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[硕士论文] 黄建蓉
水产养殖学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:运城盐湖是一个古老而又典型的内陆咸水湖,富含丰富的芒硝(主要成分硫酸钠)资源,是研究嗜盐细菌多样性的理想对象。嗜盐细菌作为一类极具基础研究价值和应用前景的微生物资源,凭借其特殊的生理结构、代谢机制、种群类群、遗传基因和独特的代谢产物受到国内外学者的广泛关注。本研究通过免培养和纯培养技术相结合的方式,探究适合运城盐湖嗜盐细菌的分离技术,系统地开展该生境嗜盐细菌的分离鉴定、物种多样性研究,并从中筛选出具有纤维素酶和木聚糖酶活性的功能菌株。Biolog ECO法是一种以微孔板碳源利用为基础的定量分析方法,可简单、快速地描述微生物群落代谢特征。通过AWCD曲线、底物代谢差异、多样性指数以及主成分分析,对运城盐湖环境10个代表性样点微生物群落多样性和代谢特征进行了研究。结果表明,运城盐湖10个样点微生物群落可分为三种代谢类型。同时也预测出用于运城盐湖环境微生物分离的“有效分离底物类型”:糖类和酯类为底物碳源的分离培养基;氨基酸类和胺类为底物碳源的分离培养基。
  本研究采用高通量测序技术对运城盐湖嗜盐细菌多样性进行了分析,24个样品共得到原始序列705,689条,注释到16,877个OTU,平均长度在396 bp左右。通过QIIME平台分析可注释得到30个门,其中主要包括:厚壁菌门(Firmicutes,47.6%),变形菌门(Proteobacteria,35.6%),拟杆菌门(Bacteroidetes,3.7%),放线菌门(Actinobacteria,3.6%)和Bacteria Other(2.9%)。PCoA分析、CCA分析结果表明,这24个样品中的嗜盐细菌可分为3大类群,其中影响微生物类群差异的理化因子主要是Ca2+和Fe2+。比较同一个盐湖不同盐浓度样点的嗜盐细菌群落组成变化,发现靠近盐湖中心的两个样点中存在的嗜盐细菌群落组成较为相似,而远离盐湖中心的两个样点的嗜盐细菌群落组成较为相似。同时在运城盐湖中也检测到了大量的经典嗜盐类群、极端微生物类群和具有特定功能的微生物类群信息。综合群落代谢特征、理化参数等结果,设计出五类10种分离培养基用于分离运城盐湖10个样点环境中的嗜盐细菌。结果表明,共分离出1,033株嗜盐细菌,形态去重复后,测序得到605株嗜盐细菌信息。经鉴定这些菌株分属于放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的7个纲,18个目,41个科,82个属以及52个潜在新分类单元。分析表明,分离培养基的营养成分、添加的盐浓度以及不同的样点对微生物的分离有着显著的影响。通过形态学、生理生化特征、化学组成和系统发育分析等研究,对2个新物种(Halomonas haloduranssp.nov.和Paracoccus halotolerans sp.nov.)开展多相分类鉴定,确定了这2株候选新物种的分类地位。纤维素类和半纤维素类物质是地球上产量巨大而又未得到充分利用的可再生资源。通过刚果红染色法对分离得到的1,033株嗜盐细菌进行纤维素酶和木聚糖酶活性菌株筛选,分别获得32株具有纤维素酶活性和49株具有木聚糖酶活性的菌株,活性菌株筛选阳性率为3.1%和4.7%,其中12株菌兼具纤维素酶活性和木聚糖酶活性。在分离培养基中添加功能底物可以增加功能菌株的获得。
[硕士论文] 车玉兰
化学工程 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:食源性致病菌易通过食品流通环节感染人群,致病菌的高效检测是食品安全重要保证。此外,细菌感染治疗中耐药菌的出现使新型抗菌药物的需求日益迫切。面对食源性致病菌检测中背景基质复杂、检测时间长、细菌含量少的特点,以及新型抗细菌感染药物研究中药物作用效果检测方法耗时、操作复杂,不能快速筛选等问题。本文基于荧光标记检测灵敏度高、选择性好等优势,提出了样本基质干扰小、不受多余标记试剂影响的结合磁分离富集与荧光标记的细菌荧光检测法和集磁捕获、荧光标记和检测一体的快速细菌微流控芯片检测法。在对细菌荧光探针和标记模式研究基础上,将荧光标记检测技术用于细菌感染细胞作用研究,实现群体感应抑制剂作用效果快速、高效检测。相关研究为复杂食品样本中低含量细菌的快速检测提供新方法,为新型抗菌药物筛选研究提供新途径和新思路,对食品安全及致病菌的监管和感染治疗有重要研究价值和应用潜力。
  本研究主要内容包括:①将纳米磁珠富集和聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)凝胶层析分离结合,采用荧光标记的检测模式,建立了一种食品中致病菌的快速灵敏分析方法。采用Fe3O4@SiO2-NH2通过静电作用捕获大肠杆菌,减少食品样本带来的复杂基质干扰,对大肠杆菌进行富集;荧光产率高、标记快速的吖啶橙标记后,利用PEG凝胶层析,有效去除其中残余纳米磁珠及多余荧光试剂;通过对PEG分离管底部浓缩的纳米磁珠及目标细菌复合物的目视观测,即可对含菌量高于100 cfumL-1的样本进行半定量初判,进一步检测分离物的荧光信号,对目标细菌含量进行定量分析。以大肠杆菌为例,检测的线性范围102-106cfumL-1,检测限为100cfumL-1,检测时间80min。对超市取样的熟肉制品样本测试,本方法结果与传统的平板计数法结果吻合。②基于多通道微流控芯片建立了细菌磁捕获富集和原位荧光定量检测新方法。设计的芯片集成含混合区和检测区的6条微通道,磁标记的细菌在混合区与吖啶橙充分混合进行标记,检测区通过外置磁铁进行细菌的捕获富集,采用搭建的小型荧光仪对检测区捕获的细菌进行荧光强度检测。该方法对大肠杆菌的检测限为100 cfumL-1,检测时间50 min,荧光信号与菌液浓度在102-106 cfumL-1范围有良好的线性关系,可同时进行6个样本测试。③设计制备了多功能的适配体修饰的磁性碳量子点,同时实现对沙门氏菌的特异性磁分离捕获和荧光标记检测,建立了选择性好、背景干扰小的沙门氏菌快速荧光检测方法。将碳量子点共价结合到的Fe3O4@SiO2-NH2表面制备磁性碳量子点Fe3O4@CQDs,在其表面修饰适配体制备Fe3O4@CQDs-Apt以实现目标菌特异性标记,Fe3O4@CQDs-Apt标记沙门氏菌后发生团聚导致荧光强度降低,荧光强度的变化值与沙门氏菌在103~106 cfumL-1浓度范围呈现良好的线性关系,在牛奶和鸡肉的沙门氏菌合成样本中检出限为103 cfumL-1,检测时间60 min,可用于复杂背景基质的样本中目标菌的分离捕获及快速荧光检测。④采用碳量子点标记的细菌与细胞相互作用,建立细菌群体感应抑制剂对细菌感染细胞作用效果荧光检测方法,对药物作用进行快速判断和评估。以公认群体感应抑制剂呋喃酮 C30为阳性对照物,对单宁酸、厚朴酚、山奈酚对沙门氏菌感染 HT-29细胞作用效果进行荧光检测。结果显示:药物对沙门氏菌黏附 HT-29细胞的抑制作用呋喃酮 C30>厚朴酚>单宁酸>山奈酚,侵染抑制作用呋喃酮 C30>单宁酸>厚朴酚>山奈酚。此外,对几种药物的群体感应抑制作用进行分析,几种药物均对AHL调控的群体感应有抑制。细菌运动性结果显示几种药物均能抑制沙门氏菌的 Swarming,厚朴酚能抑制 Swimming,表明药物通过抑制沙门氏菌群体感应及运动性抑制其对细胞的感染,建立的荧光检测方为新型细菌感染药物筛选研究提供新途径。
[硕士论文] 任韶霞
微生物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷,对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用,是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷以及许多抗病毒性药物的重要中间体。目前在工业上主要以糖质为原料发酵进行生产。但国内腺苷的生产效率仍有较大的提高空间,可通过诱变育种以及基因工程的方法来改造菌种,优化发酵条件来改善和提高产量、降低成本;同时在生产过程中还存在生产菌株遗传性状和产量不稳等问题。本实验室保藏的一株能够积累腺苷的菌株Bacillus subtilis DI4-24,经过连续传代培养,菌种退化现象严重,其遗传性状组氨酸缺陷极易发生丢失,不利于腺苷的工业化生产。本研究以分离纯化后的退化菌株B.subtilis DI4-24R为出发菌株,利用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)进行诱变处理,重新获得了增加组氨酸缺陷型菌株,进行遗传性状稳定性和高产腺苷的选育,并通过基因敲除技术定向改造菌株,来使生产菌株的稳定性能增强的研究。
