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[硕士论文] ANUM BASHIR
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是一种已被深入研究的革兰氏阴性植物病原细菌,但该菌对动物如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的致病性最近也已被研究证实。铁是自然环境中最丰富的元素之一,但其生物利用率一直相对较低。多种不同的微生物类群已经发展出具有对铁具有高亲和性能的铁吸收系统,包括血红素摄取系统、铁载体系统和细胞膜受体等。假单胞菌属(Pseudomonas)的主要铁载体是pyoverdine。它是一种低分子量、高亲和力的铁清除荧光分子,仅在铁限制条件下由荧光假单胞细菌群产生。除了具有对铁的吸收性能,铁载体pyoverdine也可以作为细菌毒素。本学位论文主要研究了基于液体培养条件下的线虫致病模型中,在铁限制条件下丁香假单胞菌野生菌株MB03和秀丽隐杆线虫之间的相互作用,以及铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌致病性中的作用。
  鉴于铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aerugionosa)PAO1菌株已经鉴定出几乎所有与pyoverdine生物合成和分泌相关的基因,使用PAO1菌株的pyoverdin基因簇作为参考序列,利用在线工具Anti-SMASH对丁香假单胞菌MB03基因组中pyoverdine编码基因簇进行了预测和定位分析。结果发现,发现丁香假单胞菌MB03中缺少5个与PAO1中的直系统同源基因(pvdX,pvdY,pvdA,pvdF和fpvI)。在这些基因中,pvdX和pvdY编码调节蛋白;pvdA和pvdF编码合成N5-甲酰基-N5羟基鸟氨酸残基所需的酶,这些残基存在于PAO1的pyoverdine的肽链中。但在MB03的pyoverdine基因簇中也存在一种为PAO1中所没有的基因,即syrP。推测syrP的编码产物可能参与存在于MB03-PVD肽链中的羟基天冬氨酸残基的β-羟基化作用此外,在PAO1中,两个Sigma因子编码基因pvdS和fpvI分别参与pyoverdine生物合成和pyoverdine受体FpvA的激活,但是,在丁香假单胞菌MB03的基因组中不存在fpvI,而是在fpvA基因的前面有一个pvdS IS基因框,表明在丁香假单胞菌MB03中的pvdS可能参与fpvA基因的转录。
  Pyoverdine在结构上由3个不同的结构域组成,即生色团(最保守的部分)、肽链(最可变部分)和侧链(羧酸衍生物)。在MB03的铁载体pyoverdine基因簇中的非核糖体基的多肽合成酶(NRPS)基因编码参与pyoverdine的肽链和发色团部分合成的一种大分子量酶。通过NRPS预测因子对丁香假单胞菌MB03的5个推定的NRPS基因进行计算机模拟表征表明,MB03-PVD的肽链呈线性形式并且由L-1ys,D-Asp,L-Thr,L-Thr,L-Ser,D-Asp和L-Ser。经测定铁载体pyoverdine特定光吸收值,发现MB03产生的pyoverdine与培养基中的Fe3+浓度成反比,而铁对于pyovidine生产的临界抑制浓度约为20μmol/L。
  通过使用RecTE重组系统来进行pyoverdine生物合成2个相关基因的中断,获得了相应基因中断突变株ΔpvdD和ΔpvdJ。由于pyoverdine是一种分泌的非核糖体多肽,所以可通过LC-MS和荧光光吸收测定来鉴定中断菌株是否丧失产铁载体pyoverdine的活性。结果发现,两株突变株的破碎细胞滤液均缺乏pyoverdine特征性的黄绿色荧光,表明突变株未能产生pyoverdine。经质谱鉴定,2株突变株也缺乏pyovine的特征峰,而野生型MB03产生了具有1123.412m/z和1142.4165m/z的两类pyovidine。
  为调查铁在MB03对线虫致病性中的作用,在添加或不添加铁的M9培养基中来培养MB03菌株,然后进行对秀丽隐杆线虫的杀虫生物测定。由于Pyoverdine也有助于在丁香假单胞菌中发现的几种常见致病因子(如AHL,EPS和Tabtoxin)的产生,因此,pyoverdine有可能在培养过程中由于铁在培养基浓度的不同从而调节了细胞毒性、并导致对线虫杀虫效果的差异性。为验证这一假设,将过夜MB03培养物产生的滤液分成两半,其中之一添加额外的100μmol/L铁并培养过夜。生物测定结果发现,野生菌株MB03导致供测线虫的显著性致死(p=0),但通过在M9中添加外源铁(100μmol/L)或通过在MB03过夜培养物中直接添加外源铁的细胞滤液可在一定程度上减小致死率。此外,液相生物测定的致死效应通常发生在培养30h之后,因此,足够的培养时间对于细菌的致死作用也是进行生物测定时要考虑的。
  将基因中断突变株ΔpvdD和ΔvdJ与野生菌株MB03在贫铁的M9培养基中生长后进行液相杀虫生物测定,另外,使用纯化铁载体pyoverdine进行相应生物测定,因为推测pyoverdine可能是具有杀虫活性的MB03滤液中的一种作用导致线虫死亡的活性因子。在液相生物测定中使用的纯化pyoverdine的浓度与在MB9中在48h内在M9培养基中产生的pyoverdine的浓度相当。测量暴露于各种滤液的线虫的相对死亡率,结果如预期相符:与M9和大肠杆菌(Escherichia coli OP50滤液相比,MB03滤液显示显着的杀死作用(p=0),而两种突变株的杀虫试验都没有发现线虫死亡。
  为了证实突变体的减毒活性是由于缺乏pyoverdine产生的,将纯化的pyoverdine加入突变体中以测量与野生型相当的相对死亡率,结果证实pyoverdine是导致线虫死亡的细菌滤液中的活性因子。通过pyoverdine生物合成缺陷的突变株的减毒活性、以及两突变株在添加纯化的pyoverdine后又可杀线虫的实验结果可以证实,pyoverdine在MB03介导的液相杀虫实验中是决定杀虫活性的重要因素。此外,通过测量MB03和两种突变株的生长曲线,发现突变株在贫铁M9培养基中生长缓慢。因此,这表明pyoverdine对丁香假单胞菌MB03生长也是至关重要的。
  总之,本研究结果表明,丁香假单胞菌MB03具有产生pyoverdine的遗传潜力。通过RecTE重组系统构建获得2株pyoverdine生物合成缺陷的基因中断突变株。铁载体pyoverdine在MB03菌株对秀丽线虫的杀虫活性中发挥重要作用。同时,pyoverdine也是影响宿主细胞生长的重要因素。就我们所知,本项研究是研究丁香假单胞菌铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌与动物宿主之间相互作用的第一例研究。
[硕士论文] 何有为
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:芽孢杆菌广泛存在于自然界中,可产生丰富的次生代谢物质,具有极强的抗逆能力和环境适应性,是一类具有实际用途和经济价值的微生物类群。本研究通过室内筛选获得对油菜根肿病菌(Plasmodiphora brassicae)具有较好抑制效果的生防芽孢杆菌F85和T113,此外还发现了一株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)具有很强拮抗效果的枯草芽孢杆菌BJ-1。本研究以此为材料,分别对生防菌株抑制油菜根肿病和稻瘟病的生防机理进行探讨,并综合评价生防芽孢杆菌的生防效果。主要研究结论如下:
  1.从湖北省当阳市油菜根肿病发生严重田块的健康油菜根际土壤先后分离微生物菌株667株,其中细菌323株,真菌253株,放线菌91株;以棉花枯萎病菌及稻瘟菌作为根肿菌指示菌进行平板对峙筛选,其中有54株分离菌株抑菌带宽度大于3mm;通过离体试验发现有20株生防菌株对根肿菌休眠孢子萌发抑制率达30-50%,16株可使根肿菌休眠孢子失活率达40-55%;通过盆栽防治试验发现有2株生防菌株F85和T113对根肿病防治效果达60%以上;两株生防菌处理后显著降低根肿菌的根毛侵染率,降低根肿菌休眠孢子初级原质团的分化,抑制次级游动孢子囊的形成。进一步对生防菌株F85和T113进行鉴定。生防菌株F85和T113菌体细胞均呈杆状,革兰氏染色反应显示阳性,16S rDNA分子鉴定且系统进化树分析都表明菌株F85和T113属于Bacillus,利用Biolog微生物快速鉴定系统鉴定结果也显示为芽孢杆菌属,但不能准确鉴定到种。
  2.通过传统的形态学,16S rDNA序列分析和Biolog微生物快速鉴定系统将对稻瘟菌具有强拮抗作用的菌株BJ-1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液经不同温度(4-100℃)和不同pH(2-12)处理后对稻瘟菌菌丝的生长抑制效果不变,表明枯草芽孢杆菌BJ-1分泌产生的抑菌成分具有热稳定性及耐强酸、碱能力。平板对峙试验结果表明,枯草芽孢杆菌B J-1具有较广的抑菌谱,对多种植物病原菌菌丝生长均有抑制作用,其中对稻瘟菌的抑菌带达22.7mm。显微观察发现,枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液(0.5%v/v)处理后的稻瘟菌菌丝尖端膨大畸形,有菌丝溢断现象。分生孢子经发酵液处理后萌发不正常,产生的芽管畸形膨大,对附着胞形成具有明显的抑制作用。在离体叶片上,浓度为1x108CFU/mL的BJ-1菌体悬浮液和浓度为5%的发酵液和发酵滤液已可完全防治稻瘟病。盆栽试验结果表明,10%枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液喷雾处理,防治效果达50.0%;BJ-1发酵液浸种处理防效更好,对稻瘟病防效可达74.3%,且对水稻植株生长有促生作用。通过实时荧光定量PCR检测,发现BJ-1发酵液处理种子后能诱导SA信号通路PAL、ICS1基因、JA信号通路AOS2基因以及抗性相关蛋白PR1a和PR10的上调表达。说明BJ-1发酵液处理种子可诱导水稻植株体内SA和JA信号通路相关基因的表达,激活水稻的防卫反应,诱导寄主产生系统抗性。
