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[硕士论文] 刘梁涛
生物学、微生物学 河南师范大学 2018(学位年度)
摘要:木质素是一种高分子的聚合物,在自然界中的含量仅仅低于纤维素,作为苯丙烷的基本结构单元,其连接形式通过C-C键和C-O-C键相互连接,从而构成无规则的空间三维结构,因而在自然存在的状态下难以被降解。目前在利用微生物降解的同时,也使得能产生大量的降解木质素的酶对木质素进行分解转化,不单单可以治理环境污染的问题,而且可以合理利用自然界中的木质素资源。
  因此,利用合理的方法分离纯化木质素降解菌,探索产酶能力及发酵条件,构建高效表达漆酶基因工程菌并应用于生产实践显得尤为重要,这将大大加快木质素原料在工农业生产的利用步伐,同时也是制约环境污染的关键所在。
  试验一高产漆酶菌株的筛选及鉴定
  为了获得高产漆酶的菌株用于降解木质素,分别从新乡周边腐木堆积处、秸秆堆积处和造纸厂废水这些木质素含量丰富的地方取样。本研究以木质素为唯一碳源,初筛出42株对木质素具有降解能力的菌株,采用愈创木酚平板法对产漆酶的菌株进行复筛得到4株产漆酶能力较强的真菌菌株,通过生理生化及18SrDNA序列分析对菌株进行鉴定,确定了2号菌株为疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria),6号菌株为粗毛革孔菌(Coriolopsis gallica),8号菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium),11号菌株为白腐菌(White rot fungi)。并通过液态发酵培养及ABTS法对漆酶活性木质素降解能力进行研究。
  试验二目的菌株产酶能力的比较及发酵条件的探索研究
  挑取筛选出来的四种真菌菌株于液体培养基中,制备粗酶液,并利用ABTS法每天测定上清液中的酶活力。试验表明,在经过培养6天后,8号菌株漆酶活力达到最高,为233.33U/L。接下来以黄孢原毛平革菌为目的菌株为研究对象,利用液态发酵研究碳源、氮源、金属离子、pH、温度对其发酵产漆酶的影响,优化产酶条件。结果表明:该菌株的最优碳源为乳糖,最优氮源为酵母粉,最适铜离子浓度为0.6mmol/L,最适温度为30℃,最适pH为4。在此条件下木质素去除率达到了84.7%,具有良好的降解木质素的能力,为进一步利用此菌株进行工业化生产奠定了基础。
  试验三黄孢原毛平革菌漆酶基因的克隆表达及蛋白的纯化
  为了获得高产漆酶的工程菌株,根据目前已知的黄孢原毛平革菌中的漆酶基因序列,设计特异性的引物,通过PCR扩增,可以成功的获得cds区为1680bp片段,送生工测序后对比发现此基因的序列与目前已公布的漆酶基因片段的同源性达98%,这就表明我们成功克隆到了该基因,将其命名为lac1680。在漆酶基因两段引入NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切,将切下来的漆酶基因,通过pET-24a载体进行连接转化到大肠杆菌原核菌株中,得到基因工程菌。将我们得到的漆酶的氨基酸序列和GeneBank中现有的真菌漆酶氨基酸序列对比分析表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的序列同源性;通过对重组菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE,出现75KDa目的条带,表明诱导表达成功;预表达成功后,通过收菌,破碎,上样流出液进行NI-NTA的层析柱,对纯化洗脱下来的mcol-c-His6蛋白进行纯化;为了更进一步的验证这个条带就是所需的漆酶条带,我们通过WesternBlot方法,洗脱纯化后和浓缩后的溶液中在目的位置都出现了75KDa的目的条带,证明这个条带就是诱导纯化后的漆酶。并经纯化回收后,漆酶纯度在98%以上。通过酶学性质的探究,对比基因工程菌和黄孢原毛平革菌培养不同时间酶活力的比较,构建好的工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高,提高了39%,为进一步利用工程菌株进行工业化生产奠定了基础,也为以后的应用指明了方向。
[硕士论文] 张健
应用数学 山东科技大学 2018(学位年度)
摘要:本文通过向一类具有可替代营养的恒化器模型中引入环境白噪声干扰,建立了一类新的随机恒化器模型,利用微分方程的相关理论、方法结合不等式放缩技术定性的研究了其全局动力学.本文的研究成果对具有可替代营养的微生物的培养工作提供了一定的理论依据.
  全文共分五章.
  第一章介绍了课题的研究背景、微分方程的相关理论知识和本文的主要工作.
  第二章首先不考虑环境白噪声干扰,得到对应的确定性模型系统,利用常微分方程的相关理论,研究了该模型平衡点的稳定性,得到了微生物种群灭绝与持久的阈值.接着重点研究了环境白噪声干扰对于微生物种群的影响,主要利用随机微分方程的相关理论、方法和不等放缩技巧,讨论了环境白噪声强度较小的情况下的模型系统的阈值动力学,得到了微生物灭绝与平均持久的条件.我们的结果表明,随机恒化器模型的阈值与对应确定性模型的阈值存在较大差异,大的环境白噪声干扰会造成微生物灭绝,从而不利于微生物的培养.最后,通过数值模拟验证了所得的理论结果.
  第三章进行全文总结,并对以后的研究工作进行了展望性探讨.
