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[博士论文] 哈西卜哈利克
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  1.硼对脾的影响
  在研究中检测了硼对脾发育变化之间的关系和硼(以硼酸的形式)对Hsp40/70表达水平的影响。将30羽健康雏鸵鸟随机分为6组:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ组,分别饲喂添加0,40,80,160,320,640mg/L硼的基础日粮。通过HE染色对脾组织进行病理学检查;采用IHC和Western blot检测技术分析Hsp40/70的表达水平;并通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测Hsp40/70的mRNA表达水平。为了研究细胞凋亡,分析了所有处理组的TUNEL反应。该部分研究工作的内容和结果如下:
  1.1硼对鸵鸟脾组织结构的影响
  与Ⅰ组的结果相比,Ⅱ组没有显著性差异。与Ⅰ组比较,Ⅲ组和Ⅳ组白髓的数量和体积增多,边缘区细胞密集增厚,边界清晰。试验组Ⅴ和Ⅵ组织病理学变化明显;白髓的数量和体积减少,边界不清晰。
  1.2硼对Hsp40/70在雏鸵鸟脾中分布的影响
  Hsp70主要在脾脏组织中呈弥漫分布。与Ⅰ组的结果相比,Ⅱ组的Hsp70的分布无显著性差异,但Ⅲ组,特别是饲喂添加160mg/L硼的Ⅳ组的Hsp70分布差异显著。然而,高硼处理组的Hsp70阳性信号的分布开始下降,其在Ⅵ下降得犹为明显。此外,与Ⅰ组相比,Ⅱ组中阳性信号IOD略有增加,但无显著性差异;Ⅲ组和Ⅳ组中Hsp70阳性信号的IOD显著性升高。然而,Ⅴ组阳性信号的IOD却略有降低,但无显著性差异,Ⅵ组阳性信号的IOD显著性降低。通过蛋白免疫印迹分析,Hsp70表达量水平与免疫组化结果的趋势相似。随着硼含量的增加,Hsp70s表达量也增加并在Ⅳ组中达到峰值。Hsp40的表达量的趋势与Hsp70的相似;然而,与Hsp70相比,相同组中Hsp40的表达量较少。这表明Hsp40是Hsp70的辅因子,有助于Hsp70的活性。
  1.3硼对鸵鸟脾Hsp40/70mRNA表达量的影响
  Ⅱ组(40mg/L硼)中Hsp40/70的mRNA表达量水平高于Ⅰ组;Ⅲ组mRNA表达量水平显著升高;Ⅳ组mRNA表达量水平达到峰值,之后Hsp40/70的mRNA表达量水平开始下降;Ⅵ组的mRNA表达量水平最低,与Ⅰ组(对照组)相近。mRNA表达量下降,表明Hsp40/70mRNA表达量是呈现剂量依赖性的,最初在较低剂量下诱导表达,然后在较高量的硼处理组中被抑制。
  1.4硼对鸵鸟脾细胞凋亡的影响
  为了检测硼对雏鸵鸟脾细胞凋亡的影响,采用TUNEL法评估细胞凋亡。TUNEL细胞主要是棕色颗粒的细胞。在Ⅱ组,Ⅲ组和Ⅳ组中,TUNEL阳性信号弱于Ⅰ组;但在第Ⅴ组,特别是Ⅵ组(640mg/L硼)TUNEL阳性信号增强。IOD分析显示Ⅱ-Ⅳ组水平较低,Ⅳ组最低;而与Ⅰ组相比,Ⅴ组和Ⅵ组的IOD水平显著升高。
  2.硼在肾脏组织发育中的作用
  在本试验中,研究了硼对雏鸵鸟肾的作用,特别是抗氧化能力。将48羽雏鸵鸟随机分为6组,在饮用水中补充不同浓度的硼。测定相对氧化/抗氧化酶(T-AOC,MDA,GSH-Px,CAT,GR,SOD)和肾细胞凋亡各项指标。通过qPCR测量该通路(Nrf2,HO-1和GCLC)中3个重要基因的表达,并通过免疫组化分析关键调节因子Nrf2的定位。研究的相应内容和结果如下:
  2.1硼对雏鸵鸟肾组织凋亡的影响
  凋亡的细胞分布在肾的各个部位,这些细胞基本上是棕色颗粒的细胞。与对照组相比,Ⅱ组和Ⅲ组凋亡细胞数量较少。饲喂添加160mg/L硼基础日粮处理组凋亡细胞数量略有增加,当添加剂量达到320mg/L时凋亡细胞数明显增加,在640mg/L剂量时达到峰值。此外,IOD分析显示Ⅱ组和Ⅲ组的水平较低,Ⅲ组水平最低,而与对照组相比,Ⅴ组和Ⅵ组IOD水平显著升高。
  2.2硼对雏鸵鸟肾组织抗氧化活性的影响
  与对照组相比,添加40mg/L和80mg/L硼组MDA含量分别显著降低了26.02%和48.12%,然而添加160-320mg/L硼时增加,640mg/L硼组增加了一倍。添加40mg/L硼组雏鸵鸟肾组织T-AOC活性与对照组相比没有差异,添加80mg/L硼组则明显升高。相反,添加640mg/L硼组T-AOC活性显著下降,与同组MDA含量变化相反。雏鸵鸟肾组织的GSH-PX活性在添加40和80mg/L硼组略有增加,但差异不显著。然而,GSH-PX在添加160,320mg/L硼组显著增加了约50%,添加640mg/L硼组增加了一倍。
  2.3硼对雏鸵鸟肾组织Nrf2抗氧化通路的影响
  研究结果表明,在低剂量硼组,Nrf2阳性产物主要分布在肾近端小管,而高剂量组Nrf2阳性产物分布主要位于上皮细胞中。IOD分析显示,低剂量组Nrf2阳性产物的分布较高,而与Ⅰ组相比,高剂量组的Nrf2阳性产物分布较少。抗氧化通路(Nrf2,HO-1,GCLc)中3个重要基因的qPCR分析显示不同组之间相似而强烈的差异。与对照组相比,当添加硼达到160mg/L剂量时能显著提高了雏鸵鸟肾组织中Nrf2的表达水平,添加80mg/L硼组达到峰值。除了添加40mg/L硼组外,其他添加硼组抗氧化通路GCLc表达量水平均显著升高,添加80mg/L硼组达到最大值。此外,与其他抗氧化因子相比,硼对雏鸵鸟肾组织中HO-1表达量水平的影响是最大的。
  3.硼对肝脏功能的影响
  在非洲鸵鸟饮用水中添加硼酸(0mg,40mg,80mg,160mg,320mg和640mg),观察并检测雏鸵鸟肝中由不同剂量硼引起的组织学,细胞凋亡,组织化学和血清生化参数的变化。通过HE染色和PAS染色评估不同组的组织结构变化;通过TUNEL检测细胞凋亡情况;通过分光光度法检测血清生化指标。得到的结果如下:
  3.1硼对肝组织结构的影响
  90羽鸵鸟肝显示出良好的结构,具有丰富的细胞数量和不同形状的肝门管区。在低剂量硼组,进一步发现肝细胞发育良好,肝门管区清晰可见。在高剂量组中观察到肝组织结构发生改变。与硼中毒有关的主要病变包括:肝门管区炎症和肝细胞病变。肝门管区炎症在Ⅵ组最严重。在肝组织的一些肝细胞中观察到轻度症状,添加640mg/L硼剂量组中较多。此外,一些肝细胞还观察到核疱化。同时,还观察到的部分的核固缩和坏死。
  3.2硼对糖原含量的影响
  Ⅱ组糖原含量高于Ⅰ组,Ⅲ组糖原含量最高,有显著性差异。Ⅳ组可能是最佳剂量,之后糖原量开始下降。与Ⅰ组比较,在Ⅴ组和Ⅵ组中糖原含量最少。经IOD分析证实了以上所述各组糖原水平。
  3.3硼对雏鸵鸟肝细胞凋亡的影响
  低剂量组显示较少的细胞凋亡,Ⅱ组中细胞死亡最少。与Ⅰ组相比,高剂量组,特别是添加640mg/L硼组中肝细胞凋亡量较多。IOD的统计学分析与本研究的TUNEL结果相似,表明硼对细胞凋亡具有剂量依赖性作用,并且添加超过160mg的硼剂量会使更多的细胞凋亡。
  3.4硼对血清生化指标的影响
  血清生化指标受硼剂量的影响显著。高剂量组(添加320mg/L,特别是640mg/L硼组)酶活性参数与空白组相比差异显著。同时,参与代谢的血清生化指标在低剂量组(至Ⅳ组)中显示出硼有利的作用。总体结果表明硼在低剂量(80-160mg/L硼酸)对肝酶活性和代谢有正面的影响,高剂量(主要是640mg硼酸/L)则具有相反的作用。
  简言之,总体结果表明适当的膳食硼摄入量(约160mg)可以使雏鸵鸟各组织发育良好,提高抗氧化的能力,减少细胞的凋亡和正向调节各项血清生化指标。然后,高剂量的硼能引起中毒反应并表现出明显的组织学结构病变。此外,长期超量添加硼会导致HSP表达量下降,糖原消耗过多,细胞凋亡增多和酶活性增加,这些都与硼的作用密切相关。
[硕士论文] 赵兴
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胸腺(thymus)是T细胞发育、分化和成熟的场所,骨髓中淋巴祖细胞在多种趋化因子的作用下进入胸腺,在胸腺微环境内发育分化为成熟的T细胞,进入外周血和淋巴器官中,成为机体健康的卫士。但动物朐腺的增龄性萎缩将导致其功能减退,机体也随之衰老,疾病丛生。因此,掌握动物胸腺发育的基本规律,探索其萎缩的机理和能够增强其功能抑制其退化的有效方法,对疾病的预防和诊断、抵抗免疫衰老具有非常重要的现实意义。目前关于鸡胸腺生长发育过程中的基因表达变化和分子机制的研究鲜有报道。因此,本研究以科宝肉鸡为研究对象,采用HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色、RNA-Seq以及实时荧光定量PCR等方法研究了鸡胸腺生长发育过程中组织结构和基因表达变化规律,主要研究内容和结果如下:
  1.鸡胸腺发育过程中重量和指数的变化规律
  测定了0w、1w、5w、9w、18w和27w鸡(n=6)的体重及胸腺重量,并计算胸腺指数(胸腺重量(g)/体重(kg))。随着周龄的增加,胸腺重量呈现先上升后下降的趋势,18w时胸腺重量达到最大,27w时萎缩严重。0w到1w,胸腺指数呈上升趋势,从1w到27w,胸腺指数呈下降趋势。
  2.鸡胸腺发育过程中组织结构的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织进行石蜡切片,并进行HE染色。结果显示,胸腺分为外周的皮质和内层的髓质,皮质主要由淋巴细胞和少量上皮细胞构成,着色较深;髓质主要由上皮细胞和少量淋巴细胞构成,着色较浅,其中有典型的胸腺小体结构。随着周龄增加,鸡胸腺皮质逐渐变薄,髓质面积增加,皮髓面积比逐渐减小,胸腺中血管和胸腺小体呈增多趋势。
  3.鸡胸腺发育过程中细胞增殖的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织切片进行免疫组织化学染色,检测PCNA阳性细胞的分布和发育变化规律。结果显示,PCNA阳性细胞在胸腺皮质和髓质均有分布,随周龄增加,阳性细胞数目逐渐减少。以上结果表明,鸡胸腺中细胞增殖活动随着周龄的增加而减弱。
  4.鸡胸腺发育过程中肥大细胞的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织切片进行甲苯胺蓝染色,检测肥大细胞的分布和发育变化规律。结果显示,肥大细胞主要位于胸腺髓质和血管周围。肥大细胞数目在1w升高然后下降,在9w又升高以后逐渐减少。
  5.鸡胸腺发育过程中基因表达的变化规律
  采用RNA-Seq技术检测鸡胸腺发育过程中的基因表达变化规律。测序共获得原始数据21723697300bp,经过过滤质控去除低质量读段后,剩余有效数据21708736650bp,有效读段434174733条,平均24120819条有效读段,有效读段率均大于99.8%,与参考基因组比对率均达到了90%。根据基因表达量进行表达趋势分析,共获得显著富集趋势10个。对持续上调趋势Profile39和持续下调趋势Profile8进行GO和KEGG通路富集分析发现,profile39(即上调趋势)GO富集主要与炎症、免疫、信号转导、凋亡等有关;KEGG富集主要与免疫系统、分泌系统、感染性疾病、信号传递、细胞活动和脂质代谢有关;profile8(即下调趋势)GO富集主要与遗传物质相关组成、传递、修复以及能量代谢等有关;KEGG富集主要与细胞生长和死亡、遗传信息传递、能量和碳水化合物代谢、氨基酸和核苷酸代谢有关。
  对下调趋势细胞周期通路中与细胞增殖和遗传信息传递密切相关的几个关键基因PCNA、CDK1、CCNA2、CCNB2进行实时荧光定量PCR检测,发现其变化规律和测序结果一致,随周龄增加表达量持续降低。
  以上研究结果表明,随着周龄增加,细胞增殖减少,胸腺结构完整性被逐渐破坏,微环境发生变化,导致胸腺重量减少。胸腺中遗传物质传递被破坏阻断,胸腺中物质代谢水平降低,脂肪代谢增加,炎症反应和免疫反应增强。
[硕士论文] 景若曦
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:卵巢发育是一个受多因子调控的动态过程。实验证明,哺乳动物和禽类的卵巢发育过程在卵巢雌激素调控方面存在差异。芳香化酶(CYP19A1)是雄激素转化为雌激素所需要的重要限速酶。本研究将围绕鸡卵泡颗粒细胞层以及膜细胞层,通过高通量测序技术检测鸡小黄卵泡中各细胞层转录组情况,利用生物信息学技术分析鸡卵泡颗粒细胞层与膜细胞层基因表达特点;并运用转录组测序数据与牛卵泡颗粒细胞层与膜细胞层转录组数据进行比较,通过基因表达模式筛选出鸡卵泡中可能调控芳香化酶基因的潜在转录因子,并通过双荧光素酶报告系统对候选转录因子进行验证。主要研究结果如下:
  (1)通过对鸡卵泡各时期各细胞层CYP19A1表达谱的结果分析,发现芳香化酶在鸡卵泡膜细胞层中高表达,并且在小黄卵泡时期表达量最高;
  (2)对鸡小黄卵泡膜细胞层以及颗粒细胞层进行转录组测序,通过分析得到膜细胞层特异表达基因179个,膜细胞层偏好表达基因196个,颗粒细胞层特异表达基因18个,颗粒细胞层偏好表达基因39个;
  (3)通过对鸡小黄卵泡阶段与牛卵泡分化及卵泡选择两个阶段分别进行共表达网络的构建、通过对比发现鸡小黄卵泡阶段基因表达模式与牛卵泡分化期更为接近;对鸡共表达网络进一步分析,发现两个与芳香化酶表达高度相关的基因模块;
  (4)通过对牛与鸡相似卵泡发育阶段基因表达模式的比较与筛选,确定ESR2为调节鸡卵泡芳香化酶基因的候选转录因子;
  (5)在细胞水平,通过双荧光素酶报告系统验证ESR2对CYP19A1启动子片段活性有抑制作用。
[硕士论文] 韩笑
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:据称,内源性反转录病毒(Endogenous retroviruses,ERVs)是远古反转录病毒感染时留下的痕迹,构成了机体“virome”的重要组成部分。过去对内源性反转录病毒的功能不够了解,曾将其视为“垃圾DNA”(Junk DNA)。但最近有研究表明,某些内源性反转录病毒不仅对早期胚胎发育和胚胎干细胞的多能性具有重要作用,还可能与病毒感染、天然免疫以及抗肿瘤作用有关。本研究选择内源性反转录病毒一鸡内源性白血病病毒(Avianleukosis virus subgroup E,ALVE)作为研究模型,应用CRISPR/Cas9系统对鸡1号染色体上存在的内源性反转录病毒ALVE1进行去表达以探索其与天然免疫之间的关系,为进一步研究内源性反转录病毒的功能和作用奠定基础。
  本研究通过CRISPR/Cas9技术将转录终止序列(SV40 ployA)敲入内源性反转录病毒ALVE1的启动子区,通过终止其转录从而实现ALVE1的去功能(Loss of function)。本文不仅成功构建了针对家禽内源性反转录病毒去功能研究的新方法,还为今后研究内源性反转录病毒的功能提供了新思路。主要的研究结果如下:
  1、ALVE1的鉴定及转录表达分析:首先,应用反式PCR(Inverse PCR)与cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,成功鉴定了ALVE1在鸡1号染色体的具体位置信息,获得了完整的ALVE1序列。然后,将ALVE1序列分成三部分,分别设计引物进行PCR扩增,结果显示:在鸡巨噬细胞系HD11中含有完整的ALVE1序列,而在鸡成纤维细胞系DF-1中缺乏ALVE1序列。最后,通过PCR鉴定ALVE1在HD11中的转录情况。结果表明: ALVE1的四个区域(即LTR、gag、pol和env)在鸡巨噬细胞系HD11中均能转录表达。
  2、转录终止元件的筛选:为了筛选高效的转录终止序列,本研究构建了含有转录终止序列以及绿色荧光蛋白GFP的载体,通过对GFP荧光的观察以及荧光定量PCR检测,分别比较SV40 polyA、4×SV40 polyA、β-globin和β-globin△5-7四个转录终止序列的终止效率。结果显示:四个转录终止序列都有较高的终止活性,其终止效率均高于90%。在四个终止序列中,由于SV40 polyA的序列最短,本文最终选定SV40 polyA作为本研究的终止元件。在此基础上,本文还继续探索了正向与反向SV40 polyA的终止效率,结果表明:正向与反向的SV40 polyA均有转录终止活性,但是反向序列的终止活性远低于正向序列。
  3、CRISPR/Cas9介导的ALVE1转录终止及其功能初探:为了实现ALVE1去功能以研究其与天然免疫之间的关系,本文构建了含有转录终止序列的同源重组载体,利用CRISPR/Cas9系统将其敲入ALVE1的启动子区,然后通过嘌呤霉素(Puromycin)和新霉素(Neomycin)双筛选,最终获得了ALVE1被终止转录的鸡巨噬细胞系(命名为:HD11-ALVE1-Knowdown)。在此研究的基础上,进一步探索了ALVE1终止表达对细胞天然免疫的影响,通过RT-qPCR检测发现:与正常HD11细胞相比,天然免疫基因TLR3和IFN-β的表达在ALVE1终止表达的细胞中显著下调(P<0.05)。这说明ALVE1与天然免疫密切相关,同时也暗示禽内源性白血病病毒可能与宿主抗病性能有关。
[博士论文] 李东
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:生殖细胞可以把生物的遗传信息传递给下一代,维持生命的传递,对生殖细胞分化研究具有重要意义。原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是所有生殖细胞的始祖细胞,能够在性腺中分化为精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)或卵原干细胞(Ovary stem cells,OSCs),进而进一步发育分化为精子或卵子。PGCs的发生受到许多内源性调控因子和细胞外基质等外源因素的调控,这些因子通过不同的信号通路,构成复杂的调控网络,直接或间接地调控PGCs的形成。目前,研究者们通过体外分离培养、体外诱导、构建转基因细胞等方多种方式对PGCs的生长和分化进行了大量的研究,然而关于调控PGCs发生过程的具体调控网络分子机制却知之甚少,因此PGCs发生过程机制的探究成为近年来备受关注的焦点。
  随着PGCs研究的深入,研究者们已经探究发现存在一些关键性的基因、信号通路、生长因子以及表观遗传修饰因素在此过程中起到重要的调控作用,随着这些因素对于PGCs发生起到了一定的促进作用,但是并没有真正从意义上提供提高PGCs生成效率,进而无法满足相关的科研需求,因此亟需对从新的领域对PGCs的生成机制进行创新性地探究,深入了解和认识PGCs的产生过程,从而获取大量的PGCs。
  为了进一步探究调控PGCs发生及分化的作用机制,从根本上解决PGCs生成效率低下的问题,本研究基于本实验室前期对鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)、PGCs和SSCs的RNA-Seq测序结果中筛选到PGCs特异表达的新基因LOC418414(Genbank登录号:XM_416629.3)的基础上,根据其表达位置命名为C1EIP,对其在鸡ESCs向PGCs分化过程中从体内和体外两个水平上进行系统的功能和机制验证,深入了解家鸡ESCs向PGCs分化过程的调控机制,为有效提高ESCs向PGCs诱导分化效率提供理论依据和参考,并且为鸡ESCs向PGCs分化其他类似关键功能基因的功能及机制研究提供理论基础。
  研究结果如下:
  1.为了有效确定候选特异基因C1EIP在的生物功能以及其真核细胞中的定位,为后期功能及机制研究奠定基础,对C1EIP进行生物信息学分析显示,C1EIP主要与鸟类同源性较高,但同源蛋白为未知蛋白,未发现特异的结构域。我们结合NCBI数据库提供的C1EIP编码序列,利用RT-PCR扩增C1EIP编码区,分别构建重组表达载体pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP。以pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP转染DF1细胞,确定C1EIP的定位,并以RT-PCR和Western Blot检测C1EIP在真核细胞中转录和翻译的情况;同时以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP载体,肌肉注射小鼠后采血制备抗小鼠血清,以IFA和Western Blot检测抗体效价。酶切及测序结果均显示pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP载体构建成功。pEGFP-C1EIP转染DF1细胞后,C1EIP表达于细胞质中,说明C1EIP定位于细胞质中,且能够启动转录和翻译;以1μg∶1.5μg的比例将PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP产物注射小鼠肌肉制备抗小鼠血清,IFA检测最佳效价为1∶25,并以此效价进行Westen Blot检测显示能够识别到C1EIP蛋白。
  2.为了探究C1EIP在鸡PGCs生成过程中生物学功能探究,我们针对C1EIP编码区设计3个shRNA靶位点和1个阴性对照位点,构建慢病毒干扰载体,并进行慢病毒包裹,以qRT-PCR检测慢病毒干扰载体的干扰效率。在体外,以慢病毒干扰载体和过表达载体分别转染2代ESCs细胞,结合RA诱导剂诱导,观察ESCs形态变化,并以qRT-PCR、细胞免疫化学和流式细胞分析检测PGCs生成效率;在体内,以慢病毒RNA干扰载体侵染鸡胚,摸索出最佳的侵染效率,侵染后的鸡胚以qRT-PCR、PAS切片染色、免疫组化以及流式细胞分析等方法检测PGCs生成效率。结果显示成功构建慢病毒干扰载体C1EIP-sh1、C1EIP-sh2和C1EIP-sh3,干扰效率分别为80.39%、87.80%和38.36%。在体外,正常RA诱导在第2d出现小类胚体(Embryoid Body,EB),在第4d时类胚体增多、变大,第6d类胚体的边缘开始出现裂口,并且伴随有少量的细胞从类胚体内部释放,第8d时类胚体严重破裂,大量细胞释放,在第10-12d类胚体基本上裂解完全,出现类精原干细胞(Spermatogonial stem cells-like,SSCs-like),并聚团成葡萄串状克隆;过表达组中,在第2d出现大的类胚体,第4d类胚体边缘开始出现小缺口,第6d类胚体大部分破裂并释放大量内部细胞,第8d出现类SSCs细胞,第10-12d出现典型的呈葡萄串状的SSCs克隆;在敲低中,第2-6d细胞未出现类胚体,第8d开始出现小的类胚体,然而培养至12d类胚体的数量、大小以及形态并未出现明显的变化;qRT-PCR结果显示过表达C1EIP后,全能性基因sox2表达量总体上由1.00±0.04持续降低至0.14±0.01,而cvh、c-kit、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1表达量自始至终都逐步上升至2.14±0.03、2.79±0.05、2.26±0.06、2.73±0.03和2.59±0.05,目的基因C1EIP表达量在第4d上升至3.99±0.06,在第12d时由下降至2.87±0.07;敲低C1EIP后,sox2表达量在第0-12d中没有显著的变化,cvh、c-kit和C1EIP表达量分别由1.00±0.02、1.00±0.01和1.00±0.02稳定持续下降至0.55±0.01、0.70±0.01和2.87±0.07,Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1表达量由1.00±0.04、1.00±0.04、1.00±0.03和1.00±0.04分别先下降至0.53±0.04、0.45±0.05、0.86±0.03和0.76±0.02,然后再略微上升至0.59±0.01、0.80±0.04、0.88±0.04、0.93±0.08;细胞免疫化学结果显示相对于RA诱导组,过表达组显著增加CVH和C-KIT的表达,而敲低组抑制CVH和C-KIT的表达。流式细胞分析结果显示,RA诱导组中CVH+细胞比例为3.4%,在过表达C1EIP后,CVH+细胞比例显著上调至4.6%,然而敲低C1EIP使得CVH+细胞降低至2.9%。在体内,鸡胚注射慢病毒载体的最佳条件为钝端注射10μL106TU/mL慢病毒干扰载体+90μL DMEM,注射后能够稳定表达egfp且鸡胚能够激发绿色荧光。qRT-PCR结果显示各个基因的表达量在Blank组和sh-Ctrl组之间没有显著的变化,而在敲低C1EIP后,全能性基因sox2的表达量下降趋势相对于其他分组有所减缓,而cvh、c-kit、stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖相关基因以及目的基因C1EIP的大幅度下降到0.20±0.07、0.43±0.08、0.45±0.06、0.51±0.07、0.35±0.07、0.46±0.04和0.22±0.03; PAS结果显示敲低C1EIP能够显著降低PGCs的产生。免疫组织化学结果显示空白组和阴性对照组中生殖嵴中高度表达CVH和C-KIT,且表达部位几乎充满整个生殖嵴中,然而在敲低组中,CVH和C-KIT蛋白表达明显降低,并且表达的部位仅仅局限于生殖嵴的边缘部分。流式细胞分选结果显示,相对于空白组和对照组(4.6%和4.3%),敲低C1EIP使得CVH标记的PGCs比例明显下调至3.1%。