[硕士论文] 田甜
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物寄生线虫(Plant Parasitic Nematodes)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫,主要寄生在植物根部,几乎可以感染所有的作物并造成作物减产,据统计可造成全世界每年1500多亿美元的经济损失。在长期的防控植物寄生线虫的实践中,人们逐渐认识到生物防治有着其它防治措施难以比拟的优势,而生防细菌在防控植物寄生线虫实践中发挥着独特作用,因此基于生防细菌的生物防治技术的研究开发受到世界各国普遍重视。丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)MB03是本实验室从感病植物组织中分离到的一株病原细菌,前期工作已证实该菌对模式线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和主要的作物虫害线虫南方根结线虫(Meloidogyne incognita)均呈现杀虫活性。本研究通过序列比对确定了一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA,对该蛋白的杀虫活性、抑制线虫生长、运动、产卵和取食偏好等的性能和在线虫体内的作用部位进行了观测;对该蛋白的作用结构域进行了分析;然后对其在线虫体内的可能受体进行了初步筛选。所获得的主要研究结果如下:
  基于MB03菌株的基因组序列构建了该菌毒性蛋白与毒性因子的预测数据库。数据库显示MB03中共有200多个潜在的具有直接或辅助杀虫的酶类或毒性蛋白,主要种类包括有Rhs家族、几丁质酶类、胶原蛋白酶类及溶血素类蛋白等。通过VirulentPred网站进行辅助序列分析从数据库中确定一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA作为研究对象。将PtxA基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a上,并表达和纯化获得PtxA纯蛋白。纯化PtxA蛋白对秀丽隐杆线虫显示具有较强的毒性,测得LC50值为65.955(41.032~125.246)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为Y1=-4.493+2.47X1;对南方根结线虫的生测LC50为139.825(30.139~264.375)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为:y2=-6.259+2.917X2,也呈现很强的毒性作用。对秀丽隐杆线虫L1期虫体生长抑制实验表明,PtxA蛋白具有很强的抑制生长作用,在315μg/mL作用浓度下,实验组线虫体长仅达到对照组线虫的50%。此外,PtxA蛋白能够抑制线虫产卵数,相同浓度下实验组线虫产卵数远低于对照组,在252μg/mL作用浓度下,实验组线虫平均产卵数仅为对照组的30%。取食偏好性实验表明相对重组菌来说线虫更偏向于取食含有空载的大肠杆菌。通过用绿色荧光标记秀丽隐杆线虫基因工程缺陷虫株FT63肠道和用FT63作为试虫,经PtxA作用3d后,观察到实验组线虫竹节状荧光结构遭到部分破坏,而对照组则很完整,说明PtxA蛋白可对线虫肠道造成物理伤害。利用pDS3.0系统将ptxA基因敲除,比较PG平板上△PtxA和野生菌株MB03对秀丽隐杆线虫的毒性,结果展示了二者毒性有一定的差异,△PtxA菌株平板上线虫死亡率要小于野生菌株MB03。
  为验证PtxA蛋白两个预测结构域的功能,将各自编码基因片段分别克隆到表达载体上,构建大肠杆菌重组菌MB772和MB773,经表达后得到纯化蛋白DUF和M10_C。利用秀丽隐杆线虫做试虫进行液体杀虫试验,结果显示两个截断的功能结构域片段均对线虫有一定的毒性,其中DUF蛋白的毒性强于M10_C,但是两个截断结构域的蛋白毒性弱于全长结构域的蛋白毒性,反映出PtxA蛋白的毒性要靠两者协作才能完全发挥。
  将PtxA作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交实验从秀丽隐杆线虫体内获取了20多个疑似受体蛋白,从中选取了rps9、rps25、daf-21和col-77等四个受体蛋白基因设计引物,以不同处理时间的线虫总RNA为模板,调查PtxA作用后不同时间线虫基因的表达量变化情况。结果显示相对于对照组来说,PtxA作用线虫12h和24h后,这4个基因表达量基本上都发生了下调,反映出PtxA蛋白影响了这些线虫基因的表达。
[硕士论文] 易时雨
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:灵敏的嗅觉系统在昆虫寄主定位、寻找配偶等行为过程中起着重要的作用。目前的研究表明,气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)等多种蛋白在对气味分子的识别过程中起着重要的功能,但对于OBPs或CSPs在昆虫中确切的生理功能及识别气味分子的机制并不是很清晰。前期在对林业重要害虫松褐天牛Monochamus alternatus Hope寄生性天敌松褐天牛肿腿蜂Sclerodermus sp.触角转录组测序中,鉴定了多个OBPs和CSPs基因,但对于OBPs和CSPs在其嗅觉感受中功能并未深入了解。为此,本课题以松褐天牛肿腿蜂为研究对象,分析了SspCSP2的时空表达特征及与气味分子的结合特性,探索了SspOBP7与寄主挥发物的结合特性及结合机制,以期为探明OBPs和CSPs在其嗅觉感受中的功能奠定理论基础。主要的研究结果如下:
  (一)松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的功能分析
  1.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因的克隆及时空表达特性
  通过PCR技术,克隆得到了1个CSPs(SspCSP2,GenBank登录号:ALG36155.1)的全长,其开放阅读框为360bp,编码120个氨基酸。qRT-PCR实验技术分析了SspCSP2在松褐天牛肿腿蜂不同虫态、不同组织的表达情况,结果表明,SspCSP2显著表达于幼虫、有翅雌虫的腹部及无翅雌虫的腹部,其中在有翅雌虫腹部的表达量最高。
  2.重组SspCSP2与气味物质的结合特性
  成功构建重组质粒SspCSP2-pET20b,并大量表达于大肠杆菌BL21(DE3)中,利用DE52阴离子交换柱成功获得纯净重组SspCSP2。以1-NPN为探针,利用荧光竞争性结合试验,分析SspCSP2在pH7.4和pH5.0条件下与24种气味分子的结合特性。结果表明,在酸性条件下,SspCSP2与大多数气味物质的结合能力高于中性条件,22种物质展现出与SspCSP2具有较强的结合能力(Ki<20μM),其中(-)石竹烯氧化物、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和壬醛3种气味物质与SspCSP2的结合能力最强(Ki<10μM);相反,SspCSP2与顺-3-己烯醇和(+)-α-长叶蒎烯这2种气味物质的结合能力则为在中性条件下的高于酸性条件;但pH对SspCSP2与反式-2-己烯醇的结合能力无影响。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的荧光猝灭分析
  Stern-Volmer方程分析SspCSP2与4种具有电生理活性物质(α-蒎烯、β-蒎烯、γ-异松油烯与(+)-α-长叶蒎烯)的猝灭类型,结果显示4种物质均为静态猝灭;结合位点分析发现,4种物质与SspCSP2的结合比例均为1∶1。热力学方法分析发现,4种物质与SspCSP2之间的相互作用力均为疏水性作用力。
  (二)松褐天牛肿腿蜂SspOBP7与气味分子的结合机制
  1.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的荧光猝灭分析
  SspOBP7与24种气味分子的猝灭类型和相互作用研究结果表明,SspOBP7与18种气味分子的猝灭类型属于动态猝灭,余下的6种物质属于静态猝灭;6种静态猝灭的物质中有3种物质属于非极性分子,分别为s-(-)柠檬烯、(+)-α-长叶蒎烯和异松油烯,与SspOBP7形成疏水性作用力;余下3种物质,反式-2-己烯醇、顺-2-戊烯-1-醇和癸醛则属于极性分子,与SspOBP7形成氢键作用;双对数方程分析结果显示,6种物质与SspOBP7的结合比例均为1∶1。
  2.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的结构分析
  利用圆二色谱法分析了SspOBP7在不同pH值、不同配体配比条件下的二级结构变化。结果表明,pH值的变化会引起SspOBP7的α螺旋含量的变化,其中pH7.4条件下SspOBP7的α螺旋数最多,其次是pH3.0,最少的为pH5.0;设定pH7.4,SspOBP7的α螺旋数会随着配体配比的增加而减少;当SspOBP7与配体按1∶1结合后,改变体系pH值,蛋白的α螺旋数变化规律与SspOBP7纯蛋白的一致。
  以意大利蜜蜂Apis mellifera的AmelOBP5(3R72)为建模模板,对SspOBP7进行同源建模。结果显示,SspOBP7具有6个α螺旋,3个二硫键,属于Classical OBP;分子对接结果显示SspOBP7中央具有一个结合腔,呈球状,结合腔的表面具有三处极性区域,分别为Thr86、Tyr105和Phe118。分析极性区域处形成的氢键作用,发现Thr86处与配体形成氢键作用时,需要Tyr105的参与,Phe118与配体形成氢键作用的位置为主链上的氧原子,Tyr105可以单独与配体形成氢键作用,且形成的位置为侧链羟基上的氧原子。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的定点突变及与气味分子结合机制
