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[博士论文] 赵龙
生物化学与分子生物学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2015(学位年度)
摘要:肝细胞核因子1α(HNF1α)作为肝脏中最重要的转录因子之一,以复合体形式参与调控多种肝脏特异基因的表达,并涉及蛋白质合成、物质代谢、损伤修复等多个生物学过程。同时HNF1α也是维持胰腺功能的重要分子,调控胰岛素、葡萄糖转运蛋白等分子的表达。在肠和肾中,HNF1α也发挥着调控发育和物质吸收的重要作用。在糖代谢中,HNF1α更是扮演着“中心分子”的作用。HNF1α的突变会引发Ⅲ型青少年发病的成人糖尿病,也就是临床上所说的MODY3,这是一种由单基因突变所导致的负显性突变疾病,临床上表现为25岁前发病,胰岛素分泌不足,血糖严重升高等症状,由于患者HNF1α基因突变的晚期糖尿病并发症的频率高,早期诊断与适当的治疗可以减少或延缓糖尿病并发症的发生。因此研究HNF1α调控机制和功能有着重要的意义。
  在研究中我们通过IP-MS发现,HNF1α是一个磷酸化蛋白质。并且我们还发现了一个新的磷酸化位点,Ser249位。接下来我们通过体外磷酸化实验发现,无论内源或者外源ATM蛋白激酶都可以磷酸化HNF1α的Ser249位点。当辐射处理引发DNA损伤活化ATM激酶活性时,HNF1α的磷酸化水平显著提高。我们发现使用ATM特异抑制剂KU55933处理细胞后,HNF1α磷酸化水平下降。IP-MS检测结果也显示抑制剂处理组249位磷酸化消失。为了进一步研究Ser249位点突变对HNF1α功能和调控机制的影响,我们构建了HNF1α-S249A突变体,通过荧光素酶报告基因实验和real-time PCR实验结果发现,与野生型相比,HNF1α-S249A突变体转录活性和下游靶基因表达均显著下调。实验中我们还发现,HNF1αSer249位点的磷酸化与之前已报道的Ser247位点的磷酸化相互独立互不影响,竞争抑制实验显示,HNF1α-S249A突变体不具有负显性抑制功能。我们通过EMSA和CHIP实验分别从体内和体外两条途径证明,与野生型HNF1α相比,HNF1α-S249A突变体的DNA结合能力显著下调,间接荧光免疫实验证明,HNF1αSer249位点突变不影响HNF1α的亚细胞定位。同时我们也在体内实验中发现,HNF1α-S249A突变体会引起糖代谢功能异常,提示了ATM调控糖代谢过程中新的机制发现。我们不仅从分子水平探索了HNF1α磷酸化修饰的分子机制和生物学意义,而且通过HNF1α-WT和HNF1α-S249A转基因小鼠实验来研究HNF1α对于生理功能的意义。我们以转基因野生型HNF1α作为对照研究发现,HNF1α-S249A转基因小鼠并未表现出明显的糖尿病或者其他糖代谢异常表型,体重变化、葡萄糖耐受、胰岛素耐受都未出现异常,而丙酮酸耐受下降,说明,HNF1αSer249位点突变降低了HNF1α-S249A转基因小鼠糖异生能力,此外,我们还对转基因小鼠血清肿瘤标志物进行检测,转基因HNF1α-WT小鼠在胰腺肿瘤标志物CA242、肝癌肿瘤标志物AFP、乳腺癌肿瘤标志物CA153显著下调,这些数据也许提示了HNF1α在肿瘤发生中的一些作用。
  除了磷酸化修饰之外,我们还通过IP-MS鉴定到了HNF1α的乙酰化位点Lys117位。且临床上有报道在MODY3患者中检测到117位突变,我们推测该位点的乙酰化修饰对HNF1α的功能十分重要。首先我们通过Lys乙酰化抗体免疫印迹发现,HNF1α是一个乙酰化蛋白,共转染乙酰化酶p300和使用去乙酰酶抑制剂TSA/Nam可以促进HNF1α乙酰化,而饥饿和乙酰化酶p300抑制剂处理会降低HNF1α乙酰化水平。同时,为了进一步研究HNF1αLys117位点乙酰化对HNF1α的功能和调控机制影响,我们构建了Lys117位的点突变,通过荧光素酶报告基因实验和real-time PCR实验显示,Lys117位点突变下调了HNF1α的转录活性。竞争抑制实验显示,HNF1α-Lys117位点突变体不具有负显性抑制功能。接下来,我们通过EMSA和CHIP实验分别从体内和体外两条途径证明,与野生型HNF1α相比,HNF1αLys117位突变体的DNA结合能力显著下调,间接荧光免疫实验证明,HNF1αLys117位点突变不影响HNF1α的亚细胞定位。同时我们也在体内实验中发现,HNF1αLys117位点突变会引起糖代谢功能异常。我们通过免疫共沉淀相互作用和荧光共振(FRET)实验以及生物信息学分子模建发现,HNF1αLys117位点突变或者p300抑制剂处理会减弱其二聚体稳定性,从而降低了HNF1α的DNA结合能力,下调了HNF1α的转录活性和下游靶基因表达。
  纵观整个研究过程,我们的研究第一次发现了HNF1α的一个新的磷酸化位点和调控它的上游激酶ATM,为ATM激酶参与调控糖代谢的靶分子提供了新的思路,也为ATM作为HNF1α的共激活子在临床上作为治疗糖代谢异常的新的途径提供了一些可能。同时我们首先发现的HNF1α的一个新的赖氨酸乙酰化位点,证明了这个位点受到乙酰化酶p300的调控,并且发现这个位点的乙酰化对于维持HNF1α二聚体结构稳定性有着重要作用。希望通过我们的以上研究可以找到HNF1α翻译后修饰调控转录的新机制,为HNF1α突变引发疾病的筛查、早期诊断以及使用抑制剂作为治疗手段提供新的思路。
[硕士论文] 廖怡芳
生物医学工程 华中科技大学 2013(学位年度)
摘要:MicroRNAs(miRNAs)是一类长约22nt的非编码小RNA分子,通过介导其靶基因的转录后调控,在人类的多种生理与病理过程中发挥着举足轻重的作用。随着二代测序技术的发展,针对人类不同组织和疾病样本的小RNA测序研究广泛开展,得到了大量有意义的发现。鉴于这些研究往往只是针对单一组织或疾病的样本,为此本项目希望整合它们所累积的海量原始测序数据,对这些组织和疾病进行系统的比较研究。
  首先,下载原始的小RNA测序数据,进行系统的处理和整合。从NCBI公共数据资源库中大规模收集人类小RNA测序数据,经过严格的质量筛选,最终确定了410个涵盖多种疾病与组织的数据集。使用自主建立的miRNA标准分析流程,测试并选用最优参数,将原始的测序数据转化为miRNA表达量数据,最终得到2042个miRNA在410个数据集中不同组织或疾病样本的表达量,并进一步利用这些结果数据,构建人类miRNA表达数据库HMED(http://115.156.249.50/smallRNA/),为miRNA研究者提供了宝贵的数据资源。
  然后,利用处理得到的表达量数据,做进一步的系统分析,如疾病与组织特异性表达miRNA、差异表达miRNA,miRNA的isomiR与臂转换(armswitching)现象的分析。通过这些分析,我们得到一些有意义的发现,如发现hsa-miR-21-5p,hsa-let-7f-5p,hsa-let-7a-5p,hsa-miR-26a-5p,hsa-miR-103a-3p和hsa-miR-191-5p这6个miRNA在所有的样本中都高表达;某些样本中,某些miRNA的isomiR表达量要高于其传统的参考序列,提示该miRNA可能是通过其isomiR来发挥功能;有的miRNA,其在某些组织中5p成熟体表达量高,而在另一些组织中3p成熟体表达量高,提示该miRNA有臂转换现象。
  本课题通过收集整合大量miRNA表达数据,对miRNA的表达进行全面研究,并挖掘miRNA相关信息,为miRNA的进一步研究提供了重要线索和资源。
[硕士论文] 杨斌
神经生物学 复旦大学 2013(学位年度)
摘要:Unc5家族蛋白作为一个轴突导向跨膜受体,最初从线虫中发现。在脊柱动物中,Unc5受体包括四大类,Unc5a、Unc5b、Unc5c及Unc5d。Unc5受体的特异性配体为分泌性轴突导向分子Netrin,并且通过Netrin的调节介导神经元轴突生长锥排斥作用。多年研究发现,Unc5家族蛋白也在血管生成和致癌作用中起到作用。