  本研究主要内容包括:⑴通过对高产腺苷菌株B.subtilis DI4-24分离纯化和遗传表型分析,得到菌落形态和遗传标记都发生改变的退化菌株B.subtilisDI4-24R,其产苷性能退化的原因为组氨酸缺陷型高频率地发生回复突变所致,退化菌菌株产量大幅度降低至4.34 g/L。⑵以B.subtilis DI4-24R为出发菌株,进行ARTP诱变处理,经过初筛选到his-恢复的突变株。实验表明,ARTP诱变放电照射10s诱变效果最佳,正变率高。经过复筛得到了一株高稳产腺苷菌株B.subtilis AR-27,传代6次该菌株依然保持相当高的产腺苷能力,摇瓶发酵产苷量达到15.84g/L,比出发菌株产量提升了近3倍,his-回变率大幅下降至9.3×10-8,其产苷性能和遗传稳定性得到显著提高。⑶对突变菌株B.subtilis AR-27进行了摇瓶发酵培养基的优化试验,通过生长因子、葡萄糖、以及氮源物质的单因子实验和多因素正交试验,确定了最佳培养基配方为:葡萄糖11g/L、豆粕80mL/L、玉米浆60mL/L、酵母精粉12 g/L、氯化铵15g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.3g/L、硫酸亚铁0.02g/L、硫酸锰0.02g/L、氯化钙5g/L、碳酸钙20g/L、亮氨酸0.02g/L、谷氨酸0.02g/L、组氨酸50 mg/L。在优化的培养基中产苷水平达16.12 g/L,产苷能力提高了10%。⑷在NCBI上检索出枯草芽孢杆菌hisC基因序列,以此为根据分别设计上下游引物,PCR扩增DI4-24R细胞基因组,得到上游(TF)与下游(TB)的同源序列,将上下游同源序列融合连接,片段大小为1000bp左右,将目的片段与T载体连接,构建成重组质粒T-H。⑸提取穿梭质粒载体pMAD和重组质粒,分别用限制性内切酶BamH、BglⅡ酶切后,采用新技术in-fusion处理后,转化到DH5α细胞,筛选得到hisC基因缺失的同源重组质粒pMAD-H。将同源重组质粒pMAD-H电转化导入受体细胞DI4-24R中,用抗性平板筛选克隆子,得到B.subtilis DI4-24R(pMAD-H)转化菌株,为后续的同源重组工程菌的筛选奠定了基础。
[硕士论文] 李成功
生物学;细胞生物学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)已知包括五种亚型,其中四种会导致人类和其它哺乳类发生严重致死的出血热疾病,被称为埃博拉病毒病。该病毒于1976年首次被发现。2013-2015年,西非爆发了最新一次的埃博拉病毒疫情,截止到2017年2月,全球已确认感染埃博拉病毒28616人,造成11310人死亡,死亡率达39.5%。人类感染病毒后,病毒可在全身各组织器官中分布,造成多部位出血以及器官坏死,严重者导致患者死亡。由于其感染性强,传播速度快,致死率高,世界卫生组织(WHO)将其列为“第四级病毒”。EBOV是一种非节段性的单股负链RNA病毒,基因组大小约19kb,顺序为3’-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’,编码包膜蛋白(GP)、N蛋白(NP)、L蛋白(L)、病毒蛋白(VP30、VP35)和基质蛋白(VP40、VP24)以及非结构蛋白sGP、ssGP等。目前已经发现埃博拉病毒蛋白可与多种宿主蛋白相互作用进而阻断干扰素应答,抗原呈递,RNAi抗病毒应答,体液免疫,T细胞依赖的B细胞应答,细胞免疫等多种过程。但其具体入侵、复制及致病致死机制尚不明确。酵母双杂交系统(Yeast Two-Hybrid System)是Fields和Song等于1989年首次提出的。该方法运用真核生物转录因子GAL4的DNA结合结构域(DNAbinding domain,BD)和转录激活结构域(DNA transcription activation domain,AD)分别标记病毒蛋白和宿主蛋白,当二者存在相互作用时启动下游报告基因表达,进而筛选出相互作用对。
  本研究运用酵母双杂交技术从人肝cDNA文库中筛选出与埃博拉病毒GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白,用于研究GP、VP30、NP、L蛋白在埃博拉病毒感染和致病过程中发挥的作用,为进一步解释埃博拉病毒的致病机理提供依据。以本实验室保存的埃博拉病毒RNA为模板,反转录成cDNA。用重组PCR技术构建诱饵质粒pGBKT7-GP、pGBKT7-VP30、pGBKT7-NP、pGBKT7-L。诱饵质粒转化至酵母感受态细胞Y2HGOLD中,进行毒性检测以及自活化试验。阳性对照质粒和阴性对照质粒进行对照实验,确保酵母双杂交系统可用。文库滴度测定,保证人肝cDNA文库符合酵母双杂交的滴度要求。将诱饵菌株与人肝 cDNA文库菌株进行杂交,在DDO/X/A筛选平板上初次筛选,然后将筛选到的阳性克隆在QDO/UA筛选平板进一步筛选,对筛选到的阳性克隆进行DNA测序和生物信息学分析。利用酵母回复性实验进一步验证,排除假阳性结果。共筛选出6个可能与GP、VP30、NP、L蛋白有相互作用的宿主蛋白,分别是铜代谢结构域蛋白1(COMMD1)、白蛋白(ALB)、脂蛋白-a-Ⅱ(APOA2)、蛋白酶调解因子8(PSMD8)、结合珠蛋白(HP)、细胞色素P4502E1(CYP2E1)。酵母回复性实验进一步说明了COMMD1和APOA2与NP蛋白可能存在相互作用。通过酵母双杂交系统筛选出了6个可能与埃博拉病毒GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白,分别是COMMD1、ALB、APOA2、PSMD8、HP、CYP2E1。为进一步研究埃博拉病毒的致病机理提供了参考。
[博士论文] 张雁
生态学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:维吉尼亚链霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14)是一株从甾体药物制药厂排污池土壤中分离得到的放线菌。该菌株能在多种甾醇类化合物(包括薯蓣皂素、雌二醇、去氧皮质酮、胆固醇、麦角固醇等)为唯一碳源的培养基上进行生长,并且能通过次级代谢产生多种新的甾醇类化合物。为系统阐明该菌株CPY在复杂的次级代谢过程中的功能与机理,实验室已对S.virginiae IBL14进行了全基因组测序,并利用GO、KEGG和Swiss-Prot,以及NR和COG等数据库对获得的全基因组数据进行了基因分析与功能注释。本研究主要内容包括:
  ⑴S.virginiae IBL14全基因组的生物信息学分析发现:该菌株含有31个CYP450基因,其中:svh001、svu001、svu003、svu004、svu005为CYP105家族基因,svh001、svu003、svu004具有极高的同源性,其二级结构基本相同,推测三个基因在结构和功能上是极其保守的,可能具有类似的功能。svu005基因和svh001、svu003、svu004具有一定的二级结构差异。svu001其氨基酸和其它CYP105同源性较低,但在二维结构上,和其他CYP105家族基因没有明显区别,均含有13个α超螺旋结构;svu001和其它CYP105家族基因二维结构主要的区别在于其α螺旋均比同家族基因长,导致其蛋白总长高达499个AA(一般为400个左右)。在CYP105家族基因的五个基因中,均发现了K-helix和Heme bindingmotif保守基序。svh001、svu003、svu004、svu005的Heme binding motif极为保守,尤其是svu003、svu004的Heme binding motif完全一致;但与svu001的Hemebinding motif有极大的差异。这五个基因的K-helix基序基本一致。而所有CYP家族中被认为是一个保守的I-helix基序,却未在svu001发现。通过基因注释、序列比对和系统进化树的分析,我们确定svh001、svu003、svu004为CYP105C1; svu005为CYP105D1;svu001因具有不同寻常的特征,认为其为CYP105家族中的一个新的亚家族或者是一个新的家族基因。
