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[硕士论文] 赵盼
养殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鹅脂肪肝(俗称肥肝)是一种营养丰富的高档食材。不同品种的鹅产肝性能存在明显差异,这表明鹅肥肝生产性能可通过遗传育种途径加以改良。目前中国用于肥肝生产的鹅品种是从国外引进的朗德鹅,由于引种费用昂贵,许多肥肝生产企业为了有利可图,常常购买引进后已多次传代、种质退化了的群体,严重影响了企业的生产效率和收益。解决这一问题的有效途径之一是对中国引进的朗德鹅群体进行选种,然而目前采用的表型选择,其选种效果并不明显。相对于表型选择,遗传标记辅助选择的优势明显。本研究旨在评估GRP78和MC5R两个基因与脂肪肝形成的关系及其多态性位点与肥肝鹅相关生产性状的关联,从而为肥肝鹅的标记辅助选择奠定基础。本研究的主要结果如下:
  1、利用荧光定量PCR检测GRP78基因在填饲第7天、14天和19天对照组(常规饲养组)和填饲朗德鹅不同组织(肝脏、腹脂和胸肌)中的表达情况。结果显示:在填饲第7天、14天和19天,填饲组朗德鹅肝脏中GRP78基因的mRNA表达量均低于对照组朗德鹅,但未达到统计显著性(P>0.05);相反,填饲组朗德鹅腹脂中GRP78基因的mRNA表达量均高于对照组朗德鹅,且在填饲第14天达到统计显著性(P<0.05)。然而,胸肉中GRP78基因的mRNA表达量在两组间没有明显差异。再者,在饲料中添加蔗糖导致肥肝中的GRP78表达量进一步被抑制,同时伴有肥肝重和腹脂重的增加,该结果表明GRP7参与鹅肥肝的形成,其表达抑制或有助于肥肝的形成。因此,GRP78是鹅肥肝辅助选择标记的良好候选基因。为探讨GRP78基因用作辅助选择标记的可行性,本研究通过PCR扩增出GRP78基因及其上游序列(<2.5kb)并测序以筛查该基因存在的SNP位点。结果发现仅在上游序列较远的位置(-1904bp~-2484bp)上存在6个SNP位点,且这些位点与测定的生产性能指标不存在显著关联,而在其他序列中并未找到SNP位点。GRP78基因编码区没有找到多态性位点反映出GRP78基因因具有重要的生物学功能而承受了较大的选择压力。
  2、利用荧光定量PCR检测MC5R基因在填饲第7天、14天和19天对照组和填饲组朗德鹅不同组织(肝脏、腹脂和胸肌)中的表达情况。结果显示:在填饲第7天、14天和19天MC5R基因在填饲组朗德鹅肝脏中的表达均显著低于对照组,且随着肝中脂肪沉积量的增加,MC5R的表达抑制变得更加明显。类似地,填饲组腹脂中MC5R基因的表达量均显著低于对照组。对于胸肌而言,在填饲第7天,填饲组与对照组间没有明显差别;在填饲第14天,填饲组低于对照组,但不显著;而在填饲第19天,填饲组显著低于对照组,且表达的抑制程度加剧。此外,与常规填饲组相比,加糖日粮的填饲进一步抑制肥肝中的MC5R表达,且这种抑制与肝重增重相关。这些结果提示,MC5R基因的表达抑制可能促进组织中的脂肪沉积,因此MC5R基因是鹅肥肝辅助选择标记的良好候选基因。
  3、为了更好地理解MC5R与鹅肥肝形成的关系,本项目检测了脂肪肝形成相关因子(高剂量葡萄糖、胰岛素和脂肪酸)对鹅原代肝细胞中MC5R基因表达的影响。结果显示:在高剂量葡萄糖、胰岛素、棕榈酸、油酸和亚油酸分别处理鹅原代肝细胞14小时后,葡萄糖和胰岛素都不同程度地诱导了MC5R的表达,而脂肪酸对MC5R表达没有显著的调节作用。这些结果与鹅肥肝组织的表达情形不一致,推测在鹅肥肝形成过程中,还存在其他因子或机制影响鹅肥肝中MC5R基因的表达。
  4、为探讨MC5R用作肥肝鹅辅助选择标记的可能性,本研究通过对PCR产物进行测序分析,查找MC5R编码区内的SNP位点,并对SNP位点与生产性能相关指标(肝重、腹脂重和胴体重)进行关联分析。数据显示:在MC5R基因编码区找到一个C/T多态性位点(起始密码子下游编码区序列的807bp处),该SNP位点并未引起MC5R氨基酸序列的改变。该SNP位点与肥肝鹅的腹脂重存在关联。CT基因型的平均腹脂重显著大于CC基因型的平均腹脂重(P<0.05),两者相差52.67g;而TT基因型与CC、CT基因型在平均腹脂重的差异未达到显著水平。SNP位点与肥肝鹅的胴体重也存在关联,CC基因型的平均胴体重显著大于TT基因型的平均胴体重(P<0.05),两者相差630g;而CT基因型与CC、TT基因型在平均胴体重上的差异未达到显著水平。然而,SNP位点与肥肝鹅的平均肝重不存在明显关联。这些结果从关联分析的角度表明,MC5R或可用于肥肝鹅的辅助选择,在保持肝重不受显著影响的情况下,对填肥后的腹脂重和胴体重进行选择。
  综上所述,通过明晰朗德鹅不同组织中GRP78和MC5R基因表达水平随填饲时间的变化规律、饲料加糖试验和脂肪肝形成相关因子对基因表达的影响,以及基因的SNP位点与肥肝鹅生产性能相关指标间的关联情况,本研究揭示了GRP78与MC5R基因在肝脏中的表达抑制有助于鹅肥肝的形成,因此两者均为肥肝鹅辅助标记的良好候选基因;在MC5R编码区筛选到的SNP或可作为辅助选择标记用于肥肝鹅腹脂重和胴体重的选择。
[硕士论文] 姚颖
养殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鹅产蛋性能低下是阻碍鹅产业发展的关键原因之一。研究已发现,鸡的产蛋就巢行为与产蛋量密切相关,但鹅的产蛋与就巢行为是否影响其产蛋性能至今尚未见有系统研究报道。基于此,本研究以产蛋量明显不同的四川白鹅、浙东白鹅、卡洛斯鹅为研究对象,采用视频自动采集系统,观察鹅只产蛋与就巢行为,并研究鹅就巢过程中卵巢形态学和激素分泌变化,分析就巢行为与产蛋量之间的关系。研究旨在了解不同鹅品种产蛋与就巢规律差异,不仅可为针对就巢性状采用有效措施提供参考依据,也为今后开展高产鹅选育提供基础数据。主要研究结果如下:
  1、为了解不同鹅品种产蛋行为特性差异,经观察发现不同品种母鹅产前均具有寻巢、巢位选择和筑巢行为。整个产程包括产前趴窝、努责产蛋、产后休息三个阶段。不同鹅品种具有不同的产蛋时间偏好性,浙东白鹅和四川白鹅产蛋时间偏好性较强,而卡洛斯鹅产蛋时间较分散。不同鹅品种连产长度和产蛋间歇长度也存在较大差异,卡洛斯鹅的平均连产长度(19.15天)显著高于浙东白鹅(14.07天)和四川白鹅(12.14天),产蛋间歇长度(4.73天)显著低于浙东白鹅(80.97天)(P<0.05),总的来说,产蛋量与连产性关系密切,因此连产性状可用于肉鹅产蛋辅助选育指标。
  2、为了解不同鹅品种就巢行为特性差异,经观察,不同鹅品种就巢行为表现相似,但就巢各时期表现差异明显。就巢中期采食饮水频次减少,体重体温降到最低点。四川白鹅母鹅就巢持续时间约49天,显著高于其他两鹅种(P<0.05)。同时对试验期内就巢鹅和非就巢鹅产蛋量进行统计分析,结果显示,卡洛斯就巢鹅平均产蛋量(13.86)显著低于非就巢鹅平均产蛋量(26.92)(P<0.05),而就巢性对四川白鹅产蛋量影响不显著(P>0.05)。浙东白鹅随着就巢次数增加,产蛋量反而上升。上述结果表明,并非所有鹅品种可通过剔除就巢鹅来提高鹅群产蛋量。
  3、为探明就巢期内鹅卵巢形态学变化,以产蛋和就巢各时期的浙东白鹅为研究对象,观察卵巢形态变化。结果显示,从产蛋期到就巢期卵巢体积逐渐变小,直径由9.38cm降低至3.61cm,皱缩程度加深。由石蜡切片和透射电镜结果可知,随着就巢的进行,卵巢萎缩退化程度加剧,闭锁卵泡数目增多。
  4、为阐明鹅就巢过程中相关基因表达变化规律,利用实时荧光定量技术检测PRL、AMH、DβH、P450scc基因在浙东白鹅不同繁殖周期不同组织中的表达情况,结果显示,PRL、AMH和Dβ何就巢期表达量显著高于产蛋期(P<0.05)。其中,PRL和DβH在下丘脑,垂体,卵巢中均表达,PRL在垂体中高表达,AMH只在卵巢中表达。相反地,产蛋期P450scc在卵巢和垂体中高表达,表达量显著高于就巢各时期(P<0.05)。同时采用ELISA试剂盒测定不同鹅品种就巢期血清中相关生殖激素的含量,测定结果显示,就巢期PRL和AMH激素含量显著高于产蛋期(P<0.05)。相反地,就巢期鹅血清中FSH、PROG和LH激素含量很低。上述结果表明,PRL和AMH对鹅就巢行为的调控起主要作用,该结果提示在生产中可通过内、外环境的改变,影响机体内分泌系统,降低就巢的发生。
  综上所述,不同鹅品种产蛋和就巢行为表现出不同的规律性,随着连产时间延长,鹅产蛋量随之增加,但是随着就巢时间延长,并非所有鹅产蛋量随之降低。在就巢过程中PRL和AMH激素对鹅就巢行为的调控起主要作用。
[硕士论文] 戴振清
特种经济动物饲养 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:内源性反转录病毒(Endogenous retrovirus,ERV)据称源于进化中感染生物体的反转录病毒,是生物体基因组组成的一部分,如人内源性反转录病毒约占基因组序列的5~8%,大部分不表达。传统观点认为内源性反转录病毒属于垃圾DNA(Junk DNA)序列,或具有感染性。内源性反转录病毒对早期胚胎发育和胚胎干细胞具有重要作用。本研究选择内源性反转录病毒—鸡内源性白血病病毒(Avian leukosis virus subgroupE,ALVE)作为研究对象,基于目前已经鉴定出鸡内源性白血病病毒能产生反义长非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA),并发现反义lncRNA lnc-ALVE1-AS1与细胞天然免疫有关联。本论文主要围绕长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1在鸡个体发育早期的表达规律、多态性分析及与鸡抗病表型关联性进行展开,初步阐明长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与鸡抗病表型的关联。
  1、禽内源性反转录病毒ALVE1在鸡基因组完整序列鉴定
  已知鸡基因组中含有禽内源性反转录病毒ALVE1序列,而ALVE1在鸡基因组中的上游和下游区域位置在参考基因组中并未成功鉴定。本研究成功鉴定出ALVE1所在鸡基因组中的上、下游序列,并通过提取CEF细胞和DF-1细胞基因组反向验证ALVE1的位置信息。与参考基因组不同的是,我们发现ALVE1序列包含3'LTR序列,在鸡1号染色体上的插入位置为chr1:65,995,534~65,993,540。本研究不仅提供了ALVE1在鸡基因组中的完整信息,也为进一步研究ALVE1的功能奠定了基础。
  2、长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1在CEF细胞和鸡个体发育早期表达规律的研究
  鉴于长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1可能与先天性免疫及以及抗病毒有关,本研究通过检测长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1在CEF细胞和鸡个体发育早期表达规律,发现禽白血病病毒抗性品系鸡G1中长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的表达量要高于禽白血病病毒易感品系鸡G3,并且早期表达量较高,这初步验证了长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1可能与先天性免疫及个体抗病毒能力相关。
  3、长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1多态性分析及与鸡抗病表型关联性研究