  本文旨在探索在斑马鱼体内Unc5家族成员Unc5a,Unc5c,Unc5da和Unc5db的具体表达情况及在前脑特异性表达的Unc5家族成员对前脑发育的影响。本文对Unc5基因家族成员(Unc5a,Unc5c,Unc5da和Unc5db)进行反转录PCR(RT-PCR)及原位杂交研究。反转录PCR结果显示所有转录本都在母源时期表达。Unc5c在整个事件轴中持续性表达,从shield时期直至48小时,而Unc5a,Unc5da和Unc5db在24小时及之后的时期具有明显表达。在原位杂交检验中,Unc5a,Unc5da和Unc5db在24小时到48小时胚胎端脑区域明显表达,并在部分丘脑和后脑中也有表达。在Unc5a-Unc5da和Unc5a-Unc5db的荧光原位杂交结果中显示,端脑区域表达有明显重叠。Unc5c在顶板,后脑和嘴部区域具有表达。
  Anterior commissure(AC),即前连合,是一条跨越中线连接两侧大脑半球的神经纤维,它位于斑马鱼脑前端,在端脑的视柄之前。在特异性敲减位于端脑区域表达的Unc5a基因时,AC发育及路径选择发生明显变化。一部分AC仍然沿正常走向形成神经纤维束,另一部分轴突则在接近前侧的位置与原轴突束发生分支,并选择更深层和更靠背侧的路径进行延伸。此时免疫组织化学的结果也显示轴突束发生分支的同时,其轴突束周围神经胶质细胞的分布同时发生改变,并围绕分支的轴突束也呈现分支情况。同时敲减Unc5a基因和Unc5da基因可以明显提高突变率,并出现神经元迁移异常并滞留中线位置的表型。此结果揭示Unc5基因家族在斑马鱼前脑发育和轴突生长及导向中具有重要作用。
[硕士论文] 徐杨
神经生物学 中南大学 2012(学位年度)
摘要:目的:探讨成年雄性大鼠脑内细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的活化在其同性别社会交往中的作用。
   方法:本研究选择8周龄健康雄性SD大鼠为研究对象。采用三箱室社会交往行为检测箱测试正常雄鼠的同性别社会交往行为,免疫组织化学检测雄鼠脑内pERK1/2的表达情况。正常雄鼠两侧鼻孔内滴入10%硫酸锌以破坏嗅上皮,观察嗅觉剥夺对雄鼠的同性别社会交往行为及脑内pERK1/2表达的影响。为了说明ERK1/2的活化在雄鼠同性别社会交往中的作用,正常雄鼠腹腔注射MEK特异性抑制剂SL327(30 mg/kg)30 min后,观察MEK抑制剂SL327对雄鼠同性别社会交往行为和脑内pERK1/2表达的影响。
   结果:正常雄鼠同性别社会交往行为及脑内pERK1/2表达的情况:当雄鼠在社会交往箱中面临一侧有交往对象鼠,另一侧无交往对象鼠时,雄鼠在社会交往侧停留时间和触网次数都明显多于其在无生命体侧停留的时间和接触金属网的次数,差异具有统计学意义(P<0.001);当社会交往箱两侧都没有交往对象鼠时,雄鼠在交往箱左右两侧停留时间和接触金属网次数差异无显著性(P>0.05)。免疫组织化学检测结果显示,正常雄鼠与同性别大鼠进行社会交往后,磷酸化ERK1/2(pERK1/2)在与主嗅球系统相关的脑区如主嗅球、梨状皮质、内嗅皮质、室旁核、杏仁中央核与杏仁内侧核以及眶额皮质、前扣带皮质内的表达都明显增加(P<0.01)。
   嗅觉剥夺对雄鼠社会交往行为及脑内pERK1/2表达的影响:嗅觉剥夺的雄鼠同性别社会交往行为显著减少,表现为在社会交往侧和无生命体侧停留时间和触网次数差异无显著性(P>0.05);同时与溶媒对照组相比,pERK1/2在主嗅球、内嗅皮质、梨状皮质、室旁核、眶额皮质与前扣带皮质内的表达明显下降(P<0.01),副嗅球内的表达增加(P<0.01),杏仁中央核和杏仁外侧核的表达差异无显著性(P>0.05)。
   MEK抑制剂SL327对雄鼠同性别社会交往行为及脑内pERK1/2表达的影响:雄鼠腹腔注射MEK抑制剂SL327后,各个脑区pERK1/2的表达都明显下降(P<0.01),但雄鼠在社会交往侧停留时间和触网次数都明显多于其在无生命体侧停留的时间和接触金属网的次数(P<0.01);并且在社会交往侧的停留时间明显长于溶媒注射组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
   结论:雄性大鼠的同性别社会交往行为诱导其脑内与主嗅觉系统相关的脑区如主嗅球、梨状皮质、内嗅皮质、室旁核、杏仁中央核、杏仁内侧核以及眶额皮质、前扣带皮质内ERK1/2的活化。雄性大鼠的主嗅觉系统与其同性别社会交往行为有关。雄性大鼠脑内ERK1/2的活化参与了对其同性别社会交往行为的调控。
[硕士论文] 张婷婷
生物化学与分子生物学 扬州大学 2012(学位年度)
摘要:青藏高原高寒生态系统中的多种植物均含有较高水平的酚类次生化合物,且酚类化合物水平因季节而不同。包括单宁在内的许多酚类次生化合物对动物的行为生理有一定的影响。动物体内的异源代谢酶能减缓植物多酚对动物的有害作用。细胞色素P450酶参与动物摄入体内的次生化合物的分解转化,而摄入的次生化合物又可能会影响这些酶基因的表达。高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)是分布于高寒草甸生态系统中的优势植食性小哺乳动物,终生取食含酚类水平较高的高原植物。本实验(一)不同季节从野外捕获高原鼠兔作为研究对象;(二)通过人工灌胃的方法,对高原鼠兔灌胃不同时间(1、4、8d)、不同剂量(0、10、20、40mg/kg.bw)的单宁酸,分别用RT-PCR的方法克隆高原鼠兔CYP1A2及CYP2E1基因的cDNA片段、荧光实时定量PCR方法测定其肝脏细胞色素酶CYP1A2及CYP2E1mRNA的表达水平及Westernblot方法检测肝脏中这两种酶含量的变化,以研究高原鼠兔肝脏CYP1A2及CYP2E1表达的季节性变化及单宁对两种酶表达的影响,探讨青藏高原植物和植食性动物间的协同进化。研究结果如下:
   1、通过RT-PCR的方法克隆获得的高原鼠兔CYP1A2和CYP2E1基因的部分cDNA序列,分别长921bp,编码307个氨基酸残基及长936bp,编码312个氨基酸残基。将这两个序列与已经公布的大鼠、小鼠、人的氨基酸序列进行相似性分析比对,结果显示:高原鼠兔肝脏CYP1A2与大鼠、小鼠、人的相似性分别为73.5%,72.5%及73.3%,CYP2E1与大鼠、小鼠、人的相似性分别为80.1%,80.8%及76%。
   2、野外生存环境下,不同月份高原鼠兔肝脏微粒体的CYP1A2和CYP2E1表达有明显的不同。
   5月份至8月份,高原鼠兔肝脏CYP1A2及CYP2E1mRNA表达量呈现先上升后下降的趋势,两者均在6月份达到最高。Westernblot实验结果也表明,肝脏CYP1A2及CYP2E1酶含量同样呈现先上升后下降的趋势,两者均在6月份达到最高。
   3、单宁酸对高原鼠兔肝脏微粒体CYP1A2及CYP2E1的表达的影响因剂量及处理时间而不同。
   中、低剂量的单宁酸短时间处理促进高原鼠兔CYP1A2及CYP2E1mRNA的表达,中、低剂量的单宁酸长时间处理及高剂量的单宁酸处理抑制高原鼠兔肝脏CYP1A2及CYP2E1mRNA的表达。即单宁酸浓度越高,处理时间越长,CYP1A2及CYP2E1mRNA的表达量越低。
   但Westernblot实验结果显示,所有的单宁酸处理组,高原鼠兔肝脏CYP1A2及CYP2E1酶的含量均显著降低。
   以上结果表明,单宁影响高原鼠兔肝脏细胞色素CYP1A2及CYP2E1基因的表达。在野外生存环境下,单宁对两种基因在转录和翻译水平的表达是一致的,逐月增加的单宁在低水平时促进两种基因的表达,高水平时抑制两种基因的表达。但是在人工灌胃条件下,单宁酸在转录和翻译水平对两种基因表达的影响有所不同。
[硕士论文] 杨子剑
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2012(学位年度)
摘要:人Eps8(Epidermalgrowthfactorreceptorpathwaysubstrate8)蛋白是一类重要的信号分子。最初被鉴定为表皮生长因子受体EGFR的重要激酶活性底物之一,后来发现Eps8也是受体酪氨酸激酶的活性底物。人的Eps8基因定位于第12条染色体上,编码的蛋白有两个亚型:P97(97KD)和P68(68KD)。研究表明,Eps8可以调节表皮生长因子EGF依赖的小G蛋白Rac的活性进而调控细胞骨架肌动蛋白的构建和重排。Eps8还能调节Rab5的活性,参与受体介导的细胞内吞作用并影响Ras和Rac之间的信号转导。此外Eps8还参与多种肿瘤细胞的增殖和侵袭,增强促有丝分裂信号的释放从而导致肿瘤细胞的恶变。