  针对Tyr105设计定点突变,突变成Phe105,目的是破坏氢键作用。表达、纯化出重组突变蛋白,测定了突变蛋白与6种静态猝灭物质的结合情况。结果显示,这6种物质与突变蛋白的结合能力均有一定程度的减弱,但结合比例没有改变。突变后的SspOBP7与极性分子葵醛的结合能力显著下降,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变之后氢键作用消失;而突变后的SspOBP7与其它2种极性分子,反式-2-己烯醇和顺-2-戊烯-1-醇,仍具有较强的结合能力,荧光猝灭和分子对接结果显示,蛋白突变之后,氢键作用还存在,只是位置发生改变;突变后的SspOBP7与3个非极性分子结合能力明显减弱,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变后仍为疏水性作用,但3个分子在结合腔内的取向均发生了改变。通过对比分析蛋白的结合腔,发现SspOBP7突变之后,结合腔的体积明显变大。
  综上,松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因主要分布在虫体腹部,SspCSP2对气味物质的选择性差,SspCSP2与电生理活性物质主要是通过疏水性作用力结合;SspOBP7与24种物质中的3种极性分子和3种非极性分子结合,结合力分别为氢键作用和疏水性作用力,环境中改变pH值和配体的浓度均会使蛋白的二级结构发生改变,极性区域的破坏会导致SspOBP7的结构发生转变,从而影响蛋白与气味分子的结合,相比之下,非极性分子结合力的改变更明显,疏水性作用力所受影响比氢键作用力更明显。
[硕士论文] 李秋玲
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)是一种严重危害棉花的重要入侵性害虫,而班氏跳小蜂(Aenasius bambawalei Hayat)是其专性寄生性天敌,在扶桑绵粉蚧生物防治过程中具有较好的应用潜力。昆虫气味结合蛋白(OBPs)是气味分子和气味受体之间的桥梁,能够携带疏水性气味分子穿过亲水性淋巴液到达受体细胞,对气味的特异性结合和选择运输上有着重要的研究意义,若能明确班氏跳小蜂气味结合蛋白与配体的相互作用关系,将为筛选班氏跳小蜂寄主定位行为活性物质提供理论依据,也为扶桑绵粉蚧的生物防治提供绿色通道。为此,本课题以班氏跳小蜂为研究对象,在构建转录组的基础上筛选并克隆出了5个AbamOBPs基因,完成AbamOBP50与AbamOBP1的表达与纯化:测定了AbamOBP50与22种寄主挥发物的结合特性;利用荧光猝灭、圆二色谱及同源建模和分子对接分析了AbamOBP1与配基的相互作用关系;利用RNAi及Y型嗅觉仪初步筛选出了对班氏跳小蜂具有行为活性的物质。主要研究结果如下:
  1、班氏跳小蜂AbamOBPs基因克隆、蛋白表达和纯化
  通过RT-PCR技术成功克隆出了班氏跳小蜂基因AbamOBP50、OBP47、OBP43、OBP41及OBP1。开放阅读框分别为369bp、378bp、405bp、402bp、408bp,分别编码123个、126个、135个、134个、136个氨基酸,分别包含有21个、21个、17个、23个、20个氨基酸残基的信号肽,氨基酸序列结果显示AbamOBP50、OBP1和OBP41属于Classic OBPs,OBP47属于Plus-C OBPs,OBP43属于Minus-C OBPs。成功构建重组质粒pET30a-AbamOBP50和pET17b-AbamOBP1。pET30a-AbamOBP50和pET17b-AbamOBP1主要在包涵体中表达,分别通过Ni离子亲和层析柱及DE52弱阴离子交换柱,在体外成功获得AbamOBP50和AbamOBP1的纯蛋白。
  2、班氏跳小蜂AbamOBP50结合特性分析
  以1-NPN(N-苯基-1-萘胺)为荧光探针,利用荧光竞争结合实验测定了班氏跳小蜂AbamOBP50在中性和酸性环境下与22种棉花挥发物单体的结合特性。在中性环境下,AbamOBP50与挥发物单体均有较强的结合能力;在酸性环境下,AbamOBP50与8种物质结合能力较强,分别是1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、S-(-)-柠檬烯、月桂烯、α-水芹烯、β-石竹烯、莰烯和橙花叔醇,其中月桂烯、S-(-)-柠檬烯、α-水芹烯和β-石竹烯在酸性环境下的结合能力高于中性环境下的结合能力。
  3、班氏跳小蜂AbamOBP1与配体荧光猝灭分析
  利用荧光猝灭测定了AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇、S-(-)-柠檬烯的相互作用关系。实验结果表明,AbamOBP1与1-NPN在pH7.4和pH5.0条件下的猝灭过程都是静态猝灭,在pH5.0条件下AbamOBP1与1-NPN是通过静电作用结合,在pH7.4条件下是以疏水作用结合,AbamOBP1与1-NPN是以1∶1比例结合。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇在pH7.4和pH5.0条件下的猝灭过程都是静态猝灭,与S-(-)-柠檬烯在pH7.4条件下是静态猝灭,在pH5.0条件下是动态猝灭。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇在pH7.4和pH5.0条件下都是通过疏水作用结合,与S-(-)-柠檬烯在pH7.4条件下是以氢键作用结合。AbamOBP1与2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇、S-(-)-柠檬烯是以二聚体的方式结合。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮可能以二聚体,三聚体甚至多聚体结合。
  4、班氏跳小蜂AbamOBP1与配体圆二色谱分析
  利用圆二色谱(CD)仪测定了AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇和S-(-)-柠檬烯的CD光谱。通过CD光谱可以观察到AbamOBP1与配基结合后二级结构构象的变化。实验结果表明,AbamOBP1在pH7.4条件下,在208和222nm处负峰值最低,表明α-螺旋含量最高,其次是pH3.0,在pH5.0条件下的负峰值最高,表明α-螺旋含量最低。在pH7.4条件下,AbamOBP1与四种气味物质设置四种配比1∶1;1∶3;1∶5和1∶10。在pH5.0和pH3.0条件下,AbamOBP1与四种气味物质设置两种配比1∶1和1∶3。在这三种不同pH条件下,随着蛋白与气味物质比例的增加,AbamOBP1的CD光谱中负峰逐渐减弱,表明AbamOBP1蛋白中的α-螺旋含量逐渐降低。说明蛋白与气味物质的结合导致蛋白肽链延伸,改变了蛋白二级结构。
  5、AbamOBP1在班氏跳小蜂寄主定位中的功能
  利用Y-型嗅觉仪测定了班氏跳小蜂雄蜂对1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、2,4,4-三甲基-2-戊烯和S-(-)-柠檬烯这4种挥发物单体的行为选择实验。结果发现1-辛烯-3-酮和2,4,4-三甲基-2-戊烯对其有明显的吸引作用,而1-辛烯-3-醇和S-(-)-柠檬烯对其没有吸引作用。RNAi实验表明在干扰48h和72h后AbamOBP1基因的相对表达量显著降低。干扰后对具有吸引作用的两种物质1-辛烯-3-酮和2,4,4-三甲基-2-戊烯进行行为选择验证。结果表明在干扰48h和72h后,这两种物质对班氏跳小蜂雄蜂的吸引作用明显降低。
  6、班氏跳小蜂AbamOBP1同源建模和分子对接
  以同源蛋白Apis mellifera的ASP1(3CAB pH7.0,3CDN pH4.0)为模板,建模得到AbamOBP1的三维结构,其具有六个α-螺旋,三个二硫键,属于Classic OBPs。通过预测发现在pH4.0条件下的结合腔要比pH7.0条件下的结合腔要大。分子对接显示,在pH4.0条件下,氨基酸lle3、Phe51、Phe54、Leu56、Leu63、Va168、Arg71、lle72、Gly80、Met83、lle84、Phe106、Lys113、Tyr114、Phe115、Val116和lle117主要参与了AbamOBP1与配基的结合。在pH7.0条件下,氨基酸Phe51、Leu56、Leu57、His62、Leu63、Asp64、Lys67、Val68、Leu69、Arg71、lle72、Ala99、Leu102、Val103、Phe106、Lys113、Tyr114、Phe115和Val116主要参与了AbamOBP1与配基的结合。
[硕士论文] 王文君
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:转Bt基因抗虫作物对大部分鳞翅目害虫具有较高的抗性。Bt杀虫蛋白可能通过对寄主的寄生而传递至其天敌体内。鳞翅目寄主取食转Bt基因抗虫作物后,其生长发育通常受到显著不利影响,从而产生“猎物质量介导效应”导致无法对其天敌进行准确的安全性评价。消除这种效应后,能大大提高转基因植物安全性评价的可靠性。本研究选择鳞翅目害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)及其寄生天敌麦蛾柔茧蜂(Habrobracon hebetor)作为研究对象,通过显微注射Bt蛋白至印度谷螟幼虫血淋巴中,将印度谷螟幼虫血淋巴作为Bt蛋白的载体,构建了一种适合外寄生寄生蜂的Tier-1安评体系。结果表下:
  (1)单头印度谷螟老龄幼虫注射70ng浓度为0.5ng/nl的Cry1C蛋白至印度谷螟幼虫血淋巴后,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中先快速下降,后缓慢下降。在注射0h时,近注射端印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白的含量显著高于远离注射端印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白的含量;注射0.5h后,两者无差异。被麦蛾柔茧蜂寄生后,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中的浓度在7天内趋于稳定,且含量始终高于直接取食转Bt基因稻谷印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白含量(1.72ng/g)的10倍以上,生测结果表明印度谷螟幼虫血淋巴中Cry1C蛋白具有生物活性。而未被麦蛾柔茧蜂寄生的状态下,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中的含量会一直下降。
  (2)印度谷螟幼虫血淋巴中的高剂量Cry1C蛋白对麦蛾柔茧蜂的卵孵化率、卵至成虫发育历期、雌性率、蛹重、初羽化(雌、雄)成虫体重、成虫寿命、存活率以及生殖力均无显著负面影响;而阳性对照GNA对麦蛾柔茧蜂的卵孵化率初羽化雌成虫体重、初羽化雄成虫体重、成虫寿命以及生殖力造成负面影响。(3)Cry1C蛋白能通过印度谷螟血淋巴传递至麦蛾柔茧蜂体内。Cry1C蛋白可在麦蛾柔茧蜂幼虫体内不断累积,在麦蛾柔茧蜂老熟幼虫体内富集量最高;麦蛾柔茧蜂蛹内、成虫体内的Cry1C蛋白含量不断下降,低于麦蛾柔茧蜂幼虫的Cry1C蛋白蛋白含量,远低于印度谷螟血淋巴中的Cry1C蛋白含量。然而,麦蛾柔茧蜂成虫体内Cry1C蛋白含量低于检测值下限。
[硕士论文] 王梅菊
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本研究旨在分离和筛选生防细菌菌株,明确其分类属性,评估其生防潜力。取得了如下研究结果:
  1.分离筛选获得了促生细菌菌株AW-17和CanL-30。
  分别从湖北武汉、湖北咸宁和安徽芜湖采集的植物样品中分离到82个菌株,包括细菌菌株和酵母菌菌株。采用拟南芥平板对峙培养试验和油菜浸种促生试验相结合的方法筛选得到2个促进植物生长的细菌菌株AW-17和CanL-30。菌株AW-17和CanL-30均能够通过产生挥发性有机物促进拟南芥幼苗生长,另外菌株AW-17还能够产生吲哚乙酸IAA,具有溶解不可溶性磷的能力。将这两株细菌用于盆栽油菜促生试验,结果表明:菌株AW-17对油菜生长有稳定促生效果,而菌株CanL-30则不具备盆栽促生能力。
  2.明确了菌株AW-17和CanL-30的生物学特性,并对其进行了鉴定。
  菌株AW-17单菌落乳黄色,质地光滑粘稠,在8℃~35℃条件下均能生长,最适生长温度范围为20℃~30℃,在7%及以下的盐浓度条件下均能生长,但无法在10%盐浓度条件下生长,革兰氏染色阴性,不产生芽孢。生理生化测定结果和16SrDNA序列分析表明:菌株AW-17属于液质沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)。菌株CanL-30单菌落乳白色,质地光滑干燥,在15℃~40℃条件下能较好的生长,最适生长温度范围为20℃~30℃,在7%及以下的盐浓度条件下均能生长,但无法在10%盐浓度条件下生长,革兰氏染色阳性,产生芽孢。鉴定结果表明菌株CanL-30属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
  3.筛选出拮抗菌株CanL-30,并对其产生的抗真菌代谢产物进行了分离纯化。
  利用平板对峙培养和离体油菜叶片接种相结合的方法,筛选到1株能够稳定抑制灰葡萄孢的拮抗菌株CanL-30,其能够对多种病原菌产生拮抗作用,二分格皿试验和带毒平板试验结果表明菌株CanL-30主要通过产生抗真菌代谢产物抑制病原菌的生长。菌株CanL-30在NB培养基中,28℃、150r/min的条件下摇培72h,产生的抗菌代谢产物抑菌效果最好,抑菌率达到90%,利用酸沉淀和甲醇萃取的方法对该条件下CanL-30产生的抗菌代谢产物进行提取,带毒平板试验结果显示,不同浓度粗提物平板对灰霉菌均有不同程度的抑制作用,其中365μg/mL粗提物平板对灰霉菌的抑菌率高达100%。CanL-30抗真菌粗提物具有耐高温、抗紫外的特性,其在100℃的水浴锅中处理60min钟后,抑菌活性与对照相比无差异。用紫外灯(UV-C,30W)处理抗菌粗提物150min后,其抑菌圈大小与对照无显著差别。对粗提物中的活性物质进行了分离和鉴定,发现CanL-30产生的代谢产物中含有iturin。
  本研究获得的油菜促生菌株AW-17和灰葡萄孢生防菌CanL-30存在着进一步研究和开发的潜力。
[硕士论文] 刘俊丽
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum,Pba)通过产生大量果胶酶来降解马铃薯组织细胞的细胞壁果胶成分,破坏细胞组织,造成马铃薯植株茎部变黑腐烂,块茎发生软腐。目前,针对由Pba导致的马铃薯黑胫病仍缺乏有效的防治办法。噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌等微生物的病毒,其中烈性噬菌体导致宿主菌细胞裂解,可用于植物病害的防治。从土壤和水样中分离获得7株烈性噬菌体。噬菌体表征结果表明,噬菌斑直径1.5-2 mm,最佳感染复数0.000001-0.01。吸附时间6-30 min,潜伏时间15-40 min,裂解时间40-80 min。筛选出吸附、潜伏时间短,而裂解时间长的3株噬菌体P-Pba-1、P-Pba-2和P-Pba-7。电镜结果表明这3株噬菌体均为无尾噬菌体,头部直径30-80nm。
  本研究选择P-Pba-1作为单一制剂G1,P-Pba-1、P-Pba-2、P-Pba-7的混合物作为混合制剂G2,在田间网室进行马铃薯黑胫病防治试验,试验包括治疗组(先注射病原菌后喷洒噬菌体)和预防组(先喷洒噬菌体后注射病原菌)。治疗组结果表明,G1处理组的马铃薯植株存活率40-100%,其中处理组G1-A4治疗效果最好,植株存活率为100%;G2处理组的马铃薯植株存活率60-90%,其中处理组G2-A3治疗效果最好,植株存活率为90%。预防组结果表明,G1处理组的马铃薯植株存活率60-100%,其中处理组G1-B1和G1-B2预防效果最好,植株存活率为100%; G2处理组的马铃薯植株存活率80-100%,其中处理组G2-B1和G2-B2预防效果最好,植株存活率为100%。以上结果表明,噬菌体对马铃薯黑胫病有防治效果,可进一步开发噬菌体制剂,用于马铃薯黑胫病的防治。
[硕士论文] 国慧
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本论文以实验室分离得到的萎缩芽孢杆菌SF1为研究对象,为了探究其拮抗蛋白的功能,对其β-1,3-葡聚糖酶基因进行了克隆和表达。本文的主要研究内容和结果如下:
  1、β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆:从萎缩芽孢杆菌SF1中克隆获得了β-1,3-葡聚糖酶基因bgl,基因全长1086bp,G+C含量50.4%,编码358个氨基酸,理论的分子量为47 kDa。
  2、β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达:将克隆得到的β-1,3-葡聚糖酶基因片段与表达载体pGEX-4T-1连接构建重组质粒pGEX-4T-1-bgl,转化宿主菌BL21(DE3),并成功获得工程菌株NDM-1。经SDS-PAGE电泳检测,融合蛋白相对分子量约为73 kDa。
  3、β-1,3-葡聚糖酶酶活力及抑菌效果的测定:异源表达的β-1,3-葡聚糖酶,抑菌率最高达到45%,是菌株SF1抑菌率的61.9%。
[硕士论文] 李纪伟
植物保护 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:花绒寄甲Dastarcus helophoroides(Fairmaire)属鞘翅目(Coleoptera)寄甲科(Bothrideridae),是防治多种林木蛀干害虫的有效天敌。本研究利用三种替代寄主—黄粉虫(蛹)、大麦虫(蛹)、褐梗天牛(幼虫、蛹)进行花绒寄甲的室内扩繁,对三种替代寄主的最大接虫量,不同接种比例下繁育的花绒寄甲的结茧率、羽化率、成虫雌雄比、产卵前期、单雌产卵量、最佳接虫比等方面进行了统计分析。结果表明:
  1、单头大麦虫蛹最多可繁育23头花绒寄甲成虫,作为替代寄主繁育花绒寄甲的潜力最大;单头黄粉虫蛹最多可繁育5头花绒寄甲成虫,单头褐梗天牛幼虫最多可繁育5头花绒寄甲成虫,单头褐梗天牛蛹最多可繁育9头花绒寄甲成虫。
  2、大麦虫蛹与花绒寄甲初孵幼虫接种比例为1:5时,结茧率与羽化率最高,分别为72.22%和69.11%。黄粉虫蛹与花绒寄甲初孵幼虫接种比例为1:2时,羽化率最高为35%;接种比例为1:5时,结茧率最高,为39.33%,羽化率为21.56%;接种比例以1:2最佳。褐梗天牛蛹与花绒寄甲初孵幼虫接种比例为1:4时羽化率最高,为74.44%;随着接种数目的增加,结茧率不断升高,最高可达到79.44。褐梗天牛幼虫龄期为9龄时、接种比例为1:4时,褐梗天牛幼虫繁育的花绒寄甲结茧率与羽化率最高,分别为69.72%和61.11%。
  3、三种替代寄主繁育的花绒寄甲成虫平均体重随着羽化数目的增加而逐渐降低。
  4、三种替代寄主繁育的花绒寄甲的产卵前期时长差异不显著,均在40d左右;花绒寄甲的雌雄比差异性不显著,均接近1:1。
