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[硕士论文] 景艳军
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:嗜酸氧化亚铁硫杆菌是一种应用性很强的工业微生物菌种,鉴于其较好的重金属抗性,可用于贵金属的浸提、环境污染的治理等领域。铁氧还蛋白作为一种广泛存在并参与嗜酸氧化亚铁硫杆菌新陈代谢过程诸如铁硫簇组装等重要环节的蛋白质,研究其结构和功能对了解嗜酸氧化亚铁硫杆菌的代谢过程、电子传递及重金属抗性具有重要意义。本研究的内容和结果如下:
  (1)从甘肃省兰州市、白银市和陇南市3个典型矿区采集的样品中分离出四株嗜酸氧化亚铁硫杆菌,一株氧化亚铁钩端螺旋菌。选取生长周期短、菌体富集量大的菌株BYSW1进行后续的研究。首先选取温度、pH值、接种量、能源种类利用单因素实验对其生长条件进行优化。在pH为2,于30℃下接种10%的菌液,BYSW1生长最好,葡萄糖和蛋白胨会明显抑制其生长。
  (2)在NCBI数据库中找出铁氧还蛋白基因序列(fdⅠ、fdⅡ),在BYSW1中扩增出目的片段,连接到pET-32(a),转化大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)DH5α。自BYSW1扩增出的铁氧还蛋白基因序列(fdⅠ、fdⅡ)与数据库汇总的序列一致性分别为83.92%和85.59%,编码的蛋白与数据库中的序列一致性分别为89.47%和85.59%。
  (3)重组的质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3)。选取温度、时间、IPTG浓度进行单因素实验,优化重组蛋白的表达条件,并用蛋白质印记法进行验证。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。FdⅠ和FdⅡ分别在25℃下加入0.5mM IPTG诱导6h、25℃下加入0.3mM IPTG诱导6 h表达效果最佳。FdⅠ和FdⅡ分别可用100mM咪唑和50mM咪唑自亲和柱中洗脱下来。
  (4)挑取五种重金属(Cd2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+),对其重金属抗性进行研究;对重金属(Cu2+和Cd2+)驯化前后的嗜酸氧化亚铁硫杆菌的菌体形态和基因组变化、重组蛋白表达差异、宿主菌体的生长情况进行了研究。结果表明:BYSW1具有较强的重金属抗性,分别在0.04mol/L Cd2+、0.04mol/L Cu2+、0.15mol/L Mn2+、0.08mol/L Ni2+和0.08mol/L Zn2+存在时生长良好,但是高浓度(大于0.04mol/L)的Cu2+和Cd2+会明显抑制BYSW1的生长。Cu2+和Cd2+胁迫后,BYSW1的菌体细胞明显变小,且表面粗糙,但基因组仍然能保持完整。不同浓度、不同种类的重金属胁迫前后,铁氧还蛋白的表达存在显著差异,且Cd2+对嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长的影响比Cu2+显著;不同浓度、不同种类的重金属对于重组蛋白的表达宿主菌体生长影响不同,0.25mM的Cu2+和Cd2+能明显抑制宿主菌体的生长。
[硕士论文] 李娟
微生物学 兰州交通大学 2017(学位年度)
摘要:抗生素的过量使用和滥用导致大量耐药菌的出现,特别是超级耐药菌的出现,对人类健康造成严重的威胁。寻找新的更为安全高效的抗生素,以及不易产生细菌耐药性的抗生素替代物,对于保障人类健康,以及健康食品生产和动物养殖具有重要意义和迫切需求。抗菌肽类物质是天然抗菌物质,具有稳定性好、无毒副作用、不会出现细菌耐药性等突出优点,也具有替代某些抗生素的潜力。因此,本项研究的目的是利用基因工程的方法,构建人工合成抗菌肽和抗菌酶基因的重组表达质粒,将重组质粒导入毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母中进行异源表达,获得了酵母表达的抗菌肽和抗菌酶,旨在为抗菌肽类物质的实际应用提供技术资料。本论文报道了几种抗菌肽类物质和具有抗菌作用的葡萄氧化酶的酵母异源表达的主要研究结果。
  1、构建了对革兰氏阴性菌有很好抗性的抗菌肽AP基因重组表达载体pPICAP,将其导入毕赤酵母SMD1168中,获得了抗E.coli的毕赤酵母菌株AP26,该菌株在培养的72 h时抑菌活性最高,之后抑菌活性降低,表明72 h时抗菌肽AP的表达量最高。进一步研究表明,在培养的72h后,重组菌抑菌活性降低是因为发生了质粒的丢失。LC-MS结果表明重组菌株正确表达了抗菌肽AP。对菌株AP26进行了亚硝基胍(NTG)诱变,筛选到了抗菌肽AP表达量最高的诱变菌株APmu4,其抗菌肽AP最高生物效价达到1.7×109 U/L。对影响抗菌肽AP表达量的因素进行了研究,发现pH为7.5、接种量为50g/L、盐浓度较高的YDFMY培养基、酵母提取物能够提高抗菌肽AP的表达量。
  2、构建了具有广谱抗菌活性的抗菌肽AB基因的重组载体pPICAB,将其导入到毕赤酵母SMD1168菌株中,获得分泌表达抗菌肽AB的毕赤酵母菌株,该重组菌株对E.coti有抗性,LC-MS结果表明该菌株正确表达了抗菌肽AB。对重组菌株进行了NTG诱变,筛选到超量表达抗菌肽AB的诱变菌株ABN97。为了进一步提高诱变菌株抗菌肽AB表达量,构建了颤藻血红蛋白基因vgb的重组载体,将其导入到菌株ABN97中,筛选出了抑菌效果最好的菌株ABN97vgb,抗菌肽AB生物效价达到4.53×108 U/L。对影响抗菌肽AB表达量的因素进行了研究,发现pH为6.0、接种量为50 g/L、盐浓度较高的YDFMY培养基、酵母提取物能够提高抗菌肽AB的表达量,最高表达量提高了14倍。
  3、构建了对革兰氏阳性菌有良好抑菌活性的抗菌肽菌丝霉素Plectasin基因重组质粒pPICPle,将其导入毕赤酵母并成功异源表达抗菌肽Plectasin。对重组菌株进行NTG诱变并筛选得到高效表达Plectasin的诱变菌株Ple100,其Plectasin的表达量提高了1.93倍。对影响菌株Ple100 Plectasin表达量的因素进行研究,结果表明盐浓度较高的YDFMY培养基和酵母提取物能提高菌株Plectasin表达量。
  4、构建了抗菌肽PSI基因的整合型载体pLACPSI和游离型载体pKDUPSI,将其导入到乳酸克鲁维酵母K1SEL1基因突变型菌株中,筛选到分泌表达抗菌肽PSI的重组菌株。对重组菌株发酵液中抗菌肽PSI进行硫酸铵沉淀法和阳离子交换柱纯化,SDS-PAGE检测验证了抗菌肽PSI。对重组菌株产抗菌肽PSI的发酵条件进行优化,结果表明中性或偏碱性、酵母提取物和盐度较高的YDFMY培养基更有利于抗菌肽PSI的表达。纯化的抗菌肽PSI对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、三线镰刀菌(Fusarfum tricinctum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、平头炭疽(Colletotrichumtruncatum)有抗性。水果保鲜实验表明纯化后的抗菌肽PSI也具有开发为新型果蔬保鲜剂的潜力。
  5、构建了葡萄糖氧化酶(GOX)基因的整合型载体pLACGOX和游离型载体pKDUGOX,成功将其导入到乳酸克鲁维酵母K1SEL1基因突变型菌株中,获得了一株能超量分泌表达GOX的乳酸克鲁维酵母菌株,其GOX最大表达量为70±7 kU/L,SDS-PAGE检测验证了GOX正确表达。研究了影响GOX酶活的因素,结果表明pH4件下GOX酶活最高,温度为37℃时GOX稳定,YPGal培养基中的高盐浓度对GOX有抑制作用。
[硕士论文] 吴瑞薇
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:煤层气(CBM)作为一种自生自储形式存在的非常规天然气,以清洁、高效、优质、安全的特点越来越受到人们的关注。近年来,生物成因煤层气作为一种环境友好及高效的能源,被人们广泛研究。针对煤层气相关微生物多样性及产气途径的研究对煤层气的开采、废弃煤层气田的处理和煤层气的再生有重大意义。而在我国,由于煤层气的勘探研究起步较晚,在煤层气相关微生物的研究方面报道甚少。本文中,以山西沁水盆地煤层气田为研究对象,该地区为我国煤层气开采最为活跃的地区,采用高通量测序技术,对煤层气田原位产出水和异位煤生物转化成甲烷的过程中微生物的群落变化进行了研究,同时也对以高阶块煤为基质中试模拟生物产气过程中,培养基的浓度和添加块煤的量对微生物群落结构的影响进行了初步研究。