  3.为了系统有效地阐明C1EIP表达的转录水平调控机制,我们结合NCBI和UCSC数据库中查询C1EIP转录起始位点上游启动子2000bp左右的序列,扩增C1EIP启动子长片段,克隆至pEGFP-N1载体中,置换CMV启动子,构建重组表达载体pC1 EIP-EGFP,转染至DF1细胞中检测C1EIP启动子长片段的启动活性;通过缺失片段克隆技术,构建C1EIP启动子不同缺失片段载体PGL3-P1~PGL3-P10,转染DF1细胞后以双荧光素酶报告系统检测各个缺失片段的启动子活性,筛查出C1EIP启动子核心调控区域;在此区域以生物信息学预测关键转录因子结合位点,并对各个转录因子结合位点分别进行定点缺失,构建缺失载体,同样以双荧光素酶报告系统检测转录因子结合位点缺失对启动子活性的影响;最后分别10μmol/L、1μmol/L和4mmol/L的5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Azadc)、Trichostatin A(TSA)和valproic acid(VPA)处理,检测DNA甲基化和组蛋白乙酰化对C1EIP启动子活性以及C1EIP在ESCs、PGCs和SSCs中表达变化的影响。酶切及测序结果均表明pC1EIP-EGFP构建正确,转染DF1细胞后能够激发绿色荧光,定性地说明扩增的C1EIP启动子长片段具有启动活性;同时启动子各个缺失片段载体酶切和测序结果也表明载体构建成功,双荧光素酶检测启动子活性结果显示P4-P6间,即-1025~-912bp为C1EIP启动子的核心活性区域;在此区域内关键的转录因子结合位点包括MEIS1、MAFG∷NFE2L1、STAT3、HLTF和Hand1∷Tcf3,其中只有STAT3起到正向调控作用;最后发现在DNA甲基化抑制5-Azadc以及组蛋白乙酰化抑制剂TSA和VPA处理后,C1EIP启动子活性由10.82±0.54上升至18.49±0.72、33.27±0.83和38.11±0.53,同时5-Azadc、 TSA和VPA处理后,C1EIP在鸡ESCs、PGCs和SSCs中表达量分别由1.00±0.23、5.73±0.54、0.94±0.23变化为1.43±0.42、10.60±0.26、2.83±0.18和2.64±0.23、9.89±0.37、3.25±0.16以及2.99±0.43、8.33±0.56、2.94±0.29。
  4.为了探究C1EIP调控PGCs生成的机制,我们通过构建C1EIP原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中表达,以GST pull-down挖掘C1EIP互作蛋白,构建融合表达载体pcDNA3.0-ENO1-HA,以体外免疫共沉淀技术验证ENO-HA和C1EIP-EGFP间互作关系。结合在线数据库,以生物信息学分析技术探究互作基因ENO1的关联基因,以qRT-PCR验证其在PGCs生成过程中的表达变化情况。通过构建Myc启动子的双荧光素酶报告载体PGL3-Myc-pro以及重组表达载体pcDNA3.0-MBP-1,同时为了消除同源家族基因的干扰,我们还构建了ENO2的重组表达载体pcDNA3.0-ENO2,结合之前构建完成的pcDNA3.0-ENO1-HA载体,共转染DF1细胞,以双荧光素酶报告系统检测Myc启动子活性变化情况,并根据所得结果和查找相关文献,绘制出C1EIP和ENO1/MBP-1互作介导Notch信号通路调控PGCs生成的模式图。GST pull-down结果显示C1EIP与ENO1之间存在互作,且体外免疫共沉淀验证C1EIP之与ENO1间的互作关系。通过Uniport和PSORTⅡ数据库以及共表达网络分析发现ENO1定位于细胞质中,与Myc相互关联,Myc下游基因为Notch1。qRT-PCR结果显示C1EIP和ENO1在鸡ESCs向SSCs分化过程中表达趋势保持一致,并且与Myc和Notch1表达趋势相反。酶切和测序结果显示双荧光素酶报告载体PGL3-Myc-pro以及重组表达载体pcDNA3.0-MBP-1和pcDNA3.0-ENO2均构建成功,且双荧光素酶检测结果显示MBP-1对Myc启动子活性存在抑制作用,而ENO1和ENO2对其没有影响。最后根据以上结果和相关文献报道绘制C1EIP和MBP-1互作介导Notch信号通路调控PGCs生成的模式图,结果显示C1EIP可能作为锚定蛋白将ENO1蛋白固定于细胞质中,当ENO1发生磷酸化或去磷酸化后,C1EIP将其释放,并易位入核,在易位过程中丢失前面96个氨基酸残基,形成MBP-1蛋白,从而结合至Myc启动子,抑制其转录,进而阻断Notch信号通路的信号传导,最终反向促进鸡ESCs向PGCs方向分化。
[硕士论文] 李富原
养殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:鹅肥肝既是重要的水禽产品,也是独特的非酒精性脂肪肝研究模型。发现与鹅肥肝形成相关的关键候选基因,揭示它们与鹅肥肝形成的关系,不仅可以促进鹅肥肝形成机制的阐明,而且有助于肝用鹅的分子育种。当一个基因的表达量或其核酸多态性标记(如SNP)与肥肝鹅的生产性能存在关联时,该基因或可用作辅助选择标记来提高肥肝鹅的育种效率,克服目前肥肝鹅育种存在的问题。本研究对IGFBP家族基因和一个长非编码RNA基因(LOC106047490)的表达量进行测定,并对这些基因所含SNP位点与肥肝鹅的生产性能进行关联分析。具体的研究方法和结果如下:
  1.利用荧光定量PCR检测填饲19天朗德鹅和对照鹅肝脏中IGFBP家族基因的表达。数据表明,相对于正常肝脏,鹅肥肝中IGFBP1、IGFBP2和IGFBP5的表达受到明显抑制。该结果提示这三个基因与鹅肥肝的形成密切相关,它们的表达量或可用于肥肝鹅生产性能的预测。
  2.对IGFBP1、IGFBP2和IGFBP5基因及上游DNA区域(起始密码子上游2kb)进行引物设计,检测这些基因SNP位点,并分析SNP位点与填饲鹅生产性能指标(如肝重、腹脂重和胴体重等)的关联。对于SNP位点的筛查,首先利用10只朗德鹅和10只扬州鹅查找品种间的SNP位点,然后扩大样本量检测朗德鹅特有的SNP位点。结果显示:①对于IGFBP1基因,扬州鹅品种内有7个SNP,朗德鹅品种内未发现SNP,而朗德鹅和扬州鹅品种间共有12个SNP;②对于IGFBP2基因,扬州鹅品种内有13个SNP,朗德鹅品种内有1个SNP,而两个品种间共存在49个SNP。统计分析表明朗德鹅品种内的SNP位点与腹脂重呈显著相关(p<0.01);③对于IGFBP5,扬州鹅品种内有10个SNP,朗德鹅品种内特有3个SNP,而朗德鹅和扬州鹅品种间共存在19个SNP。统计分析表明朗德鹅品种内的两个SNP位点与肥肝重呈显著相关(p<0.01)。这些发现从关联分析的角度进一步证实了这些基因作为肝用鹅育种辅助选择标记的应用价值。
  3.NCBI数据库中IGFBP2基因上游距离起始密码子1602bp处存在部分序列未知,本研究通过基因特异性PCR扩增获得了这段367bp长的序列。
  4.利用荧光定量PCR检测lncRNA基因(LOC106047490)在鹅不同填饲期(7天、14天及19天)肝脏、腹脂和胸肌中的表达量。结果表明,填饲可以抑制该基因在三个组织中的表达,且随着填饲时间的延长,该基因在肝脏和胸肌中的表达量下调更加明显,这可能与组织中脂肪的沉积量有关。该发现提示该长非编码RNA基因的表达量或可预测肥肝鹅组织中的脂肪沉积量。
  5.为进一步明确该基因与鹅肥肝形成的关系,本研究利用荧光定量PCR检测了lncRNA基因(LOC106047490)在不同脂肪肝形成相关因子(葡萄糖、胰岛素、棕榈酸、油酸和亚油酸)处理下鹅原代肝细胞中的表达情况。结果发现,除棕榈酸外,其他因子均能诱导该基因的表达,且这种诱导具有一定的剂量效应。这种诱导与鹅肥肝中的表达抑制不一致,提示鹅肥肝形成中还存在着其他更重要的因子调控该基因的表达。
  6.为进一步探讨该基因作为辅助选择标记的应用价值,本研究分析了该基因表达的组织特异性,利用荧光定量PCR对该基因在23日胚龄和89日龄鹅的不同组织中表达量进行测定。结果发现,在鹅胚胎期LOC106047490基因在肝脏和腿肌中表达量较低,而在心、胸肌、肠和肌胃中的表达量较高;而在89日龄鹅,该基因在腹脂中的表达量最高。此外,通过不同时期同类组织中该基因表达量的比较,可以发现该基因的表达模式受鹅生长时间的影响。这些结果为该基因用于鹅育种中的辅助选择提供了参考信息。
  7.对朗德鹅和扬州鹅LOC106047490基因的外显子区进行SNP分析,在扬州鹅品种内发现12个SNP位点,而在朗德鹅品种内未发现SNP位点。
  综上所述,本研究发现IGFBP家族基因和长非编码RNA基因(LOC106047490)均与鹅肥肝的形成密切关联,是肥肝鹅辅助选择标记的重要候选基因。进一步开发利用这些基因,将有助于肥肝鹅育种中现有问题的解决。
[博士论文] 唐现文
兽医 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:本研究以江苏农牧科技职业学院培育的黑羽番鸭为试验素材,开展了黑羽番鸭血液生化指标与产肉性能的关联分析;以黑素皮质素受体1(melanocortin-1 receptor,MC1R)和黑素皮质素受体4(melanocortin-4 receptor, MC4R)为候选基因,采用PCR-SSCP分析和直接测序法,开展了分子遗传多样性分析;利用RT-PCR技术和Western Blot方法分析了MC4R基因在黑羽番鸭不同生长时期胸肌、腿肌组织中mRNA和蛋白表达差异,初步揭示MC4R基因在黑羽番鸭不同时期肌肉中的遗传规律。主要研究结果如下:
  1.对13周龄黑羽番鸭生产性能指标进行检测,公母黑羽番鸭的7个体尺指标均存在显著差异(P<0.05);宰前活重和全净膛率公番鸭(3.2 Kg,79.6%)显著高于母番鸭(1.9 Kg,76.2%)(P<0.05);常规肉品质指标在公母间差异不显著(P>0.05);风味氨基酸含量测定中母番鸭丙氨酸含量显著高于公番鸭(P<0.05)。
  2.高产期笼养组和平养组黑羽番鸭公母鸭血清生化指标检测结果表明,母鸭天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)活性和肌酐含量笼养组显著低于平养组(P<0.05),碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性笼养组显著高于平养组(P<0.05);公鸭平养组血清中AST、UA、SOD活性显著高于笼养组(P<0.05),ALP显著低于笼养组(P<0.05),睾酮(TES)含量极显著低于笼养组(P<0.01)。表明不同饲养方式对黑羽番鸭血清生化指标有一定影响。
  3.黑羽番鸭公鸭产肉性能、肉品质以及血液生化指标进行关联分析,产肉性状与肉品质性状间的相关系数达显著水平(P<0.05),占两组性状间总相关信息的35.4%;产肉性状与血清生化性状间的相关系数达极显著水平(P<0.01),占两组性状间总相关信息的48.6%;肉品质性状与血清生化性状相关系数达显著水平(P<0.05),占两组性状间总相关信息的20.3%。表明产肉性状、肉品质性状、血液生化性状间,起主要作用的性状为半净膛重、全净膛重、pH、失水率和碱性磷酸酶。
