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[硕士论文] 吴欣瞳
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:内脏脂肪素,简称内脂素(Visfatin),是近年来新发现的一种参与机体炎症和免疫应答反应的脂肪细胞因子,它的发现推动了脂肪组织和炎症之间关系的研究,而炎症又可以引起细胞凋亡和自噬,所以内脂素可能直接或间接影响细胞凋亡和自噬反应。急性肺损伤(ALI)是全身炎症反应综合征表现在肺部的呼吸系统性疾病,经常被用作一种炎症模型。研究发现,在急性肺损伤动物模型中,肺泡灌洗液的内脂素水平升高,推测内脂素作为炎性介质可能参与肺部炎症的发生和发展,从而影响细胞凋亡和自噬。因此,本试验以昆明小鼠为研究对象,利用LPS构建的急性肺损伤模型,通过HE染色、TUNEL、透射电镜、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和Western blot等技术方法研究内脂素对急性肺损伤肺部细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT信号通路的作用,以探讨内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路调节凋亡和自噬参与炎症反应,阐明内脂素在LPS介导的炎症反应中与肺内细胞凋亡和自噬之间的关系及作用机制。研究结果如下:
  1.内脂素对急性肺损伤肺组织结构的影响
  利用LPS诱导构建的急性肺损伤模型,取肺组织制作石蜡切片并进行HE染色。显微镜下观察:生理盐水对照组小鼠肺组织的结构完整,肺泡壁较薄,无炎性细胞浸润,肺泡内无肺泡液渗出;急性肺损伤造模组(LPS组)的肺组织损伤明显,肺组织结构遭到破坏,肺泡壁明显增厚,肺间质及肺泡有红细胞渗出,可见大量炎性细胞尤其是中性粒细胞浸润;LPS+Visfatin组与LPS组比较,小鼠肺组织损伤程度减轻,肺泡隔变薄,肺泡轻微充血,肺间质及肺泡出现轻微渗出,有少量的炎性细胞浸润。通过免疫组化检测血管内皮生长因子(VEGF),结果显示:生理盐水对照组,小鼠肺泡上皮细胞中,VEGF的表达很少;急性肺损伤造模组(LPS组),肺组织中,VEGF的表达明显增强,主要在肺泡上皮细胞、呼吸性细支气管上皮细胞、炎性细胞以及单核细胞;与LPS组相比,LPS+Visfatin组肺组织中VEGF的表达明显减少。上述结果表明:内脂素能够减轻LPS诱导的急性肺损伤肺部组织结构的病理变化。
  2.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞凋亡的影响
  采用TUNEL技术以及IPP软件进行研究并统计分析了不同组肺内的凋亡细胞。结果显示:凋亡细胞在小鼠的肺泡上皮细胞中分布居多,生理盐水对照组肺组织中凋亡细胞的数目较少;与对照组相比,LPS组肺组织内的凋亡细胞数量极显著增多(P<0.01);LPS+Visfatin组肺组织内的凋亡细胞数量与LPS组相比显著减少(P<0.05)。结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞凋亡,而内脂素能够抑制急性肺损伤引起的细胞凋亡。
  3.内脂素对急性肺损伤肺组织凋亡因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测Bcl-2基因家族中的促进细胞凋亡基因Bax、Bik和抑制细胞凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的mRNA表达。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中的促凋亡因子Bax和Bik的mRNA表达呈现出极显著的升高(P<0.01),抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表达显著升高(P<0.05);促凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比显著降低(P<0.05),而抗凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比极显著升高(P<0.01)。WesternBlot检测凋亡相关因子p53和MLKL的蛋白在肺组织中的表达,结果表明:与对照组相比,LPS组中P53和MLKL的蛋白表达均明显增多。与LPS组相比,LPS+Visfatin组P53和MLKL的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:内脂素可以抑制促凋亡基因的表达,促进抗凋亡基因的表达,从而抑制细胞凋亡。
  4.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞自噬的影响
  通过透射电镜观察发现:生理盐水对照组中的自噬小体很少;与生理盐水对照组相比,LPS组的自噬小体明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组的自噬小体明显减少。采用免疫组织化学法检测自噬标志物LC3和Beclin1的定位表达,并结合IPP软件进行统计学分析,结果显示:肺组织中可见棕色阳性产物,LC3主要在细胞质中表达,并且肺泡隔的上皮细胞中居多;Beclin1主要在肺泡上皮细胞以及肺泡管结节状膨大部细胞中表达。与生理盐水对照组相比较,LPS组中LC3和Beclin1的表达极显著升高(P<0.01);与LPS组相比LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的表极显著降低(P<0.01)。以上结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞自噬,而内脂素能够减少急性肺损伤引起的细胞自噬。
  5.内脂素对急性肺损伤肺组织自噬因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测自噬因子LC3和Beclin1的mRNA表达。结果显示,生理盐水对照组中自噬因子mRNA表达较低,说明机体在正常情况下时,自噬的表达量较少;与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的mRNA表达均升高;与LPS组相比,LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的mRNA表达均降低。Western Blot检测LC3和Beclin1蛋白表达的结果显示:与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的蛋白表达均明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组LC3和Beclin1的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:在急性肺损伤中,细胞自噬的表达增强,协助细胞凋亡,而内脂素可以抑制细胞凋亡并使自噬的表达降低,从而减轻肺损伤的程度。
  6.内脂素对PI3K/AKT信号通路的影响
  利用Western Blot技术并结合ImageJ软件分别检测PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达,以验证内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路参与急性肺损伤中细胞的凋亡和自噬。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中PI3K、AKT和p-AKT的表达均上调;与LPS组相比,LPS+Visfatin组PI3K和p-AKT的表达上调,AKT的表达下调。结果提示:内脂素能够激活PI3K/AKT信号通路,抑制肺细胞凋亡,降低自噬水平,产生肺的保护作用。
[硕士论文] 冯雍炜
军事预防医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:芥子气(sulfurmustard,SM),是糜烂性毒剂的代表,在第一次世界大战中被首次使用,后又相继在日本侵华战争、两伊战争及叙利亚内战中被使用,造成大量人员中毒甚至死亡。芥子气作用时间长,中毒途径多,穿透性强,且尚无特效的防治措施,所以仍是我军面临的主要化学战剂威胁之一。芥子气是日本遗弃在华的主要化学战剂之一,对中国人民的健康和环境安全构成重大威胁,尤以东北地区最为严重。因此,积极探究芥子气的中毒机制,寻找有效的防治药物,对维持我军战斗力、保障公民健康及保护生态环境均有着重要的战略意义。
  芥子气可引起体内多脏器的中毒损伤,其中肺是芥子气损伤的主要靶器官。大量研究发现,芥子气中毒后可引起呼吸道的炎症及肺泡结构的破坏,从而引起急性肺损伤导致患者死亡。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类成体干细胞,具有自我更新以及分化的功能。研究表明BMSCs可以通过分泌抗炎性细胞因子、调节免疫细胞分型、分泌生长因子及分化作用等多种途径对损伤组织的修复、免疫系统的调节产生作用,从而减轻肺部炎症反应、加速损伤肺组织的修复,缓解肺损伤。
  本文研究发现,BMSCs能通过分泌EGF、FGF、PDGF等生长因子,促进Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮细胞增生,加强细胞连接等途径对肺损伤的修复产生影响,从而减轻肺水肿,并对芥子气中毒小鼠肺功能起到改善作用。此外BMSCs还可以通过影响巨噬细胞和T淋巴细胞的分化、调节TLR4信号通路的表达从而显著降低促炎性细胞因子的表达,升高抗炎性细胞因子的表达。
  一、BMSCs的鉴定及其在芥子气中毒小鼠体内的定位
  取ICR小鼠股骨和胫骨进行BMSCs的原代分离及培养,通过流式细胞术检测表面标志抗原及干细胞诱导分化实验对所获得的BMSCs进行鉴定:结果显示分离培养获得的细胞可以高表达间质类细胞特异性表面抗原CD73、CD90、CD105,不表达或低表达造血细胞表面抗原CD11b、CD19。透过诱导分化实验发现,获得的BMSCs能成功地分化为成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞。
  本研究通过将ICR小鼠皮下注射芥子气的方法建立了芥子气染毒的动物模型,将培养扩增鉴定后的BMSCs通过尾静脉注射从而进行下一步实验研究。首先通过小动物活体成像的方法明确了BMSCs在芥子气染毒小鼠模型中的定位,发现其主要聚集于双侧肺脏,其中1h和2h荧光强度明显升高,至24h仍有一定的荧光信号,明确了BMSCs可以作用于芥子气损伤后的主要靶器官-肺脏。
  二、BMSCs对芥子气中毒小鼠肺损伤修复的作用及机制研究
  本课题组前期研究发现,BMSCs治疗能显著降低芥子气中毒小鼠肺湿/干重比和肺泡灌洗液中总蛋白浓度。为进一步观察损伤修复在BMSCs治疗芥子气肺损伤中的作用,通过ELISA法检测了肺组织内生长因子的变化,结果显示BMSCs治疗后可以显著提高芥子气中毒小鼠肺组织内EGF、FGF、PDGF的表达。Ki-67染色结果显示,BMSCs治疗后小鼠肺组织内Ki-67阳性细胞比例与芥子气组相比显著升高。此外,还发现芥子气损伤后,肺组织内Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮细胞表面标志蛋白AQP5、SP-C及细胞连接蛋白VE-cadherin、Occludin、Claudin-5、ZO-1、Caveolin-1均不同程度降低,而BMSCs治疗后AQP5、SP-C、VE-cadherin、Occludin、Claudin-5、ZO-1、Caveolin-1的表达均显著提高。以上结果提示,BMSCs能通过分泌生长因子、促进受损的肺泡上皮细胞增殖、促进上皮细胞连接的修复及分化成为肺泡上皮细胞等多种途径促进受损肺上皮的修复,从而减轻肺水肿、改善肺功能。
  前期研究中发现BMSCs能显著改善芥子气中毒小鼠生存率的变化,本研究中进一步检测了BMSCs对于芥子气中毒小鼠肺功能的影响。结果表明,芥子气中毒后,小鼠最大呼气流速、最大吸气流速、每分钟通气量以及50%肺容积呼气流速与正常组相比明显降低,给予BMSCs治疗后上述指标出现升高,提示BMSCs治疗能在一定程度上改善芥子气中毒小鼠的肺功能。
  三、BMSCs对芥子气中毒小鼠免疫调节的作用及机制研究
  本课题组前期研究发现,BMSCs能通过减少趋化因子的产生从而显著降低芥子气中毒小鼠肺组织内巨噬细胞、T淋巴细胞等炎细胞的浸润,因此本研究进一步考察了其对于巨噬细胞及T淋巴细胞分型的变化。结果发现,与芥子气组相比较,BMSCs可以显著降低促炎性M1型巨噬细胞及Th17细胞的表达,升高抗炎性M2型巨噬细胞及Treg细胞的表达。提示BMSCs能通过调节免疫细胞的分型从而减轻芥子气所致肺损伤。
  为进一步考察免疫调节在BMSCs治疗芥子气肺损伤中的作用,检测了小鼠肺组织及细胞模型中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17等促炎因子及IL-10、TGF-β等抗炎因子的表达。结果发现,与芥子气组比较,BMSCs可以显著降低肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17的表达量,升高IL-10、TGF-β的表达量。在芥子气染毒的小鼠巨噬细胞(Raw264.7)及脾淋巴细胞模型中,将其与BMSCs共培养后同样可以显著降低培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-17的表达量,升高IL-10、TGF-β的表达量。提示BMSCs能通过降低促炎因子、升高抗炎因子减轻体内炎症反应。
  进一步在动物及细胞水平上探宄了可能在BMSCs减轻芥子气损伤中发挥作用的信号通路。结果发现,与正常组相比较,芥子气染毒后小鼠肺组织内TLR4及其及其下游NF-κB p65、p50的表达量明显增高,给予BMSCs治疗可明显降低TLR4、NF-κB p65、p50的表达。在Raw264.7细胞模型中,TLR4、NF-κβp65、p50的表达量同样出现升高,给予BMSCs Transwell共培养、敲除巨噬细胞内TLR4受体或给予TLR4抑制剂TAK242后,TLR4、NF-κβp65、p50的表达量均显著降低。提示TLR4信号通路可能在BMSCs调节芥子气肺损伤的过程中发挥着重要作用。
[硕士论文] 沈蕾蕾
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  第一部分 隐源性机化性肺炎的CT影像学征象分析及随访预后影响因素研究
  目的:
  探讨隐源性机化性肺炎(Cryptogenic Organizing Pneumonia,COP)的CT影像学征象及其预后的影响因素。
  材料与方法:
  回顾性分析我院2012年1月至2017年6月经临床-影像-病理诊断的隐源性机化性肺炎32例(男22例,女10例,20-78岁,60±13岁),由手术或活检获得病理标本,均行胸部多排螺旋CT扫描,其中20例具有随访CT,(随访时间1-43月,中位随访时间4月),分析患者的临床表现及实验室检查,并对其初次CT图像作回顾性分析,分析内容包括病变部位、形态、性质、合并纵隔淋巴结肿大、胸水等。制定评分表,对每一个患者的CT表现进行评分。治疗后及随访疗效评价分为两组,A组:病灶明显吸收好转,B组:病灶轻度吸收、无变化或进展、复发。采用Fisher检验,分析两组间患者性别、临床表现及实验室异常检查;采用t检验分析两组间患者年龄;采用Mann-whitney U检验,分析两组间不同征象评分和从出现症状到确诊时间。
  结果:
  病灶主要表现为实变影(18/32,56.25%)、磨玻璃密度影(21/32,65.63%)、结节影(18/32,56.25%)、肿块(12/32,37.50%)、线条影(23/32,71.88%)。20例治疗后随访的患者中,A组:13例,病灶明显吸收,仅残留少许磨玻璃影和/或纤维灶;B组:7例,病灶轻度吸收(n=5),病灶无明显变化或进展(n=0)、病变复发(n=2)。两组间性别、年龄、临床表现、实验室异常检查、不同征象的评分统计无明显差异(p>0.05)。两组患者从出现症状到确诊时间有明显差异(p<0.05)。