  5、利用三种人工饲料SL1、SL2、SL3饲喂不同类型花绒寄甲成虫,在9月至次年3月时间段内死亡率差异性不显著;饲喂不同人工饲料的花绒寄甲的月均单雌产卵量差异性不显著;三种人工饲料均可用于花绒寄甲成虫的饲喂。
  6、利用相同人工饲料SL3饲喂不同种类的花绒寄甲成虫,在9月至次年3月为期7个月的时间内,在9月达到产卵高峰期,最产卵数均达400头以上;11月至12月产卵量最低,部分花绒寄甲雌虫出现不产卵的现象,1月份后产卵量逐渐回升。
  7、接种比例相同时,随着寄主化蛹后时长的增加,接种的花绒寄甲羽化率逐渐降低;黄粉虫蛹表皮硬化速度最快;三种替代寄主蛹的最佳接种时间为化蛹后的24h。
[硕士论文] 侯圆圆
植物保护 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:瓜类枯萎病给瓜类生产造成巨大的经济损失,并且其防治十分困难。绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)G5菌株是一株具有生防功能的内生细菌。以绿针假单胞菌G5菌株为生防因子,进行苦瓜枯萎病和黄瓜枯萎病生物防治技术的初步研究。研究结果如下:
  1、通过平板对峙试验,绿针假单胞菌G5菌株对苦瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. momodicae)SG-15菌株和黄瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. cucumerinum)FOC菌株的菌丝具有明显拮抗作用,采用不同接种方法,G5菌株对SG-15菌株菌丝生长的抑制率达到60%以上;两点对峙法试验G5菌株对FOC菌株抑制率达到78.39%。
  2、利用绿针假单胞菌G5菌株对温室盆栽苦瓜枯萎病进行防治试验。G5菌株对苦瓜枯萎病幼苗防病效果达到31.32%;利用绿针假单胞菌G5菌株处理黄瓜幼苗,温室盆栽黄瓜枯萎病防病效果达到72.88%。
  3、利用绿针假单胞菌G5菌株处理黄瓜种子,48 h后测量黄瓜种子胚根长度,相对于空白对照处理,促生效果达到37.36%。再用绿针假单胞菌G5菌株处理发芽的黄瓜种子,播种40 d后,株高、茎粗、叶面积、干重、鲜重、壮苗指数均高于空白对照处理,并且G5菌株处理能使黄瓜叶片叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量分别增加1.6%、4.8%、1.1%。
  4、进行绿针假单胞菌G5菌株与海藻肥复配对温室苦瓜幼苗的促生试验,单独施用海藻肥、单独施用生防菌、施用海藻肥与生防菌混合液三个处理的苦瓜苗株高、茎粗、叶面积、干重、鲜重、叶片数、壮苗指数均高于空白对照处理,且生防菌与海藻肥混合使用时试验效果最佳。
  5、单独施用海藻肥、单独施用生防菌、施用海藻肥与生防菌混合液三个处理,均能不同程度提高苦瓜产量,其中施用G5菌株与海藻肥的混合液处理效果最佳,产量显著高于对照处理,增产率达到43.70%。
  6、不同稀释倍数恶霉灵对苦瓜枯萎病菌的生长有抑制作用,随着稀释倍数增大,抑制效果下降。测量不同稀释倍数带毒平板中病原菌的直径,得到毒力回归方程为y=1.9926x+5.0178,相关系数为0.9915。温室盆栽条件下,绿针假单胞菌G5菌株与恶霉灵复配对苦瓜枯萎病和黄瓜枯萎病防治效果要高于单独使用化学药剂和生防菌剂,其中G5菌株与恶霉灵复配对苦瓜枯萎病防病效果达到75.64%,G5菌株与恶霉灵复配对黄瓜枯萎病防治效果达到90.16%。
[硕士论文] 包伟方
植物保护;农业昆虫与害虫防治 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:异色瓢虫是我国一种常见的捕食性瓢虫,在农田系统中对蚜虫、粉凰、螨类等害虫具有很好的控制。除捕食猎物以外,异色瓢虫也会取食花粉、花蜜等植物性食物。充分了解异色瓢虫与花粉、花蜜等植物性食物之间的营养关系,将有助于在农田生境中合理应用相应的蜜源植物,促进异色瓢虫的种群建立与增殖,发挥其最大的控害功能。本研究利用DNA追踪技术研究了异色瓢虫成虫取食花粉的习性,结果如下:
  为评估异色瓢虫对田间不同类型猎物的选择捕食作用,以棉田为例进行了种群调查和捕食评估。调查结果显示,棉蚜与烟粉虱种群密度高,而棉铃虫与朱砂叶螨发生数量较低。利用DNA分子检测发现:异色瓢虫体内棉蚜DNA的检出率为65.83%,棉铃虫DNA的检出率为2.5%,烟粉虱DNA的检出率为0.67%,朱砂叶螨DNA的检出率为0.67%。田间异色瓢虫以捕食棉蚜为主。
  为准确评估害虫体内植物DNA在异色瓢虫体内的残留时间,以异色瓢虫-棉蚜-棉花为研究对象,利用PCR技术检测瓢虫取食棉花上棉蚜、棉花花粉后,体内棉花DNA的残留情况,明确摄入方式、消化时间对棉花DNA检出率的影响效应。结果表明,异色瓢虫成虫取食棉花叶片上的棉蚜,4h后体内棉花DNA的最大检出率为16.7%,8h后完全检测不到。瓢虫取食棉花花粉,4h后体内棉花DNA检出率为70.4%,12h后为51.9%,16h后下降为39.3%,20 h后才检测不到。异色瓢虫取食棉花花粉后,体内棉花DNA残留时间远长于通过捕食棉蚜的摄入方式,这种差异有助于对瓢虫体内由不同方式摄入的植物DNA进行区别分析。
  为明确多作物农田生态系统中异色瓢虫成虫的植物花粉利用习性,对河北廊坊灯光诱捕到的、并经约12小时饥饿的异色瓢虫成虫体内植物DNA进行克隆测序。异色瓢虫体内共检出13科植物的DNA,主要有锦葵科、伞形科、十字花科和豆科植物等,其中以陆地棉与欧芹属植物为主,检出率分别为55.22%和20.90%。7月份,异色瓢虫体内检测到了陆地棉、欧芹属、榆属、芸苔属等植物的DNA;8月份,共检测到9个不同科的植物的DNA,主要为陆地棉,同时也检测到葎草、李子、豚草、欧芹属、杨属、芸苔属植物的DNA;9月份,陆地棉和欧芹属植物的检出率的最高,同时也检测到了碱蓬、大豆属、藜属等植物的DNA。
  对2014年与2015年山东长岛灯诱的、并经约12小时饥饿的异色瓢虫成虫体内植物DNA进行克隆测序,结果发现异色瓢虫体内共检测到22不同科的植物DNA。6月份,瓢虫体内共检出了13个不同科植物的DNA,主要为紫穗槐属、柑橘属、刺槐,分别占17.86%、14.29%、10.71%;同时也有瓢虫体内检出了栎属、小麦等植物的DNA;7月份,瓢虫体内共检出了12个不同科植物的DNA,主要有棉属与合欢花,分别占29.03%、12.90%,也有部分瓢虫体内检出了猪毛菜属、牡荆属等植物的DNA;8月份,瓢虫体内共检出了4个不同科植物的DNA,主要有蒿属、陆地棉、碱蓬属,分别占33.33、13.33%、13.33%,同时也检出了合欢花等植物DNA。
  以上的结果解析了异色瓢虫主要取食的植物花粉种类,明确了不同季节异色瓢虫偏好取食的植物,为促进天敌的区域性保护与控害提供重要的科学理论依据,同时为深入研究区域性异色瓢虫的不同生境转换关系提供了重要的理论基础。
[博士论文] 吕昂
植物病理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:链霉菌是一类丝状原核生物,产孢,基因组G+C mol%含量在80%左右。链霉菌广泛存在于土壤,海洋,植物组织内以及空气中。来源于链霉菌的天然活性次级代谢产物中占已知天然活性产物的70%~80%,包括杀虫、除草、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、酶类等生物活性的物质。本研究以本实验室分离到的链霉菌3-10作为研究对象,对其分类地位、生物活性、抗真菌物质的分离纯化与鉴定、挥发性物质的生防潜力进行系统研究,主要结果如下:
  1.确定了链霉菌3-10的分类地位。从培养特征、显微形态、生理生化特征和分子鉴定对菌株3-10进行了鉴定。证明该菌株属于阳陵链霉菌(Streptomycesyanglinensis)的一个新的进化型(Phylotype)。
  2.确定了提取链霉菌3-10抗真菌物质的有机溶剂剂及提取程序。发现乙酸乙酯是最佳的提取有机溶剂。通过菌丝生长抑制法确定了链霉菌3-10粗提物的抑菌谱。结果表明:粗提物浓度为5μg/mL时对供试的16种植物病原真菌的抑制率大于80%。粗提物可以抑制灰葡萄孢的分生孢子萌发,以及根霉和毛霉的孢囊孢子萌发和芽管伸长。在草莓果实贮藏期,粗提物可以抑制灰葡萄孢、核盘菌、根霉、毛霉在果实上的侵染,显著降低草莓腐烂严重程度。在保护地种植的草莓上,施用50μg/mL的粗提物可以降低草莓灰霉病的病情严重程度,田间试验防效在50%左右,试验过程中未发现粗提物对草莓生长有任何不良影响。粗提物对大麦白粉病可以起到保护作用兼具治疗作用。
  3.明确了链霉菌3-10粗提物抗真菌活性的影响因子。结果表明,80℃处理10 min可以使粗提物的生物活性显著下降。当粗提物经紫外线(UV-C)下照射1min后其生物活性就开始下降,照射20 min后粗提物的生物活性完全丧失。在酸性条件下粗提物的水溶液呈悬浊液状态,具有较高的生物活性。在碱性条件下粗提物水溶液呈澄清状态,其生物活性有所下降。将粗提物制备成干粉后,粗提物的抗真菌活性在低温至常温条件下能保持较长时间。
  4.从链霉菌3-10的发酵产物中分离纯化出2个抗真菌化合物,即ReveromycinA和ReveromycinB。这两个化合物均为白色无定型粉末,易溶于甲醇,不溶于水。这两个化合物对4种植物病原真菌都能表现良好的抑菌作用。在相同环境pH值条件下,Reveromycin A的抗真菌活性高于Reveromycin B。在pH=4.5条件下,Reveromycin A对灰葡萄孢、核盘菌、根霉、毛霉菌丝生长的EC50分别为0.88μg/mL、0.65μg/mL、0.67μg/mL和0.73μg/mL;对灰葡萄孢分生孢子萌发的EC50为0.57μg/mL;对根霉、毛霉孢囊孢子萌发EC50分别为0.10μg/mL和0.11μg/mL;Reveromycin B对灰葡萄孢、核盘菌、根霉、毛霉菌丝生长的EC50分别为5.37μg/mL、5.49μg/mL、4.48μg/mL和4.07μg/mL;对灰葡萄孢分生孢子萌发的EC50为4.01μg/mL;对根霉、毛霉孢囊孢子萌发EC50为1.15μg/mL和1.59μg/mL。ReveromycinA和ReveromycinB的抗真菌活性随着环境pH值的升高而下降。