  4.黑羽番鸭MC4R基因编码区发现C645T、G672A突变;公番鸭在初生、10周龄、13周龄时TTGG型和CTAG型的体重显著性高于CCAG型体重(P<0.05),CCGG型仅在13周龄时体重显著低于TTGG型(P<0.05),其他基因型之间体重无显著性差异(P>0.05)。公番鸭TTGG型宰前活重显著性高于CCAG型、CCGG型(P<0.05);半净膛重、全净膛重显著性高于CCGG型(P<0.05)。CCAG型和TTGG型胸肌重显著性高于CCGG型、CTAG型和CTGG型(P<0.05);CCGG型胸肌率显著低于其他基因型(P<0.05)。母鸭体重、屠宰性能指标在不同基因型间均无显著性差异(P>0.05)。表明MC4R基因对黑羽番鸭公鸭早期体重和屠宰性能有明显的影响作用。
  5.黑羽番鸭MC1R基因编码区发现G274A、G279A和C485A突变,在第279处的G-A突变中白羽番鸭仅有GG型,而全黑番鸭群体都以GA、AA型存在;全白番鸭与其他3个番鸭群体之间卡方值最大,推测此位点对番鸭的羽色影响较大。
  6.对0-13周龄黑羽番鸭胸肌和腿肌MC4R基因mRNA动态表达水平进行检测,初生黑羽番鸭的mRNA含量显著高于其他各周龄(P<0.05),同一性别、同一肌肉组织样中mRNA含量均存在显著差异(P<0.05),且总体上mRNA含量是先下降后趋于平稳;Westernblot检测结果表明,13周龄公番鸭胸肌组织MC4R基因蛋白表达显著低于腿肌(P<0.05),母番鸭胸肌组织MC4R基因蛋白表达高于于腿肌(P<0.05);公番鸭胸肌MC4R基因蛋白表达总体上要低于母番鸭。蛋白表达与mRNA表达结果有差异,MC4R基因表达规律不明显。
[硕士论文] 曹彦博
机械工程 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:我国是一个鸡只养殖大国,无论鸡只养殖总量还是鸡产品总量均居世界前列。然而鸡产品在国际市场的竞争力却差强人意。出现这种情况的主要原因是我国现有的环境智能控制系统检测的环境因子比较少,并且只考虑了各环境因子对鸡只生长的影响,而没有考虑它们的交互作用,工作效果不理想,精度稳定性比较低。饲养者为追求利润而大量使用药物,从而造成了药物残留超标的问题。因此,本课题从为鸡只提供一个适宜的生长环境的目的出发,研究设计了该智能环境控制系统,并将数据融合技术融入到环境检测系统中,提高了检测的精度。
  通过借鉴国内外现有的鸡舍智能环境控制系统的设计经验,查阅参考有关文献,分析我国已有的鸡舍环境控制系统的发展现状,设计了一种有利于鸡只生长的鸡舍智能环境控制方案。本系统主要分为六个部分:控制模块、环境采集模块、人机交互模块、时钟模块、GPRS无线传输模块和继电器驱动模块。在论文中依次论述了智能环境控制方案的研究背景与意义、系统的总体设计、系统硬件部分的设计、环境调节设备的设计、环境参数的数据融合、系统软件部分的设计。最后将设计的环境控制系统完成了安装,并进行了实地试验。
  本设计结构简单,易于操作。经过试验表明,本系统节约了劳动力,提高了鸡舍环境的控制精度,实现了预期目标,有利于促进鸡只养殖业的发展。
[硕士论文] 张向前
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:京海黄鸡拥有小型、优质、早熟、抗逆性强四大特点。从生产记录中发现其群体中存在300日龄产蛋数高和低的特殊个体。产蛋数作为数量性状,其不仅易受环境的影响,同时受到微效多基因的控制。本文着眼于这两点,选择了可能对京海黄鸡产蛋数具有影响的4个基因(ZP2基因、Stat5b基因、AMH基因、MDH1基因),采用qRT-PCR的方法研究了四个基因在300日龄京海黄鸡个体组织里的表达规律,重点剖析了卵巢组织里的表达状况,并通过双荧光素酶基因报告系统对ZP2基因核心启动子区域进行了研究,本文还采用BSP(Bisulfite Sequencing PCR)测序的方法,对卵巢组织中ZP2基因启动子区CpG岛的甲基化进行了定量检测,同时分析了重要甲基化位点对基因mRNA表达量的调控作用,结合启动子区潜在的转录因子结合位点的预测,分析甲基化位点所在区域,进一步探讨ZP2基因的分子调控机制。主要实验结果如下:
  1.通过实时荧光定量检测4个基因在300日龄京海黄鸡9个组织中的mRNA的表达量发现,ZP2基因在卵巢中的表达丰度最高,其次是肾脏;Stat5b基因在腿肌中的表达丰度最高,其次是胸肌,在卵巢中的表达量较低;AMH基因在卵巢中的表达丰度最高,其它组织中的表达量较低;MDH1基因在心脏中的表达丰度最高,其次是腿肌,在卵巢中表达量较低。ZP2基因在高产组中的表达量极显著高于低产组(P<0.01),Stat5b基因和AMH基因在高产组的表达量低于低产组,但没有明显差异,MDH1基因在两组间的表达量几乎相同。以上结果说明,ZP2基因表达上调对京海黄鸡的产蛋数有一定影响,Stat5b基因和MDH1基因对京海黄鸡的产蛋数可能没有直接影响,AMH基因在卵巢中具有较高的表达量,但高低产组的表达差异不显著,其在京海黄鸡卵巢中发挥的作用还需进一步研究。
  2.京海黄鸡ZP2基因启动子系列缺失片段在DF-1细胞中具有不同的启动子活性,重组质粒pGL3-P6的活性最高,pGL3-P5的活性明显下降,说明ZP2基因启动子的核心区域在-1552~-1348之间,与Neural Network PromoterPredietion在线网站预测的结果一致。
  3.通过软件预测发现ZP2基因启动子区共有4个CpG岛,利用BSP技术检测启动子区CpG岛的甲基化状态。ZP2-1扩增片段总体甲基化程度与mRNA表达量有一定程度的负相关(R=-0.197,P=0.672),所有单个位点的甲基化程度与mRNA表达量的相关性都没有达到显著水平;ZP2-2扩增片段总体的甲基化程度与mRNA的表达量也有一定程度的负相关(R=-0.264,P=0.567),其中mC-9位点的甲基化程度与mRNA存在极显著的负相关(P<0.01),但其并没有位于转录因子结合位点内,mC-20和mC-21位点的甲基化程度与mRNA存在显著的负相关(P<0.05),且都位于Sp1转录因子结合位点上,推测上述位点可能是调控转录的主要位点,且可能通过抑制Sp1和DNA的结合,从而抑制ZP2基因的转录。
[硕士论文] 宋亚东
养殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:冬闲田种草养鹅是利用稻田休耕期复种牧草或绿肥,牧草养鹅,鹅粪肥田,绿肥还田,这不仅是一种养殖业和种植业有机结合的理想模式,还可有效改善农田生态环境,使草地畜牧业得到可持续发展,增加农民收入。冬闲田种草养鹅作为一种新的生态养殖方式,还存在多处问题需要进一步完善,如在冬闲田种草养鹅模式下,在规定时间内能否达到上市体重?人们虽普遍认为草饲型肉产品更天然、更健康,但是在该模式肌肉中究竟哪些指标发生改变?针对这些问题,本文将体重大小基本一致的28日龄扬州鹅随机分为4组(A组:全程放牧;B组:全程放牧+后期补饲1周;C组:全程放牧+全程补饲,D组:全程舍饲),每组设置3个重复,每个重复30只。通过比较冬闲田种草养鹅与舍内饲养下肉鹅生长性能及肉品质研究,探讨冬闲田种草养鹅模式的可行性,以期为该模式的推广应用提供理论依据,同时也为农牧结合生态养殖提供新的种养方式。主要研究结果如下:
  1.不同饲养方式下扬州鹅生长性能和屠宰性能结果表明,采用全程放牧+全程补饲方式可取得与全程舍饲生长发育(体重和体尺)相当的效果(P>0.05),70日龄体重可达3647.10g,同时能提高饲料转化率(仅为2.42∶1)。无论是全程放牧、全程放牧+后期补饲或者全程放牧+补饲的腿肌重均大于全程舍饲组(P>0.05),腿肌率显著大于全程舍饲组(P<0.05)。
  2.不同饲养方式下的70日龄鹅肉品质测定结果表明,与全程舍饲组相比,全程放牧+全程补饲的肉鹅肌肉蛋白和胶原蛋白含量都显著或极显著提高(胸肌中含量分别为22.53%和1.50%;腿肌中含量分别为23.08%和1.20%)(P<0.01),而肌内脂肪含量极显著下降(胸肌中含量为2.24%;腿肌中含量为3.51%)(P<0.01),但对肌肉的pH值未产生明显影响(P>0.05),全程放牧组与全程放牧+后期补饲组系水力显著高于全程舍饲组(P<0.05)。
  3.不同饲养方式下的肌肉金属元素含量测定结果表明,在放牧+补饲饲养模式下可提高鹅胸肌镁含量和铜含量,其含量分别为284μg/g和7.57μg/g,但对腿肌金属元素含量影响不大(P>0.05)。不同饲养方式下的肌肉脂肪酸测定结果表明,与全程舍饲组相比,全程放牧组、全程放牧+全程补饲组胸肌中硬脂酸、亚麻酸、花生酸等指标均显著提高(P<0.05);腿肌中亚油酸、亚麻酸均显著提高(P<0.05);而棕榈酸、油酸、DHA含量显著下降(P<0.05)。不同饲养方式下的肌肉胆固醇含量测定结果表明,全程放牧+补饲组与全程舍饲组相比,全程放牧组胸肌中胆固醇含量显著上升(66.58 mg/100g),而腿肌胆固醇含量差异不显著(P>0.05)。
  4.为了探讨不同饲养模式下鹅肌肉DNA甲基化和肉品质的关系,对各饲养模式下的肌肉基因组DNA甲基化进行测定,结果表明,在全程放牧情况下可以显著降低腿肌的DNA甲基化程度(P<0.05)。相关性分析结果表明,鹅腿肌基因组整体DNA甲基化水平与肌肉蛋白含量和不饱和脂肪酸含量呈显著相关(P<0.05)。
  5.为了完善冬闲田种草养鹅模式,进一步对载畜量、轮牧方案、补饲量等技术参数进行研究,根据不同阶段鹅的采食量、草的生长情况提出了冬闲田种草养鹅的最佳方案,即15只/亩,3~4天/轮;并制定了放牧+补饲饲养方式下配合饲料建议补饲量:29~35日龄,每天每只补饲量以80~100 g为宜;36~42日龄,每天每只补饲量以120~140 g为宜;43~49日龄,每天每只补饲量以150~170 g为宜;50~70日龄,每天每只补饲量以180~200 g为宜。
  综上所述,在冬闲田放牧条件下,采用全程放牧+全程补饲方式可取得理想的肥育效果,并在一定程度上提高其肉品质,降低其饲料转化率,因此,冬闲田种草养鹅模式是可行的。
[硕士论文] 任立辰
养殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:在我国优质肉鸭的培育研究中,对于快大型肉鸭与我国地方鸭品种之间杂交研究甚少,杂交模式与经济效益也鲜有研究。本试验采用人工授精技术将樱桃谷鸭与我国优良蛋鸭品种(金定鸭、攸县麻鸭、莆田黑鸭、绍兴鸭)进行杂交,通过杂交亲本的筛选、组合模式以及杂交后代生产性能比较,为我国优质肉鸭的培育和生产模式研发提供参考资料。
  1.杂交父本的筛选。引入三种候选父本:樱桃谷鸭(快大型、白羽)、广东肉麻鸭(快大型、麻羽)及重庆白鸭(中型、白羽)。同样条件下饲养至相同出栏体重(1.9kg左右),比较发现,樱桃谷鸭生长至出栏体重需要29d,料肉比1.66;广东肉麻鸭需要35d,料肉比1.98;重庆白鸭需要53d,料肉比2.70;在屠宰性能方面,广东肉麻鸭与重庆白鸭差异不显著(P>0.05),均显著高于樱桃谷鸭(P<0.05)。综合分析表明,樱桃谷鸭早期生长速度快,饲料报酬高,养殖经济效益好,符合杂交父本所需特点,因此,选择樱桃谷鸭为杂交父本。
  2.杂交母本的筛选。对杂交母本(金定鸭、攸县麻鸭、莆田黑鸭、绍兴鸭)的生长及生产性能进行测定后发现,金定鸭体重增长速度最快,初生重、105d体重及300d体重均极显著大于其它蛋鸭品种(P<0.01),攸县麻鸭体重最小,300d体重极显著小于其它蛋鸭品种(P<0.01)。在产蛋性能方面,攸县麻鸭见蛋、50%开产日龄最早,产蛋高峰期产蛋率表现为:攸县麻鸭>金定鸭>莆田黑鸭与绍兴鸭,且差异极显著(P<0.01);产蛋高峰期料蛋比:攸县麻鸭与金定鸭差异不显著(P>0.05),均极显著小于绍兴鸭与莆田黑鸭(P<0.01)。攸县麻鸭产蛋性能最佳,金定鸭产蛋性能略低于攸县麻鸭,但其所产鸭蛋蛋重极显著大于其它蛋鸭品种(P<0.01),且青壳比例最高。
  3.通过人工授精技术解决樱桃谷鸭与蛋鸭品种之间体型差异导致交配困难的问题。成功通过母禽诱情法采集樱桃谷父母代公鸭精液,平均采精量为0.62士0.28 ml。对各蛋鸭品种母鸭进行翻肛输精,每隔4天输精一次,种蛋受精率可达70%~80%,可应用于实际生产;种蛋受精率在输精后第一天最高,之后逐天下降;输精第一天后,攸县麻鸭种蛋受精率最高,为86.24%,显著高于莆田黑鸭71.63%(P<0.05)。采用人工授精模式,公母配比达到1∶27,樱桃谷公鸭利用率比自然交配模式提高了五倍。
