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[硕士论文] 潘丹丹
农业昆虫与害虫防治 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:水稻二化螟Chilo suppressalis(Walker)隶属鳞翅目Lepidoptera、螟蛾总科Pyraloidea、禾草螟属Chilo。该虫其分布广泛、适应性强,是目前影响我国水稻稳产、高产的重要害虫之一。二化螟盘绒茧蜂(Cotesia chilonis)隶属膜翅目Hymenoptera、茧蜂科Braconidae、绒茧蜂属Apanteles,是水稻二化螟的重要寄生蜂之一,对二化螟田间种群起着重要的控制作用。但是,二化螟和二化螟盘绒茧蜂协同进化的机制以及二化螟应对二化螟盘绒茧蜂寄生的策略还不清楚。本研究通过比较分析二化螟盘绒茧蜂寄生胁迫下的二化螟和未被寄生的二化螟的转录组数据,研究了二化螟4种热激蛋白对二化螟盘绒茧蜂寄生胁迫下的表达特征,同时进一步揭示它们对温度响应的规律。这些结果不仅充实了寄主—寄生蜂的协调进化理论,也为利用二化螟盘绒茧蜂防治二化螟提供理论支撑。主要研究结果如下:
  1、运用转录组测序技术,测定了被二化螟盘绒茧蜂寄生的二化螟和未被寄生的二化螟转录组。通过比较发现寄生胁迫下的水稻二化螟体内表达存在差异的Unigenes有5685个,在昆虫激素的生物合成、氧化磷酸化、核糖体、药物代谢、丙酮酸代谢和代谢途径这6条通路富集显著。进一步分析发现:呈现表达差异的热激蛋白基因有4条,2条热激蛋白70基因(hsp70s)下调,2条小分子量热激蛋白基因(shsps)上调。
  2、克隆了二化螟体内3条新型热激蛋白基因的全长序列,分别为hsp705、hsp706和hsp21.7c。它们cDNA序列全长分别为2053,2392和870bp,开放阅读框长度分别为1896、1905和570bp,分别编码631、634和189个氨基酸,HSP705和HSP706中都发现有HSP70家族的保守序列,HSP21.7c中发现小分子量热激蛋白家族的保守特征—α-晶状体结构域。系统发育分析表明,二化螟的两条HSP70的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫表现出很高的同源性,CsHSP21.7c,不含内含子,与二化螟其他小分量热激蛋白未表现出较高同源性,是一种特异性小分子量热激蛋白。
  3、采用荧光实时定量技术对二化螟9个候选内参基因在二化螟盘绒茧蜂寄生胁迫下的稳定性进行筛选和评估,运用常用的内参基因筛选程序(NormFinder、geNorm和BestKeeper)以及比较△Ct法对各内参基因进行了排名。综合看来TUB,EF-1和NADHD作为内参基因比较稳定,TUB是最稳定的,RPS11为最不稳定的基因。最后,通过寄生胁迫下二化螟目的基因HSP60的相对表达量验证了TUB的稳定性,确认寄生胁迫下的二化螟内参基因是TUB。
  4、二化螟hsp705在被二化螟盘绒茧蜂寄生前期先显著上升表达,而在寄生后期却下调表达;hsp706在被二化螟盘绒茧蜂寄生中后期显著下调表达;hsp21.7c在被二化螟盘绒茧蜂寄生中期显著上调,在被寄生末期也显著下调;hsp21.5寄生中期的表达量也显著上调。转录组比较分析发现:2个hsp70(hsp705和hsp706)显著下调,而2个shsps(hsp21.5和hsp21.7)显著上调,这表明qRT-PCR验证的结果与转录组测序结果基本一致。
  5、采用qRT-PCR技术研究了二化螟3条新hsps在高低温胁迫下的表达情况。结果表明:从-11℃到43℃这21个温度处理下的二化螟体内3条热激蛋白基因在mRNA水平上都显著上调表达,但他们对温度响应的趋势各不相同。hsp705和hsp21.7c都在-6℃达到最高表达量,而hsp706却在-11℃达到最高表达量。通过相对表达量比较发现:hsp21.7c在mRNA水平上更容易受热诱导,而hsp705和hsp706却更容易受冷诱导。
[硕士论文] 苏霞
生物化学与分子生物学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:杆状病毒是目前已知病毒种类中对人类最有益的病毒之一,已广泛应用于生物杀虫剂、真核表达载体系统、疫苗制备、蛋白表面展示系统和基因治疗等方面。苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)是杆状病毒的模式种,是第一个被完全测序的,也是目前研究最多、最广泛的杆状病毒。为了更好地利用杆状病毒,就需要揭示病毒编码的各个基因在杆状病毒生活史中的功能。ac51、ac73、ac75基因是AcMNPV中功能未知的基因,ac51基因在Ⅰ和Ⅱ型鳞翅目NPV基因组都存在同源序列;ac73基因只在已测序的Ⅰ型鳞翅目NPV基因组有同源基因;ac75的同源基因存在于所有鳞翅目NPV、GV和膜翅目NPV基因组中,但不存在于双翅目基因组中。本论文分别对ac51、ac73、ac75基因进行实验分析,探究各基因在病毒增殖、病毒粒子组装和病毒感染虫体等方面的作用;并对ac51、ac73、ac75基因产物进行亚细胞定位分析,从而揭示ac51、ac73、ac75基因在AcMNPV的感染过程中的具体功能。
  论文开始对文献进行了综述,主要从杆状病毒的基因组和分类、杆状病毒的表型和感染周期、杆状病毒基因的表达、杆状病毒基因的分类、杆状病毒的应用等方面介绍了杆状病毒的研究背景,并阐述了ac51、ac73、ac75基因的背景知识和本论文的研究目的和意义。
  论文首先以ac73基因为研究对象,利用λ-Red同源重组技术和Bac-to-Bac系统构建了ac73基因缺失型和拯救型重组病毒,将这两种重组病毒质粒及野生型转染、感染Sf9细胞,通过普通光学显微镜、荧光显微镜观察,发现ac73基因缺失型的重组病毒可以产生多角体和感染性的病毒粒子;对三种重组病毒进行一步生长曲线分析,生长曲线总体走势相似,呈稳定增长的趋势,但缺失型重组病毒滴度明显低于野生型和拯救型,因此,缺失型病毒粒子的量低于拯救型和野生型病毒;电镜观察缺失型重组病毒发现有正常的核衣壳,也有异常的中空长管状结构;形成的多角体有些中间有大空腔,有些是未包裹核衣壳的空泡。生物学测定结果表明,缺失型重组病毒的半致死时间LT50比野生型重组病毒延长了42h;取食缺失型病毒多角体的甜菜夜蛾幼虫其血淋巴中含有病毒粒子,可以感染昆虫细胞。Ac73蛋白的亚细胞定位分析结果显示,在病毒感染的早期Ac73-EGFP蛋白定位于宿主细胞核中,感染后期细胞核和细胞质都有Ac73-EGFP蛋白。综上说明,ac73基因是病毒增殖的非必需基因,但基因缺失后会影响AcMNPV病毒粒子的产量和多角体的形态,病毒增殖能力减弱,杀虫速度减慢。Ac73蛋白可能感染初期仅在细胞核中行使功能,感染晚期在细胞质中也发挥功能。
  接着以ac51、ac75基因为研究对象,同样利用λ-Red同源重组技术和Bac-to-Bac系统,分别构建ac51、ac75基因的缺失型和拯救型重组病毒质粒,通过转染、感染Sf9细胞和绘制一步生长曲线等实验,分析发现缺失这两个基因的任何一个都会使病毒失去增殖能力,而拯救型重组病毒具有感染性。电镜观察结果发现,缺失这两个基因后病毒核衣壳无法组装,也无法形成多角体。因此,ac51、ac75基因都是AcMNPV的必需基因,缺失后病毒没有感染性。Ac51和Ac75蛋白的亚细胞定位分析结果显示,病毒感染后Ac51-EGFP蛋白主要定位在宿主细胞核中,后期在细胞核边缘聚集;Ac75-EGFP蛋白在感染早期主要定位在宿主细胞的核环带区中呈成聚集状分布,后期进入细胞质中执行其功能。说明病毒感染前期,Ac51蛋白和Ac75蛋白主要在细胞核中行使功能,后期Ac75蛋白还在细胞质中发挥一定的功能。预测Ac51和Ac75与病毒核衣壳的形成相关。
  综合研究表明,ac51、ac75基因都是AcMNPV的必需基因。ac73基因是非必需基因,其对病毒的增殖和经口感染昆虫并不是必需的,但基因缺失后会影响病毒粒子的产量和多角体的形态。病毒滴度下降,缺失病毒的杀虫速度减缓。
[硕士论文] 王文君
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:转Bt基因抗虫作物对大部分鳞翅目害虫具有较高的抗性。Bt杀虫蛋白可能通过对寄主的寄生而传递至其天敌体内。鳞翅目寄主取食转Bt基因抗虫作物后,其生长发育通常受到显著不利影响,从而产生“猎物质量介导效应”导致无法对其天敌进行准确的安全性评价。消除这种效应后,能大大提高转基因植物安全性评价的可靠性。本研究选择鳞翅目害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)及其寄生天敌麦蛾柔茧蜂(Habrobracon hebetor)作为研究对象,通过显微注射Bt蛋白至印度谷螟幼虫血淋巴中,将印度谷螟幼虫血淋巴作为Bt蛋白的载体,构建了一种适合外寄生寄生蜂的Tier-1安评体系。结果表下:
  (1)单头印度谷螟老龄幼虫注射70ng浓度为0.5ng/nl的Cry1C蛋白至印度谷螟幼虫血淋巴后,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中先快速下降,后缓慢下降。在注射0h时,近注射端印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白的含量显著高于远离注射端印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白的含量;注射0.5h后,两者无差异。被麦蛾柔茧蜂寄生后,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中的浓度在7天内趋于稳定,且含量始终高于直接取食转Bt基因稻谷印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白含量(1.72ng/g)的10倍以上,生测结果表明印度谷螟幼虫血淋巴中Cry1C蛋白具有生物活性。而未被麦蛾柔茧蜂寄生的状态下,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中的含量会一直下降。