[博士论文] 王人杰
化学工程与技术 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:高效细菌检测方法的研究与建立在食品安全、环境卫生和生物医疗等领域的重要性不言而喻。将荧光检测技术和阻抗检测技术与微流控芯片(Microfluidic chip)有效集成以构建新型微型化分析平台,具有实现快速、高效、灵敏细菌检测及检测系统微型化和集成化的潜力,在细菌检测领域具有广阔的发展前景。
  本论文针对目前细菌检测耗时长、过程繁琐、灵敏度较低、依赖大型检测仪器等问题,提出将微流控细菌芯片与原位荧光检测技术及电化学阻抗检测技术集成,构建微型化分析检测微系统,并有机结合纳米技术放大检测信号的总体研究方案。为避免传统荧光标记试剂易淬灭、不易修饰等缺点,设计制备了荧光产率高、生物相容性好的荧光纳米粒子;通过对各功能区流场和电场的计算模拟,确定集成特异性富集功能和介电电泳(DEP)分选富集功能的微流控细菌芯片的主要功能区结构;完成微流控芯片功能区内细菌的分离与富集、纳米粒子标记、细菌原位荧光和电化学阻抗检测信号放大以及细菌检测方法研究,建立基于微流控芯片的细菌高效检测方法,在细菌的快速检测集成化和实时化发展方面具有重要研究价值和应用前景。
  本文主要研究工作及结果包括:
  ①综述了细菌检测需求背景和意义、微流控芯片细菌检测技术以及微流控芯片在其他生化领域应用的发展现状和趋势,对目前细菌检测方法所存在的问题进行进一步的分析,提出本文的研究目的与主要研究内容。
  ②基于荧光标记法对D-柠檬烯纳米乳液的细菌生物膜抑制效应的研究,分析并提出了细菌检测的明确需求。实验基于有机荧光试剂标记,初步探索了D-柠檬烯纳米乳液对细菌生物膜的抑制作用,发现建立快速灵敏高效的细菌检测方法十分重要,而纳米技术与多功能微流控芯片的有机集成将是新方法建立的有效途径。③建立了沙门氏菌芯片原位荧光检测新方法,研制了集成免疫捕获-CdSe/ZnS量子点标记及DEP富集的沙门氏菌微流控芯片。通过设计制作集成特异性富集功能的微流控细菌芯片,解决细菌芯片分析体系的选择性问题;通过设计制作集成DEP分选富集功能的微流控细菌芯片和原位荧光检测,有效提高了细菌芯片检测的灵敏度,还可以实现细菌的芯片可视化观测。以亲水性CdSe/ZnS量子点作为荧光标记物,构建集成微流控荧光检测微系统,对固定于微流控芯片免疫反应区的 QDs标记的鼠伤寒沙门氏菌产物进行荧光检测,实现鼠伤寒沙门氏菌的定量分析,对鼠伤寒沙门氏菌的检测限达到37cfu mL-1。为充分发挥疏水性CdSe/ZnS量子点在细菌检测领域的优势,以改进的反相微乳液法制备CdSe/ZnS@SiO2-NH2壳层结构纳米粒子,利用戊二醛“两步法”将CdSe/ZnS@SiO2-NH2壳层结构纳米粒子标记于细菌表面,建立了沙门氏菌定量测试方法。为降低细菌的检出限和获取可视化检测效果,利用CdSe/ZnS@SiO2-NH2纳米粒子标记后的沙门氏菌的介电泳特性,在集成DEP分选富集功能的微流控细菌芯片上,以正介电电泳(pDEP)模式,将沙门氏菌(5cells/25μL)捕获富集于微电极边缘,在荧光显微镜下可以实现极少量细菌的可视化计数观测。
  ④建立了集成CQDs-apt新型纳米荧光标记和DEP在线分选富集的沙门氏菌微流控芯片检测新方法。设计并制备了制备简单生物相容性高的CQDs,并与适配体(apt)结合,研制获得具有优越荧光性和特异性的新型纳米荧光探针;利用该荧光探针,在优化的条件下,无需其他富集操作,建立了沙门氏菌高效定量检测新方法,方法对沙门氏菌的最低检出限达到50cfu mL-1。在适配体特异性的识别标记沙门氏菌的基础上,将该荧光标记体系与微流控芯片上DEP技术有机结合,实现对样本中活性沙门氏菌的DEP分选富集和荧光定量检测,所建立的细菌检测方法将检测时间缩短在两个小时以内,兼具高效、灵敏、易集成等优点,在生化分析和药物筛选等领域具有巨大的应用潜力。
  ⑤建立了集成DEP富集和原位电阻抗检测的大肠杆菌微流控芯片检测新方法。设计制备了具有DEP富集和原位电阻抗检测的多功能微流控细菌芯片,搭建集成微流控芯片阻抗分析微系统,通过芯片上集成叉指微电极实现细菌的在线预富集和原位阻抗在线监测,解决了提高细菌检测灵敏度及芯片上细菌在线检测的难题,建立了微流控芯片介电电泳富集-原位阻抗检测的细菌定量新方法。以大肠杆菌为测试样本细菌,在优化的条件下,方法对大肠杆菌的检测限为5×104cfu mL-1,检测时间仅为6min,并成功应用于鸡肉合成样本中大肠杆菌检测,证明了该方法的实际应用潜力。在充分发挥细菌阻抗检测优势的基础上,为降低细菌检出限,进一步设计制备了集成“Tesla”结构混合区和叉指微电极的微流控阻抗检测芯片,利用AuNPs@Ag复合物的电信号放大作用,建立了能快速有效提高细菌阻抗检测灵敏度的方法,从而将基于微流控芯片的细菌阻抗检测方法检出限降低为5×102cfu mL-1。
[硕士论文] 周娟
化学 东华理工大学 2017(学位年度)
摘要:贵州是东亚喀斯特片区中心,是世界三大喀斯特集中区之一。微生物是土壤中最活跃的部分,是生态系统中能量流动和物质循环的主要推动者。而放线菌主要存在于土壤中,放线菌能够产生大量的具有生物活性的次级代谢产物,因此对土壤放线菌的研究具有重要的价值。贵州喀斯特区域土壤放线菌资料目前还非常有限,亟需进行深入细致的研究。本研究采用不同的分离方法对贵州万峰林国家地质公园、草海国家自然保护区、双河洞国家地质公园等8个地区的土壤放线菌进行分离和鉴定,对其多样性进行研究,并对分离得到的菌株进行抑菌活性的研究。
  具体实验结果如下:
  1.采用四种不同的方式预处理来处理106份土壤样品,其中用微波干热法的效果最佳。最终获得了76株放线菌。
  2.采用9种培养基对放线菌进行分离培养,用LNMS分离出来的放线菌数量最多为每克土5.2×105株。燕麦琼胶培养基分离出的放线菌种类数最多,为8种。
  3.在不同地区、不同植被类型的土壤分离中,耕地中分离出的放线菌数量最多可达4.65×105个/克土。
  4.在不同生境中,草海的边坡、黄果树林下和双河洞的洞穴的土壤中分离出的放线菌所占比重都在65%以上,在小生境中沟边放线菌种类比重最小为49%,而洞穴放线菌种类所占比重最大为76%。
  5.在高海拔2400 m时放线菌的种类数量减少,但稀有放线菌的数量有所增加,分别有罗氏菌属、类诺卡氏菌属等。
  6.采用滤纸片法对放线菌进行抑菌活性测定。有10株放线菌对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄杆菌的抑菌直径达到了10mm以上,其中3菌株对金黄色葡萄杆菌的抑菌直径都在14mm以上。有12株放线菌对真菌的拮抗性较强,然后用生长速率法进行活性复筛。至少对2种真菌有明显的抑制作用。综合抑细菌实验和抑真菌实验的结果可知,C1、E4这两株放线菌对细菌和真菌均有很好的抑制作用,有继续开发的价值。
  7.通过对菌株的形态学特征、培养特征和16S rDNA序列分析,可将拮抗性优良的菌株1030、1051、1112、1095、1312归属于链霉菌属。
[硕士论文] 修磊
