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[博士论文] 张莹
生理学 延边大学 2017(学位年度)
摘要:研究表明,磷脂酶A2(phopholipase A2,PLA2)促使心脏未脂质化花生四烯酸(arachidonic acid, AA)的累积,进而衍生前列腺素(prostaglandins,PGs)。各种PGs以不同亲和力结合不同的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR),参与调节心肌肥大、纤维化、梗死等多种心脏疾病的病理过程。
  PGD2是1973年被发现的PGs一员,造血型前列腺素D合成酶(hematopoieticPGD synthase,H-PGDS)和载脂蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-type PGDsynthase,L-PGDS)是催化PGH2生成PGD2的两种酶。PGD2可通过其代谢产物15-deoxy-△12,14-PGJ2(15d-PGJ2)激活过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activate receptorγ,PPARγ),从而发挥抗炎、抗凋亡和镇定动脉粥样硬化的作用。PGD2也具有抵制缺血、缺氧和保护心脏的作用。
  作为内分泌腺的心房合成和分泌心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP),其分泌受较多因素的调控,但血容量增加导致心房壁的牵张是调节ANP分泌的主要因素。研究表明,心房牵张、缺血、内皮素等因素最终能通过影响AA代谢并生成多种PGs调节心房ANP的分泌,如PGF2α和PGE2促进大鼠心房ANP的合成和分泌;PGF2α,PGE2和PGI2浓度依赖性地促进ANP分泌。虽然也有研究报道,PGD2促进ANP的分泌,但其作用机制尚不清楚。
  因此,本研究利用大鼠离体搏动的心房灌流模型,采用放射免疫技术检测心房ANP的含量,利用蛋白免疫印迹技术(Western blot,WB)分析心房肌组织PPARγ蛋白含量,观察PGD2对大鼠心房ANP分泌及其机械活动的影响,并探讨PPARγ、促分裂元活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路对PGD2促进心房ANP分泌的作用。
  本研究结果如下:
  1.不同剂量的PGD2(0.1,1.0和10.0μmol/L)明显增加ANP的分泌和心房搏动压(与对照组相比,均P<0.05),并呈现一定的时间依赖性特征(1.0μmol/L的PGD2;与对照循环比较,P<0.05)。
  2.PGD2受体抑制剂AH6809(1.0μmol/L)可完全阻断PGD2促进心房ANP分泌及其正性肌力作用(与对照循环比较,均P>0.05)。而且PGF2α受体抑制剂AL8810(1.0μmol/L)也可完全消除PGD2对心房ANP分泌和机械活动的作用(与对照循环比较,P>0.05)。
  3.PGD2的代谢产物15d-PGJ2(0.1μmol/L)也显著增加心房ANP的分泌(与对照循环相比,P<0.05),该作用与PGD2的作用相似。另外,15d-PGJ2明显抑制心房搏动压(与对照循环相比,P<0.05)。PGD2受体抑制剂AH6809不仅能完全阻断15d-PGJ2促进心房ANP分泌的效应,而且还可完全解除15d-PGJ2对心房的负性肌力作用(与对照循环比较,均P>0.05)。
  4.PPARγ抑制剂GW9662(0.1μmol/L)可完全阻断PGD2及其代谢产物促进心房ANP分泌的效应(与对照循环相比,均P>0.05),而且也可完全解除PGD2及其代谢产物对心房机械活动的作用(与对照循环相比,均P>0.05)。另外,PGD2能显著增加心房肌组织PPARγ蛋白含量(与对照组相比,P<0.05),该作用可被GW9662所完全阻断(与PGD2组相比较,P<0.05)。
  5.MAPK/ERK的抑制剂PD98059(10.0μmol/L)明显减缓PGD2促进心房ANP分泌的作用(与对照循环相比,P<0.05),同时完全阻断PGD2对心房的正性肌力效应(与对照循环相比,P>0.05)。另外,PI3K/Akt的抑制剂LY294002(1.0μmol/L)与PD98059的作用类似,也明显抑制PGD2促进心房ANP分泌的作用(与对照循环比较,P<0.05),但未能改变PGD2的正性肌力效应(与对照循环比较,P<0.05)。
  以上结果提示:
  1.PGD2通过激活PPARγ信号通路促进离体搏动大鼠心房ANP的分泌,并发挥正性肌力作用;
  2.MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路可部分地参与调节PGD2的作用过程。
  第二部分:HIF-1α-L-PGDS-PPARγ对缺氧诱导心房ANP分泌的影响
  载脂蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-type prostaglandin D synthase,L-PGDS)是一种低分子糖蛋白。研究发现,L-PGDS在心脏中有表达,而且被认为是评价心血管疾病风险的新型生物标志物。
  缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是异二聚体的转录因子,也是激活缺氧易感基因的核心调控因子。研究证实,缺氧强烈促进ANP的分泌,并促使细胞适应缺氧环境和保护缺血性心脏。另外有研究报道,在人和鼠类肥大的心肌组织中HIF-1α和过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisomeproliferator-activate receptorγ,PPARγ)的含量均明显增加,而且HIF-1α可直接激活PPARγ的转录使其发挥关键的下游效应。由于L-PGDS可催化PGH2生成PGD2,而PGD2的代谢产物15-deoxy-A12,14-PGJ2(15d-PGJ2)是PPARγ内源性配体,所以对心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用。然而,在缺氧条件下HIF-1α-PPARγ信号通路是否参与调节缺氧诱导的心房ANP分泌尚不甚清楚,而且缺氧诱导的心房L-PGDS是否参与调节HIF-1α对PPARγ的转录过程也不清楚。
  本研究假设,急性缺氧时HIF-1α通过激活心房L-PGDS的途径激活PPARγ信号通路,从而参与调节缺氧诱导心房ANP分泌的过程。因此,本研究利用离体搏动的大鼠心房灌流装置制备急性缺氧模型,采用放射免疫、Western blot技术和生理学及药理学等方法,选用相应抑制剂探讨并证明上述假设,为研究和阐明HIF-1α调控缺氧诱导心房ANP分泌的作用及其机制提供必要的理论和实验数据。
  本研究结果如下:
  1.缺氧以时间依赖性地强烈促进心房ANP的分泌,其分泌在缺氧第四循环末(约在缺氧后48 min)达到峰值(与对照循环比较,P<0.05),并伴随心房搏动压的显著抑制(与对照循环比较,P<0.05)。
  2.缺氧明显增加心房肌组织HIF-1α的含量(与对照组比较,P<0.05),并显著增加心房ANP的分泌(与对照循环比较,P<0.05)。而HIF-1α的抑制剂rotenone(0.5μmol/L)不仅可完全阻断缺氧增加HIF-1α含量的作用(与单纯缺氧组比较,P<0.05),而且也可明显减缓缺氧增加心房ANP分泌的效应(与对照和第四单纯缺氧循环比较,均P<0.05)。
  3.缺氧明显增加心房肌组织L-PGDS含量(与对照组比较,P<0.05)。L-PGDS的两种抑制剂AT56(5.0μmol/L)和HQL49(5.0μmol/L)可显著减缓缺氧增加心房肌组织L-PGDS含量的效应(与对照组比较,均P<0.05;与缺氧组比较,均P<0.05);同时也显著减缓缺氧诱导心房ANP分泌的作用(与对照和第四单纯缺氧循环比较,均P<0.05)。
  4.PPARγ抑制剂GW9662(0.1μmol/L)明显减缓缺氧增加心房ANP分泌的效应(与对照循环比较,P<0.05;与单纯缺氧比较,P<0.05)。该作用与HIF-1α的抑制剂rotenone和L-PGDS的抑制剂AT56对缺氧诱导ANP分泌的作用类似(与对照循环比较,P<0.05;与单纯缺氧比较,P<0.05;与rotenone和AT56比较,均P>0.05)。
  5.缺氧显著增加心房肌组织PPARγ的含量(与对照组比较,P<0.05)。而rotennone不仅可完全阻断缺氧增加心房肌组织L-PGDS含量的作用,也可完全解除缺氧对PPARγ的效应;AT56则可模仿rotennone对缺氧心房PPARγ的抑制作用(与对照组比较,均P>0.05;与缺氧组比较,P<0.05)。另外,将rotennone和AT56联合预处理时,其对PPARγ,的阻断效应要比各自的效应呈现微弱的叠加趋势,但与各自比较未呈现显著性差异(与rotenone和AT56比较,均P>0.05)。