  微生物基因组总DNA的提取是进行环境分子生态学研究的首要关键步骤。煤是具有复杂和难降解结构的大分子物质,因此提取高质量的基因组总DNA是后续实验的关键,也是能较真实的评估微生物多样性的保障。通过优化在该特殊环境中基因组DNA的提取方法,即采用the Mini-Bead Beater机械破碎、化学破碎与酶消化相结合,得到了高浓度、片段完整的基因组总DNA,能满足后续相关的PCR扩增和宏基因组学测序分析。
  首先分析了该煤层气田5个不同煤层气井原位产出水中产甲烷菌群和生物成因气的生成途径。以甲基辅酶M还原酶基因(mcrA)作为目标基因,采用454焦磷酸测序方法,分析不同煤层气井产出水中的产甲烷菌群。高通量测序表明,样品共检测到4种已知菌属,即甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷微菌属(Methanomicrobium)、甲烷叶菌属(Methanolobus)和甲烷螺菌属(Methanospirillum),优势菌属均为Methanobacterium。系统发育分析表明,未明确地位的菌属主要与Methanobacterium、Methanomicrobium、产甲烷球菌属(Methanococcus)和甲烷囊菌属(Methanoculleus)有较近的亲缘关系。
  同时成功利用高阶块煤首次实现异位煤生物转化成甲烷的过程,该过程通过规模化中试发酵培养更加客观的表征了微生物的群落变化。通过高通量测序分析表明在原位产出水中氢营养型的产甲烷菌Methanocalculus占主导,而在异位产气过程中乙酸型产甲烷菌Methanosaeta和Methanosarcina占主导;在原位产出水和异位产气过程中大部分细菌均属于Proteobacteria,在产出水中细菌属Sulfuricurvum, Hydrogenophaga和Methylobacter占主导;而在异位产气过程中细菌菌属差异较大,由起初的Pseudomonas为优势菌属,到后来发酵培养90天后,主要的细菌为Proteocatella,Macellibacteroides和Clostridium。
  综上,在煤层出水样中生物成因煤层气的形成主要为氢营养型产甲烷途径,而在异位煤的生物转化过程中主要为乙酸型产甲烷途径,因此在异位生物成因的产气途径判定中不能依据原始微生物群落代谢途径而决定,而应以所研究的微生物群落中优势产甲烷菌作为参考依据。
[硕士论文] 姚潇婷
生物工程 中南林业科技大学 2017(学位年度)
摘要:黄原胶具有良好的流变性、乳化稳定性、悬浮性、兼容性及增粘性,在原油开采中常被用作驱替剂,以提高钻井、完井、调剖堵水及三次采油等过程中的采油率。在实际应用过程中发现,使用黄原胶后加大了后续处理工艺的难度,因此,有效地降解黄原胶是石油开采的重要工序。本研究以课题组前期鉴定的一株具有降解黄原胶能力的嗜热地衣芽孢杆菌HT-1为材料,对其进行紫外微波复合诱变,测定复合诱变菌株温度耐受性、pH耐受性以及对黄原胶的降解能力,并与原始菌株进行比较。最后,对复合诱变菌株的应用进行初步探索。本研究对后续黄原胶生物降解法以及黄原胶在石油工业的应用提供一定的参考依据。主要研究结果如下:
  原始菌株HT-1菌株的最适生长条件:温度50℃,pH7.5,0.1%的黄原胶,1%的葡萄糖(碳源),1%的酵母粉(氮源);最适黄原胶降解条件:0.3%黄原胶作为唯一碳源和氮源,温度50℃,pH7.5。
  对原始菌株HT-1进行紫外诱变,选取一株较好的诱变菌株,命名为HT1UV-3,其对黄原胶的降粘率达到了35.79%,较原始菌株提高了14.42%。随后,对筛选得到的HT1UV-3突变株进行微波诱变,最终得到5株突变型菌株HT1UM3-1、HT1UM3-2、HT1UM3-3、HT1UM3-4、HT1UM3-5。温度耐受方面,5株突变菌株耐高温性能较原始菌株明显提高,其中HT1UM3-3菌株的最适生长温度趋于55℃;pH耐受方面,复合诱变菌株与原始菌株无明显差别;黄原胶降解方面,5株突变菌株的黄原胶降解能力较原始菌株均有提高,其中HT1UM3-5菌株的降粘率最高,达到42.02%,较原始菌株提高了20.70%。
  在原油环境下,对原始菌株和复合诱变菌株的存活情况与黄原胶降解能力进行探索。结果显示,不同原油浓度下,原始菌株和复合诱变菌株对原油的耐受程度都不高,半数致死率均在0.5g/L;在0.5g/L原油浓度下,原始菌株和复合诱变菌株对黄原胶降解能力均较差,原始菌株降粘率趋近于0%,复合诱变菌株降粘率约7.5%。
  探究原始菌株和复合诱变菌株对瓜尔胶、田箐胶、卡拉胶三种胶的降解能力。结果表明,对瓜尔胶的降解上,所有菌株降解能力微弱,最大降粘率不超过4%;对田箐胶的降解上,HT1UM3-1、HT1UM3-2、HT1UM3-4、HT1UM3-5的降解能力略高于原始菌株,降粘率在5%-8%之间;对卡拉胶的降解上,复合诱变菌株的降解能力显著高于原始菌株,降粘率在10%-12%之间,较原始菌株提高了约60%。
[硕士论文] 李垚
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:近年来科学家们在探寻新型抗生素的筛选途径时,发现昆虫内生菌能够产生许多种类多样的次生代谢产物,尤其那些能够帮助宿主抵御病原菌入侵的放线菌,其中一些具有新颖的结构并表现出较好的生物活性。由于这些化合物能够存在于真核宿主体内,且不危害宿主,所以它们很有可能对人类也没有毒副作用。因此这些昆虫内生放线菌具有很大产生人类药用的抗生素潜力,所以近年来昆虫内共生放线菌受到越来越多科学家的关注,昆虫内生放线菌也将是持续地发现新抗生素的重要领域之一,这对于对抗日益增多的抗药病原菌和新型疾病具有重要意义。
  本研究以实验室筛选得到的30株蚂蚁内生菌为材料,通过培养特征观察、抗菌活性测试和16S rRNA序列测序结果分析,发现两株潜在的放线菌新种3H-GS17T和2H-TWYE14T和一株具有良好抗菌活性放线菌1H-GS2,对它们分别进行了系统的分类学鉴定和活性物质的分离鉴定,结果如下:
  (1)16SrRNA分析结果显示菌株3H-GS17T是珊瑚放线菌属的一株菌,与Actinocoralliaglomerata JCM9376T(98.13%)和Actinocorallia longicatena JCM9377T(97.64%)的16S rRNA序列相似性最高。化学分类学特征也与Actinocorallia的特征一致。而DNA-DNA杂交结果和表型分析结果显示菌株3H-GS17T明显不同于与它相近的菌株,进一步的实验证明菌株3H-GS17T和珊瑚放线菌属的其他菌株都不相同。因此确定菌株3H-GS17T是珊瑚放线菌属的一个新种,命名为Actinocorallia lasicapitis,典型菌株是3H-GS17T(=DSM100595T=CGMCC4.7282T)。
  (2)16S rRNA分析结果显示2H-TWYE14T是链霉菌属的一株菌,与Streptomyces niveusNRRL2466T(98.84%)的16S rRNA序列相似性最高。gyrB基因分析结果同样显示2H-TWYE14T属于链霉菌属。化学分类学特征也与链霉菌属的其他菌株相一致。而2H-TWYE14T与S.niveusNRRL2466T之间的DNA-DNA杂交结果和表型分析结果显示2H-TWYE14T明显不同于S.niveus NRRL2466T。因此确定菌株2H-TWYE14T是链霉菌菌属的一个新种,命名为Streptomyces camponoticapitis,典型菌株是2H-TWYE14T(=DSM100523T=CGMCC4.7275T)。
  (3)活体生物活性检测显示菌株1H-GS2对部分测试真菌具有较好的生物活性,将菌株进行发酵,发酵产物同样显示良好的真菌抑制活性。对发酵产物中的化合物进行分离纯化后,利用现代光谱学进行结构分析鉴定,最终得到化合物白诺菌素(Albonoursin)。
[博士论文] 孟琳
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:嗜盐菌由于其独特的耐盐碱代谢机制和遗传特性已受到许多微生物学、生态学和土壤学研究工作者的广泛关注,是一类极具基础研究价值和发掘新的耐盐碱机制的重要微生物资源,而对这类微生物新的耐盐机制的研究还可以为改造农作物、开发微生物肥料、促进粮食增产等提供重要的理论依据。肇东盐单胞菌(Halomonaszhaodongensis)是一株分离自黑龙江省肇东盐碱地的革兰氏阴性轻度嗜盐菌,它能在0-15%的S-G培养基上生长(最适盐浓度为3%)。本研究借助大肠杆菌(Escherichia coli盐敏感突变株KNabc(ΔnhaA,ΔnhaB,ΔchaA),利用基因文库筛选和功能互补相结合的技术方法,以发掘更多未知的耐盐碱基因,并对它们所编码的蛋白功能进行研究。