  (2)印度谷螟幼虫血淋巴中的高剂量Cry1C蛋白对麦蛾柔茧蜂的卵孵化率、卵至成虫发育历期、雌性率、蛹重、初羽化(雌、雄)成虫体重、成虫寿命、存活率以及生殖力均无显著负面影响;而阳性对照GNA对麦蛾柔茧蜂的卵孵化率初羽化雌成虫体重、初羽化雄成虫体重、成虫寿命以及生殖力造成负面影响。(3)Cry1C蛋白能通过印度谷螟血淋巴传递至麦蛾柔茧蜂体内。Cry1C蛋白可在麦蛾柔茧蜂幼虫体内不断累积,在麦蛾柔茧蜂老熟幼虫体内富集量最高;麦蛾柔茧蜂蛹内、成虫体内的Cry1C蛋白含量不断下降,低于麦蛾柔茧蜂幼虫的Cry1C蛋白蛋白含量,远低于印度谷螟血淋巴中的Cry1C蛋白含量。然而,麦蛾柔茧蜂成虫体内Cry1C蛋白含量低于检测值下限。
[硕士论文] 陈丽丽
植物病理学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)W10是从植物根际筛选获得的一株生防细菌,能较好地抑制多种植物病原真菌,田间防治效果明显。该菌生防机制主要是产生一种抗菌蛋白。为了进一步了解该菌生防机制和进行应用,本文对W10抗菌蛋白进行了纯化鉴定、编码基因克隆和蛋白表达分析,同时为了提高生防效果,本文还初步研究了其与水稻白叶枯病菌harpin蛋白Hpa1Xoo的协同抗病作用,进而了解两类不同信号通路蛋白互作的分子机制,为这两类蛋白的应用奠定基础。
  利用硫酸铵沉淀和透析袋透析,从地衣芽孢杆菌W10培养上清滤液中获得抗菌粗蛋白,经AKTA purifier(HiPrep16/60Sephacryl S-100High Resolution)进一步纯化,再将纯化的抗菌蛋白通过5800超高分辨飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/MS-MS)进行质谱分析,根据Mascot搜索串级质谱数据鉴定为丝氨酸蛋白酶,并据此设计引物从W10基因组中获得全长序列,经测序含有1个ORF,编码基因1347bp。经生物信息学分析,该基因编码448个氨基酸残基,分子量为48794.16Da,等电点为6.04,是一种亲水性蛋白,在二级和三级结构中,α-螺旋和β-折叠所占比例相似,含有Peptidase_S8的保守结构域。
  通过载体构建,本文对W10抗菌蛋白编码基因进行了克隆,并在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌系统中进行了表达。其中,在大肠杆菌系统中未能成功表达,在枯草芽孢杆菌系统中成功表达,但是表达出的蛋白分子量与上述有点误差,且不具有抗菌活性,初步认为是在表达时氨基酸结构可能有所改变,从而影响了分子量与抗菌活性。同时丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对提取的抗菌蛋白有一定的抑制作用,进一步说明W10抗菌蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性。
  此外,本文还研究了地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白与Hpa1Xoo蛋白的协同抗病作用。两种蛋白混合处理与各自单独处理相比,能显著增加对番茄灰霉病的防治效果;防卫反应相关基因检测发现,在三生烟中,W10抗菌蛋白诱导了hsr203J、COI1、Ntexp2、Ntexp6基因不同程度的表达,分别涉及HR、茉莉酸信号通路以及植物生长调节基因,Hpa1Xoo蛋白诱导了hsr203J、aox1、Ntexp2、Ntexp6基因不同程度的表达,涉及HR、活性氧代谢及植物生长调节基因。W10抗菌蛋白与Hpa1Xoo蛋白混合处理则在三生烟中诱导了上述所有基因不同程度的表达,且表达强度比单独处理有所增加。另外发现,W10抗菌蛋白在转hpa1Xoo基因烟草中能诱导hsr203J、Ntexp2、Ntexp6、COI1、Chia5基因不同程度的表达。因此,这两类蛋白在混合应用时具有协同作用,通过增加相关信号通路和相关基因表达来提高对病害的防治作用。这将为整合生防资源提高生防效果,为开辟地衣芽孢杆菌W10的新的应用途径提供理论基础。
[硕士论文] 何有为
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:芽孢杆菌广泛存在于自然界中,可产生丰富的次生代谢物质,具有极强的抗逆能力和环境适应性,是一类具有实际用途和经济价值的微生物类群。本研究通过室内筛选获得对油菜根肿病菌(Plasmodiphora brassicae)具有较好抑制效果的生防芽孢杆菌F85和T113,此外还发现了一株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)具有很强拮抗效果的枯草芽孢杆菌BJ-1。本研究以此为材料,分别对生防菌株抑制油菜根肿病和稻瘟病的生防机理进行探讨,并综合评价生防芽孢杆菌的生防效果。主要研究结论如下:
  1.从湖北省当阳市油菜根肿病发生严重田块的健康油菜根际土壤先后分离微生物菌株667株,其中细菌323株,真菌253株,放线菌91株;以棉花枯萎病菌及稻瘟菌作为根肿菌指示菌进行平板对峙筛选,其中有54株分离菌株抑菌带宽度大于3mm;通过离体试验发现有20株生防菌株对根肿菌休眠孢子萌发抑制率达30-50%,16株可使根肿菌休眠孢子失活率达40-55%;通过盆栽防治试验发现有2株生防菌株F85和T113对根肿病防治效果达60%以上;两株生防菌处理后显著降低根肿菌的根毛侵染率,降低根肿菌休眠孢子初级原质团的分化,抑制次级游动孢子囊的形成。进一步对生防菌株F85和T113进行鉴定。生防菌株F85和T113菌体细胞均呈杆状,革兰氏染色反应显示阳性,16S rDNA分子鉴定且系统进化树分析都表明菌株F85和T113属于Bacillus,利用Biolog微生物快速鉴定系统鉴定结果也显示为芽孢杆菌属,但不能准确鉴定到种。
  2.通过传统的形态学,16S rDNA序列分析和Biolog微生物快速鉴定系统将对稻瘟菌具有强拮抗作用的菌株BJ-1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液经不同温度(4-100℃)和不同pH(2-12)处理后对稻瘟菌菌丝的生长抑制效果不变,表明枯草芽孢杆菌BJ-1分泌产生的抑菌成分具有热稳定性及耐强酸、碱能力。平板对峙试验结果表明,枯草芽孢杆菌B J-1具有较广的抑菌谱,对多种植物病原菌菌丝生长均有抑制作用,其中对稻瘟菌的抑菌带达22.7mm。显微观察发现,枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液(0.5%v/v)处理后的稻瘟菌菌丝尖端膨大畸形,有菌丝溢断现象。分生孢子经发酵液处理后萌发不正常,产生的芽管畸形膨大,对附着胞形成具有明显的抑制作用。在离体叶片上,浓度为1x108CFU/mL的BJ-1菌体悬浮液和浓度为5%的发酵液和发酵滤液已可完全防治稻瘟病。盆栽试验结果表明,10%枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液喷雾处理,防治效果达50.0%;BJ-1发酵液浸种处理防效更好,对稻瘟病防效可达74.3%,且对水稻植株生长有促生作用。通过实时荧光定量PCR检测,发现BJ-1发酵液处理种子后能诱导SA信号通路PAL、ICS1基因、JA信号通路AOS2基因以及抗性相关蛋白PR1a和PR10的上调表达。说明BJ-1发酵液处理种子可诱导水稻植株体内SA和JA信号通路相关基因的表达,激活水稻的防卫反应,诱导寄主产生系统抗性。
[硕士论文] 成淑芬
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:核盘菌是一种重要的植物病原真菌,且寄主广泛,由其引起的菌核病危害严重,目前缺乏高效、绿色的防治手段。真菌病毒是侵染真菌的病毒,能够引起寄主致病力衰退的真菌病毒是潜在的生物防治资源。国内外学者已发现多种能够引起核盘菌致病力衰退的病毒,DNA病毒SsHADV-1就是其中之一。SsHADV-1具有强侵染力,其病毒粒子可侵染核盘菌菌丝,扩散受到寄主营养体不亲和性的影响小,具有良好的防治菌核病的前景。
  为了研究SsHADV-1病毒引起核盘菌致病力衰退的机制,我们运用RNA-Seq技术比较了携带SsHADV-1的菌株DT-8和不携带病毒的菌株DT-8VF在活体油菜叶片上基因表达的差异。收集DT-8和DT-8VF的菌丝片段悬液,分别接种在活体油菜植株的叶片上,置于20℃光照培养室保湿培养。在接种油菜6hpi、12hpi、18hpi和24hpi时收取菌丝提取总RNA,测序后得到各个样本转录信息。
  比较不同时间点时菌株DT-8中与菌株DT-8VF中基因的表达情况,在核盘菌接种油菜6hpi时,菌株DT-8中显著上调基因816个,显著下调基因587个;12hpi时显著上调基因795个,显著下调基因835个;18hpi时显著上调基因991个,显著下调基因717个;24hpi时显著上调基因981个,显著下调基因756个。此外,在6hpi、12hpi、18hpi和24hpi时均显著差异表达的基因达687个,其中上调基因435个,下调基因252个,下调的基因为次级代谢、聚糖代谢、蛋白结合、脂肪酸代谢相关等;均上调的为DNA修复、DNA重组和复制等相关基因。
  对显著差异表达的基因进行GO功能分析、KEGG pathway富集分析,以及FunCat分析,结合三种分析方法可知,SsHADV-1的侵染主要影响了核盘菌自身的代谢途径和DNA损伤修复反应。其中显著性上调的基因富集到的通路有:DNA损伤和修复以及DNA复制相关,侵染初期有氧化还原相关和转运相关的通路,侵染后期与毒素转运相关通路以及氮代谢相关基因显著上调。显著性下调的基因富集到的通路为糖类代谢、脂类代谢、毒力因子以及解毒相关,碳水化合代谢通路和次级代谢通路相关基因在接种12hpi和18hpi时下调,菌株DT-8中糖基水解酶类(角质酶、蛋白酶、细胞壁降解酶等,参与碳水化合物代谢)基因显著下调。筛选获得了在菌株DT-8中显著下调的碳水化合物代谢酶类108个以及6个显著下调的小分泌蛋白,对于这些可能参与了核盘菌致病过程的酶类和分泌蛋白需进行进一步的分析和验证。