  以上结果提示:
  1.急性缺氧可通过HIF-1α激活L-PGDS并参与调节离体搏动大鼠心房PPARγ的活性;
  2.HIF-1α-L-PGDS-PPARγ通路是缺氧促进心房ANP分泌的重要机制之一。
  
[硕士论文] 芮立
免疫学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:血管新生(angiogenesis)是指胚胎血管发育过程中原始血管丛重建形成具有成熟结构和功能的血管网络的过程,包括血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成等。血管新生受多种因子调控,包括血管内皮生长因子-A(VEGF-A)/VEGFR-2、血管生成素(angiopoietin,ANGPT1-4)/受体酪氨酸激酶(TIE,TIE1-2)TIE2受体等介导的信号途径。其中,VEGF-A与ANGPT2在血管新生中起重要的协同作用,而ANGPT1-TIE2信号通路在血管内皮细胞存活、血管完整性建立与维持过程中起重要作用。另外,体内还存在可溶性TIE2(sTIE2),sTIE2是由金属蛋白酶水解TIE2胞外区后形成,其同样具有结合ANGPT1和ANGPT2的结构域。目前对于sTIE2的生物学作用及其对TIE2信号途径的调节机制还不完全了解。
  本研究利用在皮肤过表达TIE2胞外配体结合区(1-360aa)与人免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白的转基因小鼠(Keratin14-TIE2Ig,简称 K14TIE2Ig)、以及ANGPT2基因敲除(ANGPT2-/-)小鼠模型,研究可溶性TIE2Ig在体内过表达后对皮肤血管生成的影响与作用机制。所进行的实验包括TIE2Ig表达分析、皮肤组织学分析、皮肤血管新生分析、利用 ANGPT2基因敲除小鼠开展的表型挽救(rescue)与相关分析。研究结果为:TIE2Ig主要在皮肤基底细胞和皮脂腺及毛囊中表达,出生两周后其在皮肤基底细胞层的表达明显下降;TIE2Ig转基因小鼠表皮层明显增厚,增殖分析表明皮肤基底层的基细胞大量增殖。同时在出生两周后,毛囊和皮脂腺也发现不正常的增生表型;令人意外的是,我们观测到紧靠表皮层的真皮组织中血管新生显著增加,但转基因小鼠皮肤组织中免疫细胞的数量与对照组无明显差异,这与之前的关于 sTIE2抑制血管新生的认识明显不同;利用ANGPT2敲除小鼠与 K14TIE2Ig制备双重转基因小鼠,表型挽救(rescue)实验表明,敲除ANGPT2可部分逆转TIE2Ig转基因小鼠皮肤组织中血管新生增加的表型;由于ANGPT2在淋巴管发育与成熟中起重要作用,分析了K14TIE2Ig小鼠皮肤组织中的淋巴管,结果表明皮过表达TIE2Ig对淋巴管发育没有明显影响。在正常血管发育中,ANGPT1、ANGPT2和其共同受体TIE2处于动态平衡。在皮肤基底细胞过表达TIE2Ig可能破坏了这种平衡,导致血管生成异常。值得指出的是,由于ANGPT1与ANGPT2在血管发育中存在相互颉抗关系,因此过表达可溶性TIE2对血管生成的作用可能取决于其所结合的两种配体之间的比例,详细的下游信号机制有待进一步研究。
[硕士论文] 郝春辉
衰老生物学 杭州师范大学 2015(学位年度)
摘要:本文对MiR-126在端粒功能障碍小鼠造血干细胞功能上进行了研究。microRNA是在真核生物中发现的内源性并且具有调控功能的非编码RNA,很多文献报道microRNA信号通路参与造血干细胞(HSC)的稳态维持和再生。但在端粒功能障碍小鼠模型中针对miRNA调控途径还没有相关的研究工作,利用已有的两种基因缺陷小鼠模型(miR-126条件敲除小鼠模型和端粒功能障碍小鼠模型)研究miR-126对HSC稳态维持和衰老的影响;并进一步确定miR-126在HSC中的靶基因。对于阐明miR-126参与 HSC衰老的分子机制有重要的科学意义。实验结果显示正常生理状态下miR-126条件敲除小鼠骨髓中的造血干细胞数目增多,髓系粒系祖细胞数目增多,脾脏变大,脾脏中造血干细胞(LSK)比例增加,进一步染色检测脾脏中髓系粒细胞比例增加。为了研究骨髓中造血干细胞数目增多的原因,对miR-126基因条件敲除小鼠造血干细胞细胞周期进行了分析,miR-126基因条件敲除小鼠造血干细胞G0期比例降低,而G1,S/G2/M比例升高。 Brdu实验结果显示:miR-126基因条件敲除小鼠与对照小鼠相比Brdu+比例升高。对小鼠全骨髓细胞中造血干细胞进行了凋亡的检测发现miR-126基因条件敲除小鼠的造血干细胞较对照凋亡细胞比例没有差异。证明骨髓中造血干细胞增多是由于G0期细胞减少的原因和细胞凋亡无关。Q-PCR检测WT和G3小鼠造血干细胞(LSK)中miR-126表达情况,发现G3小鼠造血干细胞中miR-126表达和WT相比出现明显下调,为了验证其表达下调的原因,在WT和G3小鼠造血干细胞中过表达miR-126,竞争性骨髓移植后每个月检测外周血嵌合率发现miR-126基因过表达使WT和G3小鼠的骨髓干细胞自我更新能力减弱,证明G3 Terc-/-小鼠中miR-126的表达下调是对端粒功能障碍的一种保护机制。
[硕士论文] 蔡金洋
细胞生物学 苏州大学 2014(学位年度)
摘要:本文对造血系统上下游细胞自噬机制的构架以及功能进行了比较研究。细胞自噬在各类哺乳动物细胞中起维持稳态作用,研究表明自噬功能的缺失或者异常与各种疾病有着直接或者间接的联系。然而造血干细胞与成熟体细胞中自噬机制的构架及其作用是否存在差异目前尚不明了。为探索回答这一科学问题,我们构建了两种组织特异性基因敲除小鼠模型,在造血系统的上下游分别对自噬相关基因Atg7进行敲除。Atg7基因是自噬关键基因,对于自噬体的形成必不可少,它编码的Atg7蛋白在自噬体形成中的两个泛素连接体系中发挥作用。通过研究发现造血系统上游即干细胞层面Atg7基因敲除导致经典自噬功能缺失,造血功能衰竭最终小鼠死亡;在造血系统的下游如分化的髓系细胞中Atg7基因敲除并不会影响小鼠的表型,细胞功能正常,在成熟髓系细胞中Atg7依赖性自噬的缺损引起非经典型自噬中的正调控因子ULK1,PI3KC3,Beclin1和Rab9上调,其自噬活性能被非经典型自噬的特异性抑制剂BFA所抑制。由此推论,在成熟的体细胞中当经典型自噬失去功能时,非经典型自噬会发挥补偿作用,而造血干细胞只能依靠Atg7依赖性的经典型自噬。这为我们更好的理解造血系统中发生造血干细胞恶性转化的始因及其今后的人工干预提供了新的视野。
[博士论文] 李专
发育生物学 西南大学 2013(学位年度)
摘要:造血干细胞是不可或缺的,它为整个生命体提供不同阶段、所有类型的血细胞。造血干细胞的发育起源,包括位点、时间、调控机制等,长期以来广受关注。众所周知,AGM区是小鼠胚内唯一的造血干细胞发生位点。然而,既往研究发现去除AGM区之外的胚胎体细胞仍然能够重建成年受体的造血系统,提示胚内可能还存在其他未知的造血位点。
  本研究拟通过多种手段明确小鼠胚胎头部的造血干细胞潜能和命运。我们通过体内移植实验发现:E10.5时,移植1.7-2.5个胚胎量的AGM区细胞,大约30%(14/40)的受体长期重建(>16周),嵌合率46.6%±22.4%。而移植头部细胞,12%(5/40)的受体长期重建,嵌合率57.2%±22.9%。但移植循环血细胞后,均未检测到嵌合阳性信号。E11.5时,头部细胞移植后,40%(8/20)的受体长期重建,嵌合率54.6%±23.8%,而AGM区60%(9/15)受体长期重建,嵌合率47.9%±20.9%。同时,通过各系嵌合以及二次移植明确E10.5和E11.5的头部含有真正的造血干细胞,能多向分化和自我更新。通过流式分选后移植,发现头部造血干细胞富集于CD34+c-Kit+细胞群。
  我们利用流式技术对E9.5-E11.5小鼠胚胎头部和AGM区进行分析,发现均含有相当比例的CD34+c-Kit+、CD41+c-Kit+、CD45+c-Kit+细胞。同时,我们也利用实时定量PCR检测造血、内皮相关基因的表达,发现E10.5头部的Scl、P2-Runx1、GATA2的转录水平是相应AGM区的1.5、1.6、2.3倍,而Tie2、CD144表达水平相当。在Tie2+以及CD31+c-Kit+细胞群中,无论E10.5还是E11.5,头部细胞Scl、P2-Runxl、GATA2的表达水平均与AGM类似。
  继而,我们通过原位染色、流式分析、纯化内皮细胞体外诱导和内皮细胞命运示踪考察小鼠胚胎头部的内皮细胞是否具有生血潜能。首先我们采用免疫组化染色发现E10.5的头部紧贴动脉内皮层有CD31+的造血样细胞,或成簇或散在。通过流式分析发现,E10.5头部的CD31+c-Kithigh比例为0.063%-0.113%,稍低于AGM区(0.088%-0.157%)。其次,通过流式分选获得头部内皮细胞(CD31+CD41-CD45Ter119-),与OP9共培养后可产生CD45+的造血细胞和CD19+的B细胞,与AGM相似。应用可诱导的VE-cadherin-Cre;tdTomato小鼠模型发现,头部细胞产生的一些造血簇共表达红色荧光蛋白和CD45,即tdTomato+CD45+,表明内皮生血活动的发生,与AGM区类似。流式分析确认tdTomato+细胞中的大部分为CD45+。相反,该现象在循环血细胞并未发现。