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸菌胞外多糖(Lactic acid bacteria exopolysaccharide,LAB EPS)具有多种生物活性,对其研究与开发具有重要的实际意义与良好的应用前景。本研究以实验室保存鉴定的乳酸菌为出发菌株,筛选能够增强细胞免疫活性的乳酸菌EPS,随后将其进行分离纯化及结构初步鉴定,在此基础上探讨其对免疫细胞活性及机体特异性免疫应答的影响。
  本研究主要内容包括:⑴对实验室保存鉴定的110株乳酸杆菌所产EPS进行测定,筛选10株高产EPS乳酸杆菌,其中Lactobacillus harbinensis TCP086、Lactobacillus kefiri SXJ29和Lactobacillus casei SXJ30所产EPS可以增强巨噬细胞增殖、吞噬以及NO释放能力。⑵将上述Lactobacillus harbinensis TCP086、Lactobacillus kefiri SXJ29和Lactobacillus casei SXJ30所产EPS经过DEAE-Sepharose Fast Flow和SepharoseCL-6B色谱柱进行分离纯化后获得主要均一组分:TCP086 EPS、SXJ29 EPS和SXJ30 EPS。紫外光谱和红外光谱扫描发现三种EPS均不含核酸和蛋白质,且均具有多糖的特征吸收峰,存在α型吡喃糖环构型;多角度激光光散射仪检测其分子量分别为4.908×104 Da、3.423×104 Da和3.737×104 Da;离子色谱检测单糖组成发现,三种EPS均由氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖以及葡萄糖醛酸等7种单糖组成,其中TCP086 EPS各主要组分摩尔比氨基葡萄糖∶氨基半乳糖∶甘露糖∶葡萄糖醛酸约为2.6∶1.6∶1.2∶1; SXJ29 EPS各主要组分摩尔比葡萄糖∶氨基半乳糖∶氨基葡萄糖约为3.1∶1∶1;SXJ30 EPS各主要组分摩尔比葡萄糖∶氨基葡萄糖∶甘露糖约为1.4∶1.1∶1。⑶以纯化的TCP086 EPS、SXJ29 EPS和SXJ30 EPS刺激巨噬细胞,对其增殖能力、吞噬中性红能力、NO释放能力、细胞因子分泌以及表面分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达进行检测后发现,巨噬细胞的免疫增强活性与EPS的浓度呈正相关,且SXJ30 EPS对巨噬细胞的免疫增强活性最强。⑷在体外成功利用IL-4和GM-CSF诱导获得小鼠骨髓来源树突状细胞,显微镜下观察SXJ30 EPS刺激小鼠BMDCs后,细胞突起增多,体积增大;流式细胞术和ELISA法检测后发现,SXJ30 EPS能显著增强小鼠BMDCs表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达以及细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12)的分泌。⑸将SXJ30 EPS与OVA抗原免疫小鼠,发现SXJ30 EPS可以显著提高小鼠脾脏DCs表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达量;与铝盐(Alum)佐剂相比,SXJ30 EPS可以显著提高小鼠血清中OVA特异性IgG抗体以及IgG抗体亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的滴度;此外,SXJ30 EPS还能显著促进脾脏T淋巴细胞增殖以及INF-γ和IL-4的分泌;显著提高脾脏IL-4+ CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞以及IFN-γ+ CD8+T细胞的比例,与Alum佐剂相比差异显著。
[硕士论文] 王蕾
生态学 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:本论文从85株南极细菌中筛选获得12株具有产卡拉胶酶活性的菌株,并对高活性菌株R11-5进行种属鉴定,优化其发酵条件;通过对该菌全基因组测序分析,克隆获得卡拉胶酶基因Car1853,并实现其异源高效表达;纯化重组卡拉胶酶,系统研究其酶学性质,分析该酶的降解特性,阐明其降解产物及其类型,以期为卡拉胶酶和卡拉寡糖的工业化生产提供理论和技术支持。
  本实验首先对筛选出的产高活性卡拉胶酶菌株R11-5进行种属鉴定,根据形态学和16S rDNA法的种属鉴定结果表明该南极菌属于交替单胞菌属(Alteromonas)。通过响应面分析法对菌株优化培养单因素实验的结果最佳培养条件为温度15.7℃、pH7.0、酵母粉0.6%、牛肉膏1.17%、卡拉胶1.05‰、CaCl25.78mmol/L,接种量为2%,在此培养条件下,能够得到理论上最大酶活值为56.972U·mL-1,经过优化培养后酶活提高了1.7倍。通过对该菌全基因组测序分析,克隆获得了卡拉胶酶基因Car1853,采用基因工程手段构建重组质粒pET30a-Car1853,并成功转化大肠杆菌BL-21。采用Ni柱技术纯化获得单一条带的重组卡拉胶酶,SDS-PAGE显示其分子量为42kDa;酶学性质研究表明,该酶最佳反应温度为55℃,最佳pH为7.0,且多种金属离子对其活性具有抑制作用。薄层层析法初步表明该卡拉胶酶裂解卡拉胶的终产物主要是卡拉胶二糖。
[硕士论文] 王江
水生生物学 大连海洋大学 2017(学位年度)
摘要:海洋中蕴藏着丰富的物质和微生物资源,其中,聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate:PHA)是存在于海洋微生物体内的一种生物材料,具有生物可降解性,生物相容性等特性,可广泛地用于环保、医疗等领域。早在1926年,法国的科学家 Lemoigne首次在巨大芽孢杆菌中发现了 PHA的最常见单体:聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate:PHB),从此开启了PHA的研究之旅。本研究从海边土壤样品中分离得到了一株可以利用甲醇产PHB的菌株,对该菌株进行了鉴定,甲醇浓度的优化,对PHB合成途径中的三个基因进行了克隆、表达、纯化、酶活测定及关键酶的定点突变研究。
  从海洋土壤样品中分离得到了一株以甲醇为唯一能源和碳源合成PHB的菌株,提取其基因组,扩增该菌株的16S rRNA基因序列并用该序列构建了进化树,结果表明分离得到的这株菌属于Methylobacterium菌属,将其命名为Methylobacteriumsp.1805。探索了最适菌株生长的起始甲醇浓度,甲醇补加浓度,菌株对甲醇的耐受性及降解能力,最适PHB积累的甲醇起始浓度。结果表明:将菌接在含0.4%甲醇的生长培养液中,每天补加0.5%的甲醇最利菌的生长,在该条件下,菌株在72h OD600值可达7,进入稳定生长状态。该菌也有良好的甲醇耐受性,在含4%甲醇的培养液中仍能良好地生长,对甲醇的降解能力也很强。将菌接到含0.5%甲醇的产物积累培养液中,每天补加0.5%的甲醇,适宜菌株积累PHB。在优化的条件下,该菌株能够积累51.8%菌体干重的PHB,有工业应用的潜力。