  结论:
  COP影像学表现多样,以磨玻璃密度影及实变影为主。糖皮质激素治疗预后与患者初次影像学表现无关,但与从出现症状到确诊时间有关,因此需及时诊断,及时治疗。
  第二部分 隐源性机化性肺炎的影像-病理对照分析研究
  目的:
  探讨隐源性机化性肺炎(Cryptogenic Organizing Pneumonia,COP)的CT影像学表现与病理表现的对照及获取病理标本的方式,加深对本病的认识。
  材料与方法:
  回顾性分析我院2012年1月至2017年6月经临床-影像-病理诊断的隐源性机化性肺炎32例(男22例,女10例,20-78岁,60±13岁),经手术(n=10)、CT引导下穿刺活检(n=20)及支气管镜活检(n=2)获得病理标本,对所有标本进行切片、染色、观察。分析相应的取标本病变处的影像学表现,并与标本病理切片光镜下表现做对照性分析。
  结果:
  获取病理组织对应的影像学表现为实变影13例,磨玻璃影1例,实变及磨玻璃影2例,结节影5例,肿块影11例。实变影、肿块及结节影对应典型的COP的病理表现,肺泡腔及肺泡管内充满由成纤维细胞组成的肉芽组织(Masson小体),部分可通过肺泡孔通向邻近肺泡腔,呈“蝴蝶征”;结节或肿块影中可出现坏死组织;磨玻璃病变对应的病理表现为肺泡间隔增宽,少量炎性细胞浸润,肺泡Ⅱ上皮细胞增生,个别肺泡腔内见团块状肉芽组织。
  结论:
  COP影像学多表现为实变影、磨玻璃影、结节影、结节影、肿块影及条带状影,影像-病理对照性分析可以加深其理解。CT引导下穿刺活检病理组织可满足临床诊断,但获取组织块小,不能反映病灶影像特征的全貌,做影像-病理对照研究采用手术获得标本更好。
  第三部分 隐源性机化性肺炎孤立肿块型的临床、影像及病理分析研究
  目的:
  探讨隐源性机化性肺炎孤立肿块型的临床、影像及病理学特征,提高诊断水平。
  材料与方法:
  回顾性分析我院2012年1月至2017年6月收集的孤立性肿块型(d≥3cm)的隐源性机化性肺炎10例(男8例,女2例,52-78岁,62±7岁)的临床、影像及病理资料。经手术(n=5)、CT引导下穿刺活检(n=5)获得病理标本,对所有标本进行切片、染色、观察。分析患者的临床症状、体征、实验室检查、病变的部位、大小、形态、边缘特征、内部结构、周围结构、伴随征象。
  结果:
  10例患者均有咳嗽咳痰症状,其中7例伴少量咯血。CT可见肿块均邻近胸膜(直径3.2-6.1cm,4.2±0.7cm),病灶分布左肺上叶(4例,40%)居多;6例病灶密度不均,其中4例肿块内见空洞;4例胸膜凹陷;7例纵隔淋巴结肿大。病理光镜下均可见肺泡腔内见团块状或长条状肉芽组织,其中4例病灶间质内局灶性淋巴细胞明显增多。
  结论:
  通过总结隐源性机化性肺炎孤立肿块型的临床-影像-病理特点,其影像可充分反映本病的病理特征,即表现出炎症特性和机化特性,再结合患者临床无明显病因,可及时正确诊断大部分孤立肿块型COP。
[硕士论文] 张迪
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文从以下三部分进行了阐述:
  第一部分:慢性阻塞性肺疾病大鼠动物模型的建立与评价
  目的:使用烟熏、蛋白酶滴注及两者相结合的方法成功构建大鼠COPD模型,并从炎症水平,影像及病理多方面对模型进行评价。
  方法:使用烟熏、蛋白酶滴注及两者相结合的方法进行COPD大鼠造模,每组大鼠分别为60只、30只、30只。同时设置对照组20只。每周对大鼠进行体重测量。烟熏组及对照组于造模24h,1、2、4、8、12、16、20、24周各处理大鼠5只及2只,蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组于造模24h,1、2、4、8、12周处理大鼠各5只。所处理大鼠分别接受细胞因子检测、Micro-CT检查及病理检查。
  结果:第7周起烟熏组大鼠及蛋白酶+烟熏组大鼠体重增长较对照组明显减缓(P<0.05)。蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组大鼠24h、1、2、4周IL-10水平显著低于对照组(P<0.05)。蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组第24h的MMP-9浓度显著大于对照组(P<0.05)。蛋白酶组、蛋白酶+烟熏组第4周及烟熏组第8周在Micro-CT图像及病理图像上均可观察到肺气肿改变。
  结论:使用烟熏、蛋白酶及蛋白酶+烟熏的方法均可成功构建大鼠COPD模型。Micro-CT可灵敏真实的反应肺部病理改变。
  第二部分:COPD大鼠模型肺气肿及气道重塑的Micro-CT定量分析
  目的:使用Micro-CT对COPD大鼠肺气肿及气道相关参数进行定量测量,以分析COPD动态变化过程。
  方法:纳入正常对照组8只,烟熏组9只,蛋白酶组9只。对照组分4周、8周、12周、24周四个时间点进行Micro-CT检查及病理检测,烟熏组及蛋白酶组分别分4周、12周、24周及4周、8周、12周三个时间点进行Micro-CT检查及病理检测。Micro-CT定量参数选择肺密度,空气体积占总肺体积的百分比(LAA%-928),支气管腔直径及管壁厚度。病理定量参数选择(气管面积-管腔面积)/气管面积(MA%),管壁厚度/气管外半径(MT%),平均肺泡面积及平均内衬间隔。
  结果:12周烟熏组及蛋白酶组肺密度均明显低于对照组(P<0.001,P<0.001),LAA%-928均明显高于对照组(P=0.031,P=0.013)。24周烟熏组肺密度明显低于对照组(P=0.001),LAA%-928明显高于对照组(P=0.028)。烟熏组12周4级支气管及24周3、4级支气管管壁均较对照组显著增厚(P=0.04,P=0.033,P=0.008)。肺密度与平均肺泡面积、平均内存间隔存在明显负相关性(P=0.001,R=-0.838; P=0.043,R=-0.592)。LAA%-928与平均肺泡面积、平均内存间隔存在明显正相关性(P<0.001,R=0.926; P=0.029,R=0.629)。Micro-CT所测支气管壁厚度与MT%存在明显正相关性(P=0.026,R=0.638)。
  结论:Micro-CT测量结果可以评价大鼠肺结构改变。COPD大鼠12周即开始出现肺气肿及支气管重塑改变。
  第三部分:吸烟者MDCT双呼吸相肺气肿、空气潴留定量分析及与肺功能的相关性研究
  目的:定量分析无症状吸烟者在多排螺旋CT(MDCT)呼吸双相扫描下肺气肿及空气潴留(AT),并探讨其与肺功能的相关性。
  方法:纳入72例吸烟者,根据肺功能检查结果分为吸烟COPD组(24例)和吸烟非COPD组(48例),另纳入39例不吸烟且肺功能正常的人群作为对照组。所有受试者均接受MDCT呼吸双相扫描和肺功能检查。CT肺气肿定量参数包括:深吸气末阈值-950Hu以下低衰减区占全肺体积的百分比(LAA%-950)、深吸气末全肺像素CT值直方图上第15百分位点对应的CT值(P15-IN),深呼气末全肺像素CT值直方图上第15百分位点对应的CT值(P15-EX)、呼吸相对容积改变(Relative Volume Change,RVC)及平均肺密度呼吸比值(E/IMLD)。肺功能参数包括:第一秒用力呼气容积实测值占预计值百分比(FEV1%)、FEV1与用力肺活量的比值(FEV1/FVC)、残气量与肺总量比值(RV/TLC)及单位肺泡容积一氧化碳弥散量(DLCO/VA)。运用单因素方差分析或Kruskal-Wallis H检验比较三组间CT定量参数、肺功能指标的差异,采用Spearman相关分析评价CT定量参数与肺功能指标的相关性。
  结果:三组间肺气肿参数LAA%-950、P15-IN差异均有统计学意义(p<0.05);肺功能参数FEV1%、FEV1/FVC、DLCO/VA、RV/TLC差异亦均有统计学意义(p<0.05)。不吸烟对照组的LAA%-950与FEV1/FVC、DLCO/VA(r=-0.32,P=0.04;r=-0.69,p=0.00),P15-IN与FEV1%(r=-0.14,p=0.02)均存在负相关性;P15-IN与DLCO/VA(r=0.55,p=0.00)存在正相关性。吸烟非COPD组的LAA%-950与FEV1/FVC、DLCO/VA(r=-0.31,p=0.04; r=-0.42,p=0.00)均存在负相关性;P15-IN与FEV1/FVC、DLCO/VA(r=0.33,p=0.02;r=0.30,p=0.04)均存在正相关性。吸烟COPD组的LAA%-950与DLCO/VA存在负相关性(r=-0.62,p=0.00),与RV/TLC存在正相关性(r=0.59,p=0.00);P15-IN与DLCO/VA存在正相关性(r=0.53,p=0.01)。
  结论:MDCT呼吸双相扫描能有效评价吸烟者肺气肿及空气潴留的改变,且LAA%-950及P15-IN指标能更敏感评价吸烟者肺功能改变。
[硕士论文] 丁银锋
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  回顾性分析肺移植术后中心气道狭窄患者的临床资料,分析其临床特征,评价可弯曲支气管镜介导下介入治疗中心气道狭窄的疗效及安全性。
  研究方法:
  收集上海长海医院呼吸内镜介入诊疗中心2011年1月~2016年12月期间,因中心气道狭窄而接受介入治疗的26例肺移植术后患者临床资料,分析其临床特征。应用可弯曲支气管镜介导下以球囊扩张为基础,单一或联合冷冻、激光、暂时性金属支架置入的方法,治疗中心气道狭窄。观察单次球囊扩张气道成形术和金属支架置入前后气道阻塞症状、气道开通、FEV1改善情况,评价即时疗效。观察治疗前后狭窄段内径、气促评分、FEV1、6MWD、BODE指数的变化,评价综合疗效。随访术后6月因气道阻塞症状或气道再狭窄的介入干预情况,评价远期疗效。观察并发症情况,评价介入治疗的安全性。统计学方法:计量资料以均数±标准差((x)±s)或中位数(四分位数间距)表示。介入治疗前后的比较,采用配对资料的t检验或Wilcoxon符号秩检验。
  研究结果:
  1、一般特征:2011年1月~2016年12月长海医院呼吸科诊治的肺移植术后中心气道狭窄患者26例,男性16例,女性10例,年龄14~70岁,平均年龄(47±15)岁。原发性疾病中COPD8例,IPF8例,IPAH5例,骨髓移植术后闭塞性细支气管炎2例,弥漫性支气管扩张1例,肺多发性囊化1例,肺淋巴管平滑肌瘤病1例。双肺移植15例,左肺移植6例,右肺移植5例,吻合口均为端端间断缝合。
  2、支气管镜下表现:局限吻合口狭窄10例,吻合口至中间段、左主支气管末端狭窄5例,吻合口和叶、段支气管狭窄8例,中间段及远端支气管狭窄3例。在治疗前,镜下表现疤痕组织5例,炎症/肉芽组织14例,缺血/坏死7例;固定性狭窄33-66%有8例,固定性狭窄>66%有18例;无吻合口开裂;未见黏膜坏死19例,黏膜脱落6例,吻合口2cm以内管壁坏死1例。介入治疗后,镜下表现疤痕组织11例,炎症/肉芽组织13例,缺血/坏死2例;固定性狭窄33-66%有17例,固定性狭窄>66%有9例;无吻合口开裂。24例未见黏膜坏死,2例黏膜脱落,无管壁坏死。
  3、介入治疗方法应用:26例患者均以球囊扩张为基础,采用单一球囊扩张治疗6例(23.1%),联合冷冻或激光治疗20例(76.9%),7例(26.9%)患者因多种介入方法治疗欠佳接受暂时性金属支架置入治疗,在支架留置28~67天后取出。共进行腔内介入治疗227例次,包括球囊扩张治疗157例次,冷冻治疗34例次,激光治疗22例次,暂时性金属支架置入、取出术各7例次。
  4、介入治疗的即时疗效:157例次球囊扩张气道成形术,气道疏通、阻塞症状改善有136例次,即时治疗有效率86.6%。7例难治性狭窄给予暂时性金属支架置入,置入后气道管腔保持通畅、气促症状改善,FEV1由置入前(1.20±0.24)L增加至(1.71±0.20)L,平均提高45%,即时治疗有效率100%。
  5、术后气道直径、气促评分、FEV1、6MWD和BODE指数改善情况:介入治疗前后,狭窄段内径由治疗前2.5(1.0)mm增加至7.0(2.0)mm(P<0.01),气促评分由治疗前3.0(1.0)降至2.0(1.3)(P<0.01)。FEV1由治疗前(1.41±0.28)L增加至(1.73±0.30)L(P<0.01),6MWD由治疗前(316.50±69.04)m增加至(368.65±57.38)m(P<0.01),BODE指数由(4.65±1.77)降至(3.08±1.62)(P<0.01)。术后气道再通、气促改善、FEV1增加和运动耐力提高均具有显著统计学意义。
  6、远期疗效:除外2例因肺部感染死亡的病例,24例完成术后6月的随访。患者发生再狭窄的程度因人而异,6例(25.0%)无需介入干预,11例(45.8%)接受1~2次气道再通介入手术,7例(29.2%)需接受3次以上介入手术以维持气道通畅。接受金属支架治疗的6例患者,置入前6月内共接受介入手术33例次,取出后6月内接受介入手术10例次,介入干预次数减少23例次。
  7、球囊扩张术中并发症轻微,62例次胸骨后隐痛、48例次一过性低氧血症、22例次管壁出血均自行缓解或仅简单处理;激光治疗中2例次低氧血症简单处理后恢复;冷冻治疗未见并发症;金属支架置入术未见并发症,留置期间出现3例肉芽增生、1例组织坏死,在清理和支架取出后好转,7例次支架取出术中的出血经局部灌注凝血酶后停止。
  研究结论:
  1、经支气管镜球囊扩张气道成形术操作简便、安全,治疗肺移植术后中心气道狭窄即时疗效明确,单一或联合冷冻、激光及支架置入治疗,能显著疏通气道、改善气促症状、增加肺功能、提高运动耐力,部分可获得稳定的远期疗效,对于气道再狭窄的维持治疗大多依然有效。球囊扩张气道成形术应作为肺移植术后中心气道狭窄的起始和基础治疗。
  2、对球囊扩张治疗欠佳的难治性气道狭窄,有选择的应用暂时性金属支架置入治疗能获得理想的即时疗效,同时减少远期介入干预,有助于气道狭窄的长期稳定。短期应用气道金属支架仍存在严重并发症的风险,应注意密切随访。
[硕士论文] 朱邦晖
外科学(烧伤) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由肺内或肺外因素引起的,以顽固性低氧血症为显著特征的临床综合征。ARDS在烧伤创伤等重症ICU患者中发生率高,死亡率高,救治难度大,是临床面临的普遍难题,也是临床和基础研究的热点话题。
  基础研究发现,ARDS发病机制是全身失衡的炎症反应介导的肺实质性损伤,其中炎症因子尤其是炎症因子的级联放大效应发挥了重要作用。ARDS发生过程中产生的炎症因子,部分可成为独立损伤因素,参与ARDS的发生发展。
  CD74是细胞膜上一种由232个氨基酸组成的单次跨膜受体蛋白,膜上CD74能够和巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)相互结合参与ARDS的发生发展。膜上CD74蛋白分为三段结构,其中1-46位氨基酸位于细胞膜内,47-72位氨基酸是跨膜序列,73-232位氨基酸位于细胞膜外被称为膜外段。
  可溶型CD74分子(soluble CD74,sCD74)是CD74分子的细胞膜外段。2014年耶鲁大学的Richard Bucala教授团队在自身免疫性肝病中首次报道了sCD74的存在,初步证实了sCD74在免疫疾病中的重要作用。Kim团队也发现了非存活的烧伤患者的血清中,sCD74在烧伤后12h时含量较低,但24h后开始逐渐升高。
  我们实验团队前期对sCD74做了部分研究,发现在ARDS小鼠模型中,小鼠外周血清和肺泡灌洗液中均存在sCD74,并且sCD74的含量和ARDS的严重程度成正相关。此外,小鼠肺泡灌洗液中sCD74含量和炎症因子TNF-α、IL-6含量呈正向回归关系。在临床研究中发现,ARDS患者早期血清中sCD74水平显著升高,并且升高的sCD74和ARDS患者不良预后密切相关。
  这些结果均提示sCD74可能参与ARDS发生和进展过程。那么其在ARDS过程中究竟扮演什么样的角色?是否和其他炎症因子一样作为独立损伤因素加重肺损伤?目前还没有相关文献报道。因此本课题分别在体内和体外证实了sCD74能促进小鼠肺组织和肺相关细胞的炎症反应,并初步探讨了其可能的机制,证实sCD74是通过激活炎症经典信号通路NF-κB来促进炎症反应的。
  第一部分:sCD74气道滴入诱发小鼠炎症反应(体内实验)