  SP-A-Cre转基因小鼠模型可特异性标记脑组织而非其它位点的血管内皮细胞,适合用于追踪脑血管内皮细胞的造血命运。首先我们将E12.5的SP-A-Cre;ROSA-LacZ小鼠胚胎进行LacZ染色,相应的头部切片中,发现在动脉内皮层和动脉管腔内的造血细胞有LacZ阳性信号,一些LacZ阳性的血细胞可能是通过出芽的方式由内皮细胞层产生。类似的阳性信号在AGM区和胎肝中并未发现。
  我们也通过原代细胞的流式分析和体外诱导考察SP-A-Cre;ROSA-LacZ胚胎头部细胞的造血能力。E13.5的SPA-Cre;ROSA-LacZ头部CD31+内皮细胞中,10.5%为FDG+,而CD45+的造血细胞中,4.6%为FDG+。头部的Tie2+细胞与OP9共培养之后,CD31+内皮细胞中20%为FDG+,CD45+造血细胞中8.4%为FDG+,造血祖细胞CD45+c-Kit+中,12.3%为FDG,B细胞(B220+CD19+)中,27.6%为FDG+。这表明:小鼠胚胎的脑血管内皮细胞具有原位生血和体外造血的能力。
  最后,我们对不同年龄的SP-A-Cre;ROSA-LacZ、SP-A-Cre;ROSA-EYFP小鼠进行检测以评估脑血管内皮细胞对成体造血系统的生理贡献。我们发现,出生后2周的SP-A-Cre;ROSA-LacZ小鼠的骨髓,富集造血干细胞的LSK(LinSca-1+c-Kit+)亚群中,LacZ阳性的细胞比例较低,1.1%-1.3%。4周龄小鼠的骨髓中,在富集造血干细胞效率更高的亚群,即LSKCD48-CD150+,LacZ阳性细胞的比例为4.2%-4.5%。我们也考察了4-6周龄的SP-A-Cre;ROSA-EYFP小鼠造血各系的情况,发现骨髓的LSKCD48-CD150+细胞中,EYFP阳性细胞的比例为5.9%-7.7%。骨髓和外周血各系均有更高比例的EYFP阳性细胞。上述命运示踪的结果进一步明确了脑血管内皮细胞对血液系统的生理性贡献。
  总之,我们通过检测小鼠胚胎头部的造血干细胞功能,考察脑血管内皮细胞的生血潜能,以及评估脑血管内皮细胞对胚胎和成体造血系统的生理贡献,在国际上首次揭示小鼠胚胎头部是一个新的的造血干细胞发育位点。新的生血位点的发现,有望进一步明晰血管内皮细胞选择造血干细胞命运的关键调控信号,为造血系统的再生提供新思路和新策略。
[硕士论文] 陆奇明
生物化工 上海交通大学 2013(学位年度)
摘要:研究表明,血流切应力变化是影响血管重建的重要因素,与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关。血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)直接承载血流切应力刺激,并通过细胞间相互作用影响血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)。研究ECs与VSMCs间的相互交流,以及切应力下的细胞功能变化,有助于阐明血管重建的力学生物学机制。
  我们通过前期蛋白质组学的工作,得到了15 dyn/cm2正常切应力(normal shear stress,NSS)和5 dyn/cm2低切应力(low shear stress,LowSS)条件下体外培养的血管组织差异表达的蛋白质谱。对比发现,活化激酶C1受体(receptor for activated C kinase1,RACK1)在LowSS作用下的血管组织中呈高表达,提示 RACK1可能参与了LowSS诱导的血管重建。
  本文应用ECs/VSMCs联合的培养流动腔系统,检测静态(static)、NSS和LowSS条件下联合培养大鼠ECs和VSMCs表达RACK1及Akt磷酸化水平。同时,为探讨应力调控的上述变化是通过 ECs与VSMCs的直接接触或是通过旁分泌作用,本文设计了ECs//VSMCs隔开培养的体系,同样检测静态、NSS和LowSS条件下ECs和VSMCs的RACK1表达状况及Akt磷酸化水平。此外,本文还在静态条件下,应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特异性抑制VSMCs内RACK1表达,探讨RACK1对细胞凋亡和Akt磷酸化水平的作用。
  结果显示:①切应力与VSMCs对ECs的RACK1表达均无显著影响;② LowSS与细胞直接接触共同诱导VSMCs表达RACK1,NSS、LowSS与旁分泌共同阻遏VSMCs表达RACK1;③ NSS和LowSS都可能抑制ECs的Akt磷酸化;④旁分泌参与NSS对VSMCs的Akt磷酸化的促进作用;⑤抑制VSMCs的RACK1表达下调细胞凋亡和caspase-3表达,上调Akt磷酸化。
  上述结果表明,LowSS条件下,ECs通过直接接触作用诱导VSMCs的RACK1表达;切应力对ECs与VSMCs的Akt磷酸化水平的诱导作用不同,NSS和LowSS均抑制ECs的Akt磷酸化,但NSS的抑制作用更强,而NSS则促进VSMCs的Akt磷酸化;RACK1可能通过PI3K/Akt信号通路参与切应力对细胞凋亡的调控。结果提示,ECs与VSMCs之间的相互接触和联系,对维持血管的正常结构与功能的稳定有重要作用。
[博士论文] 聂丽
生理学 华中科技大学 2012(学位年度)
摘要:目的:心脏缺血缺氧是目前临床上死亡率最高的病因之一,心脏在发生缺血缺氧后会产生预调制和慢性缺氧适应这两种保护性作用,KATP被认为是唯一参与该过程的离子通道。已经发现哺乳动物胚胎对缺氧的耐受性明显高于成年动物,这可能和离子通道的发育依赖性变化有关。因此本文旨在探讨KATP通道随小鼠胚胎心脏发育特性,以及该通道在生理和缺血缺氧状态下的功能变化。方法:分离早晚期小鼠胚胎心室,胶原酶B消化得到单个跳动心室肌细胞。以pinacidil作为 KATP的特异性开放剂,glibenclamide作为膜KATP特异性阻断剂,电流钳记录该通道在生理状态下功能的发育依赖性变化,电压钳记录KATP的电生理学特点。以glibenclamide或5-HD分别作为膜KATP或线粒体KATP的阻断剂,电流钳记录该通道在急性缺血缺氧状态下发挥的作用。采用RT-PCR和Western blot研究构成KATP的亚单位Kir6.1、Kir6.2、SUR1及SUR2在心室肌细胞膜和线粒体上表达的发育依赖性变化。结果:生理态下状,KATP特异性开放剂pinacidil使早晚期心室肌细胞动作电位时程缩短,晚期心室肌细胞膜电位发生超极化,而对早期心室肌细胞膜电位水平没有影响。KATP特异性阻断剂则对早晚期心室肌细胞动作电位无明显作用。电压钳数据表明随胚胎心脏发育,心室肌细胞KATP电流密度并没有发生显著改变。急性缺血缺氧时,早期心室肌细胞停跳率达62.5%,同时伴随有动作电位时程的缩短,晚期心室肌细胞则没有发现停跳,但同时伴随有动作电位时程的缩短及膜的超极化。急性缺血缺氧同时应用阻断剂阻断膜KATP后,早期心室肌动作电位时程反而延长,停跳率下降,晚期心室肌细胞膜反而去极化,42.8%细胞发生停跳。急性缺血缺氧同时应用阻断剂阻断线粒体KATP后,早晚期心室肌细胞对急性缺血缺氧的反应并无明显改变。RT-PCR及Western blot结果显示Kir6.1、SUR1及SUR2均随发育依赖性表达增加,而Kir6.2表达无明显差异。细胞膜蛋白检测结果显示膜KATP上无SUR1的表达,Kir6.1及SUR2的表达呈发育依赖性增加,Kir6.2表达无明显差异。对线粒体蛋白检测结果显示线粒体KATP上无SUR2的表达,Kir6.1、Kir6.2及SUR1均在线粒体上表达,但各亚单位随胚胎发育并无明显变化。免疫荧光染色发现SUR1在细胞膜上并不表达,其余各亚单位在早晚期心室肌细胞膜均有表达。结论:随着胚胎心脏的发育,膜KATP在急性缺血缺氧过程中发挥明显不同的作用,线粒体KATP则在急性缺血缺氧过程中并未起到明显作用。组成膜KATP亚单位包括Kir6.1、Kir6.2及SUR2,且Kir6.1和SUR2的表达呈发育依赖性增加。组成线粒体KATP的亚单位包括Kir6.1、Kir6.2和SUR1,各亚单位的表达随发育并未发生明显变化。