  DNA病毒的侵染通常会激发寄主的DNA损伤修复反应,ku70和ku80是DNA损伤修复通路—非同源末端结合中的关键因子。与菌株DT-8VF相比,基因Ssku70和Ssku80在菌株DT-8侵染油菜6hpi、12hpi、18hpi和24hpi时上调达2倍至4倍,且菌株DT-8中这两个基因的表达量随时间递推而增加,而菌株DT-8VF中4个时间点下表达量几乎没有变化。为了探究这两个基因在核盘菌中的功能,本试验运用PEG介导原生质体转化的方法对菌株DT-8VF进行基因Ssku70和Ssku80的敲除,Ssku70得到5个敲除转化子,而Ssku80得到3个敲除转化子,由于核盘菌细胞具有多核的特性,qRT-PCR验证结果表明敲除转化子中基因Ssku70和Ssku80仍有表达,但表达量显著下降。对敲除转化子进行生物学性状的测定,发现基因Ssku70的敲除转化子的菌落形态发生了明显扇变,且菌丝更为致密,菌核形成速度减慢;而基因Ssku80的敲除转化子气生菌丝浓密,但菌核形成与菌株DT-8VF无明显差异。致病力测定试验结果表明所有KU敲除转化子的致病力均显著下降,尤其是基因Ssku70的敲除转化子致病力衰退更明显,且Ssku70和Ssku80的敲除转化子的致病力也存在统计学上的差异。推测Ssku70和Ssku80可能通过影响核盘菌的DNA损伤修复反应而影响其致病力,但是对病毒传播和积累的影响暂时未知。
  本论文首次探究了病毒SsHADV-1、真菌与植物这三者互作过程中核盘菌代谢通路和基因的变化,发现破坏非同源末端结合通路中的Ssku70和Ssku80基因的敲除可以降低核盘菌的致病能力。本研究结果为解析病毒SsHADV-1引起的核盘菌衰退机制提供了可靠的数据和理论基础,也为揭示弱毒真菌中病毒与寄主的互作机制以及未来应用研究提供了参考依据。
[硕士论文] 田甜
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物寄生线虫(Plant Parasitic Nematodes)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫,主要寄生在植物根部,几乎可以感染所有的作物并造成作物减产,据统计可造成全世界每年1500多亿美元的经济损失。在长期的防控植物寄生线虫的实践中,人们逐渐认识到生物防治有着其它防治措施难以比拟的优势,而生防细菌在防控植物寄生线虫实践中发挥着独特作用,因此基于生防细菌的生物防治技术的研究开发受到世界各国普遍重视。丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)MB03是本实验室从感病植物组织中分离到的一株病原细菌,前期工作已证实该菌对模式线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和主要的作物虫害线虫南方根结线虫(Meloidogyne incognita)均呈现杀虫活性。本研究通过序列比对确定了一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA,对该蛋白的杀虫活性、抑制线虫生长、运动、产卵和取食偏好等的性能和在线虫体内的作用部位进行了观测;对该蛋白的作用结构域进行了分析;然后对其在线虫体内的可能受体进行了初步筛选。所获得的主要研究结果如下:
  基于MB03菌株的基因组序列构建了该菌毒性蛋白与毒性因子的预测数据库。数据库显示MB03中共有200多个潜在的具有直接或辅助杀虫的酶类或毒性蛋白,主要种类包括有Rhs家族、几丁质酶类、胶原蛋白酶类及溶血素类蛋白等。通过VirulentPred网站进行辅助序列分析从数据库中确定一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA作为研究对象。将PtxA基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a上,并表达和纯化获得PtxA纯蛋白。纯化PtxA蛋白对秀丽隐杆线虫显示具有较强的毒性,测得LC50值为65.955(41.032~125.246)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为Y1=-4.493+2.47X1;对南方根结线虫的生测LC50为139.825(30.139~264.375)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为:y2=-6.259+2.917X2,也呈现很强的毒性作用。对秀丽隐杆线虫L1期虫体生长抑制实验表明,PtxA蛋白具有很强的抑制生长作用,在315μg/mL作用浓度下,实验组线虫体长仅达到对照组线虫的50%。此外,PtxA蛋白能够抑制线虫产卵数,相同浓度下实验组线虫产卵数远低于对照组,在252μg/mL作用浓度下,实验组线虫平均产卵数仅为对照组的30%。取食偏好性实验表明相对重组菌来说线虫更偏向于取食含有空载的大肠杆菌。通过用绿色荧光标记秀丽隐杆线虫基因工程缺陷虫株FT63肠道和用FT63作为试虫,经PtxA作用3d后,观察到实验组线虫竹节状荧光结构遭到部分破坏,而对照组则很完整,说明PtxA蛋白可对线虫肠道造成物理伤害。利用pDS3.0系统将ptxA基因敲除,比较PG平板上△PtxA和野生菌株MB03对秀丽隐杆线虫的毒性,结果展示了二者毒性有一定的差异,△PtxA菌株平板上线虫死亡率要小于野生菌株MB03。
  为验证PtxA蛋白两个预测结构域的功能,将各自编码基因片段分别克隆到表达载体上,构建大肠杆菌重组菌MB772和MB773,经表达后得到纯化蛋白DUF和M10_C。利用秀丽隐杆线虫做试虫进行液体杀虫试验,结果显示两个截断的功能结构域片段均对线虫有一定的毒性,其中DUF蛋白的毒性强于M10_C,但是两个截断结构域的蛋白毒性弱于全长结构域的蛋白毒性,反映出PtxA蛋白的毒性要靠两者协作才能完全发挥。
  将PtxA作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交实验从秀丽隐杆线虫体内获取了20多个疑似受体蛋白,从中选取了rps9、rps25、daf-21和col-77等四个受体蛋白基因设计引物,以不同处理时间的线虫总RNA为模板,调查PtxA作用后不同时间线虫基因的表达量变化情况。结果显示相对于对照组来说,PtxA作用线虫12h和24h后,这4个基因表达量基本上都发生了下调,反映出PtxA蛋白影响了这些线虫基因的表达。
[硕士论文] 李秋玲
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)是一种严重危害棉花的重要入侵性害虫,而班氏跳小蜂(Aenasius bambawalei Hayat)是其专性寄生性天敌,在扶桑绵粉蚧生物防治过程中具有较好的应用潜力。昆虫气味结合蛋白(OBPs)是气味分子和气味受体之间的桥梁,能够携带疏水性气味分子穿过亲水性淋巴液到达受体细胞,对气味的特异性结合和选择运输上有着重要的研究意义,若能明确班氏跳小蜂气味结合蛋白与配体的相互作用关系,将为筛选班氏跳小蜂寄主定位行为活性物质提供理论依据,也为扶桑绵粉蚧的生物防治提供绿色通道。为此,本课题以班氏跳小蜂为研究对象,在构建转录组的基础上筛选并克隆出了5个AbamOBPs基因,完成AbamOBP50与AbamOBP1的表达与纯化:测定了AbamOBP50与22种寄主挥发物的结合特性;利用荧光猝灭、圆二色谱及同源建模和分子对接分析了AbamOBP1与配基的相互作用关系;利用RNAi及Y型嗅觉仪初步筛选出了对班氏跳小蜂具有行为活性的物质。主要研究结果如下:
  1、班氏跳小蜂AbamOBPs基因克隆、蛋白表达和纯化
  通过RT-PCR技术成功克隆出了班氏跳小蜂基因AbamOBP50、OBP47、OBP43、OBP41及OBP1。开放阅读框分别为369bp、378bp、405bp、402bp、408bp,分别编码123个、126个、135个、134个、136个氨基酸,分别包含有21个、21个、17个、23个、20个氨基酸残基的信号肽,氨基酸序列结果显示AbamOBP50、OBP1和OBP41属于Classic OBPs,OBP47属于Plus-C OBPs,OBP43属于Minus-C OBPs。成功构建重组质粒pET30a-AbamOBP50和pET17b-AbamOBP1。pET30a-AbamOBP50和pET17b-AbamOBP1主要在包涵体中表达,分别通过Ni离子亲和层析柱及DE52弱阴离子交换柱,在体外成功获得AbamOBP50和AbamOBP1的纯蛋白。
  2、班氏跳小蜂AbamOBP50结合特性分析
  以1-NPN(N-苯基-1-萘胺)为荧光探针,利用荧光竞争结合实验测定了班氏跳小蜂AbamOBP50在中性和酸性环境下与22种棉花挥发物单体的结合特性。在中性环境下,AbamOBP50与挥发物单体均有较强的结合能力;在酸性环境下,AbamOBP50与8种物质结合能力较强,分别是1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、S-(-)-柠檬烯、月桂烯、α-水芹烯、β-石竹烯、莰烯和橙花叔醇,其中月桂烯、S-(-)-柠檬烯、α-水芹烯和β-石竹烯在酸性环境下的结合能力高于中性环境下的结合能力。
  3、班氏跳小蜂AbamOBP1与配体荧光猝灭分析
  利用荧光猝灭测定了AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇、S-(-)-柠檬烯的相互作用关系。实验结果表明,AbamOBP1与1-NPN在pH7.4和pH5.0条件下的猝灭过程都是静态猝灭,在pH5.0条件下AbamOBP1与1-NPN是通过静电作用结合,在pH7.4条件下是以疏水作用结合,AbamOBP1与1-NPN是以1∶1比例结合。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇在pH7.4和pH5.0条件下的猝灭过程都是静态猝灭,与S-(-)-柠檬烯在pH7.4条件下是静态猝灭,在pH5.0条件下是动态猝灭。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇在pH7.4和pH5.0条件下都是通过疏水作用结合,与S-(-)-柠檬烯在pH7.4条件下是以氢键作用结合。AbamOBP1与2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇、S-(-)-柠檬烯是以二聚体的方式结合。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮可能以二聚体,三聚体甚至多聚体结合。