  研究目的:在动物水平探究sCD74是否促进小鼠肺组织发生炎症反应
  研究方法:通过气道滴入方式探究sCD74对小鼠肺组织的影响,根据sCD74刺激作用时间的不同分为2h、6h、8h、12h、24h组,根据sCD74刺激剂量不同分为0.01、0.1、0.5、1、2mg/kg等浓度梯度,同时加入Ig-Fc蛋白作为实验对照,在指定时间内收取小鼠外周血清、肺组织、肺泡灌洗液等标本。采用RT-PCR法检测肺组织炎症基因相对表达量;通过ELISA法检测肺泡灌洗液中炎症因子的含量;通过BCA蛋白定量法检测肺泡灌洗液中总蛋白含量;通过肺干湿比探究肺水肿程度;通过HE染色了解肺大体损伤情况;通过ELISA法检测外周血清中炎症因子含量。
  研究结果:肺组织炎症基因TNF-α、MIP-2和IL-6在0.5mg/kgsCD74气道滴入2h后分别增高2.1、3.4和2.8倍,之后炎症基因逐渐降至正常对照水平。肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α、MIP-2含量随时间变化先增高后下降,8h是炎症因子分泌的高峰点,分别为560pg/ml和107pg/ml。在浓度效应上,炎症基因相对表达量和炎症因子含量和气道滴入浓度存在依赖关系。sCD74和Ig-Fc蛋白相比在促进炎症基因的高表达和炎症因子的分泌方面都有统计学差异。气道滴入sCD74后小鼠肺泡灌洗液中总蛋白含量、肺组织干湿比和外周血清炎症因子和对照组相比均无统计学差异,肺HE染色显示无明显损伤。
  研究结论:气道滴入sCD74能够引起小鼠肺局部的炎症基因高表达和相应的炎症因子的分泌,但对于肺整体的炎性损伤作用和全身炎症反应影响较小。
  第二部分:sCD74诱导肺相关细胞发生炎症反应(体外实验)
  研究目的:在细胞水平探究sCD74是否促进肺相关细胞产生炎症反应
  研究方法:分别选用RAW264.7作为肺巨噬细胞代表,A549作为肺上皮细胞代表,HUVEC作为肺血管内皮细胞代表,在三种细胞系中探究sCD74的生物学作用。根据sCD74和细胞共孵育时间不同分为2h、8h、12h、24h组,根据和细胞共孵育sCD74浓度的不同分为10、100、1000ng/ml组,在相应的时间内收集细胞和细胞上清。采用RT-PCR法分析细胞中炎症基因的相对表达量,采用ELISA法检测细胞上清中炎症因子的分泌情况。
  研究结果:1000ng/ml sCD74刺激巨噬细胞,在2h时炎症基因TNF-a、MIP-2和IL-6相对表达量增高最明显,分别增高4.0、11.8、2.6倍,之后炎症基因逐渐降至正常对照水平。巨噬细胞上清液中炎症因子TNF-a和MIP-2含量随着刺激时间的延长和刺激浓度的增高而增加。sCD74能够在8h时刺激A549和HUVEC细胞炎症基因TNF-a和IL-6高表达,但对炎症因子的分泌无影响。
  研究结论:sCD74能够促进肺相关细胞炎症基因表达增加,同时也能刺激巨噬细胞分泌炎症因子增多。
  第三部分:sCD74调控肺炎症反应机制的探究
  研究目的:1.探究sCD74促进炎症反应的信号通路。2.sCD74细胞膜受体的初步探究。
  研究方法:1000ng/ml sCD74刺激巨噬细胞0、10、30min后分别提取胞质和胞核蛋白,采用Western Blotting检测胞质中IκB、phosphate-IκB、P65、phosphate-P65和胞核中phosphate-P65蛋白表达情况。采用BAY11-7082预处理巨噬细胞30min后,再重复上述实验,检测检测上述信号通路蛋白表达的变化。采用BAY11-7082预处理巨噬细胞30min后,1000ng/ml sCD74刺激巨噬细胞24h,用ELISA法检测细胞上清中炎症因子分泌的变化。在A549、HUVEC、HEK293、Jurkat、RBL和RAW264.7等细胞系中,采用流式细胞技术分析hsCD74和它们细胞膜的结合情况。
  研究结果:sCD74刺激巨噬细胞后,细胞质中phosphate-IκB、phosphate-P65和细胞核中phosphate-P65蛋白含量明显增多。NF-κB通路抑制剂处理后上述增高的通路蛋白又明显降低。BAY11-7082预处理巨噬细胞能够有效抑制sCD74分泌炎症因子。hsCD74能够以剂量依赖的方式和多种人源性细胞(A549、HUVEC、HEK293、Jurkat)膜结合,hsCD74不能和大鼠源性(RBL)和小鼠源性(RAW264.7)细胞膜结合。
  研究结论:sCD74能通过激活NF-κB通路促进肺炎症反应的发生。hsCD74能够和多种人源性细胞细胞膜结合。
[硕士论文] 谢芳
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症(sepsis)是指严重感染导致的全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),宿主针对感染的特异性免疫反应失调,进而可导致脓毒性休克、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),乃至引发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),是ICU患者的主要死亡原因,其发病率仍然很高。脓毒症急性呼吸窘迫综合征的病理生理学机制非常复杂,包括炎症激活、炎细胞浸润、凝血系统激活和肺上皮屏障损伤等,其中肺上皮是急性呼吸窘迫综合征时肺部防御损伤的一种重要结构。在ARDS的致病过程中,各种炎症因子、粘附分子、趋化因子和细胞因子等不断释放参与肺部炎症反应,如肿瘤坏死因子、IL-6、IL-8、IL-1家族和干扰素。肺上皮细胞能够分泌多种细胞因子调控肺的天然免疫,目前却没有关于肺上皮细胞表达能够调控肺部天然免疫的分泌蛋白。因此,对于肺上皮细胞在脓毒症急性呼吸窘迫综合征的基因表达及相关分泌蛋白的机制探讨值得研究,肺上皮细胞表达的分泌蛋白有望成为临床上治疗脓毒症的新的分子靶点。
  sectm1b基因是一种新型人类编码基因,其基因表达的蛋白为sectm1b,即跨膜与分泌蛋白1b,属于免疫球蛋白超家族。目前sectm1b基因表达调控机制以及效应并不清楚,关于sectm1b的研究也非常少。有研究认为:sectm1b可以抑制TCR介导的T细胞活化从而发挥促炎的功能。炎症反应的失衡是脓毒症所致急性呼吸窘迫综合征的主要原因。右美托咪定作为ICU临床常用的镇静药物,最近几年,因为发现其具有抗炎的作用而逐渐被大家所关注,但目前没有关于右美托咪定对脓毒症ARDS时sectm1b表达的影响及抗炎作用的研究。另外,肺上皮细胞分泌的sectm1b能够促进中性粒细胞表达和释放促炎症因子,对中性粒细胞募集到肺部感染部位具有调控作用。但是,sectm1b对脓毒症ARDS时肺上皮细胞功能的作用及其可能的机制,目前尚未见报道。
  本研究拟通过在体与离体实验,探讨肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS的影响及作用机制。首先,对脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的筛选及验证;其次,探讨肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS促炎作用及机制;最后,探讨右美托咪定对脓毒症ARDS小鼠抗炎作用及其机制的研究,同时探讨了右美托咪定在脓毒症ARDS发挥抗炎保护作用时对肺上皮细胞sectm1b表达的影响。
  第一部分 脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的筛选及验证
  目的:
  脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的基因芯片筛选与分析,在体实验和离体实验验证脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b。
  方法:
  1.取雄性C57小鼠,构建CLP所致脓毒症ARDS小鼠模型,分离CLP术后0h、6h、12h、24h的左肺组织,利用基因表达谱芯片检测CLP术后不同时间及正常对照小鼠肺上皮细胞基因表达差异。利用基因表达热图分析、genecard软件分析及查阅文献重点分析细胞因子与趋化因子等分泌性蛋白的表达。
  2.取约8周龄雄性C57小鼠,随机分为四组,分别为:CLP术后0h、CLP术后6h、CLP术后12h、CLP术后24h。
  a.取每组小鼠肺组织,左肺组织行HE染色,并进行病理学评分;右肺组织提取mRNA,采取RT-PCR技术检测sectm1b mRNA的表达情况。
  b.取每组小鼠支气管肺泡灌洗液,采用ELISA法检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平及流式细胞术进行中性粒细胞计数。
  c.于每组小鼠行眼球取血,离心后取血清,采用ELISA法检测IL-6、IL-1β、TNF-α的表达情况。
  3.用LPS刺激小鼠肺上皮细胞MLE12,于LPS诱导后0h、6h、12h、24h提取mRNA,利用RT-PCR检测肺上皮细胞sectm1b mRNA的表达,同时收集上清,采用ELISA检测上清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。
  结果:
  1.脓毒症ARDS小鼠肺组织中基因表达差异显著,其中sectm1b在CLP术后12h表达显著增高,24h表达下降。
  2.
  a.HE染色结果显示:CLP术后小鼠肺组织病理损伤明显加重,且术后12h损伤程度强于24h,病理学评分增高(P<0.05)。sectm1b mRNA表达差异显著(12小时大于正常约30倍)(P<0.05)。
  b.ELISA结果显示:与正常对照比较,肺泡灌洗液和血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显升高(P<0.05)。CLP术后中性粒细胞计数明显增多(P<0.05)。
  3.与正常相比,脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞sectm1b表达增高(P<0.05),上清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。
  结论:
  脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b,脓毒症ARDS小鼠在体实验模型与离体实验模型建立成功,为后续的在体和离体实验提供了可靠的实验基础。
  第二部分 肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS促炎作用及机制探讨
  目的:
  研究sectm1b对LPS诱导的肺上皮细胞在脓毒症ARDS炎症反应中的作用及其机制探讨。
  方法:
  采用siRNA转染技术沉默sectm1b基因的表达,研究在LPS诱导的肺上皮细胞MLE12在沉默sectm1b时对脓毒症ARDS炎症反应的作用及其机制。实验分为:NCsiRNA组和sectm1b siRNA组,转染48小时后,分别用LPS刺激,提取LPS刺激后不同时间点的细胞总mRNA、蛋白、上清。用RT-PCR技术检测sectm1b、IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的表达,用ELISA技术检测IL-6、IL-1β、TNF-α水平,利用western-blot方法检测炎症相关信号通路(NF-κβ/MAPK)相关分子的表达。
  结果:
  1.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导12h后,RT-PCR显示sectm1b siRNA组sectm1b的mRNA表达水平明显低于NC-siRNA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
  2.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导6h、12h、24h后,sectm1b siRNA组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平较NC siRNA组降低(P<0.05),同时ELISA结果显示sectm1b siRNA组上清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平较NCsiRNA组降低(P<0.05)。
  3.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导12h后,与NC siRNA组相比,sectm1bsiRNA组的p65/p38/erk磷酸化表达水平下降(P<0.05)。
  结论:
  肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS具有促炎作用,其促炎作用可能与NF-κβ/MAPK信号通路的激活有关,表明sectm1b在脓毒症肺上皮细胞的损伤具有重要作用。
  第三部分 右美托咪定对脓毒症小鼠肺上皮细胞sectm1b表达的影响及保护作用研究
  目的:
  探讨右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)在脓毒症小鼠肺上皮细胞炎症反应中的作用及其对sectm1b表达的影响。
  方法:
  将C57小鼠随机分为3组:CLP组、CLP+Dex组、Sham组。给药组在小鼠CLP术前15min腹腔注射右美托咪定(50ug/Kg),CLP组小鼠在术前15min腹腔注射等体积的无菌生理盐水。收集每组CLP术后0h,6h,12h,24h的血清和肺泡灌洗液(BALF),用酶联免疫吸附试验检测血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,记录24h内小鼠的存活率。体外培养传代小鼠肺上皮细胞MLE12,分为空白对照组(未进行任何处理)、脂多糖组(LPS,1ug/ml)、脂多糖+右美托咪定组(LPS,1ug/ml+Dex,0.2ug/ml),RT-PCR检测总细胞中sectm1b mRNA的表达,酶联免疫吸附实验检测上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,蛋白质印迹实验检测ERK1/2和JNK磷酸化水平。
  结果:
  1.与CLP组相比,右美托咪定组脓毒症小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达下降,小鼠24h内的存活率上升(P<0.05)。
  2.与脂多糖组相比,右美托咪定组上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达减少,并且ERK1/2和JNK的磷酸化水平下降(P<0.05)。
  3.与脂多糖组相比,右美托咪定组肺上皮细胞sectm1b mRNA的表达下降(P<0.05)。
  结论:
  右美托咪定能够影响脓毒症小鼠肺上皮细胞sectm1b的表达,同时能够减少脓毒症小鼠血清和肺泡灌洗液中炎症因子的产生,提高脓毒症小鼠24h内的存活率,对小鼠肺上皮细胞炎症反应发挥保护作用,且右美托咪定的这种作用可能与抑制ERK1/2和JNK的激活有关。
[硕士论文] 刘健
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  社区获得性肺炎(Community acquired pneumonia,CAP)在全球范围内均具有较高的发病率及病死率,且随着年龄的增加而升高。为加强对CAP诊断和治疗的规范化管理,2006年中华医学会呼吸病学分会感染学组制定了社区获得性肺炎诊断和治疗指南。历经10年,国内CAP的病原谱分布及其耐药特点发生了变化,同时出现了新的抗菌药物及诊疗技术手段。中华医学会呼吸病学分会感染学组结合国内外最新研究成果,对CAP指南进行修订,发布了“中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)”(简称新版指南)。为配合我国成人CAP新版指南推广,了解上海地区各级医院医师以及呼吸与非呼吸专科医师对CAP诊断和治疗的认知现况并与指南推荐意见相比较,为指南的深度推广提供方向和依据。
  方法:
  根据CAP诊断和治疗过程中的常见问题设计问卷,问题主要涉及被调查者的人口特征和对CAP诊断和治疗的认知,包括病原的分布特点与耐药性、诊断标准与病原学诊断方法、严重程度的判断及收入院或重症监护病房的标准、经验性抗菌药物的选择和治疗后评价、对新版指南的认识与运用等。在新指南推广培训前告知参会医师通过微信二维码扫描进入电子问卷进行网上作答并对结果进行汇总分析。
  结果:
  共收到有效问卷1254份,其中三级、二级和一级医院的医师分别占46.1%(578人)、26.4%(331人)和27.5%(345人);呼吸专科医师占31.4%(394人),其他相关专业(含急诊科、ICU、感染科、全科、其他内科、外科)占68.6%(860人)。在诊断时78.1%(979/1254人)的医师对超过半数的CAP患者行胸部CT检查,二三级医院的医师及呼吸专科医师进行胸部CT检查的比例更高;60.3%(756/1254人)的被调查者采用CURB-65评分评估CAP患者病情的严重程度,“呼吸衰竭、需要机械通气”及“感染性休克”是收入重症监护病房(Intensive Care Unit,ICU)最常用的标准。CAP前5位的病原微生物依次为肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌和肺炎衣原体;重症肺炎血培养送检率普遍较低,且各级医院送检率比较差异无统计学意义(x2=1.211,P>0.05)。针对非重症CAP的抗菌药物治疗多选择单药,重症CAP中最常用的单药方案是三/四代头孢菌素;联合用药时三级医院最多选用“碳青酶烯类和万古霉素”,一二级医院为“β-内酰胺类和大环内酯类”,专科医师最多为“β-内酰胺类和喹酮诺类”,非专科医师最多为“β-内酰胺类和大环内酯类”;在更换抗菌药物的标准中,有76.6%(961/1254人)的医师认同影像学出现新的阴影时需调整抗菌药物,一级医院及非专科医师更多将“影像学肺部阴影完全吸收”作为停用抗菌药物和出院的指征,将“体温大于39℃,一般退热药物无效”、“大片实变影”、“多叶段肺炎”等作为糖皮质激素应用的指征;建议患者接种肺炎链球菌或流感疫苗的比例在二三级医院中为59.8%(198/331人),58.1%(336/578人)和61.6%(204/331人),58.3%(337/578人),均明显低于一级医院的74.8%(258/345人)和75.1%(259/345人),差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  目前在CAP诊治过程中存在胸部CT检查使用过度,重症肺炎血培养送检率低,糖皮质激素应用指征过于宽泛等问题。尽管我国已于2006年出版了首部成人CAP诊断和治疗指南,但目前上海地区医师对CAP诊治的认知与指南推荐尚有不少差距,中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)的推广尤显重要,需要在各级医院尤其是广大基层医院中加大普及力度,进一步规范CAP的诊断和治疗。
[博士论文] 高伟
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目前我国的哮喘患者有3千万左右,2010年的CARE研究中,中国8个省市14岁以上调查人群的患病率为1.24%,受全球工业化和城市化的进程、环境污染及气候变化等因素的影响,哮喘患病率有增加的趋势。
  哮喘是一种慢性呼吸道疾病,需要长期用药控制,疾病负担既表现为劳动力丧失导致的社会经济负担增加,也表现为对卫生资源的消耗。因此,研究哮喘发病机制的广度和深度不断增加,对与预防和治疗支气管哮喘有很重要的现实意义。
  miRNA是一种内源性的单链小分子RNA,长度约为20-25个核苷酸,不编码蛋白质,在体内成熟后,通过结合RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)在转录后水平调控基因表达。miRNA通过靶向mRNA发挥转录后基因调控作用。miRNA参与各种基本生物学过程,miRNA失调可导致机体的病理状态。miRNA在肺部发育及肺部疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化和肺动脉高压中的作用近年来也逐渐开始有研究涉及。
  炎症反应是哮喘发展中的重要病理过程,miRNA通过靶向免疫受体和细胞因子参与调节免疫应答和炎症。在不断的深入研究中,miRNA在哮喘中的作用及机制越来越为人们所了解,有可能在将来成为哮喘诊断和预后评估的辅助手段以及治疗的新靶点,为哮喘诊治带来新的希望。
  目的:
  筛选哮喘发病及沙美特罗药物治疗相关miRNA,探讨其在哮喘临床诊治中的作用。
  方法:
  1、构建急性哮喘小鼠模型,利用miRNA芯片检测其肺组织miRNA表达谱,进行生物信息学分析,通过聚类分析、靶基因预测、GO和Pathway分析,筛选出疾病相关miRNA,并通过RT-PCR法验证明显表达差异的miRNA。收集对照组和哮喘组患者血清,通过RT-PCR检测外周血miRNA表达水平。
  2、在筛选出与哮喘密切相关的miRNA后,复制急性哮喘小鼠模型,采用沙美特罗药物干预,评估模型综合状况,然后,利用miRNA芯片技术分析药物干预对miRNA表达谱的变化的影响,进行芯片表达谱差异分析和趋势分析,筛选出与沙美特罗药物治疗相关的miRNA;并通过细胞功能实验验证其调控作用。
  结果:
  1、建立急性哮喘小鼠模型,从一般状况观察、肺功能气道反应性测定、病理学炎症改变、粘液分泌状况、灌洗液细胞分类检测以及血清和灌洗液IgE含量检测方面全面评估了模型构建情况,确认模型构建成功。
  2、哮喘模型组与对照组间有854个差异miRNA,其中155个有显著差异,差异倍数≥2的miRNA有48个,其中下调最明显的是miR-208a-5p,下调6.41倍。通过TargetScan、miRanda两个数据库进行交集,预测候选靶基因8689个,优化靶基因范围至940个,进行GO及KEGG分析,得到118条基因注释和43条信号通路,参与调节细胞因子调节网络、趋化因子信号通路、炎症细胞跨内皮转运、细胞粘附、内皮组织增生、血管平滑肌收缩等生物过程,其中大部分都与哮喘疾病的发生、发展过程相关。接下来对6个表达差异显著的miRNA进行验证,结果表明miR-208a-5p、miR-133a-3p、miR-486-3p、miR-193b-3p、miR-205-5p的表达差异与miRNA芯片数据一致,miR-92a-2-5p在模型组型组较对照组有上调趋势,与芯片数据趋势一致,证实了芯片数据的可靠性。
  3、检测哮喘患者的外周血清中miR-208a-5p、miR-133a-3p二者表达水平,结果表明两个miRNA在临床标本中异常下调表达,有望作为哮喘临床诊断的辅助指标。
  4、对沙美特罗药物干预后的哮喘模型小鼠miRNA芯片表达谱分析,通过筛选差异基因及趋势分析,我们发现,与哮喘组异常表达的miRNA相比,沙美特罗药物干预后有233个miRNA的表达发生逆转,分析表达差异倍数为1.5,P<0.05,得到3个用药相关miRNA:miR-1291、miR-205-5p、miR-142-5p,行RT-PCR检测,验证其中两个miRNA即miR-1291和miR-205-5p在哮喘小鼠肺组织中表达水平下降,在沙美特罗药物干预组中表达水平增加,接近对照组,表明miR-1291、miR-205-5p参与了沙美特罗治疗哮喘的病理生理过程。
  5、应用屋尘螨(Der p2)刺激气道上皮细胞,结果发现,应用miR-1291mimics可以增加Der p2刺激后的气道上皮细胞内的miR-1291的含量,并抑制黏液的合成。
  结论:
  1、成功复制急性哮喘模型,而沙美特罗对其进行有效干预。
  2、成功建立急性哮喘小鼠模型miRNA表达谱,并通过生物信息学分析,发现哮喘模型差异表达的miRNA参与了哮喘发病的多个重要生物学过程,影响其中多条重要信号通路,在哮喘的发生发展中可能起到重要调控作用。
  3、通过miRNA表达谱分析及RT-PCR验证,证实miR-208a-5p、miR-133a-3p、miR-486-3p、miR-193b-3p、miR-205-5p在哮喘小鼠肺组织显著差异表达。
  4、哮喘患者外周血清miR-208a-5p、miR-133a-3p表达下降,联合检测外周血清二者的表达水平,可能成为哮喘早期诊断新的辅助分子标志物。
  5、采用沙美特罗干预哮喘小鼠后,对小鼠肺组织进行miRNA芯片表达谱的差异分析,得到3个与药物干预密切相关的miRNA,并经RT-PCR检测,验证其中两个miRNA(miR-1291、miR-205-5p)在哮喘小鼠肺组织中表达水平下降,在沙美特罗药物干预组中表达水平增加,接近对照组,提示其参与沙美特罗治疗哮喘的病理生理过程。
  6、应用miR-1291mimics可以增加Der p2刺激后的气道上皮细胞内的miR-1291的含量,并抑制黏液的合成。表明miR-1291可以负向调节哮喘气道上皮细胞的粘液合成。
[博士论文] 帅维正
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)是呼吸系统急症,感染、创伤、中毒是其常见病因。按原发病灶部位不同可将其分为肺内源性和肺外源性。急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)是急性肺损伤的严重阶段。ARDS是一种常见的危重症,在北美地区每年有超过15万的病例被诊断。其发病急骤、来势凶猛,以顽固性低氧血症为特征,表现为进行性加重的呼吸衰竭,并且传统的常规治疗手段难以纠正。需要更深入的研究发病机制和寻找新的治疗靶点。
  焦亡是一种新发现的炎症性的程序性细胞死亡,而在细胞焦亡的同时通常还伴随着炎症因子的高表达和机体炎症水平的上调。Gasdermin D(GSDMD)蛋白是经典细胞焦亡途径和非经典细胞焦亡途径的共同效应分子。GSDMD蛋白除了导致细胞焦亡,其还可以调控炎症因子的释放。虽然已有报道发现GSDMD的上游调控蛋白参与了脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)所致ALI/ARDS的发病过程,但目前尚无研究关注GSDMD蛋白是否参与并调控了ARDS的发生和发展。由此我们提出假设,在内毒素所致ARDS的发病机制中,GSDMD蛋白的表达与活化可能起到促进肺部病变加重的作用,如果对其进行抑制可能下调肺内炎症应激水平并且减轻肺组织的损害。
  研究方法:
  本研究拟从3部分来验证我们所提出的假设。第一部分,使用LPS通过经典和非经典途径验证小鼠肺泡巨噬细胞系(MH-S)是否可以被诱导出焦亡。对LPS焦亡诱导后的MH-S细胞,通过测定其乳酸脱氢酶(LDH)和IL-1β,荧光显微镜下观察细胞PI染色情况,细胞流式检测技术分析,RT-qPCR和蛋白免疫印迹检测焦亡相关蛋白表达等指标,来判定MH-S细胞有无焦亡发生。第二部分,观察野生MH-S细胞株(WT)和GSDMD敲低MH-S细胞株(KD)对焦亡刺激后的反应。比较两者接受LPS干预后在细胞焦亡数量和炎症因子水平的差异,以此说明GSDMD蛋白在LPS导致MH-S细胞焦亡中的作用。第三部分,分别对野生型小鼠和GSDMD基因敲除小鼠经气管滴注LPS以造成急性肺损伤,然后通过肺组织病理检查、湿/干比、肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子和GSDMD蛋白检测评价小鼠肺损伤和炎症反应状况。从体内实验的角度进一步揭示GSDMD蛋白在LPS所致ALI/ARDS过程中的作用。
  研究结果:
  MH-S细胞在接受LPS+nigericin和LPS+CTB进行刺激后,培养基上清中LDH和IL-1β表达水平明显上调(p<0.01),PI染色以及流式检测阳性细胞百分比明显升高(p<0.05)。说明LPS可以通过经典和非经典焦亡途径诱导MH-S细胞死亡。
  通过RT-qPCR和蛋白免疫印迹技术的检测,在接受焦亡刺激物处理后,MH-S细胞中分别出现caspase-1(经典途径)和caspase-11(非经典途径)mRNA表达上调(p<0.05)和GSDMD蛋白的剪切活化增强(p<0.01)。说明LPS可以介导MH-S细胞的焦亡。
  通过RNA干扰技术成功建立敲低GSDMD蛋白表达的MH-S细胞株。在接受LPS介导的焦亡刺激后,敲低细胞组细胞培养基上清中LDH、PI染色阳性细胞比例明显低于WT组(p<0.05),KD组上清中IL-β上升幅度较小(p<0.01)。
  对C57BL/6小鼠使用经气管滴注LPS的方法进行急性肺损伤造模。经检测结果发现,ARDS造模成功后,相比于野生型小鼠(WT-ARDS组),GSDMD基因敲除小鼠(KO-ARDS组)肺组织损伤病理评分、肺组织湿/干比、BALF中总蛋白水平明显较低(p<0.01),肺泡灌洗液中TF-α、IL-1β、IL-6水平明显较低(p<0.05)。
  研究结论:
  1、LPS可以介导肺泡巨噬细胞系(MH-S)的焦亡,而且这种焦亡通过经典途径和非经典途径刺激均可实现。
  2、在LPS导致的MH-S细胞焦亡过程,伴随着细胞因子IL-1β的释放。
  3、下调MH-S细胞GSDMD蛋白表达可以起到抑制LPS导致的MH-S细胞焦亡和IL-1β分泌释放的作用。
  4、经气管滴注LPS可以诱导小鼠肺内出现GSDMD蛋白表达和活化并导致焦亡。
  5、在LPS所致ALI/ARDS的小鼠模型中,GSDMD基因敲除可有助于降低肺组织中的炎症水平并减轻肺组织损伤程度。
[硕士论文] 李贺侠
病原生物学 安徽理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨PI3K/AKT信号通路在FABP疫苗特异性免疫治疗中的作用机制。
  方法:1)用分子生物学方法合成Blot序列基因片段,然后将其插入原核表达空质粒pET28a(+)中,以T4DNA连接酶构建含pET28a(+)和Blot的重组质粒pET28a(+)-Blot,采用限制性内切酶对保存于本实验室的空质粒pET28a(+)以及在本次实验中所构建的重组表达质粒pET28a(+)-Blot进行双酶切鉴定处理。2)将重组表达质粒pET28a(+)-Blo t转化入E.coli DH5a感受态细胞,进行菌落PCR、筛选阳性克隆以及测序鉴定,测序分析正确后,使用IPTG诱导目的蛋白FABP的小剂量表达,优化表达条件后再诱导目的蛋白FABP的大剂量表达和纯化,接着用SDS-PAGE和Western bloting方法对表达纯化的目的蛋白FABP进行检测验证分析,最后,采用SK3071非干扰型蛋白定量试剂盒测定目的蛋白FABP的浓度。3)以热带无爪螨粗制提取液制备哮喘小鼠模型,40只雌鼠随机分为4组:阴性对照组、哮喘组、FABP免疫治疗组和PI3K抑制剂组。其中哮喘组、FABP免疫治疗组和PI3K抑制剂组各小鼠分别在实验的第0d、7d、14d行腹腔三次注射热带无爪螨变应原粗制提取液以敏化各小鼠,并于第21d起雾化吸入激发,30min/次/天,连续7天;而阴性对照组则同时使用相等剂量的PBS对各小鼠行腹腔注射和雾化激发处理。FABP免疫治疗组和PI3K抑制剂组于第25d、26d、27d雾化前0.5h,腹腔注射疫苗FABP对各小鼠进行免疫治疗;而PI3K抑制剂组则于使用疫苗FABP对各小鼠行免疫治疗前1.5h雾化给予PI3K抑制剂LY294002;阴性对照组则同时使用相等剂量的PBS对各小鼠行腹腔注射治疗和雾化激发处理;同时阴性对照组、哮喘组、FABP免疫治疗组在治疗前用等量抑制剂溶解剂DMSO雾化处理。4)各组小鼠在末次雾化激发后24h内进行取材处理,接着对各小鼠行相关检测:ELISA法检测实验组各小鼠BALF中及脾培养上清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-10和IFN-γ细胞因子及血清中特异性抗体IgE、IgG1和IgG2a的含量,并作肺组织病理切片和BALF中细胞分类计数,最后提取肺组织蛋白行West blot检测通路信号蛋白及磷酸化(Akt、p-Akt、IκB-a和p-IκB-a)情况。