  目的:胸腺肽β4是一种能促进细胞迁移、存活和分化的细胞内小分子多肽。然而,它在小鼠胚胎干细胞增殖和向心血管系统分化中的作用仍未被研究。因此本文阐述了胸腺肽β4对小鼠胚胎干细胞增殖和分化的作用。方法:小鼠胚胎干细胞增殖和分化过程中的目的基因通过RT-PCR,real-time PCR检测,通过Western blotting和流式细胞术检测目的蛋白的表达水平。运用膜片钳技术研究胚胎干细胞分化的心肌细胞的电生理特性。结果:研究发现胸腺肽β4呈部分浓度依赖性的抑制了D3系小鼠胚胎干细胞增殖,同时下调了细胞周期调控基因c-myc,c-fos及c-jun的表达。对信号通路的研究发现胸腺β4抑制了STAT3和Akt的磷酸化,促进RAS和磷酸化ERK的表达,而对BMP2/BMP4和下游蛋白smad均无作用。胸腺肽β4使得Wnt3和Wnt11的表达明显下降,同时伴随着Tcf3表达的上调,β-catenin的表达则不变。在胚胎干细胞分化过程中,胸腺肽β4对a-MHC,PECAM,a-SMA的表达并无影响,并且由胚胎干细胞分化而来的心肌细胞其电生理特性和对激素的调节均不受胸腺肽β4影响。结论:胸腺肽β4通过激活STAT3,Akt,ERK和Wnt等途径抑制小鼠胚胎干细胞增殖。然而,对小鼠胚胎干细胞向心血管系统的分化并无影响,也不影响胚胎干细胞源性的心肌细胞的成熟。
[硕士论文] 乔淑敏
儿科学 苏州大学 2012(学位年度)
摘要:一、人脐带间充质干细胞培养及超微结构观察
   目的:分离培养足月新生儿脐带间充质干细胞,进行超微结构观察。
   方法:用胶原酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,进行传代培养、扩增,显微镜下观察细胞形态。培养至3代的间充质干细胞进行免疫表型测定,进行成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞诱导分化实验,并在透射电镜、扫描电镜下进行超微结构的全面观察。
   结果:人脐带间充质干细胞外观呈梭形和多角形,并可见细胞核;高表达CD44,CD73,CD105,不表达CD34,CD45,CD31和HLA-DR;能够进行成脂、成骨、成软骨分化;扫描电镜下可见细胞表面有短而粗的微绒毛突起,透射电镜下可见到两种不同的细胞形态。一种是处于静止期,细胞核大,圆或卵圆形,仅有一个核仁,胞质内细胞器少;另一种是处于相对活跃期,同一个细胞内可以看到1个或2个细胞核,细胞器数量丰富、结构清晰,并可见扩张的线粒体。
   结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞的生物学特性,具有两种不同状态的超微结构。
   二、脐带间充质干细胞治疗儿童异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病疗效观察
   目的:观察人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)治疗儿童急性移植物抗宿主病疗效和安全性。
   方法:用胶原酶消化法分离培养人脐带间充质于细胞,进行传代培养、扩增,培养至第3-5代用于临床治疗;5例急性白血病患儿经化疗达完全缓解。2例行亲缘HLA3/6相合的骨髓造血干细胞移植,1例行同胞HLA全相合骨髓与外周血造血干细胞联合移植,1例行无血缘相关HLA4/6相合双份脐血造血干细胞移植,1例行无血缘相关HLA5/6相合单份脐血造血干细胞移植。患儿发生Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD),接受二线免疫抑制治疗无效后,行人脐带MSC(0.5×106/kg受者体重)治疗。
   结果:5例急性白血病患儿均获造血重建,并发生皮肤、肝脏和胃肠道Ⅲ-Ⅳ度aGVHD,经二线免疫抑制治疗无效,输注人脐带间充质干细胞治疗后,皮疹消退,肝功能恢复正常,胃肠道症状好转。患儿均未发生输注相关不良反应。目前患儿均无原发病的复发,均处于无病生存状态。
   结论:异基因造血干细胞移植是治疗儿童急性白血病的有效方法。脐带间充质干细胞治疗儿童急性移植物抗宿主病是安全有效的。
[硕士论文] 林丛宾
物理化学 厦门大学 2011(学位年度)
摘要:pH是日常生活和生产、化学和生物体系中广泛涉及的参数之一。溶液环境的pH值控制着许多的化学和生命过程。分子机械性能的改变,纳米粒子及高聚电解质静电组装,分子表面自组装等都与pH密切相关;在生命科学领域中,作为生物活性催化剂的酶,只有在各自的最适pH下才能表现出较高的催化活性;作为日常生物生命反应场所的体液环境与细胞内环境,其pH值也有非常严格的控制;而作为生命遗传信息载体的DNA,其构型构象变化、基因表达等都受其环境pH值的影响。因此,长期以来,科学家们对建立和发展pH值的检测与调控方法投注了极大的热情和努力。然而,现有文献报道的各种pH调控方法都存在各自的不足之处,缺少一种不引起溶液总体积改变,不引入副反应杂离子、快速且大幅度调控溶液pH值的pH调控方法。
   基于此,本课题组王永春师兄的博士论文首先提出了一种基于透氢导电薄膜与双室串联电解池构型的原位电化学pH调控方法,并进行了大量的前期实验。该方法特别适用于需实时改变溶液pH值的各种研究与应用。本论文的重点在于:共同完善基于该原理的电化学pH调控的实验平台,具体实现电化学pH调控并应用于DNA酸碱变性复性的初步研究;同时,进一步完善串联双室电解池,减小溶液层厚度以减轻扩散对传质的影响,并使其满足与其他诸如荧光光谱等对生物样品损害较小的检测技术联用;最后,初步尝试基于电化学驱动下DNA酸-碱变性-复性过程的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)研究。具体内容如下:
   (1)完善了基于透氢导电薄膜与双室串联电解池构型的原位电化学pH调控方法的实验平台,摸索条件,使其能构实现在短时间内快速、实时、大范围和循环调变溶液样品pH值。从近中性pH值开始,pH调控范围可达±4~5个单位。
   (2)建立了电化学pH调控-UV光谱检测联用平台,并将该平台应用到DNA酸-碱变性-复性过程的研究。研究表明,溶液pH值在5.4~11.4范围内的原位周期性调节可驱动290bp DNA的酸-碱变性-复性过程,紫外吸收光谱在260nm的特征吸收峰发生相应的周期性涨落。
   (3)在以上的基础上,构建了立式串联双室电解池,以实现在不引入外界强制对流措施的情况下,减小工作室溶液pH达到均一状态所用时间,并且该构型将有可能应用于与荧光光谱检测技术联用。
   (4)在所建立的电化学pH循环调控方法及DNA酸-碱变性-复性的基础上,为尝试电化学酸-碱PCR的设想进行了Taq酶的碱耐受性及电化学耐受性实验。研究结果表明,Taq酶可经受11.5的碱性环境;而电化学pH调控环境则对其有较为严重的损坏作用。初步推断Taq酶在电极上发生反应而遭严重损坏,若以两面分别由阳离子交换膜与阴离子交换膜封堵而成的U型槽作为PCR场所,则可将PCR体系与电极隔离,并且槽内溶液pH值也将会随着外部工作室中环境pH值的变化而变化,有可能实现电化学pH调控下的酸-碱驱动PCR。
  
[硕士论文] 王永
生物学、生物物理学 第二军医大学 2011(学位年度)
摘要:目的:目前线粒体钠钙交换体特异性阻断剂CGP37157对心肌细胞肌浆网钙释放、钙回摄的影响缺乏研究。因此,本实验旨在探讨CGP37157对心肌细胞钙循环的影响。
   方法:(1)心室肌组织ATP 含量的测定:32只雄性SD大鼠随机分组,每组8只。以含60μmol/L Ca2+台氏液(对照组)和含有CGP37157的台氏液(实验组)灌流心肌组织,分别灌流15min、30min、60min。灌流结束后,用剪刀剪取左心室少许心肌组织,采用ATP 检测试剂盒(ATP Assay Kit)测定其中ATP的含量;(2)心肌细胞形态学观察:分组及心肌组织的灌流方法同(1),灌流结束后,用剪刀剪取左心室少许心肌组织,用于透射电子显微镜的制样及观察;(3)心肌组织cAMP 含量的测定:分组及心肌组织灌流方法同(1),灌流结束后,用剪刀剪取左心室少许心肌组织,应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中大鼠环磷酸腺苷(cAMP)水平;(4)静息期心肌细胞钙循环的测定:SD大鼠,每组10只,共两组。采用常规酶解法分离心肌细胞,Fluo-3/AM 负载心肌细胞,用激光扫描共聚焦显微镜观察;(5)收缩期心肌细胞钙瞬变的测定:SD大鼠,每组10只,共两组。采用常规酶解法分离心肌细胞,Fluo-3/AM 负载心肌细胞,用全细胞膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜联机技术同步记录系统记录各组大鼠心肌细胞L-型钙电流(Ica,L)和胞浆内钙瞬变(即钙诱导钙瞬变),对照组不灌流CGP37157,实验组灌流CGP37157 (10μmol/L);(6)统计学分析:利用SPSS11.5 统计软件进行数据处理,所有数据以均数±标准差(X±SD)表示,两组间均数的比较采用t 检验, 率的比较采用x2 检验。P<0.05为差异有统计学意义。
