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[博士论文] 韩俊成
环境工程 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:异化金属还原菌(Dissimilatory Metal-reducing Bacteria,DMRB)是一类能够将胞内有机底物代谢获得的电子转移至胞外,并耦合胞外金属氧化物还原的微生物。DMRB独特的胞外电子转移过程能以不溶性金属氧化物和固态电极为最终电子受体,在金属元素的地球化学循环和能源回收领域起到重要作用。同时,DMRB独特的胞外电子转移过程对于环境中的有机污染物的转化也起到促进作用,加速其在环境中的迁移转化过程,因而在环境污染修复领域中具有巨大的潜在应用价值。因此,DMRB作为一种特殊的功能细菌而受到微生物、环境、电化学等不同学科领域研究人员的广泛关注。为了进一步研究DMRB的胞外电子传递机制及其在污染物转化中的作用机理并拓展DMRB在环境污染修复领域中的应用,本论文以DMRB模式菌株之一的希瓦氏菌为研究对象,探索自分泌电子传递媒介——核黄素在生物合成受抑制条件下的希瓦氏菌胞外电子传递过程,深入研究了胞外电子传递在有机砷化合物(洛克沙胂)转化中的作用及机理,考察了胞外电子传递途径在重金属铬还原过程中的同位素分馏效应中的作用。上述研究工作为希瓦氏菌的胞外电子传递在环境修复中的应用提供了更多的理论依据和技术指导。主要研究内容和研究结果如下:
  1.Shewanella oneidensis MR-1的胞外电子传递的调控机制。研究了S.oneidensis MR-1在其自分泌的电子传递媒介——核黄素的生物合成受抑制条件下的胞外电子传递规律。通过构建ribBA基因突变菌株,抑制了黄素类物质的分泌水平。与野生菌株相比,ΔribBA分泌黄素水平相比于野生型菌株下降了50%,但ΔribBA在电化学池中比野生型菌株产生了较高的产电电流;胞外电子传递相关基因的表达分析结果表明mtrD、mtrE、cymA、omcA、fccA等相关基因发生了上调。这些结果表明,在核黄素合成受抑制条件下,胞外电子传递网络的内部调控能够重新增强胞外电子传递过程。因此,S.oneidensis MR-1自分泌的黄素类物质在胞外电子传递中的作用需要从全细胞系统水平上进行重新评估。该研究结果加深了对胞外电子传递过程的可塑性的认识,也为调控微生物胞外电子传递能力提供了新的途径。
  2.Shewanella putrefaciens CN32对洛克沙胂的厌氧转化机制。通过对Shewanella putrefaciens CN32厌氧转化洛克沙胂过程的研究,验证了该菌株对洛克沙胂的转化能力,通过对相应的转化产物的分析,进一步阐明了洛克沙胂转化过程的新机理。在以S.putrefaciens CN32为模式菌株的洛克沙胂转化机理研究表明,MtrC和UndA在胞外还原过程的关键蛋白;mtrC和undA基因的敲除使S.putrefaciens CN32在最初48 h对洛克沙胂的还原速率降低了70%;同时存在的胞外还原和胞内还原过程,最终导致了以As(Ⅲ)为主要形态的无机砷的释放。常见电子传递媒介蒽醌-2,6-磺酸钠(AQDS)、核黄素(RF)能够加速转化过程。因此,自然环境中丰富矿物和腐殖酸等天然有机物能够进一步促进异化金属还原菌对洛克沙胂的转化,增加As(Ⅲ)释放环境风险。此外,对几种常见的异化金属还原菌转化洛克沙胂的能力也进行了进一步验证,结果表明它们都具有迅速转化洛克沙胂的能力,而且其转化产物中的无机砷形态主要是毒性较高的As(Ⅲ)。在厌氧环境中普遍分布的异化金属还原菌具有很高的洛克沙胂耐受水平。以S.putrefaciens CN32为例,其对洛克沙胂在好氧条件下的耐受水平高达6 mM。这些结果对于理解异化金属还原菌在环境中有机砷转化过程的作用有重要意义。
  3.Shewanella oneidensis MR-1的Cr同位素分馏机制。研究了S.oneidensis MR-1及其胞外电子传递外膜蛋白突变菌株ΔmtrC/ΔomcA对Cr(Ⅵ)的不同还原过程以及相应的铬同位素分馏效应。还原实验结果表明,野生型菌株和突变菌株在前4h的平均还原速率分别为11.12±0.38 μM Cr(Ⅵ) h-1 (n=2)和4.91±0.48μM Cr(Ⅵ) h-1 (n=2);突变菌株的还原速率仅为野生菌株的44.2%;TEM观察发现野生型菌株表面有含铬的颗粒沉积物出现,而突变菌株表面没有这一现象。S.oneidensis MR-1能够通过不同的还原途径还原去除Cr(Ⅵ);进一步的铬同位素分馏分析中,使用瑞利分馏模型对两种体系中的分馏过程进行拟合,获得相应的度量同位素分馏程度大小的分馏系数ε值,结果表明两种还原过程的ε值无明显差异,野生菌株和突变菌株的相应值为-2.42±0.68‰和-2.70±0.22‰。基于此,提出以S.oneidensis MR-1为代表的非异化还原依赖的微生物Cr分馏机理模型,从而增进了对微生物Cr同位素分馏机理的理解。
[硕士论文] 李金猛
化学工程与技术;生物化工 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:微生物发酵产物(微生物次生代谢产物)研究在天然产物研究中占据举足轻重的地位。微生物具有形态小;种类多元;繁殖速度快;生长周期短,适应在不同的环境中生存等特点。基于这些特点微生物在产业化上具有巨大的优势,成为发现新的具有活性化合物的主要来源。
  本研究通过研究微生物的次生代谢产物,对次生代谢产物进行结构鉴定、活性测试、应用探究以及来源分析,逆向研究微生物发酵菌株在人类获取天然产物的意义。从两份不同采集地的土壤中,通过活性追踪和文献调研,选取了两株链霉菌:Streptomyces maoxianensis和Streptomyces sp.HS-NF-1178,并对这两株链霉菌的次生代谢产物进行分离提取研究。对两株链霉菌进行发酵,发酵液通过树脂吸附、硅胶柱层析、HPLC等一系列分离手段(或技术)和核磁共振、红外光谱、高分辨质谱等化合物鉴定手段,共获得9个化合物,其中6个为新化合物。从Streptomyces maoxianensis共分离得到3个化合物,包括两个新的不饱和脂肪酸酰胺类化合物Maoxianamides A和B,两者为同分异构体;已知化合物与1(10)E,5E-germacradiene-2,11-diol的结构一致。从Streptomyces sp.HS-NF-1178中共分离得到4个新化合物和2个已知化合物,两个已知化合物分别与Lankacidinol和Lankacyclinol的结构相一致,根据化学命名法将4个新化合物分别命名为:N-((3R,4E,6E,8S,10E,12E,14S,16S)-8,14-dihydroxy-5,11,19,20-tetramethyl-18-oxo-2,17-dioxa-b icyc lo[14.3.1]icosa-1(19),4,6,10,12-pentaen-3-yl)-2-hydroxyprop anamide(5);(6S)-4-hydroxy-3,5-dimethyl-6-((2S,3E,5E,8S,9E,11E)-2,8,13-trihydroxy-5,11-dimethyltrideca-3,5,9,11-tetraenyl)-5,6-dihydropyran-2-one;(4E,7S,8E,10E,13S,14E,16E)-7,13,18-trihydroxy-4,10,16-trimethyloctadeca-4,8,10,14,16-pentaen-3-one(8);2-((1E,3E,5S,7E,9E,11S,13E)-5,11-dihydroxy-2,8,14-trimethyl-15-oxoheptadeca-1,3,7,9,13-pentaenyl)-5-methyloxazolidin-4-one(9)。对除化合物3(样品量太少)之外的其余8个化合物进行活性测试,结果显示:Maoxianamides A和B对人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2和白血病K562细胞表现出一定的细胞毒性;同时化合物5、化学物6、化合物8和化合物9对人类前列腺癌细胞PC-3和人肺癌细胞A549表现出一定的细胞毒性,其中化合物9活性相对较好,对两个癌细胞的IC50值分别为30.3和27.3μg/mL; Maoxianamides A和B对大豆菌核具有抑制效应,两者的MIC均在0.08-0.4mg/mL之间;化合物4对藤黄球菌和耐药金黄色葡萄球菌MIC范围分别在0.08-0.4 mg/mL和0.4-2 mg/mL之间;化合物5对藤黄球菌的MIC范围在0.4-2 mg/mL之间。化合物7对枯草杆菌和耐药金黄色葡萄球菌的MIC范围均在2-10mg/mL。