  结果:1)双酶切和测序鉴定结果说明,本实验已经成功构建了重组质粒pET28a(+)-Blot。2)SDS-PAGE和Western bloting检测结果说明本实验已经成功诱导表达并纯化了目的蛋白FABP;根据标准曲线计算出纯化的目的蛋白FABP的浓度为1.12mg/ml。3)ELISA法检测结果说明,与哮喘组进行比较,FABP免疫治疗组各小鼠BALF中和脾培养上清中IL-4、IL-5、IL-13和IL-17细胞因子的含量均下降显著,IL-I0和IFN-γ含量均升高显著,而血清中抗体IgE和IgG1的含量均下降显著,IgG2a含量升高显著,各数据间差异则具高度统计学意义(P<0.01);与FABP免疫治疗组进行比较,PI3K抑制剂组各小鼠BALF中和脾培养上清中IL-4、IL-5、IL-13和IL-17细胞因子的含量均升高显著,IL-10和IFN-γ含量均下降显著,而血清中抗体IgE和IgG1的含量均升高显著,IgG2a含量下降显著,各数据间差异则具高度统计学意义(P<0.01);PI3K抑制剂组与哮喘组进行比较,各数据间差异则不具统计学意义(P>0.05)。肺组织病理切片结果说明,与哮喘组进行比较,FABP免疫治疗组各小鼠肺部炎性症状均有很大程度上的改善,炎症细胞浸润现象也有较大程度上的减轻,各气道上皮的结构也较良好,哮喘症状明显缓解;与FABP免疫治疗组进行比较,PI3K抑制剂组各小鼠肺泡隔显著增宽,支气管管壁增厚,管壁间炎症细胞明显增多,腔内有分泌物,类似哮喘组症状。BALF中细胞计数结果说明,与哮喘组进行比较,FABP免疫治疗组各小鼠Total及EOS数均下降显著,各数据间差异则具高度统计学意义(P<0.01);与FABP免疫治疗组进行比较,PI3K抑制剂组各小鼠Total及EOS数均上升显著,各数据间差异则具高度统计学意义(P<0.01);PI3K抑制剂组与哮喘组进行比较,各数据问差异则不具统计学意义(P>0.05)。Western bloting检测肺组织信号蛋白及其磷酸化(Akt、p-Akt、IκB-a和p-IκB-a)情况结果说明,FABP免疫治疗组与哮喘组进行比较,p-Akt/Akt、p-IκB-a/β-actin的值均明显降低,IκB-a/β-actin的值则升高显著,各数据间差异则具高度统计学意义(P<0.01);PI3K抑制剂组与FABP免疫治疗组进行比较,p-Akt/Akt、p-IκB-a/β-actin的值均明显升高,IκB-a/β-actin的值则降低显著,各数据间差异则具高度统计学意义(P<0.01);PI3K抑制剂组与哮喘组进行比较,各数据间差异则不具统计学意义(P>0.05)。
  结论:成功构建了重组质粒pET-28a(+)-Blot,并完成了目的蛋白FABP的大规模原核表达和纯化;利用表达的目的蛋白FABP对热带无爪螨粗制提取液敏化的哮喘小鼠进行免疫治疗,可在很大程度上改善小鼠的哮喘症状;蛋白疫苗FABP对哮喘小鼠进行特异性免疫治疗的分子作用机理很可能是通过调节分子信号通路PI3K/AKT/NF-κB来完成的,为后续凶螨致哮喘的治疗提供新思路。
[博士论文] 程碧环
急诊医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 消退素D1对CLP诱导的脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用
  目的:研究消退素D1对CLP诱导的脓毒症小鼠的影响并探讨其可能机制
  方法:将25-30g雄性C57BL/6小鼠随机分组:假手术(Sham)组;CLP模型组,即1%戊巴比妥钠(1 mg/kg)腹腔注射麻醉后,行盲肠结扎穿孔术,同时予生理盐水补液(0.5ml/10g),保温毯复温;CLP+RvD1组,即建立CLP模型后,腹腔注入消退素D1 (100ng/mice); CLP+Alcohol组,即溶剂对照组(消退素D1溶于乙醇);消退素D1组,腹腔注射100ng消退素D1;CLP+RvD1+BOC-2组,即建立CLP模型后,腹腔注入消退素D1(100ng/mice)和消退素D1受体抑制剂BOC-2(600ng/kg);每组8只小鼠。术后24h取小鼠肺组织行HE染色,进行肺组织损伤评分观察肺组织损伤程度;取肺组织匀浆行Elisa检测炎症因子观察肺组织炎症细胞浸润情况,并检测肺组织cAMP浓度;收集腹腔灌洗液行巨噬细胞和中性粒细胞数量检测,计算巨噬细胞与中性粒细胞比值观察脓毒症损伤后小鼠免疫细胞变化;术后SPF级喂养小鼠8天,观察其存活率。
  结果:1.CLP模型的建立:小鼠盲肠结扎建立CLP模型24h后取肺组织进行HE染色,明确小鼠CLP模型是否成功。结果显示,假手术组肺组织结构清晰,上皮细胞排列整齐,肺泡腔干净、匀称,而CLP组肺组织结构破坏明显、充血、水肿,炎性细胞浸润
  2.消退素对CLP诱导脓毒症小鼠的影响:假手术组肺组织结构清晰,上皮细胞排列整齐,肺泡腔干净、匀称,而CLP组和溶剂对照组(CLP+Alcohol)肺组织结构明显破坏、充血、水肿,炎性细胞浸润。消退素D1(100ng)治疗组(CLP+RvD1)可见肺组织结构明显改善,炎症细胞减少。相较于假手术组,消退素D1组(RvD1)肺组织无明显变化。
  依据肺组织病理学改变进行肺组织损伤评分显示:相较于假手术组,CLP组、溶剂对照组(CLP+Alcohol)以及消退素D1治疗组(CLP+RvD1)损伤评分显著增高(P<0.05);相较于CLP组,CLP+RvD1和RvD1组肺组织损伤评分显著降低(P<0.05)。
  肺组织湿干重比结果显示:相较于假手术组,CLP组、溶剂对照组(CLP+Alcohol)湿干重比增加(P<0.05),提示CLP损伤后肺组织水肿;相较于CLP组,CLP+RvD1和RvD1组肺组织湿干重比减少(P<0.05);相较于溶剂对照组(CLP+Alcohol),CLP+RvD1和RvD1组肺组织湿干重比减少(P<0.05), 提示消退素D1减轻肺组织水肿。
  3.消退素D1抑制CLP诱导的炎症因子分泌:Elisa检测肺组织匀浆中炎症因子显示:相较于假手术组,CLP组、溶剂对照组(CLP+Alcohol) TNF-α、IL-1β、MPO表达量增多(P<0.05),提示CLP损伤后,炎症因子增多;相较于CLP组,CLP+RvD1和RvD1组肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、MPO表达量减少(P<0.05);相较于溶剂对照组(CLP+Alcohol),CLP+RvD1和RvD1组肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、MPO表达量减少(P<0.05),提示消退素D1通过抑制炎症因子的产生减轻肺损伤。
  结论:1.本研究通过建立小鼠CLP模型可以成功复制脓毒症继发肺损伤的病理过程。
  2.消退素D1能够通过改善肺组织病理损伤,抑制肺组织炎症因子TNF-α、IL-1β、MPO分泌,以及上调巨噬细胞与中性粒细胞比值减轻炎症反应,保护肺功能,提高小鼠生存率。
  3.消退素D1调控小鼠CLP损伤脓毒症依赖于消退素D1受体ALX。
  第二部分 消退素D1调控原代巨噬细胞和中性粒细胞促进炎症消退的机制
  目的:研究消退素D1对小鼠原代巨噬细胞和中性粒细胞的影响并探讨消退素D1通过调控免疫细胞促进炎症消退的可能机制。
  方法:分离小鼠骨髓中性粒细胞和肺泡巨噬细胞,不同剂量消退素D1 (50,100,150 nM),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS lug/ml),BOC-2(消退素D1受体抑制剂,10μM)或LY294002 (PI3K抑制剂,10μM)干预中性粒细胞,检测细胞凋亡率;干预巨噬细胞24h,将巨噬细胞与CMFDA Green标记的凋亡中性粒细胞以4∶1比例共培养90 min,流式细胞术检测吞噬率;干预巨噬细胞24 h,CD206标记M2型巨噬细胞,流式细胞术检测消退素D1对M2表型的影响。
  结果:1.消退素D1促进小鼠原代中性粒细胞凋亡:相较于空白对照组,LPS(1 μ g/ml)组和LPS+RvD1 (100nM)组中性粒细胞凋亡增强(P<0.05);相较于LPS组,LPS+RvD1组中性粒细胞凋亡增强(P<0.05)。
  2.消退素D1剂量依赖性促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞:相较于空白对照组,消退素D1剂量依赖性促进巨噬细胞吞噬凋亡中性粒细胞增强(P<0.05),且消退素D1 100 nM刺激的巨噬细胞吞噬率最强(P<0.05)。
  3.消退素D1受体和PI3K依赖性促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞:相较于正常对照组,LPS(1 μ g/ml)组巨噬细胞吞噬率下降(P<0.05);相较于LPS组,消退素D1(100nM)治疗组(LPS+RvD1)组巨噬细胞吞噬率增强(P<0.05);相较于 LPS+RvD1组,LPS+RvD1+BOC-2 (10 μ M)组和LPS+RvD1+LY (LY294002,10μ M)组巨噬细胞吞噬作用降低(P<0.05)。
  4.消退素D1促进BALF刺激的巨噬细胞的吞噬作用:相较于正常对照组,BALF刺激组巨噬细胞吞噬率降低(P<0.05),消退素D1组细胞吞噬率增高(P<0.05);相较于BALF组,巨噬细胞消退素D1治疗(RvD1+BALF)组巨噬细胞吞噬率增强(P<0.05)。
  结论:1.消退素D1通过促进中性粒细胞凋亡抑制炎症反应,促进炎症消退。
  2.消退素D1促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞及M2型巨噬细胞表达,从而促进炎症消退。
  3.消退素D1促进巨噬细胞吞噬与P-P85相关。
  第三部分 消退素D1对脓毒症患者中性粒细胞的影响及机制
  目的:研究消退素D1对脓毒症患者中性粒细胞的影响并探讨其可能机制。
  方法:抽取20例健康志愿者和40例脓毒症患者外周血,分离中性粒细胞。消退素D1预刺激中性粒细胞1h后,检测中性粒细胞趋化、凋亡、内吞(Pagocytosis)、外吞(细胞外诱捕NETs)作用,活性氧(ROS)产生,细胞表面粘附分子的表达和COX-2、NF-κB蛋白表达。探讨并比较消退素D1对健康志愿者和脓毒症患者中性粒细胞的作用及可能机制。
  结果:1.消退素D1抑制中性粒细胞趋化:志愿者组:相较于空白对照组,趋化因子IL-8和fMLP增强中性粒细胞趋化指数(Chemotactic Index)和迁移速率(Velocity) (P<0.05);相较于IL-8组,消退素D1干预组抑制IL-8诱导的中性粒细胞趋化指数(Chemotactic Index)和迁移速率(Velocity)(P <0.05);相较于fMLP组,消退素D1干预组抑制fMLP诱导的中性粒细胞趋化指数(Chemotactic Index)和迁移速率(Velocity)(P< 0.05)。
  脓毒症患者组:中性粒细胞功能异常,致使中性粒细胞在趋化因子IL-8和fMLP的作用下趋化反应不明显,细胞未发生明显迁移。
  2.消退素D1促进中性粒细胞的凋亡:相较于空白对照组,消退素D1(100nM)干预中性粒细胞4h和24h后,早期凋亡细胞(Dying)增多(P<0.05),提示消退素D1促进4h和24h健康志愿者和脓毒症患者中性粒细胞的凋亡。24h时,脓毒症患者早期凋亡细胞量少于志愿者,提示脓毒症患者24h中性粒细胞凋亡延迟,炎症反应持续存在。相较于消退素D1组,消退素D1组受体ALX抑制剂BOC-2(1uM)干预4h后中性粒细胞凋亡减少(P<0.05);而PI3K抑制剂LY294002(1uM)干预4h后中性粒细胞凋亡率无明显变化(P>0.05),提示消退素D1促进中性粒细胞凋亡依赖于消退素D1的受体。
  结论:1.消退素D1通过抑制中性粒细胞的趋化、促进细胞凋亡、增强细胞吞噬、抑制活性氧产生以及细胞表面标记分子,进而抑制炎症反应,促进炎症消退。
  2.消退素D1抑制中性粒细胞COX-2、NF-κB/P-P65的蛋白表达,提示消退素D1可通过调控NF-κB信号通路发挥炎症消退的作用。
  3.消退素D1对脓毒症患者作用强于健康志愿者,提示炎症损伤时消退素D1作用更强。
[硕士论文] 王宾宾
全科医学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  通过后纵隔炎症(posterior mediastinal inflammation,PMI)伴血肿(posterior mediastinal hematoma,PMH)这一少见病例的报道,综合国内外文献复习,以增强临床医生对后纵隔非肿瘤占位性疾病(non-neoplastic diseases,NND)的认识,提高其诊断和鉴别诊断能力,以减少误诊误治的发生。
  研究方法:
  采用回顾性研究分析,通过回顾1例后纵隔炎症伴血肿的临床病例诊疗经过,结合文献复习,收集从2007年1月至2016年12月近10年间国内外杂志公开发表的共30例有关后纵隔血肿(posterior mediastinal hematoma,PMH)的文献报道,比较、分析、整理、归纳并总结其临床特征,包括发生部位、诱因、基础疾病、起病方式、出血来源、主要检查手段、误诊疾病、处理方法和预后。
  研究结果:
  1、本病例患者经增强磁共振(enhanced magnetic resonance examination,eMRI)检查和CT引导下后纵隔肿物穿刺活检(CT guided needle biopsy,CT-GNB)证实,后纵隔占位病变为炎症伴血肿。给予积极抗炎、止血等对症治疗后,病情缓解,病灶明显缩小。近期电话回访,患者身体健康情况良好,无任何不适。
  2、综合文献报道的30例病例,归纳出后纵隔血肿特点如下:
  (1)血肿部位:明确血肿部位局限于后纵隔9例,后纵隔合并胸腔9例,后纵隔、余纵隔及胸腔5例,后纵隔及咽部5例,后纵隔及后腹膜或其他部位2例。
  (2)发病诱因:有明确诱因18例(60.0%),其中抗凝治疗者2例(6.7%),外伤史5例(16.7%),医源性操作6例(20.0%),剧烈咳嗽1例(3.3%),呕吐2例(6.7%),饮食相关2例(6.7%),重体力诱发1例(3.3%)。不明原因12例(40.0%)。
  (3)基础疾病:有心、脑、肺、肝、肾及内分泌系统慢性疾病等基础疾病者21例(70.0%),无基础疾病或基础疾病不详9例(30.0%)。
  (4)起病方式:急性起病28例,占93.3%;慢性起病2例,占6.7%。
  (5)出血来源:主动脉来源9例(30.0%),大中型静脉来源3例(10.0%),其他明确血管来源8例(26.7%),出血来源不明者10例(33.3%)。
  (6)临床症状:胸痛为首发表现的共19例,占63.3%;明显呼吸困难10例,占33.3%;咽下困难4例,占13.3%;恶心呕吐5例,占16.7%;上腹痛4例,占13.3%;以寒战发热首诊1例,占3.3%;有休克征象4例,占13.3%。
  (7)相关检查:X线或胸透检查9例,均提示纵隔增宽或扩大,或心影增大;CT或MRI检查者25例,提示纵隔血肿或动脉瘤19例,占76.0%。
  (8)误诊疾病:30例患者中,初诊被误诊者4例,包括食管穿孔、食管裂孔疝、咽后壁脓肿、恶性肿瘤各1例。最后经CT/MRI及穿刺活检证实为血肿,误诊率13.3%。
  (9)治疗手段及预后:外科手术者10人,死亡1人,死亡率10.0%;介入治疗者6人,死亡1人,死亡率16.7%;保守治疗者14例,死亡3例,死亡率21.4%。14例保守治疗的患者中,行气管插管或气管切开并机械辅助通气者7例,占50.0%。结合本病例,总死亡率为16.1%(5/31)。
  研究结论:
  1、后纵隔血肿是少见病,从2007年初到2016年年底10年间,包括本例在内,国内外仅有31例个案报道。
  2、后纵隔血肿产生的原因,可分为有明确诱因型和不明原因型,尤其需要警惕不明原因型。详细询问病史和细致体格检查,结合必要的影像学检查如MRI或CT检查,对于后纵隔血肿诊断具有重要意义。
  3、后纵隔血肿形成的机制,急性者多考虑大血管来源,慢性者多考虑小血管来源可能。本病例结合病史考虑可能为情绪激动哭泣引起胸内压急剧增加致纵隔局部小血管损伤所致。判别血肿来源,分析病因、发生发展和病程转归及预后,有助于提高该病的诊治率。
  4、胸痛是后纵隔血肿发生时最常见的临床表现,其它还包括呼吸困难、咽下困难、上腹痛等非特异性症状。起病较急者,常常病情危重,如不及时处理,发生休克致死风险极高,必须加以重视。
  5、抗凝治疗是后纵隔血肿发生的一个重要诱因,对于不明原因的胸痛,除非有临床证据高度怀疑肺栓塞,否则不建议过早预防性使用抗凝药物(anticoagulant drugs,AD),以免掩盖或加重病情。
[硕士论文] 裴志鹏