  4.对不同杂交组合后代生长、屠宰性能及肉品质测定后发现:各杂交组合后代生长速度介于亲本之间,相较于杂交母本均有大幅提升;不同杂交组合后代饲养至45d,体重可达2.3~2.4kg,料肉比2.7~2.8,成活率均高于樱桃谷鸭;除樱莆鸭后代外,其他杂交后代的屠宰性能均优于樱桃谷鸭。各组杂交后代饲养至70d体重增加趋于平缓,其肌肉脂肪含量与嫩度均极显著优于樱桃谷鸭(P<0.01),且胸肌蛋白含量高于樱桃谷鸭,肉品质较好。
  5.在不同杂交组合中,樱桃谷鸭与金定鸭杂交后代的45d成活率最高、活重最大、料肉比最低且全净膛率最高;同时其受精蛋出雏率最高,杂交母本金定鸭产蛋性能优良,所产青壳鸭蛋更受市场欢迎。综上所述,确定樱桃谷鸭与金定鸭为最优杂交组合。
[硕士论文] 吴宁昭
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:microRNAs(miRNAs)是一类非编码RNA,短单链,长度约22 bp,且在进化过程中高度保守。miRNAs在单细胞和多细胞生物中广泛存在,在转录后水平对基因表达进行调控。现有研究表明miRNA-1和miRNA-133来源于同一对双顺反子(Bicistronic pairs),并对骨骼肌的发生发育有重要的调控作用,而关于鸭miRNA-1和miRNA-133对骨骼肌发育的研究还尚未见有报道。本实验以体型大小不同的樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)作为实验对象,通过实时荧光定量技术构建鸭miRNA-1和miRNA-133的组织表达谱和发育性表达谱;并通过转染miRNA的模拟物或抑制物,采用双荧光素酶报告基因系统对鸭miRNA-1和miRNA-133的功能进行初步探讨,以了解其在鸭骨骼肌发育中的调控作用。主要研究结果如下:
  1.为探明樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)的肌肉生长发育与肌纤维发育规律,分别对38、42、45、49、56等不同日龄胸肌重、腿肌重、肌纤维面积等表型进行了测定。结果显示,樱桃谷鸭42日龄胸肌重达205 g,腿肌重达238 g,其肌纤维面积分别是5835μm2和12406μm2,而莆田黑鸭(白羽系)42日龄胸肌重仅为129 g,腿肌重175 g,其肌纤维面积分别是926μm2和4089μm2,表明樱桃谷鸭与莆田黑鸭(白羽系)在胸肌、腿肌发育和肌纤维发育等方面差异显著。
  2.为构建鸭miRNA-1和miRNA-133的组织表达谱和发育性表达谱,本文通过实时荧光定量检测樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)的miRNA-1和miRNA-133表达量。检测结果显示,miRNA-1和miRNA-133在心肌、胸肌和腿肌等肌肉中呈特异性表达。同时检测胚胎期和早期生长发育过程中的肌肉组织miRNA的表达量,发现鸭胸肌和腿肌miRNA-1和miRNA-133的表达呈现出类似的变化趋势,即在胚胎期后期miRNA表达急剧上升,而在整个生长发育期miRNA的表达基本恒定。樱桃谷鸭中表达量分别在胚胎期28天和生长期42天达到峰值,且在这两个时间点,樱桃谷鸭的表达量显著高于莆田黑鸭(P<0.05)。
  3.为探明鸭miRNA-1和miRNA-133对骨骼肌发育的作用,将miRNA-1 mimic或inhibitor和miRNA-133mimic或inhibitor转染至鸭成肌细胞,实时荧光定量检测结果显示,miRNA mimic或inhibitor可有效促进或抑制其表达;且过表达miRNA-1可促进相邻成肌细胞相互融合,而过表达miRNA-133细胞融合现象很少;CCK-8细胞增殖检测结果表明,降低miRNA-1表达可促进成肌细胞增殖,而降低miRNA-133则可抑制成肌细胞增殖;成肌细胞分化标记标志基因表达检测结果显示,转染miRNA-1 mimic,分化标记标志基因MEF2d、Myod表达量显著地上升,而转染miRNA-133 inhibitor,MEF2d、Myod基因的表达量显著地上升。以上结果充分说明miRNA-1可促进鸭成肌细胞分化,miRNA-133可促进成肌细胞增殖。
  4.为进一步阐明miRNA-1和miRNA-133在鸭骨骼肌发育中的作用机制,通过文献检索和生物信息学预测,确定miRNA-1和miRNA-133的候选靶基因。实时荧光定量检测转染miRNA的模拟物和抑制物之后候选靶基因的表达量,结果显示miRNA-1可显著降低其候选靶基因HDAC4的表达(P<0.01),miRNA-133也可降低其候选靶基因SRF、TGFBR1的表达(P<0.01)。双荧光素酶报告系统进一步检测结果表明,miRNA-1可抑制pGL-Basic-HDAC4荧光素酶报告基因活性;而miRNA-133并未降低pGL-Basic-SRF,pGL-Basic-TGFBR1荧光表达强度。因此,鸭miRNA-1可通过靶向HDA C4促进鸭成肌细胞分化;而miRNA-133可影响SRF、TGFBR1的表达,并促进鸭成肌细胞增殖。
[硕士论文] 王苗苗
养殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:不同鹅品种间经济杂交已成为当前鹅业生产的主要手段之一,我们前期研究发现,不同鹅品种间杂交表现出较高的杂种优势,但种蛋受精率要明显低于纯种生产。不同品种间是否存在交配障碍(选择性交配、竞争交配等),从而引起受精率下降,目前尚未有报道。基于此,本研究采用观察记录法,以浙东白鹅、四川白鹅和卡洛斯鹅为研究对象,组建浙东白鹅♂×四川白鹅♀(ZC)、四川白鹅♂×浙东白鹅♀(CZ)、浙东白鹅♂×浙东白鹅♀(ZZ)、四川白鹅♂×四川白鹅♀(CC)、卡洛斯鹅♂×四川白鹅♀(KC)、四川白鹅♂×卡洛斯鹅♀(CK)、卡洛斯鹅♂×卡洛斯鹅♀(KK)、四川白鹅♂×四川白鹅♀(CC)多父本家系。采用视频自动采集系统,观察比较不同组合求偶交配行为,揭示不同品种间求偶交配行为差异及其对种蛋受精率的影响,为科学选配、完善饲养管理制度、提高水禽生产力和经济效益提供一定的理论依据。主要研究结果如下:
  1.为揭示不同鹅品种间求偶交配行为差异,经观察,鹅求偶方式包括公鹅主动求偶、母鹅主动求偶、公母鹅互相求偶,公鹅主动求偶为主要求偶方式。浙东白鹅与四川白鹅存在连续交配、固定交配、交配(竞争)干扰、母鹅爬跨等特殊行为。卡洛斯公鹅存在一对一交配、优胜等级序列与明显的交配(竞争)干扰行为,因此建议在卡洛斯鹅保种过程中剔除此类公鹅,以维持群体的遗传多样性。同时还发现浙东白鹅公母鹅均存在明显选择性交配。卡洛斯鹅与四川白鹅间也存在明显选择性交配,母鹅配合度低,种间亲和性差。
  浙东白鹅与四川白鹅杂交,从总体来看,杂交组公鹅主动求偶频次低于纯繁组,但求偶用时高于纯繁组。其中,四川白鹅♂×浙东白鹅♀组公鹅主动求偶频次和时长(11.93次/天,17.34s)与四川白鹅纯繁组(16.00次/天,14.15s)存在显著差异(P<0.05),说明不同品种间杂交会导致求偶频次降低。浙东白鹅母鹅主动求偶与追逐公鹅的频次高于四川白鹅母鹅,其中,四川白鹅♂×浙东白鹅♀组显著高于其他组(P<0.05),说明浙东白鹅母鹅求偶能力强于四川白鹅母鹅。不同品种杂交还会降低母鹅配合交配的频次,四川白鹅♂×浙东白鹅♀组母鹅配合交配频次为15.71次/天,显著低于四川白鹅纯繁组(20.43次/天)(P<0.05)。根据求偶交配行为频次判断各组最佳合群时间为11-15天,这为开展不同品种杂交确定种蛋收集时间提供了一定的依据。
  卡洛斯鹅与四川白鹅杂交,从总体来看,不同品种间杂交对求偶交配行为影响显著,杂交组公鹅求偶、爬跨、交尾、成功交配与母鹅配合交配的频次均低于纯繁组。尤其是四川白鹅纯繁组上述各种行为频次均显著高于其他组(P<0.05)。说明,四川白鹅求偶交配能力强于卡洛斯鹅,结果提示在今后开展不同种(中国鹅与欧洲鹅)杂交利用时,要调整好公母比例以确保合理的公鹅求偶交配次数。
  2.为揭示不同交配强度的公鹅(浙东白鹅)、母鹅(四川白鹅)血清性激素水平,酶联免疫吸附测定结果表明,成功交配40次以上的公鹅睾酮水平为111.42 ng/L,显著高于交配低于30次的公鹅(81.48 ng/L)(P<0.05);主动求偶与爬跨的母鹅雌二醇水平分别为47.52 ng/L、57.65 ng/L,均显著高于不愿交配的母鹅(13.57 ng/L)(P<0.05),该结果表明性激素在一定程度上影响求偶交配行为。
  3.为阐明求偶交配行为与种蛋受精率的关系,统计分析表明,浙东白鹅与四川白鹅各组合中,种蛋受精率与公鹅成功交配次数显著正相关(rp=0.992*,P<0.05),与三种求偶行为次数不相关。卡洛斯鹅与四川白鹅各组合中,种蛋受精率与公鹅成功交配次数、总交配行为次数显著正相关(rp=0.975*,P<0.05;rp=0.980*,P<0.05),与三种求偶行为次数均不相关。该结果提示在生产中可以通过提高成功交配次数来提高种蛋受精率。
  本研究揭示了中、欧不同鹅品种交配行为差异,并发现各组合种蛋受精率与公鹅成功交配频次呈显著相关,在一定交配次数范围内,公鹅成功交配次数越多,种蛋受精率越高。
[硕士论文] 王飞
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是动物体内重要的成体干细胞,能够将遗传物质传递给下一代,它既有胚胎干细胞的发育特性又能发育成单倍体生殖细胞。现今有大量研究表明精原干细胞可在体外被诱导为具有不同功能的细胞系,用于遗传修饰、疾病治疗和转基因动物制备等,因此对精原干细胞体外操作的研究尤为重要。其中将SSCs诱导形成精子一直是科学家们研究的热门话题,但如何大量获得SSCs并使其产生具有功能性的精子就成为科学家们亟需解决的科学问题。
  通过本课题组前期已完成的鸡雄性ESCs,雄性PGCs以及SSCs的转录组测序(RNA-Seq)的实验结果,分析得到了鸡雄性生殖细胞发生过程中基因动态表达的水平变化,有助于对该过程中重要作用的未知基因的发现。本实验研究的目的基因CPED1在SSCs的转录组测序中特异高表达并功能未知,因此有可能对SSCs分化具有重要作用,因此本实验同时利用基因过表达技术和CRISPR/Cas9技术实现对测序过程中发现的精原干细胞高表达基因CPED1功能的研究,为阐明生殖细胞发生及分化机制提供高效方法。
  本研究的主要内容如下:
  (1)基于本实验室前期RNA-Seq技术发现CPED1在ESCs向SSCs分化过程中存在显著差异表达。通过qPCR克隆如皋黄鸡CPED1编码序列,同时构建过表达载体pcDNA3.0-CPED1和敲除载体Cas9/gRNA。通过Fugene转染Cas9/gRNA载体,利用T7E1酶切、SSA活性检测、TA克隆测序和脱靶效率检测Cas9/gRNA载体敲除活性及脱靶情况。在DF-1细胞中通过T7E1酶切检测Cas9/gRNA载体的活性,酶切结果表明,通过条带灰度值估计Cas9/gRNA1载体、Cas9/gRNA2载体和Cas9/gRNA3载体活性分别为37%、20%和30%,Cas9/gRNA1载体敲除活性最佳;SSA活性检测结果表明gRNA1的荧光活性值与对照组相比增加了2倍左右,活性最佳;TA克隆测序结果表明测序的8菌液样中有2管菌液样发生了突变,初步估计基因敲除率为25%左右;脱靶效率检测结果表明在DF-1细胞中无脱靶现象。同时实现了在ESCs中CPED1的定点敲除,敲除效率为25%。这一结果表明CRISPR/Cas9技术能稳定的在鸡DF-1细胞和ESCs上实现CPED1敲除。