  通过分析Methylobacterium中phaA、phaB、phaC三个基因的同源序列,设计引物,从Methylobacteriumsp.1805中扩增三个基因,测定其序列并将三个基因连接到pET-28a(+)表达载体上,诱导表达三个酶,测定酶活及动力学数据,并对三个酶进行生物信息学分析。用RF(restriction free)克隆的方式对PhaC潜在的关键氨基酸(341的Cys、496的Asp、524的His)进行定点突变,测定突变体的酶活。使用同源对比设计的引物,成功扩增出了三个基因,将其提交到NCBI数据库,登录号分别为KY229163、KY229164、KY229165。测定的PhaA酶活为0.41U,Vmax与Km值分别为0.15μM min-1mg-1和0.25mM,该酶属于cond-enzymes超家族,通过“ping pong”催化机制,将2分子乙酰辅酶A转化为一分子乙酰乙酰辅酶A,整个催化过程是由“Cys89-His348-Cys378”催化域完成。测定的PhaB酶活为1.64U,Vmax与Km值分别为0.48μM min-1mg-1和1.21mM,该酶属于NADB-Rossmann超家族中的短链醇脱氢酶。测定的PhaC酶活为33.51U,Vmax与Km值分别为0.1μM min-1mg-1和0.14 mM,属于PhaC-N超家族的I类PhaC,通过SWISS-MODEL对PhaC进行结构分析,结果表明克隆的PhaC与人类的胃脂肪酶仅有11.91%的相似性,与典型的I类PhaC没有相似性,对可能的三个关键氨基酸进行定点突变后发现酶活都提高了,表明新克隆的PhaC与典型的I类PhaC可能有不同的催化机制。
[硕士论文] 黄建蓉
水产养殖学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:运城盐湖是一个古老而又典型的内陆咸水湖,富含丰富的芒硝(主要成分硫酸钠)资源,是研究嗜盐细菌多样性的理想对象。嗜盐细菌作为一类极具基础研究价值和应用前景的微生物资源,凭借其特殊的生理结构、代谢机制、种群类群、遗传基因和独特的代谢产物受到国内外学者的广泛关注。本研究通过免培养和纯培养技术相结合的方式,探究适合运城盐湖嗜盐细菌的分离技术,系统地开展该生境嗜盐细菌的分离鉴定、物种多样性研究,并从中筛选出具有纤维素酶和木聚糖酶活性的功能菌株。Biolog ECO法是一种以微孔板碳源利用为基础的定量分析方法,可简单、快速地描述微生物群落代谢特征。通过AWCD曲线、底物代谢差异、多样性指数以及主成分分析,对运城盐湖环境10个代表性样点微生物群落多样性和代谢特征进行了研究。结果表明,运城盐湖10个样点微生物群落可分为三种代谢类型。同时也预测出用于运城盐湖环境微生物分离的“有效分离底物类型”:糖类和酯类为底物碳源的分离培养基;氨基酸类和胺类为底物碳源的分离培养基。
  本研究采用高通量测序技术对运城盐湖嗜盐细菌多样性进行了分析,24个样品共得到原始序列705,689条,注释到16,877个OTU,平均长度在396 bp左右。通过QIIME平台分析可注释得到30个门,其中主要包括:厚壁菌门(Firmicutes,47.6%),变形菌门(Proteobacteria,35.6%),拟杆菌门(Bacteroidetes,3.7%),放线菌门(Actinobacteria,3.6%)和Bacteria Other(2.9%)。PCoA分析、CCA分析结果表明,这24个样品中的嗜盐细菌可分为3大类群,其中影响微生物类群差异的理化因子主要是Ca2+和Fe2+。比较同一个盐湖不同盐浓度样点的嗜盐细菌群落组成变化,发现靠近盐湖中心的两个样点中存在的嗜盐细菌群落组成较为相似,而远离盐湖中心的两个样点的嗜盐细菌群落组成较为相似。同时在运城盐湖中也检测到了大量的经典嗜盐类群、极端微生物类群和具有特定功能的微生物类群信息。综合群落代谢特征、理化参数等结果,设计出五类10种分离培养基用于分离运城盐湖10个样点环境中的嗜盐细菌。结果表明,共分离出1,033株嗜盐细菌,形态去重复后,测序得到605株嗜盐细菌信息。经鉴定这些菌株分属于放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的7个纲,18个目,41个科,82个属以及52个潜在新分类单元。分析表明,分离培养基的营养成分、添加的盐浓度以及不同的样点对微生物的分离有着显著的影响。通过形态学、生理生化特征、化学组成和系统发育分析等研究,对2个新物种(Halomonas haloduranssp.nov.和Paracoccus halotolerans sp.nov.)开展多相分类鉴定,确定了这2株候选新物种的分类地位。纤维素类和半纤维素类物质是地球上产量巨大而又未得到充分利用的可再生资源。通过刚果红染色法对分离得到的1,033株嗜盐细菌进行纤维素酶和木聚糖酶活性菌株筛选,分别获得32株具有纤维素酶活性和49株具有木聚糖酶活性的菌株,活性菌株筛选阳性率为3.1%和4.7%,其中12株菌兼具纤维素酶活性和木聚糖酶活性。在分离培养基中添加功能底物可以增加功能菌株的获得。
[硕士论文] 贾泽
微生物学 江西师范大学 2017(学位年度)
摘要:微生物天然产物是活性化合物的重要来源,新型活性化合物的开发与利用是人类社会健康发展的要求。炭样小单孢菌JXNU-1是本实验室从土壤中筛选得到的一株具有广谱抗菌活性的稀有放线菌。本文以炭样小单孢菌JXNU-1为研究对象,研究其发酵液中乙酸乙酯相天然产物的分离纯化方法,并对所分离得到的化合物进行结构鉴定。主要内容和结论如下:
  本实验采用5L发酵罐、乙酸乙酯萃取、正向硅胶中压柱层析、交联葡聚糖LH-20分离的方法对炭样小单孢菌乙酸乙酯相的物质进行分离,得到两个化合物。并将得到的两个化合物进行核磁共振和质谱分析物质的化学结构,最终鉴定分离到的两个物质为三亚油精和山嵛酸。
  炭样小单孢菌JXNU-1发酵液中天然产物的分离鉴定可为炭样小单孢菌JXNU-1天然产物的开发应用提供实验依据。
[硕士论文] 李亚峥
生物工程 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)是重要的植物生防细菌和植物根系促生菌,在农业领域已得到广泛应用,但是目前该菌的发酵水平仍然比较低,芽胞率低,是该菌工业化生产的主要限制因素。本文以提高生物量和芽胞率为目的,优化了多粘类芽胞杆菌Z03摇瓶发酵工艺,在此基础上进行了5L发酵罐水平的分批发酵工艺和补料发酵工艺优化。