   本文中我们用酵母双杂交的方法,以Eps8作为诱饵蛋白对人脑cDNA文库进行筛选,鉴定出了一个新的与Eps8相互作用的蛋白-ITSN2。我们克隆并表达了ITSN2基因,免疫共沉淀实验的结果证实了Eps8和ITSN2蛋白在体内能够结合。同时发现无论是内源的还是外源的Eps8和ITSN2蛋白都在细胞质中有明显的共定位。GSTpull-down实验证实了Eps8和ITSN2在体外能够相互作用。此外,我们对Eps8蛋白和酵母双杂交筛选出的ITSN2片段进行了分段表达,进一步证实了Eps8和ITSN2蛋白的相互作用区域,即Eps8的260-306位氨基酸区域和ITSN2的CC结构域。这些结果清楚地表明Eps8和ITSN2蛋白在体外和体外都能相互作用。
   本文还初步研究了Eps8和ITSN2蛋白相互作用的生理功能。蛋白质的降解实验和免疫荧光实验表明过表达ITSN2诱导Eps8蛋白质的降解。Eps8蛋白质的降解通过加入溶酶体抑制剂氯化铵后能够得到显著缓解,说明ITSN2可能通过溶酶体途径促进Eps8蛋白的降解。这些结果表明ITSN2能与Eps8相互作用并促进其降解。
[硕士论文] 王兴宝
无机化学 长春理工大学 2012(学位年度)
摘要:主要存在于肝细胞内质网上的细胞色素P450酶是高等生物体代谢转化外来化合物的关键酶系。一些有毒物质经过P450酶代谢转化,生成产物的水溶性提高,有助其排出体外,从而保护机体组织免受外来物质损害。然而,经过P450酶的代谢,有些产物反而具有更强的毒性。因此,揭示P450酶代谢转化外来化合物的机制非常重要。由于体内和体外实验测试的方法,难以捕捉P450酶促代谢的过渡态以及中间产物,成本高,耗时长,实验测试方法难以满足化学品生态风险性评价的需要。本论文将利用计算模拟的方法,评价和预测P450酶促转化外来化合物的机理和途径。本论文的主要研究内容有:
  1、多溴联苯醚(PBDEs)是一种典型的持久性环境污染物,先前的研究显示,PBDEs可以被P450酶代谢为相应的羟基化产物,然而关于这一转化过程的机理和路径仍然没有明确的解释。本论文通过理论计算的研究结果显示CpdⅠ氧化BDE-47的反应路径包括以下几种:(1)羟基化;(2)醚键断裂;(3)脱溴/羟基化。而且通过理论计算得到的产物跟先前实验检测到的产物完全相符,说明本文采用计算方法研究P450代谢PBDEs的结果具有很高的可靠性,因此,理论计算可以作为一种探究P450代谢PBDEs机理的有力工具。
  2、甲氧基多溴联苯醚(MeO-PBDEs)是一种与PBDEs结构相似的化合物,它同样可以被P450酶代谢成为羟基化产物,然而反应机理与P450代谢PBDEs有着本质的不同。本论文选择了一种非常具有代表性的MeO-PBDEs同系物6.MeO-BDE-47作为研究对象来揭示P450酶代谢MeO-PBDEs的反应机理及其路径。研究显示,6-MeO-BDE-47与CpdⅠ有Face-on和Side-on.两种可能的反应模式,Face-on模式得到的产物主要是羟基化产物,而对于Side-on模式来说,6-MeO-BDE-47会对P450酶造成自杀性抑制。
  3、二溴氯丙烷(1,2-二溴-3-氯丙烷,DBCP)是一种典型的卤化烷烃类农药,研究表明DBCP具有生殖毒性和致癌性。直到现在,人们对DBCP的代谢机理及其动力学同位素效应还没有深入的了解。通过我们的计算研究显示,DBCP的羟基化反应和烷烃羟基化反应机理存在明显的差异,尤其是在反弹过程中的能垒明显的高于烷烃的羟基化过程。我们还发现DBCP的羟基化反应具有明显的动力学同位素效应,而且温度和隧道效应对KIE值具有明显的影响。
[硕士论文] 杨易
生物化学与分子生物学 华中科技大学 2011(学位年度)
摘要:Multiple cell signaling pathways and biological processes are involved in cerebralischemia/reperfusion (I/R)injury,among which,autophagy is a most confusmg one.Studiessuggest that autophagy is activated during ischemia and reperfusion (I/R),however there'sno data to dynamically mimic autophagy level during the whole process of I/R,and it's stillnot known whether autophagy functions as a guardian or plays a detrimental role in I/RinJury. Here we employed simulated I/R of N2a cells (mouse neuroblastoma cells)as an in vitromodel of I/R injury to the neurons.LC-311 level was checked by immunoblot analysis atdifferent time points of ischemia process,and different intervals of reperfusion.Resultsshowed that autophagy was gradually activated as ischemia went on,and greatly elevatedduring the process of reperfusion after 90minutes' ischemia insult.I/R manipulation wasalso applied to N2a cells transfected with EGFP-LC3,punctate EGFP-LC3 was monitored,percentage of cells displaying obvious EGFP-LC3 puncta coincided with the forenamedimmunoblot results.Also,we found that autophagy was induced in hippocampus andcortex of rats underwent MCAO for 90 minutes and reperfusion for a week. Beclin-1 in cytosol,p-mTOR,p-P70 S6K were also checked in ischemia/reperfusiongroups by immunoblot analysis,results indicated that Beclin-1 in cytosol shared the samechange pattern with LC-311,while p-P70 S6K and p-mTOR showed delayed decrease afterreperfusion.Administration of 3MA,inhibitor of class Ⅲ PI3K,definitely abolishedautophagy during reperfusion,while employment of rapamycin,inhibitor of mTORC1,surprisingly weakened autophagy activation during reperfusion. Analyses of mitochondria function by relative cell viability were performed in I/R modelgroups and 3MA-treated groups,results came that autophagy inhibition by 3MA definitelyhold back the decline of mitochondria function during the process of reperfusion.