  4、班氏跳小蜂AbamOBP1与配体圆二色谱分析
  利用圆二色谱(CD)仪测定了AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇和S-(-)-柠檬烯的CD光谱。通过CD光谱可以观察到AbamOBP1与配基结合后二级结构构象的变化。实验结果表明,AbamOBP1在pH7.4条件下,在208和222nm处负峰值最低,表明α-螺旋含量最高,其次是pH3.0,在pH5.0条件下的负峰值最高,表明α-螺旋含量最低。在pH7.4条件下,AbamOBP1与四种气味物质设置四种配比1∶1;1∶3;1∶5和1∶10。在pH5.0和pH3.0条件下,AbamOBP1与四种气味物质设置两种配比1∶1和1∶3。在这三种不同pH条件下,随着蛋白与气味物质比例的增加,AbamOBP1的CD光谱中负峰逐渐减弱,表明AbamOBP1蛋白中的α-螺旋含量逐渐降低。说明蛋白与气味物质的结合导致蛋白肽链延伸,改变了蛋白二级结构。
  5、AbamOBP1在班氏跳小蜂寄主定位中的功能
  利用Y-型嗅觉仪测定了班氏跳小蜂雄蜂对1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、2,4,4-三甲基-2-戊烯和S-(-)-柠檬烯这4种挥发物单体的行为选择实验。结果发现1-辛烯-3-酮和2,4,4-三甲基-2-戊烯对其有明显的吸引作用,而1-辛烯-3-醇和S-(-)-柠檬烯对其没有吸引作用。RNAi实验表明在干扰48h和72h后AbamOBP1基因的相对表达量显著降低。干扰后对具有吸引作用的两种物质1-辛烯-3-酮和2,4,4-三甲基-2-戊烯进行行为选择验证。结果表明在干扰48h和72h后,这两种物质对班氏跳小蜂雄蜂的吸引作用明显降低。
  6、班氏跳小蜂AbamOBP1同源建模和分子对接
  以同源蛋白Apis mellifera的ASP1(3CAB pH7.0,3CDN pH4.0)为模板,建模得到AbamOBP1的三维结构,其具有六个α-螺旋,三个二硫键,属于Classic OBPs。通过预测发现在pH4.0条件下的结合腔要比pH7.0条件下的结合腔要大。分子对接显示,在pH4.0条件下,氨基酸lle3、Phe51、Phe54、Leu56、Leu63、Va168、Arg71、lle72、Gly80、Met83、lle84、Phe106、Lys113、Tyr114、Phe115、Val116和lle117主要参与了AbamOBP1与配基的结合。在pH7.0条件下,氨基酸Phe51、Leu56、Leu57、His62、Leu63、Asp64、Lys67、Val68、Leu69、Arg71、lle72、Ala99、Leu102、Val103、Phe106、Lys113、Tyr114、Phe115和Val116主要参与了AbamOBP1与配基的结合。
[硕士论文] 易时雨
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:灵敏的嗅觉系统在昆虫寄主定位、寻找配偶等行为过程中起着重要的作用。目前的研究表明,气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)等多种蛋白在对气味分子的识别过程中起着重要的功能,但对于OBPs或CSPs在昆虫中确切的生理功能及识别气味分子的机制并不是很清晰。前期在对林业重要害虫松褐天牛Monochamus alternatus Hope寄生性天敌松褐天牛肿腿蜂Sclerodermus sp.触角转录组测序中,鉴定了多个OBPs和CSPs基因,但对于OBPs和CSPs在其嗅觉感受中功能并未深入了解。为此,本课题以松褐天牛肿腿蜂为研究对象,分析了SspCSP2的时空表达特征及与气味分子的结合特性,探索了SspOBP7与寄主挥发物的结合特性及结合机制,以期为探明OBPs和CSPs在其嗅觉感受中的功能奠定理论基础。主要的研究结果如下:
  (一)松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的功能分析
  1.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因的克隆及时空表达特性
  通过PCR技术,克隆得到了1个CSPs(SspCSP2,GenBank登录号:ALG36155.1)的全长,其开放阅读框为360bp,编码120个氨基酸。qRT-PCR实验技术分析了SspCSP2在松褐天牛肿腿蜂不同虫态、不同组织的表达情况,结果表明,SspCSP2显著表达于幼虫、有翅雌虫的腹部及无翅雌虫的腹部,其中在有翅雌虫腹部的表达量最高。
  2.重组SspCSP2与气味物质的结合特性
  成功构建重组质粒SspCSP2-pET20b,并大量表达于大肠杆菌BL21(DE3)中,利用DE52阴离子交换柱成功获得纯净重组SspCSP2。以1-NPN为探针,利用荧光竞争性结合试验,分析SspCSP2在pH7.4和pH5.0条件下与24种气味分子的结合特性。结果表明,在酸性条件下,SspCSP2与大多数气味物质的结合能力高于中性条件,22种物质展现出与SspCSP2具有较强的结合能力(Ki<20μM),其中(-)石竹烯氧化物、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和壬醛3种气味物质与SspCSP2的结合能力最强(Ki<10μM);相反,SspCSP2与顺-3-己烯醇和(+)-α-长叶蒎烯这2种气味物质的结合能力则为在中性条件下的高于酸性条件;但pH对SspCSP2与反式-2-己烯醇的结合能力无影响。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的荧光猝灭分析
  Stern-Volmer方程分析SspCSP2与4种具有电生理活性物质(α-蒎烯、β-蒎烯、γ-异松油烯与(+)-α-长叶蒎烯)的猝灭类型,结果显示4种物质均为静态猝灭;结合位点分析发现,4种物质与SspCSP2的结合比例均为1∶1。热力学方法分析发现,4种物质与SspCSP2之间的相互作用力均为疏水性作用力。
  (二)松褐天牛肿腿蜂SspOBP7与气味分子的结合机制
  1.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的荧光猝灭分析
  SspOBP7与24种气味分子的猝灭类型和相互作用研究结果表明,SspOBP7与18种气味分子的猝灭类型属于动态猝灭,余下的6种物质属于静态猝灭;6种静态猝灭的物质中有3种物质属于非极性分子,分别为s-(-)柠檬烯、(+)-α-长叶蒎烯和异松油烯,与SspOBP7形成疏水性作用力;余下3种物质,反式-2-己烯醇、顺-2-戊烯-1-醇和癸醛则属于极性分子,与SspOBP7形成氢键作用;双对数方程分析结果显示,6种物质与SspOBP7的结合比例均为1∶1。
  2.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的结构分析
  利用圆二色谱法分析了SspOBP7在不同pH值、不同配体配比条件下的二级结构变化。结果表明,pH值的变化会引起SspOBP7的α螺旋含量的变化,其中pH7.4条件下SspOBP7的α螺旋数最多,其次是pH3.0,最少的为pH5.0;设定pH7.4,SspOBP7的α螺旋数会随着配体配比的增加而减少;当SspOBP7与配体按1∶1结合后,改变体系pH值,蛋白的α螺旋数变化规律与SspOBP7纯蛋白的一致。
  以意大利蜜蜂Apis mellifera的AmelOBP5(3R72)为建模模板,对SspOBP7进行同源建模。结果显示,SspOBP7具有6个α螺旋,3个二硫键,属于Classical OBP;分子对接结果显示SspOBP7中央具有一个结合腔,呈球状,结合腔的表面具有三处极性区域,分别为Thr86、Tyr105和Phe118。分析极性区域处形成的氢键作用,发现Thr86处与配体形成氢键作用时,需要Tyr105的参与,Phe118与配体形成氢键作用的位置为主链上的氧原子,Tyr105可以单独与配体形成氢键作用,且形成的位置为侧链羟基上的氧原子。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的定点突变及与气味分子结合机制
  针对Tyr105设计定点突变,突变成Phe105,目的是破坏氢键作用。表达、纯化出重组突变蛋白,测定了突变蛋白与6种静态猝灭物质的结合情况。结果显示,这6种物质与突变蛋白的结合能力均有一定程度的减弱,但结合比例没有改变。突变后的SspOBP7与极性分子葵醛的结合能力显著下降,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变之后氢键作用消失;而突变后的SspOBP7与其它2种极性分子,反式-2-己烯醇和顺-2-戊烯-1-醇,仍具有较强的结合能力,荧光猝灭和分子对接结果显示,蛋白突变之后,氢键作用还存在,只是位置发生改变;突变后的SspOBP7与3个非极性分子结合能力明显减弱,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变后仍为疏水性作用,但3个分子在结合腔内的取向均发生了改变。通过对比分析蛋白的结合腔,发现SspOBP7突变之后,结合腔的体积明显变大。
  综上,松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因主要分布在虫体腹部,SspCSP2对气味物质的选择性差,SspCSP2与电生理活性物质主要是通过疏水性作用力结合;SspOBP7与24种物质中的3种极性分子和3种非极性分子结合,结合力分别为氢键作用和疏水性作用力,环境中改变pH值和配体的浓度均会使蛋白的二级结构发生改变,极性区域的破坏会导致SspOBP7的结构发生转变,从而影响蛋白与气味分子的结合,相比之下,非极性分子结合力的改变更明显,疏水性作用力所受影响比氢键作用力更明显。
[硕士论文] 王梅菊
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本研究旨在分离和筛选生防细菌菌株,明确其分类属性,评估其生防潜力。取得了如下研究结果:
  1.分离筛选获得了促生细菌菌株AW-17和CanL-30。