  本研究主要内容包括:⑴通过单因素和正交实验优化后培养基配方:蔗糖15g/L,玉米淀粉25g/L,豆粕25g/L,棉籽饼粉5g/L,MgSO47H2O1g/L,MnSO4?H2O5.0mg/L,CaCO30.6g/L,最优发酵条件为温度30C,装液量30mL/250mL,初始pH7.0,种龄18h,发酵周期48h。在优化后发酵培养基和发酵条件下,生物量为4×108CFU/mL,芽胞数提高到2.0×108CFU/mL,芽胞转化率为50%。⑵在摇瓶优化结果的基础上进行了5 L发酵罐实验,通过调整转速和通气量维持溶氧在10%以上,生物量达到3.9×108 CFU/mL,芽胞3.1×108CFU/mL,芽胞数是摇瓶发酵的1.5倍。在此基础上通过流加氨水控制pH在6.2±0.1,生物量达到7.0×108 CFU/mL,芽胞数5.7×108 CFU/mL。生物量和芽胞数分别是不控pH分批发酵的1.79倍和1.83倍。⑶进一步在5L发酵罐上优化了补料分批发酵工艺,分别在14h、15h、16h补加玉米淀粉和酵母浸粉混合料,玉米淀粉和酵母浸粉的质量比为3:1,发酵31h时生物量最高,达到3.1×108CFU/mL,芽胞率61%。此外通过提高基础料中的氮源,将基础料中的棉籽饼粉增加到15g/L,整个过程补加麦芽糊精64g,在40h时,获得生物量24.5×108CFU/mL,芽胞转化率63%。
[硕士论文] 邵钋
仪器科学与技术 桂林电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:在科学领域所做的实验中,保证完整的系统密封性是很有必要的,尤其是在生物安全和健康的医疗领域中。为了避免仪器测试系统到被外界因素的影响,通常需要对其进行环境和理论的分析才能得到完好的测试方案。在本测试系统中,为了检测高温高压设备灭菌器的温度压强等参数信号,需要经过严格的系统验证才能进行下一步的实验。
  高温高压灭菌箱是在生活常见的消毒设备之一,因其成本较低,所以广泛运用在各个领域。常见的高温高压设备分为非金属结构和金属结构,常见的非金属结构的设备可以通过电磁波的传播方式来传输信号,但是遇到金属结构的高温高压设备会存在信号无法传输的问题,所以提出无线传输的新方案不可避免。
  为了解决金属屏蔽干扰和不破坏高温高压设备密闭性等问题,系统提出使用超声波的传输方案,从而避免上述等问题。针对超声波的传输,论文对其进行了理论分析和设计方案的提出;其次针对破坏灭菌箱的可能性,提出了安装超声波换能器的方法,对固体通信的数据传播进行了理论研究。
  本系统通过超声波的传输方式和固体通信的安装理论,将高温高压设备中的温度压强数据上传到PC端,同时通过上位机软件进行显示和分析,并且在论文章节中对自己的方案提出了改进的意见。通过所测量的数据表明,本设计可以用于对高温高压设备仓内的物理量的测量,并且包含了全金属屏蔽设备。通过这套可靠的硬件软件系统和其改进方案,使其在计量所精确测量的应用价值较大。
[硕士论文] 顾小飞
生物工程 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:链霉菌 SH-62是一株具有良好生物活性的吸水链霉菌,对革兰氏阳性菌有很好的抗菌效果,对酵母以及多种植物病原真菌也有良好的拮抗作用。生物信息学分析发现链霉菌SH-62基因组中存在一个I型聚酮合酶(PKS)基因簇—gld基因簇,与Streptomyces autulyticus CGMCC0516中格尔德霉素生物合成基因簇(gdm)具有同源性。前期研究发现无论是在野生型链霉菌SH-62还是gld基因簇的异源表达菌株中均没有检测到格尔德霉素的产生,暗示着gld基因簇可能产生新的代谢产物。此外gld基因簇中存在4个gap,序列相似度很高,序列拼接困难。
  本研究首先通过特异性引物的PCR扩增以及构建阳性BAC质粒的亚克隆进行测序分析,成功填补了gld基因簇中剩余的4个gap区,获得了完整的gld基因簇序列信息。将完整的基因簇序列重新进行生物信息学分析,证实除了甲基转移酶的位置不同外,gld基因簇与格尔德霉素生物合成基因簇 gdm的组成和排布几乎完全相同。同时为了验证前期实验结果的正确性,还重新构建了gld基因簇的异源表达菌株,并且通过TLC和HPLC分析证实异源表达菌株确实能够产生新的代谢产物GD-上和GD-下。
  为了进一步验证两种异源表达产物与gld基因簇的相关性,尝试利用CRISPR/Cas9-CodA(sm)系统来敲除核心PKS基因gldAIII,已完成敲除质粒的构建,尚未筛选到正确的缺失突变菌株。同时利用λred介导的PCR-targeting技术构建了核心PKS基因gldAI的缺失突变菌株S.albus::pGXF001,发现该基因缺失后两种异源表达产物在TLC和HPLC检测中的相应信号消失,表明这两种物质确实由gld基因簇异源表达产生。通过LC-MS分析发现这两个物质的质荷比m/z分别为269.0797和285.0758,对应的分子式为C16H12O4和C16H12O5。
  
[硕士论文] 潘通
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:现如今我们所接触到的抗生素、酶制剂以及一些胞外聚合物,大部分都是由放线菌所产生。由于已知产物的大量重复筛选以及病原菌耐药性的不断加强,人们对发现新构型和高活性天然药物给予极高希望。然而,常规生态环境的放线菌由于反复开发利用,阻遏了人们发现新药的脚步。在极端环境下,微生物的适应过程使其存在不同寻常的生理机制,因此对极端微生物的代谢产物、代谢途径以及功能性分已成为国际热门的研究领域。
  由于缺乏盐碱环境下微生物分离、培养方法的系统研究,人们对于盐碱环境下微生物资源的认识仍处于初级阶段。在本次实验中,我们选择了特殊生境中的盐碱土壤作为分离源,目的在于了解盐碱土壤中放线菌优势类群以及在该环境下筛选得到拮抗活性较好的菌株,为日后研究嗜盐碱放线菌的生理、遗传机制打下基础。大庆市位于黑龙江省西部,众多因素叠加造成其土地荒漠盐碱化严重,具有代表性。因此,本研究选取黑龙江省大庆市的盐碱土作为分离对象,对其进行放线菌的分离、耐盐碱特性以及拮抗菌株活性的研究。研究结果如下:
  (1)本实验对大庆盐碱土的放线菌进行了筛选,共从HV、高氏一号、改良CMKA培养基、甜醇培养基和XXA培养基上分离得到232株放线菌,通过菌落纯化形态对比合并为85株。发现烬灰类群和白孢类群为优势类群,这些菌株中的大多数属于链霉菌菌科(Streptomycetaceae),其次为黄色类群的小单孢菌菌科(Micromonosporaceae),稀有菌属占比很小。
  (2)对分离得到的放线菌进行了耐盐碱测试,有21株菌可耐受10%的NaCl,39株菌可耐受5%的NaCl,71.8%的菌株属于轻度耐盐菌。有65株菌可耐受pH10,27株菌可耐受pH11,说明大部分供试菌都具有耐碱特性。
  (3)对分离得到的放线菌进行活性实验,其中有36株放线菌可以抑制1种以上的植物病原真菌,其中的3株(S4HV2,S4GS38,S7GS2)对3种以上的植物病原真菌具有较强的活性,对其余植物病原真菌均具有较强或较弱的抑制作用。菌株S7GS2对4种病原真菌(Sclerotinia sclerotiorum,Rhizoctonia solani,Phytophthora sojae,Phytophthora capsici)的抑制率超过80%。其中菌株S4HV2和S4GS38的发酵浸提液对部分植物病原菌及两种指示细菌均具有较强的抑制作用。
  (4)对一株形态较为少见、耐盐碱且有微弱活性的菌株NEAU-ZJC8进行了系统的分类学地位鉴定。然后通过对该菌株与相似菌株在培养特征、生理生化实验、化学组分以及分子水平的同源性等方面的比较,确定NEAU-ZJC8属于链霉菌属的一个新种,并命名为Streptomyces daqingensis。