  ⑵全基因组的生物信息学分析还发现:S.virginiae IBL14基因组存在着一个CRISPR-Cas基因编辑系统。对该系统Cas蛋白的组成及排列结构分析,我们将其命名其为I-B-svi型CRISPR-Cas系统。实验证明该系统能高效的对自身基因组中的基因进行编辑;特别是应用该系统开发的基因编辑工具可对其它生物进行有效的基因编辑,具有替代目前商用的Cas9基因编辑系统的潜力。
  ⑶设计并构建了包含编辑模板片段(templet DNA/t-DNA)和靶向基因片段(guide DNA/g-DNA)的基因编辑质粒(gene editing plasmid),并将其转化到S.virginiae IBL14原生质体中,筛选得到上述5个CYP105家族基因敲除的转化子。结合唯一碳源生长、生理形态分析、生物信息学分析等方法研究了CYP105家族基因对S.virginiae IBL14生理功能的影响,结果表明:1)I-B-svi型CRISPR-Cas系统可以成功对该基因组内源基因进行编辑,其操作简单、耗时短、效率高;2)CYP105家族基因的单敲除不致死,但会明显影响菌体的生长和生理变化,其中IBL14△svu004在液体和固体培养时大量产生胞内色素,并且在液体培养时不形成菌丝球;3)S.virginiae IBL14复杂的次级代谢产物可以有效地抑制细菌和真菌的生长;4)CYP105基因的敲除通过影响聚酮的代谢途径显著影响IBL14的抗生素和抗真菌素的生产。
  ⑷实验将CYP105家族基因在大肠杆菌中成功地进行了克隆,优化了发酵条件,实现了可溶性的外源表达。并以多种甾醇类化合物作为底物,进行了生物转化功能分析。试验表明:(1) svh001具有多种甾醇类物质生物转化功能:羟化雌二醇生成雌三醇,羟化维生素D3生成25-羟基-维生素D3,羟化16,17环氧黄体酮生成新的羟化产物。(2) svu001可以羟化雌二醇生成雌三醇,羟化维生素D3生成25-羟基-维生素D3,其所在基因簇与精氨酸代谢途径相关,可以羟化精氨酸为N-ω-羟基-L-精氨酸。(3) svu003可以羟化雌二醇生成雌三醇,羟化维生素D3生成25-羟基-维生素D3。(4) svu004可以羟化雌二醇生成雌三醇和2-羟基-雌二醇,羟化维生素D3生成25-羟基-维生素D3,羟化16,17环氧黄体酮生成新的羟化产物(不同于svh001)。(5) svu005可以羟化雌二醇生成雌三醇,羟化雄烯二酮生成9位羟基化产物,以及将二苯甲酮羟化为4-羟基二苯甲酮。(6) CYP105家族的三个C家族基因的表达蛋白在多种底物代谢中表现出一定的共性,但D家族的svu005基因表达蛋白具有相对独立的底物域。
  ⑸本研究揭示维吉尼亚链霉菌IBL14的CYP105基因的亚家族定位与进化关系,探索了CYP105家族基因的底物域,加深了羟化反应的分子机理的理解。本研究的结果有助于改造、合成新的羟化酶,提高酶的反应活力与环境适应能力;在甾醇类物质的特定位点、特定立体构象引入羟基,生产全新的甾体药物及药物中间体;促进对甾体污染物的转化与降解。
[硕士论文] 谭刘刚
预防兽医学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:禽流感(Avian influenza AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus type A)引起的一种传染性疾病,根据致病性的强弱可以分为高致病性禽流感(HPAIV)和低致病性禽流感(LPAIV)。流感病毒基因由8个片段组成,其中血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)是病毒的主要囊膜糖蛋白。流感病毒感染宿主始于HA蛋白和宿主细胞上的受体结合,HA蛋白主要结合两种形式唾液酸即:α-2,3唾液酸乳糖和α-2,6唾液酸乳糖。不同宿主的唾液酸的类型不同在一定程度上决定了流感病毒感染宿主的不同。迄今为止,已经发现H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染禽类,也可以可感染哺乳动物包括小鼠、豚鼠、雪貂、灵长类。血清学调查发现我国养殖从业人员血清中H9N2流感病毒抗体的阳性率达2.3%-13.7%,这表明H9N2亚型禽流感病毒已经获得跨越种间屏障感染哺乳动物甚至是人的能力,因而具有引发新的流感大流行的潜在威胁。H9N2亚型AIV可以为新发流感病毒提供供体,如1997年香港流行的H5N1亚型流感病毒,其内部基因可能来源于A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)分离株。2013年流行的H7N9亚型AIV的内部基因有6个来自H9N2亚型AIV。因此,加强对H9N2亚型AIV对人源受体亲和性变化的检测以及病毒对哺乳动物致病机制研究具有重要的公共卫生意义。
  本研究对2001-2013间分离的12株H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进化分析发现:12株AIV尽管都属于Y-280这一大分支,但是又可以分为4个小的分支,这表明H9N2亚型禽流感病毒也在发生变异,尽管变异速度没有H5亚型禽流感那么快速。固相结合试验结果表明:不同的分离年代H9N2亚型AIV对α-2,6唾液酸受体的亲和能力存在差异,总的趋势是:随着分离年代临近,病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和能力逐渐增强,其中2013年分离株(A/Chicken/Shandong/903,简称CK/SD/903)对α-2,6唾液酸受体的亲和性最强,2006年分离株(A/Chicken/Shandong/274,简称 CK/SD/274)对α-2,6唾液酸受体的亲和性最弱。通过对CK/SD/903和CK/SD/274这两个模型毒株的HA蛋白糖基化位点进行比较发现:CK/SD/903的血凝素蛋白分别在200和295位比CK/SD/274多了两个N-糖基化位点,为了验证这两个位点糖基化是否影响病毒对α-2,6受体唾液酸受体亲和性,我们构建了CK/SD/903的8质粒反向遗传操作系统,并且对CK/SD/903的血凝素蛋白的200和295位氨基酸进行突变,得到2个突变病毒。固相结合试验结果表明HA N200Q(200位由N变为Q),而HA N295Q(295位由N变为Q)可以减弱病毒对α-2,6受体唾液酸受体亲和性。为了进一步验证这两个位点的糖基化是否影响病毒对哺乳动物致病性,分别用106EID50的野毒和突变病毒(CK/SD/903(HA N200Q),CK/SD/903和CK/SD/903)攻毒6周龄小白鼠。攻毒试验结果表明:HAN200Q(200位由N变为Q)后,尽管突变病毒对小鼠的体重没有明显影响,但是可以提高病毒在小白鼠肾脏等器官复制能力(病毒基因相对表达量是野毒的936.32倍);HA N295Q(295位由N变为Q)突变后,可以提高病毒在小白鼠肝脏等器官的复制能力(病毒基因相对表达量是野毒的56倍)。本研究系统的研究了2001-2013年间的12株H9N2亚型禽流感病毒HA基因进化和病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性,结果表明:H9N2亚型流感禽流感病毒存在一定程度变异,尽管不如 H5亚型流感那么明显;随着分离年代临近,病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性逐渐增强。利用反向遗传操作技术验证了903毒株HA蛋白200和295位糖基化影响病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性变化,并且这两个位点糖基化能够影响病毒对小白鼠组织嗜性。这为阐明H9N2亚型流感病毒跨种间传播的分子遗传机制提供重要的理论和实验依据,并且能够为H9N2亚型流感病毒感染哺乳动物或者人提供预警,因此本研究具有重要的兽医指导意义和公共卫生意义。
[硕士论文] 赵斌
有机化学 河南大学 2016(学位年度)
摘要:共生菌是与生物体共同生存的一大类群的微生物,随着对共生菌的研究日渐增多,众多的共生菌次级代谢产物已经得到了分离、纯化和鉴定,这成为发现新型天然产物的一个重要来源和途径。由于共生菌与宿主长期共同进化,导致它们有着特殊的代谢途径,因此这些共生菌可能产生具有特殊结构及显著生物活性的次级代谢产物。已有的研究证实了共生菌确实能够产生具有新颖骨架的次级代谢产物,而且具有抗菌、抗疟、抗肿瘤、免疫抑制、除草等多种生理功能。在前期工作中,完成了蜚蠊、白蚁、蝴蝶、蜜蜂、蟋蟀五种昆虫的共生菌分离纯化工作,得到真菌20株、放线菌13株以及细菌9株,共42株。通过体外活性实验,从中筛选出了两株活性较强的菌株。在此基础上,我们以其中一株从蜚蠊样品中分得的共生真菌FL-F5(曲霉属,Aspergillus sp.)为研究对象,对其发酵液中的次级代谢产物进行提取、分离、纯化和结构鉴定,并研究了部分分离得到的单体化合物的功能和生物活性。