  5.明确了链霉菌3-10产生的挥发性物质(VOCs)的化学成分及抗真菌活性。通过GC-MS检测及数据库比对,确定了不同培养时间的链霉菌3-10产生的VOCs种类及含量。共检测到19种VOCs,包括脂肪醇类、芳香族醇类、萜类、有机酸酯类和烯烃类。其中,2-甲基异莰醇是链霉菌3-10产生的VOCs的主要成分。在10d菌龄培养物中,2-甲基异莰醇的相对含量占27.9%。从中选择了4种VOCs,即2-甲基异莰醇、2-甲基丁酸甲基酯、苯乙醇和石竹烯,测定了这些物质的纯品对黄曲霉和寄生曲霉菌丝生长和产孢抑制活性。结果表明:2-甲基异莰醇、2-甲基丁酸甲基酯和苯乙醇均可以显著抑制黄曲霉和寄生曲霉的菌丝生长和产孢,石竹烯几乎没有抗真菌活性。同时,2-甲基丁酸甲基酯对黄曲霉和寄生曲霉分生孢子萌发表现出较好的抑制作用。
  6.明确了链霉菌3-10产生的VOCs对花生贮藏期黄曲霉和寄生曲霉污染以及产黄曲霉毒素的抑制效果。当链霉菌3-10小麦粒培养物为17 g/L时,所释放的VOCs熏蒸花生籽粒7d后,显著抑制黄曲霉和寄生曲霉分对花生籽粒的侵染。当熏蒸源浓度上升至86g/L时,可以基本抑制黄曲霉和寄生曲霉对花生籽粒的侵染,在籽粒中也没有检测到黄曲霉毒素的产生。通过扫描电镜的观察发现,经过链霉菌3-10产生的VOCs熏蒸后,黄曲霉和寄生曲霉菌丝变得畸形,塌陷。经高浓度VOCs熏蒸后,黄曲霉和寄生曲霉分生孢子不能萌发。以上结果表明,链霉菌3-10产生的VOCs具有生防潜力。
  7.获得了链霉菌3-10全基因组信息。全基因组大小为8.65 Mb,染色体大小为8.59 Mb,质粒大小为55.49 Kb,基因组G+C mol%含量为73.8%。在全基因组中预测到了7051个编码基因。通过antismash在线比对发现了34个次级代谢产物合成基因簇。其中,合成reveromycins的基因簇与Streptomyces reveromyceticusSN-593的相关基因簇相似度为100%。从遗传上证实链霉菌3-10具有合成reveromycins的能力。
  上述研究结果为开发利用链霉菌3-10防治植物真菌病害奠定了基础。同时,关于链霉菌3-10基因组分析为开展该菌株遗传改良研究提供了信息。
[博士论文] 都萃颖
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物寄生线虫(plant-parasitic nematodes,PPNs)是一类严重威胁现代农业的植物病原生物,宿主范围极广,多侵染植株地下根部,病原隐蔽性强。根结线虫(Meloidogyne spp.或root-knot nematodes,RKNs)是所有PPNs中危害最严重的种类,利用现有资源难以防治。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是潜在的线虫病原菌,蕴含多重杀线虫毒素。CT-43菌株是本实验室早期分离到的高毒力Bt菌株,虽然具有良好的田间生防效果,但人们对其活性组成仍不甚了解。本室前期在寻找CT-43菌株新型杀线虫毒素时,发现了一种高丰度且对南方根结线虫(M.incognita)表现良好毒杀活性的未知组分CT-A。化学结构鉴定结果显示,CT-A是已知物质反式乌头酸(trans-aconitic acid,TAA,174.11Da)。TAA与细胞三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环的中间代谢产物——顺式乌头酸(cis-aconitic acid,CAA)互为异构体,且是该循环中乌头酸酶(aconitase,ACO)的竞争性抑制剂。虽然人们早已发现自然界中植物和微生物会产生并积累这种不寻常的细胞代谢物,但其生物合成途径及生物学意义却一直未被揭示。本研究正是基于CT-A(TAA)杀线虫活性的新发现,对上述科学问题依次开展了研究,主要研究内容与获得成果如下:
  1)明确了TAA(CT-A)杀线虫活性与特征
  首先,通过南方根结线虫体外生物测定,发现了CT-A高纯品与TAA商业标准品具有极为相近的毒杀特性和半致死浓度,从活性水平上证明了CT-A是TAA;接着,发现了TAA相较CAA具有更强劲的杀线虫活性,且该活性为反式构象所赋予;其次,还发现了TAA具有抑制南方根结线虫虫卵孵化的活性。
  2)首次克隆了TAA(CT-A)生物合成基因簇,阐释了TAA合成途径
  克隆CT-43菌株中CT-A毒素合成基因簇的相关工作在其结构鉴定之前便已开展。已知pCT281质粒与该毒素合成密切相关。本研究首先针对pCT281质粒(281,231bp)全序列设计了26个独立敲除实验,涉及57个靶标基因。最终,研究获得了7个敲除突变株,涉及13个候选基因,但HPLC分析表明它们均与CT-A合成无关。
  在上述敲除实验仍在进行时,CT-A结构被解析,这使得克隆目标变得明确。已知异构酶是微生物合成TAA的关键酶。于是,研究利用CD-Search在pCT281质粒上搜寻到了唯一一个编码蛋白质与已报道的假定异构酶同源的基因CT43_RS29745(1,074bp),命名为TAA biosynthesis-related gene A(tbrA),同时将其下游111bp处的假定膜蛋白编码基因CT43_RS29750(912bp)命名为tbrB。通过对tbr基因进行异源表达、同框缺失和回补等遗传操作以及基于RT-PCR的转录分析实验,证实了tbrA与tbrB组成的tbr操纵子是CT-43菌株中TAA生物合成基因簇。
  随后,本研究通过体外催化实验证明了TbrA具有乌头酸异构酶的催化活性;通过荧光显微镜观察和Western blot杂交,首先证明了TbrB的细胞膜亚定位,又通过分析tbr基因缺失以及增加tbrB膜蛋白基因拷贝数对细胞分泌TAA能力的影响,证明了TbrB蛋白负责转运TAA的生物学功能。综上,本研究揭示了由tbr操纵子介导的毒素TAA的异构合成途径。此外,生物信息学分析表明,TAA合成操纵子还分布于其他蜡状芽胞杆菌群菌株中,这暗示小分子毒素TAA可能参与了较为广泛的芽胞杆菌与线虫之间的相互作用。
  3)揭示了植物内源TAA含量与植物防御线虫能力之间的正相关关系
  本室前期研究发现,植物源TAA也具有毒杀根结线虫的活性。本研究首先测定了不同植物根内TAA含量,并通过综述文献对各物种防御线虫的能力进行了分类,结果发现,根内TAA含量高的植物均为具有良好抵御线虫能力的宿主,而TAA含量低的物种均为易受线虫感染的宿主,这说明植物内源TAA含量正比于植物对线虫的抗性,也暗示了植物TAA含量是潜在的抗性育种生化标记。
  4)预测了潜在的植物(玉米)TAA合成相关基因
  序列比对分析表明,能合成TAA的植物基因组中不含有与微生物tbr基因同源的序列。为寻找植物TAA生物合成基因,本研究首先测定了一个玉米关联群体中455份叶片样本的TAA含量;随后通过与外室合作,以玉米B73基因组为参考基因组,通过全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)提名了2个潜在的TAA合成相关基因,分别为位于2号染色体的假定蛋白编码基因(GRMZM5G874896)与位于3号染色体的生长素受体蛋白(auxin-binding protein1 precursor,ERABP1)编码基因(GRMZM2G116204)。该预测结果还需进一步验证。
  5)证明了TAA活性资源在植物根结线虫防治中的应用潜力
  本研究将高含TAA的玉米叶片进行粉碎并拌土,发现该处理能显著抑制病变根结的产生且不影响植株正常生长;利用高产TAA重组芽胞杆菌发酵液灌根也能显著降低根结数量;此外,研究还发现TAA对同样危害巨大的孢囊线虫也具有良好毒杀活性。基于此,本研究提出了利用TAA资源防治植物寄生线虫的多元策略模型。
[硕士论文] 罗晨薇
植物病理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:盾壳霉(Coniothyrium minitans)是一种能寄生核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌丝和菌核的重寄生真菌,可用于菌核病的生物防治。盾壳霉菌株ZS-1的T-DNA插入突变体库在前期研究中已构建,本研究以其中一个产黑色素缺陷型突变体ZS-1TN24363为材料进行了深入研究,主要结果如下:
  1.通过hiTAIL-PCR克隆到了T-DNA插入位点处的侧翼序列,比对分析发现T-DNA插入破坏了一个可能的基因。该基因全长3167 bp,预测含有3个外显子,2个内含子,编码一个含1011个氨基酸的蛋白。该蛋白N端含有一个Zn-clus和Med3的保守结构域,C端含有一个fungal-TF-MHR的保守结构域。进化树分析发现该蛋白与Clohesyomyces aquaticus的转录因子Cmr1蛋白相似性最高,故将该基因命名为CmMR1。
  2.利用基因敲除技术获得了3个CmMR1基因敲除转化子。敲除转化子和突变体ZS-1TN24363的菌落形态相似,菌落显橙色无黑色素沉积,可产生无色透明的分生孢子器和分生孢子。CmMR1基因互补可使敲除转化子恢复产黑色素表型。基因CmMR1对菌株的生长速率、产孢量、生物学产量、寄生核盘菌菌丝菌和核的能力、对高渗的耐受性等均无明显影响,但CmMR1的敲除使菌丝中ROS含量增多,抗紫外线能力减弱。
  3.基因CmMR1的敲除使黑色素合成酶基因Cm4HNR、CmSCD、Cm3HNR、CmLAC的表达量下调,证明CmMR1参与调控这些黑色素合成酶基因的表达。
  上述结果表明,基因CmMR1不影响盾壳霉的生长、产孢和寄生,但是与黑色素的生物合成有关。
[硕士论文] 赵珊珊