  (5)在放线菌的分离过程中,得到一株细菌cbsb5。16S测序和系统进化建树分析后,对其进行了分类学鉴定实验,结果表明该菌株为芽孢杆菌属,并且各项实验数据均表明其可能为潜在新种。
[硕士论文] 李金猛
化学工程与技术;生物化工 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:微生物发酵产物(微生物次生代谢产物)研究在天然产物研究中占据举足轻重的地位。微生物具有形态小;种类多元;繁殖速度快;生长周期短,适应在不同的环境中生存等特点。基于这些特点微生物在产业化上具有巨大的优势,成为发现新的具有活性化合物的主要来源。
  本研究通过研究微生物的次生代谢产物,对次生代谢产物进行结构鉴定、活性测试、应用探究以及来源分析,逆向研究微生物发酵菌株在人类获取天然产物的意义。从两份不同采集地的土壤中,通过活性追踪和文献调研,选取了两株链霉菌:Streptomyces maoxianensis和Streptomyces sp.HS-NF-1178,并对这两株链霉菌的次生代谢产物进行分离提取研究。对两株链霉菌进行发酵,发酵液通过树脂吸附、硅胶柱层析、HPLC等一系列分离手段(或技术)和核磁共振、红外光谱、高分辨质谱等化合物鉴定手段,共获得9个化合物,其中6个为新化合物。从Streptomyces maoxianensis共分离得到3个化合物,包括两个新的不饱和脂肪酸酰胺类化合物Maoxianamides A和B,两者为同分异构体;已知化合物与1(10)E,5E-germacradiene-2,11-diol的结构一致。从Streptomyces sp.HS-NF-1178中共分离得到4个新化合物和2个已知化合物,两个已知化合物分别与Lankacidinol和Lankacyclinol的结构相一致,根据化学命名法将4个新化合物分别命名为:N-((3R,4E,6E,8S,10E,12E,14S,16S)-8,14-dihydroxy-5,11,19,20-tetramethyl-18-oxo-2,17-dioxa-b icyc lo[14.3.1]icosa-1(19),4,6,10,12-pentaen-3-yl)-2-hydroxyprop anamide(5);(6S)-4-hydroxy-3,5-dimethyl-6-((2S,3E,5E,8S,9E,11E)-2,8,13-trihydroxy-5,11-dimethyltrideca-3,5,9,11-tetraenyl)-5,6-dihydropyran-2-one;(4E,7S,8E,10E,13S,14E,16E)-7,13,18-trihydroxy-4,10,16-trimethyloctadeca-4,8,10,14,16-pentaen-3-one(8);2-((1E,3E,5S,7E,9E,11S,13E)-5,11-dihydroxy-2,8,14-trimethyl-15-oxoheptadeca-1,3,7,9,13-pentaenyl)-5-methyloxazolidin-4-one(9)。对除化合物3(样品量太少)之外的其余8个化合物进行活性测试,结果显示:Maoxianamides A和B对人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2和白血病K562细胞表现出一定的细胞毒性;同时化合物5、化学物6、化合物8和化合物9对人类前列腺癌细胞PC-3和人肺癌细胞A549表现出一定的细胞毒性,其中化合物9活性相对较好,对两个癌细胞的IC50值分别为30.3和27.3μg/mL; Maoxianamides A和B对大豆菌核具有抑制效应,两者的MIC均在0.08-0.4mg/mL之间;化合物4对藤黄球菌和耐药金黄色葡萄球菌MIC范围分别在0.08-0.4 mg/mL和0.4-2 mg/mL之间;化合物5对藤黄球菌的MIC范围在0.4-2 mg/mL之间。化合物7对枯草杆菌和耐药金黄色葡萄球菌的MIC范围均在2-10mg/mL。
[硕士论文] 赵莎
生态学 大连海洋大学 2017(学位年度)
摘要:海水环境已逐步成为抗性细菌和抗性基因的重要“储存库”,细菌耐药性可通过水平基因转移方式在海洋环境中进行传播扩散。海水浴场是重要的娱乐场所,也是病原微生物传播和聚集的地方,通过娱乐用水而传播的微生物疾病已成为公众关注的首要问题之一。海洋环境粪便污染指示物--大肠杆菌(Escherichia coli)可通过海水吞咽引发游泳人群致命性肠道疾病。为防止及减缓细菌耐药性的播散,就必须全面了解细菌耐药性的产生和播散机制。因此,本项目以大连付家庄海水浴场为研究区域,研究大肠杆菌在海水浴场中的分布特征及耐药性状况,分析整合子-基因盒系统介导的大肠杆菌多重耐药性;利用质粒接合转移实验揭示质粒介导大肠杆菌耐药基因的水平传递。研究结果如下:
  1.采用滤膜法对大连付家庄海水浴场海水和沙滩样品中的疑似大肠杆菌进行初筛得到373株菌,经生理生化鉴定在海水样品中共获得69株大肠杆菌,在沙滩样品中获得13株大肠杆菌,鉴定率分别为27.8%和10.4%。采用K-B纸片扩散法对海水浴场82株分离大肠杆菌进行10种抗生素的耐药性检测,药敏结果显示,海水中耐药性大肠杆菌的检出率为37.7%。对除氨曲南外的9种抗生素都存在耐药性,对四环素(24.6%),甲氧苄啶(24.6%)和复方新诺明(23.2%)的耐药率较高,对庆大霉素耐药率为10.1%,对链霉素、环丙沙星、头孢噻吩、氯霉素及左氧氟沙星的耐药率较低(<10%)。海水中大肠杆菌多重耐药率达57.7%,大肠杆菌多重耐药谱显示其最多对8种抗生素耐药。沙滩中湿砂分离菌只检出对环丙沙星耐药,耐药率为37.5%,干砂分离菌只检出对甲氧苄啶耐药,耐药率为40%,无多重耐药现象。上述结果表明海水浴场海水中多重耐药情况明显。
  2.基于上述大肠杆菌耐药表型结果,选取四环素类、β-内酰胺类、磺胺类和喹诺酮类抗性基因,采用PCR方法对海水和沙滩中耐药性大肠杆菌基因组和质粒DNA进行抗性基因检测。结果显示海水大肠杆菌基因组DNA中四环素类抗性基因的检出率为88.2%,其中tetA基因检出率为64.7%,tetB基因检出率为41.2%;质粒中四环素类抗性基因的检出率为64.7%,tetA基因(29.4%)检出率低于tetB基因(41.2%)。β-内酰胺类抗性基因在基因组DNA和质粒DNA中检出率分别为80%和20%。磺胺类抗性基因在基因组和质粒DNA中检出率分别为50%和66.7%。仅在质粒DNA上检测到喹诺酮类的qnrS型抗性基因,其余基因均未检出。而沙滩大肠杆菌仅在质粒DNA上检测到磺胺类抗性基因sul1,其余抗性基因均未检出。
  3.为研究整合子介导的海水大肠杆菌多重耐药性,对15株多重耐药菌进行整合酶基因检测,9株基因组DNAⅠ类整合酶阳性,在整合酶阳性分离株中有3株扩增出Ⅰ类整合子可变区;13株质粒DNAⅠ类整合酶阳性,在整合酶阳性分离株中有3株扩增出Ⅰ类整合子,多重耐药菌株中I类整合子检测率较高。对整合子可变区测序结果显示得到8种不同的基因盒,分别是编码磺胺类耐药基因二氢叶酸还原酶基因(dfr16/A12/A17,dhfr12/17),编码氨基糖苷类耐药基因核苷转移酶基因(aadA2/5),以及编码林可酰胺核苷酸转移酶基因(linF)。上述结果表明整合子可能介导了大肠杆菌的多重耐药。