  本研究主要内容包括:⑴综合运用各种现代化的色谱分离手段,对其发酵粗提物进行分离纯化,分离得到9个单体化合物,利用多种鉴定技术综合解析代谢产物的结构,确定了5个化合物的平面结构,其中1个为新骨架化合物Aspergirin A(1),4个为已知化合物:反式-对羟基肉桂酸甲酯,6,8-二羟基-3,4,5-三甲基异香豆素,反式-对羟基肉桂酸,苜蓿素。⑵运用荧光光谱法对四个已知化合物(2-5)与不同金属离子的相互作用进行研究,结果发现化合物3和5加入铅离子后荧光强度分别增大8.5和5.3倍,表明化合物3和5对铅离子有识别作用。通过Job’s plot分析法和Benesi-Hildebrand方程,可以确定这两个化合物与Pb2+的结合比为1:1,其结合常数分别为1.62×104和1.84×104。⑶考察了四个已知化合物(2-5)对5-脂氧合酶(LOX)活性的抑制作用,结果显示化合物2、3和4对5-LOX酶基本无抑制作用,化合物5对5-LOX有抑制作用,IC50值为2.05 mmol/L。考察了四个已知化合物(2-5)对酪氨酸酶活性的抑制作用,结果表明化合物2对酪氨酸酶的活性基本无抑制,化合物3、4和5对酪氨酸酶酶的活性有抑制,IC50值分别为0.94 mmol/L、0.41 mmol/L和0.66 mmol/L,阳性对照Vc的IC50值为0.31 mmol/L,这三个化合物对酪氨酸酶活性的抑制作用跟阳性对照Vc相当,动力学实验发现化合物3对酪氨酸酶的抑制属于可逆抑制,抑制类型为竞争型抑制。⑷利用四氮唑盐还原法(MTT法),选用6种人肿瘤细胞宫颈癌(Hela)细胞,肝癌(HepG-2)、(SMMC-7721)细胞,人白血病(K562)细胞,乳腺癌(MCF-7)、(MDA-MB-231)细胞对分离得到的四个化合物(2-5)进行了体外细胞毒活性研究,结果表明化合物2对Hela细胞有中等抑制作用,IC50值为52.59μmol/L,化合物3对SMMC-7721细胞有弱抑制作用,IC50值为154.36μmol/L,化合物4对HepG-2细胞有弱抑制作用, IC50值为121.6μmol/L,化合物5对Hela细胞和肝癌SMMC-7721细胞都有中等抑制作用,IC50值分别为13.19μmol/L和46.17μmol/L。
[博士论文] 米见对
生态学 兰州大学 2016(学位年度)
摘要:青藏高原被称为世界“第三极”,拥有全球海拔最高、面积最大和唯一被四季放牧利用的高寒草地。独特的高寒生态环境(高海拔、寒冷、缺氧、紫外线强、牧草季节供应严重失衡),使得生存于此的牦牛种群在协同进化过程中产生了一系列特殊的适应机制。近年来的研究发现,与黄牛相比,牦牛在消化器官组织结构、牧食行为、氮素利用效率、甲烷排放、瘤胃甲烷菌菌群结构、季节间能量分配等方面均优于黄牛;并从牦牛全基因组测序中找到了适应高寒营养胁迫的相关功能基因。为此我们推断,长期的极端环境与营养胁迫,使细菌/甲烷菌在牦牛瘤胃和不同肠道部位中分别形成了特殊的时间动态和空间分布模式,以帮助宿主提高能量利用效率和有效应对每年长达8个月的冷季营养匮乏。本试验以牦牛为研究对象,主要利用通用引物515F/806R通过16S二代高通量测序,分析了细菌/甲烷菌在瘤胃中的定植过程(3、14、60、180、365和730天)、季节动态(春、夏、冬)和不同肠道部位(19个部位)的空间分布,拟寻找牦牛肠道微生态系统中有助于宿主适应高寒严酷生态系统的特殊微生物群落,为进一步通过调控肠道微生态系统提高牦牛生产性能和实现藏区畜牧业的可持续发展提供理论基础和技术支撑。
  本研究主要内容包括:⑴牦牛瘤胃细菌/甲烷菌定植过程中丰度指数Chao1的增加分为三个梯度,3和14天为第一阶段,60、180和365天为第二阶段,730天为第三阶段;多样性指数Shannon在3、14天低于其它年龄组(P<0.05),其它年龄组之间没有差异(P>0.05)。⑵牦牛瘤胃细菌定植过程中优势门水平的细菌是厚壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)三大类,约占85%。其中厚壁菌门(Firmicutes)所占的比例最高,在不同年龄组之间维持在约50%;拟杆菌门(Bacteroidetes)从3天的23%增加到了730天的43%;变形菌门(Proteobacteria)从3天的17%降低到了730天的2.3%。以上两种菌门的增加/降低都呈现出幼龄段(3、14天)、发育段(60、180天)和成年段(365、730天)阶梯式的变化。⑶牦牛瘤胃甲烷菌—广古菌门从3天的0.3%增加到60天最高的2%,随后在成年组(365、730天)维持在约1.3%。⑷瘤胃微生物定植过程中的途径主要是通过母畜唾液,将从母畜瘤胃中反刍带到口腔的瘤胃微生物转移到幼龄反刍动物的瘤胃中。⑸牦牛瘤胃细菌/甲烷菌季节变化过程中的丰度指数Chao1从大到小的顺序是春>夏>秋。U多样性指数 Shannon与丰度指数呈现相同的趋势,但是春夏两季之间多样性更加接近。同一季节组内相似性春季最低,夏季最高。⑹不同季节间以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌,在春、夏、冬三个季节所占的比例分别为75%、80%和77%。其中拟杆菌门的组成比例在春季最低约45%,在夏冬两季基本相同约为54%;而厚壁菌门在春夏冬三个季节的比例分别是30、26、23%。⑺在冷季(春冬两季),由于牦牛采食牧草中的纤维含量增高,瘤胃微生物中分解纤维的菌属高于暖季(夏季),而夏季中降解植物次级代谢产物和利用可溶性糖、氨基酸的菌属高于冷季。春季中的纤维降解菌属的种类和比例高于冬季。牦牛瘤胃甲烷菌的比例在冬季最低,而春夏两季的比例基本相同。⑻在相同的低氮日粮下,牦牛和黄牛不同肠道部位的细菌/古菌Alpha和Beta多样性没有差异。细菌/甲烷菌在不同肠道部位的丰度指数(Chao1)和多样性指数(Shannon),都是在前肠道内容物和大肠最高,前肠道壁次之,小肠中最低。不同肠道部位同一样品组内微生物多样性在小肠部位最低,其次是大肠,前肠道(内容物和肠道壁)中相似性最高。⑼忽略不同的肠道部位,在门水平的优势细菌是厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes),在前肠道和小肠约占75%,而大肠中的占比高达90%。厚壁菌门(Firmicutes)在小肠和大肠中的比例高于前肠道,而拟杆菌门(Bacteroidetes)在前肠道部位高于小肠和大肠。甲烷菌的比例在小肠高于肠道其它部位。Cyanobacteria菌门在牦牛不同肠道部位的比例高于黄牛。⑽在前肠道壁分布的优势菌属主要参与氧气、尿素和挥发性脂肪酸的吸收利用;前肠道部位内容物中比例较高的菌属主要负责来自日粮中的纤维素、植物次级代谢产物、淀粉和糖类的降解与利用;小肠中具有优势的菌属很少,主要是参与维生素的合成和黏素的降解;大肠主要负责吸收和利用一些没有被前肠道部位消化吸收的糖类、次级代谢产物和盐类。PICRUSt功能分析显示牦牛肠道微生态中比黄牛存在更多未知的菌群。与 KEGG数据库比对,牦牛高于黄牛的基因家族的数量要多于黄牛高于牦牛的数量,其中能量储存、脂质代谢和聚糖合成和代谢的三大基因家族在牦牛要高于黄牛,这些基因家族的差异,可能会帮助牦牛提高能量利用效率。
[硕士论文] 史文思
生物化学与分子生物学 河北大学 2016(学位年度)
