上皮细胞核染色质边集,胞浆空泡样变性。 3.TUNEL染色切片统计学分析结果显示:E组和F组、C组与F组比较,具有显著性差异(P<0.05);A组与D组比较,具有显著性差异(P<0.05)。 4.免疫组化染色切片观察大鼠肾组织HIF-1a的蛋白表达显示:将实验各组肾组织样本的石蜡切片进行免疫组化染色,在显微镜下观察发现:HIF-1a免疫组织化学阳性物质定位于细胞核内,呈弥散或颗粒状或二者混合。呈强染性的肾组织细胞核中可见丰富阳性反应颗粒,细胞核周围的胞浆内亦有阳性表达。统计学分析结果显示: B组、C组分别与A组比较,均具有显著性差异(P<0.05);E组和F组比较具有显著性差异(P<0.05);A组和D组比较,具有显著性差异(P<0.05)。 5.免疫组化染色切片观察大鼠肾组织Bcl-2、Bax和EPO的表达显示,Bcl-2、Bax和EPO免疫组织化学阳性物质定位于胞浆内,偶见胞膜(或)核膜,细胞核被苏木素复染成蓝色。统计结果显示:A组、B组、C组之间Bcl-2、Bax的表达均具有显著性差异(P<0.05);E组与F组、C组与F组比较之间比较,具有显著性差异(P<0.05);A组和D组比较具有显著性差异(P<0.05)。EPO的表达结果显示:EPO结果显示:B组和C组分别与A组比较,B组与A组有显著性差异(P<0.05)。 6.大鼠肾组织细胞凋亡与Bax、Bax/Bcl-2比值的相关性以及HIF-1a与Bax表达的相关性显示:大鼠肾组织细胞凋亡与Bax、Bax/Bcl-2比值之间存在正相关(P<0.05);肾组织细胞HIF-1a的蛋白表达与Bax之间存在正相关(P<0.05)。 结论: 1.合适的低氧刺激使SD大鼠有氧代谢能力提高。 2.低氧训练可诱导大鼠肾组织HIF-1a、EPO、Bcl-2以及Bax蛋白表达;细胞凋亡率与凋亡指数及病理损伤与运动时低氧刺激有关,以低氧12小时训练组最明显。 3.Bcl-2与Bax参与调控肾组织细胞的凋亡;HIF-1a的表达可能协同Bcl-2家族凋亡相关因子的表达,在低氧训练导致的肾组织细胞凋亡中发挥双重效应。
[博士论文] 陈龙健
农业工程 中国农业大学 2007(学位年度)
摘要:无论从重量还是面积来看,皮肤都是人体最大的组织器官,时刻都与外界环境直接接触,具有重要的屏障作用。皮肤屏障具有两方面的功能:防止体内水分和营养物质的损失:防止外界化学性、物理性或生物性物质的入侵。无论是隔绝外来物质还是阻止内部物质的损失,均与皮肤渗透性能有着紧密的联系。皮肤渗透性能与多个领域密切相关,如医药、日化和环保等,因此皮肤渗透机理及其模型研究也受到了人们越来越多的重视。本文主要研究内容及结论如下: 1.采用砖墙结构描述角质层物理结构,综合考虑皮肤角质层、溶质和溶质载体理化特性对皮肤渗透的影响,建立皮肤渗透机理模型; 2.收集大量理化特性各异溶质的皮肤渗透系数对所建立的皮肤渗透机理模型进行验证,结果发现,忽略角质细胞水相通道的先前模型对亲水性较强溶质的皮肤渗透系数(K<,p>)预测能力较差;与这些先前模型相比,考虑角质细胞间脂质域通道和角质细胞内水相通道的当前机理模型对K<,p>有较好的预测能力,尤其对于亲水性较强(P<,ow>≤0.01)的溶质。当前机理模型的预测值与试验值之间的决定系数R<'2>和平均绝对误差MAE分别为0.76和7.2%。 3.通过皮肤渗透机理模型,分析了溶质理化特性对其皮肤渗透的影响。当溶质亲油性或亲水性较弱(P<,ow>0.01)时,考虑角质细胞内水相通道模型与不考虑角质细胞内水相通道模型预测值相当;当溶质亲水性较强(P<,ow><0.01)时,考虑角质细胞内水相通道模型的预测值与试验值吻合较好,但是不考虑角质细胞内水相通道模型的预测值比试验值低估1-3个数量级。