[硕士论文] 罗森
生物物理学 电子科技大学 2016(学位年度)
摘要:必需基因是生物体中非常重要的一类基因,如果缺少这种基因,生物将无法存活。对于必需基因的确认,现在主要有两种方法,一种就是使用实验方法进行确认,但是这种方法耗时长,并且消耗巨大,由于实验方法的缺陷与局限性,至今也只有很少的细菌必需基因被大规模实验确定;另一种方法是利用计算机进行必需基因预测,这种方法解决了实验方法的缺陷,现今的预测方法大部分使用的是整合方法,但是这种方法非常依赖实验数据,在缺乏实验数据的时候很难对细菌必需基因进行预测。为了摆脱实验数据的限制,我们决定开发基于基因本身特征的必需基因预测算法。
  首先我们选择了蛋白质结构域作为预测必需基因的特征,通过实验验证,我们发现蛋白质结构域在必需基因的预测中起到了非常大的作用。之后,我们选择了25个物种作为实验物种,通过物种间的亲缘距离将不同物种间的结构域联系起来,设计了基于蛋白质结构域的必需基因预测算法。通过对25个实验物种进行多重交叉检验并计算结果AUC值,最终结果有5个物种超过了0.9;而在0.75到0.9之间的物种,也有14个;低于0.75的物种只有6个,最低的也有0.66,说明了我们的这种算法效果非常的好。
  然后,对于同样基于基因序列特征的必需基因预测工具Geptop,我们对其进行了改进。改进的地方如下:(1)对参考集由最初的19个物种扩充到25个;(2)对不易让人理解的评分公式进行了简化,使之简单易懂同时不降低必需基因预测准确度;(3)对预测程序进行了优化,使之效率提升。通过这三面的改进过后,Geptop的预测准确度得到了一定的提升,通过和之前的版本进行比较,19个物种中,有12个物种的结果均有所提高。同时,以大肠杆菌为例,程序的运行速度从107分钟缩减到了26分钟,效率提高了接近4倍。
  最后,我们尝试将基于蛋白质结构域的必需基因预测方法和Geptop结合起来,期望得到更好的预测结果。由于时间关系,我们没能找到提高预测结果的结合方式,但是我们已探索的结合方式也能给继续研究这方面的学者提供经验。
[硕士论文] 肖若楠
微生物学 哈尔滨工业大学 2016(学位年度)
摘要:针微藻油脂含量是制约生物柴油产率的关键性因素之一,有效提高微藻油脂含量依旧是微藻生物能源领域亟需解决的瓶颈技术难题,本研究创新性的采用低频、低强度超声波作为处理微藻的一种技术手段,其目的是为了有效促进微藻的油脂积累,同时对其促进作用机理进行探索,以期为进一步的研究提供理论指导和技术支持。
  首先,以实验室自主筛选的产油微藻突变株Z-4作为研究对象,分别研究其在不同超声条件(包括超声频率、超声阶段、超声功率、超声持续时间、超声脉冲间隔)下的油脂含量、生物量、底物消耗能力的变化规律,从而确定了促进微藻油脂累积的最佳超声条件:最佳超声频率为20kHz,最佳超声阶段为微藻生长周期的对数期,最佳超声功率为20W/L,最佳处理时间为30min/d,最佳超声脉冲间隔为2s。同时,该研究还考察了在最佳超声条件下超声处理对微藻及油脂含量的影响。在最佳超声条件下,生物量、生长速率其油脂累积速率、油脂含量都有明显提高。超声处理后的微藻相较于未超声的对照组其稳定期油脂含量由21.2%提高至29.1%,提高37.2%;微藻细胞干重由2.1g/L提高至2.8g/L,提高33.3%。
  在确定超声波处理的最佳参数后,对超声促进微藻产油脂的机理进行了初步探索,主要从超声处理后微藻对底物的利用速率、微藻细胞结构的变化、细胞表面元素含量的变化、细胞通透性的变化、油脂组成成分、细胞组分、细胞色素以及关键酶含量等的变化等方面进行分析。研究结果表明:超声组微藻细胞表面碳元素与氧元素分别增加5%和5.8%,叶绿素总量约增加了18.6%,多糖含量降低12.8%,总蛋白含量降低6.5%。低频低强度的超声处理可以在不破坏微藻细胞及代谢功能的前提下,提高细胞的通透性进而提高细胞代谢速率和底物的传质速率,这是提高油脂含量和促进微藻生长的关键原因,超声对微藻油脂代谢过程中关键酶活性的影响不大。本研究为提高微藻油脂含量和细胞生物量提供了一种新的策略,为微藻产油的产业化发展奠定了良好的实验基础。
[硕士论文] 张国华
生物工程 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:抗生素的滥用在我国的临床医学和畜牧业中广泛存在,诱发大量病原菌产生了耐药性,甚至产生能免疫多种抗生素的超级细菌,严重威胁着人类的健康,寻找一种有效的抗生素替代品迫在眉睫。与传统抗生素相比,抗菌蛋白无毒、无残留、不污染环境且不易产生耐药性,是抗生素的理想替代物。
  本研究从本室保藏的菌种中筛选到了一株有良好抑菌能力的菌株P7,并利用多种分类法,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。通过不同浓度的饱和硫酸铵沉淀,确定Bacillus subtilis P7发酵上清中抗菌物质的最适沉淀浓度为40%。得到的蛋白粗提物具有良好的热稳定性和pH稳定性,在100℃下处理30分钟仍有56%的相对抑菌活性,pH3-10之间抑菌活性变化较小。胃蛋白酶(pepsase)和胰蛋白酶(trypsin)处理后粗提物活性没有变化,但蛋白酶K(proteinase K)处理后抑菌活性丧失,因此推测抗菌物质中可能是蛋白质或其衍生物。蛋白粗提物透析后用SephadexG-75柱层析纯化,呈现两个洗脱峰,将其命名为M1和M2。对这两个峰的收集液进行活性验证,发现M1无抑菌活性,M2有抑菌活性。将M2峰的蛋白用超滤管浓缩,用SDS-PAGE凝胶电泳检测,得到单一的蛋白条带,分子量大约为25kDa。将蛋白条带进行 MALDI-TOF-MS质谱鉴定,结果表明 M2峰的蛋白与枯草芽孢杆菌中的蛋白 CM50-07410同源性的最高,质谱鉴定的肽段与该蛋白的氨基酸序列的一致性为45%。同时对抗菌蛋白的抑菌机理进行了初步探究:电镜检测用纯化后的抗菌蛋白处理的金黄色葡萄球菌菌体,发现处理后的菌体表面出现褶皱,处理时间越长细胞膜结构破坏越明显。表明抗菌蛋白确实能破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的结构。
  在NCBI中检索蛋白CM50-07410的核酸序列,设计引物从Bacillus subtilis P7的总DNA中扩增出了anti1基因,并成功构建了重组质粒pGEX-6p-anti1,但是抗菌蛋白表达之后没有抗菌活性,是否因为抗菌蛋白本身需要修饰,而大肠杆菌无修饰功能导致抗菌蛋白没有抑菌活性,尚需要进一步验证。
[硕士论文] 王伟伟
细胞生物学 青岛大学 2016(学位年度)