[硕士论文] 杨维
细胞生物学 西北大学 2009(学位年度)
摘要:摇蚊幼虫能在脱水状态下存活,即体内水分完全丧失,新陈代谢活动几乎全部停止,但摇蚊幼虫仍保持存活,并在适宜条件下恢复生命活动,这就是所谓的隐生现象。此外,在缓步类动物门水熊中也观察到隐生现象。进一步研究发现这些生物体在干燥状态下可以合成、积累大量海藻糖,耐受干燥。对上述现象的研究有可能实现动物组织和器官的干燥保存,避免了目前深低温保存的种种缺陷,例如冰晶损伤和运输不便等。 本研究首先探索了海藻糖导入皮肤组织的最佳条件,为皮肤组织干燥保存提供了依据。然后,对负载海藻糖的皮肤组织进行干燥处理,并在室温下保存一定时间后进行活性检测(包括荧光染色和MTT分析)。最后,通过自体移植评价干燥保存皮肤修复皮肤缺损的效果。 1.优化海藻糖导入皮肤组织的条件。海藻糖是一种非渗透性的非还原型双糖,正常情况下不能主动进入细胞。以不同海藻糖浓度、孵育温度和孵育时间为变量,探索海藻糖载入皮肤的最佳浓度,温度和时间。用80%甲醇提取后用葸酮法测定海藻糖进入皮肤组织的浓度。结果显示,皮肤组织海藻糖最佳导入条件为:加载液海藻糖浓度800mM、孵育温度37℃、孵育时间7h。 2.皮肤组织干燥保存研究。负载海藻糖的皮肤组织分两组进行干燥,一组冻干,另一组吹干。加载海藻糖皮肤干燥后用荧光标记直接显示皮肤的活性状况,MTT分析定量测定皮肤活性,此外,还进行了HE染色和透射电镜观察,对比干燥皮肤和新鲜皮肤的组织结构以及细胞内外结构差异。结果表明:荧光染色的干燥皮肤,在70-80%区域可见绿色荧光(活性区域),MTT分析表明干燥皮肤仍保持有50%左右的活性。HE染色和透射电镜结果也表明两者在内部结构上无显著差异。 3.自体移植试验。通过最有效的评价手段—自体移植,观察干燥再复水皮肤在自体动物身上存活情况。自体移植结果显示冻干皮肤能存活长达15d,晾干皮肤最长存活13d。
[博士论文] 蔡建光
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2009(学位年度)
摘要:本论文是从整体动物水平和细胞分子水平研究脂质过氧化过程中的一个重要中间产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)对SD大鼠学习记忆能力的影响及对培养的海马神经元胞内钙离子稳态的破坏作用。 在整体动物水平上,用Morrise水迷宫试验研究了经侧脑室注射不同浓度MDA的SD大鼠在定位航行试验(place nawgation test,PNT)和空间探索试验(spatial probe test,SPT)中的行为变化。与生理盐水处理组和/或空白对照组相比,发现大鼠在定位航行试验中寻找水下平台的逃避潜伏期(escape latent period,ELP)极显著地延长(P<0.01),在空间探索试验中120s时间内穿越水下平台次数显著减少(P<0.05),说明不同浓度的MDA导致了大鼠在空间学习和记忆能力的降低。运用透射电子显微镜(transmission electronicmicroscope,TEM)比较观察了生理盐水组/空白对照组和不同浓度MDA处理组大鼠海马CA1区神经元亚细胞结构和超微结构的变化,发现MDA处理后的大鼠CA1区海马神经元细胞内线粒体结构变形,线粒体内的折叠结构和附着在上面的嵴减少或者消失,突触连接结构如突触后致密物质(postsynaptic density material,PSD)的厚度减少,突触界面(curvature of synaptic interface,CSI)的曲度增加,突触后活性区(activezone,AZ)的长度缩短,但突触间裂隙的宽度(synapticcleft,SC)没有显著变化。说明MDA处理后的大鼠海马神经元结构受到了损伤,从而引起了其在学习能力和空间探索寻找水下平台的记忆能力的下降。 在细胞分子水平上,MDA作用于原代培养的SD大鼠海马神经元,研究了其在光学显微镜下细胞形态学上的变化及对神经元细胞内游离Ca2+浓度变化的影响。结果表明:在光学显微镜下,可以清楚地显示随着体系中MDA浓度的升高,对培养的海马神经元的毒害作用增强以至于神经元表现出死亡和/或凋亡的形态特征。在MDA的浓度为1.0~1000μmol/L,随着浓度的升高和时间的延长,表现出对质膜Ca2+—ATPase(plasma membrane Ca2+_ATPase,PMCA)活性的抑制作用增强;在MDA浓度为1.0~1000μmol/L和30min的作用时间内,胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)也显著升高,并且出了一个早期的逐渐的升高(0~10min)和一个晚期的快速升高过程(15~30min)。用尼莫地平(nimodipine)阻断由L—型钙通道(L—VOCC)开放引起的外钙内流,可以抑制晚期胞内[Ca2+]i升高,对早期胞内[Ca2+]i升高没有影响;过量的Ca2+螯合剂EGTA,同样可以抑制晚期胞内[Ca2+]i升高,而早期只在Smin内有轻微地升高胞内[ca2+]i,推测晚期胞内[Ca2+]i升高是由于质膜上L—VOCC开放,胞外Ca2+通过L—VOCC内流引起的;在体系中加入磷脂酶C(PL—C)活性抑制剂U73122,能抑制早期胞内[Ca2+]i的升高,推测早期胞内[Ca2+]i升高是由于MDA的作用激活了PL—C信号途径,使内质网(endoplasmic reticulum,ER)钙通道开放,ER钙库中的钙外流致胞内[ca2+]i升高;在体系中加入蛋白质激酶A(PKA)抑制剂H—89,该抑制剂对胞内[Ca2+]i变化没有影响,推测cAMP/PKA信号途径可能没有参与MDA导致的胞内[Ca2+]i变化。 1995年,印大中教授和Brunk教授共同提出羰基毒化衰老学说。该学说认为,生物体代谢过程中产生的不饱和醛酮类物质(如MDA,4—HNE)是导致个体衰老和退行性疾病形成的核心物质和造成熵增性衰老改变的关键过程。本论文探讨了由于MDA的应激作用,在整体动物水平上导致SD大鼠学习能力和空间记忆能力的下降,在神经元的形态结构、亚细胞结构和超微结构上也观察到了由于MDA的作用导致的形态结构上破坏,并在分子水平上探讨了MDA作用下的海马神经元胞内钙稳态的破坏及可能的作用机制。
[硕士论文] 孙利兵
生物化学与分子生物学 苏州大学 2009(学位年度)
摘要:目的:探讨沙苑子黄酮(FAC)及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对CCl4致小鼠肝纤维化的干预作用及其机制研究。 方法:昆明种小鼠随机分成正常对照组、模型组、FAC-1低剂量组、FAC-2中剂量组、FAC-3高剂量组、EGCG-1低剂量组、EGCG-2中剂量组、EGCG-3高剂量组和阳性对照药秋水仙碱组,共9组。除模型组20只外,其余每组均12只。小鼠腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液(1 ml/kg)诱导肝纤维化模型,正常对照组给予等量生理盐水腹腔注射,每周2次,持续6周。自造模当日起,给药组每天分别灌服FAC、EGCG和秋水仙碱(0.1 ml/10g)。实验结束后,称小鼠体重及肝重计算肝系数,检测各组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)以及肝组织中羟脯氨酸(HYP)、丙二醛(MDA)、过氧化物歧化酶(SOD)水平,并进行组织病理学相关检测。应用免疫组织化学技术(SABC法)检测肝组织中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和β-连蛋白(β-catenin)的表达。 结果:(1)对肝重、肝系数水平的影响:与正常对照组相比,模型组小鼠肝重、肝系数明显升高,FAC及EGCG各剂量组能不同程度地降低肝纤维化小鼠肝重、肝系数。(2)光镜观察显示:模型组小鼠肝组织病理损害严重,肝索排列紊乱,肝小叶结构破坏,肝小叶周围明显坏死,且有假小叶形成,FAC及EGCG各剂量组均在不同程度上减轻了上述病理状况,FAC-3高剂量组、EGCG-2中剂量组和EECG-3高剂量组效果显著(P<0.01)。(3)透射电镜观察显示:FAC及EGCG各剂量组可减轻肝纤维化小鼠肝细胞受损程度。(4)对血清ALT、AST、ALB水平的影响:与正常对照组相比,模型组小鼠血清中的ALT、AST水平显著升高,ALB水平明显降低。FAC及EGCG各剂量组小鼠血清中ALT、AST显著降低(P<0.01),血清ALB水平不同程度地降低。(5)对肝组织SOD、MDA、HYP水平的影响:肝组织生化测定显示FAC及EGCG各剂量组可显著提高肝组织中SOD活性,降低MDA、HYP的含量(P<0.01,P<0.05)。(6)免疫组化结果显示:FAC及EGCG各剂量组可显著升高PPARγ、降低β-catenin在肝组织中的表达(P<0.01)。 结论:通过对肝组织光镜和透射电镜观察,显示FAC及EGCG抑制了CCl4诱导的小鼠肝纤维化的形成和发展。其作用机制可能与降低血清ALT、AST水平,抗肝细胞损伤;增强肝组织中SOD活性,降低MDA、HYP的含量,提高抗氧化能力及抑制胶原蛋白过度沉积;抑制β-catenin的表达、提高PPARγ的含量,干预wnt信号转导通路有关。FAC及EGCG各剂量组对各项指标的作用有所差异。