  (2)分别将Cas9/gRNA1载体和pcDNA3.0-CPED1过表达载体通过Fugene转染ESCs,转染48小时候换RA诱导培养基培养12d。采用细胞形态学观察、间接免疫荧光检测、流式细胞分析和qRT-PCR等方法检测CPED1于敲除与过表达对ESCs向SSCs分化的影响,结果表明敲除CPED1的ESCs与正常RA诱导组相比,类胚体形成时间延长且停止向雄性生殖细胞分化;第12d RA诱导组与过表达组均能形成类SSCs,敲除组则无类SSCs形成。间接免疫荧光检测结果表明敲除CPED1导致体外诱导10d的ESCs分化生成的integrinα6和integrinβ1双阳性类SSCs数量显著低于过表达组和RA诱导组。流式细胞分析结果表明RA诱导组、过表达组和敲除组中integrinα6阳性类SSCs数量比例分别为1.5%±0.163、1.8%%±0.294和0.9%±0.216,敲除组中阳性细胞率明显低于其它两组。12d qRT-PCR结果表明RA诱导组中目的基因CPED1和生殖相关基因Cvh、C-kit、Stra8、integrinα6和integrinβ1的最高表达量分别为1.72,1.62,1.74,2.01,2.36,2.42;过表达组中目的基因CPED1和生殖相关基因Cvh、C-kit、Stra8、integrinα6和integrinβ1的最高表达量分别为2.68,1.71,1.95,2.46,2.67,2.78;敲除组中目的基因CPED1和生殖相关基因Cvh、C-kit、Stra8、integrinα6和integrinβ1的最高表达量分别为0.42,1.12,1.03,0.87,1.41,1.53;
  RA诱导组和过表达组中CPED1的表达量具有显著差异,敲除组中CPED1以及生殖相关基因Cvh、C-kit、Stra8、integrinα6和integrinβ1的表达量与RA诱导组和过表达组相比呈显著下调。在RA诱导ESCs向SSCs分化过程中,敲除CPED1抑制类SSCs形成,证明CPED1在调控家禽ESCs向SSCs分化过程中起重要作用。
  (3)取新鲜的受精鸡胚,利用PEI包裹Cas9/gRNA1载体和pcDNA3.0-CPED1过表达载体分别进行鸡胚注射,并设立正常孵化组与对照组。分别收集正常孵化至4.5d鸡胚生殖嵴样和18.5d睾丸样,采用石蜡切片及PAS染色、qRT-PCR和流式细胞分析等方法检测CPED1敲除和过表达对鸡雄性生殖细胞体内动态变化的影响。qRT-PCR检测结果显示4.5d的过表达组中生殖相关基因Cvh、Stra8和integrinα6的表达量分别为2.12,1.37,1.20,显著高于敲除组,CPED1表达量(1.07)极显著高于敲除组;18d的过表达组中的Nanog的表达量(0.32)显著低于对照组,integrinα6基因表达量(1.89)显著高于敲除组,CPED1表达量(2.09)极显著高于敲除组。4.5d鸡胚石蜡切片结果表明对照组中PGCs数量为(45±2.236)个,过表达组中PGCs数量为(41±1.699)个,敲除组中PGCs数量为(18±0.745)个,敲除组中含有的PGCs数量低于对照组和过表达组。同时对18d睾丸分离培养的SSCs进行流式细胞分析检测,结果表明对照组、过表达组和敲除组中integrinα6阳性细胞率分别为1.3%±0.141、1.6%±0.356和0.8%±0.245,敲除组中SSCs数量显著减少,对照组和过表达组中却无显著差异。结果证明CPED1对鸡胚干细胞向精原干细胞分化具有促进作用。
[博士论文] 徐璐
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:生殖系细胞担负着遗传信息的世代传递,其基因组特性、表达与调控模式对个体及物种维持都至关重要。作为一半的遗传信息载体的精子在家禽中一直未受到足够关注。但是近年来,鸡繁殖力持续下降的问题始终困扰着产业的发展。地方鸡种中每年有5~12%的公鸡因精子发生障碍症而遭淘汰。在现代商业品种中,种公鸡的精子质量导致出苗率逐年下降。另外,由精子介导的细菌微生物(白痢沙门氏菌、空肠弯曲杆菌等)与病毒性疾病(禽白血病、EDS-76等)逐年上升,其中,困扰产业多年的“两白”(白痢与白血病)至今尚未解决。因此,研究鸡精子发生及其影响机制成为当下迫切解决的问题之一。piRNA(Piwi-interacting RNA)是一类长度约为30nt左右的小RNA,与PIWI蛋白家族成员结合发挥调节作用。在小鼠、果蝇、斑马鱼等模式动物中,PIWI/piRNAs复合物引起的基因沉默能调控生殖干细胞增殖、分化以及精子发生;但在家禽中,PIWI/piRNAs的研究报道甚少,其具体作用与功能尚未阐明。鉴于此,本研究以中国地方鸡种——狼山鸡为对象,分别从精子发生的不同阶段生殖系细胞small RNAs表达谱、与鸡PIWI蛋白特异结合的piRNAs表达与分析、piRNAs与靶基因的作用关系、减数分裂中Piwi基因作用及敲除Piwi基因后个体精子发生变化等方面来揭示家禽精子发生过程中Piwi基因与piRNAs的可能作用与具体功能,从而为探明Piwi基因及piRNAs在禽类中的生物学功能与改善家禽繁殖力提供理论依据,也为丰富生殖细胞和精子发生的表观遗传调控机制研究增添新的资料。
  为探究参与鸡精子发生及生殖干细胞增殖相关的piRNAs,本研究利用深度测序技术获得不同生殖干细胞(PGCs、SSCs)与生精细胞(Sa、Sperm)的small RNAs表达谱。结果发现,鸡piRNAs主要集中在31~33nt之间,比小鼠中的piRNAs略长,主要定位于编码基因序列及转座子区域;碱基偏好性分析表明鸡piRNAs均表现出首碱基为U,第10位为A(1U-10A)的特征,并且Sa细胞与Sperm中piRNAs的碱基偏好性更为明显。另外,在Sa细胞及Sperm中预测到大量piRNAs簇,分别定位于不同染色体中。由此推测鸡的piRNAs与小鼠piRNAs类似,对于精子发生有重要调控作用。通过不同生殖系细胞的单独比较以及组间比较(PGCs vs.SSCs; Sa.vs.Sperm)富集到一批与鸡精子发生及生殖干细胞增殖相关的piRNAs及其靶基因。对靶基因进行GO富集后得到5个候选靶基因:KIT,SMAD6,SCX,PGR和GG、BP2。与这些靶基因对应的piRNAs有:piR-gga-19128(KIT),piR-gga-403821(SMAD6, SCX),piR-gga-123686(PGR),piRNA-396(GGNBP2)。同时,通过KEGG富集到的信号通路有:Melanogenesis,Notchsignaling pathway, Steroid hormone biosynthesis, Cytokine-cytokine receptorinteraction,Wnt signaling pathway与TGF-beta signaling pathway。
  为验证禽类piRNAs与PIWI蛋白结合状况以及共同参与鸡精子发生及生殖于细胞增殖、分化的可能作用,本研究利用免疫沉淀技术结合深度测序技术获得PGCs、SSCs与Sperm的small RNAs表达谱。长度分析表明,与PIWIL1蛋白结合的piRNAs主要集中于31~33 nt;碱基偏好性同样表现为“1U-10A”特征,并且Sperm中的碱基偏好性比PGCs、SSCs明显,上述分析结果均与前期研究结果一致,由此表明,鸡piRNAs确实与PIWI蛋白相互结合并共同参与调控鸡精子发生与生殖干细胞增殖与分化。通过三种细胞的venn分析筛选出一批与PIWI蛋白结合且参与精子发生及生殖干细胞增殖的piRNAs:piRNA-19128、piRNA-70672,piRNA-64217,piRNA-139648。通过靶基因注释及GO富集分析获得候选靶基因有:KIT、SRC、WNT4、HMGB2。KEGG富集分析获得以下信号通路:Steroid hormone biosynthesis,Notch signaling pathway,Melanogenesis。综合以上两部分piRNAs的分析结果,通过Venn分析进一步发现piRNA-19128为二者交集,因此选取piRNA-19128为鸡关键piRNAs进行功能验证。研究表明KIT基因参与精子发生过程,并且对减数分裂发挥重要调控作用。因此,选取piRNA-19128对应的靶基因KIT作为候选功能验证对象。
  为进一步验证piPNAs与KIT基因的靶向调控关系,首先利用RT-qPCR技术检测了PGCs、SSCs、Sa及Sperm中KIT与piRNA-19128的表达量,结果表明,在SSCs与Sperm中,KIT基因表达量相对较高,但piRNA-19128表达量相对较低;在PGCs及Sa中piRNA-19128表达量相对较高,但KIT基因表达量相对较低,且均达到显著差异水平(P<0.01)。由此推测,piRNA-19128与KIT基因可能存在靶向抑制关系。其次,利用piRNAs-19128模拟物与抑制物结合RT-qPCR技术检测piRNA-19128的表达量。结果发现,转染piRNA-19128mimics与inhibitor至DF-1细胞后,随mimics的转染浓度增加,piRNA-19128的表达量随之增加,KIT基因表达量随之降低;随inhibitor的转染浓度增加,piRNA-19128的表达量随之降低,KIT基因表达量随之增加。双荧光素酶荧光活性检测进一步发现,突变型KIT基因荧光活性与野生型荧光活性相比,突变型显著高于野生型(P<0.01)。综上表明,piRNA-19128与KIT基因确实存在靶向调控关系,并且piRNA-19128抑制KIT基因的转录,从而参与精子发生过程中的减数分裂。
  为探明PIWI蛋白与piRNAs如何调控鸡精子发生,我们选择精子发生过程中关键事件—减数分裂作为功能研究平台,探讨编码鸡PIWI蛋白的Piwil1(Piwilike-1)基因、KIT基因与piRNA-19128在减数分裂中的作用。本研究利用维甲酸诱导PGCs细胞,通过RT-qPCR、Western Blot及流式细胞分析技术检测诱导过程中Piwil1mRNA及蛋白水平的变化。有研究表明,Piwil1基因在圆形精细胞中表达量最高,精原细胞次之,推测Piwil1基因参与减数分裂,并发挥重要调控作用。分别收集诱导48h、96h、144h的样品,通过检测减数分裂标志基因Stra8的表达,结果发现,随诱导时间的增加,Stra8基因的表达量显著增加;流式分析诱导144h的细胞,表明44.9%的细胞形态发生变化,由二倍体变为单倍体,由此推断细胞进入减数分裂状态。通过检测不同时间点Piwil1基因、KIT基因与piRNA-19128的表达量,表明随诱导时间的增加,Piwil1、KIT、 piRNA-19128的表达量增加;PIWIL1蛋白水平检测表明,随诱导时间的增加,PIWIL1蛋白表达增加。由此推断,在禽类中,Piwil1基因、KIT基因与piRNA-19128参与鸡精子发生过程并调控减数分裂。
  为阐明PIWI/piRNAs复合物在家禽(鸡)精子发生的具体功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术在体内、体外水平分别对Piwil1基因进行敲除。首先针对Piwil1基因第八外显子分别构建3条敲除载体,通过转染DF-1细胞后使用T7E1酶切及PCR扩增、测序表明2号位点可发挥敲除活性。利用有活性载体转染DF-1细胞,结合有限稀释法得到58株单克隆细胞,PCR扩增靶位点测序表明2株细胞为阳性细胞,一株共缺失23 bp,另一株共缺失8 bp。由此表明,利用该技术成功构建Piwil1敲除细胞株,敲除效率为3.44%,略低于大鼠的敲除效率。在体内水平,利用胚下腔注射法将敲除载体导入孵化2.5日龄的鸡胚个体,分别检测5日龄(心脏、生殖嵴)及18日龄(心脏、睾丸)不同组织中Piwil1基因DNA及RNA水平的突变情况。结果发现,在5日龄及18日龄的各个组织中,敲除位点附近均出现不同程度的突变。RT-qPCR结果显示,实验组中Piwil1基因及SOX2基因表达水平显著低于对照组(P<0.01),表明敲除载体成功导入鸡胚个体发挥敲除作用。对敲除后F0代雏鸡进行饲养并检测其体重及精子活力,结果显示敲除组群体体重与对照组无差异(P>0.05),表明敲除Piwil1基因对个体体重无影响。精液品质检测表明敲除Piwil1基因后,鸡精子活力、活率下降,云雾状不明显,精液量显著减少。对F0代实验鸡群进行本交得到F1代,PCR扩增靶位点并测序表明,10只个体发生Piwil1基因突变。综上表明,在家禽中Piwil1基因参与精子发生,并在其中发挥重要的功能;CRISPR/Cas9技术适用于家禽基因组修饰,并且其修饰效果可遗传。
[博士论文] 朱沛霁