摘要:目的:烟曲霉是一种常见的、通过空气传播的条件致病真菌,对于烟曲霉的致病机制,虽然发现了一些与其致病性相关的因子,但到目前为止还未证实其在烟曲霉致病性中起关键作用。因此本实验利用构建的烟曲霉金属还原酶基因(AF UA-1G00350,FreB2)缺失突变株,对烟曲霉金属还原酶基因FreB2功能进行初步研究,为揭示该基因与烟曲霉的致病关系提供基础。
  方法:比较野生株和基因缺失突变株在AMM和无铁AMM液体培养基中生长时金属还原酶的活性,绘制不同时间野生株和基因缺失突变株在AMM和无铁AMM液体培养基中生长时金属还原酶活性曲线。利用Real-Time PCR方法分析SreA、SidA、FetC、FtrA和FreB这些与铁的吸收相关基因的mRNA的表达量变化。测定野生株和基因缺失突变株对氧化压力的敏感性及胞内活性氧物质阳性细胞率。
  结果:金属还原酶活性测定实验发现,不论在AMM液体培养基中还是在无铁AMM液体培养基中培养时,突变株金属还原酶的活性都明显高于野生株。Real-Time PCR结果显示,与野生株相比培养60h时,突变株SreA、SidA、FetC、FtrA和FreB这些与铁的吸收相关基因的表达量出现明显上调。氧化压力敏感性实验显示,基因缺失突变株对H2O2的敏感性显著增强,同时胞内活性氧物质阳性细胞率明显增多。
  结论:金属还原酶基因FreB2在烟曲霉铁吸收及氧化压力应答过程中发挥作用;烟曲霉与铁吸收相关基因之间存在功能互补效应。
[硕士论文] 何亚婷
食品工程 宁波大学 2016(学位年度)
摘要:嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus,La.)具有多种益生特性和良好的发酵性能,被广泛应用于食品和药品行业,是乳酸菌发酵剂的重要菌种之一。真空冷冻干燥是工业生产中制备直投式乳酸菌发酵剂的常用方法,但是在冷冻干燥过程中,乳酸菌会受到多种损伤,导致乳酸菌发酵制剂活力降低。因此,提高冻干嗜酸乳杆菌的存活率对制备高活性乳酸菌发酵剂、提高生产效益都具有重要意义。本文以嗜酸乳杆菌ATCC4356为研究对象,在冷冻干燥前进行热休克处理,优化了热休克条件、超声提取菌体全蛋白条件,并利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术比较热休克处理组与未处理的对照组在冷冻干燥前后的嗜酸乳杆菌蛋白质差异表达图谱,经质谱鉴定差异蛋白,利用生物信息学对差异表达蛋白质进行功能分类和代谢途径分析,从蛋白组学水平探讨热休克处理调控嗜酸乳杆菌的抗冻干胁迫机制。进一步通过热休克预处理结合冻干保护剂来提高嗜酸乳杆菌菌粉冻干存活率,获得热休克处理条件和保护剂的最佳组合为制备高活性乳酸菌发酵剂提供一个新思路。
  本研究主要内容包括:⑴菌培养时期、热休克处理温度和时间是影响热休克处理效果的重要因素。获得嗜酸乳杆菌ATCC4356的冻干存活率最高的热休克处理条件,即菌培养18h后,在45℃热休克处理30min,再进行冷冻干燥,其冻干存活率较高,为47%,约为未经热休克处理的对照组的2倍。⑵对超声波法提取细菌全蛋白的功率和时间进行了优化,得到提取蛋白量最高的超声条件为:工作6s停6s,150w,5min。制备 P1(冻干前对照组)、P2(冻干前热休克组)、P3(冻干后对照组)和 P4(冻干后热休克组)四组不同条件下的嗜酸乳杆菌全蛋白样品,采用基于 iTRAQ技术的蛋白质组学研究构建蛋白质差异表达图谱,共鉴定出蛋白质1185种,比较不同组间样品蛋白质,统计得到差异蛋白数量表明经过热休克处理后菌体的蛋白损失明显减小,说明热休克处理对菌体蛋白有保护作用。经过生物信息学分析,结果表明热休克处理主要通过调节细菌细胞中脂类代谢、糖代谢、能量产生和转换、转录和翻译、应激蛋白、核糖体的结构及其生物合成相关的蛋白来提高嗜酸乳杆菌ATCC4356的抗冻干胁迫能力。⑶比较了12种不同的保护剂与热休克处理结合对嗜酸乳杆菌的冻干保护效果,其中10种保护剂能进一步增加冻干菌体的存活率,以脱脂乳为冻干保护剂的菌体存活率最高,以葡萄糖为保护剂时,两种冻干保护处理的正向叠加作用最明显,菌的存活率从34.42%提高为76.28%,说明适合的冻干保护剂结合热休克处理对嗜酸乳杆菌的冻干保护存在正相关的交互作用。结合热休克处理与效果较好的四种保护剂进行正交试验优化,得到冻干存活率最高的条件为:菌培养18h后,在45℃热休克处理20min后,加入10%脱脂乳、10%葡萄糖、1.5%甘油以及2.5%山梨糖醇为冻干保护剂,冷冻干燥后存活率为92.8%。
[硕士论文] 李娟
微生物学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:硫化物及其衍生物,经常是一些空气和水体的污染物。自然环境中,硫化物的主要来源是火山作用和微生物的厌氧硫代谢,在一些细胞内的代谢过程中,也会产生一定量的硫化物。过去,对硫化物氧化的研究大都集中在自养微生物,而异养微生物的硫化物氧化经常被忽略,因此在异养微生物中的硫化物氧化机制非常模糊。
  我们在异养微生物罗尔斯通氏菌(Cupriavidus pinatubonensis)中,发现了硫化物氧化相关的酶(过硫化物双加氧酶PDO和硫醌氧化还原酶SQR)的表达基因pdo和sqr附近存在一个可能的调控基因fisR,该基因所表达的蛋白为一类σ54因子依赖的转录所需要的激活子,具有典型的调控(R)、ATP酶(C)、DNA结合(D)三结构域形式。在目前已有的研究中,相似硫化物氧化途径的调控方式都是负调控,调控蛋白均为阻遏子:植物病原菌(Agrobacterium tumefaciens)中的生物膜生长抑制子BigR,以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的类铜敏感操纵子阻遏蛋白的硫转移酶抑制子CstR。
  本文构建了fisR基因敲除菌株和回补菌株,并进行了与硫化物相关的生理实验,fisR基因敲除菌株与pdo和sqr基因双敲除菌株在硫化氢积累和硫化物压力下的生长曲线等表型上的变化具有相同的趋势,说明了该基因对硫化物氧化相关的pdo和sqr基因存在正调控作用。随后,提取了野生型菌株和fisR敲除型菌株的RNA,进行了共转录分析,转录起始位点的测定,以及荧光定量PCR,检测硫化物氧化相关基因转录水平上的表达量变化。结果发现,fisR基因的缺失,使得pdo和sqr基因不再表达,证明了fisR基因确实具有正调控的作用。尝试添加硫化物对菌株进行刺激,再次检测pdo和sqr基因的表达量变化,发现其表达量大大提高,这表明硫化物可能诱导它们的表达。
  异源表达并纯化了不含调控(R)结构域,只包含ATP酶(C)和DNA结合(D)结构域的FisR-CD蛋白,通过蛋白-DNA相互作用的体外实验,证实了FisR-CD蛋白能够结合在pdo基因启动子的上游,并测得了结合位点的序列。构建了启动子报告系统,通过检测荧光强度,反映胞内转录活性的高低,证明了硫化物具有诱导作用,并且其浓度与诱导强度存在一定的正相关。并且利用启动子报告系统,进行FisR蛋白突变,发现调控(R)结构域中存在的三个半胱氨酸残基对蛋白的信号感受和活性调控具有重要的影响。
  本文通过一系列的实验,初步揭示了FisR调控蛋白对硫化物氧化途径的调控机制,为探究异养微生物中硫的代谢途径开拓了新方向。
[硕士论文] 张陈
微生物学 中国农业科学院 2016(学位年度)
摘要:外胞质功能转录因子(Extra-Cytoplasmic Function sigma factor, ECF-σfactor)是数量最大、种类最多的一类σ因子,在调控逆境胁迫反应中起到重要作用。耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans R1)对辐射、氧化、干燥等胁迫具有极强抗性和极端环境的适应性。该球菌中仅含有3个σ因子,SigA/RpoD(DR_0916)、Sig1(DR_0180)、Sig2(DR_0804),其中只有Sig1属于ECF-σ家族,本实验室前期研究结果表明 sig1突变导致菌株对热、氧化等胁迫敏感,其中热胁迫表型尤为明显。已有的研究报道仅显示sig1突变株中热胁迫相关基因在mRNA水平的变化,对Sig1在热胁迫环境中的调控作用缺乏深入的了解,相关研究甚少。本研究开展了耐辐射异常球菌sig1突变株及其野生型在正常和热激条件下进行了全局转录组分析,以及通过荧光实时定量PCR,融合报告基因lacZ的靶基因启动子分析、凝胶阻滞实验等研究Sig1对下游靶基因的调控作用,取得如下研究进展:
  1.sig1突变株及其野生型在正常(30℃,2h)和热胁迫条件下(48℃,2h)的转录组分析显示,热胁迫导致该菌中674个基因表达上调,707个基因下调,涵盖了高温信号感应、传递及应答反应过程涉及的代谢通路。热胁迫条件下相对于野生型,sig1突变株中共有90个基因表达量上调,980个基因表达量下调,下调基因涉及核糖体、嘌呤嘧啶、氨基酸合成等代谢及胁迫相关通路。包括组成核糖体的22个主要亚基基因表达差异显著,其中rpmD、rpmJ、rpsO、rpsH、rpmF和rpmG发生显著下调2倍以上(p<0.05),核糖体的合成受到影响;嘌呤代谢通路中22个基因、嘧啶代谢通路中10个基因都发生了显著的下调,致使机体在转录水平受阻。此外,氨基酸合成、脂肪酸合成等代谢途径相关基因表达差异显著,最终导致突变株在热胁迫条件下生长受到影响。qPCR验证热胁迫相关基因hsp20、hslJ、dnaJ1下调2倍以上,其他胁迫相关基因如csp、pspA、fur发生显著下调3倍以上(p<0.05),DNA修复相关基因如recQ、ruvA表达量同样显著下调。结果表明耐辐射异常球菌Sig1参与了热胁迫反应的全局调控。
  2. Sig1同源模建表明其含有保守的ECF-σDNA结合结构域:区域2和区域4;它们能够特异性的识别靶基因启动子区的-10Box和-35Box。耐辐射异常球菌中受热胁迫诱导且在sig1突变株热胁迫下表达量下调的基因有266个,对上述显著下调基因进行汇总分析,利用Softberry、Virtual Footprint等软件对其启动子区进行预测(500bp),推测Sig1在-35Box的结合位点为5’-TTGACT-3’,-10Box的结合位点为5’-CGTAAAC-3’。
  3.通过将显著下调的热休克蛋白基因hsp20、冷激蛋白基因csp、内膜蛋白稳定基因pspA、铁吸收蛋白基因 fur启动子与报告基因lacZ融合,测定β-半乳糖苷酶酶活,进一步证明了Sig1对这些基因(均含有-10Box和-35Box)的调控作用。其中,对在热胁迫条件下起重要保护功能的蛋白小分子热休克蛋白 Hsp20基因进一步分析,转录组数据及 qRT-PCR结果显示热胁迫条件下hsp20表达量上调7倍,sig1突变株较野生型菌株的hsp20表达下调3倍;hsp20突变导致细胞对热胁迫敏感,存活率下降3个数量级,凝胶阻滞实验(EMSA)表明,Sig1能结合在hsp20启动子区上。上述结果表明,在热胁迫条件下Sig1直接参与了hsp20、csp、pspA、fur等基因表达调控。
  本研究结果表明Sig1能与热休克蛋白基因hsp20等启动子互作,参与核糖体、嘌呤嘧啶、氨基酸合成代谢及热胁迫等反应的调控。为揭示耐辐射异常球菌热胁迫响应机制奠定工作基础。
[硕士论文] 邵昭
环境工程 沈阳理工大学 2016(学位年度)
摘要:水环境污染已成为世界各国普遍关注的问题,重金属污染是水环境污染的一个重要方面。重金属废水排入水体,破坏水体生态系统,对人体造成危害。因此,对水中重金属离子的治理至关重要。生物吸附法具有吸附剂来源广泛、成本低、无二次污染等优点,具有广阔的发展前景。
  本文以酵母菌作为吸附剂,对水中六价铬离子和镍离子进行吸附去除研究。研究了吸附时间、溶液的初始pH值、吸附温度和吸附剂用量等因素对游离酵母菌吸附重金属离子吸附效果的影响。实验对游离酵母菌吸附重金属离子的吸附动力学和热力学进行了研究和分析,并对酵母菌吸附重金属离子的机理进行初步探索。实验还研究了酵母菌固定化包埋,对固定化条件进行了优化,考察了固定化酵母菌吸附重金属离子的规律。
  实验结果表明,采用培养3d的酵母菌为吸附剂,溶液的初始pH值分别为2和7时,酵母菌分别对Cr6+和Ni2+有较高的吸附效果。在实验研究温度范围内,温度升高对酵母菌吸附重金属离子有一定的促进作用。当溶液中存在50mg/L的Cl-、NO3-、SO42+任一种阴离子时对酵母菌菌体吸附六价铬离子和镍离子均产生一定的抑制作用。当溶液中存在50mg/L Ca2+、K+、Na+任一种阳离子时,对酵母菌吸附重金属离子几乎没有影响;而当溶液中存在一定浓度的Fe3+时,对酵母菌吸附重金属离子产生一定促进作用。
  对酵母菌吸附的吸附动力学研究表明,酵母菌吸附Cr6+和Ni2+过程符合准二级动力方程。对等温吸附数据进行分析,表明酵母菌对六价铬和镍离子的吸附行为符合Langmuir模型。对热力学参数进行计算和分析,表明酵母菌对六价铬和镍离子的吸附过程是自发、吸热过程,在实验研究的温度范围内,升高温度有利于吸附。
  紫外光谱表明,菌体表面的官能团主要为蛋白质和多糖的特征官能团,且灭活前后,官能团的特征峰并没有改变;菌体细胞的ζ-电位及溶液中重金属离子的赋存状态分析表明,酵母菌对Cr6+和Ni2+吸附过程中存在静电吸附作用。菌体吸附重金属离子前后的红外光谱分析结果表明,酵母菌菌体上的-OH,-NH2,-COOH,C-N,C-O为主要吸附位点。
  对酵母菌进行固定化研究,通过向包埋小球中掺杂磁性四氧化三铁,可以提高吸附效果;对凝胶包埋菌体掺杂磁性四氧化三铁,能缩短吸附两种重金属离子的吸附平衡时间。通过扫描电子显微镜分析,固定化包埋后的菌体,均匀分散在小球内部,菌体形貌无明显改变。
[硕士论文] 李成林
环境工程 江苏大学 2015(学位年度)
摘要:木质素是自然界中含量仅次于纤维素的第二大可再生资源,同时也是造纸黑液废水和农业废弃秸秆中的主要成分。食木白蚁是自然生态系统中罕见的可高效转化利用木质纤维素的木食性昆虫。近年来,食木白蚁高效转化利用木质纤维素尤其是木质素的特性,引起了一些昆虫学家和其他领域科学家的极大兴趣。木质素由于其结构的复杂性和疏水性,一般很难被微生物降解,而食木白蚁肠道中的大量共生微生物可以帮助白蚁消化和降解木质素,是一类功能独特的共生微生物。因此,本研究以黄胸散白蚁(Reticulitermes flaviceps)、黑胸散白蚁(Reticulitermeschinensis)、圆唇散白蚁(Reticulitermes labralis)和台湾乳白蚁(Coptotermesformosamus Shiraki)4种食木白蚁为研究对象,从白蚁肠道内筛选可转化利用木质素类化合物的共生细菌,对菌株降解/修饰木质素的培养条件进行调控,并探究了菌株的木质素代谢机制,以期为第二代生物质能源的发展、造纸废液和农业废弃秸秆的可再生利用提供重要理论基础。本研究的主要结果归纳如下:
  1.食木白蚁消化系统中存在有大量的可培养共生细菌,这些细菌可以利用木质素类化合物作为代谢对象,这表明白蚁肠道共生细菌可能参与了木质素的降解和代谢。经分离纯化和分子生物学鉴定,成功地从4种食木白蚁消化系统中筛选出13个属共33株细菌可利用木质素类化合物的细菌,其中黄胸散白蚁肠道内筛选出5个属的13株细菌,黑胸散白蚁肠道内筛选出7个属的13株细菌,圆唇散白蚁肠道中筛选出5个属的7株细菌,台湾乳白蚁肠道内筛选出8个属的15株细菌。
  2.采用平板划线法复筛出一株可高效转化利用木质素类化合物的菌株YC105C,经16S rRNA基因序列比对,确定该菌株YC105C为肠杆菌属(Enterobacter sp.);经扫描电镜的超微结构观察,肠杆菌YC105C为杆状细菌,长度约2.0-3.0μm,直径约0.3-0.4μm。