摘要:本文以土壤真菌漆斑菌 Myrothecium sp. KX136897和地枝顶孢菌 Acremonium terricola作为研究对象,将其次级代谢产物进行分离、纯化及结构鉴定。采用不同色谱分离技术(正相硅胶柱色谱,Sephadex LH-20凝胶柱色谱,反相硅胶柱色谱—ODS柱,高效液相色谱HPLC以及重结晶等),根据现代波谱学技术(1D和2D-NMR、IR、MS、UV等)和其理化性质进行结构鉴定,共分离鉴定了20个化合物。两株菌种是从北京云岗森林公园的土壤中分离得到的。漆斑菌 Myrothecium sp. KX136897经过液体发酵后,从其乙酸乙酯萃取浸膏中纯化鉴定了10个化合物,分别为:9-十八烯酸(M-01),疣孢菌素A(M-02),杆孢菌素D(M-03),疣孢菌素 J(M-04),杆孢菌素 A(M-05),疣孢菌素 B(M-06),5,7-二羟基-4,6-二甲基-1(3H)-异苯并呋喃酮(M-07),5-羟基-7-甲氧基-4,6-二甲基异苯并呋喃酮(M-08),deoxycyclopaldic acid(M-09),7-羟基-5-甲氧基-4,6-二甲基-7-O-α-L-鼠李糖-异苯并呋喃酮(M-10)。部分化合物进行了活性测试实验,其中化合物M-02、M-03和M-05具有很好的抗肿瘤活性,且活性高于对照组顺铂,与紫杉醇的活性相似;M-05具有中等的抗菌活性,M-03有弱抗菌活性。地枝顶孢菌 Acremonium terricola经过液体发酵后,从其乙酸乙酯萃取浸膏中纯化鉴定了10个化合物,分别为:酪醇(AT-01),海绵尿核苷(AT-02),D-半乳糖醇(AT-03),3-氨基丙酸对甲苯酯(AT-04),3-羟基-5-甲基-5,6-二氢-7H-环戊并[b]吡啶-7-酮(AT-05),环(反式-4-羟基-L-脯-L-亮)二肽(AT-06),二氧嘧啶(AT-07),环(D-苯丙-甘)二肽(AT-08),环(L-丙-L-苯丙)二肽(AT-09),酪氨酰酯(AT-10)。其中化合物AT-01、AT-02、AT-04、AT-05、AT-06、AT-08、AT-09、AT-10均为首次从地枝顶孢菌分离到的次级代谢产物。部分化合物进行了活性测试实验,其中化合物 AT-04具有弱抗菌活性。在这两株真菌的次级代谢产物中分离得到了具有抗肿瘤、抗菌活性的化合物,这为进一步分离具有生物活性且结构新颖的化合物提供了研究基础。
[硕士论文] 郑元博
生物化学与分子生物学 北京交通大学 2016(学位年度)
摘要:目的:构建可表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)或分泌型荧光素酶(Gaussia luciferase,Gluc)报告基因的单/双顺反子人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)微型基因组cDNA克隆并进行拯救,以探讨并验证RSV的辅助蛋白在RSV反向遗传学操作中的作用,同时,构建以巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子为表达盒、密码子优化的辅助蛋白质粒系统,用于开展微型基因组拯救及RSV辅助蛋白功能的研究。
  方法:通过分子生物学技术,将人工合成的带EGFP基因的微型基因组cDNA克隆在改造的pBR322B载体上;将EGFP基因替换为Gluc报告基因,获得分别表达EGFP及Gluc的单顺反子微型基因组,向上述质粒中插入一个编码无生物活性的蛋白的开放阅读框(open reading flame,ORF),获得分别表达EGFP或Gluc的双顺反子微型基因组。同时,构建基于CMV启动子表达盒及密码子优化的辅助蛋白质粒系统,Western blot鉴定辅助蛋白质粒的蛋白表达,并与之前构建的基于T7启动子表达盒的辅助蛋白质粒比较拯救微型基因组的效率。将以EGFP或Gluc为报告基因的单/双顺反子微型基因组分别与辅助蛋白质粒共转染至BHK-T7细胞,通过荧光显微镜观察EGFP的表达、Gluc检测试剂盒分析Gluc的表达,以及RT-qPCR对EGFP mRNA水平进行检测,以实现对微型基因组的拯救及验证RSV四种辅助蛋白在拯救过程中的作用。
  结果:构建了以EGFP或Gluc为报告基因的单/双顺反子微型基因组及其编码质粒,以及基于CMV启动子表达盒及密码子优化的辅助蛋白质粒系统。成功拯救了携带EGFP或Gluc报告基因的单/双顺反子微型基因组,并验证了四种辅助蛋白在拯救过程中的生物学意义,其中M2-1具有抑制转录终止和促进亚基因组转录的生物学活性。研究也表明以CMV启动子表达盒和密码子优化为基础的辅助蛋白质粒较以T7启动子表达盒的辅助蛋白质粒拯救效率有所提高。
  结论:成功构建了编码可表达EGFP或Gluc报告基因的单/双顺反子微型基因组的重组质粒,并验证了四种辅助蛋白、尤其是M2-1蛋白在双顺反子微型基因组的拯救过程中具有转录延长的生物学活性,同时,发现以CMV启动子表达盒和密码子优化为基础的辅助蛋白质粒能高效进行拯救,适用于后续的RSV重组病毒拯救实验研究。
[硕士论文] 张灿灿
生物化学与分子生物学 河北大学 2016(学位年度)
摘要:生活在不同环境(海洋、盐碱地、火山口、沙漠等)的微生物,由于其温度、酸碱度、盐度以及氧含量等的差异性,使得不同来源的微生物在长期自然选择下具有了独特而多样的代谢方式和生物合成途径,从而能够代谢产生结构新颖、生物活性丰富多样的次级代谢产物,已经成为了科研工作者们的关注和研究的热点,以及成为了人类发现药物活性先导化合物的一个重要来源。
  本文是以两株真菌漆斑菌 Myrothecium sp.和肉色曲霉 Aspergillus carneus为研究对象,分别对其次级代谢产物进行了分离纯化以及结构鉴定。本实验采用常规的硅胶柱色谱、制备薄层色谱、Sephadex LH-20柱色谱、MCI柱色谱、反相硅胶柱色谱、结晶、重结晶以及半制备高效液相色谱等分离手段。通过理化常数测定、化学方法和各种波谱学数据(1D/2D-NMR, MS, OR, IR)进行结构鉴定。从两株真菌中分离鉴定了21个化合物,其中化合物ZC-1和Z-5为新化合物,ZC-1,ZC-2,ZC-3,ZC-4这四个化合物为首次从漆斑菌中分离得到。从中国云南程海湖的湖水中分离得到的漆斑菌 Myrothecium sp.进行固体发酵,用乙酸乙酯进行萃取,并从其萃取物中分离鉴定出11个化合物,其中包括喹啉酮类生物碱4个:7-hydroxy-3-methoxyviridicatin(ZC-1),viridicatin(ZC-2),3-methoxyviridicatin(ZC-3),viridicatol(ZC-4);环二肽类的化合物5个:(11aS)-2,3-dihydro-1H-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine-5,11(10H,11aH)-dione(ZC-5),cyclopeptine(ZC-6),cyclopenin(ZC-7),dehydrocyclopeptin(ZC-8),trans-3-(3'-hydroxybenzylidene)-3,4-dihydro-4-methyl-lH-1,4-benzodiazepin-2,5-dione(ZC-9);苯衍生物及其他类的化合物2个:verrucosidin(ZC-10),4-(2-hydroxybutynoxy) benzoic acid(ZC-11),其中喹啉酮类生物碱ZC-1为新化合物。采用微量稀释法对4个喹啉酮类生物碱和5个环二肽类的化合物进行了抗菌活性评价,ZC-1和ZC-2表现出了一定的抗菌活性。I从中国南海的海水中分离得到的真菌肉色曲霉 Aspergillus carneus,从其固体发酵产物中分离得到了10个化合物,包括生物碱类化合物2个:环(L-色氨酰-l-苯丙氨酰)(Z-1),3-hydroxy-4-phenylquinolin-2(1H)-one(Z-3),聚酮类化合物3个:杂色曲霉素(Z-2),3-hydroxy-5-(3-hydroxy-5-methylphenoxy) benzoic acid(Z-4),3-hydroxy-5-(3-hydroxy-5-methylphenoxy)-4-methoxybenzoic acid(Z-5);苯衍生物3个:4-(acetylamino) benzoic acid(Z-6);苔色酸(Z-7);2,3-dihydrobenzo[b] furan-5-ol(Z-10),其他类2个:(9E,11Z)-13-oxo-9,11-octadecadienoic acid(Z-8),2,6,6-trimethyl-4-oxo-2-cyclohexene-1-acetic acid methyl ester(Z-9),其中化合物Z-5为新化合物。
[硕士论文] 李温馨
生物化学与分子生物学 河北大学 2016(学位年度)
摘要:本文对漆斑菌化学成分及天然产物绝对构型的鉴定进行了研究。筛选得到的漆斑属真菌(Myrothecium sp.)32302是从程海样品中分离出的一株具有很强的抗真菌活性的真菌。经过固体发酵后,将其培养基的乙酸乙酯萃取层分离纯化,采用多种现代柱色谱层析法,包括硅胶柱色谱法、凝胶Sephadex LH-20色谱、ODS反相色谱、中压液相色谱及循环半制备高效液色谱相等技术进行分离纯化。根据理化性质和波谱数据(1D/2D-NMR)进行结构鉴定,共鉴定14种化合物。同时,对六个具有良好生物活性的天然产物进行了绝对构型鉴定。在B3LYP/6-311++G(2d,p)//PCM/B3LYP/6-311++G(2d,p)的基组下进行旋光和电子圆二色性的计算。实验结果发现:早期报道的该系列化合物结构并非能量最低。通过对计算预测的旋光OR和圆二色谱ECD与实验数据进行比较,最终得到4个能量较低的结构。传统上,只有立体手性中心的构型相反时,如从(R)变到(S),ECD谱线才会出现相反的变化。该研究是第一次发现Griseusin芳香环上羰基位置的不同(平面结构变化)导致ECD光谱线出现相反的变化,而不是手性中心变化导致ECD光谱线出现相反的现象。