  通过比对禽白血病病毒抗性品系鸡G1和禽白血病病毒易感品系鸡G3的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1序列,我们发现禽白血病病毒抗性品系鸡G1的序列相比易感品系鸡G3的序列,含有一个3碱基GCG插入突变,推测可能与禽白血病抗性有关。本研究选取如皋黄鸡、海南文昌鸡和河北麻城蛋鸡等3个地方鸡种,扩增其长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1序列,并与抗性品系鸡G1和易感品系鸡G3进行比对,发现如皋黄鸡和海南文昌鸡的测序序列与抗性品系鸡G1相一致,同样含有一个3碱基GCG插入突变,而河北麻城蛋鸡的序列则与易感品系鸡G3相一致。因此推测,如皋黄鸡和海南文昌鸡可能同样具有对禽白血病具有抗性。进一步通过制备3个地方鸡种CEF细胞进行细胞攻毒实验进行验证,发现结果与预期相一致,所以易感品系鸡G1所含有的3碱基GCG插入突变可能与禽白血病抗性相关。
  综上所述,长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1可能与禽白血病病毒抗性有关,在个体发育早期免疫器官中表达量高,感染病毒后显著下调。抗性品系鸡G1中含有一个3碱基GCG插入突变,可能与禽白血病抗性相关。
[硕士论文] 王美青
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:在养鸭业中,鸭雌雄个体间因生理、行为等特性的不同导致在生产性能、饲养管理与经济用途及价值等方面存在巨大差异。在胚胎早期进行性别鉴定或者通过性别控制,提前预知甚至决定动物性别,这将会为养鸭业带来一次巨大的飞跃。本实验以凤头鸭胚为研究对象,通过比较与优化鸭胚胎期全血和尿囊液直接PCR性别鉴定方法,旨在获得一种方便、快捷、无损的早期鸭胚性别鉴定的方法。同时,通过在鸭胚中注射芳香化酶抑制剂(AI)和17β-雌二醇(E2),在性别分化关键时期观察其性腺组织学和形态学变化,成功建立鸭胚性反转模型;采用RT-qPCR方法分析AI和E2诱导的性反转鸭胚中DMRT1、SOX9、AMH、P450arom、FOXL2、SF-1等6个性别决定候选基因在性腺分化发育过程中的表达,探讨鸭性别决定相关基因的作用机制。进一步通过构建SOX9和FOXL2的干扰和过表达载体,检测性别决定关键基因的表达水平变化,为探明SOX9和FOXL2基因在鸭性别分化中功能提供理论依据。主要研究结果如下:
  1.以鸭胚全血为模板,用常规PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶直接进行PCR扩增,成功鉴定鸭胚性别,该方法同样适用于雏鸭及成年鸭血,但不适用于胚胎尿囊液性别鉴定;以鸭胚E10~E20的尿囊液为模板,应用高保真酶MightyAmp DNA Polymerase直接PCR,E17~E20的尿囊液鉴定出了鸭胚性别。两种方法均可进行直接PCR,无需提取DNA,具有简便、快速、准确特点,但胚胎期全血采样对鸭胚伤害过大,死亡率较高,难以应用于实际生产;而尿囊液属于微创采样,对孵化率影响较小,可在实际生产中推广应用。
  2.通过性腺组织形态学以及组织切片观察发现:与对照组相比,注射芳香化酶抑制剂能够使鸭雌性个体性别反转成雄性,其影响性别分化的关键时期是在8.5-10.5胚龄,并且能促进公鸭胚性腺的早熟;注射雌二醇组可使胚胎表现性别由雄性反转为雌性,其影响性别分化的关键时期也在8.5-10.5胚龄,并且能促进母鸭胚性腺的早熟。
  3.鸭胚在外源注入AI后,呈现性别反转,其中,DMRT1、SOX9、AMH在遗传雌性(ZW)胚胎性腺中表达量均出现上调趋势,表明DMRT1、AMH和SOX9等雄性决定基因与睾丸的形成紧密相关;同时P450arom、FOXL2、SF-1等雌性决定基因的表达量显著降低,与表型一致,表明AI确实能使雌性鸭胚雄性化,且能调控鸭性别决定基因表达。注入E2后发现胚胎表现性别由雄性反转为雌性,DMRT1、SOX9、AMH在遗传雄性(ZZ)胚胎性腺中表达量都明显降低,P450arom、FOXL2、SF-1的表达量均显著升高。进一步表明DMRT1、SOX9、AMH、P450arom、FOXL2、SF-1有性别决定效应,可能是通过参与性激素的合成,在性别分化后的生殖腺生长和发育过程中产生影响。
  4.在成功构建鸭SOX9基因和FOXL2基因干扰和过表达载体基础上,发现SOX9基因和OXL基因均可以调控性别决定关键基因DMRT1,还可以通过调节SF-1、AMH以及P450arom基因发挥调控性别作用,另外,SOX9和FOXL2也存在反向调控作用,进一步表明SOX9和FOXL2是决定鸭性别的关键基因。
[硕士论文] 赵凤至
动物营养与饲料科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本试验旨在研究饲粮中果胶对仔鹅生产性能、养分利用率及肠道微生物区系的影响,为今后富含果胶的非常规饲料在鹅生产上的应用提供理论基础及参考依据。选用180只体重相近且健康的28日龄扬州鹅公鹅,随机分为3个组(试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组),每组6个重复,每个重复10只。试验Ⅰ组(对照组)饲喂基础饲粮,试验Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂添加1.5%和3%果胶的试验饲粮,试验期为42天。通过饲养试验、代谢试验及16sDNA测序试验分析饲粮中果胶对仔鹅生长性能、屠宰性能、养分利用率及肠道微生物区系等方面的影响。结果显示:
  (1)1.5%和3%果胶处理组显著降低了42、56、70日龄仔鹅的体重和28~70日龄平均日增重(P<0.05),提高了料重比(P<0.05);3%果胶处理组显著降低了70日龄仔鹅的胸深和胸宽(P<0.05);1.5%果胶果胶处理组显著降低了70日龄仔鹅的胸肌率(P<0.05),3%果胶处理组显著降低了70日龄仔鹅的胸肌率和腹脂率(P<0.05);3%果胶处理组显著提高了70日龄仔鹅的脾脏指数和腺胃指数(P<0.05),显著降低了法氏囊指数和胸腺指数(P<0.05)。
  (2)3%果胶处理组显著提高了70日龄仔鹅血清中谷丙转氨酶、尿酸、高密度脂蛋白的含量(P<0.05),降低了低密度脂蛋白的含量(P<0.05);1.5%和3%果胶处理组显著提高了谷草转氨酶、尿素氮和甘油三酯的含量(P<0.05);3%果胶处理组显著提高了70日龄仔鹅肌肉水分含量(P<0.05),降低了胸肌粗蛋白质含量和腿肌粗蛋白质、粗脂肪含量(P<0.05)。
  (3)1.5%果胶处理组显著提高了70日龄仔鹅胸腹部的羽毛评分值(P<0.05),3%果胶处理组显著提高了背部、左翅、胸腹部及尾部的羽毛评分值(P<0.05),显示果胶含量越高羽毛越脏。
  (4)1.5%和3%果胶处理组能够显著降低仔鹅对饲粮中粗蛋白质和粗脂肪的利用率(P<0.05)。
  (5)3%果胶处理组显著提高了42日龄回肠肌层厚度、56日龄日龄空肠隐窝深度、70日龄回肠重量(P<0.05),降低了42日龄十二指肠绒毛高度、56日龄十二指肠肌层厚度、回肠绒毛高度及隐窝深度、70日龄盲肠重量(P<0.05)。
  (6)肠道微生物结果显示,饲粮中较高的果胶含量:降低了仔鹅十二指肠物种丰度及物种多样性,提高了变形菌门(Proteobacteria)和螺杆菌属(Helicobacter)的相对丰度;降低了仔鹅空肠物种丰度及物种多样性,提高了厚壁菌门(Firmicutes)、螺杆菌属(Helicobacter)、乳球菌属(Lactococcus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、链球菌属(Streptococcus)和巨单胞菌属(Megamonas)的相对丰度;提高了仔鹅回肠物种丰度及物种多样性,提高了厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺杆菌属(Helicobacter)、乳球菌属(Lactococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和链球菌属(Streptococcus)的相对丰度,降低了厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度;提高了仔鹅盲肠物种丰度及物种多样性,提高了拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和梭菌属(Clostridium)的相对丰度,但降低了盲肠中拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺杆菌属(Helicobacter)、拟杆菌属(Batcteroides)的相对丰度。
  综上所述,饲粮中较高的果胶含量对仔鹅生长性能、屠宰性能、养分利用率等具有不良影响,推测果胶可通过改变肠道微生物区系对其生长性能、屠宰性能、养分利用率等产生不利影响,在生产实践中,对于一些富含果胶的饲料原料,应当注意其使用量。
[硕士论文] 吴诗樵
动物营养与饲料科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本论文利用单胃动物仿生消化系统模拟鸡胃肠道的消化,探究外源蛋白酶对饲料原料总能和氨基酸的消解规律,首先分析外源蛋白酶添加剂量和上样量对饲料原料养分消化率的影响,确定外源蛋白酶的最适添加量,继而研究不同仿生参数条件下外源蛋白酶对饲料原料体外养分消化率的影响,并分析外源蛋白酶对常用饲料原料养分消化率提升作用,为快速评价饲用酶制剂有效性提供方法参考。
  1、外源蛋白酶添加剂量和上样量对豆粕饲料原料体外养分消化率的影响。不同添加剂量的外源蛋白酶对豆粕体外干物质、能量消化率和酶水解物能值均有显著提高作用(P<0.01),并能够显著提高氨基酸消化率(P<0.05)。上样量为1g的豆粕的体外养分消化率显著高于上样量为2g时的测值(P<0.01)。外源酶的添加剂量与豆粕上样量对酶水解物能值存在互作效应(P<0.01)。外源蛋白酶添加量为2500mg/kg,豆粕剂量为1g时,豆粕的体外养分消化率最高。
  2、不同仿生参数条件下外源蛋白酶对豆粕饲料原料体外养分消化率的影响。试验共分为五个部分,分别研究在不同模拟胃液接触时间、pH值、体积、蛋白酶浓度条件下外源蛋白酶的作用以及外源蛋白酶的作用部位。试验一结果表明随着胃液接触时间的延长,外源蛋白酶的消化作用越显著,豆粕的养分消化率越高,在240min时,豆粕样品中养分的消化率达到最大值。试验二结果表明豆粕的养分消化率随着pH值增加而减少,添加外源蛋白酶的豆粕在pH值为2.0时,样品的养分消化率可达到最大值(P<0.01)。试验三表明豆粕饲料的养分体外消化率随着胃液体积的减少而增加(P<0.01),但外源蛋白酶降低了豆粕干物质和能量消化率(P<0.01)。试验四结果表明豆粕消化率随着胃液蛋白酶浓度的增加而增大,胃液蛋白酶浓度为3100U/mL时达最大(P<0.01)。不添加外源蛋白酶的豆粕消化率在胃蛋白酶浓度为3100U/mL时模拟胃消化中达最大(P<0.01)。试验五试验结果表明,外源蛋白酶在胃消化阶段和小肠消化阶段均能显著提高豆粕样品的体外养分消化率(P<0.01),且有小肠段豆粕养分消化率高于胃段消化率的趋势。
  3、外源蛋白酶对鸡常用饲料原料体外养分消化率的影响。添加外源蛋白酶的鸡常用饲料原料的干物质和能量消化率与对照组差异不显著;外源蛋白酶提高了棉粕、玉米和酒糟的表观和标准化蛋氨酸消化率(P<0.05),提高了甜菜粕的组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸的标准化氨基酸消化率(P<0.05)。
[博士论文] 李婷婷
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:畜禽的产肉潜力与其肌纤维数量密切相关,而动物胚胎发育后期和动物出生后,肌纤维数量基本已固定。胚胎肌肉发生主要依赖于成肌细胞的增殖和分化,其增殖和分化的能力很大程度上能够决定动物出生后的肌纤维数量。为了探讨家禽骨骼肌发育的受调控情况,特别是由成肌细胞向肌管分化的过程,本研究以鸡为研究对象,以鸡原代成肌细胞为工具,利用RNA-seq技术对鸡原代成肌细胞分化过程中的mRNA、lncRNA和miRNA进行鉴定和分析,主要结果如下:
  研究一:分离培养鸡原代成肌细胞并诱导分化,利用RNA-seq技术分析成肌分化第0、1、3和5天的lncRNAs和mRNAs表达情况,结合生物信息学分析方法,鉴定在成肌分化过程中表达的lncRNAs,预测其可能的生物学功能。同时筛选成肌分化过程中的差异表达lncRNAs和mRNAs,进行K-means表达聚类分析。
  1、共鉴定出2,484条lncRNAs,其中包括2,285条基因间区长链非编码RNAs和199条反义长链非编码RNAs。这些lncRNAs在染色体上的分布具有明显的偏好性,1号染色体上分布最多(367)。与鸡已知的蛋白编码基因相比,lncRNAs具有更短的转录本、ORF长度以及更少的外显子数。
  2、选取lncRNA上下游10kb范围内的蛋白编码基因为其cis作用的靶基因,结果在1,530个lncRNAs附近共发现2,041个蛋白编码基因。功能富集分析显示,鸡原代成肌细胞分化过程中的lncRNAs在多条骨骼肌发育相关的通路中显着富集,如肌动蛋白细胞骨架调节、胰岛素信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路以及黏着斑。
  3、以皮尔森相关系数为筛选依据(r>0.95或r<-0.95,p<0.05),选择与lncRNAs显着相关的蛋白编码基因为其trans作用的靶基因,结果发现990个lncRNAs与7,436个蛋白编码基因显着相关,78,202对为正相关关系,27,724对为负相关关系。功能富集分析显示,鸡原代成肌细胞分化过程中的lncRNAs主要被富集在细胞周期、黏着斑、p53信号通路以及细胞外基质受体互作等生物学通路,参与成肌细胞增殖、分化和融合过程。
  4、在鸡原代成肌细胞分化过程中共筛选到906个差异表达lncRNAs和4,422差异表达mRNAs。功能富集分析显示,差异表达基因主要富集在骨骼肌分化、有丝分裂、细胞迁移和粘附等相关的生物学进程,同时发现多个成肌分化相关通路,如ECM受体互作、黏着斑、DNA复制、细胞粘附分子、细胞周期、肌动蛋白细胞骨架调控、PPAR信号通路等。
  5、对差异表达基因表达数据进行K-means聚类分析,最终将4,422个差异表达基因聚为4个类别(命名为K1、K2、K3和K4)。功能富集分析表明,K1可能在成肌细胞增殖或由增殖过渡到分化过程发挥重要作用;K4可能与成肌细胞分化启动或初始分化密切相关;K2和K3则可能与成肌细胞迁移、粘附以及融合有关。
  研究二:基于cis靶基因预测,联合差异表达基因数据,构建lncRNA-mRNA互作调控网络,筛选参与鸡骨骼肌发育调控的潜在候选因子;以鸡原代成肌细胞分化过程中的差异表达lncRNAs和差异表达mRNAs为数据源进行WGCNA分析,鉴定成肌分化过程中的功能模块,筛选调控鸡骨骼肌分化的重要候选因子。
  1、构建差异表达lncRNAs及其共表达cis作用靶基因间的互作网络。该网络中lncRNAs主要被富集在肌动蛋白细胞骨架调节、ErbB信号通路和胰岛素信号通路,参与骨骼肌分化、有丝分裂、细胞迁移和粘附等相关的生物学进程。SIX2、PAK3、HA CD1、SULF1、SOCS1、MFN2、SIK1、CFL2、ACTC1、TNNI2等以及与它们关联的lncRNAs可被视为参与调控鸡骨骼肌发育的重要候选分子。
  2、WGCNA分析鉴定到6个与有丝分裂、肌细胞分化、肌动蛋白细胞骨架动态调节、能量代谢、细胞迁移和粘附等GO分类密切相关的基因模块。模块中高连通性枢纽基因可能对骨骼肌发育具有潜在的重要作用,包括TRIM55、DES、FAM65B、ACTC1、TNNI2、FEN1、AIF1L、ALDBGALT0000002581、NEK6、FAR-1等。
  研究三:利用RNA-seq技术获得成肌分化过程中miRNA的表达谱。结合生物信息学分析方法,鉴定在成肌分化过程中表达的miRNAs,预测其可能的生物学功能。同时,整合差异表达miRNAs和mRNAs表达数据,辅以多种功能性分析和互作网络构建软件进行miRNA-mRNA联合分析,筛选参与鸡骨骼肌发育调控的潜在候选因子。
  1、共鉴定出712个miRNAs成熟体,对应584个miRNA前体,属于123个miRNAs家族,此外还鉴定到224个新miRNAs。
  2、鸡原代成肌细胞中miRNA的表达量普遍较低,其中TPM在1-10的miRNAs数目占总miRNAs数量的85.32%以上,大于10,000的miRNAs仅占1.4%左右。
  3、每个文库表达丰度前15共19个miRNAs的靶标通路分析表明,介导靶向抑制参与鸡原代成肌细胞分化调控的功能性miRNAome可能很小且趋于高表达。
  4、对成肌细胞不同分化阶段的miRNA表达进行差异表达分析,共鉴定出298个DEMs。相邻阶段DEMs功能富集分析显示,DEMs在骨骼肌发育、有丝分裂、细胞迁移和粘附相关的通路显着富集。
  5、构建差异表达miRNAs及其差异表达靶基因间的互作调控网络,筛选到多个参与鸡骨骼肌发育调控的潜在候选因子,如miR-206、miR-133b、miR-204、miR-214、miR-7、miR-7b、miR-146b-5p、miR-222b-5p、miR-10a-5p、miR-203a、miR-10b-5p、miR-34a-5p、miR-218-5p、CDK6、AOX1、FS TL1、SESN1、TIMP2等。
[硕士论文] 曹正锋
养殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:随着人民生活水平的不断提高,风味独特、肉质鲜美的肉产品越来越受到消费者欢迎。一般认为,肉品质除受品种、饲养环境与方式、饲料营养水平等因素影响外,上市日龄对肉品质的影响也非常大。研究已发现,随着日龄的增加,体内的呈味物质(氨基酸等)也随之变化,从而使肉品质发生改变。但由于在肉鸭上缺乏相关的研究,导致其上市日龄不统一,产品参差不齐。本研究以樱桃谷鸭和白改鸭为研究对象,分别探讨不同日龄对肉鸭肌肉发育及营养物质含量的影响,以期为快大型肉鸭和优质小型肉鸭确定合理的上市日龄与产品分级提供参考依据。试验主要结果如下:
  1.不同日龄对樱桃谷鸭肌肉生长发育的影响:对28日龄、38日龄、42日龄、45日龄等不同日龄樱桃谷鸭肌肉生长和肌纤维发育进行测定,结果显示,樱桃谷鸭38日龄后增重速度明显减缓,胸、腿肌重也表现为类似的趋势;肌纤维面积测定结果显示,早期胸肌和腿肌的肌纤维面积增粗明显,38日龄胸肌、腿肌的肌纤维面积分别达791.48μm2,3180.76μm2,而后随日龄增加,腿肌肌纤维发育开始滞缓,42日龄后,胸肌肌纤维发育也出现减慢。不同日龄肌肉发育相关基因表达量检测结果表明,胸肌PPAR-α和MyoD表达量在38日龄时达到峰值,腿肌在42日龄时达到峰值,而胸肌MSTN的表达量在45日龄时达到最高,腿肌MSTN在42日龄时达到最高。由上可以看出,樱桃谷鸭38-42日龄肌肉生长和肌纤维发育达到最佳,而45日龄时出现明显的滞缓。
  2.不同日龄对樱桃谷鸭肌肉营养物质沉积的影响:对28日龄、38日龄、42日龄、45日龄等不同日龄樱桃谷鸭肌肉常规营养成分、金属元素含量、氨基酸含量和脂肪酸含量进行测定,结果显示,38日龄时胸肌蛋白含量达22.62%,显著高于其他3个时期(P<0.05),而42日龄时脂肪含量达到最低水平;胸肌中Fe、Mg、P、K含量均在38日龄时最高,Cu含量在42日龄时最高;肌肉氨基酸含量测定结果显示,除蛋氨酸外,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等6种人体必需氨基酸和丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸等呈味氨基酸均在38日龄时达到峰值,其中38日龄时肌肉谷氨酸含量达到了33.72g/kg;肌肉脂肪酸含量测定结果表明,38日龄胸肌中花生四烯酸、DHA、多不饱和脂肪酸含量达到峰值,而硬脂酸、饱和脂肪酸含量在42日龄表现最高。由上可以看出,从绝大多数指标来看,38-42日龄肌肉营养物质沉积达到峰值。
  3.不同日龄对小型肉鸭肌肉生长发育的影响:对42日龄、49日龄、56日龄的白改鸭和莆田黑鸭肌肉生长和肌纤维发育进行测定,结果显示:白改鸭早期生长发育明显快于莆田黑鸭,且两者在49-56日龄阶段体重及胸、腿肌的增重速度均有所减缓;肌纤维面积测定结果显示,白改鸭与莆田黑鸭肌纤维生长发育趋势相似,49-56日龄阶段胸、腿肌肌纤维面积增大的趋势逐渐减小,56日龄时胸肌分别达到719.74μm2、611.45μm2,腿肌分别达到2608.32μm2、2360.56μm2;不同日龄肌肉发育相关基因表达量检测结果表明,白改鸭胸、腿肌的PPAR-α、MSTN基因均在56日龄时表达量最高,而腿肌MyoD基因在56日龄时达到峰值。由此看出,白改鸭早期生长和肌纤维发育较快,但49日龄后增幅明显减缓。
  4.不同日龄对小型肉鸭肌肉营养物质沉积的影响:以白改鸭和莆田黑鸭为实验材料,对42日龄、49日龄、56日龄的肌肉常规营养成分、金属元素含量、氨基酸含量和脂肪酸含量进行了测定。结果显示,白改鸭与莆田黑鸭肌肉蛋白沉积和金属元素沉积表现出相似的趋势,胸肌蛋白含量均在56日龄时最高(p<0.05),胸肌中Ca、Mg、P、K等金属元素均在56日龄达到峰值,但两者脂肪沉积表现出相反的趋势,随日龄增加,白改鸭肌肉脂肪随之升高,莆田黑鸭变化不明显。肌肉氨基酸含量测定结果显示,除莆田黑鸭肌肉中苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸外,两个品种肌肉的苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等人体必需氨基酸随日龄增加变化不明显;除莆田黑鸭肌肉甘氨酸和脯氨酸外,两个品种的谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸等呈味氨基酸也随日龄增长而变化不明显。脂肪酸含量测定结果表明,不同鸭品种表现出一定的差异性,白改鸭的胸肌中多种不饱和脂肪酸在49或56日龄处有较高含量的富集,莆田黑鸭的胸肌中多种不饱和脂肪酸的含量在42或56日龄处有较高的富集。由上可以看出,对于小型鸭而言,肌肉中蛋白含量,Ca、Mg、P、K等金属元素含量以及不饱和脂肪酸含量随着日龄增加而增加;但肌肉氨基酸含量随日龄增加沉积不明显。这一结果也澄清了并非所有肌肉营养物质都是随着日龄增加而逐渐转化和积累的观点。
  综上,对于大型肉鸭(樱桃谷鸭)而言,38-42日龄时肌肉生长和肌纤维发育达到最佳,且在该时期内,肌肉蛋白含量,Fe、Mg、P、K等金属元素含量,丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酸等呈味氨基酸含量以及花生四烯酸、DHA、多不饱和脂肪酸含量达到峰值,因此建议生产中,大型肉鸭以38-42日龄上市为宜。对于白改鸭而言,早期生长和肌纤维发育较快,49日龄后增幅明显减缓;且随着日龄增加,肌肉中蛋白含量,Ca、Mg、P、K等金属元素含量,不饱和脂肪酸含量而增加,56日龄达到最大值,建议生产中以56日龄上市为宜;鉴于莆田黑鸭56日龄体重较小,可适当延长上市时间。
[博士论文] 王莎莎
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鸭脂肪细胞的形成与脂肪沉积属于复杂性状,一方面脂肪组织在维持机体稳态具有重要作用,另一方面脂肪异位过度沉积与饲料转化率、机体疾病密切相关。另外,肌肉与皮下、腹部组织中对脂肪含量的需求也截然不同,这些都是行业亟待解决的关键问题。本研究以脂肪沉积存在显著差异的樱桃谷鸭、凤头鸭及其F2资源群体为对象,从群体表型、全基因组、转录组水平等筛选出影响鸭脂肪细胞形成与脂肪沉积的候选功能基因,并整合全基因组关联分析(GWAS)与RNA组学数据,利用联合荟萃分析的方法,进一步鉴定出与脂肪生成与沉积相关的关键功能基因,旨在筛选出一批影响鸭脂肪生成与沉积的候选功能基因,为全面揭示不同鸭品种、不同部位脂肪生成与沉积的分子调控机制以及降低脂肪异位沉积造成的危害提供参考依据。