  3.研究表明,肠杆菌YC105C降解/修饰木质素的最优氮源为硝酸铵,氮源的最适浓度为0.01 mol/L,最适培养温度为30℃,最适初始pH为7.0,最适摇床转速为120 r/min;在适宜的生长条件下,肠杆菌YC105C的降解率可达到21.72%。通过产酶检测发现肠杆菌YC105C能有效分泌漆酶和过氧化物酶,分别在第3天和第4天时活性达到最高,为136.48 U/L和16.38 U/L。
  4.肠杆菌YC105C可将球状的木质素颗粒物破坏并降解,使其完全变成细小的碎片;肠杆菌YC105C对木质素的降解/修饰主要分为两个步骤:首先肠杆菌YC105C将木质素解聚为低分子量的芳香族化合物,然后低分子量的芳香族化合物被进一步降解为小分子的酸、醇类化合物;肠杆菌YC105C可能通过侧链氧化、去甲基/甲氧基作用等机制对木质素聚合物进行解聚和降解。
[硕士论文] 李连杰
微生物学 东北农业大学 2015(学位年度)
摘要:由于微生物的次级代谢产物拥有潜在的生物活性以及对非目标生物和人类具有较低的毒性,因此逐渐获得了越来越多的人的关注。现在一些微生物的次级代谢产物,如阿维菌素、米尔贝霉素等现在已经被商业化生产,并被认为是在动物健康和在农业病虫害控制等方面中使用的最为广泛的药物。在我们寻找新型的天然杀虫剂和抗寄生虫药物的过程中,有两个大环内酯类的化合物、三个米尔贝霉素类的化合物、以及六个与多拉菌素的有相类似结构的化合物从Streptomyces avermitilis NEAU1069的发酵液中被分离出来。为了发现更多具有不同种类的活性的化合物,我们对菌株Streptomyces avermitilis NEAU1069使用了紫外诱变的育种方法因此获得了突变的菌株Streptomyces avermitilis NEAU1069-3,我们通过将野生菌株与突变型菌株进行对比发现两者的次生代谢产物的HPLC图谱有显著的差别。因此说明伴随着突变菌株的发酵过程中有新的化合物的合成。为了探究突变菌株中次生代谢产物的多样性,于是我们对其所产生的次级代谢产物的分离提取进程、结构解析和活性测定,进行了具体的描述。
  本研究对突变菌株Streptomyces avermitilis NEAU1069-3进行30L的放大发酵,收集其发酵的液体并对其发酵的液体进行前处理、HP-20树脂柱的吸附与洗脱过程、通过硅胶和凝胶的柱层析、高效液相等现代的分离方法和技术手段进行更进一步分离与纯化,最终经过我们的分离方法和技术手段后获得到10个次级代谢产物,其中有2个化合物经过鉴定后确定其为新型化合物。利用现代波谱分析方法(1H-NMR,13C-NMR,紫外,旋光度,红外,质谱,1H-1HCOSY,HMBC,HMQC)对化合物结构进行鉴定,其中化合物23,24-didehydro-13α-hydroxymilbemycin A3(1)和24,30-didehydro-13α-hydroxy milbemycin A3(2)是新化合物,其余8个为已知化合物,分别为:13β-hydroxyMilbemycin D(3),13β-hydroxy Milbemycin A4(4),13β-hydroxy Milbemycin A3(5),13α,24-dihydroxy Milbemycin A4(6),13β,30-dihydroxyMilbemycin A4(7),13β-hydroxy-14,15-epoxyMilbemycin A4(8),13β-hydroxy-5-oxo-5-deoxyMilbemycin A4(9), Milbemycin A3(10)。最终,我们决定对其中2个新型的化合物进行了抗朱砂叶螨和抗蚜虫活性的测试。最后两个新化合物对朱砂叶螨表现出较弱的活性,而对菜蚜表现出比较好的活性,因此在这里我们重点描述了抗蚜虫活性。菜蚜,从十字花科蔬菜上收集未施过药剂的带有蚜虫的叶片,所收集的叶片中不应该含有若蚜和有翅蚜,使蚜虫大小基本相同、密度适中,于温室内培养。本实验所选用的试验方法是叶碟浸虫浸液的方法。分别将化合物1、2和米尔贝霉素(其色谱的纯度可以达到95%,其中两者各占的比例为A3/A4=30/70)配制成0.5%的制剂,添加水将其稀释成为0.1、0.25、0.5、1、2个浓度梯度的药液,置于烧杯中备用。将含有试虫的叶片在配制好的药液中浸泡5秒钟后,拿出叶片后置于底部铺垫有保湿的滤纸的培养皿(其直径为9cm)中后待其自然风干。每个处理以相同的实验操作进行3次重复,每一个重复实验选择50头供试虫,并置于养虫室种恒温饲养,将清水作为对照。在室内的条件下饲养24h后检查各浓度药液处理后的死亡虫体的个数,并采用几率值法计算致死浓度LC50(mg·L-1)值。其中化合物1,2的LC50分别为0.4987和0.5694,数据表明化合物1,2具有较好的杀虫活性。
[硕士论文] 程玲
微生物学 大连理工大学 2015(学位年度)
摘要:枯草芽孢杆菌是被食品药品管理局认为安全的菌株,同时也是农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一,具有易培养、繁殖快、易保存、对环境适应强、无毒无污染等特点,近年来在工业生物领域、生物防治领域、动物生产领域、微污染水体净化方面都发挥了很大的作用。乙偶姻作为一种平台化合物,在日化食品行业、制药工业、化学工业、烟草行业、涂料工业及农业等多种行业有广泛应用前景。甘蔗糖蜜是制糖过程中产生的副产品,含有丰富的营养物质,是发酵行业的廉价原材料。本文针对课题组筛选得到的一株产乙偶姻的海洋枯草芽孢杆菌DL01的发酵性能进行了研究,并对乙偶姻的分离和菌种诱变进行了探索。
  本文首先考察了营养组分和初始条件对枯草芽孢杆菌生长和代谢的影响,包括二价金属离子、氮源种类及浓度、初始糖浓度和初始pH等。研究发现最适合的氮源是(NH4)2HPO4,金属离子为Mn2+,该菌株在由糖蜜、(NH4)2HPO4和MnSO4的简单培养基中生长良好。当初始糖浓度为180g/L、初始pH6.5时,摇瓶培养72 h,D-乙偶姻浓度达52 g/L。其次,考察了枯草芽孢杆菌在不同供氧情况下的代谢情况,包括恒定转速和通气、恒定转速阶段性增加通气、恒定通气分阶段增加转速,最后确定最适宜的供氧条件为通气量0.4 vvm、分阶段提升转速(0 h-6 h200 rpm、6 h-24 h300 rpm、24 h-72 h400 rpm)。在此条件下,200 g/L糖蜜发酵乙偶姻浓度可达61.15 g/L,其中D-乙偶姻58.2 g/L,转化率为0.35 g/g糖蜜,生产强度0.80 g/(l· h);210 g/L葡萄糖发酵乙偶姻浓度可达76.04 g/L,其中D-乙偶姻60.91 g/L,转化率为0.42 g/g,生产强度1.00 g/(l·h)。再次,采用盐析萃取的方法对糖蜜发酵液中乙偶姻进行分离,对三种盐析萃取体系进行比较,发现乙醇/K2HPO4效果较好,当发酵液与乙醇体积比为2∶1、与K2HPO4体积质量比为4∶3时,回收率达96.7%,色素去除率达94.5%。最后,采用紫外线-LiCl复合诱变与低温等离子体-LiCl两阶段复合诱变的方式对菌种进行诱变筛选出的一株乙偶姻产量高于原始菌株21%的诱变菌株。
[硕士论文] 徐芳迪
生物学 上海交通大学 2015(学位年度)
摘要:本研究对分离自西南印度洋水深2784米的沉积物样本的细菌Kangiella profundi FT102进行多相分类鉴定,并利用Illumina第二代测序平台测定了其基因组序列。