   结果:(1)透射电子显微镜形态学观察:CGP37157 引起心肌细胞线粒体结构异常,表现为不同程度的线粒体嵴溶解,并且作用时间越长,线粒体受损伤越重;(2)心室肌组织中ATP 含量的比较:对照组、15min、30min、60min 各组测得的ATP的浓度依次是1.23±0.02 μM/L、0.75±0.01μM/L、0.44±0.02 μM/L、0.17±0.01μM/L,各实验组较对照组ATP 含量显著减少(n=10, P<0.05);60min组较30minATP 含量显著减少(0.17±0.01μM/Lvs0.44±0.02 μM/L, n=8, P<0.01);(3)心肌组织中cAMP 含量的比较:CGP37157 引起心肌组织cAMP的含量增加,对照组15min、30min、60min 各组测得的cAMP的含量分别为791±35pMol/g、1101±55pMol/g、1525±40pMol/g、2017±60pMol/g;60min组较对照组cAMP 含量显著增加(n=8,P<0.05);(4)对静息期肌浆网钙循环的影响:钙释放速率实验组(5.02±0.015)比对照组显著增强(1.01±0.006,n=10,P<0.01);钙存储实验组(20.2±0.8)比对照组显著减小(0.3±0.3, n=10, P<0.01);钙回摄速率实验组(1.08±0.15)与对照组没有差异(0.99±0.09,n=10,P>0.05);(5)收缩期心肌细胞的钙瞬变:Ica,L的电流密度实验组(2.02±0.16pA/pF)比对照组显著减少(0.69±0.07pA/pF, n=10, P<0.01);实验组(45.5±5.2)大鼠CICR 过程中钙释放的幅度显著低于对照组(23.2±4.8,n=10,P<0.01)。
   结论:CGP37157 导致心肌细胞钙循环的异常,原因可能为其导致线粒体受损和PKA通路异常。具体如下:(1)CGP37157 导致线粒体的损伤,表现为其结构受损和ATP 合成下降。(2)CGP37157 介导的线粒体损伤导致静息期心肌细胞钙循环异常,表现为促进肌浆网钙泄漏,但不影响其钙回摄。(3)CGP37157 导致cAMP 增加,导致PKA 激活增强,可能导致静息期肌浆网钙泄漏。(4)CGP37157 导致收缩期心肌细胞Ica,L 电流密度减小,进而导致其钙瞬变幅度减小。
[硕士论文] 朱勇
生物化学写分子生物学 重庆医科大学 2011(学位年度)
摘要:本文对GATA-1、EKLF结合于人miR-144/451基因簇上游协同激活期转录调控进行了研究。人的造血分化是一个极复杂且多步骤的发展过程,它起始于多能造血干细胞(HSCs)在骨髓微环境(HSCs:niche)中的产生,以红细胞生成为终止。中间过程主要包括造血干细胞的自我更新,定向分化和功能成熟,而每个步骤涉及众多复杂的调控过程。红系分化是造血分化的重要分支之一,其分化过程包括从造血干细胞(HSCs)生成开始,逐步分化发育成原始成红细胞,即最早期的红系前体细胞。随后,红系前体细胞会形成爆发集落形成单位(BFU-E)和克隆集落形成单位(CFU-E),最后再经历一系列分化发育过程直到最后产生成熟的红细胞。红系分化过程涉及许多转录因子的调控,如:GATA-1、FOG-1、EKLF,LOM-2等,它们在红系分化的不同阶段发挥重要调控作用。这些转录因子本身受到很多小分子的调控,microRNA就是其中之一。microRNAs(miRNAs)是一类在转录后水平对靶基因表达发挥重要调控作用的小分子家族。它们一般长约21~25个核苷酸,并且其序列在各物种中高度保守,已被认为是多细胞生物基因表达转录后水平调控的一种普遍方式。随着miRNAs数量的不断增加和功能研究的不断深入,现已发现miRNAs参与了生命过程的各个方面并涉及许多疾病的发生发展。最近,大量的研究表明,许多miRNAs还参与了红系分化过程。miR-144/451基因簇是目前已被公认的与红系分化密切相关的miRNAs。已有文献报道,红系特异性转录因子GATA-1能结合到小鼠miR-144/451基因簇上游序列激活RNA聚合酶Ⅱ介导的转录进程。本研究受此启发,首次证明了GATA-1、EKLF能够结合于在人miR-144/451上游各自的保守结合位点,并初步探究了其对miR-144/451的转录调控作用,为红系相关转录因子对miR-144/451基因簇的协同转录研究奠定了一定的实验基础。
[硕士论文] 翟雅斌
工程分析与计算力学 天津大学 2010(学位年度)
摘要:血细胞在血管中的运动是一种非常重要的生理现象,它不仅关系到血液和生物体本身的生理特性,还和某些疾病有着密切的联系。通过实验观察,已经发现白细胞在血管中运动时,会在血管壁附近发生黏附,然后贴血管壁滚动前进,在滚动前进的过程中跳离血管壁的现象。
   本文基于流固耦合方法,在固体分析中采用非线性大变形理论,在流体分析中采用低雷诺数理论,通过数值模拟的方式分析了单个细胞在矩形培养腔内受流体作用下的运动状态和变形情况,获得了如下结论:
   1、由于受重力影响,细胞在流动腔中运动时缓慢向流动腔底部运动,细胞在下降过程中没有直接降落到底面,而是在离底面一定距离时发生回跳,称为细胞的跳跃现象。细胞回跳到一定高度后,细胞重新向流动腔底部运动,在离壁面一定距离时再次发生回跳。细胞不断重复了这一过程,跳跃过程连续循环出现,每个循环历程基本一致。
   2、当细胞运动发生突然改变时,细胞的受力与速度是振荡式变化的。
   3、细胞在受流体某一方向作用时,通常会出现细胞迎流面压缩,背流面伸长的现象,背流面伸长主要是由于此时这部分表面所受流体剪应力大于压应力造成的。
  
[博士论文] 刘爱芬
生理学 华中科技大学 2010(学位年度)
摘要:IK1(inward rectifier potassium channel)是哺乳动物心脏中具有强大内向整流特性的钾通道。心肌细胞动作电位发生过程中,IK1在稳定静息膜电位和三期复极中起着非常重要的作用。IK1强度减少,可以延长心肌细胞动作电位时程,导致长QT综合征,即Anderson's syndrome。IK1强度增加,可能导致动作电位时程、有效不应期和QT间期缩短,有效不应期缩短则容易发生快速性的室性心律失常,如室性心动过速和心室颤动等。IK1通道主要由Kir2家族的同聚体或者异聚体所组成,包括Kir2.1,Kir2.2,Kir2.3和Kir2.4亚单位。心肌细胞中主要含有前三种。近年来诸多研究表明,不同亚单位组装的IK1具有不同的电生理特性,且具有组织特异性和物种依赖性。胚胎心肌细胞具有自律性动作电位。越来越多的研究表明,胚胎心肌细胞的某些电生理特性与一些病理情况如心肌肥厚和心力衰竭相似,后者可以反演胚胎心肌细胞的某些电生理学特性,因此近年来胚胎心肌细胞的离子通道电生理学特性已经被广泛研究,其中IK1也是一个研究热点。在大鼠、犬、兔、鸡等的胚胎心脏发育过程中,IK1密度呈发育依赖性的增加,但是有关胚胎小鼠心脏IK1的发育性特点研究较少,特别是发育过程中,IK1的电生理学特性及其亚单位基础尚不清楚。因此本研究以小鼠胚胎心室肌细胞为对象,应用钡离子作为阻断剂,采用全细胞膜片钳技术,实时定量PCR,Western blot和免疫荧光双标技术研究不同发育阶段的小鼠IK1电生理学特性及其分子生物学基础。本研究为更好理解胚胎心肌基因以及IK1通道的亚单位组成和物种特异性表达提供进一步认识,为理解和治疗心肌肥厚和心力衰竭等疾病提供理论基础。
   一.小鼠胚胎心室肌细胞IK1电生理学特性的发育依赖性变化
   1.IK1密度发育依赖性增加方法:采用胶原酶B消化获得单个小鼠胚胎心室肌细胞并培养24-36小时。选择跳动的单个细胞,2 mM Ba2+作为阻断剂,以全细胞电压钳模式使用protocol电压(为失活钠通道钳制电位在-40 mV,测试脉冲为-120到+60 mV,步阶为10 mV,持续时间500 ms)记录心室肌细胞的Ba2+敏感性电流即IK1。分别记录胚胎早期(E10.5)和晚期(E17.5)心室肌细胞的IK1。结果:含5.4 mM KCl的正常台式液中早期和晚期记录到的IK1均很小,几乎观察不到。100 mM 细胞外K+条件下,早期和晚期都可以记录到较大的IK1,符合一般IK1的特点。负于翻转电位时有相对较大的内向电流,正于翻转电位时则有相对较小的外向电流。Ba2+可阻断该电流,经正常外液洗脱后可恢复。早期和晚期心脏的IK1在激活电压-120 mV时均有较大的内向电流,分别为-6.72±1.02 pA/pF(n=9)和-92.29±3.03 pA/pF(n=10),晚期比早期有显著性增加(P<0.01)。最大外向电流密度早期为0.60±0.32 pA/pF(n=9),晚期为3.27±1.11 pA/pF(n=10),二者有显著性差异(P<0.05)