  本研究利用含有0.2MNaCl的氨苄抗性固体培养基作为筛选工具,用以克隆肇东盐单胞菌中潜在的与耐盐碱有关的基因。实验共获得21个能使KNabc突变株在0.2 M NaCl的培养基上恢复生长能力的重组质粒,经过酶切及测序分析,发现这21个重组质粒中,包括一对属于DUF1538(domain of unknown function with No.1538 family)家族的蛋白和一个属于DUF2062家族(domain of unknown function with No.2062 family)的蛋白,它们的功能尚未被注释,实验结果表明它们均是与耐盐有关的基因,本文将它们分别被命名为umpAB(unknown membraneprotein)、duf2062。
  umpAB基因序列全长1580 bp,由两个开放阅读框(ORF)组成,其中第一个阅读框(umpA,765 bp)终止密码子的最后一个碱基与第二个阅读框(umpB,816 bp)起始密码子的“A”碱基重叠在一起。它们编码的蛋白序列分别由254个和271个氨基酸残基组成,并将其分别命名为Hz_UmpA、Hz_ UmpB(from Halomonaszhaodongensis)。跨膜预测分析也显示,它们皆具有7个跨膜区,它们和亲缘关系最近的12个同系物有47个高度保守的氨基酸残基,其中包括36个疏水性氨基酸、6个带正电的氨基酸、5个极性氨基酸。同源比对显示,Hz_UmpA和Hz_UmpB同属于一个未知功能的DUF1538(domain of unknown function with No.1538family)蛋白家族,该家族在NCBI的Pfam数据库中被定义为一类功能未知的、具有同一个保守结构域的蛋白集合,其发现顺序为1538。更重要的是,Hz_UmpA和Hz_UmpB与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的其他蛋白没有任何同源性。系统发育分析显示,它们与各自同源性在50%以上的同系物聚簇成阙值(bootstrap values)为96%和99%的两个分支,但是与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的其他蛋白的进化距离较远。除此之外,功能互补的实验揭示了umpAB基因具有一定的耐盐碱能力,在0.4 MNaCl或30mMLiCl的盐胁迫下,umpAB能使盐敏感突变株KNabc恢复生长,而单独的umpA,umpB却不能;当NaCl浓度为0-0.15 M时,与负对照相比,单独的Hz_UmpB具有一定的耐盐能力,而单独的Hz_UmpA在有盐条件下生长受到抑制;单独的Hz_UmpA和Hz_UmpB具有一定程度的耐碱能力,且后者要好于前者。考虑到Hz_UmpB比Hz_UmpA多出一个亲水的C末端,推测多出的这一亲水C末端在其耐盐碱过程中起到比较关键的作用。功能分析表明,Hz_UmpAB具有Na+(Li+,K+)/H+逆向转运蛋白活性,且这个活性具有一定的 pH依赖性,其最适活性pH为9.0,对Na+、Li+、K+三种离子的K0.5值分别是0.26±0.06 mM、0.46±0.09 mM、0.41±0.06 mM,换而言之,Hz_UmpAB对底物的偏好性是:Na+>K+>Li+。为了进一步研究Hz_UmpAB的细胞定位及二聚体鉴定,我们构建了共表达载体pETDuet-1-umpAB,运用超离蛋白分级法对菌体的膜蛋白及胞浆蛋白进行分离,Western Blot检测显示,Hz_UmpA和Hz_UmpB的蛋白条带(约25 KDa)仅在全蛋白样品和膜蛋白样品中被检测出来,而且它们的确是大小不同的两个蛋白,这就表明,Hz_UmpAB均定位于细胞质膜。Co-IP显示,在免疫沉淀Hz_UmpA蛋白时,用Western Blot分析也能检测到Hz_UmpB的蛋白条带,表明Hz_UmpAB很可能是由两个膜蛋白构成的一个异源二聚体。
  duf2062基因序列全长552 bp,可编码的蛋白由183个氨基酸残基组成,将其命名为Hz_DUF2062。功能互补实验显示,它可使盐敏感突变株KNabc在0.3 M NaCl或5 mM LiCl的培养基上恢复生长,而且在偏碱性的环境中,其生长能力要明显好于负对照。这表明了该基因具有一定的耐盐碱能力,且可能具有钠/氢逆向转运蛋白活性。跨膜预测分析显示,Hz_ DUF2062具有3个跨膜区,和它们亲缘关系最近的同系物有54个高度保守的氨基酸残基,其中主要包括28个疏水性氨基酸、10个带正电的氨基酸和13个极性氨基酸;同源比对表明,Hz_ DUF2062属于一个未知功能的DUF2062蛋白家族,而与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的蛋白没有任何同源性。系统进化发育学分析表明,Hz_DUF2062与同家族的其他蛋白聚集在一簇,阙值(bootstrap values)为91%,且此分支与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的蛋白的进化距离较远。功能分析表明,Hz_DUF2062具有Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白活性,以上活性具有pH依赖性,其最适活性pH为8.5,对Na+、Li+、K+三种离子的K0.5值分别是0.2±0.13 mM、0.22±0.1 mM、0.43±0.08 mM,换而言之,Hz_ DUF2062对底物的偏好性是:Na+>Li+>K+。
  综上所述,本研究首先对Hz_UmpAB和Hz_DUF2062两个蛋白的功能进行了注释,首次报道了未知功能的DUF1538家族和DUF2062家族成员的确切功能,即代表DUF1538家族的蛋白对Hz_UmpAB和代表DUF2062家族的蛋白Hz_DUF2062具有Na+(Li+,K+)/H+逆向转运蛋白活性,同时还重点研究了Hz_UmpAB的细胞定位及这个异源二聚体的鉴定。基于以上结果,建议来自肇东盐单胞菌(H.zhaodongensis)中的Hz_UmpAB蛋白对和Hz_ DUF2062蛋白是两个新型的Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白。而且,也通过Co-IP首次揭示了钠/氢逆向转运蛋白的新结构,即钠/氢逆向转运蛋白的结构除了同源二聚体和异源多聚体之外,还应有像Hz_UmpAB这样的异源二聚体结构。
[博士论文] 李英俊
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated)系统广泛分布于古菌和细菌中,是一种抵御病毒和质粒等外源遗传物质的获得性免疫系统。在最新的分类中,CRISPR-Cas系统已被分为两大类和六个亚型,其中主要的三个亚型(Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型)得到了广泛的研究。Ⅱ型CRISPR/Cas9系统目前已被广泛应用于不同的细菌和真核生物的基因组编辑;此外,Ⅰ型和Ⅱ型CRISPR-Cas系统还被开发成抗菌剂来选择性消除特定的菌群。但是,迄今还没有利用Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统进行基因组编辑的报道。
  本研究在冰岛硫化叶菌中开发了一种基于其内源的Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法。该方法只需要构建一个新型的基因组编辑质粒(pGE),该质粒携带一个提供能靶向干涉或沉默基因的成熟CRISPR RNA的人工mini-CRISPR簇以及一个含有非靶标序列的用于同源重组的供体DNA片段。将pGE质粒转化到宿主细胞之后,细胞将会有两种命运:野生型细胞因基因组DNA被靶向降解而死亡;而那些基因组与供体DNA发生了同源重组从而携带突变基因的细胞能免于干涉而成为转化子存活下来。利用该方法,本研究实现了不同类型的基因组编辑,包括缺失、插入和定点突变。我们相信该方法可以推广到其它含有能干涉DNA的CRISPR-Cas系统的细菌和古菌。