[硕士论文] 文刚
儿科(小儿外科) 温州医科大学;温州医学院 2009(学位年度)
摘要:目的: 从胚胎20天SD大鼠消化道提取的神经干细胞-肠神经干细胞(Enteric neural stem cells,ENSCs),在体外生长增殖较缓慢,这对进一步研究和应用造成了一定的阻碍。据报道人参皂甙对脑神经干细胞有促进增殖和分化作用,但对肠神经干细胞作用如何未见报告。本研究观察人参皂甙单体Rb1、Rg1对肠神经干细胞培养、增殖和分化的影响,旨在为今后人参皂甙在肠神经干细胞的基础和临床应用方面奠定基础,最终为治疗肠神经元发育异常性疾病提供依据。 方法: 1.采用改良的ENSCs培养液,以反复传代法从胚胎20天SD大鼠提取神经干细胞。 2.进行Nestin、Tuj-1、GFAP和sMA免疫荧光化学染色,以确定分离培养的细胞是否为ENSCs。 3.传代得到的肠神经干细胞分4组进一步培养:分别加入1umol/l Rb1、1umol/l Rg1、1umol/l Rb1+1umol/l Rg1,及空白对照组,比较4组的神经球生长情况。 4.CCK-8法及Brdu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)法测定4组的神经干细胞增殖速度。 5.流式细胞仪检测比较4组神经干细胞Nestin、Tuj-l、GFAP、SMA染色阳性细胞数目及比例。 结果: 1.培养第3-5天,见细胞贴壁生长;第6-7天,贴壁细胞出现神经球样结构;第9-10天,悬浮生长的肠神经球形成。 2.通过我们使用的ENSCs培养液及分离培养方法,培养的细胞阳性表达Nestin,能分化成为表达Tuj-1的神经元和表达GFAP的神经胶质细胞以及表达SMA的平滑肌细胞,确认为ENSCs。 3.CCK-8测定4组肠神经干细胞增殖速度, Rb1组、Rg1组及Rb1+Rg1组,要快于空白对照组(P<0.05),三组间无明显统计学差异(P>0.05)。 4.Brdu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)测定4组肠神经干细胞增殖速度, Rb1组、Rg1组及Rb1+Rg1组,要快于空白对照组(P<0.05),而三组间亦无明显统计学差异(P>0.05)。 5.流式细胞仪分别测定Rb1组、Rg1组、Rb1+Rg1组及空白对照组4组肠神经干细胞Nestin阳性细胞比例分别为7.11%、6.53%、6.87%和9.79%;Rb1组、Rg1组及Rb1+Rg1组,要小于空白对照组(P<0.05),而三组间无明显统计学差异(P>0.05)。 6.流式细胞仪测定4组肠神经干细胞Tuj-1阳性细胞比例分别为6.48%、8.40%、6.89%和5.20%;Rb1组、Rg1组及Rb1+Rg1组,要大于空白对照组(P<0.05),而三组间无明显统计学差异(P>0.05)。 7.流式细胞仪测定4组肠神经干细胞GFAP阳性细胞比例分别为15.59%、14.33%、14.90和10.07%; Rb1组、Rg1组及Rb1+Rg1组,要大于空白对照组(P<0.05),而三组间无明显统计学差异(P>0.05)。 8.流式细胞仪测定4组肠神经干细胞SMA阳性细胞比例分别为3.76%、5.67%、4.07和3.21%;四组间比较Rg1组阳性细胞比例大于其余三组(P<0.05)。 结论: 1.通过我们使用的ENSCs培养液及分离培养方法,能够培养出肠神经干细胞。 2.培养的细胞阳性表达Nestin,能分化为表达Tuj-1的神经元、表达GFAP的神经胶质细胞和表达SMA阳性的的平滑肌细胞,确认为肠神经干细胞。 3.人参皂甙单体Rb1、Rg1能增强体外培养肠神经干细胞的增殖能力,两者促进增殖能力无明显差别。 4.与正常对照组比较,人参皂甙单体Rb1、Rg1能促进ENSCs体外培养向神经元和神经胶质细胞分化(P<0.05),两者促进分化能力无明显差别。 5.与正常对照组比较,人参皂甙单体Rg1能促进ENSCs体外培养向平滑肌细胞分化(P<0.05)。
[博士论文] 赵理
生物化学与分子生物学 清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院 2009(学位年度)
摘要:DRD1(dopamine receptorD1)是多巴胺受体的一种,是由七个跨膜区域(7-GM)组成的G蛋白偶联受体。DRD1广泛分布于神经系统,特别是尾壳核(Cpu),伏隔核(Act),视束(OT),脑皮层(Cx)和杏仁核。DRD1通过正调控cAMP,激活蛋白激酶A,从而激活下游信号通路和细胞膜离子通道。研究表明DRD1在神经前体细胞的增殖与分化中发挥重要作用,另外DRD1受体的表达异常与药物成瘾,帕金森综合症等多种神经系统疾病有密切关系。
   HuD是ELAVL(embryoluc lethal abnormal visuallike)/Hu家族中的一员,在神经系统中特异表达。HuD通过其蛋白含有的三个RRM结构域识别和结合靶mRNA39UTR中的ARE元件,增加靶mRNA稳定性,引导靶mRNA胞内运输和调控靶mRNA翻译。HuD在神经突起的生长与修复,神经干细胞和神经前体细胞的细胞周期调控等方面发挥重要作用。HuD表达异常与多种神经系统疾病相关。
   ARE元件是一种重要的顺式作用元件,富含A和U,参与介导mRNA的降解。Tala等人在ARED3.0数据库中汇集了所有NCBI收录的mRNA3'UTR上含有ARE元件的基因。通过检索ARED3.0数据库,我们发现DRD1mRNA的3'UTR上具有一个进化保守的ARE元件。通过Real-timePCR实验,我们发现RA诱导后向神经元方向分化的P19细胞中DRD1和HuD呈同时上升的趋势,这提示我们HuD有可能识别DRD1mRNA3'UTR的ARE元件,并由此调控DRD1基因的表达。
   我们首先应用RNA-chip方法进行了检测。利用HuD抗体在P19细胞全蛋白裂解液中捕获HuD蛋白-RNA复合体,然后通过链霉亲和素珠从细胞全蛋白裂解液中分离纯化出抗体-HuD蛋白-RNA复合体。经过酚氯仿抽提出其中的RNA后,通过逆转录得到相应的cDNA,最后利用特异性引物通过PCR扩增出特异条带。发现在P19细胞中HuD蛋白结合DRD1mRNA。随后通过REMSA实验,证实HuD蛋白识别并结合DRD1mRNA3'UTR上的ARE元件。说明HuD通过识别和结合DRDlmRNA3'UTR上的ARE元件来实现对DRD1mRNA的调控。
   通过荧光素酶报告实验,我们发现HuD蛋白能够上调DRD1基因的表达。将野生型DRD13'UTR序列插入报告质粒荧光素酶基因编码区下游,用报告基因重组质粒和HuD真核瞬时表达载体共同转染293ET细胞,我们发现与转染空质粒的对照组相比,带有野生型DRD13'UTR序列的荧光报告素酶活性有明显的上升。Real-timePCR实验表明过表达HuD蛋白后,含有野生型DRD13'UTR的荧光报告素酶转录本数量明显高于对照组。在P19细胞中过表达HuD蛋白后,Real-timePCR实验表明DRD1mRNA也出现了上升。这说明HuD蛋白识别和结合靶基因mRNA3'UTR的ARE元件后增加DRD1mRNA的稳定性,从而促使靶基因表达上调。
   最后我们还发现HuD蛋白影响miR-504对DRD1的上调作用。受到W。Huang等在HEK293细胞中观察到has-miR-504可以上调人源DRD1表达的报道的提示,我们在293ET细胞中观察到过表达mmu-miR-504可以上调小鼠源DRD1的表达。我们将miR-504瞬时表达载体和带有DRD13'UTR的荧光报告素酶表达质粒共同转染293ET细胞,24小时后荧光报告素酶表达出现显著上升;而如果将HuD瞬时表达载体与前二者同时转染293ET细胞,24小时后荧光报告素酶的上调程度会受到明显抑制。这是第一次发现HuD对靶基因的调控涉及miRNA。
   综上所述,我们发现DRDI3'UTR上的ARE元件能够被HuD蛋白识别和结合,从而增加DRD1mRNA的稳定性,提高DRD1在细胞中的表达。另外,miR-504可能影响HuD蛋白对于DRD1的表达调控。
[博士论文] 韩仁文
生物化学与分子生物学 兰州大学 2009(学位年度)