这些结果暗示了角质细胞间脂质域通道是亲油性或弱亲水性的溶质的主要渗透通道,而角质细胞内水相通道则是亲水性较强的溶质主要渗透通道。 4.利用溶质在角质层中的浓度分布试验数据对当前模型进行了进一步有效性验证。首先采用无损检测的激光共聚焦拉曼光谱技术,对维生素A在角质层中相对浓度分布进行试验测量。苯甲酸(Benzoic acid)和4-氰基苯酚(4-cyanophenol)在角质层中绝对浓度分布试验数据通过胶带粘贴试验测量。分别将三种物质的皮肤渗透过程试验数据与当前模型预测值进行了比较,结果表明当前模型能较好的拟合试验数据。这标志着当前模型不仅能准确预测皮肤渗透系数,而且能模拟溶质在皮肤中扩散过程。
[硕士论文] 孟小倩
细胞生物学 山东师范大学 2004(学位年度)
摘要:在体内,哺乳动物卵母细胞的发育停滞在第一次减数分裂前期的双线期.在周期性激素的诱导下,一部分卵母细胞发生生发泡破裂,恢复减数分裂.在这一过程中,卵丘细胞中的蛋白激酶(PKC)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在卵丘包裹的卵母细胞减数分裂过程中具有重要作用,但是它们之间的相互调节及相互作用关系并不清楚.该实验主要研究了1)卵丘细胞中MAPK是否参与了PKC激活的减数分裂恢复;2)在激素诱导的减数分裂恢复过程中PKC对MAPK活性的调节作用;3)卵丘细胞中PKC和MAPK诱导减数分裂恢复的可能作用模式.体内卵母细胞减数分裂的恢复由于受到卵泡内抑制性微环境的影响而发生阻滞,激素的作用打破这一阻滞而重新启动减数分裂.该实验应用一种体外诱导模型模拟这一过程.将从卵巢中取出的猪卵母细胞培养在含有减数分裂恢复抑制剂的培养液中,然后用PKC的激活剂和激素诱导猪卵母细胞的减数分裂恢复,用蛋白质免疫印迹检测MAPK的活性.我们的结果表明PKC的激活剂,豆蔻酰佛波醇乙脂(PMA)可以诱导猪卵母细胞减数分裂恢复,同时激活卵丘和卵母细胞中的MAPK活性,而这一过程可被PKC的抑制剂chelerythrine和calphostin C所抑制.同时,MAPK上游激酶MEK的抑制剂U0126也可以抑制PMA诱导的卵母细胞减数分裂恢复和卵丘细胞中的MAPK活性,这说明PKC诱导的卵母细胞减数分裂恢复可能是通过激活卵丘细胞中MAPK的活性实现的.γ-微管蛋白是微管蛋白家族的成员之一,在微管的晶核起始过程中具有重要作用.该研究应用激光共聚焦显微术研究了小鼠卵母细胞减数分裂成熟、受精及早期胚胎发育过程中γ-微管蛋白的动态变化,以及在第一次减数分裂纺锤体形成过程中α-微管蛋白和γ-微管蛋白的共定位情况.结果表明,γ-微管蛋白均匀地分布在生发泡期(GV期)小鼠卵母细胞中;生发泡破裂(GVBD),γ-微管蛋白呈星点状分布于卵胞质及凝集的染色体周围,至前中期,则迁移至纺锤体的两极;后期至末期,γ-微管蛋白逐渐解凝集,定位于分开的染色体之间.γ-微管蛋白在第二次减数分裂及受精后的定位与第一次减数分裂过程相似.与GV期卵母细胞不同的是,在早期胚胎的间期卵裂球中,γ-微管蛋白呈星点状分布.另外,第一次减数分裂纺锤体组装过程中,在卵胞质中检测到定位几乎完全重叠的点状分布的α-微管蛋白和γ-微管蛋白,而在凝集的染色体的位置可见α-微管蛋白以γ-微管蛋白为中心向四周辐射,随着γ-微管蛋白向纺锤体两极迁移,α-微管逐渐组织形成中期纺锤体.以上结果表明,在小鼠卵母细胞减数分裂成熟、受精、及早期胚胎发育过程中,γ-微管蛋白在微管晶核起始及纺锤体形成过程中起重要作用.
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