动物营养与饲料科学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:随消费者对食品安全和动物生产过程中因抗生素使用不当而引起畜产品中残留的问题关注与日俱增,研究探索新型抗菌饲料添加剂成为热点课题。以有益微生物菌群研制开发的饲用微生物添加剂,作为一类新型无公害饲料添加剂已被广泛使用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,BS)是一种优质、安全的益生菌,它具有提高动物生长性能、增强机体免疫、抗菌能力、改善肠道菌群、提高机体抗氧化功能等多种功能。虽然芽孢杆菌对肉鸡的功效已经得到了广泛的认识,围绕这一主题的研究也很多,但基本上都以快速型白羽肉鸡为研究对象。以慢速型优质型鸡为研究对象的研究甚少,而现在国内慢速型优质鸡占整体肉鸡养殖量近50%,雪山鸡为我国地方优质黄羽肉鸡品种之一。本论文旨在阐明枯草芽孢杆菌对雪山鸡的生产性能和免疫功能的影响及其作用机理,为慢速型优质型鸡合理使用饲用芽孢杆菌提供理论指导。研究内容如下:
  试验一、研究BS对大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌的体外抑菌作用
  选择8株BS菌株BS044、BS048、BS050、BS075、BS090、BS155、BS281和BS306,以抑菌圈试验评估其对2株标准菌株(E.coli K88菌株)和肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritis,SEATCC13076菌株)和61株临床分离株(29株E.coli、32株沙门氏菌)的抑菌作用。结果发现:(1)BS048和BS155对E.coli K88菌株的抑菌圈较大(20.5±0.3 mm、15.8±1.1 mm),抑菌效果较强,BS090和BS306的抑菌圈较小(8.6±0.7 mm、10.1±0.6 mm),抑菌效果较弱;(2)BS048和BS155对SE ATCC13076的抑菌圈较大(19.2±0.7 mm、17.3±0.9 mm),抑菌效果较强,BS090的抑菌圈较小(11.2±0.8 mm),抑菌效果较弱;(3)BS048、BS155菌株分别能够抑制20株和12株E.coli临床分离菌株,抑菌谱较广,BS090、BS306菌株仅分别能抑制2株和5株,抑菌谱较窄;(4)BS048、BS155菌株均能够抑制23株沙门氏菌临床分离株,抑菌谱较广,BS090仅抑制7株,抑菌谱较窄。综合上述结果,BS048和BS155表现出较好的E.coli和沙门氏菌双抑菌活性。故将BS048和BS155作为试验菌株进行后续的雪山鸡生长试验。
  试验二、枯草芽孢杆菌对雪山鸡生产性能、养分消化率、盲肠菌群变化、维持肠道健康作用及机理
  选取1470只体重相近(35.0 g±1.0 g)的1日龄雪山公鸡随机分为对照组(基础饲粮)、BS048组(添加0.1%(W/W)BS048的基础日粮)和BS155组(添加0.1%(W/W)BS155的基础日粮),饲养80d。测定了BS048和BS155分别对雪山鸡生长性能、成活率、小肠食糜粘度与pH、空肠消化酶活性、盲肠挥发性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)的影响。结果发现:与对照组相比,BS048组雪山鸡的日增重(average daily gain, ADG)、日采食量(average daily feed intake,ADFI)、空肠消化酶(淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶)活性和盲肠VFA含量均有显著提高(P<0.05),小肠食糜粘度则显著降低(P<0.01),料肉比、小肠食糜pH则无显著变化(P>0.05),而BS155组仅ADFI、空肠淀粉酶和盲肠VFA含量显著提高(P<0.05);成活率各组间差异均不显著。由此可见,BS048不仅能够降低小肠食糜粘度并提高空肠消化酶活性,增强肠道的消化功能,而且可以促进盲肠VFA的产生,维持并改善肠道健康状况,从而提高雪山鸡的生长性能。虽然BS155对雪山鸡肠道的作用机制和BS048相似,但没有表现出明显的促生长效果。
  雪山鸡80日龄时,添加枯草芽孢杆菌处理组,雪山鸡对粗蛋白质和能量的表观利用率显著提高,且BS048与BS155两组间没有显著性差异,对干物质、钙和磷的表观利用率均没有明显的影响。在20、40日龄时,添加枯草芽孢杆菌BS048和BS155活菌制剂后均提高了雪山鸡盲肠菌群多样性,并且BS048表现优于BS155。综合本节3个试验,BS048的功效相比BS155更好,故后续章节仅研究BS048的免疫调节和抗感染机理。
  试验三、研究BS048对雪山鸡抗沙门氏菌(Salmonella)感染防御能力的影响
  选取240只体重相近(35.0 g±1.0 g)的1日龄雪山鸡(公,SE阴性)随机分为四组,对照组、对照感染组、BS组和BS感染组(前两组饲喂基础日粮,后两组饲喂添加0.1%(W/W)BS048的基础日粮),每组设3个重复,每个重复20只,饲养14天;两个感染组在5-7日龄时每天以1×108CFU SE感染试验鸡只。观察BS048对正常和SE感染雪山鸡盲肠粘膜、肝脏、肾脏SE荷菌量、空肠粘膜结构、血液Ig、空肠分泌型IgA(secretoryIgA,sIgA)、空肠粘膜碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性、抗氧化功能以及紧密连接蛋白、Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)和炎症因子基因表达的影响。结果显示:(1)对于正常雪山鸡,BS048能够显著促进空肠粘膜发育及其sIgA分泌(P<0.05),提高空肠粘膜ALP活性(P<0.05)和小肠抗氧化功能(P<0.05),诱导空肠粘膜细胞的紧密连接蛋白(CLDN-1、OCLN、ZO-1)、TLR2和炎症因子(IL-6、IL-10)(P<0.05)表达;(2)对于SE感染雪山鸡,BS048能够显著减少SE感染雪山鸡盲肠粘膜、肝脏和肾脏中的SE数量(P<0.01),促进小肠粘膜结构的损伤恢复以及生长发育,促进血液Ig和肠道sIgA分泌(P<0.05),提高空肠粘膜ALP活性(P<0.05)并降低MPO活性(P<0.01),提高小肠抗氧化功能(P<0.05),上调空肠粘膜的紧密连接蛋白(CLDN-1、OCLN、ZO-1)基因表达并下调TLR(TLR2、TLR4)与炎症因子(IL-6、IFN-γ、IL-10)的基因表达。由此可见,BS048能够增强雪山鸡的肠粘膜屏障功能、机体免疫和抗SE感染能力,包括:(1)促进小肠粘膜发育以及感染后的恢复;(2)增强机体的体液免疫和肠道粘膜免疫;(3)增强肠道抗氧化功能,缓解因细菌感染引起的氧化应激,保护组织及其正常功能;(4)增强肠粘膜物理屏障;(5)增强空肠粘膜对病原体的识别和防御能力。
  试验四、研究BS048对鸡巨噬细胞免疫功能的影响
  本研究以108CFU/mL BS048处理HD11鸡巨噬细胞系,并以LPS处理(100 ng/mL)为阳性对照,观察BS048对HD11细胞活化以及吞噬杀菌、细胞因子分泌和NO合成等功能的影响。结果发现:(1)BS048对胞外乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)活性没有显著影响(P>0.05),其具有良好的安全性;(2)BS048能够显著提高HD11细胞内的酸性磷酸酶和LDH活性(P<0.05),表明其导致了HD11细胞活化;(3)BS048能够显著增强HD11细胞的吞噬功能以及其杀伤胞内SE的能力(P<0.01);(4)BS048能够显著上调HD11细胞的促炎因子IL-1β、IL-6,抑炎因子IL-10、TGF-β1,抗病毒因子IFN-β的基因表达(P<0.01),表明BS048具有很强的抗炎能力;(5)BS048能够显著上调HD11细胞的iNOS基因表达(P<0.01),增加iNOS活性和胞外NO含量(P<0.01),表明其能够显著增强HD11细胞的NO合成能力。由上可见,BS048不仅对鸡巨噬细胞有良好的安全性,而且能够活化鸡巨噬细胞以增强雪山鸡的免疫功能和抗SE感染能力。
  综合上述研究获得结论:(1)BS048对标准及临床分离的E.coli和沙门氏菌菌株均有较好的体外抑制作用;(2)BS048通过增强肠道消化功能和改善肠道健康,提高雪山鸡的生长性能;(3)BS048通过增强巨噬细胞功能、肠道粘膜屏障、机体免疫,改善雪山鸡的肠道健康和抗沙门氏菌感染能力。可见,BS048是一株适用于雪山鸡的优质益生菌。
[博士论文] 张涛
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:肌肉中肌内脂肪沉积与多种肉质性状相关,如嫩度、多汁性、风味和系水力。为了迎合消费者对高肉质不断增加的需求,提高肌内脂肪含量已经成为全世界育种工作者的目标之一。然而,在过去几十年中,由于人们对肉鸡生长速度和饲料利用率遗传选择的过度追求,导致目前鸡肉质量和风味降低。与此同时,对肉鸡生长速度的过度选择伴随着腹部脂肪的过度积累,因此,增加肌内脂肪同时减少腹部脂肪沉积已经成为目前肉鸡育种工作的目标之一。本研究一方面旨在利用RNA-seq技术描述鸡腹部和肌内脂肪前体细胞在成脂分化过程中的转录组表达情况,鉴定两种细胞中的lncRNAs,并分析lncRNAs的特点。一方面筛选鸡腹部和肌内脂肪前体细胞成脂分化过程中的差异表达基因,结合生物信息学方法,鉴定出可能影响鸡腹部和肌内脂肪沉积的重要因子和信号通路。最后,通过比较鸡腹部和肌内脂肪前体细胞成脂分化过程中基因的表达水平,研究鸡腹部和肌内脂肪前体细胞分化过程中转录组水平上的差异。主要研究结果如下:
  1.鸡腹部脂肪沉积关键基因的筛选
  由鸡腹部脂肪组织分离培养获得鸡原代腹部脂肪前体细胞,诱导其成脂分化,油红O染色显示,成功分离获得鸡腹部脂肪前体细胞。在鸡腹部脂肪前体细胞成脂分化过程中共鉴定出27,023条lncRNAs,分析显示,鸡腹部脂肪前体细胞中的lncRNAs具有序列和开放阅读框短及外显子少的特点;功能预测发现,鸡腹部脂肪前体细胞中的lncRNAs主要参与蛋白修饰、细胞蛋白修饰和信号调控等生物学过程。在鸡腹部脂肪前体细胞成脂分化过程中共筛选到4,232条差异表达lncRNAs和1,656条差异表达mRNAs;功能注释显示,差异表达基因主要富集在细胞周期、间叶细胞分化和细胞周期过程等生物学过程;通路分析结果显示,差异表达基因显著富集在细胞周期、DNA复制和PPAR等信号通路中。共表达分析共鉴定出了6个阶段特异性模块,并利用可视化在6个模块中筛选出了29个高连通性的基因,这些基因可能为调控鸡腹部脂肪前体细胞成脂分化的重要候选基因,包括XLOC_052948、gga-mir-30c、SCD和KLF15等基因。
  2.鸡肌内脂肪沉积关键基因的筛选
  由鸡胸部肌肉组织分离培养获得鸡原代肌内脂肪前体细胞,诱导其成脂分化,油红O染色显示,成功分离获得鸡肌内脂肪前体细胞。在鸡肌内脂肪前体细胞中共鉴定出26,172条lncRNAs,分析显示,鸡肌内脂肪前体细胞中的lncRNAs具有序列和开放阅读框短及外显子少的特点;功能预测发现,鸡肌内脂肪前体细胞中的lncRNAs主要参与基因表达、细胞学大分子合成、RNA代谢等生物学过程。在鸡肌内脂肪前体细胞成脂分化过程中共筛选到4,694条差异表达lncRNAs和2,169条差异表达mRNAs;功能注释显示,差异表达基因主要富集在信号调控、细胞通信调控及信号转导调控等生物学过程,通路分析结果显示,差异表达基因显著富集在焦点黏连、MAPK及PPAR等信号通路中。共表达分析共鉴定出了6个阶段特异性模块,可视化分析在6个阶段特异性模块中筛选出了28个高连通性的基因,这些基因可能为调控鸡肌内脂肪前体细胞成脂分化的重要候选基因,包括XLOC_013577、gga-mir-146b、BMP3和MYOD1等基因。
  3.鸡腹部和肌内脂肪沉积机制比较分析