  菌株FT102为杆状革兰氏阴性细菌,无运动性和产孢性。最适生长温度为37-42℃,pH为6.5-8.5,盐浓度为1-4%。菌株 FT102与Kangiella属内成员的16S rRNA基因序列的相似性为95.5-98.6%,其基因组 DNA的G+C mol%为45.0%。FT102菌株和Kangiella aquimarina JCM12318、Kangiella koreensis JCM12317的基因组DNA-DNA杂交率分别为47.3%和13.7%。菌株FT102的全细胞脂肪酸以iso-C15:0为主,呼吸醌以Q-8为主,主要的磷酸类脂为DPG、PE、PG和PME。从表型、基因型和系统发育三个不同层次对菌株 FT102的多相分类研究证实 FT102为γ-变形菌纲海洋螺杆菌目食烷菌科Kangiella属的一个新种,命名为Kangiella profundi sp. nov.(Type strain FT102T=CGMCC1.12959T=KCTC42297T=JCM30232T)。
  通过PCR扩增和测序,对第二代测序获得的全基因组序列中的缺口进行了人工修补,获得了FT102的环状全基因组序列。其基因组大小为2,647,333bp,共编码蛋白2442个。FT102与K. koreensis JCM12317在基因组上具有良好的共线性。从基因组序列中选取5个看家基因(recA、gyrB、atpB、trpB、rpoB),利用其编码的蛋白序列构建系统发育树,结果表明 FT102与 K. koreensis JCM12317和K. aquimarina JCM12318归于一簇。
  本论文对Kangiella profundi sp. nov.的模式菌株FT102进行了多相分类鉴定,并提供了该菌株的全基因组序列信息,为深入理解具有独特系统发育地位的Kangiella属的海洋微生物的生理生态功能奠定了良好的基础。
[硕士论文] 包远远
微生物学 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:微生物在矿物风化这一地质作用过程中起着重要的作用,尽管国内外学者对微生物风化矿物研究多年,对其风化矿物的机理有一定的认识,但是对于微生物在矿物风化过程中的分子生物学机制还没有统一的认识,特别是从矿物风化细菌基因组学角度研究其矿物风化作用的研究还比较欠缺。
  矿物风化细菌可以通过产生生物膜、有机酸和铁载体等实现对矿石的风化。本文从4株矿物风化菌株出发,测定了其和矿物风化相关的生物学特性,并以菌株D.jiangningensis SBZ3-12为研究对象,通过对其全基因组测序,利用比较基因组的分析方法,对其基因组进行分析,从基因水平阐述该菌株的遗传特征,为后续研究其风化矿物的分子生物学机制提供遗传学背景。
  采用454 GS Junior pyrosequencing system(Roche)测序平台对供试菌株进行全基因组测序。共获得373571条Reads,将这些Reads通过Newbler2.4拼接得到39个Contigs,测序产生的Gap通过PCR扩增的方法补平。基因组分析发现,供试菌株D.jiangningensis SBZ3-12基因组序列总长度为5396991bp,GC含量为64.22%,共含有4790个基因,25个假基因、6种rRNA操纵子、52种tRNA和1个ncRNA。
  将基因组ORF采用在线数据库COG、VFDB、PAIDB、ARDB和KEGG对其进行功能分类与注释。对菌株D.jiangningensis SBZ3-12基因组COG分析发现,COG类别为“R”(General function prediction only)的比例最高,为9.39%,其次为“E”(Aminoacid transport and metabolism),为6.15%;对毒力基因分析发现其基因组中含有137个潜在的毒力基因,占到所有蛋白编码序列的2.94%;对抗生素抗性基因分析发现了9个潜在的抗生素抗性基因,可能对氯霉素、大环内脂、三甲氧苄二氨嘧啶、春雷霉素和磷胺霉素具抗性;对潜在的水平转移基因分析发现共有1068个潜在的水平转移基因,占所有蛋白编码序列的22.89%,其中来源于质粒的水平转移基因、来源于原噬菌体的水平转移基因和来源于病毒的水平转移基因分别占所有水平转移基因的86.70%、12.73%和0.57%。基因组共线性分析发现菌株D.jiangningensis SBZ3-12和同属的全基因组测序菌株基因组染色体之间局部具有一定的共线性关系。对其代谢途径分析发现具有完整的TCA循环途径,能够保证苹果酸的产生。代谢途径比较分析发现Dyella属其他菌株的TCA循环途径都不完整。对其基因组分析发现含有编码儿茶酚型铁载体受体的基因,可能参与混合型铁载体的转运。
  通过ExPASy ProtParam Server、 Pole Bioinformatique Lyonnais Network Proteinsequence analysis和SWISS-MODEL在线数据库对菌株D.jiangningensis SBZ3-12及其他种属的CsrA(Carbon storage regulator)分析发现,CsrA虽然一级结构差异不明显,但是其三级结构却明显不同,可能在不同菌株中行使特定的功能,为阐明该菌风化矿物的分子生物学机制奠定了基础。
  通过多相分类学方法鉴定一株矿物风化细菌A31为Sinomonas属的一个新种,命名为Sinomonas susongensis sp.nov.
[硕士论文] 车召堂
生物化学与分子生物学 石河子大学 2015(学位年度)
摘要:布鲁氏菌(Brucella)是一种强致病性人兽共染致病菌。布鲁氏菌侵染的主要目标是专业和非专业的巨噬细胞,于其内生存和繁殖。致病菌与宿主之间互作的分子机制错综复杂,也是布鲁氏菌病的病因。因此,对布鲁氏菌的胞内生存以及与宿主之间的分子互作机制的研究是有重要意义的。以泛素为主导的泛素-蛋白酶途径参与了胞内多种生理生化反应的调节,本研究对小鼠E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1在布鲁氏菌侵染中的影响作了初步探讨。
  目的:本实验以布鲁氏菌宿主细胞小鼠巨噬细胞 E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1基因为研究对象,分别构建干扰和过表达Nrdp1和SOCS-1基因的小鼠巨噬细胞转染模型;羊种布鲁氏菌16M侵染小鼠巨噬细胞,探究其对布鲁氏菌胞内生存和布鲁氏菌诱导的巨噬细胞凋亡的影响。
  方法:⑴羊种布鲁氏菌16M侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,实时荧光定量PCR检测在侵染发生0h、2h、4h、8h、12h和24h时Nrdp1和SOCS-1基因相对表达量的变化。⑵在小鼠巨噬细胞RAW264.7中,构建两个基因的干扰模型PLL3.7-Nrdp1、PLL3.7-SOCS-1和过表达模型Plex-Nrdp1、Plex-SOCS-1。羊种布鲁氏菌16M侵染干扰和过表达Nrdp1和SOCS-1基因的小鼠巨噬细胞,分别进行CFU计数,细胞凋亡率流式细胞仪分析,以及实时荧光定量PCR检测凋亡相关因子Bax和Bcl-2、肿瘤坏死因子TNF-α的相对表达量变化。⑶羊种布鲁氏菌16M侵染巨噬细胞模型,在侵染发生的不同时间对JAK1、JAK2、JAK3、STAT1、STAT2、STAT3六个基因的转录水平进行实时荧光定量PCR检测,观察其表达量变化。