  分别从湖北武汉、湖北咸宁和安徽芜湖采集的植物样品中分离到82个菌株,包括细菌菌株和酵母菌菌株。采用拟南芥平板对峙培养试验和油菜浸种促生试验相结合的方法筛选得到2个促进植物生长的细菌菌株AW-17和CanL-30。菌株AW-17和CanL-30均能够通过产生挥发性有机物促进拟南芥幼苗生长,另外菌株AW-17还能够产生吲哚乙酸IAA,具有溶解不可溶性磷的能力。将这两株细菌用于盆栽油菜促生试验,结果表明:菌株AW-17对油菜生长有稳定促生效果,而菌株CanL-30则不具备盆栽促生能力。
  2.明确了菌株AW-17和CanL-30的生物学特性,并对其进行了鉴定。
  菌株AW-17单菌落乳黄色,质地光滑粘稠,在8℃~35℃条件下均能生长,最适生长温度范围为20℃~30℃,在7%及以下的盐浓度条件下均能生长,但无法在10%盐浓度条件下生长,革兰氏染色阴性,不产生芽孢。生理生化测定结果和16SrDNA序列分析表明:菌株AW-17属于液质沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)。菌株CanL-30单菌落乳白色,质地光滑干燥,在15℃~40℃条件下能较好的生长,最适生长温度范围为20℃~30℃,在7%及以下的盐浓度条件下均能生长,但无法在10%盐浓度条件下生长,革兰氏染色阳性,产生芽孢。鉴定结果表明菌株CanL-30属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
  3.筛选出拮抗菌株CanL-30,并对其产生的抗真菌代谢产物进行了分离纯化。
  利用平板对峙培养和离体油菜叶片接种相结合的方法,筛选到1株能够稳定抑制灰葡萄孢的拮抗菌株CanL-30,其能够对多种病原菌产生拮抗作用,二分格皿试验和带毒平板试验结果表明菌株CanL-30主要通过产生抗真菌代谢产物抑制病原菌的生长。菌株CanL-30在NB培养基中,28℃、150r/min的条件下摇培72h,产生的抗菌代谢产物抑菌效果最好,抑菌率达到90%,利用酸沉淀和甲醇萃取的方法对该条件下CanL-30产生的抗菌代谢产物进行提取,带毒平板试验结果显示,不同浓度粗提物平板对灰霉菌均有不同程度的抑制作用,其中365μg/mL粗提物平板对灰霉菌的抑菌率高达100%。CanL-30抗真菌粗提物具有耐高温、抗紫外的特性,其在100℃的水浴锅中处理60min钟后,抑菌活性与对照相比无差异。用紫外灯(UV-C,30W)处理抗菌粗提物150min后,其抑菌圈大小与对照无显著差别。对粗提物中的活性物质进行了分离和鉴定,发现CanL-30产生的代谢产物中含有iturin。
  本研究获得的油菜促生菌株AW-17和灰葡萄孢生防菌CanL-30存在着进一步研究和开发的潜力。
[硕士论文] ANUM BASHIR
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是一种已被深入研究的革兰氏阴性植物病原细菌,但该菌对动物如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的致病性最近也已被研究证实。铁是自然环境中最丰富的元素之一,但其生物利用率一直相对较低。多种不同的微生物类群已经发展出具有对铁具有高亲和性能的铁吸收系统,包括血红素摄取系统、铁载体系统和细胞膜受体等。假单胞菌属(Pseudomonas)的主要铁载体是pyoverdine。它是一种低分子量、高亲和力的铁清除荧光分子,仅在铁限制条件下由荧光假单胞细菌群产生。除了具有对铁的吸收性能,铁载体pyoverdine也可以作为细菌毒素。本学位论文主要研究了基于液体培养条件下的线虫致病模型中,在铁限制条件下丁香假单胞菌野生菌株MB03和秀丽隐杆线虫之间的相互作用,以及铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌致病性中的作用。
  鉴于铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aerugionosa)PAO1菌株已经鉴定出几乎所有与pyoverdine生物合成和分泌相关的基因,使用PAO1菌株的pyoverdin基因簇作为参考序列,利用在线工具Anti-SMASH对丁香假单胞菌MB03基因组中pyoverdine编码基因簇进行了预测和定位分析。结果发现,发现丁香假单胞菌MB03中缺少5个与PAO1中的直系统同源基因(pvdX,pvdY,pvdA,pvdF和fpvI)。在这些基因中,pvdX和pvdY编码调节蛋白;pvdA和pvdF编码合成N5-甲酰基-N5羟基鸟氨酸残基所需的酶,这些残基存在于PAO1的pyoverdine的肽链中。但在MB03的pyoverdine基因簇中也存在一种为PAO1中所没有的基因,即syrP。推测syrP的编码产物可能参与存在于MB03-PVD肽链中的羟基天冬氨酸残基的β-羟基化作用此外,在PAO1中,两个Sigma因子编码基因pvdS和fpvI分别参与pyoverdine生物合成和pyoverdine受体FpvA的激活,但是,在丁香假单胞菌MB03的基因组中不存在fpvI,而是在fpvA基因的前面有一个pvdS IS基因框,表明在丁香假单胞菌MB03中的pvdS可能参与fpvA基因的转录。
  Pyoverdine在结构上由3个不同的结构域组成,即生色团(最保守的部分)、肽链(最可变部分)和侧链(羧酸衍生物)。在MB03的铁载体pyoverdine基因簇中的非核糖体基的多肽合成酶(NRPS)基因编码参与pyoverdine的肽链和发色团部分合成的一种大分子量酶。通过NRPS预测因子对丁香假单胞菌MB03的5个推定的NRPS基因进行计算机模拟表征表明,MB03-PVD的肽链呈线性形式并且由L-1ys,D-Asp,L-Thr,L-Thr,L-Ser,D-Asp和L-Ser。经测定铁载体pyoverdine特定光吸收值,发现MB03产生的pyoverdine与培养基中的Fe3+浓度成反比,而铁对于pyovidine生产的临界抑制浓度约为20μmol/L。
  通过使用RecTE重组系统来进行pyoverdine生物合成2个相关基因的中断,获得了相应基因中断突变株ΔpvdD和ΔpvdJ。由于pyoverdine是一种分泌的非核糖体多肽,所以可通过LC-MS和荧光光吸收测定来鉴定中断菌株是否丧失产铁载体pyoverdine的活性。结果发现,两株突变株的破碎细胞滤液均缺乏pyoverdine特征性的黄绿色荧光,表明突变株未能产生pyoverdine。经质谱鉴定,2株突变株也缺乏pyovine的特征峰,而野生型MB03产生了具有1123.412m/z和1142.4165m/z的两类pyovidine。
  为调查铁在MB03对线虫致病性中的作用,在添加或不添加铁的M9培养基中来培养MB03菌株,然后进行对秀丽隐杆线虫的杀虫生物测定。由于Pyoverdine也有助于在丁香假单胞菌中发现的几种常见致病因子(如AHL,EPS和Tabtoxin)的产生,因此,pyoverdine有可能在培养过程中由于铁在培养基浓度的不同从而调节了细胞毒性、并导致对线虫杀虫效果的差异性。为验证这一假设,将过夜MB03培养物产生的滤液分成两半,其中之一添加额外的100μmol/L铁并培养过夜。生物测定结果发现,野生菌株MB03导致供测线虫的显著性致死(p=0),但通过在M9中添加外源铁(100μmol/L)或通过在MB03过夜培养物中直接添加外源铁的细胞滤液可在一定程度上减小致死率。此外,液相生物测定的致死效应通常发生在培养30h之后,因此,足够的培养时间对于细菌的致死作用也是进行生物测定时要考虑的。
  将基因中断突变株ΔpvdD和ΔvdJ与野生菌株MB03在贫铁的M9培养基中生长后进行液相杀虫生物测定,另外,使用纯化铁载体pyoverdine进行相应生物测定,因为推测pyoverdine可能是具有杀虫活性的MB03滤液中的一种作用导致线虫死亡的活性因子。在液相生物测定中使用的纯化pyoverdine的浓度与在MB9中在48h内在M9培养基中产生的pyoverdine的浓度相当。测量暴露于各种滤液的线虫的相对死亡率,结果如预期相符:与M9和大肠杆菌(Escherichia coli OP50滤液相比,MB03滤液显示显着的杀死作用(p=0),而两种突变株的杀虫试验都没有发现线虫死亡。
  为了证实突变体的减毒活性是由于缺乏pyoverdine产生的,将纯化的pyoverdine加入突变体中以测量与野生型相当的相对死亡率,结果证实pyoverdine是导致线虫死亡的细菌滤液中的活性因子。通过pyoverdine生物合成缺陷的突变株的减毒活性、以及两突变株在添加纯化的pyoverdine后又可杀线虫的实验结果可以证实,pyoverdine在MB03介导的液相杀虫实验中是决定杀虫活性的重要因素。此外,通过测量MB03和两种突变株的生长曲线,发现突变株在贫铁M9培养基中生长缓慢。因此,这表明pyoverdine对丁香假单胞菌MB03生长也是至关重要的。
  总之,本研究结果表明,丁香假单胞菌MB03具有产生pyoverdine的遗传潜力。通过RecTE重组系统构建获得2株pyoverdine生物合成缺陷的基因中断突变株。铁载体pyoverdine在MB03菌株对秀丽线虫的杀虫活性中发挥重要作用。同时,pyoverdine也是影响宿主细胞生长的重要因素。就我们所知,本项研究是研究丁香假单胞菌铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌与动物宿主之间相互作用的第一例研究。
[硕士论文] 杨艳敏
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:桃流胶病是我国桃树上最严重的病害之一,主要是由病原菌Botryosphaeria dothidea,B.rhodina和B.obtuse引起的,目前针对桃流胶病的防治策略以化学防治为主,农业防治为辅,但化学农药的使用不仅会使病原菌产生抗药性,而且造成环境污染,危害人体健康,生物防治因其绿色环保、安全可靠而受到广泛关注。本试验从桃树根组织中分离并筛选出了一株对桃流胶病病原菌具有拮抗作用的内生细菌,结合形态观察与分子手段对其进行鉴定,并对菌株进行GFP标记,研究其在植物体内的定殖情况,另外初步探讨了该菌株的生防机制,主要研究结果如下:
  1.从桃树根茎叶部位共分离到内生细菌129株,其中有20株对桃流胶病病原菌B.dothidea XNHG-241具有拮抗作用,选取拮抗作用较好的一株菌株HAR3进行鉴定,通过16S rRNA和gyrB基因序列构建系统发育树并结合形态观察将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
  2.构建了含egfp片段的质粒pUBXCP,通过接合转移的方法将质粒转入解淀粉芽孢杆菌HAR3,得到菌株HAR3-GFP。标记菌株能够表达强烈的荧光,并能稳定遗传,且菌株HAR3-GFP与野生型菌株HAR3对B.dothidea XNHG-241的抑制作用没有显著性差异。
  3.HAR3的抗真菌谱试验结果表明,HAR3不仅对造成桃流胶病的B.rhodina,B.dothidea和B.obtusa具有拮抗作用,对Botrytis cinerea,Monilinia fructicola,Colletotrichum higginsianum,Penicillium digitatum和Geotrichum citri-aurantii等多种病原菌也具有拮抗作用,但对Rhizopus stolonifer没有拮抗作用。
  4.采用灌根的方法用HAR3-GFP菌悬液处理植株,取番茄和拟南芥幼苗根部制作切片,置于激光共聚焦显微镜下拍照观察,发现接种1d和3d后,有大量的HAR3-GFP定殖在根表和根毛区,5d后只能观察到少量的菌落定殖。对桃幼苗采用组织再分离和稀释涂布平板的方法,在接种10d,30d,100d后从桃树根茎叶部位均能分离到HAR3-GFP,表明HAR3-GFP能够在桃树体内定殖,并能通过根部扩展到茎叶部。
  5.对桃枝条喷施HAR3菌液后立刻接种病原菌B.rhodina JMB-122,接种5d后,处理组枝条病斑为4.36mm,相比对照组降低了32.8%。对于流胶情况,处理组无胶体的流出,而对照组流胶率达到了75%。另外,对枝条喷施HAR3菌液24h后,再接种病原菌,对照组枝条在第5d病斑为5.16mm,流胶率达到了25%,而处理组枝条在第5d病斑为0.65mm,相比对照组降低了87.4%,未发生流胶。
  6.经三氯甲烷∶甲醇(65∶15)萃取菌株HAR3发酵上清液,制备发酵液粗提物,当在培养基中加入0.5625%的发酵液粗提物就能完全抑制B.dothidea XNHG-241的生长。同时从HAR3中扩增出了8个不同的脂肽生物合成基因,包括可以合成杆菌霉素的bamD基因,合成杆菌溶素的bacD,bacAB基因,合成伊枯草菌素的ituD,ituA,ipa14,ituC基因,合成抗霉枯草菌素的fenF基因。
[硕士论文] 樊金星
农业昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:二化螟Chilo suppressalis(Walker)是水稻上重要的农业害虫之一,在全世界范围内均有发生。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的杀虫晶体蛋白具有杀虫活性,可通过生物农药和转Bt基因作物的方式应用到有害生物的防治中,研究靶标害虫对Bt蛋白的防御机制非常有必要。MAPK(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路广泛存在于生物体中,在细胞的生长、发育、分化以及凋亡中都发挥着重要的作用。ERK基因在MAPK信号通路中发挥着重要作用。本研究通过RNAi技术研究CsERK在二化螟防御Cry1Ca蛋白过程中的作用,主要研究结果如下:
  1.利用RT-PCR结合RACE技术克隆二化螟ERK基因并获得cDNA序列全长。CsERK1基因序列全长1,892bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列为1,209bp,编码403个氨基酸,预测蛋白的分子量为44.51kDa;CsERK2基因序列全长2,015bp,ORF序列为1,092bp,编码364个氨基酸,预测蛋白的分子量为41.96kDa。结果显示,两个序列的内同源性较低,仅为21.5%。
  2.利用实时荧光定量PCR技术,分析CsERK基因在二化螟不同龄期及不同组织内的时空表达模式。时间表达模式结果显示,CsERK1基因在蛹和成虫中表达量最高;CsERK2基因在成虫中表达量高于其他龄期;空间表达模式结果显示,两个CsERK基因均在中肠的表达量最高。
  3.将不同浓度的Cry1Ca蛋白混入饲料饲喂二化螟三龄幼虫,并通过实时荧光定量PCR技术检测二化螟ERK基因的表达情况。结果显示,二化螟三龄幼虫在取食20μg/g的Cry1Ca人工饲料30min后,CsERK1基因表达量迅速上调为对照组的3倍,CsERK2基因表达量无显著变化;取食60μg/g的Cry1Ca人工饲料30min后,CsERK1基因表达量无显著变化,CsERK2基因表达量显著下调,1h后出现小幅上调。
  4.通过饲喂法对二化螟初孵幼虫ERK基因进行沉默,48h后取样检测沉默效率,结果显示CsERK1、CsERK2基因沉默效率分别为46.2%、38.5%。干扰48h后,将幼虫转至含30μg/g的Cry1Ca蛋白的人工饲料或表达Cry1Ca蛋白的转基因水稻胚芽中饲喂7d。生测结果显示,两个处理组与对照组相比,幼虫死亡率均无显著差异。说明Cry1Ca蛋白虽然可以引起ERK基因表达量的变化,但沉默二化螟ERK基因对幼虫死亡率没有影响,这预示着ERK基因不参与二化螟对Cry1Ca蛋白的防御机制。
[博士论文] 那娃兹
农业昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:为了满足世界各地日益增长人口的粮食需求,需要不断增加农作物的产量。为了挽回害虫爆发对农作物造成的损失,需要更多新型杀虫剂的研发和应用。然而杀虫剂对环境、人类健康和害虫天敌的不利影响已成为世界性的热点问题。害虫天敌与杀虫剂靶标害虫栖息于同一生境,天敌可能通过不同途径直接或间接暴露于这些杀虫剂中。杀虫剂对害虫天敌潜在的不利影响引起公众和科学家的高度关注,已有很多这方面的报道。氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈是两种广泛使用的农药,用于防治不同农作物的鞘翅目、鳞翅目、双翅目和半翅目害虫。异色瓢虫(鞘翅目:瓢虫科)是一种重要的生防因子,能够控制多种重要害虫,包括蚜虫、介壳虫、粉虱、粉蚧、螨虫和木虱类。它在包括中国、日本、美国、非洲、欧洲等很多国家,作为IPM(Integrated Pest Management)的重要组成部分,广泛应用于生物防治。在本研究中,我们测定了氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈对异色瓢虫的急性毒性,研究了这两种杀虫剂亚致死剂量对异色瓢虫存活率、发育历期、寿命、繁殖、体重、酶活性和基因表达谱的影响。主要研究结果如下:
  1.急性毒性试验
  选择异色瓢虫2龄幼虫(≤24h)用于这两种杀虫剂致死浓度和亚致死浓度测定。使用微量点滴仪向供试幼虫腹部区域点滴1μl药液,处理72h后记录急性毒性数据。结果表明:氯虫苯甲酰胺对异色瓢虫2龄幼虫的LC50值为36.67mg a.i./L,LC10和LC30值分别为2.42mg a.i./L和12.06mg a.i./L;氟啶虫胺腈对异色瓢虫2龄幼虫的LC50值为53.42mg a.i./L,LC30和LC10值分别为21.30mg a.i./L和5.65mg a.i./L。这两种杀虫剂对异色瓢虫有毒性,因为它们的LC50值均低于防控田间靶标害虫时的推荐剂量。因此,需要进一步评价这两种杀虫剂的亚致死效应。
  2.亚致死剂量氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈下异色瓢虫生命表参数
  选择LC30和LC10进行亚致死效应测定。采用age-stage two-sex生命表评价亚致死效应。LC10和LC30剂量下,分别取100头2龄幼虫(≤24h)进行点滴处理,点滴丙酮作为对照。处理后,记录存活率、发育历期、繁殖力和寿命,直至最后一个个体死亡。称量幼虫、蛹重、成虫体重。
  氯虫苯甲酰胺对异色瓢虫亚致死效应。与对照相比,LC10(2.42mg a.i./L)和LC30(12.06mg a.i./L)处理后,2龄和4龄幼虫的发育历期、蛹期、产卵前期(POP)显著延长幼虫、蛹及成虫体重、成虫寿命和繁殖力显著降低。另外,异色瓢虫种群增长参数如净生殖率(R0)、内禀增长率(r)和周限增长率(λ)均显著下降。
  氟啶虫胺腈对异色瓢虫亚致死效应。LC10(5.65mg a.i./L)和LC30(21.30mg a.i./L)处理后,处理组的发育历期、平均寿命、产卵前期(TPOP)与对照组相比均显著延长。幼虫、蛹及成虫体重、处理组成虫寿命和繁殖力均显著降低。同时,LC10和LC30对种群增长参数有不利影响,例如LC30处理组内禀增长率(r)降低到0.01d-1,其次是LC10(0.11d-1),均显著低于对照组(0.12d-1)。氟啶虫胺腈处理组种群周限增长率(λ)和净生殖率(R0)也呈现相似趋势。
  以上结果表明,在亚致死剂量下,氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈均对异色瓢虫至关重要的生命表参数具有不利影响,这可能导致这些天敌种群增长和捕食率的下降。异色瓢虫在杀虫剂胁迫下,必须启动体内解毒相关的过程,从而对其生物学、发育和繁殖过程产生不利影响。因此,进一步研究暴露于杀虫剂解毒酶对氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈的反应是十分必要的。
  3.氟啶虫胺腈胁迫下解毒相关酶活性测定
  比较异色瓢虫2龄幼虫在LC10和LC30处理处理及对照(丙酮)中,解毒相关酶如谷胱甘肽S-转移酶(GST)、细胞色素P450(P450)和羧酸酯酶(CarE)的酶活性。处理24h、48h和72h后,采集存活的幼虫用于酶活性测定。结果表明:LC10和LC30处理后,24h、48h和72h GST显著高于对照组。同样地,施药72h后,与对照组相比,处理组P450和CarE酶活性也呈增加趋势。因此可以看出,GST酶是异色瓢虫对氟啶虫胺腈解毒机制的主要解毒酶,而P450和CarE发挥部分作用。