  研究不同CRISPR-Cas系统的分子机制是应用开发的基础,且已成为当前生物学研究的热门领域之一。已有研究表明,Ⅲ型CRISPR-Cas系统与其它类型有显著不同的核酸干涉活性,其既有RNA酶活性也有RNA激活的DNA酶活性。我们的前期研究已经揭示了冰岛硫化叶菌Ⅲ-B型Cmr-α系统在体内同时具有RNA干涉活性和依赖于转录的DNA干涉活性。为了更深入的解析相关机制,本研究用一个携带43nt SS1spacer(靶向lac基因上protospacer SS1)的人工mini-CRISPR质粒,从冰岛硫化叶菌中纯化出天然Cmr-α复合物,并对其进行了系统的体外研究。研究发现,Cmr-α复合物能切割与复合物中的crRNA互补配对的靶标RNA,同时该靶标RNA又能激活Cmr-α复合物的ssDNA切割活性,该活性需要靶标RNA的3'端侧翼序列与crRNA的5'端tag序列错配。此外,激活的Cmr-α复合物能够快速切割大量的ssDNA底物,这说明Cmr-α系统可以快速消灭复制中的病毒DNA。
  为了揭示Cmr2α蛋白在Cmr-α系统DNA干涉活性中的功能,本研究针对Cmr2α的HD和Palm两个结构域构建了四个突变株,分别命名为HD-M1(H14N和D15N),HD-M2(H14N, D15N,K19A和I23A), Palm-M1(G666K和D667K)和Palm-M2(662-IYlGGDDiLA-671—AAlAAAAiAS)。体内干涉质粒分析显示,其中3个多氨基酸突变株HD-M2、Palm-M1和Palm-M2都丧失了DNA干涉活性。而HD结构域的双氨基酸突变株HD-M1却只是消除了体外的DNA切割活性。这些结果表明,Cmr2α的HD和Palm两个结构域都是Cmr-α系统体内DNA干涉所必需的,而体外检测到的ssDNA切割活性可能只是HD结构域介导的。
  此外,Ⅲ型CRISPR-Cas系统的crRNA加工成熟和靶标核酸的结合机制仍然是不清楚的。本研究用携带不同长度spacer(14,20,28,40和76nt)的人工mini-CRISPR质粒分别纯化Cmr-α复合物。结果显示,无论spacer长短,Cmr-α系统都合成固定长度的crRNA(40nt和46 nt)。这说明mini-CRISPR簇下游的repeat元件可以在没有被加工情况下补充为crRNA序列。此外,一个仅含有上游repeat元件和40nt spacer的人工mini-CRISPR质粒也能合成一样固定长度的crRNA。这些结果表明,Cmr-α复合物的组装可能是从crRNA的5'端tag区域(经Cas6初加工产生)起始,而crRNA的3'端则由其它未知的RNase加工成熟,从而组装成两个固定大小的复合物。另外,对这些复合物的体外切割活性和结合靶标RNA能力的分析表明,随着复合物中crRNA的3'端区域和靶标RNA的5'端序列错配碱基数的增加,不能被复合物结合和切割的RNA底物的数量也随之增加。
  在Ⅲ-B型效应复合物的结构模型中,结合crRNA的3'端区域的是Cmr1亚基。本研究在冰岛硫化叶菌中构建了一个Cmr1α缺失突变株和两个关于Cmr1α的丙氨酸替换突变株,分别命名为△β△1α,△β1α-M1(W58A和F59A),△β1α-M2(I52A,G54A,R57A和R61A)。体内基于mini-CRISPR的报告基因法分析表明,△β1α-M1的RNA干涉活性相比野生型菌株大大降低,而△β△1α和△β1α-M2则基本丧失了RNA干涉活性。
  纯化Cmr1α三个突变株的Cmr-α复合物发现,突变株△β1α-M1 Cmr-α复合物的组分和野生型基本一样,而突变株△β1α-M2 Cmr-α复合物的组分却和△β△1α一样,都缺少Cmr1α蛋白。同时,体外RNA切割实验与体内的RNA干涉活性分析结果一致。在靶标RNA激活的DNA切割活性分析中,突变株△β△1α和△β1α-M2的复合物均基本丧失了DNA切割活性,突变株△β1α-M1的Cmr-α复合物也只检测到相比野生型复合物非常弱的DNA切割活性。此外,EMSA实验结果显示,△β△1α和△β1α-M1的Cmr-α复合物均很难与靶标RNA形成三元复合物(Cmr蛋白,crRNA和靶标RNA)。以上结果表明,Cmr1α在Cmr-α复合物与靶标RNA形成三元复合物过程中扮演关键角色。两个保守的疏水氨基酸(W58和F59)是Cmr-α复合物结合靶标RNA所必需的,另外四个氨基酸(I52,G54,R57和R61)可能主要介导Cmr1α与crRNA相互作用,从而形成完整的Cmr-α复合物。
[博士论文] 公维丽
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:进入二十一世纪,农作物秸秆作为现代农业的必然废弃物未得到充分利用,常常被就地焚烧,造成环境的污染和资源的浪费。利用生物技术将其细胞壁中多糖组分高效降解转化,形成生物化工产品或生物燃料,这对我国农业及工业绿色可持续发展具有重要意义。丝状真菌可以高效分泌生物质多糖降解酶,常被用于酶制剂生产,实现生物质多糖的降解转化。由于植物进化途径及生长环境迥异,使得不同植物细胞壁多糖组成及结构存在明显异质性;而微生物伴随植物进化过程中也形成了多样的降解策略,不同微生物分泌酶种类及浓度各不相同,因此系统认识植物细胞壁的异质性与微生物降解偏好性之间的关系,将会对生物质转化利用效率提升,推动其工业化规模应用具有意义。
  对丝状真菌降解天然生物质偏好性的研究,将会为寻找降解特定底物的优势降解酶系,根据底物类型复配降解酶系提供指导,从而提高秸秆等生物质的利用效率,丝状真菌降解偏好性主要由基因组中生物质多糖降解酶编码基因的种类和数目、基因的转录和表达、以及酶系中不同组分的功能特异性决定,基于这一问题,本文主要以三种子囊真菌,重点以黑曲霉为研究对象对其基因组、蛋白质组及胞外多糖降解代谢组进行了系统研究,认识相应微生物的降解偏好性,取得的主要成果如下:
  1.利用比较基因组学方法探究重要子囊真菌生物质多糖降解酶基因组成差异,确定不同真菌降解潜能
  通过JGI数据库和NCBI数据库获取已测序的曲霉属、木霉属、青霉属和脉胞菌属中代表性菌株ITS序列信息,构建系统发育进化树。从UniProt数据库中下载每一菌种中所有功能注释蛋白,按照生物质中多糖结构组成和糖苷键类型,将功能注释蛋白归类分析,结果表明在不同属之间曲霉属真菌基因组中生物质多糖降解酶编码基因种类及数量较多,而青霉属真菌基因组中降解双子叶植物中含量较高的木葡聚糖和半乳甘露聚糖的酶编码基因较少,因此推测其降解双子叶植物的能力可能不高,木霉属和脉胞菌属真菌在进化关系中位于同一分支,并且两者都具有较少半纤维素酶和果胶酶编码基因,但纤维素酶基因的比例较高,这可能由于其他生物质多糖降解酶基因特化为纤维素降解酶基因,从而使其在纤维素降解中具有明显优势,基因特化现象也是丝状真菌降解偏好性的基础。同时同工酶家族分布分析显示部分家族酶类如GH11和GH10家族木聚糖酶在不同菌株之间含量比例差异明显,因此,酶系种类及其专一性家族分布的差异可导致丝状真菌降解生物质能力明显不同。
  2.利用比较功能蛋白质组学方法分析黑曲霉、里氏木霉和草酸青霉在固体培养条件下分泌组动态变化,确认三者在降解双子叶和单子叶植物多糖的偏好性
  利用玉米秸秆和小麦麸皮等农业废弃物对重要丝状真菌黑曲霉、里氏木霉及草酸青霉进行固体培养,并对其胞外酶的种类组成及浓度随时间的动态变化进行分析。结果表明在培养过程中大量的糖苷水解酶被诱导表达。利用LC-MS/MS在黑曲霉、里氏木霉和草酸青霉胞外共检测到279、161、183种蛋白,对其按照断裂生物质糖苷键类型分析发现,黑曲霉胞外蛋白质组中的酶种类可高效降解双子叶植物细胞壁多糖如(半乳)甘露聚糖、木葡聚糖和果胶主链,而草酸青霉胞外降解酶主要参与β-(1,3;1,4)-D-葡聚糖、木聚糖等单子叶植物细胞壁组分多糖的降解。里氏木霉主要分泌纤维素酶及Cip1,Cip2,Swollenin等辅助蛋白,而相对于里氏木霉和黑曲霉,草酸青霉的纤维素降解酶系组成更为合理。这从蛋白质组水平进一步确证丝状真菌胞外发挥功能的蛋白在降解不同生物质的偏好性,这为探究微生物的降解能力与其偏好性及工业合理复配酶系提高降解效率奠定了理论基础。
  3.利用荧光辅助糖电泳(FACE)和糖质谱定量表征木聚糖酶作用模式,建立胞外多糖降解代谢组学分析技术