  结果:①随着侵染时间的变化,Nrdp1和SOCS-1的表达都分别出现了两次有规律的变化。布鲁氏菌进入细胞之后,这两个基因的表达量迅速上升,两小时后增加停止,开始下降;4h后达到最低,而后上升;8h时上升停止,开始下降,一直到24h时,都是表达下调的。2h和8h左右时,表达量是超出正常水平的。每个基因在不同侵染时间的各组中差异性显著(P<0.05)。②分别构建Nrdp1和SOCS-1基因的两个干扰模型PLL3.7-N1、PLL3.7-N2和PLL3.7-S1、PLL3.7-S2,干扰效果分别为:66%、25%和54%、8%,选取干扰效果最好的PLL3.7-N1和PLL3.7-S1干扰模型进行侵染实验;过表达模型Plex-Nrdp1和Plex-SOCS-1两个基因的表达量分别升高了228%和332%。CFU实验显示,Plex-SOCS-1和Plex-Nrdp1组logCFU值显著低于对照组,PLL3.7-S1和PLL3.7-N1组差异不显著,各组实验的logCFU值随侵染时间都是升高的。Plex-SOCS-1组Bax和Bcl-2表达量显著升高,Bax/Bcl-2比值差异不显著;PLL3.7-S1组Bax表达量显著降低,Bcl-2表达量差异不显著,Bax/Bcl-2比值差异显著降低;Plex-Nrdp1组Bax和Bcl-2表达量显著升高,Bax/Bcl-2比值差异显著升高;PLL3.7-N1组Bax表达量显著降低,Bcl-2表达量差异不显著,Bax/Bcl-2比值差异显著降低;各组实验的Bax和Bcl-2表达量都是先升高(2-8h)后降低(8-24h)的趋势,Bax/Bcl-2比值都是先降低(2-8h)后升高(8-24h)的趋势。Plex-SOCS-1组TNF-α表达量显著升高,PLL3.7-S1组显著降低;Plex-Nrdp1与PLL3.7-N1两组的TNF-α表达量与对照组相比差异不显著;每组实验中,TNF-α的表达量随侵染时间都是升高的。细胞凋亡率流式细胞仪检测结果显示,Plex-SOCS-1组细胞凋亡率与对照组相比显著升高,PLL3.7-S1组细胞凋亡率与对照组相比显著降低;Plex-Nrdp1组细胞凋亡率与对照组相比显著升高,PLL3.7-N1组差异不显著;随着的侵染时间的变化,每组细胞凋亡率都是升高的。③Plex-SOCS-1组细胞的JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3表达量与对照组相比显著降低,JAK3表达量差异不显著;PLL3.7-S1组细胞的JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3表达量与对照组相比显著升高,JAK3表达量差异不显著;Plex-Nrdp1组细胞的JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3表达量与对照组相比显著降低,JAK3表达量差异不显著;PLL3.7-N1组细胞JAK1、JAK2、JAK3、STAT1、STAT2、STAT3六个基因的表达量与对照组相比均差异不显著。
  结论:⑴在布鲁氏菌侵染过程中,小鼠基因Nrdp1和SOCS-1对布鲁氏菌的胞内生存有一定的抑制作用;⑵在布鲁氏菌侵染过程中,Nrdp1和SOCS-1诱导了细胞凋亡;⑶在布鲁氏菌侵染过程中,Nrdp1和SOCS-1基因对JAK/STAT信号通路有负向调控作用。
[硕士论文] 瞿娇娇
微生物学 贵州大学 2015(学位年度)
摘要:被毛孢属(Hirsutella Patouillard,1892)真菌是一类寄主广泛,全球性分布的节肢动物和线虫病原真菌,经常引起寄主的流行病从而大量消减寄主的种群数量,其生态价值受到学界广泛关注。近年研究结果表明,被毛孢是暗色虫草亚属真菌Ophiocordyceptea Sung的无性阶段,由于虫草是亚洲很多国家的传统药物使得该属真菌的药用活性物质研究也受到关注。被毛孢类真菌资源在控制节肢动物种群维持生态系统平衡以及医药、生物活性物质开发方面有重要价值,因此研究该属真菌资源有重要意义。本文以鹿儿岛被毛孢(Hirsutella satumaensis Aoki)和家蚕(Bombyx moriLinnaeus.)为材料进行了如下研究:
  1.对鹿儿岛被毛孢(Hirsutella satumaensis)进行了重新描述和鉴定,并向GenBank提交了该菌的两条ITS序列KJ913066和KJ913067,补充了该种相关分子的系统学资料;并对该菌进行了生长周期测定以及该菌产孢条件的初步优化。该菌生长周期较长,接种10 d后开始形成芽孢子,20 d后达到稳定期;较优产孢条件为:蛋白胨3%,葡萄糖1%,蚕蛹粉1.5%,维生素B11%,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.1%,琼脂2%,蒸馏水1000 ml,25℃。方差分析结果表明,四个因素中蚕蛹粉对单位产孢量有显著性影响。
  2.对鹿儿岛被毛孢(H. satumaensis)分生孢子孢外黏液层的洗脱条件进行了研究。较优洗脱条件为:采用pH8.0磷酸钠缓冲液进行孢子洗脱,洗脱液放入含玻璃珠的50 mL三角瓶,100 rpm/min低速旋转10 min,使菌丝和孢子充分分散,4层擦镜纸过滤,将菌丝等杂质过滤。滤液中再加入浓度为0.5%的β-巯基乙醇做保护剂后置于4℃下,玻璃棒轻搅20 min提取黏液;10000 rpm/min高速离心5min分离孢子和上清液。将洗脱粘液后孢子于扫描电镜下观察,与正常具黏液孢子相比,该方法能将粘液层较为完整地洗脱下来。对磷酸钠缓冲液洗脱粘液中蛋白质含量进行了测定,含量为0.105 mg/mL,说明粘液层主要成分中有蛋白质;对洗脱液上清液进行了液质联用初步分析,结果显示主成分较多,无法比对鉴定,需将主成分分离纯化后再进行鉴定;研究了孢外黏液层在对该菌生长、侵染寄主过程中的影响,结果显示粘液层有保护孢子、适应环境及有助对寄主表面粘附、提高毒力的作用。
  3.采用鹿儿岛被毛孢(H. satumaensis)对寄主家蚕的侵染方式进行了研究。使用正常和脱粘液后两种孢子,通过血体腔注射、体表接触、孢子喂食、体表接触与孢子喂食双重处理,以家蚕平均体重、体长作为衡量指标,H. satumaensis对家蚕的生理生长有一定抑制影响,但各处理组均未出现被该菌感染致死的僵蚕,不具统计意义;孢子经血体腔注射萌发实验表明,该菌株对家蚕有毒力退化现象,因而不能判定该菌对寄主有多种侵染途径;设计该菌特异性引物对处理后家蚕蚕卵进行检测,与对照相比,该菌在家蚕基因组中无法检测出来,说明该菌在家蚕中的初始表达极微量或是该菌不能通过垂直传播方式进行侵染。
[硕士论文] 陶伟
生物学;微生物学 南京师范大学 2015(学位年度)
摘要:黏菌湿室培养的研究采用随机采样的方法,对采集的活树皮、地表腐木和枯枝落叶等基物进行湿室培养。培养从2013年5月至2014年11月末为止,共培养出5目5科10属18种黏菌子实体,其中,玫瑰绒泡菌Physarum mellum观察到从原生质团到子实体成熟的个体发育过程,灰团网菌Arcyria cinerea观察到从幼子实体到成熟子实体的个体发育过程。基物培养补充野外标本采集的不足,为后续实验提供材料。
  黏菌实验室培养的研究利用悬滴培养、燕麦-琼脂培养相结合的方法对黏菌进行实验室培养,应用显微摄像技术观察其生活史,选取黏菌纲的3目4科7属12种黏菌作为研究材料。在燕麦-琼脂培养基上成功培养出针箍菌Physarellaoblonga、黄头绒泡菌Physarum flavicomum、淡黄绒泡菌Physarum mellum、垂头绒泡菌Physarum album、玫瑰绒泡菌Physarum roseum、粗丝钙皮菌Didymiumlaxifilum、鳞钙皮菌Didymium squamulosum、白钙皮菌Didymium listeri和球形双皮菌Diderma globosum并详细记录其生活史,其中垂头绒泡菌P.album、粗丝钙皮菌D.laxifilum、白钙皮菌D.listeri和球形双皮菌D.globosum为首次培养成功并观察到生活史。通过悬滴培养观察到褐发网菌Stemonitis fusca、蛇形半网菌Hemitrichia serpula、暗红团网菌Arcyria oerstedtii孢子萌发阶段。研究发现:针箍菌属的针箍菌P.oblonga以及绒泡菌属的黄头绒泡菌P.flavicomum、淡黄绒泡菌P.mellum、垂头绒泡菌P.album等几种绒泡菌科的黏菌孢子萌发均为裂式,而双皮菌属球形双皮菌D.globosum和发网菌属褐发网菌S.fusca孢子萌发为孔式;孢子萌发后释放的原生质均转变为黏变形体或游动胞,但不同种类黏菌游动胞的鞭毛着生部位与游动方式有所不同;绒泡菌目的黏菌种类为具有大型菌脉的显型原生质团;绒泡菌属黏菌种类诱导子实体的产生需要光照的刺激,而双皮菌属黏菌子实体的产生对光照无要求。