  4.从大肠杆菌的分离菌中选取质粒上含有磺胺类耐药基因的菌株,将其与受体菌E.coli C600进行接合实验,同时测定接合时间。结果表明含耐磺胺类耐药基因质粒的12株大肠杆菌中有6株接合成功,接合率为50%,发生接合转移的时间为2~7h,接合子中检测到磺胺类抗性基因,但耐药表型未呈现。上述结果表明环境菌株耐药性基因可通过质粒接合在同种属菌株中进行传递。
[硕士论文] 王迪
食品科学 大连海洋大学 2017(学位年度)
摘要:褐藻胶是存在于褐藻中的一类褐藻多糖,利用食用褐藻的棘皮动物内脏筛选并优化菌株培养条件,使之产生高活性的褐藻胶裂解酶,在制备褐藻寡糖等方面具有重大应用价值。本文以褐藻酸钠为唯一碳源,从皱纹盘鲍内脏中筛选分离得到12株产褐藻胶裂解酶菌株,检测12株菌的发酵液酶活并优选酶活最高的两株菌,分别命名为M3与M7,基于16S rDNA系统发育树分析,初步确定M3、M7菌株属于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)属。
  本文采用Plackett-Burman试验、中心复合试验设计(Central Composite Design,CCD)对M3菌株进行发酵产酶优化。根据M3菌株单因素试验的优化结果设计Plackett-Burman试验,结果表明影响酶活的4个显著影响因素为培养温度、初始pH、褐藻胶浓度和蛋白胨浓度,以此优化结果进行中心复合试验设计(Central Composite Design,CCD),应用响应面方法进行回归分析,结果表明其最佳产酶条件为:初始pH7.5,接种量2%,褐藻胶浓度0.5%,装液量50mL,蛋白胨浓度0.6%,培养温度为28℃,200r/min,酶活最高可达到1.063U/mL。
  采用正交试验方法对M7菌株产酶条件进行优化,优选菌株培养基。M7菌株通在单因素试验的基础上利用正交试验优化菌株的产酶条件,研究结果显示菌株的最佳产酶条件为:初始pH7.5,接种量为6%,褐藻胶浓度1.0%,装液量为10mL,氯化钠浓度为1%,培养温度为18℃,200r/min,酶活最高终达到1.751U/mL。
[硕士论文] 孙婧
生物物理学 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:木材腐朽是指木材因木腐真菌的侵害而引起木材糟烂和解体的现象。近年来我国木材腐朽现象十分普遍,木材腐朽给林业的加工生产造成巨大的经济损失。木材与人类的关系十分密切,人类的生活和生产中离不开木材的使用,然而随着我国经济的快速发展,森林资源出现严重供不应求的现象。为了提高木材质量,降低木材腐朽造成的木材损害现象,对于木腐真菌的鉴定和研究就显得尤为必要。
  纤维素是一种可再生性的资源,在工业生产中需要将其降解后才具有实际应用价值,它的降解主要依赖纤维素酶的催化作用。木腐真菌所分泌的纤维素酶可以较为高效地分解纤维素,因此本文对木腐真菌纤维素酶的活力进行了测定,并寻找出最优产酶条件。这为有害病原木腐真菌向有益方向进行转化,也为提高纤维素的降解率和生物转化方面提供实验基础。
  本文首先从林区的活立木材上采集木腐真菌子实体,用分离筛选培养基分离纯化菌种,得到两株活力较好的菌株,并用愈创木酚的方法区分出木腐真菌的木材腐朽类型。之后提取基因组DNA,运用基于PCR的分子生物学技术扩增DNA序列,对扩增产物纯化回收,测序结果登陆Genba nk数据库进行序列比对,同时设计7对特异性引物和构建系统发育树分析其亲缘关系,对两株木腐真菌进行了分子水平上的鉴定。菌种鉴定结果显示,木腐真菌Y1为红缘拟层孔菌(Fomitopsis pinicola),NCBI登录号为KM373236.1。木腐真菌Y2为木蹄层孔菌(Fomes fomentarius),NCBI登陆号为HM58410.1。
  同时结合传统的形态学鉴定方法,对两株木腐真菌的子实体形态特征,菌落新生区的形态、生长速度、菌落颜色、菌丝气味以及菌丝结构变化等进行观察和记录。将两种鉴定方法的结果进行比对,得出两种鉴定结果一致。但传统形态学鉴定方法,是根据鉴定者以往经验和查阅参考书籍对菌种进行观察和鉴定,对同一种培养菌落形态特征描述可能会不同,或者一旦子实体的形态结构特征发生改变,可能得到不同的鉴定结果,该鉴定方法的准确性相对较低,并且木腐真菌菌落培养周期和鉴定所需时间较长。因此对比形态学鉴定方法,运用基于现代分子生物学的方法能够更加快速和准确的对木腐真菌进行鉴定。同时将两种鉴定方法相结合,能够更加可靠的对木腐真菌进行鉴定。
  本文在鉴定木腐真菌的基础上,对一株褐腐真菌进行纤维素酶活力分析和产酶条件优化,发酵试验表明,在初始pH6.0、乳糖15g/L、KH2PO40.5g/L、硝酸铵15g/L、MgSO40.5g/L、VB10.4g/L,接入菌饼2块,装液量为80mL条件下培养5d时,红缘拟层孔菌的纤维素酶活力最高,内切葡聚糖酶(CMCase)为116.94U/mL,为进一步研究褐腐真菌降解纤维素的机制提供前期基础。
[硕士论文] 郭玮
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:为开发和利用细菌资源,本研究从张家界天门山表层土中分离到23株细菌,其中以不动杆菌和金黄杆菌为主要菌属。其中一株革兰氏阴性、短杆状细菌WG4T为金黄杆菌属新种。16S rRNA基因序列分析显示菌株WG4T与金黄杆菌Chryseobacterium anthropi NF1366T和Chryseobacterium haifense H38T的进化关系最近,相似性分别为97.39%和97.05%,WG4T与这两株菌株的DNA-DNA杂交结果分别为63.3%和62.7%。通过对菌株WG4T进行多相分类学分析,鉴定了该菌株生长温度范围为4-40℃,主要脂肪酸为iso-C15∶0(32.4%)、anteiso-C15∶0(21.8%)和iso-C17∶03-OH(17.2%),主要呼吸醌类型是MK-6,主要极性脂是磷脂酰乙醇胺(PE),基因组G+C含量为37.7mol%,以上特性均与金黄杆菌属特性相吻合。但基于16S rRNA基因同源性、DNA-DNA杂交结果,及特殊生理生化表型(不可水解明胶、可分解纤维二糖产酸等)结果,表明菌株WG4T为金黄杆菌属的一个新种,将其命名为高山金黄杆菌,即Chryseobacterium montanum sp.nov.。
  此外,本研究组前期鉴定了一株铁矿类芽胞杆菌新种Paenibacillus ferrariusCY1T,该菌可产生H2S气体,可与重金属反应生成沉淀等性质在重(类)金属污染修复方面具有一定作用。本研究发现CY1T具有六种重(类)金属抗性,代谢产生的H2S可与Cd(Ⅱ)发生共沉淀作用,以及该菌具有还原Se(Ⅳ)和Cr(Ⅵ)的能力。通过全基因组测序得到CY1T的基因组草图,包含了75个contigs,8,260个编码基因,81个RNA基因。该基因组具有完整的SO42-还原通路,可将SO42-还原成S2-,生成H2S或可与Cd(Ⅱ)发生反应,生成CdS沉淀。同时,在基因组内还可以找到与Se(Ⅳ)和Cr(Ⅵ)还原相关的蛋白,可能参与Se(Ⅳ)和Cr(Ⅵ)的还原反应。体现了菌种CY1T在重(类)金属抗性与转化等方面的基因型和表型的一致性,为重金属污染的治理提供了菌种资源和理论基础。