  利用阴离子交换层析方法及大肠杆菌异源表达体系获得2个GH10家族木聚糖酶和5个GH11家族木聚糖酶,并建立FACE技术分析不同木聚糖酶降解异质木聚糖产物谱,结果表明FACE技术可以准确区分异质木聚糖酶解产物中带侧链木寡糖和不带侧链木寡糖,并可对不同种类木寡糖随时间的动态变化进行定量表征。基于对木寡糖谱随时间变化的定量分析,发现GH10家族和GH11家族木聚糖酶都可以将木聚糖迅速降解为木寡糖,而对木寡糖进一步降解速度却很慢。GH10家族和GH11家族木聚糖酶降解带侧链木聚糖主链的最小产物谱明显不同,具有家族特异性,利用LC MS-IT-TOF鉴定为2-甲基葡萄糖醛酸取代的木三糖和木四糖。对无侧链取代的木聚糖主链的降解,GH10与GH11家族木聚糖酶都可以产生单糖、木二糖、木三糖,未展现出家族专一性,而降解产物谱中寡糖种类及寡糖浓度差异应由酶活性中心亚位点的识别专一性及结合力差异导致。β-木糖苷酶的加入可以将2-甲基葡萄糖醛酸-木四糖高效降解为2-甲基葡萄糖醛酸-木三糖,但是对后者进一步高效降解需要侧链降解酶的参与。降解产物谱的动态变化反映不同家族同工酶对降解带侧链聚糖主链取代程度的偏好性不同,导致高效降解所需辅助酶种类不同,这为复杂聚糖高效降解酶系的复配指明了方向。
  4.限制碳源培养条件下分析黑曲霉An-76功能蛋白组动态变化,发现带侧链的木寡糖在黑曲霉降解、转运与代谢木聚糖系统中发挥重要激活作用
  黑曲霉An-76可以彻底高效降解利用木聚糖,利用功能蛋白质组学和qPCR方法对在木聚糖类底物生长的黑曲霉An-76胞外、胞内蛋白组及膜转运蛋白质进行系统分析,结果表明黑曲霉An-76可以有次序的分泌降解木聚糖的所有同工酶组分,木聚糖主链降解酶类优先被诱导,降解产生的木糖、木寡糖等进一步诱导侧链降解酶的高效表达,木寡糖比木糖等代谢产物更高效的激活转录激活因子XlnR的表达,从而可提高酶量表达,并提升降解效率。带侧链木寡糖可以提高侧链降解酶类、特定糖转运蛋白以及戊糖代谢途径中关键还原酶、脱氢酶的表达量,加快异质性木寡糖的降解代谢,因此有目的添加天然木聚糖的中间降解产物(带侧链木寡糖)可以诱导异质多糖降解的全酶系,并可以提高酶系表达量及缩短产酶周期。
[硕士论文] 张炎焱
微生物学 黑龙江大学 2017(学位年度)
摘要:许多研究显示,益生菌对生物体具有多种生理功能,如调节肠道菌群,提高免疫力,降脂等。本课题在实验室前期工作的基础上,制备了短双歧杆菌微胶囊和植物乳杆菌-发酵乳杆菌-短双歧杆菌三菌复合微胶囊,并对这些微胶囊的体外性能进行了评价,然后研究了不同的微胶囊对肥胖小鼠模型的降脂效果。
  短双歧杆菌及植物乳杆菌-发酵乳杆菌-短双歧杆菌三菌复合微胶囊的研制实验内容及主要结果如下:试验用低甲氧基果胶(LMP)作为微胶囊壁材,短双歧杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌为芯材,采用离子交联法制备了短双歧杆菌微胶囊和三菌复合微胶囊,两种微胶囊的包埋率都在99%以上;体外模拟胃肠道试验结果显示,短双歧杆菌裸菌、短双歧杆菌微胶囊活菌数分别下降了4.82,1.76lg(cfu/g),三菌复合裸菌、三菌复合微胶囊活菌数分别下降了4.82,1.741g(cfu/g);保藏稳定性试验结果表明,LMP胶囊对短双歧杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌具有非常好的保护作用。
  益生菌微胶囊对高脂饮食肥胖小鼠降脂作用的研究方案及主要结果如下:试验小鼠分别喂以普通饲料和高脂饲料,肥胖小鼠建模成功后,将小鼠随机分为六组,即空白组A(喂以普通饲料),高脂对照组B(喂以高脂饲料),高脂阳性对照组C(喂以高脂饲料加奥利司他),短双歧杆菌微胶囊组D(喂以高脂饲料加短双歧杆菌微胶囊),植物乳杆菌-发酵乳杆菌微胶囊组E(喂以高脂饲料加植物乳杆菌-发酵乳杆菌微胶囊)和植物乳杆菌-发酵乳杆菌-短双歧杆菌复合微胶囊组F(喂以高脂饲料加植物乳杆菌-发酵乳杆菌-短双歧杆菌三菌复合微胶囊)。试验结果显示,各组微胶囊不同程度的减少了高脂饮食肥胖小鼠血清中TC、TG含量。微胶囊的干预减少了高脂饮食小鼠血清中IL-6、IL-2β、LPS、TNF-α的水平,并且缓解了高脂饮食肥胖小鼠肝细胞变性程度,减小了脂肪细胞尺寸,肠道上皮细胞未发生病理变化。高脂饮食使得小鼠肠道菌群结构发生明显的改变,厚壁菌门的比例明显升高,而微胶囊的干预不同程度的调节了菌群结构,使双歧杆菌和乳杆菌数量明显增加,肠杆菌和肠球菌数量明显减少。
  本研究结果表明:微胶囊可以调节高脂饮食小鼠相关的代谢及免疫功能,发挥了降脂作用。本试验结果为益生菌系列产品在改善人类健康领域的应用提供了数据支持。
[硕士论文] 李倩
环境工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:环境中的微生物会经历各种环境变化造成的胁迫作用,导致微生物自身产生一系列表现型与基因型的变化来响应外界环境压力。目前大多数研究旨在揭示环境胁迫对微生物的作用机理以及微生物的响应机制,很少有研究从应用的角度对微生物的胁迫响应机制进行探讨。鉴于环境生物技术主要依赖微生物的表面性质或代谢功能来进行污染物的处理,且微生物这些性质会被外界环境胁迫诱导发生改变,因此我们假设微生物的胁迫响应机制可以作为一种开发新型环境生物技术的新策略。
  本研究以环境微生物细长聚球藻(Synechococcus elongatus)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)以及模式菌株大肠杆菌(Escherichia coli)为研究对象,通过外源施加环境胁迫和合成生物学手段的利用,探究了微生物胁迫响应机制在环境生物技术中的应用。主要内容包括:⑴通过外加高盐胁迫诱导蓝细菌胁迫响应机制的产生,可以增强其吸附性能。吸附性能的提高是由于表面EPS中PS分泌的增多和碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase)活性的提高共同引起的。Sigma70因子转录水平的提高证实了这一作用是由外界环境胁迫诱导的全局转录因子控制的。本章研究证明了环境胁迫诱导可以用于提高环境生物技术中微生物的性能。⑵通过合成生物学手段,构建了含有四环素降解基因tetX的四环素降解模块,并将其转化到E.coli中,构建出具有四环素降解能力的工程菌株。所构建的功能菌株可以通过羟基化作用有效转化四环素。结果表明,24h时对四环素的降解效率即达到了98%以上。本章研究证明了将具有环境功能的基因模块整合到模式菌中的可行性,并将其应用于生物技术的开发。
[硕士论文] 田莉
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素作为自然界中储量最丰富、分布最广的可再生资源,实现木质纤维素的资源化利用对解决人类当前面临的资源和环境问题具有重要的现实意义。但是生物质通过自身复杂的组成成分形成一道抗降解屏障,完成其高效降解需要依赖于微生物以及降解酶的协同作用。堆肥生境是一个高效降解生物质的系统,含有大量微生物种群,并且不同菌株形成酶系的特化,具备降解特定多糖的偏好性,可以协同完成生物质的高效降解。因此,全面系统分析某一微生物的降解潜能与酶系优化方向,对形成绿色高效的新转化技术有重要意义。结构生物信息学和整合功能组学方法为所需分析提供了平台。本文通过结构生物信息学平台分析各类降解酶的活性架构区域,探讨它们识别底物的结构基础和共性规律,通过酶识别底物的特异性和混杂性从而提出酶的协同降解方式,并利用整合组学深入分析了优势功能微生物Thermobifida fusca编码的高效酶系组合,阐明其生长偏好性及高效降解机制,并本文取得的相关研究进展如下:
  (1)活性架构分析糖苷水解酶家族结合底物的结构基础
  以主要糖苷水解酶家族为研究框架,选取9个家族的纤维素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶为研究对象。通过活性架构区域的结构生物信息学分析,发现活性架构氨基酸出现频率存在明显的偏好性,并且这些偏好氨基酸着重分布在催化位点附近的亚位点上。对这些亚位点上的氨基酸进行保守性的分析,结果显示大多数氨基酸是保守的,Trp、His、Arg和Asn表现最明显。保守氨基酸的多寡与酶分子识别底物的特异性有关,保守氨基酸越多,特异性越强。纤维素酶家族GH5和GH12特异性差,可识别多种底物,而GH6、GH7和GH9家族特异性较强;木聚糖的降解依赖于GH10和GH11家族对侧链容忍位置的不同;而GH1的特异性可进一步完成纤维寡糖的降解。
  (2)木质纤维素辅助降解酶类氧化机制的生物信息学探究