  在绒泡菌科黏菌个体发育的比较研究中发现,绒泡菌科黏菌发育进程因物种不同而有差异,针箍菌P.oblonga、黄头绒泡菌P.flavicomum、淡黄绒泡菌P.mellum、垂头绒泡菌P.album孢子萌发均为Ⅴ-型开裂,但萌发时间有所不同,黄头绒泡菌萌发所需时间最短,仅需5h,而针箍菌萌发所需时间最长,需要48h;针箍菌和淡黄绒泡菌形成的黏变形体均可转变为游动胞,而相同条件下黄头绒泡菌和垂头绒泡菌并未有游动胞形成;4种黏菌原生质团的生长速率不同,在光照刺激下分别经过2-3d、2-3d、7d和13d,针箍菌、淡黄绒泡菌、黄头绒泡菌和垂头绒泡菌的原生质团发育成子实体;完成孢子到孢子的整个生活史,针箍菌和淡黄绒泡菌需要25-30d,黄头绒泡菌和垂头绒泡菌需要40-45d。
[硕士论文] 贾雅琼
微生物学 华侨大学 2014(学位年度)
摘要:不产氧光合细菌(APB)光合色素及色素蛋白复合体(PPC)的环境适应性调控研究,是国际上关注的热点之一,本文针对该研究的进展及存在的问题进行了系统综述。活细胞吸收光谱是APB鉴定的一项重要指标,目前将活细胞呈现的~421 nm特征光谱归为类胡萝卜素(Car)特征峰,但本课题组前期工作并没有检测到相关 Car积累,围绕探索该特征光谱形成的原因,本文以Rhodobacterazotoformans R7为材料,考察了呈现该特征光谱的影响因素,通过光合色素组成的分析,提出了菌体积累镁原卟啉IX单甲基酯(MPE)也能形成该特征光谱的观点。针对产奥氏酮系Car的紫色硫细菌光合色素环境适应性调控研究相对薄弱这一问题,在菌株的分离、纯化和鉴定的基础上,本文以一株产奥氏酮的嗜盐海洋着色菌283-1为材料,采用吸收光谱、TLC和LC-MS法,对该菌株积累的光合色素组分进行了分析鉴定,进一步考察了6种理化因子对菌体内积累光合色素组成的影响。比较了现有 APB Car提取方法,建立了适合Okenone系Car大量制备的方法。现有文献报道,在分离纯化过程中含Okenone系Car的PPC很不稳定,难以分离。鉴于此,本文初步探索了283-1菌株PPC分离的方法,以寻找稳定的PPC的分离条件,为在蛋白质水平上进行PPC的调控研究奠定基础。主要研究结果如下:
  R7菌株在以谷氨酸盐为氮源生长时,其活细胞吸收光谱上呈现421 nm特征峰,该特征峰强度受甘氨酸调控,甘氨酸浓度较低(<7 mmol/L)时有助于该特征峰的形成,高浓度则产生抑制作用,15 mmol/L时该特征峰基本消失。依据有无421 nm特征光谱菌体积累光合色素组分分析,发现大量BChl合成中间产物—MPE的积累,是形成活细胞421 nm特征光谱的原因,而非Car的积累。甘氨酸不但对菌体积累MPE具有调控作用,而且对BChl和Car组成也具有明显的调控作用。
  色素组分分析表明:283-1菌株主要积累BChl aTHGG、BChl aP、OH-R.g-ketoI、BPhe、R.g-ketoIII以及Okenone6种光合色素,其中BChl aP和Okenone积累量最大,高浓度DPA和NaNO2对菌体生长具有明显的抑制作用,在选择的剂量范围内,光强、氧、盐度和甘氨酸则仅影响菌体生长的延滞期,最终生物量比较接近。这6种理化因素对菌体光合色素合成量均有明显影响,对BPhe积累的影响最大,Okenone和BChl aP的相对含量虽有变化,但仍为主要积累的色素组分,其他组分的相对含量有轻微变化。菌体中OH-R.g-ketoI、R.g-ketoIII和Okenone的积累,表明该菌株中至少含有Okenone和R.g-ketoIII2条Car合成途径。
  对现有Car提取剂和提取方式筛选,以丙酮甲醇(7:2,v/v)为提取剂,2 mol/L HCl预处理再浸提,提取液中Car含量最高,进一步采用硅胶柱层析分离, Okenone系Car组分中常残留BPhe或BChl,色素提取液经皂化处理再进行硅胶柱层析,则可有效排除BChl和BPhe的干扰,大量制备Okenone和OH-R.g-ketoI。
  PPC分离纯化表明:Tween-80作为增溶剂,从283-1菌株中可分离得到结构完整且具有能量传递功能的 LH2,分离的 LH2在低温黑暗条件下很稳定。LDAO、Tween-80、Triton X-100和SDS均未分离得到LH1-RC,仍需要进一步研究。
  综上所述,本文提出了MPE积累能使菌体呈现421 nm特征光谱的观点,为分析活细胞吸收光谱提供了可靠依据和新的思路。以Marichromatium sp.283-1为材料系统分析了该菌株积累的主要光合色素,并探讨了不同理化因子对其生长和光合色素合成的影响,弥补了产奥氏酮紫色硫细菌光合色素组分研究的不足,为其调控研究提供了材料。建立了一种绿色的 Okenone系 Car乙醇水提取工艺,为Car大量制备奠定了基础。初步探索了283-1菌株PPC的分离纯化条件,为开展含Okenone菌株PPC的相关研究奠定基础。
[硕士论文] 郑鑫怡
生物物理学 大连海洋大学 2014(学位年度)
摘要:光合细菌用途广泛,常见于水产养殖类以及其他各种养殖业,近些年来对其他方面的研究也很丰富,但是应用物理因子处理的研究较少,本文通过用较小强度的电场和磁场对光合细菌进行处理,测定菌体本身营养成分以及菌体生物特性的改变。
  本文电场处理过程采用1V/cm、2V/cm、3V/cm、4V/cm、5V/cm和6V/cm六个梯度,每个梯度处理20分钟;研究发现:经过72小时的测定,电场对光合细菌的生物量、蛋白质含量、菌液pH值、维生素B6含量以及在水体中的同化氨态氮、亚硝酸氮、苯酚和溶解氧能力方面都会产生影响:2V/cm电场强度处理的光合细菌生长72小时后,生物量最高;1V/cm电场强度处理的光合细菌生长24小时的菌体蛋白质增产效果最好;6V/cm电场强度处理的光合细菌在72小时的生长中pH值都最小;4V/cm的电场处理过的光合细菌生长72小时后,提高光合细菌维生素 B6的含量效果最明显;5V/cm的电场处理的光合细菌生长72小时后处理养殖废水,对废水的铵态氮去除率最强;6V/cm的电场处理的光合细菌生长24小时后处理养殖废水,对废水的亚硝酸态氮去除率最强;6V/cm的电场处理的光合细菌生长48小时后处理含有苯酚养殖废水,对废水的苯酚去除率最强;4V/cm的电场处理的光合细菌生长48小时后处理的废水中含氧量最高。
  本文磁场处理过程采用2mT、4mT、6mT、8mT和10mT五个梯度,每个梯度处理20分钟。研究发现:经过72小时的测定,磁场对光合细菌的生物量、蛋白质、菌液pH值、维生素 B6含量以及在水体中的同化氨态氮、亚硝酸氮、苯酚和溶解氧能力方面都会产生影响:6mT磁场强度处理的光合细菌生长72小时后,生物量最高;4mT和6mT磁场强度处理的光合细菌生长48小时的菌体蛋白质增产效果最好;10mT磁场强度处理的光合细菌在生长48小时pH值最小;6mT磁场处理过的光合细菌生长72小时后,提高光合细菌维生素B6的含量效果最明显;8mT磁场处理的光合细菌生长72小时后处理养殖废水,对废水的铵态氮去除率最强;10mT磁场处理的光合细菌生长24小时后处理养殖废水,对废水的亚硝酸态氮去除率最强;2mT磁场处理的光合细菌生长48小时后处理含有苯酚养殖废水,对废水的苯酚去除率最强;4mT磁场处理的光合细菌生长72小时后处理的废水中含氧量最高。
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