摘要:神经肽S(NPS)是最近发现的具有调节觉醒和焦虑作用的一种神经肽。NPS受体(NPSR) mRNA在海马的主要输出和输入结构有大量的表达,这些脑区对于学习记忆有着重要的调节作用。然而到目前为止还没有关于NPS-NPSR系统调节学习记忆的相关报道。因此,我们通过水迷宫实验来研究侧脑室注射NPS对小鼠空间学习和记忆的作用。我们的数据表明侧脑室注射NPS显著增强小鼠的空间记忆能力,但是对学习能力和游泳的速度没有明显的影响。此外,侧脑室注射NPS可以减轻N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂MK801引起的空间记忆损伤。总之,这些结果首次证明了中枢NPS能促进小鼠的空间记忆并且可以减轻MK801引起的空间记忆损伤,提示NPS-NPSR系统可能作为提高记忆能力和治疗记忆障碍的靶点。 此外,NPSR mRNA在下丘脑的很多个核区都有很高的表达,并且下丘脑是脑中能量平衡的调节中枢,说明NPS-NPSR系统很可能参与了相关功能的调节。虽然已经报道了NPS在大鼠和鸡中对摄食的调节作用,但是这些结果并不一致。因此,我们研究了NPS-NPSR系统对小鼠摄食的调节作用。我们的结果表明侧脑室注射NPS(1-1000 pmol)能够剂量依赖的抑制禁食小鼠的摄食。此外,侧脑室共注射NPSR的选择性拮抗剂[D-Val5]NPS和NPS可以拮抗NPS抑制小鼠摄食的作用。这些结果首次证明了中枢注射NPS通过激活NPSR来抑制禁食小鼠的摄食。 NPSR mRNA在一些重要的中枢自主神经调节脑区有着大量的表达,通过这些脑区可以控制内脏的运动以及一些必要的生存反应。此外,很多对摄食有调节作用的药物对胃肠道运动也有调节作用。然而,NPS-NPSR系统在胃肠道运动中的作用还未见报道。因此,我们研究NPS-NPSR系统在胃肠道运动中的作用。结果表明侧脑室注射NPS(1-1000 pmol)对小鼠的胃排空和胃肠道穿行都没有明显的影响。但是侧脑室注射NPS(1-1000 pmol)可以剂量依赖的抑制小鼠远端结肠的运动。此外,侧脑室共注射NPSR的选择性拮抗剂[D-Val5]NPS和NPS可以拮抗NPS抑制远端结肠运动的作用。这些结果首次证明了中枢注射NPS通过激活NPSR来抑制小鼠远端结肠的运动,但是其对胃排空和胃肠道穿行都没有明显的作用。这些结果暗示NPS-NPSR系统可能成为治疗远端结肠运动功能混乱的药物靶点。
[博士论文] 李威
生物化学与分子生物学 兰州大学 2009(学位年度)
摘要:第一部分:神经肽S镇痛活性研究 神经肽S(NPS)是最近发现的生物活性肽,具有调节觉醒、焦虑、运动和摄食的功能。NPS受体(NPSR)分布于下行控制系统,如中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG)、中缝核(raphe nuclei)、侧臂旁核(lateral parabrachialnucleus,PBN)等,暗示了NPS-NPSR系统在痛觉调节中的可能作用。我们使用甩尾实验和热板实验首次评价了NPS在脊髓上水平的痛觉调节作用。在两种急性热痛觉模型中,侧脑室注射NPS(0.01-1 nmol)能引起明显的镇痛效果。NPS(0.1nmol,i.c.v.)诱导的镇痛活性不被纳洛酮(i.c.v.共注射,10 nmol或i.p.提前15分钟注射,10 mg/kg)影响。而在相同的剂量条件下,纳洛酮能降低3 nmol吗啡诱导的镇痛效果。NPSR的拮抗剂[D-Cys(tBu)5]NPS(i.c.v.,3、10 nmol)本身没有任何痛觉调节活性。但与NPS共注射后,能明显抑制NPS诱导的镇痛活性。这些结果表明,NPS的镇痛活性,是通过NPS受体而不是阿片受体发挥作用的;NPS-NPSR系统可能是新型止痛药的新靶点。 第二部分:[Tyr6]γ2-MSH(6-12)在脊髓水平的痛觉调节作用 Mrg家族受体(mas-related gene,简称Mrg,也称为sensory neuron-specificreceptor,SNSR),特异地分布于脊髓三叉神经节和背根神经节的小直径感觉神经元中,在痛觉传导中发挥重要作用。我们的目的是研究MrgC激活后诱发原痛效果的机制,以及MrgC受体与N/OFQ-NOP系统在调节脊髓痛觉中相互作用。鞘内注射MrgC高效激动剂[Tyr6]γ2-MSH(6-12)产生明显的热痛觉过敏效果(小鼠甩尾潜伏期的缩短,0.01-10 pmol),和诱发疼痛行为应答(后肢抓挠身体两侧,嘴咬或舔前后肢及尾巴,0.01-10 nmol)。这种原痛效果能被NMDA受体拮抗剂非竞争性MK-801、竞争性D-APV和NO合酶抑制剂L-NAME抑制;但不受共注射NK1受体拮抗剂L-703,606或NK2受体拮抗剂MEN-10.376影响。 在其它实验中,[Tyr6]γ2-MSH(6-12)诱发的疼痛行为被N/OFQ双向调节。高剂量N/OFQ(0.01-1 nmol)抑制,低剂量N/OFQ(1 fmol-3 pmol)加强这种疼痛行为应答。另外,NOP受体拮抗剂[Nphe1]N/OFQ(1-13)-NH2加强[Tyr6]γ2-MSH(6-12)诱发的原痛效果(包括热痛敏效果和疼痛行为应答)。 我们的结果表明,[Tyr6]γ2-MSH(6-12)诱发的原痛效果是由NMDA-NO系统介导的。MrgC与N/OFQ-NOP系统在调节脊髓痛觉中存在相互作用。
[硕士论文] 顾鹏毅
生物化学与分子生物学 中国医科大学 2009(学位年度)
摘要:神经生长因子(never growth factor,NGF)是神经营养因子中最早被发现,目前研究较为透彻的,具有神经元营养和促进突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子,其临床应用前景广阔。它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。 NGF具有多种营养性生物学效应:对胚胎发育期神经元的作用;促进生后发育神经元的生长;维持成熟神经元的存活;促进神经损伤的修复与再生;对神经变性性疾病的作用;对肿瘤的潜在性治疗作用;在炎性疾病中的作用;在糖尿病周围神经病变中的治疗作用。 目前,NGF的主要来源是小鼠的颌下腺、蛇毒、豚鼠前列腺、牛精液等,临床较多的采用小鼠颌下腺、蛇毒来源以及基因工程产品人重组NGF(rhNGF),其对人的神经组织有明显的作用,国内外文献已有很多报道。 人体的微量元素有70种,根据其作用分为人体必需微量元素和非必需微量元素及人体有害微量元素二类。所谓必需微量元素,就是正常人体生命过程中不可缺少的微量元素,它参与人体的重要的生命活动过程,对人体的各种生理活动起影响、调节作用。锌在脑中的分布是不均衡的,其中尤以海马结构最高,约占全脑的1/6,它主要位于海马苔状纤维的胞浆中,这些纤维起自海马,止于下丘脑。 本研究对牛脑神经生长因子进行分离纯化,以期为下一步应用性研究做好基础。 材料与方法: 从牛脑中分离出海马结构,利用生物大分子分离纯化技术分离纯化出NGF;利用电泳、蛋白印记杂交鉴定提取物为NGF;采用PC12细胞法测定其生物学活性;对其微量元素Zn、Fe、Cu进行测量。 结果: 牛脑海马粗提物经透析过夜,再经CM柱离子交换层析,得到2个洗脱峰:CM1峰、CM2峰,其中CM2峰为NGF的主要含量峰。电泳及WB结果表明:NGF的主要含量带大约为55KD,次含量带约为70KD,主、次含量带中亦含有β亚基,但结合了不同的α、γ亚基,WB显示的各条带中均含有活性基团B亚基。CM1分离组分和粗提物作用下的PC12细胞轴突生长不明显,标准品NGF、CM2分离组分作用下的PC12细胞轴突生长两者间存在差异(P<0.01),CM2分离组分作用效果低于标准品NGF,但也满足活性判定标准,可以认为CM2分离组分有生物学活性。牛脑海马结构的微量元素中Zn与Cu含量无差别,Fe与Zn、Cu有差异(P<0.01);NGF中Fe与Cu含量无差异,Zn远高于Fe、Cu含量(P<0.01)。 结论: 1.分离纯化得到的牛脑海马NGF的分子量主要为55KD、70KD的两种成分,具有生物学活性。 2.牛脑海马结构中锌元素的含量与铜元素相当,低于铁元素水平;牛脑海马NGF中锌元素的含量明显高于铁、铜元素含量。
[硕士论文] 王明虹
内科学(心血管) 东南大学 2008(学位年度)