  除了糖苷水解酶类外,还有一类辅助降解酶类,这些酶是实现木质纤维素完全降解不可缺少的一部分。通过研究相关酶类的活性区域,即可能影响氧化还原过程电子传递效率的氨基酸组合,发现该区域偏好出现的氨基酸有His/Cys/Glu和Trp/Tyr/Phe,它们带有极性基团或苯环可协助电子传递。分析这些氨基酸的保守性,发现电子受体区域的氨基酸明显比电子供体区域更为保守,意味着这类酶对供体选择具有特异性,而电子传递途径所涉及的氨基酸保守度更高,且位于结构内部,保证了电子传递的快速性与安全性。另外,基于电子供体和受体之间的关联性,提出了不同酶类之间可能会存在的协同和竞争模式,可指导酶的高效协同降解。
  (3)基因组分析Thermobifida fusca降解潜能
  将T.fusca与其他18株木质纤维素降解放线菌进行木质纤维素降解酶基因数目的比较,发现该菌编码的CAZy基因数目是相对较少的,因此可彻底降解的底物种类有限,天然底物谱较窄。从降解的底物类型分析,T.fusca具有可彻底降解纤维素的全酶系,包括裂解多糖单加氧酶LPMO,其半纤维素降解酶系缺乏侧链降解酶类,无木质素降解酶。胞外酶分子近40%存在碳水化合物结合结构域(CBM),其中CBM2家族出现频率最高,CBM2是平面结合型,可识别结合结晶纤维素。
  (4)底物种类对Thermobifida fusca胞外蛋白质组的影响
  利用不同木质纤维素类的底物培养T.fusca,测定其理化性质及胞外分泌组的动态变化,明确了该菌的最适诱导条件以及偏好降解的底物——纤维素和甘露聚糖,并确定了适宜浓度的二糖为主要糖苷水解酶大量分泌的诱导物,同时从胞外酶的分泌情况来看,T.fusca具有特化的纤维素降解酶,GH6与GH9家族分泌能力强,AA10较弱。此外猜测该菌细胞膜上存在不溶性底物的感应蛋白,从而诱导部分降解酶作为“先锋部队”分泌至胞外,随后产生的二糖被菌体快速吸收利用诱导更多的降解酶分泌。
[硕士论文] 舒伟学
微生物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:家禽养殖场和屠宰场每年会产生几万吨的羽毛废弃物,这些羽毛废弃物中含有丰富的且有价值的角蛋白和氨基酸,其主要成分是角蛋白。角蛋白巾含有丰富的二硫键,而使其在羽毛废弃物很难被降解。微生物降解羽毛角蛋白目前已经成为一个吸引人的方法,用于处理角蛋白废弃物。
  本试验从陕西省杨凌区崔西沟养鸡场采集了样本土样,在以羽毛为唯一碳氮源的培养基中,共分离出13株细菌。对分离的菌株进行16S rDNA PCR-RFLP分析,并对不同类群的代表菌株进行16S rDNA序列进行测定和降解能力的测定,最终获得1株对羽毛降解能力最强的菌株,该菌株能够能在7天内将10 g/L羽毛完全降解。通过形态学和分子生物学方法鉴定,该菌株与节杆菌G2-1T(Arthrobacter nitroguajacolicus G2-1T)相似度最高(100%),并结合生理生化,初步将该菌株鉴定为Arthrobacter sp.ZJT01。
  对菌株ZJT01产角蛋白酶的酶学性质进行了初步的研究,结果表明:菌株ZJT01最适发酵温度是30℃,最适发酵时间为3天;粗酶液的最适pH为8,最适温度是35℃;异丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、CaCl2和KCl对角蛋白酶具有一定的抑制作用,MgCl2能够促进角蛋白酶的酶活。该角蛋白酶能够被PMSF抑制,所以该角蛋白酶属于丝氨酸类角蛋白酶。
  为提高其角蛋白酶的活性,我们通过基因组改组的方法来获得高产菌株。首先通过硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)诱变获得突变体库,然后通过原生质体融合使多亲本基因组发生重组,使角蛋白酶活性获得提高。
  通过DES和NTG对菌株ZJT01分别进行诱变,确定了最佳的诱变条件。DES最适浓度为9μL/mL,诱变时间为20 min,NTG的最适合浓度是0.6 mg/mL,处理时间为15min。然后对突变株进行筛筛选,经过三轮诱变后得到了5个突变株,其角蛋白酶活性都有所增加,其角蛋白酶活分别为13.4 U/mL、15.5 U/mL、14.2 U/mL、15.7 U/mL、13U/mL,相对原始菌株(10.6U/mL)提高了26.4%、46.2%、33.96%、48.1%、22.6%。
  通过单因素试验研究了原生质体制备的最适条件,结果表明:向菌悬液中加入10mg/mL溶菌酶,酶解温度在37℃条件下酶解处理30 min,原生质体形成率最高。以DES和NTG突变体为亲本库进行原生质体融合,通过筛选,三轮基因组改组后获得6个突变菌株,其中F3-5和F3-6角蛋白酶活较高,分别为68.3 U/mL和68.7 U/mL,和原始菌株相比提高到6.48倍。菌株传代5代后,菌株F3-5和F3-6遗传性稳定。
[硕士论文] 崔文霞
临床兽医学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:内生真菌广泛存在于植物中,可以产生许多新颖的化学物质,具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化等功效。紫花地丁为一种常见中草药,具有抗菌消炎等功效。目前关于紫花地丁内生真菌的研究较少,缺乏紫花地丁内生真菌的分布特点及内生真菌代谢产物的研究。本试验从紫花地丁体内分离纯化内生真菌,经过形态学和分子生物学的鉴定,多样性分析及抑菌活性研究,取得以下试验结果:
  1.本试验从1,532块紫花地丁组织块中共分离出1,058株内生真菌,形态学和5.8SrDNA序列分析,最终鉴定为46株真菌,归为12个属。其中Colletotrichum属为优势属,占总菌数的36.86%,其次为Fusarium属,占25.05%。
  2.不同组织、不同季节紫花地丁内生真菌种属分布不同。根、叶、茎和种子中分别分离到556、268、173和62株内生真菌,其中根中的优势属为Fusarium属,占43.88%,茎、叶和种子中的优势属为Colletotrichum属,分别为60.69%,54.85%和22.58%。有些真菌具有组织特异性,如只在根中分离出Paramyrothecium属,叶中分离出Glomerella,种子中分离出Leptosphaerulina属真菌。对不同季节的紫花地丁进行内生真菌分离,其中春季分离出188株,夏季分离出462株,秋季分离出408株,这3个季节的优势属均为Colletotrichum属。
  3.多样性指数中,根中的真菌多样性最多,其次是茎和叶,丰富度最低的为种子。均匀度分析,根、茎和叶内生真菌的分布度相似,为0.95左右,而种子中的分布度最低,为0.79。结合三种多样性分析,夏季的内生真菌多样性最为丰富。均匀度比较,秋季的均匀度最高,为2.07,其次为夏季,春季的均匀度最低,为0.28。
  4.10株内生真菌的提取物对蜡状芽孢杆菌有抑菌作用,其中VM-32对蜡状芽胞杆菌为高敏;7株真菌的提取物对链球菌有抑菌活性,有3株菌提取物为中敏,其他为低敏;11株菌的提取物对金黄色葡萄球菌有抑菌活性,其中VM-8、VM-28和VM-34为高敏,VM-23和VM-33为中敏,其他6株真菌为低敏。VM-8、VM-9、VM-14、VM-25和VM-33对以上三种菌均有抑菌活性。但是这些内生真菌提取物对大肠埃希菌、沙门氏菌和铜绿假单胞菌三种革兰氏阴性菌没有抑菌活性。
[硕士论文] 冯鑫妍
免疫学 大连医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  对生物学实验Western Blot中常用试剂SDS及免疫组织化学技术组织前处理过程和乙醇对抗原、抗体活性及DNA影响进行定量分析,间接反映其对抗原抗体反应可能造成的实验信息的丢失和错误,并试图寻找替代试剂。
  方法:
  1、采用双向免疫扩散实验,通过观察沉淀线及确定抗原效价定量分析SDS处理血清后对血清抗原的影响。
  2、采用免疫散射比浊技术,定量分析SDS处理血清后对IgA、IgM、IgG抗原的影响。
  3、采用电化学发光技术,定量分析SDS处理乙肝表面抗原阳性血清后对乙肝表面抗原的影响。
  4、采用免疫固定电泳技术,分析SDS处理血清后对免疫球蛋白抗原结构的影响。
  5、采用凝集实验,通过比较凝集效价及凝集强度定量分析免疫组织化学组织前处理过程和所应用试剂处理颗粒型抗原后对颗粒型抗原的影响。
  6、采用酶联免疫吸附试验,定量分析SDS及乙醇处理乙肝表面抗体阳性血清后对乙肝表面抗体的影响;定量分析SDS对不同类型患者伤寒及卵清抗体的影响有无差异。
  7、采用荧光定量PCR技术,将DNA模板经SDS及乙醇处理,通过对GAPDH及CRP基因的扩增,比较Ct值,计算实验组与对照组Ct值之差,即△Ct值,及抑制率,定量分析SDS及乙醇对DNA的影响。