   2.IK1内向整流特性的发育依赖性增加方法:采用全细胞膜片钳技术在100 mM 细胞外K+条件下记录心室肌细胞的Ba2+敏感性电流即IK1,分别对小鼠胚胎早期和晚期IK1 I-V曲线经Boltzmann方程拟合计算翻转电位数值,Gauss方程拟合计算最大外向电流激活电压,以负于翻转电位30 mV内向电流数值与正于翻转电位20 mV外向电流数值的比值作为公式计算早期和晚期IK1的内向整流率(averaged rectification ratio,RR),分别对应于-40 mV和+10 mV,即RR=IK1(-40 mV)/IK1(10 mV),研究比较胚胎早期(E10.5d)和晚期(E17.5d)IK1的内向整流特性。结果:早期IK1的翻转电位为-11.55±4.55 mV(n=9),晚期的为-18.41±8.68 mV(n=10),二者没有显著性差别(P>0.05)。但IK1内向整流特性有明显变化:最大外向电流激活电压早期为22.58±2.42 mV(n=9),晚期为18.32±0.79 mV(n=10),早期有更加正向的最大外向电流激活电压;平均内向整流率RR晚期(-13.39±1.9,n=9)几乎为早期(3.36±0.92,n=10)的4倍,表明了晚期比早期胚胎小鼠心室肌细胞的IK1有更强大的内向整流特性。
   3.IK1激活动力学发育依赖性增快方法:IK1记录方法同前,电压Protocol(为失活钠通道钳制电位在-40 mV,测试脉冲为-120到-20 mV,步阶为20 mV,持续时间500 ms),为了更清楚观察胚胎小鼠早期和晚期心室肌细胞的IK1的激活情况,我们选择激活时间在前100 ms的电流进行指数方程拟合并计算IK1激活动力学Tau值,研究比较胚胎早期(E10.5)和晚期(E17.5)IK1激活动力学的特点。结果:在发育过程中,IK1表现了不同的激活动力学特性。早期和晚期IK1均有伪瞬时(pseudoinstantaneous)激活的特性,紧接着是一个比较慢的单指数激活电流。后者经过拟合,早期Tau值(6.14±0.32 ms,n=9)明显大于晚期的Tau值,(0.85±0.14 ms,n=10),两者具有显著性差异(P<0.01)。
   二 小鼠胚胎心室肌细胞IK1通道亚单位的发育依赖性变化1.不同IK1亚单位mRNA的发育依赖性改变方法:采用半定量RT-PCR和Real time PCR技术,比较早期(E10.5)和晚期(E17.5)小鼠胚胎心室肌组织Kir2.1,Kir2.2和Kir2.3 mRNA的异同。结论:通过对比早期和晚期胚胎小鼠心室肌细胞IK1的电生理特点和分子生物学基础及其对动作电位的贡献,我们发现① 与早期相比,晚期胚胎小鼠心室肌细胞上的IK1通道电流密度增加,激活动力学增快,内向整流特性增强。② IK1通道电生理学特性发育依赖性变化的分子生物学基础:早期IK1通道亚单位Kir2.1和Kir2.3占主导。随着发育Kir2.1表达上调,Kir2.3表达下调,使得晚期Kir2.1表达占主导。③ IK1通道的功能性作用在早晚期胚胎小鼠心室肌细胞是不同的,IK1对晚期动作电位时程(APD20,APD50和APD90)的影响比早期的更显著,而对最大舒张电位或复极化速率的影响早期和晚期无明显差别。
[硕士论文] 马兰兰
发育生物学 中国医科大学 2010(学位年度)
摘要:间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是来源于发育早期的中胚层和外胚层,具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入和自我复制等特点的一类细胞,在体内或体外特定的诱导条件下,可分化为骨、软骨、肌肉、脂肪、内皮等多种表型组织细胞,传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能,可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。MSCs多取材于骨髓,属侵袭性取材,制约其应用于临床。脐带血(umbilicalcordblood,UCB)是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液,含有丰富的干细胞,临床常采集脐带血中造血干细胞用于治疗血液类疾病。最近几年来有研究表明,脐带血中也存在MSCs。由于脐带血来源丰富,采集方便,排斥小,无伦理争议等优点,脐血来源MSCs作为移植用细胞越来越受到重视。
   脐带血MSCs缺少特异性表面标志物,此类细胞表达CD29、CD44、CD73、CD90和HLA-ABC,CD105和CD106,不表达CD14、CD34、CD45、CD133和HLA-DR[3],并可分化为成骨、软骨、成脂和成肌样细胞[4-5]。有学者应用流式细胞学单管多色染色技术分析脐带血内MSCs的数量[6],每百万个有核细胞当中含有8.8±4.3个MSCs细胞,而骨髓样本当中每百万个有核细胞当中含有13.2±5.8个MSC细胞。分析了脐血MSCs表面抗原表达情况,建立了应用流式细胞学单管多色染色分析脐带血内MSCs数量的方法。有报道[7]说脐带血中MSCs数量变化较大.脐带血中MSCs的数量能有多少,随着胎儿成熟,其数量是否发生变化,MSCs体外培养其生长速度如何,培养的成功率如何,脐带血中MSCs在胎儿发育中是扮演了什么样的角色,发挥了怎样的作用都是值得探讨的问题。本实验应用单管多色荧光染色技术分析了不同胎龄脐带血中CD44、CD105阳性而CD34、CD45阴性细胞的数量,以比较不同胎龄脐带血中MSCs数量的差别,并分析脐带血成功培养出MSCs的影响因素,比较不同胎龄脐带血获得的MSCs的生长特性,为进一步探讨脐带血MSCs生物学特性打下基础。
   方法:
   1、单管多色染色行流式细胞学分析脐带血中MSCs的数量
   (1)无菌条件下取正常脐带血52份,胎龄从28周~42周,产妇及胎儿无血液系统疾病及其他影响造血功能的病变,
   (2)每份各取适量血进行单管多色染色行流式细胞学分析,
   (3)比较不同胎龄脐带血中MSCs的数量。
   2、培养
   (1)无菌条件下取37周~40周脐带血12份,28周~36周脐带血12例,用含抗凝保护液的采血袋抽取,分别作为足月组和非足月组。
   (2)每组各例分别取适量血进行单管多色染色行流式细胞学分析
   (3)将脐血稀释后,直接用Ficoll分离单个核细胞,采用含10%血清浓度的L-DMEM常规间充质干细胞贴壁培养:
   (4)对贴壁细胞类型、生长速度进行观察记录;
   (5)对各组成功培养出间充质干细胞的例数进行统计分析;
   (6)对分离出的脐血间充质干细胞进行鉴定。
   3、统计学分析。
   结果:
   1、流式细胞学结果:52例脐带血中CD44(+)、CD105(+)/CD34(-)、CD45(-)细胞在10例28周~30周脐带血中的数量为15±0.2个/百万有核细胞;在12例31周~33周脐带血中为11±0.3个/百万有核细胞;在10例34周~36周脐带血中为10±0.1个/百万有核细胞;在10例37周~39周脐带血中为6±0.5个/百万有核细胞;在10例40周~42周脐带血中,为2±0.3个/百万有核细胞。可见随胎龄增加,检测到的MSC数量减少。
   在用来培养的脐带血足月组中CD44(+)、CD105(+),而CD34(-)、CD45(-)的细胞数量为6.2±0.2个/百万有核细胞,非足月组为10.3±0.2个/百万有核细胞,两组间存在显著性差异(P<0.01)。
   2、足月组与非足月组间充质干细胞生长特性比较
   足月组单个核细胞培养96小时后贴壁细胞均出现梭形纤维状的细胞和圆形细胞两种形态细胞,传代后有1/12份脐血出现旋涡状排列的间充质样的细胞,其余11/12份传代后只有少量梭形细胞混杂,胰酶难以消化下来,最终老化死亡。非足月组单个核细胞培养72小时后,贴壁细胞多为纤维状的间充质样细胞,传代后3/12份脐带血分离出了间充质样梭形细胞,且生长速度明显快于足月组。
   3、脐血分离培养间充质干细胞成功率
   足月组分离培养间充质千细胞总的成功率为8.3%,非足月组为25.0%。
   4、对分离出的脐血MSCs进行鉴定
   两组培养所获得梭形细胞免疫细胞化学染色检测MSCs标志物表达:CD45(-),CD90(+)。
   结论:
   1、脐带血中含有MSCs,随胎龄增加数量减少;
   2、非足月产脐带血间充质干细胞接种成功率高于足月产脐带血的接种成功率;
   3、非足月产脐带血间充质干细胞生长速度快于足月产脐带血间充质干细胞生长速度。
[硕士论文] 李萍
应用数学 上海交通大学 2010(学位年度)
摘要:对血液流运动的刻画是生命科学中极其重要的研究课题之一,随着生命科学的发展和数学理论的不断完善,近年来,血液流数学理论的研究受到了广泛的重视并且获得了一些很有意义的研究成果.由于血液流模型其自身的复杂性,它与经典流体力学理论有着很多本质的不同点.比如说,血管壁是一个自由面,血液的流动与血管壁的运动相互制约,血管端口的压力变化对血管中的血液流动有着重要的影响等等.本文用一类不可压Navier‐Stokes方程描述血液流动,用弹性力学方程来描述血管壁的运动,然后用它们在侧壁上的耦合的边值问题来建立血液流模型,我们的主要目的是来讨论此类血液流模型定解问题的适定性,从而说明此模型一定的合理性.对此耦合问题的定解问题我们先给出了其对偶问题的具体形式,通过建立一系列先验估计的方法,我们得到了原问题解的存在唯一性及稳定性.