摘要:目的:纤维化是多种慢性病的常见病理过程之一。作为多个信号通路中的下游作用因子,结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)在纤维化的发生、发展过程中起着关键作用,因此CTGF是一个更具特异性的靶点。对于细胞因子拮抗剂的研究是目前纤维化疾病治疗中的热点。本研究试图从随机十二肽库中筛选与CTGF特异性结合的噬菌体克隆,利用基因工程技术获得与CTGF特异性结合的小肽,初步研究该小肽是否能抑制CTGF促人脐静脉内皮细胞增殖及迁移的活性。为开发CTGF小分子抑制剂打下基础,进而为纤维化疾病的治疗提供新途径。 方法:1.用基因重组方法制备硫氧化还原蛋白(TrxA)及硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白;噬菌体随机十二肽库经TrxA预吸附后,与TrxA-CTGF结合,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取10个阳性克隆,提取单链DNA后进行测序;用直接噬菌体-ELISA试验检测噬菌体刚性克隆与CTGF结合的特异性。2.设计并合成一段带有肠激酶切割位点的基因片段,插入pET-32(a)+质粒载体中硫氧化还原蛋白基因下游,构建重组质粒,转入E.coliBL21表达菌中,用终浓度1mmol·L-1的IPTG诱导表达融合蛋白;用热变性和硫酸铵分级沉淀对融合蛋白进行初步纯化,用亲和层析进一步纯化,经肠激酶切割后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽;用反相色谱对所获小肽进行纯度鉴定。3.体外培养人脐静脉内皮细胞,采利用MTT试验观察所获小肽是否能抑制CTGF促人脐静脉内皮细胞增殖的作用、利用Transwell试验观察所获小肽是否能抑制CTGF促人脐静脉内皮细胞迁移的作用。 结果:1.10个噬菌体阳性克隆中8个DNA序列完全一致,命名为810A,另有2个序列各不相同,分别命名为810B、810C;根据三联密码子推导810A、810B、810C的氨基酸序列分别为LLADXXXXRPWT、HATGXXXXSLSH、TSGYXXXXGRWR;计算其相对分子量分别为1448.627D、1218.315D、1502.725D,等电点分别为7.985、8.075、12.185;阳性噬菌体克隆810A用直接噬菌体-ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.05)。2.所构建的重组质粒测序结果与预期序列一致;诱导表达后经SDS-PAGE鉴定,发现在相对分子量20000D处有浓密的表达条带出现,与预期分子量一致;融合蛋白用热变性、硫酸铵分级沉淀、亲和层析、肠激酶切割、凝胶过滤层析分离获得目的小肽,用反相色谱鉴定其纯度大于95%;最终每升发酵液获得3.4mg目的肽。3.0.1μg·mL-1CTGF能促进人脐静脉内皮细胞增殖,与阴性对照比较差异显著(P<0.05),浓度为10μg·mL-1的小肽810A能抑制0.1μg·mL-1CTGF促人脐静脉内皮细胞增殖的作用,与阳性对照比较差异显著(P<0.05),而浓度分别为2μg·mL-1、0.4μg·mL-1、0.08μg·mL-1、0.016μg·mL-1、0.0032μg·mL-1、0.00064μg·mL-1的小肽810A不能抑制0.1μg·mL-1CTGF促人脐静脉内皮细胞增殖的作用,与阳性对照比较无显著差异(P>0.05):1μg·mL-1CTGF可促进人脐静脉内皮细胞迁移,与阴性对照相比有显著差异(p<0.05),浓度分别为1mg·mL-1、100μg·mL-1、10μg·mL-1、1μg·mL-1、0.1μg·mL-1的小肽810A能抑制1μg·mL-1CTGF促人脐静脉内皮细胞迁移的作用,与阳性对照比较差异显著(P<0.05)。 结论:1.成功获得3个与结缔组织生长因子特异性结合的噬菌体克隆,分别命名为810A、810B、810C,并通过测序获得其DNA编码序列。2.成功制备与结缔组织生长因子特异性结合的小肽810A。3.一定浓度的小肽810A可抑制结缔组织生长因子促人脐静脉内皮细胞增殖及迁移的作用。
[硕士论文] 刘亮亮
遗传学 中国海洋大学 2008(学位年度)
摘要:酒精性肝病是由于长期大量的饮酒,导致肝脏清除氧自由基的能力下降,脂质氧化代谢紊乱,造成肝脏内脂肪沉积;同时,酒精在肝脏内转化成乙醛,乙醛的毒副作用对肝脏的损伤也很大。酒精性肝损伤可分为酒精性脂肪肝,酒精性肝炎和酒精性肝硬化三大类,其中酒精性脂肪肝是最主要、最初期的发病方式。当肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重的5%,或组织学上每单位面积见1/3以上肝细胞脂变时,称为脂肪肝。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变,酗酒者不断增多,导致酒精性脂肪肝有迅速增加的趋势。酒精性脂肪肝对人体健康的危害越来越受到社会的广泛重视。 壳聚糖作为自然界中多糖生物合成第二大再生资源,近20年来已引起世界许多国家的关注并在生物医药,功能食品,日用化工,环境保护等诸多领域中得到广泛的研究和开发应用。甲壳素经降解和脱乙酰化而制得的小分子壳寡糖(COS)和氨基葡萄糖(Glu-NH2),由于其分子量小,水溶性好,易被机体吸收,无毒性且具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫等功能。已应用于功能食品,动物抗病饲料添加剂,农作物抗病剂及增产剂等行业。有关壳寡糖和氨基葡萄糖用于酒精性肝损伤的保护方面的研究,除壳寡糖对于CCl4导致的小鼠急性肝损伤的保护作用有少量文章报道外,氨基葡萄糖在国内外尚未见详细报道。 本实验制备和纯化出低分子量的壳寡糖和氨基葡萄糖,并对其理化性质指标进行了测定。通过体内实验研究了COS和GLc-NH2对酒精性肝损伤小鼠的保护作用。以昆明种小鼠为研究对象,建立急性酒精中毒模型和酒精性肝损伤模型,并用不同剂量的壳寡糖和氨基葡萄糖进行连续灌胃8周。眼球取血,对小鼠的血液指标进行测定,主要包括丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),Y-谷氨酞基转移酶(GGT),甘油三酯(TG)总胆固醇(TC);处死取肝脏固定,做组织切片,观察分析组织受损情况。 体内实验结果表明:通过急性酒精中毒实验发现GLc-NH2、COS对急性酒精中毒小鼠具有明显的保护作用,能很大程度缩短小鼠的醒酒时间,减少小鼠的死亡率。酒精性肝损伤的模型组ALT、 AST和GGT的活性和TG、TC含量均显著升高,与空白对照组有极显著性差异(P<0.01)。组织学观察肝脏细胞有大量的Mallory小体并聚集成灶,肝中有明显的小泡性脂变,证明造摸成功。给小鼠灌服不同剂量的GLc-NH2和COS,能显著降低血清中ALT、AST和GGT的活性和TG、TC含量,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),与空白组差异不明显;组织学观察表明各剂量组小鼠的肝脏受损程度有明显的改善,少见Mallory小体和小泡性脂变。 本实验结果表明:GLc-NH2和COS对急性酒精中毒和慢性的酒精性肝损伤都有明显的保护作用,为进一步研究壳寡糖和氨基葡萄糖的解酒和酒精性肝病的治疗提供了一定的实验依据。
[博士论文] 廖之君
生物化学与分子生物学 南方医科大学 2008(学位年度)
摘要:随着人类基因组计划和人类基因组单体型图计划的完成,基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、相互作用组学和表型组学等各种组学的兴起和蓬勃发展,生命科学研究已经跨入后基因组与系统生物学的崭新时代。系统生物学使生命科学由描述式的科学转变为定量描述和预测的科学,她是在注重个别基因和蛋白质的实验生物学基础上,从整个生物系统的角度整合研究所有基因、所有蛋白质、所有组分的性质,以及在特定条件下这些组分间的相互关系。高通量基因芯片技术的发展成熟和广泛应用,产生了海量的基因表达谱数据,许多相应数据库也已建立,蛋白质组学相关技术的发展也汇聚了大量的生物大分子相互作用信息。生物信息学为储存、处理、分析和整合这些庞杂的数据信息提供了强大的技术平台。人类基因组中蛋白质编码基因的数量只有3万左右,序列占有量还不到整个基因组(约3,000,000,000bp)的2%,而在这些蛋白编码基因中,调节基因表达的反式因子(又称转录因子)占据了相当大的比例,约3000左右。这些转录因子在调控基因表达时与DNA、蛋白质等分子相互作用,形成极为复杂的基因转录调控网络。 基因表达调控是生物体内基因表达的调节控制机制,是细胞中基因表达的过程在时间、空间上处于有序状态,并对环境条件的变化作出适当反应的复杂过程。基因表达的调控可在多个层次上上进行,包括基因水平(基因结构的活化)、转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的调控,其中转录水平尤其是开始转录时的调控对基因表达起关键作用。真核细胞染色质是以核小体形式存在,结构复杂,转录起始时RNA聚合酶并不能单独识别结合启动子,这个过程需要转录因子的协助完成。转录因子是指与基因调控序列结合并调控基因转录的一类核蛋白,包含起始转录所需要的除RNA聚合酶以外的任何一种蛋白质组分,可分为基本转录因子、活化因子、协同活化因子和其它调节因子四类。这里研究的是后3类,统称为特异转录因子,依其作用的效果不同分为转录活化因子和转录抑制因子2种。转录因子可以识别RNA聚合酶,也可以识别DNA序列,也能与另一些转录因子结合,转录因子结合位点通常为基因的上游区域中(包含启动子区)的一段特定的DNA序列,这些序列本身并不执行任何功能,只有当其被转录因子识别、结合后才能发挥作用,它们共同控制着基因的转录。因此,转录因子和/或基因之间形成复杂的转录调控网络。 