[硕士论文] 袁亚静
生物化学与分子生物学 山西大学 2016(学位年度)
摘要:Chromodomain(chromatin organization modifier domain)是与染色质结构相关的功能蛋白结构域,直接参与异染色质的形成和动态调控。真菌、原生动物、植物、哺乳动物等不同进化地位的真核生物中同样含有chromodomain蛋白的存在,并且在进化过程中高度保守。Chromodomain通过芳香族氨基酸残基组成保守的疏水“box”结构与“组蛋白密码”中的二甲基或三甲基修饰的H3K9和H3K27结合,进而招募不同的下游调节因子形成多聚复合体,调控染色质的结构和功能。含有chromodomain结构域的蛋白在基因转录调节、基因组重排修复和染色质重塑等过程中发挥作用,控制表观遗传调节过程。
  嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中的chromodomain蛋白Pdd1和Pdd3在有性生殖过程中特异表达,并且在四膜虫大核基因组重排中起到重要调节作用,本研究对嗜热四膜虫chromodomain蛋白Tcd1的功能进行了系统分析,结果如下:
  1. TCD1基因的生物信息学分析 TCD1(TTHERM_01337400)在营养生长期和饥饿期不表达;进入有性生殖时期开始表达,并在配对8h~10h时表达量最高。基因全长2340bp,开放阅读框2172bp,编码723个氨基酸,含有3个内含子,在第3个内含子处经过选择性剪切产生另一转录本 TCD1β。Tcd1含有2个 chromodomain(CD1,CD2)和1个chromoshadow domain(CSD),与不同物种的CD和CSD序列比对显示,CD1、CD2和CSD进化上序列保守。
  2. Tcd1参与DNA重排和断裂修复敲除TCD1后,四膜虫细胞能完成有性生殖核发育,但不能产生可存活的后代。单细胞PCR检测IES删除情况,发现部分配对细胞中 R元件的删除受阻。免疫荧光定位表明ΔTCD1细胞株中 H3K9me2和H3K27me3的形成不受影响;但细胞核发育完成后新大核上仍能检测到γ-H2A.X免疫荧光信号。
  3. Tcd1和Tcd1β分别定位在大核和细胞质构建过表达Tcd1和Tcd1β的细胞株。免疫荧光定位分析表明,HA-Tcd1在有性生殖期早期形成点状结构定位;随着新大核形成,HA-Tcd1从亲本大核上消失并迅速转移到新大核上呈致密的分布;在发育的晚期,随着小核特异系列在新大核的删除,HA-Tcd1在新大核逐渐减少,并聚集为点状结构。Tcd1β在有性生殖的整个过程不能定位在亲本大核和新大核中,而是点状分布于细胞质中。
  4. CD1和CD2结构域共同决定了Tcd1的核内定位模式构建CD1结构域单一位点突变的TCD1W159A细胞。免疫荧光定位表明在有性生殖早期HA-Tcd1W159A呈点状分布于亲本大核;但在新大核形成时期HA-Tcd1W159A不能全部从亲本大核转移至新大核,一部分保留在亲本大核上直至凋亡,在新发育的大核中聚集在核的外周;在发育晚期,HA-Tcd1W159A在核外周的定位进一步富集,核中心的定位消失。CD1和CD2双位点突变后,有性生殖早期HA-Tcd1W159AW437A在亲本大核形成较大的异常环状结构;新大核形成时聚集成点状分布,与H3K9me2几乎不能共定位;在细胞发育晚期,逐步聚集在大核周围。
  5. CSD结构域决定了Tcd1的核内定位构建截短Tcd1的CSD结构域C端35个氨基酸突变体,截短后的Tcd1Δ35在亲本大核上能形成点状分布,在新大核上围绕核膜形成致密结构,类似于野生型。截短CSD结构域C端53个氨基酸后Tcd1Δ53在有性生殖时期不能定位在亲本大核以及新大核上,而是分散在整个细胞质中。
  本研究首次鉴定了四膜虫中TCD1存在两个不同转录本TCD1和TCD1β,Tcd1和Tcd1β具有不同的定位模式,Tcd1定位在亲本大核和新发育大核,而Tcd1β定位细胞质。TCD1敲除突变体进行正常无性生殖,但有性生殖后代不能存活。TCD1敲除的突变体细胞有性生殖过程中内部删除序列R元件的删除受阻,新大核DNA不能正常修复,表明Tcd1参与大核基因组重排和修复过程。突变Tcd1的chromodomain模体CD1影响Tcd1从亲本大核向新大核的转运;同时突变CD1和CD2后,Tcd1在亲本大核和新大核上的定位异常;截短C端CSD的53个氨基酸后Tcd1不能定位在细胞核上而是分布在胞质中,表明Tcd1的3个保守功能结构域具有不同的功能,共同决定了Tcd1的定位和功能。
[硕士论文] 吴金龙
微生物学 中南民族大学 2016(学位年度)
摘要:本实验室从土壤中分离得到了一株具有抗农作物病原真菌活性的链霉菌ⅡR21菌株,对其抗真菌活性、发酵条件、抗真菌化合物分离纯化、attB位点以及全基因组等方面进行了研究,为新型农用抗生素的开发奠定基础。利用琼脂块法和杯碟法测定链霉菌ⅡR21菌株次级代谢产物对七种指示菌的抑菌活性,链霉菌ⅡR21菌株的菌块和发酵上清液对稻瘟病菌168菌株、稻瘟病菌NO-1菌株、立枯丝核病菌的抑菌圈直径都达到了40 mm以上;同时,链霉菌ⅡR21菌株的菌块和发酵上清液对禾谷镰刀病菌、黄色镰刀病菌及腐霉病菌的生长也具有一定的抑菌活性。
  本研究主要内容包括:⑴发酵培养基为优化菌丝体发酵培养基时,链霉菌ⅡR21菌株发酵液抑菌活性较高,抑菌圈直径达到了53.31 mm。发酵时间为第7天时,链霉菌ⅡR21菌株发酵上清液的抑菌活性较高,抑菌圈直径为49.40 mm。培养温度为30℃时,链霉菌ⅡR21菌株发酵上清液抑菌圈较大,抑菌圈直径52.30 mm。转速为180 r/min时,链霉菌ⅡR21菌株的发酵上清液抑菌圈直径较大,为50.02 mm。从而确定了链霉菌ⅡR21菌株发酵培养基为优化菌丝体培养基,培养时间为7天,发酵温度为30℃,转速为180 r/min。⑵利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇作为萃取剂,对链霉菌ⅡR21菌株发酵滤液进行萃取,发现发酵液中有效抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯部位。进一步通过薄层层析和硅胶柱层析对链霉菌ⅡR21菌株乙酸乙酯粗提物进行分离,最终获得F1、F2和F3三个活性较好的组分,三个活性组分的抑菌圈直径分别为21.26 mm、47.28 mm和30.78 mm。利用制备型高效液相色谱对活性组分进行纯化,从F1组分中分离到1个纯度在90%以上的具有抗真菌活性的化合物单体。⑶以链霉菌ⅡR21菌株总DNA为模板,引物为通用引物,利用PCR技术获得了链霉菌ⅡR21菌株的attB位点序列,链霉菌ⅡR21菌株的attB位点序列长269 bp,与Streptomyces. natalensis的attB位点核心区域的序列的相似度最高,达到92%,具有发生交换的核心区域5’-TT。含有ΦC31attP位点的整合型质粒pSET152通过attP位点能与链霉菌ⅡR21菌株的染色体上的attB位点发生位点特异性重组。⑷对链霉菌ⅡR21全基因组的580个contigs进行次级代谢产物合成基因簇分析,共预测得到61个contigs含有合成基因簇,其中6个已知合成基因簇分别合成的6种产物具有抗真菌活性(BE-14106、Ambruticin、Clavams、Dorrigocin/migrastatin、ECO-02301、Lactimidomycin);对 Contig51中的基因合成簇的分析,表明链霉菌ⅡR21菌株具备合成clavams代谢产物的相关基因。
[硕士论文] 刘琳
细胞生物学 中南民族大学 2016(学位年度)