  4.氟啶虫胺腈诱导表达的基因
  通过全基因组转录组测序研究异色瓢虫被氟啶虫胺腈诱导表达的基因,对深入了解该杀虫剂对异色瓢虫的作用机理是必要的。用氟啶虫胺腈LC30(21.29mg a.i./L处理异色瓢虫2龄幼虫,24h后取存活的幼虫用于转录组测序。氟啶虫胺腈处理组和对照组两个文库分别产生50,702,976和47,005,096个clean reads。这些转录产物进一步组装成52,229个unigene,其中,分别有33,820和25,175个unigene可以在NCBI非冗余蛋白质序列(Nr)和SwissProt数据库中找到同源蛋白质。在这些基因中,有794个差异表达基因,其中446个为上调基因,348个为下调基因。从DEGs中发现许多与杀虫剂相关的差异表达基因(DEG,differentially expressed genes),如P450s、GSTs、USTs、ESTs等。此外,差异表达基因GO(the gene ontology)分析表明:处理组幼虫中大多数Go terms显著下调。此外,部分DEGs还涉及一些关键的与解毒相关的KEGG途径,如视黄醇代谢、药物代谢、异生素代谢和催乳素信号传导途径。本研究选择了15个特异性表达基因,通过实时定量PCR(qRT-PCR)分析对转录组结果进行验证。综上所述,氟啶虫胺腈可诱导异色瓢虫解毒相关基因和代谢通路的变化,为下一步研究其分子作用机制打下基础。
  总之,本研究从不同层面证明了氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈对异色瓢虫均具有不利影响,提供了关于这两个新型杀虫剂应用对天敌潜在不利影响的全面信息:一方面,为IPM和化学防治时,如何正确选择化学农药,避免对异色瓢虫情况产生不利影响,提供了重要参考;另一方面,为进一步研究这两种新型杀虫剂对天敌的分子毒理打下了基础。
[硕士论文] 于洋
生物工程 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,新型抗生素的发现速度变得缓慢,越来越多的病原菌在已知抗生素频繁作用下已经产生了“耐药性”,急需发现新构型、新功能的活性化合物。常规生态环境限制了人们发现新菌种和新构型抗生素型化合物的脚步,极端环境作为一种微生物分离的新型高效的分离源已引起人们的广泛关注。盐碱地作为极端环境的一种,具有pH普遍偏高,可溶性盐含量在1-2%左右的特性,盐碱地土壤环境中的微生物种群大多具有耐盐碱的性质以及产生一些特殊的生理机制和功能。本研究主要对黑龙江省杜尔伯特地区盐碱化土壤中的放线菌进行分离,并对所分离放线菌的抗菌活性及植物促生的活性进行检测,不仅为新菌种的扩充和新型抗生素的获取提供宝贵的资源,也为盐碱环境的开发和改良打下坚实基础。
  研究的主要结果如下:
  (1)对杜尔伯特蒙古自治县地区的盐碱化土壤中的放线菌进行分离,利用四种分离培养基共分离并纯化得到43株放线菌,通过菌落形态对比发现其中大多数菌株属于链霉菌属。
  (2)对43株放线菌进行抗真菌活性初筛,共得到7株具有广谱抗菌活性的菌株,其中链霉菌2SGS2具有极强的抗真菌活性,对大豆菌核和大豆疫霉的抗菌活性均可达到90%以上,对其它8种植物病原真菌的平均抑菌率也能达到50-60%左右,而且发酵液对枯草芽孢杆菌有较强的抑菌活性,抑菌直径D=21mm,由于链霉菌2SGS2对大豆植株相关的病原真菌均具有较强的抗菌活性,故选择链霉菌2SGS2对大豆植株的离体叶片和苗期植株抗病性分别进行试验。
  (3)离体大豆叶片试验表明,链霉菌2SGS2对离体大豆叶片的染病情况有减弱作用,在孢子稀释液浓度为1.0×108cfu/mL时,对离体大豆叶片的病情指数减弱作用最显著;盆栽试验表明,该菌株对大豆幼苗的发病率和病情指数等均存在明显的抑制作用。当孢子稀释液浓度达到1.0×107cfu/mL时,对大豆菌核病的发病情况抑制效果最明显,且对大豆幼苗的株高等生理指标存在不同程度的促进作用。此外,平板催芽和盆栽试验显示,链霉菌2SGS2的孢子稀释液对小麦、玉米等植物均具有不同程度的促生长作用。通过对植物的株高、地上部分鲜重、地上部分干重、根长、根鲜重和根干重等指标的测试,结果显示,在孢子稀释液浓度为1.0×107cfu/mL时,对玉米地上部分鲜重和小麦株高的促进作用最为明显,与对照组相比,其值分别了提高33.72%和18.33%。
  (4)对菌株NEAU-S1GS20进行16S rRNA测序,结果显示该菌株与链霉菌Streptomyces xinghaiensis S187T具有98.41%的相似性,有可能为链霉菌属的一个新种。对该菌株采用多相分类学方法进行系统分类学鉴定,结果显示菌株NEAU-S1GS20在系统进化树中与Streptomyces xinghaiensis S187T形成稳定的分支,但它们在培养形态特征观察、生理生化指标对比、化学成分分析等多个方面均存在显著差异,DNA同源性结果显示,菌株NEAU-S1GS20与相似菌株的同源性小于70%,故可以确定NEAU-S1GS20属于链霉菌属的一个新种,并将其命名为Streptomyces durbertensis。
[硕士论文] 韩宁宁
农药学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:囊泡病毒(ascovirus)是一类较新发现的含有大分子双链DNA基因组的昆虫病毒。囊泡病毒主要侵染鳞翅目夜蛾科昆虫,引起寄主昆虫产生慢性致死病。囊泡病毒侵染使细胞裂解产生包含病毒粒子的囊泡,囊泡在血淋巴中积累,使血淋巴呈乳白色。囊泡病毒侵染形成包含病毒粒子囊泡的过程类似于凋亡小体的形成过程,囊泡病毒通过凋亡形成囊泡而不是凋亡小体。本研究以HvAV-3h为实验对象,拟通过研究HvAV-3h侵染与细胞凋亡的关系及决定凋亡过程的基因为囊泡病毒侵染形成囊泡提供新的理论依据。主要结果如下:
  快速测定囊泡病毒滴度方法的建立。通过测定HvAV-3h侵染细胞不同时期的细胞凋亡率并结合显微观察研究结果确定病毒凋亡检测的最适侵染时间为24h p.i.。梯度稀释病毒原液侵染细胞24h后台盼蓝染色计数染色细胞个数并计算死细胞率。病毒侵染组每孔的细胞死亡率高于对照组则判定为病毒侵染孔,否则为病毒未侵染孔。并根据Reed-Muench的方法测定病毒的滴度为5.62×108TCID50/mL。
  HvAV-3h侵染细胞12h诱导细胞凋亡,但病毒侵染24h时能抑制由放线菌素d(ActD)引起的细胞凋亡。分析HvAV-3h基因组序列发现HvAV-3h含有5个iap-like基因,分别编码IAP-1到IAP-5蛋白。HvAV-3h IAPs蛋白结构域分析结果表明:只有IAP-2含有一个类BIR结构域和一个RING结构域。表达谱分析结果表明:IAP-1和IAP-2在病毒侵染9h时有表达高峰,另一表达高峰分别在病毒侵染21h和27h;IAP-3仅在24h p.i.有一个表达高峰;而IAP-4和IAP-5在病毒侵染过程中表达量变化不明显。
  通过构建瞬时表达IAPs的质粒,瞬时转染后测定细胞凋亡率,结果表明:瞬时表达IAPs的质粒均无诱导凋亡活性。瞬时转染表达质粒后用ActD诱导细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡率及测定caspase-3活性结果表明:只有IAP-2具有抑制细胞凋亡活性。通过构建过表达IAPs的稳定细胞系进一步验证IAP-2抗凋亡活性的结果表明:IAP-2能抑制由ActD诱导的细胞凋亡。因此,IAP-2可能在HvAV-3h侵染细胞抑制由ActD引起的细胞凋亡中起重要作用。
[硕士论文] 韩桂喜
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:野生型酵母菌株34-9,属于柠檬型克勒克酵母(Kloeckera apiculata),具有抑制柑橘采后青绿霉病的生物防治作用,由于该菌易受环境影响,并且防治的病原菌种类单一,所以存在防治效果不稳定,抑菌谱较窄等问题。酵母菌株34-9的防治效果,可以通过对其基因进行改良的方式来优化,以实现在分子水平上对酵母的转化。本课题实验运用的转化方法为农杆菌介导,通过优化酵母的转化体系条件,包括预培养阶段是否加入乙酰丁香酮,酵母的浓度,共培养阶段的时间和温度,以及承载膜的类型,得到了稳定遗传的转化子,建立了酵母菌株34-9的遗传突变体库。同时,对获得的转化子进行了生防效力的初步探究,研究了转化子对柑橘采后酸腐病和炭疽病的防治效果。
  研究的主要结果如下:
  1.优化了农杆菌介导的条件:供体农杆菌AGL-1的OD600为0.6,酵母34-9的菌液浓度为8×107CFU/mL时,预培养阶段加入乙酰丁香酮,共培养阶段用滤纸作为承载膜,温度调至28℃,培养48h,达到的转化效率最高。
  2.通过对500个转化子进行生防效力检测,找到一株可以延缓酸腐菌AY-1发病的酵母转化子3-138,对酸腐有一定的生防效力。
  3.通过筛选500个转化子,找到一株对炭疽AISH有一定抑制作用的酵母转化子3-2。
[硕士论文] 吕思彤
药学 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:核桃叶为植物胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)的树叶,其资源丰富并存在一定的杀虫活性。本文研究了核桃叶对三种农业害虫小菜蛾(Plutella xylostella L.)、棉蚜(Aphis gossypii G.)和菜青虫(Pieris rapae L.)的杀虫活性。以参与免疫防御的关键酶-酚氧化酶为靶点进行研究,阐明核桃叶杀虫的作用机制,为核桃叶靶向杀虫提供理论依据。
  (1)测定核桃叶50%、70%、90%乙醇提取物对小菜蛾、棉蚜和菜青虫的杀虫活性。实验表明:70%乙醇提取物的胃毒活性最强,棉蚜>小菜蛾>菜青虫,其中棉蚜施药30h和48h的致死中浓度分别为11.70mg/mL和5.07mg/mL;小菜蛾施药3d和4d的致死中浓度分别为16.92mg/mL,8.31mg/mL;菜青虫施药3d和4d的致死中浓度分别为21.55mg/mL和13.86mg/mL。70%乙醇提取物对棉蚜的触杀活性最好,25mg/mL接触48h杀虫率达到80.15%;90%乙醇提取物对小菜蛾和菜青虫的触杀活性最好,同样条件下杀虫率达71.23%和56.12%。70%乙醇提取物对小菜蛾的生长抑制效果最好,24h体重抑制率达34.12%;90%乙醇提取物对菜青虫的生长抑制效果最好,24h体重抑制率为41.23%。90%乙醇提取物对三种试虫拒食活性最强,48h的非选择性和选择性拒食活性均为棉蚜(81.96%,87.74%)>菜青虫(75.75%,79.35%)>小菜蛾(61.20%,65.23%)。