  主要研究结果如下:
  1.鸭原代前脂肪细胞诱导体系建立与成脂能力研究
  以20胚龄(E20)樱桃谷鸭脂肪组织为材料,胶原酶消化分离培养鸭原代前脂肪细胞。由于家禽的脂肪细胞自身不能合成脂肪酸,因此需要添加外源脂肪酸刺激成脂,本研究选用油酸作为鸭原代前脂肪细胞诱导剂,在10μg/μL胰岛素,1μm/L DEX,0.5mmol/L IBMX,1μM罗格列酮组成的基础配方中添加不同浓度油酸(100μM,300μM,600μM),来探究油酸在鸭前脂肪细胞成脂过程中的作用。通过表型的定性观察和定量测定,发现在诱导2天后,视野中发现形似亮斑的小脂滴,油红O染色为红色的亮斑,诱导4-6天后,小脂滴逐渐累积,体积从小到大,梭形的前脂肪细胞开始回缩,诱导8天后,前脂肪细胞分化为圆形的脂肪细胞,细胞质被大量的脂滴填充,细胞核位于一侧,视野中的前脂肪细胞发育成椭圆形或圆形成熟脂肪细胞,所有细胞几乎都染成红色,而作为脂滴主要成分的甘油三酯含量随着诱导时间的增加逐渐升高。同时,发现在油酸添加量为300μM时,前脂肪细胞的成脂量最高,且在一定范围内,随着油酸浓度的增加,成脂量逐渐增加,增加到600μM时,油酸对成脂存在一定程度的抑制作用。根据诱导效率和表型检测,最终建立了最佳诱导体系:10μg/uL胰岛素,1μm/L DEX,0.5mmol/L IBMX,1μM罗格列酮以及300μM油酸,成功将鸭前脂肪细胞诱导为脂肪细胞。
  生产中发现大体型肉鸭品种—樱桃谷鸭与小体型鸭品种—凤头鸭相比,无论是在肌内脂肪、腹脂含量或者皮下脂肪含量上均存在显著差异,推断其前脂肪细胞的成脂能力可能存在差异。通过分离樱桃谷鸭与凤头鸭胚胎20天(E20)脂肪组织的前脂肪细胞,经过3天体外诱导后,通过CCK-8检测发现樱桃谷鸭在前脂肪细胞的增殖能力以及脂肪细胞中TG含量均显著高于凤头鸭,表明了大体型的樱桃谷鸭具有较强的脂肪生成能力。
  2.全转录组测序筛选鸭脂肪细胞成脂关键功能基因
  为筛选鸭脂肪细胞成脂关键功能基因,以20胚龄(E20)樱桃谷鸭原代脂肪前体细胞为素材,在上述前脂肪细胞的体外分离与诱导模型的基础上,对前脂肪细胞与诱导72h后的脂肪细胞进行全转录组测序,分析mRNA,miRNA,lncRNA与circRNA的差异。结果表明,与前脂肪细胞相比,诱导72h后的脂肪细胞中共筛选到4702个差异表达的mRNA(2606个基因显著上调,2096个基因显著下调),839个差异表达的lncRNA(58个lncRNA显著上调,781个lncRNA显著下调),141个差异表达的circRNA(66个circRNA显著上调,75个circRNA显著下调),59个差异表达的miRNA(32个miRNA显著上调,27个miRNA显著下调)。通过GO与KEGG功能注释发现,差异基因大量地富集在与脂肪有关的不饱和脂肪酸、脂肪酸的生物合成以及细胞代谢等过程中,通路分析的结果显示,差异表达基因显著富集在脂肪酸代谢通路,类固醇的生物合成,PPARγ信号通路等。采用RT-qPCR对9个mRNA,7个lncRNA,7个circRNA,15个miRNA在樱桃谷鸭样本上进行验证,发现表达趋势、差异显著性与转录组测序结果均一致,证实了转录组测序结果的可靠性。通过生物信息学预测了差异表达lncRNA与circRNA的靶向miRNA,构建了lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA的竞争内源调控机制,其中,起关键的作用包括XLOC_014103-miR-181b-5p-MMP13,XLOC_001895-miR-122-5P-KLF2,circ_0003172-miR-15c-5p-LYZ,circ_0009143-miR-206-FAS和circ_0003172-miR-219b-KLF2等,为进一步研究鸭脂肪细胞中的成脂机制奠定了基础,筛选出与成脂过程中的关键RNA。
  在上述初步筛选的基础上,我们将鸭脂肪细胞成脂关键功能基因,包括DLK1,PPARγ,FAS,C/EBPα,FABP4和LPL进行细胞水平的功能验证,发现随着前脂肪细胞的分化与脂肪形成的过程中,DLK1作为前脂肪细胞因子在前脂肪细胞中表达量最高,伴随着诱导过程其表达量逐渐下降,到诱导10天后,DLK1的表达量最低,几乎不表达。FABP4和LPL基因的表达量最高峰出现在诱导10天后,而在诱导8天后,C/EBPα和FAS的表达量达到最高点。随着诱导分化时间的延长,PPARγ的表达逐渐增加,最高峰在诱导后的第6天。以上表明DLK1,PPARγ,FAS,C/EBPα,FABP4和LPL等基因在脂肪形成中均发挥重要作用。
  为了进一步研究PPARγ这一影响家禽脂肪性状的明星基因,同时以上测序数据与细胞水平验证结果,也发现PPARγ在鸭脂肪形成中发挥着关键作用。因此,我们筛选出对PPARγ特异性干扰作用的siRNA进行了敲低实验。干扰PPARγ48h后,发现原代脂肪细胞TG含量下降,同时相关成脂基因的mRNA表达水平也表现为下降,其中,转录因子C/EBPα与FABP4基因的表达水平均下降但差异不显著,而LPL的表达水平显著下降(P<0.05)。表明PPARγ确实能够影响鸭脂肪形成,并发挥关键作用,是重要的候选基因之一。
  在上述试验中已经发现樱桃谷鸭与凤头鸭的成脂能力存在差异,为探明不同品种的成脂差异的分子机制,我们对樱桃谷鸭与凤头鸭的的差异miRNA和关键mRNA进行了比较分析。首先从诱导72h后的凤头鸭脂肪细胞与前脂肪细胞比较中筛选出影响凤头鸭成脂的关键miRNA,结果发现差异显著的miRNA有105个(50个miRNA显著上调,55个miRNA显著下调)。选择其中7个miRNA在凤头鸭原代细胞中进行表达水平验证,结果与测序结果一致。在樱桃谷鸭与风头鸭中,共有37个miRNA是樱桃谷鸭与风头鸭所共有的,且在这37个交集miRNA中,有31个在2个品种中的表达趋势是一致的,推测这些miRNA可能在脂肪的生成过程中发挥不可缺少的作用;同时发现有22个miRNA在樱桃谷鸭成脂过程特异表达,68个miRNA在凤头鸭的成脂过程特异性的发挥作用,通过靶基因预测后,我们发现了419个特异性在樱桃谷鸭成脂过程表达的基因,显著富集到了包括脂肪酸的延伸,生成和代谢等过程。进一步对其中的成脂关键基因:PPARγ
[硕士论文] 赵悦
动物营养与饲料科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本试验旨在研究饲粮中添加壳聚糖对仔鹅生长性能、屠宰性能、养分利用及肠道发育、肠道微生物组成等的影响,以确定仔鹅饲粮中壳聚糖适宜添加量,并初步探讨其作用机理。选取360只14日龄健康、体重相近的扬州鹅公鹅,随机分为5个组,每组6个重复,每个重复12只鹅。对照组(A组)饲喂基础饲粮,试验组(B、C、D、E)分别饲喂添加250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg、2000mg/kg壳聚糖的试验饲粮,试验期56d。从壳聚糖对仔鹅生长性能、屠宰性能、营养物质的利用、肠道发育、肠道微生物等方面的影响来探讨其应用效果,并筛选出添加效果较好的剂量。试验结果表明:
  1.饲粮添加500mg/kg壳聚糖显著提高42、56和70日龄仔鹅体重,各阶段平均日采食量、平均日增重(P<0.05),显著降低各阶段料重比(P<0.05)。添加1000mg/kg和2000mg/kg壳聚糖时,仔鹅体重、平均日采食量、日增重呈下降趋势(P<0.05),同时料重比升高(P<0.05)。2.饲粮添加500mg/kg壳聚糖显著提高仔鹅心脏指数、肝脏指数、脾脏指数、空肠指数、回肠指数和盲肠指数(P<0.05),降低腹脂率和肌肉中脂肪含量(P<0.05)。3.饲粮添加250、500mg/kg壳聚糖组粗脂肪表观利用率显著高于试验2000mg/kg组(P<0.05),同时干物质表观利用率显著高于对照组(P<0.05)。4.饲粮添加500mg/kg壳聚糖显著提高各肠段长度和重量,并显著提高十二指肠、空肠及回肠的绒毛高度、肌层厚度,降低隐窝深度(P<0.05),而添加1000和2000mg/kg壳聚糖时,十二指肠、空肠及同肠绒毛长度变短、隐窝深度升高(P<0.05)。5.添加500mg/kg壳聚糖增加肠道微生物区系中厚壁菌门、链球菌属、消化球菌属、瘤胃球菌属的相对丰度,降低拟杆菌门、变形菌门、巨单胞菌属的相对丰度。添加500mg/kg壳聚糖与对照组物种相似性较低,随着添加剂量的增加(1000、2000mg/kg)与对照组菌群相似性较高,达到0.34。
  综上所述,饲粮中壳聚糖使用量为250mg/kg、500mg/kg,显著提高仔鹅平均日采食量、平均日增重,饲料干物质和粗脂肪利用率以及各肠段长度重量,并显著降低仔鹅腹脂率,同时增加有益菌数量,尤以添加500mg/kg的结果较为显著;当饲粮中壳聚糖使用量为1000mg/kg、2000mg/kg,仔鹅生长发育迟缓,腹脂率和有害菌数量增加。综合本试验研究结果,建议仔鹅生产应用中壳聚糖使用量为500mg/kg。
[硕士论文] 程少泽
特种经济动物饲养 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:生殖干细胞在有性繁殖的生物中肩负着将遗传信息在世代中传递的重要任务,通过精卵结合产生新的个体。对于具有这些特殊性质的生殖干细胞,科学家们早在十年前就致力于体外培养和诱导分化成精子和卵子的研究,试图使得精子和卵子能源源不断地通过体外分化产生,这一研究一旦取得成功,将对了解生殖细胞的发生、调控机理、遗传修饰以及临床治疗不育疾病产生深远意义的影响。多年以来,对于其发生机制的研究从未停止过,其主要涉及到关键基因、生长因子等因素的调控,而随着研究的深入,lncRNA在细胞分化中发挥的重要作用逐渐被人发现。
  lncRNA作为一度被忽视的角色,越来越多的研究发现,其在生物学过程中发挥着不可替代的作用。由于lncRNA在表观遗传、转录水平参与调控许多生理过程中的作用,已得到较为深刻的认知,但对生殖细胞分化的调控研究相对较少。本研究通过单细胞的高通量测序方法检测了鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)、原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)、精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)、成纤维细胞(CEFs)四种细胞的lncRNA表达模式,通过对结果的比较分析,发现胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化这一个复杂的过程中有众多的lncRNA参与其中。而PGCs作为生殖细胞的祖细胞,对其调控的研究具有重要的意义。多年以来,对于PGCs发生机制的研究一直是人们关注的热点,其中主要集中在一些内源性调控因素以及外源性活性物质,而lncRNA在PGCs的发生过程中所扮演怎样的角色,还少有报道,本研究筛选出其中在PGCs中特异高表达的lncRNA,TCONS_00948124,在ESCs和SSCs中低表达,推测该lncRNA可能参与了PGCs的发育调控,将其命名为PGClnc1。
  为了系统地研究PGClnc1的功能与机制,本研究通过对PGClnc1进行功能性获得和缺失,旨在探索其在PGCs形成过程中的功能及其参与转录水平的调控因素;利用RNA-PullDown,质谱分析等技术探究与其互作的蛋白及其调节方式,以及探究PGClnc1与cis预测的靶基因BTRC,两者与miRNA之间的ceRNA竞争机制:为阐明PGClnc1在PGCs形成过程中的分子调控机制提供基础依据。
  研究结果如下:
  (1)ESCs向PGCs和SSCs分化过程的IncRNA单细胞测序分析收集鸡的ESCs、PGCs、SSCs、CEFs细胞,提取RNA,进行RNA-seq,筛选出参与胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞(PGCs、SSCs)分化过程的差异lncRNA,其中8个lncRNA与ESCs对PGC组的表达变化超过10倍,而在ESCs与SSCs组中的4个lncRNA和PGCs与SSCs组的1个相关lncRNA表达变化超过10倍,包括STRA8,WDR91,WNT7A,PTPDC1,BARX1等。对DELs进行GO功能注释表明,超过75%的DELs富集于生物过程,包括细胞因子刺激反应、分化;超过15%DELs富集在分子功能,与miRNA、双链DNA结合有关;而超过8%的DELs富集于细胞成分,与细胞膜表面、细胞器子室相关。DELs的KEGG通路富集分析,20个信号通路显着富集于三组中,包括Jak-STAT signaling pathway和细胞因子。细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、叶酸生物合成(Folate biosynthesis)、TGF-beta signaling pathway、Wnt signaling pathway和mTOR signaling pathway、内质网蛋白加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)、嘌呤代谢(Purine metabolism)、胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)和Hedgehog signaling pathway等。在这些信号通路中,DELs主要包括ENSGALG00000002005、ENSGALG00000005733、ENSGALG00000002403、ENSGALG00000001967、ENSGALG00000003339、ENSGALG00000006431、ENSGALG00000006794等。荧光定量PCR检测结果显示这些lncRNA的表达量与RNA-seq结果相一致。
  (2)PGClnc1的筛选与鉴定对筛选获得的差异lncRNA进行分析后发现,在ESCs vs PGCs、ESCs vs SSCs和PGCs vs SSCs组分别有354,654和239个特异novel lncRNA;且共有367个特异表达lncRANA参与生殖细胞分化,其中包括ENSGALG0000000038,ENSGALG0000015297,ENSGALG0000011415等;KEGG通路富集结果表明XLOC_612989(ACVR2A)、XLOC_478357(Lef-1)、XLOC_225283(MAPK1)等lncRNA能够显著的富集于18条参与雄性生殖细胞分化的关键信号通路,如TGF-β,Notch和Jak-STAT等信号通路;其中PGCs特异表达的lncRN(TCONS_00948124)显著富集于TGF-βsignaling pathway,命名为PGClnc1;表达谱检测结果表明:PGClnc1在性腺中高表达,且主要表达于细胞质中,扩增PGClnc1的4个开放阅读框(ORF2、ORF3、ORF6、ORF8),连接带有his标签的原核融合表达载体pET28a(+)载体,经IPTG诱导细菌蛋白进行Western Blot检测,发现PGClnc1的ORF2可诱导表达his标签蛋白,进而确定PGClnc1具有编码小肽的能力。
  (3)启动子调节PGClnc1差异表达结合NCBI和UCSC数据库,确定PGClnc1转录起始位点上游1500bp左右的序列为PGClncq1启动子并克隆,置换扩增pEGFP-N1载体中的CMV启动子,将重组载体pPGClnc1-EGFP进行体外转染DF-1细胞,绿色荧光能够正常表达,说明克隆的PGClnc1启动子区域具有活性;通过缺失片段克隆技术,构建PGClnc1启动子不同缺失片段载体PGL3-P1~PGL3-P6,并通过双荧光素酶报告系统检测发现PGClnc1启动子核心区域为-1033~-661bp;PGClnc1启动子核心区域存在STAT1、TCF7L2、Sox2转录因子结合位点,对这些位点进行点突变实验同时构建相应转录因子点突变载体,通过双荧光素报告系统检测发现这些转录因子对启动子的活性都有一定的正向调控作用,其中TCF7L2作用极显著;利用5-Azadc(10μmol/L)、TSA(1μmol/L)处理转染P GL3-P1的DF-1细胞,发现DNA甲基化抑制剂5-Azadc以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理后,PGClnc1启动子活性由8.36±3.33上升至68.99±2.29、141.7±3.12,表明降低DNA甲基化水平和提高组蛋白乙酰化水平能够提高PGClnc1启动子活性。
  (4)PGCInc1在PGCs形成过程中的功能针对PGClnc1序列设计3个shRNA靶位点,构建慢病毒干扰载体,并进行慢病毒包裹,以qRT-PCR检测慢病毒干扰载体的干扰效率。成功构建干扰载体PGClnc1-sh1、PGClnc1-sh2和PGClnc1-sh3,干扰效率分别为29%±0.04、77%±0.02和47%±0.05(P<0.01),通过体内和体外两个水平研究PGClnc1在PGCs形成过程中的功能,结果显示:体外实验过程中,在过表达组诱导4天后能出现生殖样细胞,且生殖标记基因有显著性的上调表达,敲除组在相同的情况下则不能。流式细胞分选结果表明,在第4d,正常诱导分化的细胞中类PGCs样细胞所占比例为4.5%±0.19,而在过表达PGClnc1后,比例上升至5.9%±0.21(P<0.01),相对地,敲低PGClnc1后,比例显著下降至1.1%±0.2(P<0.01)。荧光定量实验结果也显示PGClnc1敲低后PGCs的标记基因cvh的表达(0.3412±0.03)与正常组(1.02454±0.03)相比出现了显著的下调(P<0.01);间接免疫荧光结果显示,相对于RA诱导组,过表达PGClnc1后CVH蛋白表达增加,而在敲低PGClnc1后,CVH蛋白表达却显著下降;体内实验过程中,鸡胚注射慢病毒载体10μL106TU/mL+90μL DMEM,注射后能够稳定表达EGFP且鸡胚能够激发绿色荧光。qRT-PCR结果显示在敲低PGClnc1后,cvh、c-kit生殖相关基因大幅度下降到0.245±0.199、0.17±0.0458,过表达PGClnc1,体内各个基因的表达量发生了相反的变化,其中cvh、c-kit大幅上升至0.67±0.02、0.85±0.01(P<0.05);PAS结果显示敲低PGClnc1能够显著降低PGCs的产生。流式细胞分选结果显示,在control组中cvh阳性细胞率所占比例为4.2%±0.21,而在过表达PGClnc1后,cvh阳性细胞率所占比例上升至5.8%±0.15(P<0.01),相对地,敲低PGClnc1后,cvh阳性细胞率所占比例下降至1%±0.19(P<0.01)。
[硕士论文] 汪怡临
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCs)作为配子的祖先细胞,是生殖细胞发育过程中必不可少的。研究PGCs的发生和分化机理对动物种质资源保存、创新利用以及基因修饰鸡的生产等领域具有重要理论和实践意义。
  PGCs的发生受到许多因素的影响。目前,研究者们已经发现一些关键性的基因、信号通路、生长因子和表观遗传修饰因素对PGCs的发生起重要调控作用。尽管这些因素对于PGCs形成起到了一定的促进作用,但体外诱导PGCs的生成效率并没有得到提高。因此,亟需从新的领域对PGCs的生成机制进行创新性地探究,深入了解和认识PGCs的形成过程,以期获取能够满足生产研究所需的大量PGCs细胞。
  随着测序技术和生物信息分析技术的发展,长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在生殖细胞分化与胚胎发育过程中的作用逐渐受到重视。研究lncRNA对PGCs发生的影响及机制,能够为提高PGCs体外生成效率提供新的研究策略。本研究基于前期单细胞高通量测序结果筛选得到鸡PGCs特异表达lncRNA-M1ANCR,利用RNA干扰技术,以家鸡为研究对象,从体内和体外两个水平探究了lncRNA-M1ANCR在PGCs发生过程中的功能和机制,为有效提高PGCs效率提供理论依据和参考。研究结果如下:
  (1)lncRNA-M1ANCR的全长扩增,细胞定位与编码能力鉴定:基于前期高通量测序筛选得到PGCs特异性表达lncRNA,命名为lncRNA-M1ANCR,通过RACE实验扩增获得lncRNA-M1ANCR全长(共计1115bp),qRT-PCR验证了lncRNA在PGCs中特异性高表达(ESCs:1.021±0.231,PGCs:5.131±1.23,SSCs:1.825±0.828),与转录组测序(ESCs:1.143±0.350,PGCs:37.131±1.053,SSCs:6.825±0.923)结果一致,细胞定位监测发现lncRNA-M1ANCR定位于PGCs细胞质中(细胞核:0.773±0.051,细胞质:3.395±0.583);生物信息学预测发现lncRNA-M1ANCR的4bp-115bp为开放阅读框序列,构建原核融合表达载体发现该序列在BL菌种中不表达蛋白,表明明lncRNA-M1ANCR不存在编码小肽能力。
  (2)体内外研究lncRNA-M1ANCR在PGCs形成过程中的功能:根据lncRNA-M1ANCR全长序列,设计三个shRNA靶位点,连入pGMLV-SC5干扰载体,转染DF-1细胞后通过定量检测发现3号靶位点的干扰效率(67.16%±2.0%)最高且显著高于对照组(P<0.01);同时,克隆lncRNA-M1ANCR全长,构建pcDNA-M1ANCR过表达载体;然后,将lncRNA-M1ANCR慢病毒干扰载体与过表达载体分别转染鸡ESCs,在RA诱导条件下,观察细胞分化形态的变化,结果发现,干扰lncRNA后,类PGCs形成数量(3±1/400×视野)较RA单独诱导组(10±2个/400×视野)和过表达组(12±2个/400×视野)显著减少;进一步采用qRT-PCR检测PGCs细胞特异性标记基因Cvh和C-kit的表达水平发现,干扰组的表达量(Cvh:1.029±0.062,C-kit:1.154±0.009)显著低于过表达组(Cvh:1.672±0.123,C-kit:2.232±0.029)和诱导组(Cvh:1.232±0.234,C-kit:1.561±0.017)(P<0.01),而全能性基因Nanog的表达(Nanog:1.029±0.024)则显著高于过表达组(Nanog:0.918±0.038)与诱导组(Nanog:0.984±0.033)(P<0.01);间接免疫荧光检测结果表明,干扰组Cvh的表达显著低于RA诱导组和过表达组;流式细胞检测发现,干扰组诱导4d后产生的类PGCs细胞(3.96%±0.32%)显著少于RA诱导组(9.67%±0.24%)和过表达组(12.1%±0.46%)(P<0.01);体内实验中,将干扰载体与过表达载体通过血管注射整合进入鸡胚后,检测生殖标记基因在PGCs的表达情况,发现均出现显著性下降(Cvh:2.631±0.208,C-kit:3.028±0.23)(P<0.01),同时通过石蜡切片观察PGCs细胞在生殖嵴的数量,发现干扰组PGCs的形成明显减少(15±0.57个);为进一步说明lncRNA对PGCs形成的影响,流式细胞分选仪检测干扰lncRNA后PGCs的形成被抑制(4.0%±1.1%),与体外诱导结果一致。结果表明,lncRNA-M1ANCR对鸡ESCs向PGCs的分化过程具有正向调控作用。