摘要:为了研究禽类多瘤病毒(Avian polyomavirus,APV)晚期基因多顺反子翻译起始调控机制,Agno-1a前导蛋白对下游VPs蛋白合成的调控机制的影响作用。设计构建一系列新型cDNA重组病毒,在agno-1a mRNA编码序列的ATG区域,设计插入一个和插入两个含有ATG的最佳翻译起始信号的7个氨基酸in-frame片段。在agno-1a编码mRNA序列的ATG区域,设计PCR点突变,使起始密码子ATG变成ACG或CTG,从而关闭agno-1a的翻译并可能改变关键mRNA二级结构,形成ATG突变型重组克隆。片段插入型克隆:SDS碱裂解法,提取APV cDNA克隆pHL1003质粒DNA,用限制性内切酶Acc I部分酶切,得到回收的载体片段,人工合成的27bp DNA并磷酸化的目的片段,经T4连接酶与载体片段连接,筛选阳性重组质粒,通过测序验证,得到片段插入型 cDNA克隆 pHL1003+1、pHL1003+2。点突变型克隆:用限制性内切酶 Nco I完全酶切和Acc I部分酶切pHL1003质粒DNA,得到载体片段,设计PCR点突变起始密码子ATG变为ACG和CTG的目的片段,与载体片段连接,筛选阳性克隆测序验证。设计构建GFP为下游报告基因荧光标记的APV-1晚期基因真核双顺反子表达载体,以 EGFP报告基因替代野生型病毒 APV-1编码晚期结构蛋白 VPs基因的碱基序列。pHL1003质粒DNA为模板,PCR扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期 agno-1a区序列,作为载体片段,载体片段黏性末端补齐平末端连接后,得到重组质粒pHL1003-1(可作为Agno-1a蛋白表达质粒)。质粒DNA pEGFP-N1为模板, PCR扩增出编码绿色荧光蛋白的EGFP片段,作为目的片段与上述载体片段经T4连接酶连接,构成重组质粒pHL1003-GFP,测序验证。用限制性内切酶NruI和NedI双酶切 pHL1003+1、pHL1003+2和 pHL1003-GFP,得到目的片段和载体片段连接,构建pHL1003+1-GFP,pHL1003+2-GFP克隆。
  本研究通过磷酸钙和脂质体的转染方法,将构建的cDNA突变型质粒DNA,分别定量转染到鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,分别利用Western blot和荧光显微镜观察检验。Western blot结果显示出部分特异性条带,荧光显微镜观察转染72 h后的鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光。结果表明,GFP荧光标记的APV-1真核双顺反子 cDNA表达载体在鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞中正常表达了 GFP蛋白并产生荧光。转染实验过程中,对转染过程的时间,转染质粒DNA的用量和转染过程中培养基pH等方面条件不断优化,提高了转染效率。根据不同质粒DNA组合转染不同染禽类胚胎原代细胞及其荧光表达量的差异的结果分析提示,在APV晚期基因多顺反子上游基因插入额外起始密码 ATG会影响下游顺反子的翻译;Agno-1a蛋白对其下游基因翻译起始起重要的正调控作用。
[硕士论文] 牛春城
微生物学 中南民族大学 2016(学位年度)
摘要:本研究通过改造M13噬菌体使其在外壳蛋白gp8上展示酪氨酸残基,研究发现铁离子浓度与噬菌体滴度存在联系,在一定范围内铁/亚铁离子浓度与噬菌体滴度的降低率成正比。该酪氨酸展示的M13噬菌体作为生物传感器检测铁及亚铁离子。在对Fe3+的检测中,铁离子浓度在200 nmol/L到8μmol/L与空斑降低率线性相关,检测限达58 nmol/L。在对Fe2+的检测中,亚铁离子浓度在800 nmol/L到8μmol/L与空斑降低率线性相关,检测限达到641.7 nmol/L。同时还使用Ni2+, Pb2+, Zn2+, Mn2+, Co2+, Ca2+, Cu2+, Cr3+, Ba2+, K+等作为干扰离子,发现这种生物传感器对铁及亚铁离子检测专一性较好。这种生物传感器检测铁及亚铁离子的技术有着较好的检测专一性和灵敏度,并无需其他仪器设备的辅助,在工厂、生化实验室等特殊环境下的铁离子快速检测有着独特的优势。HIV-1表面抗原P24蛋白作为一种标志物,在HIV窗口期检测中有着极其重要的作用。通过噬菌体展示技术在M13噬菌体gp3外壳蛋白上展示抗P24蛋白的单链抗体,利用噬菌体ELISA法检测HIV-1表面抗原P24蛋白。首先,PCR扩增p24基因,将其克隆到pET-28a表达载体中,转化BL21大肠杆菌,构建P24蛋白原核表达工程菌。通过IPTG诱导后,BL21大肠杆菌表达P24 His-tag融合蛋白,再通过镍柱纯化及超滤浓缩后得到浓度为1.8 mg/mL的P24蛋白。通过噬菌体ELISA检测P24抗原蛋白,其检测限可达93.5ng/mL。
[硕士论文] 席晓圆
生物化学与分子生物学 中南民族大学 2016(学位年度)
摘要:紫杉醇是一种高效抗癌药物,但其药源植物红豆杉资源匮乏,严重限制了紫杉醇在临床上的广泛应用。采用内生真菌发酵法生产紫杉醇被认为是解决紫杉醇药源紧缺最有前景的途径之一。但由于产紫杉醇内生真菌的产量较低和不稳定等问题,尚无一株产紫杉醇真菌用于工业化生产。筛选出产紫杉醇的真菌菌株,并采用分子育种技术构建紫杉醇稳定高产的基因工程菌株是实现其工业化应用的主要途径,而真菌紫杉醇合成酶类基因的克隆及其功能研究是实现产紫杉醇真菌遗传修饰的前提。
  本研究主要内容包括:⑴从红豆杉树皮的内表皮共分离到90株内生真菌,200株内生细菌。经检测发现:2株真菌可产紫杉醇(Taxol)、巴卡亭III(Baccatin III)和10-去乙酰巴卡亭III(10-deacetyl baccatin III,10-DAB);1株真菌可产紫杉醇和巴卡亭III;2株真菌可产巴卡亭III。2株细菌拟产紫杉醇。其中产紫杉醇真菌MHZ-32初步鉴定为拟茎点霉(Phomopsis sp.)。⑵通过同源性分析共找出与紫杉醇合成相关候选基因(Unigene)16个,并克隆得到16个Unigenes的DNA全长序列及其中12个Unigenes的cDNA全长序列。Southern blot分析结果表明,这些基因均以单拷贝数存在于染色体。qRT-PCR分析结果表明,12个Unigenes响应茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)诱导表现出不同的表达特征,在诱导30 h范围内,1个Unigene表达量上升,4个 Unigenes表达量显著下降,6个Unigenes表达量下降不显著,1个Unigene表达量不稳定,呈现先下降后上升再下降的趋势。⑶分别对UnigeneA09801和A03231序列进行了生物信息学分析。UnigeneA09801的DNA和cDNA全长为1674 bp,不含内含子,编码557个氨基酸;编码蛋白的相对分子量为61291.8 Da,等电点为5.47,分子式为C2717H4201N743O840S18,编码蛋白为亲水性蛋白,不存在跨膜结构和信号肽,N端含有GMC和FAD(flavin adenine dinucleotide)结构域,C端含有GMC结构域。UnigeneA03231的DNA和cDNA全长为918 bp,编码305个氨基酸;编码蛋白的相对分子量为33071.5 Da,等电点为5.69,分子式为C1457H2314N406O448S12,编码蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,含有2个跨膜结构,N端含有ADH(Alcohol dehydrogenases)short C2和ADH short结构域。⑷完成了UnigeneA09801和A03231的原核表达载体构建及其原核表达条件优化。UnigeneA09801的较适诱导表达条件为:诱导温度32℃,IPTG剂量1.2 mM,诱导时间4 h。UnigeneA03231的较适诱导表达条件为:诱导温度28℃, IPTG剂量0.6 mM,诱导时间10 h。在E.coliBL21中,Unigene A09801和A03231的表达产物多为可溶性蛋白。该结果为后期UnigeneA09801和A03231表达产物的纯化及体外催化功能研究奠定基础。⑸构建了真菌表达元载体p元(pOrigin,简称pO),分别构建了UnigeneA09801和A03231的真菌表达载体pO-A09801和pO-A03231。为后期UnigeneA09801和A03231的过表达分析奠定了基础。
[硕士论文] 杨志枫
运筹学与控制论 山东大学 2016(学位年度)
摘要:生物信息学起步于20世纪90年代,是一门新兴的交叉学科.先进的测序技术使得各种生物的基因以及蛋白质序列被大量测出,为生物信息学的研究带来了方便,但与此同时,也产生了海量的生物学数据,为我们如何分析处理这些数据带来了挑战.