  (2)以小菜蛾为昆虫模型,探究核桃叶70%乙醇提取物杀虫的作用机制。实验表明:核桃叶提取物在给药初期可以激活小菜蛾体外血淋巴的黑化,3d后黑化又被抑制。中间产物多巴的含量随着给药浓度的增加而升高,验证了核桃叶对黑化反应的激活作用。在蛋白质水平上,核桃叶70%乙醇提取物对血淋巴中蛋白含量产生影响,以给药48h为分界点,蛋白质含量增后降低,变化浮动在10%左右。在血糖水平上,血淋巴中海藻糖的含量随着提取物浓度的增加而降低,随着时间的变化在昆虫体内的含量先增加后减少。
  (3)探究杀虫过程中靶点-酚氧化酶的活性及蛋白和基因的表达量差异。酶学特性实验表明:小菜蛾酚氧化酶在pH=6-6.8范围内稳定性较好,最适pH值为6.4,在20-40℃酶活相对稳定,最适温度为34℃。70%乙醇提取物在体外对小菜蛾酚氧化酶有激活作用,给药浓度9mg/mL时,激活率达到35.09%。在体内对4龄虫的激活作用最强,测定对四龄虫不同组织的激活作用,血淋巴>表皮>头部。通过qRT-PCR和SDS-PAGE分别检测小菜蛾酚氧化酶的mRNA和蛋白的表达情况,结果均表现出给药浓度越高其表达量越高的情况,表明70%乙醇提取物至少会促进酚氧化酶基因转录水平的表达,是否直接促进翻译水平的表达还需进一步验证。
[博士论文] 高姗姗
生物学;动物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:G蛋白偶联受体(GPCR)Latrophilin(LPH)不仅涉及人类与哺乳动物的多动症、精神分裂症及成瘾等精神疾病的发生,还涉及到对外源蛛毒素的信号传递及多种药物的敏感性。目前关于LPH受体在昆虫中的功能和信号传导机制尚不清楚。
  本研究首先在21种动物中对LPH进行了系统进化分析,结果显示,lph是由一个共同祖先基因衍化而来,但是拗分别在脊椎动物、头索动物、尾索动物和昆虫中发生了独立的进化。lph基因在脊椎动物中发生了复制,产生了3个拷贝(lph-1,lph-2和lph-3);鸟类、尾索动物、头索动物中也发生了基因复制事件只存在lph-2和lph-3。线虫中有两个拷贝,分别对应于脊椎动物lph-1和lph-2;然而,lph基因在昆虫只有一个拷贝。这些物种的lph虽然起源与一个共同祖先基因,但是却发生了复杂的分化,暗示其在这些物种中可能发生了功能分化。
  为了研究LPH在赤拟谷盗生长发育中的调控作用,克隆了其Tclph基因,发现该基因在赤拟谷盗中存在3种选择性拼接形式Tclpha,Tclphb和Tclphc。为了进一步研究赤拟谷盗中这3种剪接本的作用,分别敲减了三种剪接本特异区域及公共区域,结果显示,dslph组不产卵,成虫翅异常比例约24%,成虫性成熟时累计死亡率约30%;进一步分析表明,这些效应由转录本Tclphb所引起。且进一步回交实验结果显示dslph组会导致雌性卵巢萎缩,其萎缩比例约为63%,进而影响赤拟谷盗的生殖。
  在mRNA水平上对Tclph的信号通路进行初步研究,发现抑制lph表达后可导致plc,pka和foxo表达上调,进而影响cAMP/PKA、PLC/IP3及ISS信号通路。这些信号通路会影响昆虫翼羽化后表皮细胞死亡、卵黄原前体蛋白Vg合成及寿命进而导致赤拟谷盗生长发育及生殖受到影响。推测Tclph可能是通过这些信号通路来影响赤拟谷盗的生长发育。
  有趣的是,使用10mg/mL克百威(氨基甲酸酯类农药)和1mg/mL敌敌畏(有机磷类农药)处理对照组和敲除组的晚期幼虫,72h后dslph组的累计死亡率较对照组死亡率显著增加。研究结果显示,抑制赤拟谷盗Tclph表达可导致乙酰胆碱(ACh)通路上的关键基因Tcace-1上调表达,Tcchat下调表达;进一步测定乙酰胆碱酯酶(AChE)及乙酰胆碱转移酶(ChAT)酶活,结果显示酶活水平与mRNA水平变化一致;推测Tclph可以通过调控ACh通路影响赤拟谷盗对克百威和敌敌畏的药物敏感性。
  为进一步研究LPH受体在赤拟谷盗生长发育、生殖和药物敏感过程的调控机制,利用RNA-sequencing高通量测序的方法分析了其下游关联基因及通路。测序结果显示RNAi干扰组(dslph)和对照组有274个差异表达基因,其中172个基因表达量上升,102个基因表达量下降。这些差异基因被分匹配到42功能条目中,包括免疫系统,应激反应,发育和生殖,杀虫剂的代谢过程。有趣的是,敲除Tclph抑制了Toll免疫通路,Tclph可能通过这些通路来调节寿命和抗逆性。同时,敲除Tclph也抑制了部分抗氧化酶和转录因子的基因,包括CuZnSOD和Pxd,这些基因可能调节了Tclph对发育和生殖的影响。另外,赤拟谷盗Tclph的RNAi改变了大量丝氨酸蛋白酶(sp)和半胱氨酸蛋白酶(cp)基因表达模式,显示SP、CP等分别调节发育,生殖,应激反应和先天免疫力等作用。此外,抑制Tclph表达下调OBPs,CSPs,CYPs和ESTs等基因的表达,这些基因编码的酶参与到phase0和phaseⅠ的细胞解毒过程。而在dslph昆虫中,FMOs上调表明它也可能涉及昆虫代谢系统的生物碱解毒。随着这些解毒酶的活性发生变化,提示Tclph参与了phase0,phaseⅠ和phaseⅡ的细胞解毒过程,进一步影响了ds-Tclph昆虫的杀虫剂敏感性。
  本研究还鉴定了赤拟谷盗Tclph的两个下游基因-羧酸酯酶Tcest和Tcest6,并且初步探究了Tclph与这两个羧酸酯酶基因的作用关系。Tcest4和Tcest6分别在晚期幼虫和晚期成虫高表达,并且在幼虫的中枢神经系统和血淋巴中高表达。同时,与对照组相比,两种抗胆碱杀虫剂(敌敌畏和百克威)在12~72h内诱导Tcest4和Tcest6表达量显著上调。而Tcest4或者Tcest6的敲减会引起幼虫对克百威和敌敌畏的药物敏感性升高,暗示Tcest4和Tcest6在杀虫剂解毒中发挥重要作用。除此之外,在抗胆碱酯酶杀虫剂处理后干扰Tclph会上调Tcest4的表达,下调Tcest6的表达。这些结果暗示:Tclph引起的药物敏感性上调是由于上调Tcest4基因的表达来补偿Tclph和Tcest6的低表达。进一步的实验显示,RNA干扰Tcest6降低43%雌性产卵量并且完全抑制卵的孵化,暗示Tclph通过下调Tcest6的表达影响生殖。我们的结果为Tclph在赤拟谷盗中调控药物敏感性和生殖的分子机制提供了一个新的思路。
  本研究在赤拟谷盗中利用RNAi技术揭示了Tclph的功能,结合RNA-seq初步探讨了它的信号通路,为全面解析LPH的信号通路提供了重要信息;因Tclph对赤拟谷盗的生长、发育和药物敏感性均具有重要影响,对其功能和信号传导系统的研究还可能鉴定新的杀虫剂作用靶标,同时为害虫的生物学防治打下基础。
[硕士论文] 李敏
入侵生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:蜡蚧菌(Lecanicillium lecanii)是一种优良的虫生真菌,对农业病虫害具有很好的防治效果。然而,蜡蚧菌在应用时为活菌制剂,杀真菌剂对其有致命的影响,在田间不能与杀菌剂等化学药剂同时施用。针对蜡蚧菌对杀菌剂敏感的问题,有必要对蜡蚧菌进行菌株改良而用于生物防治。本研究筛选对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂具有高抗性的真菌菌株,克隆其抗性基因,利用其抗药性基因转化蜡蚧菌的敏感菌株,筛选获得抗性较强的转化子,为蜡蚧菌的田间应用提供基础。研究已取得了如下结果。
  1、筛选对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂具高抗性的真菌菌株。从分离纯化的多类植物病原菌中,应用孢子萌发法,筛选对醚菌酯药剂表现出高抗药性水平的菌株F-2。F-2菌株对醚菌酯的EC50值大于2500μg/ml(田间常用浓度为250μg/ml)。菌株经ITS序列测序鉴定为极细枝孢菌(Cladosporium tenuissimum)。
  2、克隆抗性基因。从筛选得到的高水平抗药性突变菌株F-2菌株中,克隆抗药性高抗性基因Cytb,同时从野生型敏感性枝孢菌菌株B-3中也克隆出Cytb抗性基因,二者Cytb基因编码区序列进行比较分析。通过普通PCR和3'RACE实验扩增出Cytb基因编码区序列全长,二者序列比对后,结果为F-2菌株在核酸编码区序列429位点处发生碱基突变,氨基酸序列中143位点的氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸(G143A)。因此,F-2菌株对醚菌酯药剂表现出高抗药性水平,与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的已知抗性机制相符合。
  3、构建表达载体。构建Cytb抗药性突变基因的真菌ATMT表达载体,以pBHt2载体为基础,应用重叠PCR方法连接真菌表达强启动子PtrpC基因和Cytb抗性基因两个片段。然后,利用T4DNA连接酶将KpnⅠ和HindⅢ双酶切后的pBHt2载体和连接目的片段连接起来,构建含Cytb抗药性基因的pBHt2重组质粒。
  4、农杆菌介导法转化蜡蚧菌。将构建成功的含Cytb抗药性突变基因的pBHt2重组质粒导入农杆菌AGL-1中,然后,通过农杆菌和蜡蚧菌分生孢子共培养的方法,实现农杆菌介导的蜡蚧菌的转化,将外源Cytb抗药性基因导入蜡蚧菌中,获得含Cytb抗药性基因的转化子菌株,并对转化子菌株进行一系列验证。
  5、转化子验证。以转化子菌株基因组DNA为模板,PCR扩增出目的片段,证明外源Cytb抗药性基因已成功导入蜡蚧菌,以转化子菌株cDNA为模板,RT-PCR扩增出目的片段,证明外源Cytb抗药性基因已成功在蜡蚧菌中进行转录反应,测定转化子菌株对醚菌酯药剂的抗药性,结果得转化子菌株对醚菌酯抗药性最高提高了77倍,证明外源Cytb突变基因已成功在蜡蚧菌中翻译并表达。由此获知,对醚菌酯具有抗药性的蜡蚧菌工程菌株构建取得成功,菌株抗药性显著提高,具有很好的应用前景。
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