  (3)lncRNA-M1ANCR启动子核心区域鉴定与转录因子分析:根据RACE结果预测lncRNA-M1ANCR启动子区域并构建真核表达载体p0-EGFP,转染DF-1细胞发现,克隆片段能够稳定表达绿色荧光,确定该区域具有启动子活性;分别构建启动子缺失载体pGL3-p1-783,pGL3-p2-530,pGL3-p3-269与pGL3-p3x后,转染DF-1细胞,进行双荧光素酶报告检测,结果表明,pGL3-p3-269的启动活性最高(4.39±0.35),说明在-269bp~-1bp中存在重要的调控作用元件,对启动子活性具有重要影响。进一步通过生物信息学分析获知,在启动子区域-269bp~-1bp间存在转录因子p53的结合位点,为探究p53对启动子活性是否具有调控作用,本研究构建了p53的干扰载体与过表达载体。分别转染DF-1细胞后检测缺失片段的双荧光素酶活性,发现干扰p53后核心区域的活性(1.65±0.53)显著低于正常组(4.06±0.41)和过表达组(4.55±0.66)。综上表明,转录因子p53能够调控lncRNA-M1ANCR启动子核心区域的活性,进而调控lncRNA的表达。
  (4)lncRNA-M1ANCR与gga-mir-1591竞争性结合抑制机制的初步探究:lncRNA具有潜在的ceRNA特性,本研究通过生物信息学分析得到与lncRNA-M1ANCR存在潜在竞争性结合关系的miRNA(gga-mir-1591,gga-mir-3539),分别构建miRNA的模拟物与抑制物,并在RA诱导条件下体外转染鸡ESCs细胞,通过细胞形态观察发现,抑制gga-mir-1591的表达能够促进类PGCs的形成,而模拟gga-mir-1591的表达则干扰类PGCs的形成,gga-mir-3593的模拟物与抑制物对类PGCs的形成无明显作用;同时通过qRT-PCR检测lncRNA-M1ANCR,MAPK1,全能性基因以及生殖标记基因的表达,发现转染gga-mir-1591抑制物后,MAPK1与lncRNA的表达显著上调(MAPK1:12.293±2.012,lncRNA-M1ANCR:2.137±0.324),生殖标记基因的表达量(Cvh:6.731±0.921,C-kit:6.631±0.918)也显著高于其他组别;为进一步验证gga-mir-1591对鸡PGCs形成的影响,本研究通过流式分析检测发现,抑制gga-mir-1591后,类PGCs的阳性细胞率(3.13±0.22%)显著高于其他组别(P<0.01),表明miRNA gga-mir-1591对鸡ESCs向PGCs的分化过程具有调控作用,与lncRNA-M1ANCR可能存在竞争性结合抑制关系。为进一步验证gga-mir-1591与lncRNA-M1ANCR之间的关系,本研究在转染gga-mir-1591模拟物与抑制物的基础上,分别转染了lncRNA-M1ANCR的过表达载体与干扰载体,通过拯救实验来验证两者之间存在的竞争性结合抑制关系。细胞形态学观察结果发现,抑制gga-mir-1591后类PGCs的形成能够受lncRNA干扰载体的影响,导致类PGCs形成减少,反之亦然;同时通过qRT-PCR检测lncRNA-M1ANCR,MAPK1,全能性基因以及生殖标记基因的表达发现,在抑制gga-mir-1591表达同时干扰lncRNA情况下,MAPK1的表达量较抑制gga-mir-1591组显著降低(P<0.01),生殖标记基因的表达也有显著下降(P<0.05);综上表明,gga-mir-1591与lncRNA-M1ANCR存在竞争性结合关系,lncRNA-M1ANCR通过“海绵样”吸附的方式,竞争性结合靶向作用于MAPK1的miRNA gga-mir-1591,调控MAPK1的表达水平,进而调控鸡PGCs的形成。
  (5)lncRNA-M1ANCR互作蛋白的筛选与鉴定:通过对lncRNA-M1ANCR的RNApull down结果分析得到,在鸡ESCs向PGCs分化过程中lncRNA-M1ANCR与ILF3蛋白存在潜在相互作用关系,为进一步验证两者之间的作用机制,本研究通过Western Blot实验确定了ILF3蛋白在鸡PGCs中存在表达,并通过RIP实验发现,ILF3与lncRNA间存在结合。为了进一步探究两者之间的互作关系,本研究对与ILF3与lncRNA相关的下游信号通路的关键节点基因进行了qRT-PCR检测,结果表明干扰lncRNA后,下游信号通路关键基因MAPK与Wnt(MAPK:10.342±1.192,Wnt:6.323±0.624)较过表达组(MAPK:14.432±1.394,Wnt:10.960±0.934)显著降低。综上表明,在鸡PGC的形成过程中,lncRNA-M1ANCR与ILF3蛋白间存在互作关系,并且lncRNA表达的变化能够影响下游信号通路关键基因的表达。
[硕士论文] 袁曼曼
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本试验采用PCR-SSCP技术检测了京海黄鸡中Fbxl5(F-box and lecucine-rich repeat protein5)基因以及Myf6(myogenic factor6)基因的多态性,并且运用一般线性模型与京海黄鸡的经济性状进行相关联分析,旨在探讨这两个候选基因影响生长、繁殖性状的分子机理;同时,利用实时荧光定量PCR技术研究两个候选基因在京海黄鸡和金茅黄鸡公母鸡的不同组织的表达谱,以及不同生长时期的表达规律。主要研究结果如下:
  1.以Fbxl5基因为候选基因,对该基因CDS区进行了单核苷酸多态性检测。结果表明:试验共发现了四个突变位点,其中T14286C位于外显子3上,T14291C位于内含子3上,T15780C位于外显子4上,G19048A位于外显子5上,除了T14286C突变造成了编码氨基酸从亮氨酸变成脯氨酸,是非同义突变外,其余位点均未造成编码氨基酸的改变,属于同义突变。利用PHASE2.1软件对该基因检测到的4个突变位点进行单倍型分析,发现在京海黄鸡12世代核心群母鸡群体中,这4个突变位点形成了8种单倍型。与生长性状关联分析的结果表明,单倍型组合H1H8型个体的各周龄体重均高于其他单倍型组合个体,为优势单倍型组合,并且单倍型组合H1H8型个体和H3H8型个体在0、12、14、16周龄体重方面显著或极显著高于其他单倍型组合(P<0.05或P<0.01)。繁殖性状关联分析结果表明:单倍型组合H9H11的开产日龄均值是所有单倍型组合中均值最大的组合,且极显著大于H1H1、H1H3、H1H4、H1H8、H1H9组合(P<0.01);单倍型组合H1H2是开产体重最大的组合,且单倍型组合H1H2、H1H3、H1H4、H1H8均显著高于H8H9、H9H9组合(P<0.05);单倍型组合H2H4是开产蛋重最大的组合,单倍型组合H4H9是开产蛋重最低组合;单倍型组合H1H2是300日龄体重最高组合,且H1H2、H1H3、H1H8组合极显著高于H8H9组合(P<0.01);单倍型组合H9H11是300日龄平均蛋重最高组合,除单倍型组合H2H4、H9H9之外,其余组合均有极显著或者显著差异(P<0.05或P<0.01);单倍型组合H1H4是300日龄产蛋数数量最高组合,单倍型组合H1H3、H1H4均显著高于H3H8组合(P<0.01)。
  2.以Myf6基因为候选基因,对该基因CDS区进行了单核苷酸多态性检测。结果表明:试验在外显子1中共发现了一个变异位点T586C,经检测,在此位点上形成了三种基因型,分别为HH、Hh、hh,此处的突变导致其编码的氨基酸由丙氨酸突变成天冬氨酸,属于非同义突变。运用SPSS软件将Myf6基因在外显子1中所形成的突变位点与生长性状进行关联性分析,由结果可知,HH、Hh、hh三种基因型个体在0周、2周、4周、6周龄的体重无显著差异(P>0.05),但在8周、10周、12周、14周、16周龄上,Hh基因型个体体重极显著高于HH基因型个体(P<0.01)。繁殖性状关联性分析结果表明,在开产蛋重上,基因型hh个体显著高于HH个体(P<0.05),除了开产日龄,在其余性状上,三种基因型个体的性状虽无显著差异(P>0.05),但Hh基因型个体均优于其他两种基因型个体。
  3.对两个候选基因的表达谱和表达规律进行的研究,发现在两个鸡种上,候选基因在胸肌、腿肌上均高表达;Fbxl5基因的表达规律结果表明:在金茅黄鸡公母鸡、京海黄鸡公鸡上,候选基因的表达量在出雏期为最高,之后均是先大幅下降然后有少量回升,而在京海黄鸡母鸡上,其表达量为先持续上升然后大幅下降。My f6基因的表达趋势较为稳定,在两个品种的鸡上,表达趋势总体上均为上升趋势,并在16周龄时达到最高,两个鸡种的表达规律表明,Myf6基因在不同品种、不同时间段上、胸肌的表达量始终高于腿肌。
[硕士论文] 朱鹏飞
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:2010年首次在小鼠上发现新型NOD样受体NLRC5基因,NLRC5是NLR家族最大的成员,大量研究表明NLRC5在固有免疫和获得性免疫中有重要的作用,但其自身的调控机制尚不明了,因此为了探究NLRC5基因启动子自身调控原理,本研究首先检测了鸡NLRC5基因在鸡不同组织中的表达特异性,利用软件预测NLRC5启动子区的CpG岛,并通过亚硫酸氢盐修饰后BSP检测DF1和HD11细胞中NLRC5启动子区的甲基化状态,利用甲基化转移酶抑制剂5-aza-cd处理细胞,比较甲基化程度与基因表达的关系,并最终通过启动子竞争结合转录因子实验、定点突变实验、凝胶迁移实验的方法来验证甲基化影响基因表达的转录因子。克隆了NLRC5起始密码子前2265bp的启动子区,构建启动子区系列缺失载体,转染DF1细胞,根据双荧光素酶实验确定不同缺失片段活性高低从而确定关键调控区域,预测分析关键调控区域内可能存在的反式作用元件,利用启动子竞争结合转录因子实验、定点突变实验、凝胶迁移实验的方法来验证顺式元件及对NLRC5启动子活性的影响。最后通过LPS和IFN-γ处理HD11细胞,RT-qPCR以及ELISA确定NF-κB激活条件,并验证鸡NLRC5基因启动子区NF-κB顺式作用元件,结果表明:
  1.RT-qPCR检测到NLRC5在鸡脾脏、肝脏等免疫相关组织的表达量显著高于心脏、肌肉等组织,并且检测NLRC5基因在鸡巨噬细胞系HD11中的表达量显著高于鸡成纤维细胞系DF-1。
  2.为探讨NLRC5启动子区的甲基化对转录水平的影响进行了一系列实验,其中MethPrimer预测发现2个CpG岛:-4060到-3428,共663bp和-3344到-3027,共318bp;BSP实验结果表明DF1处于高甲基化状态,而HD11甲基化水平较低,利用不同浓度甲基化转移酶抑制剂5-aza-cd处理两种细胞,CCK-8检测细胞存活率,定量检测相关基因的表达,发现40μmol/L终浓度5-aza-cd处理条件下,细胞DF-1存活率相比对照组差异极显著(P<0.01),并对处理细胞进行甲基化检测发现具体甲基化降低位点。并最终构建该区域缺失载体转染双荧光素酶实验、启动子结合转录因子实验、定点突变实验、凝胶迁移实验的方法确定甲基化通过E2F转录因子影响NLRC5基因的转录调控。
  3.为寻找NLRC5启动子-2265到-1区域的潜在调控元件,利用JASPAR软件分析发现NLRC5启动子-2265到-1间可能存在的转录因子结合位点,构建缺失载体进行双荧光素酶实验确定三个活性较高的区域,启动子竞争结合转录因子实验发现在-459区域存在STAT1转录因子,针对该核心区域的顺式元件STAT1的点突变和凝胶迁移实验进一步确认了该区域内存在STAT1顺式元件,其在NLRC5基因启动子活性调控过程中能够发挥重要作用。
  4.为寻找NLRC5启动子区的NF-κB转录因子结合位点。利用过表达结合缺失载体确定NF-κB可能结合区域,利用脂多糖(LPS)和干扰素γ(IFN-γ)刺激鸡巨噬细胞HD11,发现10ng/mlLPS刺激8小时和1ng/mlLPS+10ng/mlIFN-γ刺激12小时能有效激活细胞中的NF-κB,最终EMSA验证-2423和-2342存在两个NF-κB反式作用元件。
[硕士论文] 姚文成