  8、通过酶联免疫吸附试验及荧光定量PCR技术测定SDS及十二烷基麦芽糖苷(DDM)对乙肝表面抗体及DNA的影响,并进行比较,探讨DDM在蛋白质提取时,对SDS的替代作用。
  结果:
  1、双向免疫扩散实验结果显示:对照组抗原效价为1:256,SDS37℃实验组抗原效价为1:4,SDS100℃实验组抗原已破坏,结果无沉淀线产生。
  2、免疫散射比浊实验结果显示:SDS37℃实验组IgA、IgM、IgG较对照组略有上升,SDS100℃实验组IgA、IgG抑制率在90%以上,IgM为30%。
  3、电化学发光实验结果显示:SDS37℃实验组乙肝表面抗原抑制率为70%,SDS100℃实验组为96%。
  4、免疫固定电泳技术结果显示:经SDS处理后,免疫球蛋白抗原结构被破坏。
  5、凝集实验结果显示:免疫组织化学技术组织前处理过程对抗原的抑制率为72.2%。各试剂单独处理抗原与对照组相比结果为:75%以上的高浓度乙醇对抗原活性的抑制率约为70%,甲醛抑制率约为20%,二甲苯约为10%。
  6、酶联免疫吸附试验结果显示:SDS对乙肝表面抗体的半数抑制浓度为0.92%(32mmol/L);30%乙醇对HBsAb无明显抑制作用;0.1%SDS对伤寒抗体及卵清抗体具有一定的抑制作用,但是在对ICU患者与健康体检者及不同年龄组健康体检者之间对这两种抗体的抑制作用无明显差异。
  7、荧光定量PCR技术结果显示:SDS及乙醇处理DNA模板后,GAPDH及CRP扩增的Ct值随SDS及乙醇浓度的增加而增加,0.05%(1.74mmol/L) SDS处理后,无扩增曲线。
  8、SDS及DDM对乙肝表面抗体的半数抑制浓度分别为0.92%(32mmol/L)和1.90%(37mmol/L);致使基因不能被扩增出来的处理浓度,SDS为0.05%(1.74mmol/L),DDM在5%(98mmol/L)左右。
  结论:
  1、SDS、免疫组织化学技术组织前处理过程及该过程所应用试剂对抗原、抗体活性及DNA均具有一定的抑制作用,可能造成抗原抗体反应信息的丢失及结果的错误。
  2、DDM对DNA的抑制作用较小,优于SDS。
[硕士论文] 吴玉婷
环境科学 合肥工业大学 2017(学位年度)
摘要:位于淮北平原地区的两淮煤田含煤地层及相邻地层的甲烷含量丰富,是我国著名的高瓦斯、高突出矿井分布区和煤层气开发潜力矿区。通过细菌基因测序技术检测已发现矿井深部涌水中含有一定量的产甲烷菌(Methaneproduction bacteria,简称MPB)。本实验所用的水样取自淮北煤田任楼矿井下中六采区运输大巷内的放水钻孔,终孔层位于C31-3石炭系太原组含溶洞石灰岩层,作为菌源水样,选取煤样中部分大分子有机物作为实验体系中的碳源和能源物质,进行生物性产甲烷实验。
  实验研究结果表明淮北矿区的煤系地下水中微生物菌群可以将煤中一些有机物水解成分子量较小的有机物,体现在这些有机物被降解的同时,丙酸、乙酸乙酯、辛酸乙酯等小分子有机酸含量在试验过程中整体呈现增长趋势。其中的2-己基-1-癸醇、己二酸二异辛酯、亚油酸3个实验组发现甲烷气体的产生,表明这些有机物被充分水解后生成的小分子有机酸物质可以被产甲烷菌所利用进行产出甲烷。验证了煤田区生物性产气的可行性,并显示出煤中大分子有机物水解产气的基本途径。
  通过对矿井水样品的古菌基因组DNA提取、mcrA基因片段扩增和文库构建,及基因序列同源性对比,发现淮北矿区煤系地下水中存在Methanoregula、Methanobacterium、Methanomethylovorans、 Methanoregula、Methanolobus、Methanomassiliioccus,显示了本区煤系地下水中含有丰富的产甲烷菌群,其中Methanomassiliicoccus目古菌的发现填补了天然煤系产甲烷菌群记录的空白。
[硕士论文] 孙登岳
发酵工程 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:功能性油脂是一类具有特殊生理功能的油脂,它具有减少心血管疾病发生、促进机体细胞生长、调节免疫机制及脂代谢、抗癌、抗过敏和抗皮肤衰老等功能,在医学医药、功能性食品及日常方面得到广泛应用,具有广阔的应用前景。微生物功能性油脂的开发研究可以解决功能性油脂产量短缺、生产来源有限、人们日常需求量不足的问题。深黄被孢霉是目前研究较为广泛,最有可能实现功能性油脂工业化生产的产油微生物。为提高功能性油脂的产量,本文以深黄被孢霉 As3.3410为出发菌株,研究了功能性油脂高产菌株的选育,培养基组分的优化,超临界提取功能性油脂工艺,外源因子添加对菌株产功能性油脂代谢的影响。主要研究结果如下:
  1.本研究通过紫外-氯化锂复合诱变、丙二酸和芝麻酚筛选,获得功能性油脂高产菌株 ZL2-103,经遗传性稳定性试验,该菌株具有良好的遗传稳定性,产油能力较强,其生物量为25.73 g/L,油脂产量为20.38 g/L,功能性油脂产量为4.32 g/L,其油脂产量和功能性油脂产量分别比原始出发菌株提高111.19%和285.71%。
  2.对菌株ZL2-103的发酵培养基组分进行单因素试验,在此基础上,通过BBD试验设计对发酵培养基组分进行了优化,确定了最佳的发酵培养基组分:葡萄糖107.40 g/L,复合氮源8.71 g/L,硫酸镁91.87 mg/L,磷酸二氢钾2.73 g/L,其中复合氮源为花生饼粉和酵母膏按照1:3(w/w)的比例混合而成,经优化后,功能性油脂产量达到了5.21 g/L。
  3.采用超临界 CO2提取微生物油脂,对影响油脂得率的提取条件进行了单因素试验,通过BBD试验设计,确定了最佳提取工艺:萃取压力48 Mpa,萃取温度43℃,动态萃取时间141 min,静态萃取时间20 min,菌体粉碎度60目;在此条件下,油脂得率为94.83%。对传统有机法和超临界CO2法提取的油脂进行了GC-MS组分分析、油脂理化指标(酸价、过氧化值、皂化值、碘值及折射率)分析,并且对两种方法提取油脂后的菌体进行电镜扫描观察菌体的破壁程度,经全面比较分析,超临界CO2提取法优于传统有机法,超临界CO2提取法更适用功能性油脂的提取。
  4.研究了三种外源因子对菌株ZL2-103产功能性油脂代谢的影响,实验结果表明:浓度为0.3%乙酸钠、0.01%苹果酸及0.01%柠檬酸对菌株功能性油脂的积累均有促进作用,存在最佳添加的发酵时期,且在特定发酵时期组合添加外源因子,能使功能性油脂产量达到最高。在发酵初始添加0.3%乙酸钠和0.01%苹果酸以及第4 d添加0.01%柠檬酸时,菌株功能性油脂产量达到了5.89 g/L,比对照组提高了15.26%。
[硕士论文] 王凯
微生物学 兰州交通大学 2016(学位年度)
摘要:植酸酶是一类催化植酸盐水解为无机磷酸盐和肌醇的酶类,作为一种新型饲料添加剂,在动物营养及环境保护等领域具有很大的应用潜力。在单胃动物饲料中加入微生物源植酸酶不仅能有效提高磷的利用率,降低磷对环境污染,而且可解除植酸对饲料中营养因子螯合作用,提升饲料的营养价值,因而在国内外受到广泛关注。
  本研究对青藏高原地区土壤中产植酸酶微生物进行分离筛选,诱变选育,获得高产植酸酶菌株,并对其产植酸酶的性质进行了研究,取得了如下主要研究结果。
  1、从青藏高原土壤中共分离得到18株产植酸酶菌株,分别来自三种不同的生境,其中柴达木盆地灌丛沙丘根际分离得到10株(占55.5%),青藏高原沙化草原分离得到3株(占16.7%),青藏高原铁路沿线5株(27.8%),其它沙化地且植被较少的取样地未分离得到植酸降解菌。
  通过16s/18s rRNA基因序列分析方法对18株菌进行鉴定,其中Erwinia persicina AT1-1, Fusarium tricinctum BLH-2,Talaromyces pinophilus NMH2-1-1,Cladosporium cladosporioides NMH3-3-2菌株是首次发现植酸降解菌。对18株菌酶活的研究发现Penicillium glabrum NMH2-3-1产植酸酶活性最高(2695.3U/mL)。
  2、在28℃、160r/min条件下对菌株Penicillium glabrum NMH2-3-1进行摇瓶培养,培养6d后,对所产植酸酶进行了纯化和酶学性质研究,结果表明该酶在pH4.0~8.0和20~60℃性质稳定,最适反应温度为55℃,60℃保温1h,酶活保持在75%,具有较好的热稳定性。Mn2+、Cu2+、Al3+对该酶活具显著抑制作用,Ca2+、Mg2+显著提高该酶的活性。该酶具有较好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解能力。