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:大豆菌核病是由土传性病原真菌核盘菌引起的,该菌株的寄主范围较广泛,可以侵染400多种植株,广泛分布于全球各地。由于其可以产生一种休眠体组织菌核,可以长时间存留在土壤中,因此难以得到有效控制。大豆是我们国家的重要农作物,深受菌核病的危害导致每年产量大幅度降低。目前对于该疾病的防治主要以化学制剂为主,但由于化学试剂的使用导致成本的不断提高且对环境的严重危害,使得其无法在实践中更好的得以利用。相比而言,生物防治具有安全可靠、低毒无害等优点,因此采用生物防治的方法来控制大豆菌核病具有十分重要的意义。
  本研究选取了5种高效的筛选培养基对大豆健康植株和感染菌核病的病态植株的根部内生菌进行了分离,将获得的菌株通过培养特征、形态特征的观察后去重,对各样品分离获得的菌落数、菌株数进行统计分析比较。然后利用大豆菌核病的病原真菌作为供试菌株,将分离得到的大豆根部内生放线菌分别进行体外平板抑菌活性以及发酵液抑菌活性的测定,结合大豆苗期试验,对获得的拮抗菌株的抗病、促生、定殖能力进行评估。然后对拮抗菌进行分子生物学、形态培养特征、生理生化特性的描述,为今后大豆菌核病的生物防治提供新资源。此外,本实验还对一株小单孢菌属的稀有放线菌进行了多相分类学鉴定,丰富了微生物资源库。结果如下:
  (1)健康植株以及感病植株大豆根部共筛选得到放线菌1574株,分离自健康植株的菌落数显著高于病态植株。而后将获得的菌株经排重后获得70株不同的放线菌,其中15株内生放线菌仅分离自健康植株,27株内生菌仅分离自感病植株,28株放线菌为健康植株与病态植株共有放线菌,表明经大豆菌核侵染后根部菌群的多样性有所提高。
  (2)对全部经分离纯化的70株菌株均进行了体外抑菌活性试验,5株放线菌对大豆菌核病病原真菌的菌丝的生长存有抑制作用,这5株菌中有2株(ZGS1-10和ZBCPA2-13)为健康植株与感病植株共有放线菌,抑菌率从20.9%到22.4%,另外3株(ZBDPA2-2、ZBAAG12-4和ZBAAG3-15)均分离自病态植株,抑菌率从28.3%到58.5%,其中ZBDPA2-2对大豆菌核病的抑菌效果最强,抑制率可达58.5%,并且对其他检测的11种真菌也均存在抑菌活性。
  (3)大豆苗期试验表明,当ZBDPA2-2的接种浓度达到1.0×106 cfu·g-1-1.0×107 cfu·g-1时,可以明显降低大豆菌核病的发病率以及病情指数,对大豆离体叶片的发病指数也有减弱作用,且对大豆幼苗植株的鲜、干重,根鲜、干重,根长和株高均存在不同的促进作用,并且可以长期稳定的定殖于大豆植株的根表,但无法很好的定殖于大豆的根组织内部。
  (4)通过分子生物学分析、形态特征培养观察、生理生化特性的比较,对ZBDPA2-2进行了初步的特征描述,发现其在多处均不同于相似菌株,并确定该菌株属于链霉菌属。
  (5)本实验对一株稀有放线菌NEAU-JXY5T进行了多相分类学鉴定。经16S rRNA和gyrB基因序列的分析发现,菌株NEAU-JXY5T与多个小单孢菌属的典型菌株的相似度很高,且始终在一个进化分支上,但经过形态培养特征、生理生化特性、细胞化学组分等的分析比较,其符合小单孢菌属的典型特征但又显著区别于其他相似度较高的菌株,且DNA同源性分析结果表明,菌株NEAU-JXY5T与其他检测菌株的同源性均在70%以下,从而确定了菌株NEAU-JXY5T为小单孢菌属的一个新种,命名为Micromonospora parathelypteridis。
[硕士论文] 徐馨竹
植物保护;农业昆虫与害虫防治 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:夜蛾科(Noctuidae)害虫种类多且危害广,发生周期长,给农业生产带来极大损失。目前夜蛾科害虫的治理仍以化学防治为主,化学农药长期大量施用造成的“3R”问题,使生态环境日趋恶化,也使得有害生物的绿色防控成为众望所归。苏云金杆菌(简称Bt)以其杀虫专一性强、环境友好等特点,在害虫生物防治中得到大量应用,但随着Bt大面积的推广应用,田间抗性种群也不断产生,因此,不断挖掘新的Bt菌株,筛选出高效、广谱的cry基因尤为重要。
  本研究利用醋酸钠选择筛选法从黑龙江省不同类型的土壤中分离出苏云金杆菌,并对其基因型进行了鉴定,以棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae Linnaeus)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)为靶标,检测了菌株对夜蛾科害虫的生物活性,并对高毒力菌株的新基因进行了克隆与表达,获得以下实验结果:
  从黑龙江省不同地区采集的352土样中分离出Bt菌株46株,出菌率为13.6%,其中哈尔滨等地区的黑土与伊春等地区的暗棕壤分离出来的Bt菌株最多,出菌率分别占18.81%和18.83%;其次是加格达奇等地区针叶林土和齐齐哈尔等地区的草甸土,出菌率分别占7.89%与9.52%,佳木斯市风沙土的出菌率为2.38%,大庆等地区的盐碱地并没有分离出Bt菌株。
  通过光学显微镜镜检观察,分离株的伴孢晶体形态不一,主要以长菱形、钝菱形等不同类型的菱形为主,还存在不规则形、球形、镶嵌形等一些晶体类型,部分分离株还可观察到几种形态晶体共存的现象。
  采用PCR-RFLP鉴定体系,利用10对通用引物筛选出cry1、cry2、cry8以及cry9四种基因型。其中,检测出cry1类基因的菌株共34株,检出率最高,占73.91%,其次是存在cry2类基因的菌株共计18株,4株检测出cry8类基因,6株存在cry9类基因。有16株菌株仅有单一的cry1或cry2基因,其他呈现基因组合形式,如cry1+cry2型、cry1+cry2+cry9型等多种类型。有9株分离株并未检测出基因型,占总数的19.57%,却有蛋白表达,分析原因可能是鉴定引物数量较少而未检测出杀虫基因型亦或是有未知杀虫基因存在。
  通过SDS-PAGE方法,分析了Bt分离株的Cry蛋白表达的杀虫晶体量,发现分子量在130 kDa、90 kDa、70 kDa以及60 kDa的蛋白量最为丰富。13株仅有cry1型基因的菌株蛋白表达量约为130 kDa;3株仅有cry2型基因的菌株蛋白表达量约为60 kDa-70 kDa;兼有cry1型、cry2型基因的菌株其伴孢晶体为菱形,表达ICPs分子量大小为130 kDa和60 kDa;存在多种基因型的菌株蛋白表达大小多样,多为130 kDa和60 kDa;未鉴定出cry基因型的菌株却检测出了表达的蛋白,而且蛋白的表达量大小不一。
  本研究克隆获得了cry1Ab36与cry2Ab35两个新基因(登录号分别为KY440260和KY501107),均来自对夜蛾科害虫有较高杀虫活性的菌株HT2。对cry1Ab36与cry2Ab35基因进行了克隆与分析,结果表明:cry1Ab36基因开放阅读框共3546 bp,编码1181个氨基酸,分子量133.52 kDa,等电点为4.98;cry2Ab35读码框为1902 bp,编码633个氨基酸,分子量70.72 kDa,等电点为8.73,都具有三个典型的结构域,不含有信号肽。
  经由SDS-PAGE分析、Western blot验证均证:cry2Ab35基因在大肠杆菌内成功表达了70 kDa左右蛋白,其上清液和沉淀均有蛋白的表达,说明该蛋白有部分溶解现象。
[博士论文] 汪波
动物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:狼蛛是农田生态系统中一类重要的捕食性天敌,为更好的发挥天敌控制虫害作用,采用室内行为学实验判断、气相色谱-触角电位联用(GC-EAD)检测技术、气相色谱-质谱(GC-MS)联用检测技术、扫描电镜观察等方法,探究游猎型蜘蛛捕食寻觅猎物中的机制,实验结果如下:
  1.拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)为狼蛛科豹蛛属的动物。为了探究蜘蛛接收外界信号的机制,通过对拟环纹豹蛛体表进行扫描电镜观察,分析拟环纹豹蛛体表感受器,附肢体毛(触毛、听毛、味觉感觉毛)的类型、分布及特征。结果显示,拟环纹豹蛛的单个裂缝感受器主要分布在触肢的跗节与胫节,数量较少,在整个触肢只能发现一到两个单个裂缝感受器;竖琴器在拟环纹豹蛛体表分布广泛,螯肢、触肢、步足均有发现,且胫节分布较多;而跗节器则见于触肢端部的前跗节上,其形态似水滴状小孔,为圆形或椭圆形空洞。拟环纹豹蛛的触毛与体表形成的角度为锐角,触毛粗大,毛干较挺立,周围有绒毛环绕,触毛主要分布在蜘蛛体触肢的跗节、胫节和步足的跗节、胫节、端部处,其中第一步足分布最多,其数量较听毛和化学感觉毛多。拟环纹豹蛛的听毛细而长,基本垂直于表皮,毛囊深窝有褶皱,听毛主要分布于触肢和第四步足的胫节上,其余腿节分布较少,不同部位的听毛在形态、长度上没有太大的差别。拟环纹豹蛛的味觉感觉毛基部四周有微微隆起的圆形状毛囊,味觉感觉毛大于听毛又小于触毛,四周被绒毛环绕,主要分布于蜘蛛的第一步足和第二步足的跗节胫节处,在触肢和螯肢也有少量分布。
  2.为了探明听觉在游猎型蜘蛛捕食猎物中的作用,在实验室条件下,比较拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)对有模拟果蝇振翅声源端和无声源端的反应状态。结果表明,在近距离条件下,狼蛛能够正确选择声源端,且狼蛛对声源端选择指数显著高于无声源端(P<0.05),但当狼蛛与声源距离增大至15 cm后,狼蛛对声源端和无声源端选择具有随机性,选择指数无显著差异(P>0.05);狼蛛在有声源端停留时间也呈类似变化,当狼蛛和声源间距离在12cm以内,狼蛛在声源端停留时间较长,多于总观察时间的一半,且狼蛛在声源端停留时间显著高于无声源端(P<0.05),当距离增加后,狼蛛对声音敏感程度下降,在声源端和无声源端停留时间无显著差异(P>0.05)。总之,从狼蛛在声源端的停留时间和选择情况来看,与声源距离越近,狼蛛对声音的敏感性越高,随着距离的增加,敏感性逐渐降低,声源间距与狼蛛成功地寻找和定位猎物有明显的负相关性。另外,狼蛛的性别对听觉感受器的敏感度与有一定的影响,雌性狼蛛对果蝇振翅声音更为敏感,定位准确率更高。