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:当前市场消费者的需求,促使育种工作者对家禽羽色性状进行选择改良。本课题组在利用樱桃谷鸭(父本)和凤头白鸭(母本)为材料的杂交育种过程中,发现在杂交后代中出现羽色分离现象,即在后代中出现花色、黑色等与亲本(白色)羽色不一致的个体。鸭的羽色性状受到多个基因座的调控,羽色表型和基因型之间存在着复杂的关系。有研究表明,前黑素小体蛋白17(pre-melanosomal protein17,PMEL17),是PMEL基因家族中重要的稀释基因,该基因的突变会影响黑色素的合成,导致动物毛色或羽色发生稀释现象,是动物毛色或羽色形成的重要候选基因之一。本研究以樱桃谷鸭(父本)和凤头白鸭(母本)杂交后代群体为试验材料,选取PMEL17基因作为鸭羽色性状相关的候选基因,分析了不同羽色杂交后代鸭毛囊组织黑色素的沉积情况,进行了PMEL17基因CDS区序列的克隆、氨基酸生物信息学分析和PMEL17基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)与羽色性状的关联研究,为了解鸭羽色形成机制提供参考。实验主要研究结果如下:
  1、对杂交F2代3种羽色鸭的毛囊组织进行黑色素(黑色素包含真黑色素和褐黑色素)含量测定和石蜡切片-多巴染色观察。黑色素含量测定结果表明:3种羽色鸭个体之间毛囊黑色素含量存在显著差异,其中黑羽鸭毛囊组织中的黑色素含量最高,显著或极显著高于白羽和花羽鸭(P<0.01),而白羽和花羽鸭毛囊组织中黑色素的含量没有显著差异(P>0.05)。石蜡切片结果显示,3种羽色鸭的毛囊组织染色效果不同,花羽和黑羽鸭染色效果最明显,可以清晰的看到黑素颗粒的存在。
  2、以凤头白鸭全基因组测序结果中调取的PMEL17基因序列为模板,通过单克隆测序获得杂交F1代鸭个体PMEL17基因的编码区序列。扩增获得的编码区序列长1972bp,编码656个氨基酸,与凤头白鸭测序结果中调取的PMEL17基因CDS区序列同源性较高,高达96%。生物信息学分析,鸭PMEL17基因编码蛋白属于可溶性蛋白,带负电荷,存在信号肽,无跨膜区。系统进化树分析结果表明:鸭PMEL17基因与原鸡具有较近的进化关系,序列同源性高达79%。
  3、通过PCR直接测序技术,以凤头白鸭PMEL17基因序列为模板,扩增出3段不同大小的片段,分别为1597bp、534bp和244bp。测序结果显示,在PMEL17基因上发现26处SNP位点,其中5个位点的突变导致了编码氨基酸的变化:1904(C/G)位点,谷氨酰胺(Gln)变为丙氨酸(Ma);1961(T/C)位点,丙氨酸(Ala)变为缬氨酸(Val);2102(C/T)位点,缬氨酸(Val)变为丙氨酸(Ala);2110(G/A)位点,丝氨酸(Ser)变为谷氨酰胺(Gln);2143(A/G)位点,丙氨酸(Ala)变为苏氨酸(Thr)。群体遗传学分析显示,1904(C/G)、2102(C/T)、2110(G/A)和2143(A/G)位点表现为中度多态(0.25<PIC<0.5),1961(T/C)位点表现为低度多态(PIC<0.25)。x2检验表明鸭F2代群体在5个多态位点均达到Hardy-Weinberg平衡(P>005)。单倍型分析发现了4种主要单倍型,分别为CTCGA、CTTAG、CCTAG和GTCGG。关联分析表明,PMEL17基因1904(C/G)和1961(T/C)位点基因型分布与鸭羽色性状具有极显著差异(P<0.01)。同时,4种单倍型在不同羽色鸭群体中的分布存在极显著差异(P<0.01)。
  综上所述,不同羽色鸭毛囊组织中黑色素的沉积存在差异,证实了黑色素的含量和分布对鸭羽色的形成产生一定的影响。PMEL17基因作为羽色形成候选基因之一,其突变在一定程度上与杂交鸭羽色的分化存在联系,可为后期鸭羽色相关研究提供一定的参考资料。
[硕士论文] 张李荣
动物营养与饲料科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本试验旨在研究饲粮中添加益生菌对蛋雏鸡生长、小肠发育及盲肠微生物区系的影响。选取1日龄健康,体重相近的罗曼褐蛋雏鸡432只,随机分成A、B、C、D4个组,每组6个重复,每个重复18只。A组为对照组,饲喂基础日粮;B、C、D为试验组,分别在基础日粮中添加粪肠球菌制剂(活菌数:1.3×1011CFU/g)、嗜酸乳杆菌制剂(活菌数:1.0×1010CFU/g)、乳双歧杆菌制剂(活菌数:1.5×1010CFU/g),添加量均为:1.0×107CFU/g,试验期为42d。试验结果表明:
  (1)益生菌对雏鸡生长性能的影响:在0~21d时,试验组雏鸡平均体重小于对照组;在28~42d时,试验组雏鸡体重转为大于对照组。在35d和42d时,B、C、D组雏鸡体重分别较A组显著提高了3.6%、4.4%、4.3%和6.9%、7.9%、6.3%(P<0.05)。在35d和42d时,与A组相比,B、C、D组ADFI极显著提高8.6%、10%、7.4%和9.2%、13.5%、10%(P<0.01)。在42d时,与A组相比,B、C、D组ADG显著提高17.2%、18.7%、12.2%(P<0.05)。组间F/G无显著差异(P>0.05)。
  (2)益生菌对雏鸡血液生化和免疫指标的影响:与A组相比,D组尿素氮(BUN)含量显著降低(P<0.05)。与A组相比,B、C、D组免疫球蛋白A(IgA)含量极显著提高24.4%、32.0%、28.5%(P<0.01)。
  (3)益生菌对雏鸡内脏器官指数的影响:与A组相比,B、C、D组肌胃指数分别显著提高了6.8%、14.0%、22.3%(P<0.05)。
  (4)益生菌对雏鸡小肠长度和重量的影响:不同益生菌对小肠长度和重量无显著影响(P>0.05)。
  (5)益生菌对雏鸡小肠组织形态的影响:与A组相比,B、C、D组十二指肠隐窝深度分别极显著降低17.5%、16.0%、15.1%(P<0.01),绒毛高度/隐窝深度(V/C)极显著提高20.6%、25.3%、16.23%(P<0.01)。D组回肠绒毛高度显著提高16.5%(P<0.05)。
  (6)益生菌对雏鸡小肠粘膜蛋白MUC2mRNA表达的影响:益生菌对不同肠段MUC2蛋白的分泌具有促进作用。与A组相比,C、D组十二指肠MUC2mRNA表达水平极显著提高(P<0.01)。与A组相比,B、C、D组空肠MUC2mRNA表达水平均有提高趋势(P=0.06)。与A组相比,C、D组回肠MUC2mRNA表达水平极显著提高(P<0.01)。D组的添加效果最好。
  (7)益生菌对雏鸡盲肠微生物区系的影响:a)在42d时,各组盲肠菌群在门水平上主要存在Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)。B、C、D组Bacteroidetes(拟杆菌门)含量较A组显著降低38.3%、36.5%、35.4%(P<0.05),Firmicutes(厚壁菌门)含量较A组显著提高62.4%、52.6%、45.7%(P<0.05)。b)在属水平上,各组主要存在Alistipes、Barnesiella、Faecalibacterium、Bacteroides(拟杆菌属)、Ruminococcus2(瘤胃球菌属)等属种。与A组相比,B、D组Barnesiella丰度显著提高(P<0.05)。与A组相比,B、C、D组有潜在致病性的Clostridium sensu stricto(狭义梭菌属)含量显著降低(P<0.05),Escherichia/Shigella(埃希氏菌属/志贺氏菌属)含量极显著降低87.5%、100%、75%(P<0.01)。c)与A组相比,D组Shannon指数显著大于对照组(P<0.05)。从主成分分析上看,A组和B、C、D组的样本点分布区域不同,说明处理间群落构成存在差异性。
  综上,不同益生菌能够提高雏鸡生长性能、促进小肠发育及改变盲肠微生物区系。乳双歧杆菌的添加效果最佳。
[硕士论文] 郭其新
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:生殖系细胞作为遗传信息的载体,其为物种基因组完整性及遗传多样性提供物质基础。而精子作为雄性生殖细胞,其基因组特性、表达与调控模式对个体及物种维持都至关重要。但是在家禽中关于精子发生的研究并没有被重视,尤其是近年来,鸡繁殖力持续下降问题始终困扰家禽养殖业的发展,尤其地方鸡种中每年由近12%的公鸡因精子发生障碍而被动淘汰。另外,垂直传播的遗传性疾病作为当下迫切需要解决的问题之一,而精子作为这类疾病的一个重要的传播媒介,因此,精子发生的机制以及调控模式成为当前家禽养殖业迫切需要解决的问题之一。精子发生是多细胞生物产生雄性配子的过程,整个精子发生过程受到激素、表观遗传、非编码RNA以及其他一些调控元件的调控。miRNA(micro RNA)作为一类长度为~22nt左右的非编码小RNA,其在大多数生物过程中均发挥重要的调控作用。miRNA通常与mRNA的3'-UTR以不完全互补配对的方式识别并结合,进而在基因转录后发挥负向调控作用。大量的研究表明,miRNA在鼠精子发生过程中起到至关重要的作用,但是在家禽中对精子发生整个时期的miRNA的表达研究较少。本研究以中国地方鸡种---狼山鸡为研究对象,分别对鸡胚胎成纤维细胞(CEF),PGCs,SSCs,Sa和精子细胞进行小RNA测序,并通过基因组比对、差异比较、靶基因预测及靶基因功能注释等分析方法,筛选在鸡精子发生过程中差异表达miRNA,同时通过双荧光素酶报告系统鉴定miRNA与其靶基因的靶向关系,确定miRNA在精子发生过程中调控机制,为研究鸡精子发生过程中相关miRNA提供理论依据。
  研究结果如下:
  1.为探究参与鸡精子发生及PGCs增殖分化相关的miRNA,本研究利用深度测序技术获得PGCs,SSCs,Sa及精子中表达的miRNA。通过与miRbase数据库比对,结果显示CEF中注释到559条miRNA,PGCs注释到685条miRNA,SSCs共注释到305条miRNA,Sa注释到576条miRNA和精子中共注释到635条miRNA。同时通过对未注释到miRNA的序列进行结构分析,分别在CEF,PGCs,SSCs,Sa和精子中鉴定出73,137,94,66和397条具有miRNA结构的Novel miRNA。miRNA表达水平分析表明精子中的miRNA含量相对较少,且表达水平较低。另外,通过对Novel miRNA进行靶基因预测及功能注释,发现其主要涉及TGFβ信号通路、Wnt信号通路以及MAPK信号通路等。miRNA进行差异表达分析结果显示PGCs、SSCs、Sa及精子中counts>10000的miRNA分别含有6条、2条、1条和0条。基于差异表达分析,本研究获得PGCs、SSCs、Sa及精子miRNA的表达谱。另外,通过对PGCs、SSCs、Sa及精子miRNA的表达谱中的miRNA进行靶基因预测,构建PGCs、SSCs、Sa及精子中miRNA-基因调控网络。
  2.为探究PGCs向SSCs,SSCs向Sa分化过程相关的miRNA,本研究通过对PGCs、SSCs及Sa进行两两比较,发现miRNA:miR-202-3p,miR-202-5p,miR-147和miR-126-3p四个miRNA在三组中均存在差异表达。本研究通过对筛选得到的4个miRNA进行靶基因预测,并对靶基因进行GO和KEGG分析,结果显示LIMK2为miR-202-5p的一个候选靶基因。通过对各生殖系细胞中miR-202-5p和LIMK2的表达量进行分析,发现miR-202-5p和LIMK2之间存在逆向调控关系。双荧光素酶实验结果显示miR-202-5p通过靶向LIMK2抑制SSCs向A型Sa以及粗线期精母细胞分化。
  3.为了探究细胞增殖过程相关的miRNA,本研究通过将PGCs、SSCs和Sa中表达的miRNA分别与精子表达的miRNA进行差异比较,对这些存在差异的miRNA进行Venn分析,发现有128条miRNA均与精子存在差异,差异miRNA的靶基因GO和KEGG分析结果显示miR-301a-5p可以靶向TGFβ2参与调控TGFβ信号通路,并且通过双荧光素酶实验结合miRNA zipper技术证明miRNA可以靶向TGFβ2参与调控TGFβ信号通路。