[硕士论文] 高雷
应用数学 江南大学 2009(学位年度)
摘要:Rh血型系统作为人类最复杂的血型系统之一,其临床意义仅次于ABO血型系统。在临床输血实践中因ABO、Rh血型不合的妊娠或输血可发生输血反应和新生儿溶血病。
   本文的主要工作包括以下几个方面:
   1、根据a,t,c,g的化学结构分类,给出了DNA序列的特征序列概念(σ-,t-和σt-)并推广到蛋白质序列中,从而给出一种数值刻划,将蛋白质序列简化成一个(0,1)序列,并且应用到18条三种结构(α螺旋类,β折叠类,αβ类)的蛋白质序列中,得到了不同结构蛋白质序列的一些二级结构的信息。从另一种角度出发,根据氨基酸分子量与简并度的相关性,给出了DNA序列的特征序列概念(ω-)并推广到蛋白质序列中,通过数值刻划,将蛋白质序列简化成一个(0,1,2)序列,通过比较特征序列的数值刻划图,得出RHD基因和RHCE基因均偏爱使用低分子量且高简并度的氨基酸。
   2、利用基于经典HP模型的蛋白质序列的混沌游走(Chaos game representation,简称CGR)的方法,给出了RHD基因的蛋白质序列的CGR图,可作为蛋白质序列的二级结构的一个特征图谱描述,同时给出了RHD基因的DNA序列的CGR图,并且计算出了RHD基因的相应的马尔可夫两步转移概率矩阵,从而得到RHD基因对编码氨基酸的三联子的第三个碱基的使用偏好性。
   3、利用一种新的氨基酸编码方法:拟氨基酸编码方法,计算了基于拟氨基酸编码方法下的78个人类基因的同义密码子的相对使用度,结果表明这些特征不但与石秀凡等人的研究结果一致,而且更为明显。进而说明拟氨基酸编码方法更具合理性和科学性。在此基础上,计算了人类Rh血型系统中RHD基因基于拟氨基酸编码方法下的同义密码子相对使用度(QRSCU),以及QRFN3’,得出了RHD基因对密码子的偏好使用性以及后面所接碱基的偏好性。
   本论文的创新点为:
   1、提出了一种新的特征序列(ω-特征序列)。
   2、利用一种新的氨基酸编码方法:拟氨基酸编码方法,将所建立的QRSCU,应用于Rh血型系统研究。
[硕士论文] 李智
凝聚态物理 华中科技大学 2009(学位年度)
摘要:生物微循环最重要的生理功能就是血液和组织液在生物脏器里的流动,从而进行物质交换,给生物体内的细胞提供营养物质,同时带走细胞组织产生的废物,从而保证机体的新陈代谢得以顺利进行.由此可见研究生物脏器毛细血管中血液的流动具有非常重要的生理意义.
   研究毛细血管中血液的流动的学者们基本上都是把毛细血管当作刚性的直圆管来进行研究的,但是实际上生物体内的毛细血管是极其弯曲,相互缠绕,非常不规则的,所以这些研究对实际的血液在毛细血管中的流动造成一定的误差。本文就是根据这一想法,将分形理论中迂曲度的概念引入到毛细血管中血液的流动中,把毛细血管弯弯曲曲的特点考虑到血液流动的过程中。
   文章首先把分形的基本理论和多孔介质的一些基本特性做了一个综述,接着对生物脏器内毛细血管与组织液间渗流的发展现状做了简单的概述;第二部分主要是研究生物体内各种脏器毛细血管系统的特点,得出生物脏器毛细血管系统是属于多孔介质,所以血液在毛细血管中的流动属于渗流,其流动我们可以作为渗流力学进行研究。第三部分先对血液在毛细血管中流动做了基本的假设,然后建立模型,用二种方法计算得到结果,画出图形,进行分析,得出生物毛细血管中血液流动的基本特性随毛细血管系统分形维数的变化而变化的基本规律。最后一部分对文章做了简单的总结和展望。
[硕士论文] 刘丹丹
生理学 苏州大学 2009(学位年度)
摘要:目的:探讨中枢胆碱能系统在常态下对大鼠颈动脉窦压力感受性反射(Carotid sinus baroreceptor reflex,CSR)的影响及其可能的调节机制。 方法: 孤离麻醉SD大鼠的双侧颈动脉窦区,向一侧孤离窦及股动脉内各插一导管,分别经压力换能器同步记录窦内压(intracarotid sinus pressure,ISP)和平均动脉血压(mean arterial pressure,MAP);ISP以40 mmHg为一阶梯由0逐级加压至280mmHg(每级停留4 sec),然后以同样的梯级减压至0;将各级ISP与其对应的MAP数值进行Logistic五参数曲线拟合,获取ISP—MAP、ISP—Gain(增益)关系曲线及其反射特征参数;在不影响基础血压水平的前提下,通过侧脑室及核团(蓝斑、孤束核)微量注射胆碱酯酶抑制剂毒扁豆碱(physostigmine,PHY)以及各种选择性胆碱能受体拮抗剂,观察中枢胆碱能系统对CSR的调制作用及其机制。 结果: 1.侧脑室注射毒扁豆碱(PHY)对CSR的影响 分别侧脑室注射(intracerebroventricular injection,i.c.v.)小、中、大3种微剂量的PHY后,均导致ISP—MAP关系曲线剂量依赖性的显著上移(P<0.05),ISP—Gain关系曲线中部剂量依赖性的明显下移(P<0.05),反射参数中调定点、饱和压和最大增益时的窦内压值增大(P<0.05),MAP反射变动范围及反射最大增益减小(P<0.05),表明脑内胆碱可明显引起CSR抑制性重调定。 2.预先i.c.v.选择性胆碱能受体拮抗剂对侧脑室给PHY所致CSR抑制的影响 2.1单独i.c.v.所给剂量的M1受体拮抗剂哌仑西平(prienzepine,PRZ)或M2受体拮抗剂美索曲明(methoctramine,MTR)或N1受体拮抗剂六烃季胺(hexamethonium,HEX),均对CSR无明显影响(P>0.05); 2.2但预先i.c.v.相应剂量的PRZ或MIR后,均能不同程度的缓解i.c.v.PHY对CSR的抑制性重调定(P<0.05),表现为:ISP—MAP关系曲线显著下移,ISP—Gain关系曲线明显上移,饱和压和最大增益时的窦内压值下降,MAP反射变动范围及反射最大增益加大;且阻断M2受体比阻断M1受体的缓解效应更加明显(P<0.05);而预先i.c.v.相应剂量的HEX,对i.c.v.PHY引起的CSR的重调定没有明显作用(P>0.05)。 3.预先蓝斑内注射选择性胆碱能受体拮抗剂对i.c.v. PHY所致CSR抑制的影响 3.1单独向蓝斑(locus ceruleus,LC)内注射所给剂量的PRZ或MTR或HEX,也对CSR均无明显影响(P>0.05); 3.2预先向LC内微量注射相应剂量的M1或M2受体拮抗剂PRZ或MTR,对i.c.v.PHY所致CSR抑制性重调定的影响结果,类似于结果2.2,且PRZ的这种减弱作用不如MTR的显著(P<0.05);预先向LC内注射相应剂量的N1受体拮抗剂HEX,也对i.c.v.PHY引起的CSR的重调定没有明显影响(P>0.05)。 