  腹部和肌内脂肪前体细胞间lncRNAs结构比较分析显示,两种细胞lncRNAs具有相同的特点,即外显子数少、开放阅读框短和序列短。表达量比较显示,两种细胞lncRNAs的表达量均远远低于mRNAs。转录组比较分析显示,两种细胞间差异基因随着分化的延长而减少,在分化第0、2、4和6天,分别筛选到2,942(1,877个mRNAs和1,065个lncRNAs)、3,788(1,964个mRNAs和1,824个lncRNAs)、2,872(1,194个mRNAs和1,678个lncRNAs)和2,214(1,206个mRNAs和1,008个lncRNAs)个差异表达基因。异表达基因GO注释显示,在分化第0天,腹部和肌内脂肪前体细胞之间差异表达基因主要显著富集在生长因子应答、生长因子刺激细胞应答及细胞运动性调控等生物学过程;在分化第2天,差异表达基因主要显著富集在肌肉结构发育、肌肉器官发育和生长因子细胞学应答等生物学过程中;在分化第4天,差异基因主要显著富集在间充质细胞分化、细胞迁移调控和细胞粘附等生物学过程中;细胞学组分分析显;在分化第6天时,差异基因主要显著富集在酶联受体蛋白信号通路、运动和细胞定位等生物学过程中。Pathway分析显示,差异表达基因显著富集到了4条已知与脂肪前体细胞分化相关的信号通路,如PPAR和甘油酯代谢通路等。最后,我们比较了两种细胞成脂分化过程中的差异表达基因,结果显示,两种细胞间仅有253个共有的差异表达lncRNAs,而差异表达mRNAs则达到了911个。共有基因显著富集到了包括细胞周期、细胞周期过程、染色体分离等在内的超过200个生物学过程中;通路分析显示,共有差异基因显著富集到了包括细胞周期、细胞外基质-受体相互作用和焦点粘连等在内的数十条信号通路,其中包括多条已知参与脂肪生成调控的信号通路,如PPAR、p53、Foxo和TGF-beta信号通路。
  4.gga-mir-30c-2与XLOC_060155和SIX4基因靶关系验证
  高通量测序和基因共表达结果显示,XLOC_060155、gga-mir-30c和SIX4为调控鸡腹部脂肪前体细胞成脂分化的重要候选基因,XLOC_060155与gga-mir-30c及gga-mir-30c与SIX4基因的表达模式具有高度相关性。RT-qPCR结果显示,XLOC_060155的表达模式与gga-mir-30c呈显著负相关(r=-0.97,P<0.01),gga-mir-30c的表达模式与SIX4基因呈显著负相关(r=-0.684,P=0.014<0.05)。靶基因预测显示,SIX4和XLOC_060155基因存在gga-mir-30c-5p的结合位点。双荧光素酶活性检测结果显示,gga-mir-30c-5p与XLOC_060155结合后荧光素酶的表达活性显著降低,而将结合位点突变后,荧光素酶表达活性极显著回升;gga-mir-30c-5p与SIX43'UTR区结合后荧光素酶的表达活性显著下降,而将结合位点突变后,荧光素酶表达活性显著回升,表明XLOC_060155和SIX4基因确实是gga-mir-30c的靶基因。
[硕士论文] 郭晓莉
动物遗传育种与繁殖 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:甲状旁腺激素样激素(PTHLH)最初被认为是引起恶性肿瘤伴发的体液高钙血症的主要原因,能通过自分泌、旁分泌、细胞内分泌等方式起作用,生物学功能涉及钙转运、骨形成、平滑肌收缩、细胞增殖分化等多个方面。PTHLH与PTH共用一个G蛋白偶联受体PTH1R,该受体在进化过程中高度保守。实验室前期对鸡SY卵泡进行了转录组测序,发现鸡FSHR的mRNA表达水平高的SY卵泡中,PTHLH基因的mRNA水平也升高,推测其可能参与卵泡选择。本实验研究了PTHLH及其受体PTH1R在鸡卵巢卵泡中的表达调控,鉴定了PTHLH启动子区的多态性,并探索了多态性与鸡产蛋性能之间的关系。
  我们首先通过5′-及3′-RACE确定了PTHLH在鸡上主要表达NCBI上第一转录本。PTHLH与PTH1R mRNA表达一致,在等级前卵泡中表达量逐渐上升,在SY中达到最高,大黄卵泡(LY)中次之,在等级卵泡中表达量显著下降;PTHLH主要在等级前卵泡的膜细胞和等级卵泡的颗粒细胞中表达,而PTH1R在卵泡发育各时期均在膜细胞中表达,他们蛋白水平的表达在各级卵泡及不同时期卵泡的颗粒细胞、膜细胞中的表达无显著差异。PTHLH能刺激细胞增殖,并能促进未成熟卵泡中颗粒细胞的分化,通过刺激类固醇激素合成相关酶如StAR、CYP11A1的产生,促进类固醇激素的产生。用FSH处理原代鸡卵泡颗粒细胞、膜细胞,发现PTHLH的mRNA在等级前卵泡的膜细胞及等级卵泡的颗粒细胞中表达量升高。我们进一步检测了PTHLH的启动子活性,在确定的两个关键调控区各检测到一个SNP:rs72520524(C>T)和rs72518862(A>G),两个SNP完全连锁不平衡,杂合基因型AG和CT以及双倍型AC/GT对应鸡更早的开产日龄及更多的32周产蛋数。每个SNP均位于一个转录因子的结合位点,两个转录因子共同作用,受FSH调控,作用于PTHLH转录。EMSA实验确定C>T(rs72520524)包含于AP-1结合位点,但A>G(rs72518862)不包含于NF-κB结合位点中。
  综上所述,我们的研究首次提出了PTHLH在鸡卵泡中的表达调控,并鉴定了其启动子区的多态性。鸡PTHLH受FSH调控,通过调节细胞增殖、分化,及类固醇的生成在卵泡选择过程中起重要作用。PTHLH基因启动子区的两个多态性位点,通过影响转录因子AP-1等的结合,影响对FSH的应答和鸡的产蛋性能。
[硕士论文] 陈秋月
动物遗传育种与繁殖 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:鸡的卵巢卵泡生长发育过程中,下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPGA)起到了非常重要的作用。下丘脑-垂体-性腺轴是一个完整而协调的神经内分泌系统,下丘脑通过分泌GnRH调节垂体LH和FSH的释放,从而控制性腺发育和性激素的分泌。本研究对GnRH1在鸡下丘脑和卵巢卵泡发育过程中的表达及其调控作用进行了初步分析。结果如下:
  1.qRT-PCR分析GnRH1基因在30、60、90、110和140日龄产蛋(140a)和未产蛋(140b)济宁百日鸡下丘脑和卵巢中的表达。结果显示:GnRH1 mRNA在下丘脑和卵巢中的表达从30日龄至140日龄未开产鸡均呈现出低高低高的趋势,60日龄与140日龄的表达量显著高于其他各个时期(P<0.05),但两者之间差异不显著(P>0.05);而在卵巢中,140日龄时GnRH1 mRNA相对表达量同下丘脑一样显著上调,但产蛋时却显著下调(P<0.05),表现出与下丘脑不同的变化趋势。在开产后鸡的不同等级卵泡中,GnRH1 mRNA表达从SW(the small white follicle)到F5(the fifth large follicle)最后到F1(the first large follicle)和POF1(the first post-ovulatory follicle)中的表达差异未达到显著(P>0.05)。
  2.免疫组化检测结果显示,GnRH1免疫阳性信号在未开产鸡(45d)和开产鸡(159d)卵巢膜细胞和颗粒细胞均被检测到,并且在未性成熟鸡的卵巢中,其主要在卵泡颗粒细胞层表达较高,而性成熟后则在膜细胞层表达较高。进一步分离性成熟卵巢卵泡的颗粒细胞和膜细胞,qRT-PCR结果表明,GnRH1 mRNA在卵泡膜细胞中的表达显著高于颗粒细胞(P<0.05),与免疫组化结果一致。
  3.构建GnRH1基因的过表达载体,转染鸡原代膜细胞和颗粒细胞后,检测LHR,FSHR,PGR,ERα基因的表达量。结果显示,过表达GnRH1后,在颗粒细胞中,四个受体基因表达量均未出现显著变化;在膜细胞中,FSHR,PGR,ERαmRNA表达量未发生显著变化,而LHR mRNA表达量出现了显著下调(P<0.01)。随后用LH和FSH激素处理膜细胞,检测GnRH1 mRNA的表达变化。结果显示,FSH激素对GnRH1的表达无显著影响,LH在浓度50 ng/mL时,GnRH1表达量显著上调(P<0.05);继续加大LH的浓度发现,当LH浓度大于200 ng/mL时,GnRH1 mRNA表达量开始下调,而LHR mRNA表达量与LH浓度呈正相关。随后用50 ng/mL LH激素与GnRH1过表达共处理后,LHR表达量出现显著下调(P<0.01)。
  4.在鸡等级卵泡膜细胞中过表达GnRH1基因并进行转录组测序,以未过表达GnRH1基因的膜细胞为对照,在过表达GnRH1的等级卵泡膜细胞中共筛选出了3997个差异表达基因,其中上调的差异表达基因1998个,下调的差异表达基因1999个,并对部分差异表达基因进行了qRT-PCR验证,包括表达量下调的基因CYP11A1,MMP11,MMP13, StAR,上调的基因FOXP1,FOXP2,VEGFA,USF1。对差异基因进行功能注释发现,它们被富集到FOXO、MAPK、TGF-beta、VEGF、GnRH、PPAR、Prosgesterone-mediated oocyte maturation、Toll-like receptor以及Wnt等信号通路。
  5.分析了GnRH1基因5′调控区长度3863bp片段的启动活性,双荧光素酶活性分析结果表明,在GnRH1基因启动子区3863bp长度内各个区域均未发现双荧光素活性,具体原因需进一步试验分析。
  总之,我们目前的研究结果表明:GnRH1作为卵巢内调节因子,接近开产时GnRH1 mRNA的高表达有助于鸡性成熟的启动。在鸡卵巢膜细胞中,GnRH1可介导LH与LHR受体的结合,从而影响卵巢卵泡的发育和排卵。GnRH1可与多种因子协同调控鸡卵巢功能,在鸡性成熟的启动和卵巢卵泡发育中起着重要作用,具体调控机制有待深入研究。
[硕士论文] 袁野
养殖 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:脂肪代谢与家禽免疫功能关系密切,本研究通过饲喂常能高脂日粮(1-21 d,ME=12.34MJ/kg;22-42 d,ME=12.76 MJ/kg)和混合油脂日粮,分别探讨脂肪摄入量和脂肪酸组成(单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸和中短链脂肪酸)对肉鸡生长、代谢和免疫的影响,进一步明确油脂类型与水平对家禽健康生产的调控机制,以期为饲粮油脂的高效利用提供新思路、新方法。
  试验一研究常能高脂日粮对肉鸡生长、代谢和免疫的影响。选用1日龄AA肉鸡100只,随机分为2组,每组5个重复,每个重复10只。对照组(NFD)饲喂正常日粮;试验组(HFD)饲喂高脂日粮。分别在14、21、38d进行采集血液、胸腺、脾脏、法氏囊、十二指肠、空肠、回肠、盲肠样本。试验结果表明,38d饲喂常能高脂日粮组的脾脏重量和脾脏指数和脾脏炎性信号通路相关基因的表达上显著高于饲喂正常日粮组(P<0.05),饲喂正常日粮的肉鸡血液甘油三酯含量显著高于常能高脂日粮组,对血糖的含量没有影响(P>0.05),饲喂高脂日粮明显降低了十二指肠的绒腺比(P<0.05)。结果提示,肉鸡饲喂常能高脂日粮未引起血糖和血脂的明显升高,但可能激活炎症信号通路,抑制小肠黏膜发育。
  试验二研究混合油脂对肉鸡生长、代谢和免疫的影响。选用1日龄雄性AA肉鸡540只,随机分为9组,每组设6个重复,每个重复10只。试验分前期(1-21 d)和后期(22-42 d)两个饲养阶段,饲料中分别添加2%和3%的油脂。试验设豆油和鸭油2个对照组;7个试验组分别以椰子油、大豆油和鸭油不同配比添加混合油脂。试验第21d和42d,每个重复随机取2只试验鸡,屠宰,采血,屠宰。称取组织器官重量,采集胸腺、肝脏、脾脏、法氏囊、十二指肠、空肠、回肠、盲肠食糜、腿肌、胸肌样本。测定血液生化,肠道形态,盲肠微生物,肝脏脂肪代谢相关指标。结果表明,前期豆油组与其他组相比在体增重上有明显的差异(P<0.05),采食量和料肉比没有差异(P>0.05),鸡体重和十二指肠重指数有明显差异(P<0.05),其他器官指数无明显差异(P>0.05)。前期混合油脂不影响前期肝脏脂肪代谢和肠道炎症反应(P>0.05)。后期体增重、采食量和料肉比没有差异(P>0.05),椰子油比重大的组腹脂指数明显上升(P<0.05),胸腺指数有下降的趋势,血液TG、VLDL、LPL、NEFA、肝脏甘油三酯和脂肪代谢相关基因明显上升(P<0.05),肠道绒腺比显著高于椰子油比重低的组和单一油脂组,盲肠益生菌数量上升,降低病原菌数量。
  试验二结果表明在肉鸡生长前期,单一油脂(豆油或鸭油)提高生产性能,促进组织发育;在肉鸡生长后期,椰子油比重大的混合油脂促进肠道黏膜发育,改善盲肠微生物组成,但增加腹脂沉积,降低免疫器官指数。
  综上所述,脂肪的摄入量过多不利于肉鸡的生长发育,混合油脂在一定程度上更有利于肉鸡的生长发育。
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