  3、对Penicillium glabrum strain NMH2-3-1进行了紫外线诱变选育,得到4株高产植酸酶的菌株,分别命名为P.glabrum U1、P.glabrum U2、P.glabrum U3、P.glabrum U4,其中P.glabrum U3产植酸酶酶活最高,达到3611.3U/mL,较出发菌株提高34%。通过甲基磺酸乙酯(EMS)对P.glabrum U3株菌进行再次诱变,通过复筛,最终得到4株高产菌株,其中P.glabrum E1酶活比P.glabrum U3提高8.9%,达到4014.9U/mL,较原始出发菌株提高了近49%。对P.glabrum E1连续传代培养,产酶性能基本稳定。
  4、通过Plackett-Burman实验设计对发酵条件进行优化。结果表明,培养液中NH4NO3、MnSO4、FeSO4的浓度是影响植酸酶酶活的显著因素。利用Box-Behnken设计进行了3因子优化设计,优化得到的培养基组成及发酵条件为:淀粉1.5%、NH4NO30.375%、MgSO4·7H2O0.05%、KCl0.05%、MnSO40.008%、FeSO40.0078%,pH6.0,接种量2%,30℃,摇床转速160r/min。酶活达4197.15U/mL,较优化前菌株,植酸酶酶活提高了4.9%。
  5、在37℃条件下,用P.glabrum E1产植酸酶粗提液对麸皮、豆粕、棉粕、玉米粉四种饲料原料植酸磷降解率进行了测定,结果表明,4种原料的植酸磷含量分别为69.64%、62.82%、61.24%、44.00%,加入酶液3h后,该植酸酶粗提液对4种饲料原料中植酸磷降解率分别为47.08%、59.95%、62.48%、65.74%,表明该植酸酶对四种原料中的麸皮植酸磷降解效率最好,然后依次是豆粕>棉粕>玉米粉,对麸皮的降解率要分别比豆粕、棉粕、玉米粉高出8.82%、4.96%、28.38%。
[硕士论文] 刘彬
微生物学 内蒙古科技大学 2016(学位年度)
摘要:化石能源短缺与环境污染愈发严重,迫切要求世界能源结构发生转变,绿色、可再生的新型能源开发与利用迫在眉睫。微藻以其生长迅速、油脂积累量大、CO2固定效率高、可去除污水中有机物质等特点,成为新型能源研发的重要领域。但在实际生产中,仍存在生产成本高、生物量积累低、生物质利用不完全等问题。基于此,本文对拟微绿球藻营养盐配方进行最优化研究,实现生物量的最大化积累;以黄丝藻提油后剩余藻渣为材料,采用厌氧发酵技术制备沼气和热化学转化技术制备热解气、生物油等生物燃料,实现微藻提油后剩余藻渣的能源化利用。主要研究结果如下:
  1.研究拟微绿球藻培养液中 N、P、Fe、Mg以及维生素混合液最优化组成,进行单因素和L16(45)正交试验,结果显示:拟微绿球藻生长最佳培养基配方为NaNO30.225 g/L,NaH2PO4·2H2O0.015 g/L, FeCl3·6H2O0.0189 g/L,MgCl20.025 g/L,维生素混合液0.05 mL/L。优化后拟微绿球藻的最大生物量(OD680)可达1.544,是优化前的1.35倍。
  2.利用黄丝藻提油后剩余藻渣为原料,与牛粪混合厌氧发酵。研究发现:藻渣与牛粪混合发酵工艺,能使发酵液维持在适于厌氧发酵菌群生长的pH环境。在藻渣和牛粪混合比为4:6的厌氧发酵体系下,累计产气量(783 mL)、产甲烷速率(9.8 mL/d/g-VS)均为最大,日产气量(86 mL/d)和累计产甲烷量(88.07 mL/g-VS)较高,发酵滞留时间最短(2.1 d)。
  3.以黄丝藻提油后剩余藻渣为原料,对其进行直接热解研究。研究发现:微藻藻渣热分解最大失重峰对应温度约为335℃,低于其他木质纤维素生物质。当热解反应温度为450℃、氮气流量为50 mL/min时,生物油产量最大,为29.82%。热解气中CO2和CO占绝大部分,CO2含量随反应温度升高而降低,CO含量变化趋势与之相反。H2和C1~C3化合物含量随温度升高呈现上升趋势。生物油中含有100多种化合物,其中羰基类、烃类、含氮类化合物占主要部分。随温度升高,脂肪烃、芳香烃、酚类等小分子化合物含量增大,酮类、多糖类等大分子物质含量降低。但其中还含有较大量的含氮化合物。
  4.利用金属改性催化剂对黄丝藻提油后藻渣在固定床上进行催化热解。研究发现:黄丝藻藻渣热解过程中,金属改性 ZSM-5分子筛催化剂的加入会降低热解液体产物收率,增加热解气体产物的收率。催化热解使气体产物中 CO百分比增大,CO2百分比减少;CH4含量降低,其他碳氢组分均有不同程度增加。采用6% Ni/HZSM-5分子筛催化热解,生物油中酸类物质降至0.09%,碳氢化合物组分达34.81%,且含有较低的稠环化合物和最高的烷基苯成分(4.92%)。采用2% MgO改性6% Ni/ZSM-5分子筛催化热解,生物油产物品质最好。在此条件下,碳氢化合物含量达到最大,为35.52%。且稠环化合物含量较低,烷烃和烷基苯化合物含量均达到最大,分别为11.51%和8.48%。
  由上述结果可知,对微藻进行最优化培养,可实现微藻生物量的大量积累;采用藻渣与牛粪共发酵,可获得高品质沼气;利用直接热解技术,可制得生物油、热解气等燃料;通过催化热解方式,可提升生物油品质。
[硕士论文] 刘杉
系统工程 大连理工大学 2016(学位年度)
摘要:随着生物技术的发展,微生物反应过程在国民经济中的地位也越来越重要。由于微生物反应过程机理复杂,具有非线性、时变性、模型不确定性等特点,对微生物反应过程进行建模研究有着重要意义。另一方面,当微生物反应系统出现较为显著的随机干扰或存在某些不确定因素时,经典的控制方法很难在反应过程控制应用中取得良好的效果。因此,探究合适的建模方法和优化控制策略,并将其应用到微生物反应过程具有重要的理论意义和现实意义。本文针对这两部分做了如下工作:
  首先,研究了两类基于单一限制性基质的微生物反应过程非结构式动力学模型。第一类,建立了基于状态反馈脉冲控制的微生物培养模型,并对该模型进行理论分析。此外,通过对生物量产率的优化,得到了最佳的底物控制水平和反应器介质的去除比例,提高了资源的利用率和生物量产量及质量。第二类,建立了基于变结构控制的微生物培养模型。利用Utkin等效控制方法对模型进行定性分析,给出正常平衡态、虚拟平衡态、伪平衡态以及切点的存在条件以及全局稳定性。同时利用MATLAB软件对所建立的模型进行数值模拟,进而验证了理论结果的正确性。
  其次,为了使微生物反应过程处于稳定的最佳操作状态,同时消除振荡现象,我们将最优控制与滑模控制相结合,设计了滑模最优控制器,用来跟踪最优控制下的奇异弧,并在瞬态条件达到生物量产量最大化。此外,针对于微生物连续反应过程存在的不确定性因素可能会引起系统不稳定这一问题,采用区间二型模糊算法对反应过程进行控制。仿真结果表明:在系统参数发生扰动时,区间二型模糊控制算法能够使系统的动态性能得到有效的改善。
[硕士论文] 陈磊
生物化工 齐鲁工业大学 2016(学位年度)
摘要:本论文重点研究了坎皮纳斯类芽孢杆菌xy-7菌株产木聚糖酶最佳条件、酶的分离纯化及酶学性质、降解产物分析。
  (1)通过单因素试验结合正交实验优化后得出最佳产木聚糖酶的条件为:15g/L木聚糖、8g/L蛋白胨、0.5g/L K2HPO4、0.8g/L KCl、0.4g/L MgSO4,初始pH8.0,通风量在0.33vvm,转速300r/min,接种量3%,培养温度37℃。在此培养条件下,发酵时间为24h,酶活达到322.11IU/mL。
  (2)采用硫酸铵盐析、Sephadex G50凝胶过滤、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对类芽孢杆菌坎皮纳斯xy-7发酵液中的木聚糖酶进行分离纯化,获得纯化的木聚糖酶,纯化倍数为26.36,回收率为5.13%。最终获得电泳纯木聚糖酶,分子质量为24.5ku。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60℃,最适pH为8.0。K+、Fe2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+对酶有强烈的抑制作用。以榉木木聚糖为底物时,米氏常数 Km=4.733mg?mL-1,最大酶反应速率Vm=315.85μmol?min-1?mg-1
  (3)纸层析和 HPLC法分析榉木木聚糖和玉米芯木聚糖为底物的降解产物发现,最终酶解产物以木二糖为主,含有少量的木糖,几乎不含有其它寡糖。
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