4、预先孤束核内注射选择性胆碱能受体拮抗剂对i.c.v.PHY所致CSR抑制的影响 4.1单独向孤束核(nucleus tractus solitarius,NTS)内注射所给剂量的PRZ或MTR或HEX,对CSR仍无明显影响(P>0.05); 4.2预先向NTS内微量注射相应剂量的M1或M2受体拮抗剂PRZ或MTR,均可明显增强i.c.v.PHY对CSR的抑制效应(P<0.05);且NTS内预先注射MTR,与NTS内预先注射PRZ相比,更加明显增强i.c.v.PHY对CSR的上述抑制效应(P<0.05)。预先向NTS内注射相应剂量的HEX,仍对i.c.v.PHY引起的CSR抑制效应没有明显作用(P>0.05)。 结论: 1.侧脑室给予拟胆碱药(毒扁豆碱)对颈动脉窦压力感受性反射(CSR)具有明显的剂量依赖性抑制作用。 2.预先i.c.v.M1或M2受体拮抗剂可减弱i.c.v.PHY对CSR的抑制性重调定,M2受体拮抗剂的缓解作用大于M1受体拮抗剂;N1受体拮抗剂则无明显作用。提示下丘脑室周核团的M1、M2受体参与介导脑内胆碱能系统对CSR的抑制性重调定,且M2受体作用大于M1受体。 3.预先向蓝斑(LC)内微量注射M1受体或M2受体拮抗剂后,再i.c.v.PHY,对CSR的影响则与结论2类似,且LC处M2受体拮抗剂的缓解作用大于M1受体拮抗剂;N1受体拮抗剂则无明显作用。提示LC的M1、M2受体参与介导中枢胆碱能系统对CSR的抑制性重调定,且LC的M2受体作用大于M1受体,下丘脑—LC的胆碱能通路可能是脑胆碱系统调节CSR机能的下行通路之一。 4.预先向孤束核(NTS)内微量注射M1受体或M2受体拮抗剂后,再i.c.v.PHY,对CSR的影响则与结论2、3相反,可强化i.c.v.PHY对CSR的抑制性重调定;M2受体拮抗剂的强化作用明显高于M1受体拮抗剂;N1受体拮抗剂则无明显影响。提示NTS的M1、M2受体尤为M2受体可弱化i.c.v.PHY对CSR的抑制性重调定,下丘脑—NTS胆碱能通路可能也是脑胆碱系统整合CSR机能的下行通路之一。 5.下丘脑、蓝斑和孤束核的N1受体可能与中枢胆碱能系统对CSR的抑制性重调定无关。
[硕士论文] 郑莉
电工理论与新技术 郑州大学 2009(学位年度)
摘要:随着科学技术的飞速发展,电磁辐射成为危害人们健康的重要隐患。经过国内外学者长时间的研究,发现电磁场对心血管系统会产生影响。所以,就有必要去研究电磁场对心血管系统的影响。
  本文在对心血管系统的生理知识和心血管系统建模的基本方法论证的基础上,采用建立电路模型与仿真的方法来研究电磁场对心血管系统的影响。分析了心脏、动脉系统的电路模型以及神经调节机制中的颈动脉窦-主动脉弓减压反射的数学模型。从能量角度和血流动力学角度详细阐述了生理上的耦合机制,并根据血液流动的基本参量与电学参量之间的比拟关系对心脏电路模型和动脉系统电路模型进行耦合,进行了MATLAB仿真。
  针对电磁场对心血管系统的影响主要是神经调节功能,进一步对模型加入神经调节机制的数学模型,进行正常生理情况下的仿真和分析,结果完全符合生理学上的心脏泵血机制,说明本文所建立的心血管系统的电路模型是正确的,与人体正常生理情况相符合。通过分析心血管系统的电磁生物效应的机理以及流行病学调查和动物实验,发现电磁波会引起交感传出频率和迷走传出频率发生变化,据此对模型相应参数进行调整,从外周血管阻力、心肌收缩能力和心动周期三个方面分别对电路模型进行仿真,用数字定量地说明了电磁场对心血管系统确实有影响,而且还会诱发疾病。
[博士论文] 李趣欢
信息生物学 中山大学 2008(学位年度)
摘要:流动增强型粘附受到粘附分子与环境剪切力的双重调制。揭示其中的分子反应动力学机制,对于深入了解白细胞如何在血流剪切作用下到达炎症部位,启动炎症级联反应,以及与此相关的生理和病理过程,相应抗炎、抗肿瘤等药物的设计,均具重要意义。本论文以免疫分子系统(E—选择子/PSGL-1)调控的HL—60细胞粘附为实验模型,采用流动腔实验技术手段,研究了流动增强型粘附过程中的二维反应动力学问题。主要内容包括以下三个方面: 一、对E—选择素与PSGL-1相互作用介导的流动增强型粘附的动力学机制进行了全面的研究。首先,通过加入3%右旋糖苷提高溶液粘性1.69倍,结果表明:不同粘性溶液下细胞的滚动速度与剪应力相关,而不依赖剪切率;另外,采用多聚甲醛固定细胞,发现固定前后细胞的滚动速度变化很小,由此排除了剪切率输运和细胞形变通过提高正反应速率来增强细胞滚动的可能性;其次,测定了瞬时粘附细胞的生存时间,结果表明生存时间随剪应力的单调增大呈现出先增大后减小趋势。当剪应力为0.35 dyn/c㎡时,瞬时粘附的生存时间达到最大值;进而,利用一阶解离动力学模型,对生存时间大于等于时间t的细胞数目对t作图,线性拟合得到斜率的负值:即逆反应速率(koff)。结果表明逆反应速率随剪切力的增大呈现先减小后增大的趋势。这一曲线与生存时间曲线存在互补关系,却跟滚动速度的趋势一致。最后,对由双键或多键介导的细胞滚动过程进行了滚动步态分析,用停留—行走模式定量描述了细胞的滚动行为,所用参数包括平均停留时间、平均行走时间、停留频率、停留时间比率和行走时间比率,结果表明平均停留时间作为重要的描述参数,其曲线与单键的生存时间曲线趋势一致,并与滚动的平均速度趋势相反。通过以上的分析,研究证实了E—选择素介导的流动增强型滚动粘附的逆锁键机制,即力的作用降低了分子键的解离速率,从而增加了分子键的生存时间,使细胞的滚动更稳定。 二、首次采用倒置流动腔技术,比较研究了细胞在正置和倒置方向下的滚动特性。结果表明,无论重力的作用是使粘附细胞趋向于离开还是接近流动腔的壁面,由E—选择素介导HL—60细胞的滚动粘附过程,均受到粘附分子间力—化学偶联相互作用的调控,呈现由“逆锁键”介导的流动增强型细胞粘附滚动现象;相较于沉降使细胞趋向于壁面的情形,当沉降使粘附细胞趋向于离开流动腔的壁面之时,细胞的沉降效应,不会影响剪应力阈值的大小,但将使得细胞的滚动更为稳定,延长细胞停留时间,进而降低细胞的滚动速度;偏离剪应力阈值越远,细胞沉降的效应越显著。由此显示,上述细胞沉降效应,可能源于细胞粘附事件的“沉降筛选”机制与粘附分子间力—化学偶联相互作用的动力学机制。 三、首次测定了滚动粘附细胞的解离率常数koff(RA),用于描述重力和水动力耦合作用下细胞的解离过程。研究发现,由粘附分子介导的滚动过程,若最后的粘附键解离,新键未能形成之时,滚动细胞解离,重力沉降作用使之远离壁面并被流体带走。在其中,重力并不直接影响细胞滚动,但通过沉降作用对细胞解离起到一定的作用。流动腔在倒置方向下能防止新细胞的粘附和解离细胞的再次粘附。可测得细胞解离的时间,转换为细胞保持粘附的时间并运用一阶解离动力学模型,计算出滚动粘附细胞的解离常数,结果表明,细胞解离动力学曲线跟单键解离的逆反应速率曲线趋势一致,因此,在细胞水平进一步证实了流动增强型滚动的逆锁键机制。
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