  基因的表达调控是一个十分复杂的生物过程,基因调控网络模型的构建也是生物信息学研究的重点与难点.原核生物的表达调控是通过RNA聚合酶与调控因子之间相互作用进行的,调控因子与DNA序列上特定的片段结合,从而调控基因的表达,这些特定的片段通常都具有一定的保守性,我们称之为调控模体.调控模体尤其是转录因子结合位点的准确预测是建立准确的调控网络模型的关键所在,本文中主要对原核生物调控模体进行预测分析.
  在本篇论文中,首先介绍了调控模体预测问题的研究背景和生物学意义,然后对已存在的调控模体预测算法进行了简要的介绍与分析.在此基础上,我们构造一个无向加权图,并设计了一种新的基于图理论的调控模体预测算法MDS,MDS算法主要包含搜索极大团、加点合并、细化三个过程.然后通过结合regulonDB数据库中真实数据与BOBRO,MEME,MotifClick调控模体预测算法进行比较分析可知,MDS算法能够快速地识别调控模体序列同时能够保证了预测结果具有一定的准确性,是一个好的算法.
  本文的创新点在于:设计了一种新的基于图理论的调控模体预测算法MDS,该算法中给出的极大团搜索的方法以及加点合并原则可以得到较多包含真实模体实例的子序列,同时又能减少了一些极大团的重复搜索,能够在保证最终预测结果的准确性的同时降低调控模体的预测时间.
[硕士论文] 孙安徽
微生物学 安徽大学 2016(学位年度)
摘要:目前存在的有生物活性的微生物次级代谢产物中,将近一半是由丝状真菌所产生的,里氏木霉、黑曲霉和产黄青霉等都是其中的典型代表。同时,丝状真菌作为异源蛋白表达的重要细胞工厂有着原核和酵母表达系统无法比拟的优势。因此作为异源表达系统的丝状真菌在发现多种多样的活性化合物等方面发挥着重要的作用,也越来越受到国内外的关注并取得非常显著的研究成果。因此,对真菌次级代谢产物的挖掘具有很重要的科学和实用价值,也为寻找更有效的抗耐药菌的药物提供了天然的聚宝盆,值得科学家们大力开发。丝状真菌的后基因组时代已经开启,不过由于很多丝状真菌的遗传操作和发酵培养体系不完善,或者最终产生的次级代谢产物的产量很低,以及在遗传背景和代谢调控上的复杂性等等问题都阻碍着对这些可能的新型活性化合物进行深入研究,急需科学工作者花很长时间去攻克。本研究中的白僵菌素是一种来自于海洋中筛选的层出镰刀菌Fusariumproliferatum LF061产生的环己缩脂肽类真菌毒素,属于思镰孢家族的一员,具有抗细菌、抗真菌、杀虫、抗病毒和生理毒性的作用。本实验室在2007年发现了低剂量的白僵菌素与低剂量的酮康唑可以发挥很好的互动抗真菌的效果,并且能够显著降低两者的使用剂量和毒副作用,有望成为新型的抗真菌复合药物的潜力。由于Fusarium proliferatum LF061在固体或者液体培养条件下产生白僵菌素的量很不稳定,而且此株菌的基因序列和遗传操作还不是很清楚。所以,我们选择在构巢曲霉中异源表达白僵菌素,期望可以达到较高的产量。
  本文首先构建了包含白僵菌素合成酶和α-酮异戊酸还原酶的共表达载体pYWL21,通过PEG介导的原生质体转化技术将重组质粒整合到构巢曲霉A.nidulans RJMP1.59基因组上。将携带空载体pRG-AMAI的TYAH0和重组质粒pYWL21的TYAH1以及野生型菌株A.nidulans RJMP1.59一起进行摇瓶发酵,LC-MS检测到了白僵菌素在A.nidulans RJMP1.59的成功表达,产量最高达到了0.79mg/L。丝状真菌通常可以大量表达内源蛋白,在表达外源蛋白的时候产量却很低,已有文献报道了这些内源基因可能是由强启动子驱动表达的,因此,我们需要更强的启动子来增强基因的转录效率,进而高效表达目标产物。为了进一步地提高白僵菌素的产量,我们使用了组成型的3-磷酸甘油醛脱氢酶的强启动子gpdAP和木糖诱导型的强启动子xylP来联合表达白僵菌素合成酶或者α-酮异戊酸还原酶。与在构巢曲霉中利用白僵菌素生物合成基因簇中内源性启动子进行异源表达相比,强启动子的驱动表达使得白僵菌素的产量提高了5倍多,最高达到了4.52mg/L。在丝状真菌发酵培养的过程中,微生物的菌体生长形态与发酵产物的种类与产量上有着很大的关联。同时,摸索出更适合的发酵培养基的成分以及发酵工艺对于产量提高也是十分必要的。本论文在优化白僵菌素的产量的时候,起初从无机微粒的添加入手,着力解决发酵液粘稠导致的产量低下问题,接着综合考虑发酵培养的温度、时间和前体供应等,最终得到白僵菌素的产量最高达到了668.97mg/L。通过在构巢曲霉中异源表达白僵菌素合成酶和α-酮异戊酸还原酶成功获得了白僵菌素,并且产量最高达到了668.97mg/L,这些方法和结果一方面为我们继续优化白僵菌素的产量提供了前期基础,另一方面也为挖掘更多的环缩脂肽类化合物提供了新的依据,对发现更多新颖活性化合物具有重要的意义。
[硕士论文] 孟丽君
微生物学 安徽大学 2016(学位年度)
摘要:A型流感病毒是造成人类及动物流行性感冒的单股负链RNA病毒,其不仅对人类和动物的健康产生威胁,同时为社会带来巨大的经济损失。A型流感的有效防控手段通常有两种:一是接种流感疫苗,但由于A型流感病毒存在多种亚型,又常出现抗原漂移,从而致使流感疫苗保护效果不济。二是研发抗病毒药物。也因为耐药性的产生,抗病毒药物的药效也迅速下降。因此研究防控A型流感病毒的新手段刻不容缓。随着宿主因子在病毒复制过程中的重要作用被陆续报道,因此宿主蛋白与流感病毒复制的关系也越来越受到关注。磷酸化修饰则是蛋白质翻译后修饰加工的一种手段,流感病毒当中可通过磷酸化修饰来发挥其重要功能。我们聚焦于影响宿主细胞整体磷酸化水平的宿主因子例如磷酸酶或激酶。希望能够为抗流感病毒新药物提供新的靶点。CDC25B(Cell division cycle25B)是CDC25激酶家族中的重要成员,编码酪氨酸磷酸酶。其通过磷酸化和去磷酸化修饰在细胞周期中发挥重要的作用,过量表达能够促进肿瘤的产生。此外CDC25B对流感病毒的复制也有一定的影响。为了研究CDC25B对A型流感病毒复制的调控,本文利用CRISPR/Cas9(Clusteredregularly Interspaced short palindromic repeats)系统构建了CDC25B低表达水平的HELA细胞系(CDC25B-/-HELA)。将A型流感病毒A/WSN/33(WSN)毒株分别感染CDC25B-/-HELA细胞与WT HELA细胞,发现CDC25B-/-HELA细胞中,流感病毒的复制与转录水平发生明显下调,NP蛋白则出现核内滞留的结果,同时出现vRNP聚合酶活性显著降低等现象。结果证明了CDC25B蛋白能够促进A型流感病毒的复制和转录。本研究进一步阐明了宿主蛋白对流感病毒的调控机制,并为新抗病毒药物的研究提供新的靶点。
  本研究通过A型流感病毒NA蛋白作为抗原,建立间接ELISA(Enzyme linked immunosorbentassay)检测方法来快速检测流感病毒的亚型。实验参照GenBank上H5N1亚型流感病毒的NA基因与氨基酸序列,进行比对其同源性,最终选取A/duck/Shandong/009/2008(H5N1)毒株为目的毒株,其NA蛋白第139-400位氨基酸序列为目的片段。将该基因片段连入质粒pET-28a中,利用大肠杆菌BL21(DE3)进行表达及纯化。以纯化得到的重组蛋白N1作为抗原,构建H5N1亚型流感病毒NA蛋白间接ELISA检测方法。结果得到最佳抗原包被浓度是400ng/孔,血清的最佳稀释倍数为1∶20,酶标二抗稀释度是1∶5000。包被抗原,检测阳性血清P/N=15.579>2.1为阳性,表明重组NA蛋白具有强抗原性。对该ELISA方法进行重复性试验、种内和种间试验特异性试验以及批内批间试验,结果表明该间接ELISA方法具有较高的特异性、敏感性以及重复性。此方法为N1亚型的流感病毒的检测与诊断提供一定的科研依据,并为以NA蛋白为基础的流感病毒检测试剂盒的研发奠定了基础。
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