  除以上内容外,本人还参与了细菌中锑(Sb)氧化调控机制研究,主要涉及到氧化还原酶AnoA对锑氧化的作用,进行了包括蛋白质表达体系的构建、蛋白质的诱导表达及纯化、酶反应动力学实验,基因的同框敲除等工作(未展示)。
[硕士论文] 苏晓霄
药物分析学 西南大学 2017(学位年度)
摘要:革兰氏阳性菌是一类威胁人类和动物健康最主要的致病菌。其中金黄色葡萄球菌可以造成食物中毒,败血症,脓毒症等严重危害;蜡样芽孢杆菌和藤黄微球菌同样也可以引起食物中毒和严重感染;变异链球菌是人类龋病的主要致病微生物,常见于牙菌斑中。鉴于革兰氏阳性菌对人类,动物的危害,发展灵敏,简单,即时的革兰氏阳性致病菌的检测新方法对临床诊断具有重要意义。化学发光分析法是一种依据于体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理,利用仪器对体系化学发光强度的检测,进而确定待测物含量的一种痕量分析方法。而生物发光是一种生物体系中发生的化学发光,它在化学反应过程中会产生可见光。ATP发光是一种最常见的生物发光,它的反应机理是荧光素酶在荧光素和氧气的存在下,催化消耗ATP而产生较强的光辐射信号。
  本研究主要内容包括:⑴基于万古霉素的亲和作用建立了一种利用生物发光法检测革兰氏阳性菌活菌总量的新型分析策略。本项工作中,万古霉素作为一种新型分子识别试剂,修饰在羧基化的磁性颗粒上用于从样品基质中快速分离和富集革兰氏阳性菌。随后裂解捕获的细菌,使三磷酸腺苷从细菌细胞内释放,进而通过采集生物发光反应产生的发光信号来定量检测革兰氏阳性菌的活菌总量。实验结果表明,四种革兰氏阳性菌,包括金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌、变异链球菌在1×102-1×107 CFU ml-1范围内均与生物发光强度呈现出良好的线性关系,其检测限均为33 CFU mL-1(信噪比=3)。由于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌死菌对该方法的检测几乎没有干扰,该策略用于检测活的革兰氏阳性菌表现出良好的特异性。同时该策略可成功地应用于食品和药物样品的加标回收实验,所得回收率范围为72%-120%。该策略具有灵敏度高,成本低,特异性较高,检测时间短等优点,并且在药品质量控制、医疗卫生、食品安全等方面有较好的应用潜能。⑵基于化学发光分析方法建立了一种利用双位点分子识别模式检测变异链球菌的新型分析策略。在这项工作中,替考拉宁作为一种新型的分子识别试剂,修饰在羧基化的磁性颗粒上用于识别和捕获变异链球菌。为了进一步提高该策略的特异性,利用大鼠免疫球蛋白G2a能够特异性结合变异链球菌细胞壁上G蛋白这一特点,我们在大鼠免疫球蛋白 G2a上标记辣根过氧化物酶作为第二种分子识别试剂以及信号探针,然后通过采集磁性颗粒捕获到的变异链球菌的化学发光信号来定量检测样品基质中的变异链球菌。结果表明,变异链球菌在1×102-1×106 CFU ml-1范围内与化学发光强度有着良好的线性关系,检测限为33 CFU mL-1(信噪比=3)。该策略可成功应用于食品、药物和生物样品的加标回收实验,所得回收率在83%-110%之间。该策略具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等特点,可以为复杂样品中病原菌的快速检测提供一条新的途径。
[硕士论文] 钟丹
药物分析 西南大学 2017(学位年度)
摘要:作为荧光纳米材料家族一颗冉冉升起的新星,碳点(Carbon dots,CDs)具有类似于量子点的光致发光性能,且具有低毒性、粒径小和良好的生物相容性等特点,被认为是替代量子点的最佳选择。而其良好的电子供受能力、稳定的荧光性能和耐光漂白等特点,也吸引了研究者们的广泛关注。近年来,经过研究者的不懈探索,碳点在生物成像、药物分析、载药诊疗等领域取得了一定的研究成果。但是,建立更为简便、环保、快速的新方法来制备具有优良荧光性能的碳点,并拓展其在分析领域的应用仍需进一步研究。本文成功构建了一种更环保快捷的荧光碳点制备方法,探究了所制备碳点的组成结构、荧光稳定性和生物相容性,并将其应用于pH传感和细菌检测等与人类健康息息相关的领域。
  本研究主要内容包括:⑴为探索更为经济环保、简便快捷的碳点制备方法,我们以康乃馨花瓣为碳源,于万用电炉上加热2 min,得到荧光量子产率为11.36%的水溶性碳点。其最佳激发发射波长分别为320 nm和435 nm,在日光下照射12小时或高盐环境中荧光强度未衰减。高分辨透射电镜(HR-TEM)结果显示该碳点形貌类似球形、分散性良好、粒径约为6-10 nm;通过红外光谱(FTIR)、X射线光电子能谱(XPS)和核磁共振碳谱(13C NMR)的表征,揭示了该碳点是由碳、氮、氧三种元素组成,且表面含有羧基、氨基、羟基等官能团。利用该碳点pH依赖的荧光特性,我们建立了一种pH传感的新方法。更重要的是,当碳点溶液pH值在10.6到5的范围内变化时,其发光程度和溶液颜色也随之变化,且荧光强度和色调 H值与 pH值成线性关系,证明碳点具有从荧光强度和溶液颜色变化两方面对 pH进行双信号传感的能力。此外,我们还考察了该碳点的细胞毒性,获得了较满意的实验结果,并进一步将其用于细胞成像。所得结果证明碳点能充分进入细胞并发出明亮的荧光,有望替代不耐光漂白的传统有机染料和毒性较大的量子点作为新的生物成像试剂。⑵食品特别是乳制品和肉制品受到细菌污染的机会很多,尤其是金黄色葡萄球菌,对其实现定量检测于食品安全和人类健康都具有重大意义。而万古霉素能和革兰氏阳性细菌细胞壁上的尾肽结构D-Ala-D-Ala通过氢键结合,可以作为连接荧光信号分子和细菌的中间体。受此启发并结合碳点的优良荧光性能,本文将修饰了万古霉素的碳点作为荧光探针。由于万古霉素和细菌之间的特殊作用力,碳点会大量聚集在细菌细胞壁表面,导致其荧光信号发生变化。基于此,本文建立了一种检测革兰氏阳性细菌的新方法。具体而言,首先,以柠檬酸和尿素为碳源,微波法一步制备出发蓝色荧光的碳点,其最佳激发、发射波长分别为320 nm和435nm。研究表明所合成的碳点分散性良好,粒径约为2-3 nm,且表面含有较多羧基。因此,我们可以将EDC和NHS作为交联剂在碳点表面修饰万古霉素。其次, HR-TEM、FTIR和紫外光谱(UV-vis)数据表明,万古霉素的修饰并未对碳点的分散性、荧光性能和紫外吸收产生明显影响。质谱(MS)所得结果显示在每个碳点表面大约修饰了2个万古霉素分子。随后我们以金黄色葡萄球菌为代表,探索了该探针用于定量检测细菌的可能性。结果表明随着金黄色葡萄球菌浓度的增加,探针的荧光强度不断降低,二者呈现出良好的线性关系,检测限为9.40×104 cfu/mL。另外,我们将该方法用于考察橙汁在接种金黄色葡萄球菌并孵育后的细菌含量,并与平板计数法相对比有满意的回收率,表明了此方法检测革兰氏阳性细菌的实用性。
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