军事预防医学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:芥子气(sulfur mustard,SM)是糜烂性毒剂的典型代表,多次在各种冲突中使用,造成重大伤亡,也一直是我军面临的化学战剂威胁之一。芥子气结构简单,难防难治,易于合成,容易被恐怖分子掌握和利用,是最有可能被用于恐怖袭击的毒剂之一,也是中国面临的化学恐怖威胁之一。因此,积极探索芥子气中毒机制,开发有效的防治药物,对我军战斗力的保持、国家公共安全和中国公民健康都具有重大的战略意义。
  肺是芥子气损伤的主要靶器官,急性肺损伤是芥子气致死的主要原因之一,而氧化应激是芥子气肺损伤的起始和关键环节之一。硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)作为一种新型气体信号分子,广泛参与机体的多种生理和病理过程,具有明确的抗氧化作用。H2S可以通过抑制ROS的产生,促进GSH合成,促进Nrf2核转位等途径改善肺纤维化,肺缺血再灌注损伤和急性肺损伤。H2S对于肺部正常生理功能的维持具有重要的作用。
  本文研究发现,H2S在动物和细胞水平上都参与了芥子气致肺损伤的调节过程,可改善芥子气引起的肺氧化应激损伤;进一步研究发现,H2S可通过硫巯基化Keap1使Nrf2解离,促进Nrf2入核表达,在芥子气致肺损伤中发挥抗氧化应激调节作用。
  一、H2S对芥子气染毒小鼠肺部损伤的作用及机制研究
  芥子气染毒后,采用比率计H2S荧光探针RHP-2检测不同时间点肺组织中H2S的含量变化,结果发现,染毒后第1天开始肺组织中H2S含量开始下降,第3天与对照组有明显差异(P<0.01)。蛋白印迹法检测肺组织中H2S合成酶CBS和CSE的表达,芥子气染毒后第1天到第4天,小鼠肺组织中CBS没有明显变化,而CSE表达降低,第3天与对照组相比有明显差异(P<0.01)。
  进一步考察了内源性H2S含量变化与芥子气致小鼠肺损伤的关系,芥子气染毒小鼠给予H2S供体化合物NaHS后可升高内源性H2S含量,给予H2S合成酶抑制剂PPG则可降低内源性H2S含量。通过染毒后第3天小鼠肺组织HE染色的病理切片发现,芥子气染毒小鼠肺组织中肺泡壁增厚,间质及肺泡腔出血,炎性细胞浸润;NaHS可以改善芥子气造成的肺损伤,PPG则会加重损伤。另外,NaHS可以降低肺湿/干重比和肺泡灌洗液中的蛋白浓度,显著改善肺损伤。
  也对小鼠肺组织氧化应激损伤情况做了分析。芥子气染毒后,SM组小鼠肺组织中的H2O2、MDA含量显著升高;与SM相比,SM+NaHS组H2O2、MDA含量显著降低,SM+PPG组H2O2、MDA含量显著升高。同时,SM组小鼠肺组织中的GSH/GSSG、SOD活性显著降低,SM+NaHS组与SM相比,GSH/GSSG、SOD活性显著升高;SM+PPG组GSH/GSSG、SOD活性显著降低。
  进一步考查了Keap1-Nrf2通路上的Nrf2、HO-1和NQO1等相关蛋白表达和下游GR、GCLC和GCLM等相关基因表达,初步探讨了H2S在芥子气致小鼠肺损伤中发挥作用的可能机制。结果显示,染毒小鼠给予NaHS可促进Nrf2入核表达,升高Nrf2下游相关抗氧化基因HO-1、NQO1、GCLC、GR、GCLM和抗氧化蛋白HO-1、NQO1表达,从而减轻氧化应激损伤;给予PPG会出现相反的结果。这提示Nrf2可能在H2S调节SM致肺损伤的过程发挥重要作用。
  二、H2S对芥子气染毒BEAS-2B细胞和MRC-5细胞的保护作用及机制研究
  进一步在细胞水平上验证了H2S对芥子气损伤的保护作用和机制。应用CCK-8法检测不同浓度芥子气对人支气管上皮细胞BEAS-2B和人肺成纤维细胞MRC-5毒性作用,给予不同浓度的NaHS,结果显示当NaHS浓度为70μM时可显著升高芥子气染毒细胞活力。通过NIR-HS荧光探针孵育细胞后共聚焦显微镜下观察荧光强度,进一步研究内源性H2S含量变化,同时检测细胞内ROS分析氧化应激损伤状态,观察发现,给予NaHS组与芥子气组相比,细胞荧光强度即内源性H2S含量升高,细胞内ROS含量明显降低。应用基因沉默技术,敲低CSE表达后的细胞荧光强度即内源性H2S含量低于普通细胞,细胞内ROS含量升高。敲低CSE后给予NaHS的细胞内NaHS升高H2S含量的作用被阻断,且细胞内ROS含量明显升高。结果表明,NaHS可通过CSE升高内源性H2S含量,并改善细胞内氧化应激损伤。
  细胞水平上研究Nrf2在H2S调节SM致损伤中的作用。普通细胞中,与SM处理组相比,SM+NaHS组胞核中Nrf2表达显著升高,Nrf2下游的HO-1和NQO1表达明显升高,细胞内ROS含量降低。质粒转染沉默Nrf2基因表达细胞中,SM+NaHS组与普通细胞中的SM+NaHS组相比,胞浆和胞核中的Nrf2表达均显著降低,Nrf2下游的HO-1和NQO1表达显著降低,细胞内ROS含量升高。结果表明,基因沉默Nrf2后,与普通细胞中的SM+NaHS组相比,NaHS在芥子气染毒细胞中的作用被阻断。进一步检测细胞中S-硫巯基化Keap1蛋白表达,发现SM组同对照组相比,S-硫巯基化Keap1蛋白表达降低;SM+NaHS组与SM组相比,S-硫巯基化Keap1蛋白表达显著升高,细胞中应用硫巯基化抑制剂DTT后,SM+NaHS+DTT组与SM+NaHS组相比,S-硫巯基化Keap1蛋白表达显著降低,且胞核中Nrf2表达降低。结果表明,芥子气损伤细胞中硫巯基化抑制剂DTT可以阻断NaHS的保护作用,H2S通过硫巯基化Keap1促进Nrf2核转录,在芥子气损伤中发挥抗氧化应激作用。
  本实验研究中发现,芥子气致肺氧化应激损伤中内源性H2S含量降低,通过给予芥子气染毒小鼠H2S供体化合物NaHS,可升高内源性H2S含量,促进Nrf2入核表达,升高Nrf2下游相关抗氧化基因HO-1、NQO1、GCLC、GR、GCLM和抗氧化蛋白HO-1、NQO1表达,改善芥子气造成的肺氧化应激损伤。细胞实验中研究发现NaHS可通过H2S合成酶CSE升高芥子气损伤细胞中内源性H2S含量,进一步通过硫巯基化Keap1促进Nrf2核转录,改善芥子气损伤细胞内氧化应激水平。
[硕士论文] 何融冰
急诊医学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨全氟化碳联合肺表面活性物质雾化吸入对兔整肺灌洗型急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)模型的治疗作用。
  材料与方法:
  32只体重2.0-2.5kg健康成年新西兰白兔给予麻醉、固定并行气管插管、右股动静脉穿刺置管后,随机分为假手术组、加氧用药组、模型组、不加氧用药组各8只,记录手术操作完成后30min时动脉血气、呼吸频率(respiratory rate,RR)、动态肺顺应性(dynamic compliance,Cdyn)为基础值。两用药组及模型组急性呼吸窘迫综合征模型的制备参照Lachmann等人的方法,将10ml/kg37℃生理盐水经气管导管注入实验动物肺内,将实验兔左右摇动生理盐水分布均匀,保持20s后抽出,每隔5min1次,每只兔重复灌洗3次。每次灌洗前后给予吸纯氧2min,最后一次灌洗完成后30min测血气,将氧合指数(oxygenation index,OI)≤300mmHg且持续30min以上作为ARDS模型制备成功的标准。假手术组仅行气管切开及右股动静脉置管,不进行灌洗。加氧用药组及不加氧用药组在造模成功后分别雾化吸入3ml/kg加氧、不加氧全氟化碳与肺表面活性物质,模型组将相同容量生理盐水雾化吸入。记录各组动物制模后30min(基础值)、用药前及用药后0min、30min、2h、4h各时间点的呼吸频率、动脉血气、动态肺顺应性。实验结束后留取静脉血、肺组织测肺系数(lung index,LI)、肺通透指数(lung permeability index,LPI)、血清及肺组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)及肺组织中细胞间粘附因子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)水平,经肉眼及显微镜观察肺组织病理学改变。
  结果:
  与假手术组相比,加氧用药组、模型组、不加氧用药组造模后三组氧合指数均迅速下降,呼吸频率明显增快,动态肺顺应性明显下降,肺组织出现明显水肿、出血及炎症渗出,加氧用药组在用药后0min、2h、4h OI较模型组均有显著上升(0min:231.0±16.7vs189.5±21.0;2h:282.4±15.7vs244.8±32.4;4h:347.1±27.1vs243.3±36.7,P<0.05),不加氧用药组OI在用药后2h、4h时亦显著高于模型组。但加氧用药组于用药后0min、4h OI明显高于不加氧用药组(0min:231.0±16.7vs190.5±13.3;4h:347.1±27.1vs313.3±21.0),证明两用药组均对于该ARDS模型氧合指标有明显的改善作用,但加氧用药组的作用优于不加氧用药组;两用药组的呼吸频率均于30min、4h时明显减慢(P<0.05),两用药组动态肺顺应性、肺系数、肺通透指数、血清及肺组织匀浆TNF-α、IL-1β及ICAM-1水平、肺组织病理学指标均较模型组有显著改善(P<0.05),两用药组间差异无统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  在整肺灌洗ARDS模型中,全氟化碳联合肺表面活性物质(即PFOB/DPPC乳剂)雾化吸入可能通过输送氧气、降低促炎因子水平、补充肺表面活性物质并影响其在肺表面的分布,从而显著改善氧合及肺顺应性,减轻肺组织水肿及炎症反应。
[博士论文] 张新丽
肿瘤学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  肺癌发病率、死亡率呈逐年上升趋势,已成为严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一。由于早期缺乏明显的临床表现,30-40%肺癌患者在确诊时已经为中晚期。中央型肺癌常常伴有阻塞性肺炎,后者导致肺容积的减少最终出现阻塞性肺不张。
  肺不张和肺癌组织在常规的CT图像中显示密度相似,将肺癌和肺不张组织完全区别开来存在着一定的困难,但是将肿瘤与肺不张区别开来对于肺癌的临床分期、组织活检、肿瘤的靶区勾画以及疗效评价都具有重要意义。
  放射治疗是肺癌患者的一种重要治疗手段。肺癌的放疗靶区勾画目前多数是以增强CT为影像学基础。众所周之,CT图像的空间分辨率较高,而它的软组织分辨率则不是太理想,特别是对于合并肺不张的中央型肺癌患者,由于不张的肺组织和肺癌组织都可以表现为实体组织影像,因此单纯用CT来将肺肿瘤和不张肺组织区别开来有困难,而基于CT图像勾画的中央型肺癌的靶区精确性就存在一定的局限,如果将不张的肺组织误画为肿瘤组织,就会增加正常组织特别是肺组织的放疗受量,同时增加放射性肺炎等相关并发症的发生率,给患者的治疗后生活质量带来极大的损害。
  PET-CT是近几年发展较快的一种功能性影像学技术,该项技术的显像基础是18F-FDG在不同代谢水平组织可以出现浓聚程度的差异,而18F-FDG在组织内的浓聚程度与细胞内的糖酵解水平高低呈正相关。CT可显示机体精细的断层解剖结构,PET则能从分子水平上反映人体组织的代谢水平,因此PET-CT可以实现PET图像和CT图像的同机高精度融合。
  近年来,磁共振技术的发展较快,特别是硬件和软件水平的提高,使DWI-MRI技术在肿瘤的诊断治疗方面的应用受到了较多的关注。DWI-MRI是以细胞外组织间隙水分子随机弥散运动为基础、反映组织细胞微环境变化的医学影像技术。由于肿瘤组织具有增殖旺盛、细胞密度高、细胞内大分子蛋白含量高等特性,细胞外空间减少,导致水分子细胞外和细胞内扩散受到限制,因此在DWI图像上表现为高信号。以DWI-MRI图像作为肿瘤放疗靶区勾画的影像学基础,已经在多种肿瘤中有报道,比如在前列腺癌,头颈肿瘤等。由于肺癌组织在DWI-MRI图像上表现为高信号影像,与周围正常肺组织对比明显。因此众多的研究结果表明,DWI-MRI技术在肺癌的诊断的敏感性和特异性方面能够相媲美于PET-CT,特别是在转移淋巴结及微小转移灶的发现方面甚至优于PET-CT。
  但是应用DWI-MRI技术作为合并肺不张的中央型肺癌的靶区勾画的影像学基础目前的研究还比较少。因此我们课题的目的就是研究DWI-MRI技术在合并肺不张的中央型肺癌精确放疗中的应用,相比于PET-CT和CT技术,我们评价基于DWI-MRI技术勾画靶区的特点,比较周围危及器官的放射受量变化,从而拟为临床上应用DWI-MRI技术作为合并肺不张的中央型肺癌患者精确放疗靶区勾画的基础提供参考信息,并为以后基于DWI-MRI图像进行靶区自动勾画提供依据。
  本课题拟分两部分进行研究。
  第一部分 DWI-MRI在合并肺不张的中央型肺癌精确放疗靶区勾画中的应用研究
  世界范围内肺癌是导致患者死亡最为常见的一种肿瘤。中央型肺癌常常伴发阻塞性肺炎而后者可以导致肺不张发生。肺癌的精确靶区勾画是精确放疗的基础,而常规基于CT图像勾画的靶区由于分辨率所限,精确性和适形性方面存在着一定的局限。PET-CT在肺癌的靶区勾画方面优势明显。随着MRI技术的发展,将DWI-MRI技术作为合并肺不张的肺癌的靶区勾画的影像技术成为近期的研究热点。
  目的:
  探讨磁共振弥散加权成像技术(diffusion weightedimaging,DWI)在合并肺不张的中央型肺癌精确放疗靶区勾画中的应用价值及意义。
  方法:
  27例合并肺不张的中央型肺癌患者纳入研究,所有患者均病理学证实。所有入组患者在一周内先后行胸部强化CT、PET-CT、DWI-MRI检查,根据扫描结果将PET、DWI-MRI分别与强化CT进行图像配准,根据获得的图像分别勾画大体肿瘤靶区GTVCT、GTVPLT、和GTVMRI,计算GTV体积和变异系数并进行比较,比较GTVCT、GTVPET、GTVMRI在三维空间中的靶区中心间距,并对图像信息的ADC值和SUV值进行分析。用SAS9.3(SAS公司,USA)软件进行分析。通过单因素方差分析对三种图像方法的每个指数的平均值进行比较。我们还计算了皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)来检验三者之间的相关性。在所有的检验中,P<0.05被视为差异有统计学意义。
  结果:
  27例患者平均GTVCT为109.45±14.90cm3,GTVPET为85.23±13.10cm3,GTVMRI为83.10±14.26cm3。GTVCT较GTVMRI大,差值为26.34±6.39c m3,差异有显著统计学意义(P<0.01); GTVCT大于GTVPET,差值为24.22±5.84 cm3,差异有统计学意义(P<0.01)。GTVPET稍大于GTVMRI,差值为2.12±2.46 c m3,但是差异无统计学意义(P>0.05)。GTVCT的变异系数较大,为33.76%,GTVPET和GTVMRI的变异系数较小,分别为32.00%和26.60%。GTVCT和GTVPET靶区中心间距VCT-PLT平均为0.87±0.54cm,GTVMRI和GTVPET靶区中心间距VMRI-PET平均为0.72±0.34cm,VCI-PTT与VMRI-PET相比,差异无统计学意义(P>0.05)。肿瘤组织的平均ADC值小于肺不张组织,并与肿瘤的最大SUV值呈显著负相关。
  结论:
  对于合并肺不张的中央型肺癌患者,基于DWI-MRI勾画的大体肿瘤靶区体积GTVMRI可以媲美于GTVPET,都显著小于GTVCT,勾画的靶区的一致性和重复性都好于GTVCT。GTVMRI、 GTVCT与GTVPET在三维空间中的靶区中心一致性好,三者在三维空间中靶区中心无明显的空间错位。对于合并肺不张的中央型肺癌,应用DWI-MRI对大体肿瘤靶区体积及靶区外轮廓的确定有很大的指导意义,同时该措施有助于降低不同医师间靶区勾画的差异。
  第二部分 DWI-MRI对合并肺不张的中央型肺癌精确放疗计划中危及器官剂量影响
  基于扫描图像的肿瘤靶区勾画,在放射治疗计划中至关重要。近几年磁共振弥散加权成像技术(DWI-MRI)在肿瘤放疗靶区勾画方面逐渐成为一种有广阔发展前景的影像技术,在某方面可能优于强化计算机断层扫描(CT)和正电子发射断层扫描(PET)。
  我们的前期研究结果显示,对于中央型肺癌合并肺不张患者,在精确放疗大体肿瘤靶区勾画方面,DWI-MRI优于CT,可以媲美于PET-CT。评价靶区勾画及放疗计划的优劣,危及器官的照射剂量是非常重要的一个方面。在保证肿瘤靶区照射剂量的基础上,有效减少危及器官的受量有利于减少放疗并发症,从而提高患者的治疗后生活质量。
  目的:
  评价基于DWI-MRI图像勾画的合并肺不张中央型肺癌患者放疗计划中危及器官包括肺、心脏和脊髓受量的变化。
  方法:
  27例合并肺不张的中央型肺癌患者纳入研究,所有患者均病理学证实。所有的入组患者在一周内先后行胸部强化CT、PET-CT、DWI-MRI检查,根据扫描结果将PET、DWI-MRI分别与强化CT进行图像配准,根据勾画的GTV制定放疗计划PlanCT,PlanPET,PlanMRI,计算并比较危及器官肺、心脏和脊髓受量的变化。用SAS9.3(SAS公司,USA)软件进行数据的统计学分析。三种勾画方式所做的放疗计划中肺、心脏及脊髓的受量都用均数±标准差表示,危及器官的受量比较运用student's t检验。组间均数的比较采用one-way ANOVA。P<0.05视为有统计学意义。
  结果:
  我们分别计算患侧肺V5,V10 V15,V20,V25,V30,V35,V40,Dmean大小,结果发现所有计算的患侧肺剂量体积直方图参数,PlanMRI和PlanPET相似,都显著低于PlanCT,差别具有统计学意义(P<0.01)。而对于心脏受量,无论是V30,V40,V45,V50,V55,还是平均受量Dmean及最大受量Dmax,PlanMRI都和PlanPIT都相似,而都低于PlanCT,但是差别都无统计学意义。三种计划的脊髓最大受量Dmax、平均受量Dmean都无显著差别(P>0.05)。
  结论:
  对于合并肺不张的中央型肺癌患者,基于DWI-MRI图像制定的放疗计划能显著降低肺组织的照射受量,降低放射性肺炎的发生率,并能降低心脏的照射受量,但是脊髓受量并无明显改变。
[博士论文] 赵洁
儿科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  本研究中一方面从遗传学角度研究基因多态性与支原体肺炎的相关性,为支原体感染的预防控制、早期诊断和治疗提供多方位的论证;另一方面对山东地区支原体肺炎患儿肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)进行肺炎支原体P1基因分型及基因测序,探讨山东地区肺炎支原体流行亚型及其基因变异情况;同时收集不同型别肺炎支原体感染患儿的临床资料,探讨肺炎支原体亚型与疾病严重程度之间是否存在相关性。目前对儿童支原体肺炎在病原学及解剖结构方面报道较多,而BALF中细胞因子变化的研究尚不多。通过对支原体肺炎患儿BALF中IL-6、IL-27水平的检测,探究各种疾病状态下IL-6与IL-27的水平变化情况,比较各组细胞因子水平有无差异性,评估IL-6与IL-27的水平与重症支原体肺炎的发生是否具有相关性,能否反应该疾病的严重程度,尽可能的发掘更多的重症支原体肺炎识别方法,争取能为重症支原体肺炎早期发现、诊断及治疗提供更多的论据。
  研究方法:
  本研究主要分为三个部分,第一部分中,采用病例-对照研究方法,收集2014年10月至2016年6月间于山东大学齐鲁儿童医院住院的415例支原体肺炎患者外周静脉血标本,其中重症肺炎205例,非重症肺炎210例,同时收集儿保门诊健康查体300例健康儿童的外周血标本,以415例支原体肺炎患者和300例健康儿童为研究对象,提取各研究对象的基因组DNA,应用聚合酶链反应及测序方法对ACErs4340、GSTM1(Ins/del)、IL-6(rs1800795)、NOS3(rs1799983)及CYP1A1(rs2606345)进行基因分型,用SPSS统计软件分析各多态性位点与MPP严重程度的相关性,从宿主层面来分析某些特定人群对支原体感染有无易感性,及与肺炎严重程度有无相关性。
  第二部分于山东大学齐鲁儿童医院住院部收集2015-2016年肺炎患儿的肺泡灌洗液,对诊断为MPP的240例患儿肺泡灌洗液标本进行P1基因分型,并进行基因测序,探讨此期间山东地区肺炎支原体流行亚型及其基因变异情况;同时收集该组患儿的临床资料,分析肺炎支原体亚型与疾病严重程度之间的相互关系。数据用SPSS22.0软件进行分析,采用卡方检验和方差分析的方法来分析临床症状和人口统计学数据(年龄和性别)。
  第三部分为了探讨儿童肺炎支原体与肺泡灌洗液中细胞因子之间的相互关系,选择临床采集的无肺部病变的支气管异物患儿与MPP患儿的肺泡灌洗液作为对照组与研究组,采用酶联免疫分析(ELISA)技术监测MPP患儿BALF中IL-6、IL-27水平,收集各组支原体肺炎患儿是否混合感染,病情轻重及肺泡灌洗液中MP-DNA拷贝值等临床及实验数据。ELISA检测结果采用SPSS22.0统计软件进行数据处理,连续性正态分布的计量资料数据以均数±标准差表示。多组间均数比较采用单因素方差分析,多组均数的两两比较采用LSD检验方法。
  研究结果:
  第一部分中,研究发现,ACErs4340、NOS3rs1799983、CYP1A1rs2606345存在三种基因型,但IL-6rs1800795和GSTM1基因(Ins/del)只有野生型和杂合型。对照组各单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisin,SNP)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。病例和对照组中,ACErs4340ID(42.67%vs54.22%,OR=1.81,95%CI:1.31-2.48,P<0.001),IL-6rs1800795GC(1.33%vs5.78%,OR=4.54,95%CI:1.56-13.23,P=0.003),NOS3rs1799983TT(3.20%vs8.82%,OR=6.53,95%CI:1.95-21.87,P<0.001)和等位基因的分布ACErs4340I(OR=1.32,95%CI:1.06-1.65,P=0.014)/NOS3rs1799983T(OR=1.48,95%CI:1.07-2.05,P=0.018)/IL-6rs1800795C(OR=4.44,95%CI:1.53-12.86,P=0.0027)比较有统计意义,表明ACErs4340ID、IL-6rs1800795GC和NOS3rs1799983TT与MPP的风险增加有关。而对于GSTM1(Ins/del)和CYP1A1rs2606345G/T,病例组和对照组比较基因型分布无明显差异,Logistic回归也未发现这两个多态位点与MPP易感性相关。
  继续分析ACErs4340、GSTM1基因(Ins/del)、IL-6rs1800795、NOS3rs1799983和CYP1A1rs2606345各基因-基因之间的相互作用。等位基因频率组合表示,ACErs4340D/NOS3rs1799983T/CYP1A1rs2606345G(OR=3.08,95%CI:1.80-5.26);ACErs4340D/NOS3rs1799983T(OR=3.44,95%CI:2.01-5.89)基因携带者,MPP患病风险明显高于对照组。应用MDR分析软件继续探讨这一群体中研究基因的SNP-SNP的交互作用。最终,ACErs4340及NOS3rs1799983被认定为与MPP发病风险最大(CV consisitency=9/10)。同时使用SAS软件(version9.1.3portable)分析各SNP组合后的发病风险,结果表明ACErs4340和NOS3rs11799983遗传多态性的组合频率在MPP病人(n=415)病例和对照组之间存在显著差异(OR=3.32,95%CI:1.90-5.85)。
  此外,在415例MPP患者中,我们分析了各多态位点与MPP病情严重程度的关系,发现,ACErs4340I等位基因携带者,严重MMP发生的风险要高1.44倍(OR=1.44,95%CI:1.05-1.97,P=0.024),IL-6rs1800795C等位基因携带者,发生严重MMP的风险要高6.9倍(OR=6.9,95%CI:2.14-22.22,P=0.001)。综上所述,本研究提示SNP在MPP高风险个体筛查中的潜在应用价值。
  第二部分通过巢式多重PCR方法对240例MPP患儿肺炎支原体P1分型检出P1-Ⅰ型228例,P1-Ⅱ型12例。研究表明,在研究期间,山东地区发生的MP感染以P1-Ⅰ型为主,未发现变异株。这一结果与欧洲某些国家,以及中国北京、浙江、天津等地区学者监测结果相同。进一步分析发现P1-Ⅱ型中重症比例高于P1-Ⅰ型,肺炎支原体P1亚型与肺部感染严重程度可能存在相关性,差异有统计学意义(P=0.018<0.05)。
  第三部分本研究BALF中的IL-6水平可反映MPP患者肺部感染程度,IL-6水平越高,肺部感染程度越重,高水平的IL-6与重症MPP的发生具有相关性,未发现IL-27水平与重症MPP的发生具有相关性;进一步分组分析,单纯支原体感染与混合支原体感染,都存在IL-6水平升高,混合感染相对于单纯感染,有统计学意义,而IL-27在混合感染组降低明显,与单纯组比较差异无统计学意义,与对照组比较有显著差异;肺泡灌洗液的MP-DNA拷贝值,其高低与IL-6分泌水平存在相关性,而与IL-27无相关性。
  研究结论:
  1.ACErs4340,IL-6rs1800795和NOS3rs1799983的多态性与MPP易感性存在统计学关联;
  2.交互分析证明,儿童ACErs4340D/NOS3rs1799983T基因携带者,MPP患病风险明显增高;
  3.ACErs4340I及IL-6rs1800795C等位基因携带者,发生重症MMP的风险要高;
  4.研究期间,山东地区发生的MP感染以P1-Ⅰ型为主,未发现变异株。P1-Ⅱ型中重症比例高于P1-Ⅰ型,肺炎支原体P1亚型与肺部感染严重程度可能存在相关性,差异有统计学意义。
  5.本研究未发现BALF中的IL-27水平与重症MPP发生具有相关性,而IL-6与重症MPP的发生具有相关性,可作为预测重症MPP发生的标志物。
[硕士论文] 王昊颖
急诊医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD),是一种常见的慢性呼吸系统疾病,由于其起病隐匿,反复发作的特征,导致患者的病死率、致残率居高不下。COPD将被列入未来10年中,世界范围内第五大负担的疾病。COPD患者存在不同程度的肺通气和肺换气功能障碍,造成患者骨骼肌摄氧量显著降低,加重疲劳乏力的症状;在此基础上,患者极少的运动负荷也会引起整体耗氧量的增加,迫使患者用力呼吸,使呼吸肌做功相应增加,加重喘息的症状。喘息和疲劳乏力的症状使患者被迫采取减少运动的方式来缓解;而减少运动使肺功能进一步降低,同时骨骼肌废用性萎缩,造成肌力的退化。在此过程中,患者的心理极易受到上述负面因素的影响,产生焦虑甚至抑郁情绪。消极情绪可以在一定程度上进一步加重患者的主观不适感,形成恶性循环。如何有效的稳定和逆转患者生理和心理条件,从而达到提高患者的生存质量和运动能力的目的,有效打破这一恶性循环,成为一个备受关注的问题。
  肺康复的理念及内容在过去近20年里不断充实与更新,最早于1997年被正式提出。作为一种非药物干预措施,随着门诊患者肺康复和住院患者肺康复工作的开展与普及,越来越多的中重度慢性肺损害患者从肺康复中获益,因此逐渐被广大患者所认可,并成为首选干预方案。在实际工作中,这种干预方案要真正得以实施,需要投入大量人力、物力作为保障,这就引出一个迫在眉睫的问题---在经济水平不高和偏远地区无法作为常规开展与普及。怎样科学设置肺康复,合理安排COPD患者进行肺康复,个性化设计运动锻炼方案,提高患者肺康复的依从性,实现有限医疗资源获益的最大化,是目前研究的热点和难点。在肺康复工作开展初期,曾有医疗机构专门组织医护人员上门对COPD患者指导肺康复,并收到了显著效果,但同时也暴露出无法大范围普及推广的缺憾。针对这种情况肺康复急需一种更安全、经济、实用、方便的技术来帮助家庭病房中的COPD病人。远程医疗技术(云-ICU)具有方便、快捷、低廉等优势,对肺康复的设置和传递方法在适应不同人群的需要方面有很大潜力,可探讨运用远程医疗技术对家庭病房COPD患者肺康复的影响。
  方法:
  本次研究采取随机对照试验的方法,对比分析接受远程医疗技术(云-ICU)支持前后,家庭病房COPD病人的肺康复疗效。
  本次研究的对象为稳定期COPD患者,研究对象均来自急性加重期经住院治疗后,进入稳定期且具备转至家庭病房继续治疗的COPD患者40例。分为两组,干预组20例,给予定期远程医疗技术肺康复训练指导;对照组20例,在研究过程中仅提供相关内容咨询和督导,肺康复训练由患者自行完成。
  评价工具:1)采用由西方学者Jones等2009年开发的COPD评估测试问卷(COPD Asessment Test,以下简称CAT,详见附录表1)中文版。在研究起始阶段,统计干预组和对照组患者的一般情况以及CAT评分,在经过12周实验后,再次统计两组患者CAT评分,经统计学分析对比远程医疗技术支持前与远程医疗技术支持后COPD患者CAT分值变化,评价肺康复效果。2)6分钟步行试验(6-Minute Walk Test,以下简称6MWT):反应病人客观运动能力,在研究起始阶段,测评所有入组患者的6MWT并进行记录,为避免数据对患者造成心理暗示,尽量转移患者对数据的注意力并不告知患者测评结果。经过12周研究结束后,再次进行两组患者的6MWT测评,经统计学分析比较远程医疗技术支持前后COPD患者6MWT变化,评估肺康复效果。
  结果:
  1)干预组CAT总分值、主观症状分值、主观运动能力分值,在远程医疗技术支持后明显降低,有显著差异(p<0.05);心理分值,较未接受远程医疗技术支持前无明显的改变,无显著差异(p>0.05)。对照组CAT总分值、症状分值、心理分值、运动能力分值没有明显改变,无显著差异(p>0.05)。
  2)6MWT:干预组较远程医疗技术支持前平均提高了61米,达到了临床意义上的显著性改变。两组6MWT的变化在接受远程医疗技术支持前后有明显差异(p<0.05),干预组明显优过对照组。
  3)干预组20名患者全部顺利完成12周肺康复训练,完成率100%;对照组20名患者中仅有1人,根据研究人员提供的相关内容和督导要求完成12周肺康复训练,完成率5%。完成率具有显著意义(p=0.000)。
  结论:
  1)就改善主观症状和主观耐受能力而言,远程医疗技术对家庭病房COPD病人肺康复效果改善作用明显。
  2)就改善心理而言,包括情绪、睡眠和精力,远程医疗技术对家庭病房COPD病人肺康复效果改善不明显。
  3)就改善客观运动能力而言,远程医疗技术对家庭病房COPD病人肺康复效果改善作用明显。
  4)远程医疗技术可以改善家庭病房COPD病人肺康复的管理,特别是在提高病人肺康复的依从性方面尤为突出。
[博士论文] 刘波
内科学(呼吸) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:特发性肺纤维化(IPF)是一类慢性纤维化性肺疾病,起病隐匿,病情进展迅速,致使患者出现呼吸衰竭,严重可导致死亡。回顾性研究结果提示,特发性肺纤维化患者从确诊到死亡的中位生存期为2-3年。目前,IPF病因不清楚,其发病可能与以下因素有关,如易感基因、老龄、烟草暴露、环境因素、病毒、免疫失衡以及慢性胃肠道酸或非酸物质反流和吸入等。目前,有假说认为,具有易感倾向的个体,尤其是老龄人群,常存在反复慢性微吸入,这可引起肺泡上皮细胞损伤和修复异常,导致肺成纤维细胞增殖和活化,胶原沉积和肺纤维化形成IPF合并高发的胃食管反流为该假说提供了依据。
  过去的十余年,呼吸科医生组织多中心临床试验探索了多种治疗手段,然而临床试验的结果令人失望,都不能改善IPF患者的生存率,这表明IPF目前无有效的治疗措施。既往治疗探索的经验显示,治疗药物可能没有阻断肺泡上皮细胞的动态损伤,以及随之发生的肺部炎症和纤维化过程。临床上迫切地需要寻找有效的治疗方案,治疗应当转变为预防策略,针对可能的病因进行治疗,从而改善IPF患者的预后。越来越多的研究表明,IPF合并高发的胃食管反流。部分IPF急性加重患者的支气管肺泡灌洗液中可以检测到增高的胃蛋白酶,为胃液成分进入下呼吸道提供了直接的证据,提示慢性微吸入可能在IPF急性加重中起作用。药物或外科治疗胃食管反流可以使IPF患者肺功能维持稳定,抗胃食管反流为IPF的治疗提供了新的靶点。
  本论文本研究观察了104例IPF患者,分析了IPF多种预后影响因素,特别是抗反流治疗,对患者生存期的影响。
  目的:
  继发于胃食管反流(GER)的长期微量吸入可能在特发性肺纤维化(IPF)的发病机制和自然史中起作用。我们的目标是调查长期抗反流治疗与IPF患者生存时间之间的关系。
  方法:
  分析了包括胃食管反流诊断和治疗数据的病例报告,探讨了威海市立医院IPF患者GER相关变量与存活时间的关系。在104例患者中,51例接受慢性抗反流治疗,16例患者接受了抑酸和胃肠动力药物联合治疗,18例单独用应用抑酸药治疗,17例单独应用胃肠动力药物治疗。SPSS17统计软件用于数据处理和分析。描述性统计数据以平均值和标准偏差(SD)或中位数(第25百分位数,第75百分位数)表示。生存时间由初次访视(诊断时间)计算,直到主要结局达到,无论是死亡还是后续失败。幸存的病例直到最后一个随访日,涉及非IPF疾病的失踪和死亡病例均通过审查统计数据进行管理。生存时间(天)报告为中位数(第25百分位数,第75百分位数)。进行未调整和调整的Cox比例风险回归分析。通过Kaplan-Meier方法绘制生存曲线,并使用对数秩检验来测试差异。在未经调整的分析中使用所有重要的预测因子进行调整后的Cox回归模型,并采用逐步选择。所有测试均为双侧,并以0.05的显著水平进行。
  结果:
  1、研究人口
  研究队列由104例患者组成。患者主要为男性(67%),平均年龄为68岁。大多数患者超重,平均体重指数(BMI)为27,大多数患者是现在或以前的吸烟者(73%)。平均基线用力肺活量(FVC)预测为71%,一氧化碳(DLCO)肺弥散能力预测为52%。35%的患者出现GER症状。在诊断时,49%的患者报告了当时应用抗反流治疗(抑酸药和/或胃肠动力药物)治疗,其中大多数患者(67%)使用PPI作为常规抑酸治疗。
  2、生存分析
  单因素Cox比例回归分析结果显示性别,Velcro音,GER症状,RV%,巨噬细胞%和磨玻璃影评分对IPF患者的生存的影响没有统计学意义,p>0.05。年龄(HR=1.11,Wald=3.37,p=0.049),BMI(HR=0.99,Wald=9.55,p=0.004),呼吸困难评分(HR=1.08,Wald=45.14,p=0.000),吸烟史(HR=0.73.7,Wald=3.783,p=0.032),GERD(HR=0.77,Wald=6.55,p=0.009),TLC%(HR=0.95,Wald=18.22,,p=0.000),PAP(HR-=0.89,Wald=4.65,p=0.040),长期使用氧气(HR=1.16,Wald=3.45,p=0.043),抗反流治疗(HR=1.05,Wald=39.27,p=0.000),FVC%(HR=0.97,Wald=2.15,p=0.045),DLCO%(HR=0.99,Wald=27.78,p=0.000),PaO2(mmHg)(HR=0.95,Wald=3.57,p=0.010),Sa02(HR=0.91,Wald=9.11,p=0.003),PA-a02(mmHg)(HR=1.04,Wald=5.15,p=0.030),N%(HR=1.09,Wald=15.23,p=0.000),L%(HR=0.99,Wald=4.65,p=0.040),E%(HR=1.25,Wald=8.17,p=0.003),网格影评分(HR=1.08,Wald=33.22,p=0.000),蜂窝肺评分(HR=1.11,Wald=54.18,p=0.000),是影响IPF患者预后的主要因素,其中HR值小于1,与IPF患者预后呈正相关,对患者延长生存期有益;HR值大于1,与IPF患者预后呈负相关,是IPF患者预后危险因素,是缩短患者生存期的因素。
  Kaplan-Meier组间生存率比较,性别,GERD、PAP(mmHg)、长期使用吸氧、PaO2(mmHg)、Sa02(%)、淋巴细胞%参数Kaplan-Meier组间生存率比较没有统计学意义(log-rank分别为0.34、3.65、3.12、1.22、2.45、2.69、0.11、P>0.05),营养状况BMI(Cutoff值=26.45,log rank=50.11,p=0.000),呼吸困难评分(Cutoff值=6.30,log rank=10.12,p=0.002),抗反流治疗(Cutoff值=6个月,log rank=47.43,p=0.000),TLC%(Cutoff值=62.84,log rank=,55.00,p=0.000)FVC%(Cutoff值=67.00,log rank=9.67,p=0.040),DLCO%(Cutoff值=55.00,log rank=26.78,p=0.000),PA-a02(mmHg)(Cutoff值=39.90,logrank=6.45,p=0.010)中性粒细胞%(Cutoff值=10.00,logrank=14022,p=0.000),嗜酸性粒细胞(Cutoff值=1.00,logrank=15.67,p=0.000),网格影评分(Cutoff值=41.00,log rank=47.78,p=0.000)和蜂窝肺评分(Cutoff值=32,logrank=52.19,p=0.000)参数组间统计有统计学意义,p<0.05。
  3、抗反流治疗用药比较
  在有报告和没有报告的抗反流治疗的患者之间,年龄,BMI,吸烟史,性别,长期使用氧气及肺部生理学,没有显著差异p>0.05。抗反流治疗与929天的中位生存时间相关,而没有这种治疗的患者的中位生存时间为685天。进行抗反流治疗的患者比没有抗反流治疗的患者存活显著更长(Log Rank=5.936,P=0.015)。经进一步分层分析,发现在有或没有GERD的患者中,与没有进行抗反流治疗的患者相比,抗反流治疗组导致更长时间的存活。GERD患者的差异更显著(Log Rank=7.263,P=0.007)。在报告GER症状存在的患者中,与没有抗反流治疗的患者相比,抗反流治疗后的生存时间没有显著性差异(Log Rank=0.592,P=0.441)。然而,在报告不存在GER症状的患者中,抗反流治疗的生存期显著长于未经治疗的患者(Log Rank=7.148,P=0.007)。在用抑酸和胃肠动力药物组合进行抗反流治疗的患者中,存活时间明显长于单独使用抑酸药治疗的患者(Log Rank=12.103,P=0.001)。
  4、抗反流治疗对I PF危险因素和血清指标的影响
  与对照组相比较,抑酸性药物治疗组的指标DLCO(%)和PaO2(mmHg)明显升高,有统计学差异(p<0.05),联合治疗组的参数TCL(%)、DLCO(%)和PaO2(mmHg)显著升高,有统计学差异(p<0.05),呼吸困难评分明显降低,有统计学差异(p<0.05)。
  与对照组相比较,抑酸性药物治疗组的指标网格影评分明显降低,有统计学差异(p<0.05),联合治疗组的参数中性粒细胞(%)、嗜酸性粒细胞(%)、网格影评分和蜂窝肺评分均显著降低,有统计学差异(p<0.05)。
  与对照组相比较,抑酸性药物治疗组的血清指标MMP-7明显降低,有统计学差异(p<0.05),联合治疗组的血清指标TGF-β1和MMP-7均明显降低,有统计学差异(p<0.05)。
  结论:
  长期应用抗反流治疗是IPF患者生存时间延长的独立预测因素。
[博士论文] 郭飞
内科学(呼吸系病) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是呼吸系统常见的一种间质性肺疾病,其发病原因不详,在老年人中发病率极高,IPF具有强烈的致死性,患者确诊后平均存活时间大概只有2-3年,IPF的患者临床上主要表现为呼吸困难,除此之外还伴有咳嗽、无力、食欲减弱以及体重下降等症状。中国目前人口老龄化严重,IPF的患病人数和死亡人数也在逐年增加,IPF严重危害人类的生活质量,但目前对于IPF的治疗方法仍是有限的,对特发性肺纤维化发病机制的解析有利于更快的找到治疗的新策略。
  博来霉素(bleomycin)是一种抗肿瘤药物,其在鳞癌和一些肿瘤疾病中具有一定的疗效,应用时在人体的各个组织中往往都存在,但是博来霉素的聚集往往会产生毒副作用,会使细胞出现纤维化,其作为抗肿瘤药物的使用就受到了限制。目前,博来霉素由于其价格低廉、容易获取等优点已经被广泛应用于肺纤维化模型构建中,为深一步研究IPF的发病机制奠定了基础。
  微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一种非编码的RNA分子,长度一般为18-26个核苷酸,在细胞的生命调节中起重要作用。1993年,Lee等就在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,Celegans)中发现了与胚胎发育有关的基因lin-4,之后,又有研究者在C.elegans中又发现了基因let-7,随后,又在许多的真核生物中找到了一些类似的小RNA分子。miRNA可以与靶向mRNA结合,抑制mRNA的翻译或者降解mRNA,它可以有多个靶基因,也可以通过多个miRNA的作用共同调节某一个基因。miRNA是近年来研究的热点,并且与多种疾病有密切关系,如:癌症、神经变性疾病、糖尿病以及一些炎症反应,目前已经成功将miRNA应用到某些疾病的治疗中。
  miR-142-3p是miRNA家族中的一员,有研究发现,miR-142-3p在一些炎症反应中发挥重要的作用,而其作用的机制推测是通过高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1,HMGB1)来调控一些炎性因子的释放,在肺癌细胞中发现,miR-142-3p能调控HMGB1的表达,而HMGB1与细胞中IL-1、IL-6和IL-8等炎性因子的释放有关并在一些炎症反应中发挥重要作用,但在特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)中的作用尚未明确。
  环氧化酶(cyclooxygenase,Cox)又称为前列腺素合成酶(prostaglandin synthetase,PGHS),是前列腺素物质合成的主要限速酶,在人体中,Cox能将花生四烯酸(arachidonic acid,ARA)催化生成十多种前列腺素。Cox-2是Cox同工酶中的一种,Cox-2与一些炎症反应有密切关系并在肿瘤细胞中高表达,如:肺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌以及肝癌等,其表达程度的高低与肿瘤的分化程度有关。除此之外,Cox-2主要是在细胞周期、细胞凋亡、肿瘤新血管的生成以及肿瘤转移等方面发挥重要的作用。
  PI3K/Akt/mTOR信号通路也是近年来研究的热点,主要包括磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、丝苏氨酸蛋白激酶(protein kinase B,Akt或者PKB)以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)。它们是细胞生理、病理过程中细胞的生长和存活过程中关键的信号转导通路,采用信号传导通路阻断的方法,并作用于特定的肿瘤细胞靶点来抑制肿瘤细胞的生长,在肿瘤的治疗中起到了积极的作用,但是对于PI3K/Akt/mTOR信号传导通路的作用机制并没有完全解析,因此,对于PI3K/Akt/mTOR信号通路的深入研究,对于开发新的治疗药物具有重要意义。
  目的:
  研究miR-142-3p在IPF中的作用及其作用机制,首先,利用不同浓度的博来霉素处理肺上皮细胞MLE-12,并对细胞的活力、细胞凋亡率以及细胞中的促炎性因子白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达量进行测定,构建IPF体外模型;为确定miR-142-3p在博来霉素诱导的IPF模型中的作用,对肺上皮细胞MLE-12中miR-142-3p的表达水平进行检测,同时将miR-142-3p过量表达和抑制表达,并检测细胞中促炎性因子IL-1和TNF-α的表达水平;为探究其作用机制,对细胞中Cox-2的表达水平和PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性进行测定。
  方法:
  为了构建IPF体外模型,首先向小鼠肺上皮细胞MLE-12添加0μg/ml,10μg/ml,50μg/ml和100μg/ml博来霉素,并利用采用CCK-8法和流式细胞术分别对细胞活力和凋亡率进行检测,同时用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和Western blot对肺上皮细胞MLE-12中的两种促炎细胞因子白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA和蛋白表达量进行测定。在研究miR-142-3p在体外IPF模型中的作用时,首先利用qRT-PCR对0μg/ml,10μg/ml,50μg/ml和100μg/ml博来霉素诱导的肺上皮细胞MLE-12中miR-142-3p的表达情况进行测定,然后利用细胞转染技术,将miR-142-3p的模拟物(mimic)、抑制剂(inhibitor)及其对照分别导入到肺上皮细胞MLE-12中,同样采用CCK-8法、流式细胞仪、qRT-PCR以及Western blot分别对细胞活力、细胞凋亡率以及促炎性细胞因子白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA和蛋白表达量进行测定;在进行miR-142-3p在体外IPF模型中作用机制探究时,利用qRT-PCR和Western blot对肺上皮细胞MLE-12中的Cox-2的mRNA和蛋白表达情况进行测定,并利用Western blot对PI3K/Akt/mTOR信号通路中的蛋白表达水平进行检测。
  结果:
  体外IPF模型构建实验结果显示,博来霉素能够降低细胞活力、促进细胞凋亡,并且能够上调IL-1和TNF-α的表达水平,当博来霉素浓度为10μg/ml时,肺上皮细胞MLE-12的细胞活力和细胞凋亡率与对照细胞相比并无显著差异,当博来霉素浓度为50μg/ml和100μg/ml时,其细胞活力显著下降(P<0.05或P<0.01),而细胞凋亡率明显增加(P<0.01或P<0.001),对促炎因子IL-1和TNF-α的表达量测定发现,当博来霉素浓度为10μg/ml时,IL-1和TNF-αmRNA的表达量与未添加博来相比没有显著差异,其蛋白表达量也无显著差异,而当博来霉素浓度增加到50μg/ml和100μg/ml,IL-1和TNF-αmRNA的表达都显著上调(P<0.05),Western blot实验也发现,IL-1和TNF-α蛋白表达量增加,并且在50μg/ml时,IL-1和TNF-αmRNA和蛋白表达量达到最高;
  miR-142-3p在IPF中的作用实验表明,随着博来霉素添加浓度的增加,miR-142-3p表达下调,当添加浓度为10μg/ml、50μg/ml和100μg/ml时,miR-142-3p的表达水平显著下调(P<0.05或P<0.0001);进一步对miR-142-3p表达上调或者下调的细胞以及对照组细胞的活力、凋亡率以及IL-1和TNF-α的表达量进行检测发现,在过表达miR-142-3p细胞中其细胞活力要比对照组增加(P<0.05),细胞凋亡率明显减弱(P<0.05),促炎性因子IL-1、TNF-α的mRNA和蛋白表达量也降低(P<0.01或P<0.05);相反,在miR-142-3p表达受抑制的模型中,肺上皮细胞MLE-12活力与对照相比明显下降(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),而促炎性因子IL-1、TNF-α的mRNA和蛋白表达量也升高(P<0.05)。
  结论:
  通过实验可知,博来霉素能够影响细胞的活力以及凋亡率,并且随着添加的浓度的增加,降低了细胞活力,促进细胞凋亡,并发现促炎因子IL-1和TNF-α的表达量增加,利用博来霉素诱导小鼠肺上皮细胞MLE-12,成功构建了体外IPF模型,在此模型中研究miR-142-3p的作用发现,博来霉素诱导的IPF模型中miR-142-3p表达下调,进一步对其作用验证发现,miR-142-3p的过表达能够避免博来霉素诱导肺上皮细胞MLE-12带来的细胞损伤,而miR-142-3p的表达受抑制时,作用则反之。说明miR-142-3p与IPF的发病机制有密切关系,并且发现miR-142-3p能通过下调Cox-2的表达,来上调PI3K/Akt/mTOR信号通路活性,本文揭示了miR-142-3p参与调控体外肺上皮细胞损伤的作用和机制,也为治疗IPF提供了新的治疗靶点。
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