大量基因表达谱数据分析表明,至少存在约几千个基因表达具有组织选择性现象,其中约有366个基因首先选择性高表达于肝脏及相关组织,对这些基因进一步按功能分类,预期得到的基因集所具有的表达模式和功能,在很大程度上与共调控基因相似,然后根据反向工程的原理,预测可能对这些基因进行调控的转录因子,并构建转录因子和基因之间的转录调控网络,揭示各相关基因间的主从和调控关系。 研究内容主要分为四个部分: 1.基因芯片数据挖掘概述。本章较详细介绍了基因芯片、储存基因芯片数据的GEO数据库、基因芯片数据的生物信息学分析、常用基因芯片数据挖掘软件的应用等内容。详细介绍了一款适合基因表达谱数据分析的GeneSifter软件,以本研究所完成的Velcade影响K562细胞基因表达谱数据集和下载于GEO数据库的GSE6902(电离辐射致人成纤维细胞损伤的全基因表达谱)数据集为例介绍了数据挖掘流程,供生物学背景的科研工作者进行数据挖掘时参考。 2.肝组织选择性基因转录因子的预测分析。利用DAVID软件强大的基因功能注释模块:根据基因本体词汇、蛋白质.蛋白质相互作用、蛋白功能结构域、疾病关联性、生物通路、基因表达、基因特征、同源性等40多种注释分类体系,实现基因的合理分类,先把组织选择性探针集(包含97种组织)按照功能显著性不同分为10大类,分别是细胞通讯、遗传相关、糖蛋白、KEGG、膜蛋白、金属结合蛋白、OMIM、受体、信号转导、转录因子等共有10大类,与肝组织相关的探针集按选择性高低又细分为23类。包括:1个细胞通讯类,4个遗传相关类,2个糖蛋白类,5个KEGG类,2个膜蛋白类,3个金属结合蛋白类,1个OMIM类,1个受体类,3个信号转导类,1个转录因子类,共23类。假定这些类基因集满足共表达并且共调控的前提条件,采用PromoSer软件提取各基因转录起始位点上游500个碱基序列,接着利用针对组织选择性转录因子预测的MaxLAPS程序和TFME软件预测这些基因集的转录因子,并结合SCOPE软件预测转录因子结合位点及分布,最后按照TRANSFAC真核转录因子数据库的分类标准(基于DNA结合结构域相似性的分类体系)对预测的转录因子进行了归类。 将MaxLAPS程序和TFME软件预测结果交叉合并,得到23类基因集的转录因子,各类基因集的转录因子数分布4~19个,总数达85个。这些转录因子分属于经典的4个超类中,分别是:碱性结构域超类(25个,占29.4%)、含锌配位的DNA结合结构域超类(17个,占20%)、螺旋-转角-螺旋超类(27个,占31.80%)、具有与小沟接触的β-骨架因子超类(16个,占18.8%)。为了观察这些转录因子结合的DNA调控元件在基因上游的位置分布,采用SCOPE软件以图形直观显示得分最高的10个(转录因子类6个)转录因子结合位点序列在各基因-500bp区域的分布情况,经检验部分序列logo,发现这些位点与预测的转录因子基本相对应。总之,预测过程为先对共表达的组织选择性基因进行功能归类,再用3款软件分别预测各功能类基因集的转录因子和转录因子结合位点,并且预测结果相互间可以验证对应,这种方法确实可行,对肝组织选择性基因转录因子的预测方法国内未见报道。 3.肝组织选择性基因转录调控网络构建的研究。随着网络节点数的增加,相应的网络拓扑结构复杂度成指数倍增,因而,节点数必需适中。我们根据已知基因.基因关联度大小和转录产物的细胞分布位置不同,选择从胞外到核的6类(细胞间通讯1类、受体1类、信号转导3类和转录因子1类)基因和预测的转录因子来构建基因转录调控网络。先用3款基因和/或蛋白质之间相互作用网络构建工具STRING、UniHI和Bibliosphere软件分别生成6类的基因转录调控网络,找出网络的核心节点,再综合构建总的基因转录调控网络,这些网络主要在已有文献证据基础上生成。 细胞对刺激反应的过程一般可解释为胞外因子或者膜受体的信号,经过信号转导级联途径传到核中,启动或关闭某些基因的转录。肝细胞的这一信息流需要许多具有肝组织选择性功能的蛋白因子的协同参与,构建的含基因和转录因子JUN,SP1,HNF4A等的复杂转录调控网络显示,这些转录因子参与肝组织选择性基因集的调控过程。网络显示各基因分布呈功能聚集现象--成簇,不同的簇代表不同的功能基因群。经过功能聚类分析发现,细胞外(包含胞膜)的基因基本上可以分为3~4群,分别为参与补体激活信号基因集(以补体成分4A“C4A”为核心),参与血液凝固信号级联基因集(以凝血因子X“F10”为核心)和结合功能基因集(以白蛋白“ALB”为核心),其中结合功能基因集包含了脂代谢(以载脂蛋白B“APOB”为核心)有关的基因,构建的网络反映了肝脏几种常见而且重要的功能:脂代谢网络,凝血和补体信号转导网络,以及转录调控网络之间的复杂关系。本研究从系统水平体现出肝脏具有复杂的生理功能,如果整合具体的肝病数据,该网络可潜在应用于肝脏在生理病理水平发生变化时的分子机制预测。 4.肝组织选择性细胞通讯基因网络初步应用于未知基因的预测分析。应用BioLayout能根据基因间的相似性(如表达谱相似性)将已知和未知基因/蛋白质的关系以三维关系图的形式表示出来,帮助构建含有未知基因的LSCC基因网络,通过进一步对网络成员进行聚类、文献挖掘分析,对未知基因LOC91614进行基因本体(GeneOntology,GO)、KEGG通路、Transfac转录因子结合位点、保守结构域等分析。结果获得21个节点含有6个未知基因的LSCC基因网络,聚类也显示各成员的基因表达关联较紧密,其中LOC91614与APOB有密切关联,支持BioLayout的结果;文献挖掘显示已知基因与肝组织、胞质、血清、糖、脂、胰岛素、肝炎等关键词显著相关;GO功能富集分析揭示LOC91614具有细胞通讯、信号转导、细胞内信号级联的功能,大约有7个TFBS可对含LOC91614的靶基因集进行调控,推测LOC91614产物可能分布于肝细胞的胞质中,可能涉及肝脏的糖、脂代谢过程的调控,可能与肝组织的特异性细胞通讯相关,LOC91614这些功能可能依赖于DEP保守结构域。 本研究在转录因子预测的假阳性率控制、功能相关的转录因子对应的DNA顺式调控模块优化研究、以及预测结果的验证等方面值得进一步深入研究与完善。
[硕士论文] 阴瑞兰
生物化学与分子生物学 山西医科大学 2008(学位年度)
摘要:目的:在饲喂大鼠高脂饲料的同时添加葡萄籽提取物原花青素(Grape seedproanthocynadin extract GSPE),采用吡格列酮作阳性对照,观察原花青素是否能预防大鼠胸主动脉壁过氧化物酶增殖体激活受γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)mRNA表达下调,及对PPARγ下游信号分子--核因子NF-kB活性的影响,并观察原花青素通过对PPARγ的调节能否拮抗高脂血症的形成,探讨原花青素的血管预防保护作用的分子机制。 方法:雄性SD大鼠32只,随机分为四组:基础组(C)、高脂组(HL)、吡格列酮组(PI)、原花青素组(PC)。每组8只,其中PⅠ组为阳性对照组。基础组饲喂基础饲料,其他三组饲喂高脂饲料。与各组饲喂饲料的同时,灌胃给相应的干预剂,其中吡格列酮和原花青素灌胃量分别是10 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d),C组和HL组灌溶剂蒸馏水,喂养六周。在0周、3周、6周禁食12h后,尾静脉采血,测血清总甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。实验期末,将大鼠水合氯醛腹腔麻醉后,留取胸主动脉组织,将组织液氮速冻后,保存于-70℃备用。血清TG、TC、HDL-C含量采用相应试剂盒测定,RT-PCR技术检测PPARγ的mRNA表达水平,运用EMSA技术检测NF-kB活性。 结果: 1.高脂组大鼠血脂的变化:3周、6周时,与正常饮食大鼠基础组相比,高脂组大鼠血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)水平含量明显升高(p<0.05)。 2.大鼠胸主动脉壁PPARγ mRNA的表达和NF-κB活性的变化: (1)高脂组与基础组相比,大鼠胸主动脉壁PPARγ mRNA表达显著降低(p<0.05),而NF-κB活性明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)。 (2)原花青素组与高脂组比较,大鼠胸主动脉壁PPARγ mRNA表达水平明显升高(p<0.05),NF-κB活性显著降低(p<0.05);较基础组、吡格列酮组无显著变化(p>0.05)。 3.原花青素的降血脂作用:6周时,原花青素组较高脂组血清TG、TC的含量显著降低(p<0.05),较基础组、吡格列酮组无显著变化(p>0.05)。 结论: 1.原花青素具有预防血清总甘油三酯、总胆固醇升高的作用,但对高密度脂蛋白胆固醇的影响不明显; 2.原花青素能增加高脂状态下胸主动脉壁PPARγ mRNA表达的作用; 3.原花青素可以抑制高脂状态下胸主动脉壁核因子NF-κB激活的作用。
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