  综上所述,表明miRNA在精子发生过程中起到至关重要的调控作用,其中miR-202-5p通过靶向LIMK2参与调控SSCs向A型Sa以及粗线期精母细胞分化,而miR-301a-5p通过靶向TGFβ2调控TGFβ信号通路调控细胞增殖。
[硕士论文] 吴允
养殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:中国是世界上最大肉鸭生产与消费国。随着生活水平的提高,人们消费结构的改变,由原来只重视鸭屠体重量,逐渐转为体型较小、肉质鲜美和营养价值高的鸭产品。本研究以沭州土鸭(凤头鸭和樱桃谷鸭合成系)为对象,通过生长性能、料重比、皮炎发生率、成活率四个指标,确认网上平养方式下最适饲养密度基础上,对沭州土鸭体尺、屠宰性能、常规肉品质等进行测定,同时比较了沭州土鸭、樱桃谷鸭的肌纤维发育规律以及肌肉组织中氨基酸、脂肪酸、常见的矿物质元素和胆固醇含量的差异;最后分析了肌肉相关基因MyoD、Myf5和IGF的时空表达水平,以期阐明沭州土鸭肌肉生长发育规律、肉品质以及分子调控机制。主要研究结果如下:
  1.在网上平养模式下,比较不同饲养密度之间沭州土鸭的生长性能发现:在3只/m2下,料重比是2.81∶1,皮炎发生率为1.26%,成活率高达99.8%,在49日龄出栏体重达到1957.50g,为最适饲养密度。
  2.在最适饲养条件下,对沭州土鸭体尺指标、屠宰性能进行了测量,同时对两种鸭肌肉中氨基酸、脂肪酸、矿物质元素和胆固醇进行了检测,结果发现:42日龄樱桃谷鸭体重显著大于42、49日龄沭州土鸭(P<0.05);49日龄沭州土鸭与42日龄樱桃谷鸭,胸肌率大于11%、腿肌率大于10%、腹脂率低于2%、屠体率大于80%、全净膛率大于70%;49日龄沭州土鸭肌肉中鸭肌内脂肪、胶原显著高于42日龄樱桃谷鸭(P<0.05);49日龄沭州土鸭在胸肌矿物质元素Fe、Cu、Zn、Ca的沉积上均高于42日龄樱桃谷鸭,其中Ca、Cu元素差异显著(P<0.05),腿肌中矿物质元素Fe、Cu含量高于樱桃谷鸭,但差异不显著(P>0.05);49日龄沭州土鸭中胸肌、腿肌中氨基酸总量分别为19.01%、18.70%、必需氨基酸含量7.85%、7.64%,均高于42日龄樱桃谷鸭;49日龄沭州土鸭与42日龄樱桃谷鸭的胸肌中不饱和脂肪酸总量分别为52.67%、50.50%并且两者差异显著(P<0.05),腿肌中不饱和脂肪酸总量分别为65.07%、63.40%,差异不显著(P>0.05),同时发现49日龄沭州土鸭腿肌不饱和脂肪酸含量显著高于胸肌(P<0.05);42日龄樱桃谷鸭胸肌、腿肌中胆固醇含量显著高于42日龄和49日龄沭州土鸭(P<0.05),且发现49日龄沭州土鸭中胸肌胆固醇含量显著高于腿肌(P<0.05)。
  3.比较沭州土鸭、樱桃谷鸭两种鸭的肌纤维的发育规律后发现,在前5周沭州土鸭与樱桃谷鸭肌纤维直径差异不显著,第5周龄开始沭州土鸭肌纤维直径小于樱桃谷鸭,说明沭州土鸭出栏(49日龄)时比42日龄樱桃谷鸭肉质更嫩,口感更佳。在肌肉发育调控机制中,基因MyoD和Myf5的表达量随着周龄增加先下降后上升再下降,在第1周龄和第5周龄表达量较高,第3周龄和第7周龄表达量最低;基因IGF表达量随着周龄增加而下降,在第1周龄表达量最高,第7周龄最低,表明基因MyoD、Myf5和IGF对肌肉早期发育有重要影响。
  综上,本试验中网上平养模式下,沭州土鸭最佳的饲养密度为只3只/m2,49日龄出栏体重达到1957.50g。其生长性能、屠宰性能、胴体品质较好,与樱桃谷鸭比较其总氨基酸、必需氨基酸、不饱和脂肪酸、矿物质元素含量更为丰富、胆固醇含量低、肌纤维直径小,适合作为小体型肉鸭品种进一步推广。
[硕士论文] 王倩
动物营养与饲料科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鹅在填饲过程中肝脏可以沉积大量脂肪却不发生明显的病理症状,表明鹅在肝脂肪变性过程中存在耐受机制。线粒体是重要的细胞器,负责细胞的有氧呼吸和三磷酸腺苷(ATP)的合成,为细胞的活动提供能量,因此线粒体也被称为细胞的动力工厂。除了参与细胞内物质代谢和能量调控外,线粒体的功能还涉及活性氧(ROS)的产生和细胞凋亡等重要的细胞生物学功能。有证据表明,线粒体数量减少、组分丢失和功能发生障碍与人类、啮齿类动物脂肪肝的形成密切相关。我们最近的肝脏转录组分析也发现不少线粒体相关基因的表达与鹅脂肪肝(肥肝)的形成有关。线粒体外膜蛋白己糖激酶基因(HK1)是其中突出的基因之一。虽然HK1基因是糖酵解过程中的第一个限速酶,参与细胞的糖脂代谢,但其在鹅肥肝形成的作用及机制并不明确。对此,本研究分析了HK1基因在糖脂代谢相关组织(肝脏、胸肌和腹脂)中的表达量随填饲时间的变化情况,脂肪肝形成相关因子(高剂量葡萄糖、胰岛素和脂肪酸)和转录因子对HK1基因表达的调控,以及HK1基因对ROS产生、脂肪沉积和其他信号通路的影响。主要的研究方法和结果如下:
  1.HK1基因在鹅肥肝形成过程中的时空表达规律。填饲可以显著诱导HK1基因在填饲后期(填饲19天)在肝脏中的mRNA表达量,但不显著影响填饲初期(填饲7天)和中期(填饲14天)时的表达量;显著诱导填饲中期在腹脂中的mRNA表达量,但不显著影响填饲初期和末期的表达量;显著抑制填饲中、后期在胸肌中的表达水平,但不显著影响填饲初期的表达量。这些结果表明HK1基因在鹅肥肝形成过程中的作用受组织类型和填饲时间的影响。
  2.脂肪肝相关因子对HK1基因的调控。脂肪肝形成相关因子(高葡萄糖、胰岛素和脂肪酸)处理鹅原代肝细胞后发现,50mM葡萄糖处理可以显著诱导HK1基因的mRNA表达水平;高胰岛素(50-100nM)处理可显著抑制HK1基因的表达;一定浓度(0.25mM、0.5mM)的棕榈酸处理可显著诱导HK1基因的表达;而0.125mM油酸和亚油酸处理对HK1基因的表达有显著的抑制作用。这些结果表明,HK1基因在肥肝中的表达增加可部分归因于血液中葡萄糖和饱和脂肪酸的升高。
  3.转录因子对HK1基因的表达调控。通过生物信息学方法预测得到Pax-4和HNF-1是HK1基因的潜在转录因子。用转录因子激活剂(链脲佐菌素、维甲酸)处理鹅原代肝细胞,结果发现HK1基因的表达量均受到显著抑制。另一方面,敲低HNF-1的表达也会导致HK1的表达量显著减少。这些结果说明Pax-4和HNF-1很可能是HK1基因的转录因子。激活剂抑制HK1基因的表达可能涉及更复杂的机制,有待进一步查明。
  4.HK1基因的生物学功能。利用RNA干扰和过表达技术,干预鹅原代肝细胞中HK1基因的表达,通过油红染色后,检测肝细胞中脂肪沉积量,通过ROS显色反应检测细胞内的ROS含量,通过RNA-seq分析技术比较空载体和过表达载体转染后的鹅肝细胞转录组。结果表明,HK1基因过表达引起肝细胞内脂肪沉积增多,ROS含量减少,敲低HK1基因表达引起肝细胞内脂肪沉积减少,ROS含量相对增多。在空载体和过表达载体转染后的鹅肝细胞转录组中有1609个差异表达基因,其中933基因表达上调,676个基因表达下调。通过差异基因的GO分析和KEGG通路分析,发现差异基因主要富集在糖脂代谢通路,其次在肿瘤形成和免疫反应通路,说明HK1基因可能通过这些路径参与鹅肥肝的形成。该发现与已报道的鹅肥肝转录组中差异表达基因富集于脂肪代谢信号通路、细胞生长与死亡信号通路、免疫反应信号通路相一致。
  综上所述,HK1基因可能通过影响肝脏中的脂肪沉积、氧化应激、细胞生长和免疫反应参与鹅肥肝的形成,其表达水平受脂肪肝形成相关因子(高葡萄糖、胰岛素和脂肪酸)和转录因子Pax-4、HNF-1的调控。
[硕士论文] 杨耀宗
特种经济动物饲养 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鹅产蛋量作为鹅业生产中至关重要的经济性状,不仅关系到养殖经济效益,还与鹅产业发展与壮大密切相关。不同鹅品种产蛋量差异很大,高产品种的年产蛋量可达70个以上,低产品种的年产蛋量仅为20个左右。为揭示不同鹅品种产蛋性能差异原因,本研究以产蛋量不同的扬州鹅、浙东白鹅、卡洛斯鹅为研究对象,比较不同鹅品种卵泡组织学、生殖激素分泌量的差异,并分析不同品种产蛋量候选的SNPs位点基因频率分布,进一步鉴定SNPs突变位点对鹅产蛋量的影响。研究旨在揭示不同鹅品种产蛋性能差异原因,同时也为提高鹅产蛋性能提供一定的参考依据。主要研究结果如下:
  1.为从卵泡组织学揭示不同鹅品种产蛋性能差异,对产蛋期的不同鹅品种卵泡形态结构进行了研究观察,结果显示,扬州鹅等级卵泡一般以5~6枚居多,浙东白鹅和卡洛斯鹅一般以3~4枚居多,在等级前卵泡数量上,浙东白鹅最多,达69~75枚,其次为扬州鹅,卡洛斯鹅最少。石蜡切片结果显示,扬州鹅小白卵泡(small white follicle,SWF)、大白卵泡(large white follicle,LWF)、小黄卵泡(small yellow follicle,SYF)和大黄卵泡(large yellow follicle,LYF)的颗粒层厚度分别为13.62±0.89μm,20.53±1.35μm,22.50±1.44μm,24.69±l.30μm,均显著高于其他两种鹅,表明鹅产蛋量的高低主要取决于等级卵泡数量以及等级前卵泡颗粒层厚度。同时采用ELISA试剂盒对各品种生殖激素进行检测,结果显示,不同鹅品种促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)在等级前卵泡发育时期维持在一定浓度(16.82~20.11U/L)。扬州鹅LYF的促黄体素(luteinizing hormone,LH)达884.17±39.44pg/mL,显著高于浙东白鹅(503.09±34.76pg/mL)和卡洛斯鹅(485.56±16.17pg/mL)。扬州鹅孕酮(progesterone,PROG)含量在进入LWF时期后迅速上升,显著高于浙东白鹅和卡洛斯鹅,并且这种趋势维持到LYF时期,上述表明,高分泌量的LH和PROG有助于等级前卵泡发育。
  2.为从分子水平揭示不同鹅品种产蛋性能差异,以产蛋量关键候选基因MAGI-1、KLAA1462、ARHGAP21、ACSF2和ASTN2基因为研究对象,分析其在不同鹅品种基因频率分布,结果显示,ARHGAP21基因Record-112359位点,ACSF2基因Record-106582位点和ASTN2基因Record-111407位点基因频率分布差异均达显著水平;其中ACSF2基因Record-106582位点基因频率分布差异最大(xc2=92.377,Pc=2.29×10-22),扬州鹅A基因频率0.71显著高于卡洛斯鹅0.06,表明ACSF2基因A>C突变可能与不同鹅品种产蛋量差异有关。
  3.为进一步验证产蛋候选基因SNPs位点功能,选择MAGI-1基因Record-106975位点和ACSF基因Record-106582位点作为候选位点,采用实时荧光定量PCR对不同基因型表达量进行检测,结果发现MAGI-1基因AG基因型mRNA表达量(1.87±0.37)显著高于AA基因型(1.01±0.33)和GG基因型(1.00±0.35),AA基因型和GG基因型差异不显著,ACSF2基因CC基因型(1.11±0.07)显著高于AA基因型(1.00±0.04),AA基因型显著高于AC基因型(0.65±0.04)。进一步利用EMSA技术对突变前后转录因子结合位点进行功能分析,结果显示ACSF2基因Record-106582A>C位点影响了转录因子顺式作用元件,从而引起ACSF2基因CC基因型高表达,结合ACSF2基因Record-106582位点在产蛋量不同的鹅品种中的基因频率分布差异,说明该SNP位点与产蛋性能有关。
  综上,产蛋量高低主要取决于等级卵泡的数量以及等级前卵泡颗粒层厚度,且ACSF2基因Record-106582A>C位点突变也与产蛋性能有关。
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