  通过测定猎物发声距离(4cm、6cm、8cm、10cm、12cm、14cm、16cm)及发声停顿间隔时间(0s、1s、3s、5s、7s、9s、11s)对蜘蛛定位与捕食猎物的影响,研究听觉在游猎型蜘蛛定位猎物中的作用。实验结果表明蜘蛛运动速度(y)与发声间距(x)呈高度负相关,间距为4 cm和6 cm的时候,运动速度最快,分别达到5.12±0.40cm/min和5.45±0.31 cm/min,显著高于其他组(P<0.05),运动速度最慢的是声源间距为14 cm和16 cm的时候,只有2.95±0.11和2.63±0.11 cm/min。在相同发声间距(6 cm)的条件下,声音停顿间隔增大,蜘蛛的运动速度逐渐下降,当声音停顿间隔为1s和3s的时候,蜘蛛运动速度达到最大,分别为5.02±0.31 cm/min和5.15±0.40cm/min,之后随着发声停顿间隔延长,蜘蛛运动速度显著下降(P<0.05),到声音停顿间隔达到11s时,蜘蛛运动速度只有2.36±0.15cm/min。
  3拟环纹豹蛛能依靠视觉发现位于3、4、5、6 cm这4个距离的猎物。当果蝇距离拟环纹豹蛛3、4 cm时,拟环纹豹蛛的视觉敏感性最好,当果蝇距离达到5、6 cm时,拟环纹豹蛛仍具有视觉敏感性,但选择指数呈明显下降趋势(P<0.05),说明敏感性下降显著,当果蝇距离达到或者大于7 cm时,拟环纹豹蛛仅依靠视觉难以发现猎物的存在。实验结果表明拟环纹豹蛛选择指数(y)与果蝇间距(x)呈高度负相关,标准曲线为y=-9.6770x+118.74,R2=0.8378。拟环纹豹蛛对颜色选择的实验中,结果显示,拟环纹豹蛛对4种实验环境颜色的选择指数分别为,红色为35.40±1.60%,绿色36.03±1.60%,黄色18.01±1.60%,橙色10.56±1.60%,可知,拟环纹豹蛛对红色和绿色环境的敏感性显著高于对黄色和橙色环境的敏感性(P<0.05),拟环纹豹蛛对红色和绿色环境最敏感,说明拟环纹豹蛛能够感知不同波长的光色差异。
  利用单因子变量法和正交试验法,从光照强度、光照颜色、环境温度三个方面对影响拟环纹豹蛛捕食效率的主要环境因素进行了分析。研究结果表明,当环境因素组合为15Lx光照强度,绿色环境颜色,环境温度27℃时,拟环纹豹蛛捕食效率达到最高。
  4.采用Y型嗅觉仪法研究了狼蛛对猎物体液气味和体表气味的灵敏度反应。结果表明在实验距离内,狼蛛均能够正确选择有果蝇体液气味端,选择指数显著高于无果蝇体液气味端(P<0.05),停留时间显著高于无果蝇体液气味端(P<0.05),但当狼蛛与有果蝇体液气味端距离增大后,狼蛛对气味敏感程度下降,当狼蛛与气味源距离达到11 cm后,虽然狼蛛仍然能够正确选择有果蝇体液气味端,但选择指数显著下降(P<0.05),回归分析显示,狼蛛对有果蝇体液气味端选择指数与狼蛛和气味源间距离呈高度负相关。同时,研究结果发现狼蛛对果蝇体液气味比果蝇体表气味的反应更敏感。
  选取狼蛛第一步足的腿节靠近胫节处到跗节进行电生理试验,GC-EAD检测分析得出,猎物体表挥发性成分能够对拟环纹豹蛛的第一步足产生刺激,雌性和雄性拟环纹豹蛛对这两种物质均有反应。猎物浸提液GC-MS测试结果表明,猎物浸提液中共鉴定有10种组分,主要为烯烃(占32.49%)、芥酸衍生物(占28.34%)、酯类(占21.78%)、烷烃(占17.39%)。其中,芥酸酰胺含量最高,占28.34%;其次为十四酸十六酯,占21.78%。
[硕士论文] 雒国兴
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)营养期杀虫蛋白Vip3A类对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。虽然Vip3Aa蛋白间的序列相似性很高(95%-100%),但是,不同Bt菌株来源的Vip3Aa蛋白的杀虫谱和杀虫活性存在很大差异。本研究为了探索Vip3 Aa11羧基端点突变对其杀虫活性和敏感性的影响,基于Vip3Aa11和Vip3Aa39蛋白氨基酸序列同源性高而杀虫活性差异大的特点,利用定点突变技术将挑选的位于Vip3 Aa11羧基端的九个差异氨基酸分别突变为Vip3 Aa39相应位点上的氨基酸。得到九个突变体:S543N、I544L、D547E、T681V、T685I、S686R、R704G、I780L和Y784N。将突变体基因在大肠杆菌(E.coli) BL21菌株中诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明九个突变基因和vip3Aa11均在可溶组分中表达大小约88 kDa的蛋白片段。
  对小菜蛾(Plutella xyllostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、棉铃虫(Helicoverp aarmigera)、小地老虎(Agrotis ipsilon)进行生物活性测定。结果显示,突变体以及Vip Aa11蛋白均对小菜蛾无明显杀虫活性。与Vip3Aa11相比,突变体蛋白对甜菜夜蛾、棉铃虫和小地老虎三种试虫的杀虫活性均有不同程度的变化。三个突变体蛋白S543N、I544L和S686R对甜菜夜蛾活性明显升高,其活性分别提高了5倍、2.65倍和8.98倍;而这三个突变体对棉铃虫和小地老虎的杀虫活性均有不同程度的降低;突变体蛋白Y784N对四种试虫完全丧失了杀虫活性。胰蛋白酶消化结果显示,Y784N对胰蛋白酶极度敏感,被胰蛋白酶全部降解,这可能是其杀虫活性完全丧失的根本原因。而其余八个有活性的突变体蛋白经胰蛋白酶消化后均可形成一个稳定的62 kDa抗性核心多肽。
  这些结果表明Vip3 Aa11羧基端543-784区段部分氨基酸对其杀虫特异性以及杀虫毒力均具有重要作用,且不同的害虫所需要的氨基酸位点也不同。本研究为揭示Vip3Aa11蛋白的杀虫活性和特异性奠定了重要基础。
[硕士论文] 叶罗娜
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:鸡腿菇(Coprinus comatus)是一种风味和口感十分独特的美味食用菌,营养和药用价值高,深受消费者的喜爱。鸡腿菇从菌丝生长到子实体形成耗时较短,同时生物转化效率非常高,栽培过程简单容易掌握。但栽培的一系列过程中病虫害发生严重,常造成惨重的经济损失。特别是细菌性病害发生快、蔓延快和传播范围广,防治相当困难。本课题研究了鸡腿菇菌柄腐烂病的发生规律,后根据柯赫氏法则对病原分离物的致病性进行验证,同时鉴定病原物所属属名和种名,并将分离的病原物和对应的临床标准菌株进行了动物致病性验证。采集不同地点的土壤样品,分析病原物的来源。筛选植物提取物和生防细菌,进行了鸡腿菇腐烂病生物防治初探。
  2015年7月在山东省平阴县鸡腿菇栽培场内发现一种鸡腿菇菌柄腐烂病。从发病部分分离纯化到了3种细菌菌株,分别命名为JTG-A,JTG-B1,JTG-B2。根据柯赫氏法则,验证3种分离物的致病性,采用摩擦伤口接种的方式,分为四组进行接种,每组25个健康的子实体,重复4次,在接种16h、36h和52 h后连续观察发病情况。结果显示,JTG-B1在16h后可使50%以上的子实体发病,形成明显的病斑,并有菌脓出现,后期整个子实体腐败,直至死亡。JTG-A和JTG-B2接种后仅少数子实体出现症状,致病力明显低于JTG-B1。
  对JTG-B1采用菌落形态观察、生理生化反应和16s rDNA序列分析进行鉴定,确定其为人体病原菌-氧化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。从华中科技大学医学院附属同济医院得到对应的临床标准菌株TJ-ade,采用腹腔注射小白鼠验证JTG-B1和TJ-ade的动物致病性。结果显示80%JTG-B1悬浮液和20%生理盐水混合物腹腔注射小白鼠,在21 d后进食率为33%,TJ-ade在相同处理下进食率为29%。小鼠在各处理组中均表现出明显的不活跃性,眼紧闭,有抱团现象,体毛有脱落现象,但未出现死亡现象。对两个菌株最适pH和温度进行测定,JTG-B1和TJ-ade在16-34℃时均可生长,28℃为最适生长温度,在pH4-11之间两者均可生长,pH7为最适生长pH值。
  对JTG-B1和TJ-ade的7个管家基因nusA、rpoB、eno、gltB、lepA、nuoL、和nrdA进行扩增,测序后输入MLST数据库,将等位基因编号进行一对一的比对,从而确定对应的ST型。PCR扩增后对产物进行琼脂糖凝胶电泳,可知管家基因扩增片段大小为300-400bp,JTG-B1和TJ-ade分别为ST14和ST29。采用上述相同方法进行鸡腿菇子实体致病性实验,TJ-ade在16h时伤口接种也能使50%以上的健康鸡腿菇子实体菌柄发病,症状与JTG-B1接种后相同。生理生化反应观察两者对不同糖类分解情况,CIT(柠檬酸盐利用试验),VP(丙酮酸盐试验),GLU(葡萄糖发酵试验),SAC(蔗糖发酵试验),AMY(苦杏仁苷发酵试验)和ARA(阿拉伯糖试验)的反应均为阳性,但JTG-B1所有阳性反应小管的颜色反应均深于TJ-ade,可知其代谢反应速率和相关酶类表达量高于TJ-ade,结合动物致病性实验,可综合分析两者种间差异情况。
  从山东省平阴县鸡腿菇栽培基地周边的7处位置采集土壤样品,提取土壤总DNA,扩增目的病原菌JTG-B1的blaOXA-114基因。洞穴外地面土壤PCR反应产物在电泳时出现了大小500bp左右的条带,表明病原物可能在栽培场地周边存在,通过人为携带、覆土材料或栽培料等进入栽培场地中。
  制备大蒜、梧桐树叶、银杏、蒲空、龙葵、茶叶、肉桂油、石榴皮和辣椒等植物的提取物。结果显示,仅肉桂油在浓度100mg/mL和120mg/mL时,可以对病原菌产生直径1.0mm和9.0mm的抑菌圈。荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)发酵液对病原菌没有抑制作用。120mg/mL肉桂油对鸡腿菇菌丝生长无影响,且在12h和24h时肉桂油在鸡腿菇子实体上可以预防病原菌感染。
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